Etablierung der MLPA-Analyse für seltene genetische Erkrankungen
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Aus der Abteilung für Humangenetik der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. J. T. Epplen Etablierung der MLPA-Analyse für seltene genetische Erkrankungen (orphan diseases): Morbus Sandhoff (HEXB), Morbus Tay-Sachs Typ AB (GM2A) und Morbus Schimke (SMARCAL1) Publikationsbasierte Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Anna Kathrin Ulrike Sobek aus Solingen 2013 Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: Prof. Dr. med. J. T. Epplen Koreferent: PD Dr. med. B. Miterski Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2014 Abstract Von Anna Sobek Etablierung der MLPA-Analyse für seltene genetische Erkrankungen (orphan diseases): M. Sandhoff (HEXB), M. Tay-Sachs Typ AB (GM2A) und M. Schimke (SMARCAL1) Problemstellung: Für die oben genannten Krankheitsbilder gibt es bisher kein etabliertes Verfahren, welches eine kostengünstige und verhältnismäßig schnelle Bestimmung von größeren Deletionen und Insertionen darstellt. Bisher wurden die entsprechenden Gene (HEXB, GM2A und SMARCAL1) sequenziert und somit „nur“ auf Mutationen und kleinere Deletionen untersucht. Durch die PCR-basierte multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) Methode soll die Routinediagnostik um eine Methode zur Identifizierung größerer Deletionen und Insertionen ergänzt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für die vier Exons des GM2-Gens, die 14 Exons des HEXB-Gens und die 18 Exons des SMARCAL1-Gens die MLPA-Analyse etabliert. Dazu wurden zwei Untersuchungseinheiten mit Oligonukleotidsonden erstellt. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Ergänzung der bereits bestehenden Diagnostik für die genannten Krankheitsbilder. Inhaltlich handelt es sich um die Entwicklung und Erprobung der Sonden mit anschließender Verifizierung und Validierung der Ergebnisse inklusive der Untersuchung einer bereits vorhandenen Patientenkohorte. Diese setzt sich aus betroffenen Patienten aus dem europäischen sowie dem nordamerikanischen Raum zusammen. Die bisherigen Untersuchungen der ausgewählten Patienten dieser Kohorte haben keine oder jeweils nur eine Mutation im homozygoten Zustand ergeben. Eine Compound-Heterozygotie mit einem deletierten Allel konnte bei diesen Patienten somit noch nicht endgültig ausgeschlossen werden. Aus diesem Grund werden die Patienten nochmals mit der entwickelten MLPA-Methode auf mögliche größere Deletionen und Insertionen nachuntersucht. Methode: Die in dieser Dissertation entwickelten Sonden wurden nach dem Protokoll für synthetische Oligonukleotide der Firma MRC-Holland (www.MRC-Holland.com) entwickelt. Es wurden zwei verschiedene Sondensets zur Untersuchung der Gene HEXB, GM2A und SMARCAL1 erstellt. Im ersten Set sind 19 exonspezifische Sonden für die Gene HEXB und GM2A enthalten. Im zweiten Set befinden sich die 18 Sonden für das SMARCAL1-Gen. Nach erfolgreicher Etablierung wird die MLPA-Methode für diese Gene als Ergänzung zur Routinediagnostik zur Verfügung stehen. Zum Vergleich der eigens hergestellten MLPA-Methode wurde ein kommerzielles Set der Firma MRC-Holland für das ASPA-Gen (M. Canavan) herangezogen. Ergebnisse: Die meisten Veränderungen wurden im HEXB-Gen nachgewiesen. Mittels MLPA wurde eine Deletion der Exons 1-5 identifiziert, wobei ein Zusammenhang zwischen dieser Deletion und einer Normvariante (c.1614-14C>A) festgestellt werden konnte. In der Gruppe der untersuchten Patienten wurden fünf bereits veröffentlichte und 12 noch unbekannte Mutationen gefunden. Bei der Validierung ließ sich im Vergleich zum kommerziell erhältlichen M. Canavan-Untersuchungsset