Fachinformation 42 (10/11) | Molekulare Onkologie

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Fachinformation 42 (10/11) | Molekulare Onkologie
Next Generation Sequencing (NGS) in der Molekularen Pathologie
Dipl.-Ing. (FH) Tanja Hinrichsen, Prof. Dr. med. Barbara Dockhorn-Dworniczak
Wissenschaftlicher Hintergrund
Bei der Behandlung von soliden Tumoren nimmt der Einsatz von molekularen Antikörpern
(mAB) oder „Small Molecules“ (z.B. Tyrosinkinase-Inhibitoren, TKI) immer breiteren Raum
ein. Der Behandlungserfolg ist allerdings abhängig vom Mutationsstatus bestimmter Gene.
Während beim kolorektalen Karzinom (CRC) nur Patienten mit Wildtypsequenz im KRAS(Exon 2 und 3) bzw. BRAF-Gen (Exon 15) auf eine Therapie mit den mABs Cetuximab
(Erbitux) oder Panitumumab (Vectibix) ansprechen, profitieren beim Nicht-kleinzelligen
Lungenkarzinom (NSCLC) vor allem Patienten mit Mutationen im EGFR-Gen (Exon 18, 19,
20 und 21) von einer Therapie mit den TKI Erlotinib (Tarceva) und Gefitinib (Iressa).
Allerdings können bestimmte Mutationen (sog. Escape-Mutationen) auch zur TherapieResistenz führen. Auch Patienten mit NSCLC, bei denen eine KRAS-Mutation vorliegt, zeigen
ein Nichtansprechen gegenüber TKI. Patienten mit Gastrointestinalen Stromatumoren
(GIST) weisen häufig Mutationen im c-KIT- (Exon 9, 11, 13 und 17) und im PDGFRa-Gen
(Exon 12, 14 und 18) auf. Diese Mutationen können Einfluß auf die Sensitivität einer
Behandlung mit Imatinib (Gleevec) nehmen bzw. Resistenzen gegenüber TKI verursachen.
Tumorentität
Gen
KRAS
Exon
Mutationsstatus
Therapiemöglichkeiten
2, 3
Wildtyp
Cetuximab, Panitumumab
BRAF
15
Wildtyp
Cetuximab, Panitumumab
Nicht-kleinzelliges
Lungenkarzinom (NSCLC)
EGFR
18, 19, 20, 21
mutiert*
Erlotinib, Gefitinib
KRAS
2, 3
Wildtyp
Erlotinib, Gefitinib
Gastrointestinale
Stromatumoren (GIST)
C-KIT
9, 11, 13, 17
mutiert*
Imatinib
PDGFRa
12, 14, 18
mutiert*
Imatinib
malignes Melanom
BRAF
15
mutiert
Vemurafenib
kolorektales Karzinom (CRC)
* auch Mutationen beschrieben, die zu einer Therapieresistenz führen
Derzeit wird in der Routinediagnostik nicht der gesamte codierende Bereich der genannten
Gene untersucht, da die Mutationsrate niedrig, die Mutationssuche aufwändig ist und das
Untersuchungsmaterial meist eine Mischung zwischen Tumor- und Normalgewebe darstellt.
Mit der herkömmlichen Sanger-Sequenzierung können Mutationen übersehen werden, da
für eine sichere Detektion mindestens 20% der untersuchten DNA verändert sein muß.
Durch NGS ist es jetzt möglich, mit hohem Durchsatz einzelne Templates (d.h. Einzelmoleküle)
der zu untersuchenden DNA klonal zu amplifizieren und zu sequenzieren. Mit dieser
Methode werden in einem parallelen Ansatz mehrere Gene bzw. Zielsequenzen in einem
Tumor gleichzeitig mit hoher Abdeckung (Coverage) analysiert, wodurch Datenqualität und
Informationsgehalt erheblich verbessert werden.
Weiterhin können mit dieser Technologie Mutationen mit einer hohen Sensitivität vor einem
Wildtyp-Hintergrund detektiert werden. Bei einer 1.000-fachen Abdeckung beispielsweise
wird jedes Nukleotid der Zielsequenz 1.000-fach sequenziert und einzeln ausgelesen. Dies
entspricht einer Nachweisgrenze von ca. 5% an veränderten DNA-Molekülen. Durch die
klonale Amplifikation von Einzelmolekülen aus dem DNA-Gemisch werden sog. Allelic Dropouts vermieden. Auch dies trägt zu einer Erhöhung der Sensitivität bei.
Z ENTRUM FÜR H UMANGENETIK UND L ABORATORIUMSMEDIZIN
Dr. Klein und Dr. Rost
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LOCHHAMER STR . 29
82152 M ARTINSRIED
Tel. +49.89.895578-0
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Abb.: Deletionsnachweis (c.1652_1666del; p.Pro551_Val555del) in Exon 11 des C-KIT-Gens
mit Sanger-Sequenzierung (links) und NGS (rechts). Die Datenqualität ist bei NGS besonders
in Mischgewebe wie z.B. Tumoren der konventionellen Sanger-Sequenzierung überlegen.
Indikation
Therapieentscheidung bei:
Diagnose
CRC
NSCLC
GIST
malignes Melanom
Gen
KRAS
EGFR
C-KIT
BRAF
Mutationsnachweis
Exon 2, 3
Exon 18, 19, 20, 21
Exon 9, 11, 13, 17
Exon 15
Gen
BRAF
KRAS
PDGFRa
Mutationsnachweis
Exon 15
Exon 2, 3
Exon12, 14, 18
Anforderung/Versand
nach Rücksprache
Material
Je nach Tumorgröße 3-5 je 10 µm-Schnitte aus FFPE-Gewebe fixiert auf Objektträgern,
sowie ein gesonderter Objektträger mit Tumor für die histopathologische Begutachtung oder
Paraffinblöcke vom Tumor
Methode
Das eingesandte Material wird histopathologisch untersucht, entsprechende Tumorareale
identifiziert und markiert, sowie für die DNA-Isolierung mikrodisseziiert. Nach PCRAmplifikation der Zielregionen wird mittels Emulsions-PCR weiter angereichert und klonal
auf dem GS Junior (454 Life Sciences, Branford, CT, USA) sequenziert.
Dauer der Untersuchung
7 Tage
Literatur
Heinemann et al, Cancer Treatment Reviews, 35:262 (2009) / Jönsson et al, BMC Clinical
Pathology, 9:8 (2009) / Neumann et al, Pathol Res Pract, 205:858 (2009) / Richman et al, J Clin
Oncol 27:5931 (2009) / Kalikaki et al, Lung Cancer 69:110 (2009) / Lasota et al, Histopathology,
53:245 (2008)
In Zusammenarbeit mit dem
ZENTRUM
FüR
PATHOLOGIE KEMPTEN-ALLGäU
Prof. Dr. med. Barbara Dockhorn-Dworniczak, Dr. med. Claus Hirte, Prof. Dr. med. Laszlo Füzesi
Robert-Weixler Str.48, 87439 Kempten, phone: +49-831-51299-0, fax: +49-831-51299-40
Zentrum
für
Humangenetik
dr. klein und dr. rost
und LaboratoriumsmediZin
n
LocHHamer str. 29
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82152 martinsried
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