KRAS-und NRAS-Mutationsanalyse bei kolorektalem Karzinom

Institut für Pathologie und
Neuropathologie
Medizinisches Versorgungszentrum
Pathologie und Neuropathologie
KRAS-und NRAS-Mutationsanalyse bei kolorektalem Karzinom
Genetischer Hintergrund
Die Untersuchung dient der Selektion behandlungsgeeigneter Patienten für
eine zielgerichtete Therapie mit den 2008 eingeführten Anti-EGFR-Antikörpern
Panitumumab (Vectibix®) und Cetuximab (Erbitux®). Diese therapeutischen
Antikörper sind nur dann wirksam, wenn die durch den EGFR (epidermal
growth factor receptor) gesteuerten Signalwege noch regulierbar sind. Die in
diesem Zusammenhang verwendeten Biomarker sind Mutationen in den KRASund NRAS-Genen, deren Proteine dem EGFR im Signalweg nachgeschaltet sind.
Mutationen in den Kodons 12, 13, 59, 61, 117 und 146 bewirken im
kolorektalen Karzinom eine Daueraktivierung des KRAS- oder NRAS-Proteins
mit konsekutiver Autonomie des Signalwegs, der nicht mehr durch die Aktivität
des EGFR reguliert werden kann. Daher ist eine Anti-EGFR-Therapie bei
Vorliegen einer KRAS- oder NRAS-Mutation (Kodon 12 oder 13 (Exons 2), Kodon
59 oder 61 (Exon 3), Kodon 117 oder 146 (Exon 4)) wirkungslos.
Die KRAS- und NRAS-Status-Konkordanz zwischen Primärtumor und
Metastasen beträgt über 90%, es sollte aber nach Möglichkeit der Primärtumor
untersucht werden, da darauf auch die klinischen Studiendaten beruhen.
Material
Paraffingewebe aus dem Tumor (Röllchen oder auf Leerschnitten zum
Makrodissezieren)
Testprinzip
KRAS Kodon 12 und 13:
Der Clamped Probe Assay dient der Detektion spezifischer Mutationen bei
Minderheiten von neoplastischen Zellen. Dabei wird der Bereich des KRASGens um Codon 12 und 13 mittels einer PCR mit LightCycler FRET
Hybridisierungssonden amplifiziert und anschließend erfolgt eine
Schmelzpunktanalyse. Dieser Test detektiert 9 verschiedene Mutationen in den
Kodons 12 und 13. Die Sensor-Sonde hydrolysiert mit unterschiedlichen
spezifischen Schmelztemperaturen, je nachdem an welcher Stelle der beiden
Kodons welche Mutation vorliegt (Abbildung 1). Die Sensor-Sonde enthält die
komplementäre Sequenz für G12C, wodurch die Schmelzpunktanalyse, wenn
diese Mutation vorliegt, den höchsten Schmelzpunkt zeigt. Wurden die
Wildtyp(WT)-Sequenz oder eine der anderen 8 Mutationen amplifiziert, liegen
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die Schmelzpunkte entsprechend thermodynamischer Kriterien niedriger. Um
auch kleine Anteile von mutierten Sequenzen detektieren zu können, wenn
wenig Tumorzellen im Infiltrat vorliegen, werden LNA-Oligomere (Clamping
Oligomer) zugesetzt, die komplementär zur WT-Sequenz an Kodon 12 und 13
binden und aufgrund ihrer veränderten Ribose-Konformation mit höherem
Schmelzpunkt hybridisieren. Somit dienen sie als Kompetitor zur
Detektionssonde, die komplementär zur Mutation ist, verhindern die
Amplifikation der Wildtypsequenzen und bedingen die Anreicherung der
mutierten Sequenzen. Es werden die Schmelzkurven aus Ansätzen mit und
ohne LNA-Oligomer verglichen.
Abbildung 1: Spektrum an Mutationen mit entsprechenden Schmelzkurven in Codon 12 und 13 des KRAS-Gens, die mit dem beschriebenen Assay detektiert werden können
Beispiele:
Abbildung 2:
Die Abbildung zeigt die Schmelzkurven der Proben von zwei Patienten nach einer PCR des K-RAS-Gens im
Bereich von Kodon 12 und 13 mit FRET Hybridisierungssonden am LightCycler. Der Schmelzpunkt der
Sensorsonde beträgt ca. 64,6°C bei Wildtypsequenz.
Im linken Bild ist zu erkennen, dass die Patientenprobe nur die Wildtypkurve zeigt. Bei Zugabe von LNAOligomer verschwindet die WT-Schmelzkurve durch Blockierung der Amplifikation der WT-Sequenzen. Der
Patient hat somit nur Zellen mit WT-Sequenz.
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Im rechten Bild zeigt die Schmelzkurve der Patientenprobe den Hauptpeak bei WT-Schmelztemperatur und
zusätzlich einen kleineren Nebenpeak bei G13D-Schmelztemperatur. Bei Zugabe von LNA-Oligomer
verschwindet die WT-Schmelzkurve und es zeigt sich angereichert die G13D-Schmelzkurve. Der Patient hat
somit neoplastische Zellen mit einer G13D-Mutation.
KRAS Kodons 59, 61, 117 und 146 und NRAS Kodons 12, 13, 59, 61, 117 und
146:
Mittels PCR werden die KRAS Exons 3 und 4 und NRAS Exons 2, 3 und 4
amplifiziert und anschließend im Sequenzer von beiden Richtungen (vom 5’Ende und vom 3’-Ende) sequenziert. Die Sequenzen werden in einem
Alignment mit der Sequenz der Wildtyp-DNA, also nicht mutierten DNA,
verglichen. Zusätzlich werden die Chromatogramme der Sequenzierungen
analysiert, weil in Gewebeproben, in denen weniger Tumorzellen als normale
Zellen vorliegen, die Mutationspeaks kleiner als die Wildtyppeaks ausfallen
können und dementsprechend dann die Mutation im Alignment der Sequenzen
nicht detektiert werden würde.
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