eine geringfügig größere Abweichung in der Genauigkeit der Ergebnisse feststellen. In der Auswertung zeigten sich gelegentliche Variationen um den Normwert, welche im kommerziell erhältlichen Untersuchungsset nicht in dem Maße auffindbar waren. Diskussion: Die Ergebnisse, legen nahe, dass die MLPA-Methode eine sinnvolle Ergänzung der Routinediagnostik darstellt, um größere Deletionen und Insertionen nicht zu übersehen. Im Rahmen der Etablierung hat sich die MLPA als effiziente Methode erwiesen, um kostengünstig und schnell größere Deletionen und Insertionen in den bereits erwähnten Genen nachzuweisen. Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung..........................................................................................................................8 2 Zielsetzung.......................................................................................................................9 3 Beschreibung der Gene und der Krankheitsbilder....................................... 10 3.1 Gangliosidosen ...............................................................................................................10 3.1.1 M. Sandhoff (OMIM: 268800 (Sandhoff Disease); 606873 (HEXB)) ..............11 3.1.2 M. Tay-Sachs AB (OMIM: 272750 (GM2-Gangliosidosis, AB Variant); 613109 (GM2A)).................................................................................................................................12 3.2 M. Schimke (OMIM: 242900 (Schimke Dysplasia); 606622 (SMARCAL1)) ..........13 3.3 M. Canavan (OMIM: 271900 (Canavan Disease); 608034 (ASPA)) ......................14 4 Material und Methoden............................................................................................. 15 4.1 Historisches und Hintergründe zur MLPA Methode ..................................................15 4.2 Materialien .......................................................................................................................16 SALSA MLPA kit P200-A1 Human DNA Reference 1....................................................17 4.3 Herstellung der synthetischen Sonden .......................................................................18 4.4 Patientenkohorten ..........................................................................................................22 4.5 Methodik ..........................................................................................................................22 4.5.1 MLPA ........................................................................................................................22 4.5.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Agarosegelelektrophorese................24 4.5.3 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse ........................24 4.6 Datenanalyse ..................................................................................................................24 4.7 Verifikation der gefundenen Mutationen .....................................................................25 4.8 Software...........................................................................................................................25 4.9 Datenbanken...................................................................................................................25 5 Ergebnisse und Diskussion ................................................................................... 26 6 Literaturverzeichnis................................................................................................... 32 7 Anhang............................................................................................................................ 