Poster 196 - IPA - Ruhr

Analyse von Mutationen der Gene TP53
und KRAS in Adenokarzinomen der Nase
von Holzstaub-exponierten Arbeitern
BGFA
P. ROZYNEK1, G. JOHNEN1, H. STOCKMANN1, J. WOLF2, J. SCHULZE2, H. HANNIG3,
C. PIERL1, S. HATTENBERGER3, K. DONHUIJSEN3, B. PESCH1, T. BRÜNING1
1 Berufsgenossenschaftliches Forschungsinstitut für Arbeitsmedizin (BGFA), Institut der Ruhr-Universität Bochum, Germany,
2 Holz-Berufsgenossenschaft, München, Germany,
3 Städtisches Klinikum Braunschweig, Institut für Pathologie, Braunschweig, Germany
Einleitung/Ziel
Adenokarzinome der Nase werden in Deutschland als Berufskrankheit anerkannt (BK 4203), wenn eine Exposition gegen Eichen- oder
Buchenholzstaub vorlag. Als mitverantwortlich für die Entwicklung
nasaler Tumoren werden Mutationen in den Genen für den Tumorsuppressor TP53 und das Signalprotein KRAS diskutiert. Im Rahmen der Studie sollte daher untersucht werden, ob sich (a) die publizierten Mutationen in unserem Kollektiv bestätigen lassen und
(b) mögliche stoffspezifische Mutationsmuster innerhalb der beiden
Gene nachweisen lassen. Mutationsmuster in Assoziation mit der
Art der Exposition (Holzstaub und/oder Additive) würden ggf. eine
Abgrenzung der Holzstaubexposition von Expositionen gegenüber
Holzbehandlungsstoffen ermöglichen.
Methoden
Abb. 1: Mit Hilfe der Laser-Mikrodissektion können definierte
Gewebebereiche und sogar einzelne Zellen für die Gewinnung
von DNA aus einem Gewebeschnitt ausgeschnitten werden.
DNA wurde aus formalinfixiertem
und paraffiniertem Gewebe
sinonasaler Adenokarzinome des
Intestinalen Typs sowie aus korrespondierendem tumorfreiem Gewebe isoliert und anschließend
mittels PCR und DNA-Sequenzierung analysiert. Da das Gewebe zum Teil nur kleine oder nur
sehr verstreut liegende Tumoranteile aufwies, konnten die Tumorzellen nur mittels Laser-Mikrodissektion herausgeschnitten werden
(Abb. 1).
Limitierend für die molekularbiologischen Untersuchungen war nicht
nur die Menge der isolierbaren DNA. Infolge der Formalinfixierung
der Gewebe war die DNA der Proben auch hochgradig fragmentiert
und unterschiedlich stark abgebaut (Abb. 2).
Es stand Material von ca. 100 Holzstaub-exponierten Arbeitern mit
anerkannter BK 4203 zur Verfügung, wobei aber nur von 48 Personen geeignetes Probenmaterial zu gewinnen war. Die Sequenzen
wurden mit der TP53 -Referenzsequenz X54156, bzw. KRAS Referenzsequenz NT_009714 verglichen.
Ergebnisse
TP53 Exon 7 konnte mittels PCR aus 32 Paraffinblöcken amplifiziert und anschließend durch DNA-Sequenzierung analysiert
werden. In der kodierenden Region von TP53 Exon 7 fanden
sich in fünf Tumorproben Mutationen, vier davon führten zu
Aminosäureaustauschen. Alle untersuchten 3’-Intronregionen
von Exon 7 zeigten die bekannten SNPs 14168 G>T und 14234
+ 5 T>C. Exon 8 von TP53 konnte im Tumorgewebe von 15 der
48 Patienten untersucht werden. Insgesamt zeigten 13% der Proben Mutationen im kodierenden Bereich. In den Exons 7 und 8
der gleichen Patienten in Nichttumorgewebe fanden wir keine
Mutationen. In KRAS Exon 1 hatten drei (14%) der Tumorproben
von 25 Patienten eine Mutation in Codon 12 (Gly>Asp). Es zeigte sich keine signifikante Assoziation zwischen einer aufgetretenen Mutation und der Exposition gegenüber Holzstaub und Holzadditiven. Patienten mit Mutationen hatten allerdings eine nicht
signifikant längere Beschäftigungsdauer in der Holzindustrie
(Median = 37,5 Jahre mit Mutation vs. 30,5 Jahre ohne Mutationen, p = 0,30).
Ergebnisse der Mutationsuntersuchungen in TP53 und KRAS
bei Nasentumorproben von Holzstaub-exponierten Arbeitern
TP53 Exon 7
TP53 Exon 8
KRAS Exon 1
Tumor
Nichttumor
Tumor
Nichttumor
Tumor
Nichttumor
Proben [N]
48
48
48
48
48
48
sequenzierbar [N]
32
32
16
16
25
25
Exon-Mutationen
5 a)b)
0
2c)
0
3 d)
0
3’-Intron Mutationen
5b)
0
3
0
-
-
a)
b)
c)
d)
Codons 231 Thr>Ile, 232 Ile>Val, 234 Tyr>Stop, 248 Arg>Trp, 257 silent (kein resultierender Aminosäureaustausch)
In einem Fall wurde sowohl im Exon wie auch im Intron eine Mutation gefunden
Codons 262 Gly>Asp, 273, Asp>His, 280 Arg>Thr, 296, His>Pro, dabei in einem Fall drei Mutationen
ausschließlich Codon 12 Gly>Asp
Zusammenfassung
Abb. 2: Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA aus Nasentumorproben (1 und 2) im Vergleich zu DNA aus Frischblut (3). Lediglich die
Probe aus Frischblut zeigt eine gute DNA-Qualität, während die DNA
aus Nasentumorproben entweder nicht darstellbar war (2), oder eine
starke Fragmentierung zeigte (1). In den meisten Fällen konnte die
fragmentierte DNA trotzdem bezgl. Mutationen in den Exons 7 und 8
von TP53 sowie KRAS Exon 1 untersucht werden. Bei den im Gel nicht
darstellbaren Proben war dies nicht möglich.
Die gefundenen Mutationsfrequenzen in den Exons 7 und 8 des
TP53 Gens sowie in Exon 1 von KRAS stimmen gut mit publizierten Ergebnissen (zwischen 10-15% werden angeben) überein.
Bisher konnten keine Mutationsmuster gefunden werden, die
auf eine spezifische Exposition gegen Holzstaub und/oder Holzadditive hinweisen. Molekulare Defektmuster können sich über
größere Bereiche des Genoms erstrecken und somit nur bei einer erweiterten Betrachtung erkennbar werden. Daher könnte
die Untersuchung weiterer Genabschnitte, insbesondere der
Exons 5, 6 und 9 von TP53 sowie auch epigenetischer Effekte,
zur Klärung der Fragestellung beitragen.