Mutationsanalyse des SCN5A Gens für den Herzmuskel

Institut für Transfusionsmedizin und Immunologie
der Medizinischen Fakultät Mannheim
(Ärztlicher Leiter: Prof. Dr. med. Harald Klüter)
Mutationsanalyse des SCN5A Gens für den Herzmuskel­
spezifischen spannungsgesteuerten Natriumkanal Nav1.5 bei
Herzinfarktpatienten mit Kammerflimmern
Inauguraldissertation
zur Erlangung des medizinischen Doktorgrades
der
Medizinischen Fakultät Mannheim
der Ruprecht-Karls-Universität
zu Heidelberg
vorgelegt von
Tim Böhringer
mfMtchen Prüfung:
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aus
Heilbronn
2013
http://d-nb.info/1076406734
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
1
Der plötzliche Herztod
1.1.1
Definition des plötzlichen Herztodes
1
1.1.2
Epidemiologie des plötzlichen Herztodes
1
1.1.3
Ätiologie des plötzlichen Herztodes
2
1.2
Kammerflimmern
4
1.3
Myokardinfarkt
5
1.4
1.5
1.3.1
Definition des Myokardinfarktes
5
1.3.2
Epidemiologie des Herzinfarktes
5
Primär elektrische Erkrankungen des Herzens
6
1.4.1
Das Long-QT-Syndrom
1.4.2
Brugada-Syndrom
Das SCN5A-Gen
7
10
11
1.5.1
Definition
11
1.5.2
Aufbau des Natriumkanals Nav1.5
12
1.5.3
Funktion des Natriumkanals Nav1.5
13
1.5.4
Assoziierte Erkrankungen
13
2
FRAGESTELLUNG
15
3
MATERIAL UND METHODEN
16
3.1
16
Material
3.1.1
Untersuchungsproben
16
3.1.2
Reagenzien
17
3.1.3
Rezepte für Lösungen
17
3.1.4
Enzym-Systeme und Kits
18
3.1.5
Laborgeräte
19
3.2
4
3.1.6
Primer
20
3.1.7
Software
26
3.1.8
Verbrauchsmaterialien
27
Methoden
28
3.2.1
Methodenübersicht
28
3.2.2
DNA-Isolierung
28
3.2.3
Messung der DNA-Konzentration
29
3.2.4
PCR-Amplifikation der Zielsequenz
30
3.2.5
Agarose-Gelelektrophorese
31
3.2.6
Reinigung des PCR-Produktes
33
3.2.7
DNA-Sequenzierung
34
3.2.8
PCR mit sequenzspezifischen Primern (PCR-SSP)
38
3.2.9
High Resolution Melting
40
3.2.10
Sequenzabgleich
42
3.2.11
Statistik
42
ERGEBNISSE
43
4.1
Sequenzierung Exon 2-28
43
4.2
High-Resolution-Melting
46
4.2.1
Etablierung und Testung
46
4.2.2
HRM-Ergebnisse
47
4.2.3
Übereinstimmung
48
4.2.4
Diskrepanzen zwischen HRM-Analyse und Sequenzierung
49
4.2.5
Schwierige Exone
50
4.3
PCR-SSP für SNPs und Mutationen in Patienten und Kontrollen
50
4.4
Haplotyp-Analyse
54
4.4.1
Haplotypen-Analyse der SNPs
54
4.4.2
Genotypen-Analyse der SNPs
55
4.5
5
Ergebniszusammenfassung
56
4.5.1
SNP 87G>A in Exon 2
56
4.5.2
Mutation 630G>A in Exon 6
56
4.5.3
SNP 1673A>G (H558R) in Exon 12
56
4.5.4
SNP IVS16-6C>T im Intron 16
56
4.5.5
SNP 3183G>A in Exon 17
56
4.5.6
Mutation 3578G>A in Exon 20
57
4.5.7
Mutation 4509C>T in Exon 26
57
4.5.8
Mutation 4786T>A in Exon 27
57
4.5.9
SNP 5457T>A in Exon 28
57
DISKUSSION
58
5.1
Mutationen in SCN5A bei Kammerflimmern
58
5.2
Fazit der Genuntersuchung
61
5.3
Diskrepanz zwischen HRM und Sequenzierung
62
5.4
Aufgabe, Nutzen und Probleme der HRM-Untersuchung
64
5.5
Weitere genetische Risikofaktoren für das Kammerflimmern
65
5.6
Ausblick
65
6
ZUSAMMENFASSUNG
67
7
LITERATURVERZEICHNIS
69
8
LEBENSLAUF
77
9
DANKSAGUNG
78
10 ANHANG
79
10.1
Probenübersicht
79
10.2
DNA-Sequenz der SCN5A-Amplikons
83
10.3
Programm zur Ergebniserfassung der Sequenzierung
99