38 1 Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung ASPA Aspartoacylase/Aminocyclase 2 BLAST/BLAT basic local alignment search tool/BLAST-like alignment tool bp base pairs (Basenpaare) BPM basic probe mix °C Grad Celsius CGH comparative genomic hybridization Chr. Chromosom CNV copy number variation DHPLC Denaturierende Hochdruck Flüssigkeitschromatographie (denaturing high performance liquid chromatography) DNA Desoxy-Ribonukleinsäure (desoxy ribonucletid acid) et al. und andere (et alteri) EtBr Etidiumbromid FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung FPM final probe mix F-Primer Vorwärts-Primer (forward) ΔG Gibbs’sche freie Energie g Gramm GM1 ganglioside 1 GM2 ganglioside 2 GM2A GM2-Aktivatorprotein (Ganglioside 2 Activator) h Stunde(n) HEXA Hexosaminidase A HEXB Hexosaminidase B kb Kilobasen kV Kilovolt k kilo (103) l Liter 2 LHS linke Hybridisierungssequenz (left hybridisation sequence) LPO linke Sondenhälfte (left probe oligo) m milli (10-3) M. Morbus MAPH multiplex amplifiable probe hybridisation min Minute(n) ml Milliliter MLPA multiplex ligation-dependent probe amplification MLPA-Probe LPO+RPO mM millimolar MRT Magnetresonanztomografie MS-MPLA methylation-specific MLPA ® mV Millivolt µ mikro (10-6) n Anzahl NAA N-acetyl L-aspartic acid NCBI National Center for Biotechnology Information NaCl Natriumchlorid nm Nanometer nt Nukleotid(e) NML U.S. National Library of Medicine o.g. oben genannt OMIM Online Mendelian Inheritance in Men OR odds ratio P picco (10-12), kurzer Arm eines Chromosoms PCR Polymerasekettenreaktion (Polymerase chain reaction) Q Langer Arm eines Chromosoms RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus RHS rechte Hybridisierungssequenz (right hybridisation sequence) RPO rechte Sondenhälfte (right probe oligo) RNA Ribonukleinsäure (ribonucleotid acid) R-Primer Rückwärts-Primer (reverse) rs reference SNP (refSNP) 3 sek Sekunde(n) SIOD Schimke immunoosseous dysplasia SMARCAL1 SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a-like 1 SNP Einzelnukleotidpolymorphismus (single nucleotide polymorphism) SLS sample loading solution Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TBE TRIS-Borat-EDTA TE TRIS-EDTA TIA transitorische ischämische Attacke Tm Schmelztemperatur (melting temperature) TRIS Tris(hydroxymethyl)-Aminomethan UCSC University of California Santa Cruz UV ultraviolettes Licht V Volt Vgl. vergleiche www world wide web ZNS Zentrales Nervensystem % Prozent Nukleobasen: A Adenin G Guanin C Cytosin T Thymin Aminosäuren: Ala Alanin Leu Leucin Arg Arginin Lys Lysin Asn Asparagin Met Methionin Asp Asparaginsäure Phe Phenylalanin Cys Cystein Pro Prolin Gln Glutamin Ser Serin Glu Glutaminsäure Thr Threonin Gly Glycin Trp Tryptophan 4 His Histidin Tyr Tyrosin Ile Isoleucin Val Valin 5 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: MLPA-Sonden-Benennung Seite 18 Abbildung 2: Flussdiagramm zum suffizienten Erstellen synthetischer Oligos Abbildung 3: Arbeitsschritte der MLPA Seite 21 Seite 23 6 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Aufstellung des P200 Kit Seite 17 Tabelle 2: Übersicht über die gefundenen HEXB-Mutationen Seite 28 Tabelle 3: Übersicht über die gefundenen HEXB-Variationen Seite 29 Tabelle A1: MLPA-Sonden für die Gene HEXB, GM2A und SMARCAL1 Seite 38 7 1 Einleitung Menschliche Genome sind polymorph, das heißt, sie weisen in einer Population verschiedenste Unterschiede Einzelnukleotidpolymorphismen auf. Einerseits (single gibt nucleotide es Normvarianten, polymorphisms; SNPs) genannt, welche im Laufe der Evolution entstanden sind und unter anderem aufgrund von Frequenzunterschieden Bevölkerungsgruppen voneinander unterscheidbar machen. SNPs sind in jedem menschlichen Genom vorhanden und können entweder nur eine Abweichung von der Norm darstellen oder aber krankheitsverursachenden Charakter haben. Es handelt sich um einfache Basenpaar-Austausche. Andererseits gibt es eine Vielzahl weiterer Veränderungen, welche sich unter dem Begriff der Kopienzahlvariation (CNV, copy number variation) zusammenfassen lassen. Sie gehören zu den strukturellen Veränderungen des Erbguts (Conrad et al., 2010; Mills et al., 2011). Diese Veränderungen können krankheitsverursachend sein, werden aber auch als für die genetische Unterscheidbarkeit mitverantwortlich diskutiert (Henrichsen et al., 2009). Ob eine Variation der Kopienzahl definitiv zu einer Erkrankung führt, ist abhängig von ihrer Lokalisation im Genom (Redon et al., 2006). Zu den CNVs gehören die in dieser Arbeit untersuchten Deletionen (Genomabschnitte liegen nur in einfacher anstatt in doppelter Ausführung vor) und Duplikationen (Genomabschnitte liegen in mehr als zweifacher Kopienanzahl vor). Ursächlich für die in dieser Arbeit beschriebenen Erkrankungen, M. Sandhoff, M. Tay-Sachs Typ AB, M. Canavan und M. Schimke, sind in den meisten Fällen Punktmutationen, jedoch sind für alle drei Erkrankungen auch krankheitsursächliche Deletionen und Insertionen beschrieben (Bikker et al., 1990; Boerkoel et al., 2002; Brown et al., 1992; Chen et al., 1999; Clewing et al., 2007a; Clewing et al., 2007b; Gomez-Lira et al., 2001; Hara et al., 1994; Kleiman et al., 1998; McInnes et al., 1992a; McInnes et al., 1992b; Schepers et al., 1996; Taha et al., 2004; Zampieri et al., 2009; Zampieri et al., 2012; Zhang et al., 1994). Für das ebenfalls untersuchte Aspartoacylase (ASPA)-Gen liegt ein kommerzielles Untersuchungsset der Firma MRC-Holland bereits vor, da bei diesem Gen Deletionen und Insertionen häufiger der Grund für die Erkrankung sind (Kaul et al., 1996; Shaaget al., 1995; Surendran et al., 2003; Zeng et al., 2006; Zeng et al., 8 2002; Elpeleg & Shaag, 1999; Kaya et al., 2008; Tahmaz et al., 2001). Dieses Set wurde zur Validierung und als Diagnostikergänzung in dieser Arbeit eingesetzt. Die MLPA-Analyse stellt ein geeignetes Instrument zur Darstellung von Deletionen und Insertionen bzw. Duplikationen dar (Armour et al., 2002; Schouten et al., 2002). Es handelt sich um ein Ligations- und PCR (polymerase chain reaction)basiertes Verfahren, mit dem bis zu 40 DNA-Loci in einer Untersuchung routinemäßig, kosten- und aufwandsgünstig untersucht werden können. Für Erkrankungen, die häufig mit CNVs assoziiert sind, werden seit 2002 spezielle MLPA-Untersuchungssets von MRC-Holland vertrieben. Da es sich bei den in dieser Arbeit untersuchten Genen Hexosaminidase B (HEXB), Ganglioside 2 Activator (GM2A) und SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a-like 1 (SMARCAL1) um Gene für seltene Erkrankungen handelt, gibt es bisher kein kommerzielles Untersuchungsset. Parallel zur vorgestellten Arbeit veröffentlichten Zampieri et al. die MLPA-Methode für das HEXB-Gen (Zampieri et al., 2012). Zum Vergleich mit dem selbst hergestellten MLPA-Ansatz wurde ein kommerziell erworbenes Untersuchungsset für das ASPA-Gen verwendet. Es besteht jedoch die Möglichkeit, die MLPA-Methode speziell für diese Gene nach einem Protokoll der MRC-Holland-Webseite anzufertigen. Da Deletionen und Duplikationen ein häufiger Krankheitsgrund sind, ist es sinnvoll, eine MLPA-Analyse für diese o.g. Gene zu erstellen und damit die Routinediagnostik zu komplettieren. 2 Zielsetzung Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Ergänzung der bereits bestehenden Diagnostik für die Krankheitsbilder M. Sandhoff, M. Tay-Sachs Typ AB und M. Schimke. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dazu ein Verfahren etabliert, welches für diese seltenen Erkrankungen noch nicht verfügbar war, sich jedoch bei anderen genetischen Erkrankungen bereits als verlässlich erwiesen hat. Dieses Verfahren, MLPA genannt, basiert auf der Herstellung einzelner Sonden, welche sich der komplementären DNA anlagern und im Verlauf der Untersuchung auf das Fehlen oder das mehrfache Vorhandensein einzelner DNA-Abschnitte schließen lassen. Es handelt sich bei der vorliegenden Arbeit also inhaltlich um die Entwicklung und Erprobung der Sonden mit anschließender Verifizierung und Validierung der Ergebnisse inklusive der Untersuchung einer bereits vorhandenen Patientenkohorte. Diese setzt sich aus betroffenen Patienten aus dem 9 europäischen sowie dem nordamerikanischen Raum zusammen und liegt im Lehrstuhl für Humangenetik von Prof. Dr. Epplen an der Ruhr-Universität bereits vor. Die bisher durchgeführten Untersuchungen der ausgewählten Patienten dieser Kohorte haben in der Vergangenheit keine oder jeweils nur eine Mutation im homozygoten Zustand ergeben. Eine Compound-Heterozygotie mit einem deletierten Allel konnte bei diesen Patienten somit noch nicht endgültig ausgeschlossen werden. Aus diesem Grund werden die Patienten nochmals mit der entwickelten MLPA-Methode auf mögliche größere Deletionen und Insertionen nachuntersucht. 3 Beschreibung der Gene und der Krankheitsbilder 3.1 Gangliosidosen Gangliosidosen gehören zu den lysosomalen Speicherkrankheiten. Durch einen genetisch bedingten Defekt der am Abbau beteiligten Enzyme kommt es zu einer Akkumulation des jeweiligen Substrates und einer Funktionsstörung der betroffenen Zellen. Eine Gemeinsamkeit der Lysosomenerkrankungen stellt der prozesshafte Krankheitsverlauf mit initial normaler Entwicklung und anschließender psychomotorischer Degeneration dar (Beck, 2007). Es lassen sich GM1- und GM2-Gangliosidosen unterscheiden. Bei Ersterer kommt es zu einer Degeneration von Neuronen, welche durch einen Mangel an β-Galaktosidase und eine resultierende Anhäufung von GM1-Gangliosid verursacht ist. Bei den in dieser Arbeit besprochenen Erkrankungen handelt es sich um die autosomalrezessiv vererbten GM2-Gangliosidosen: M. Tay-Sachs und M. Sandhoff. Durch Funktionseinschränkung der Enzyme Hexosaminidase A und B kommt es zur Akkumulation von Sphingolipiden in Neuronen des zentralen Nervensystems (Sandhoff et al., 1968). Unter Sphingolipiden sind zuckerhaltige Lipide zu verstehen, die vor allem im zentralen Nervensystem als Bausteine von Plasmamembranen anzutreffen sind. Im klinischen Erscheinungsbild lassen sich diese beiden Krankheitsbilder nicht unterscheiden. Die Diagnose kann jedoch über die Bestimmung der beteiligten Enzyme aus Fibroblasten und Leukozyten sowie die Sequenzierung der betroffenen Gene erfolgen. Es lassen sich eine infantile, eine juvenile und eine adulte Form unterscheiden. Mit steigendem Alter des Krankheitsbeginns kommt es zu variierenden, teils milderen Symptomen (Beck, 2007). 10 3.1.1 M. Sandhoff (OMIM: 268800 (Sandhoff Disease); 606873 (HEXB)) Bei M. Sandhoff (Sandhoff et al., 1968) handelt es sich um eine angeborene, lysosomale Speicherkrankheit, die durch das Fehlen von Abbauenzymen verursacht wird. Um intrazelluläre GM2-Ganglioside abbauen zu können, werden zwei Hexosaminidasen benötigt; HEXA und HEXB (Robinson und Stirling, 1968). Die HEXA ist aus einer α- und einer β-Untereinheit aufgebaut, während die HEXB aus zwei β-Untereinheiten besteht (Sandhoff et al., 1969; Sandhoff, 1969). Das HEXAGen kodiert für die α- und das HEXB-Gen für die zwei β-Untereinheiten, aus denen die Hexosaminidase B besteht. Mutationen in den beiden Genen können verschiedene Krankheitsbilder hervorrufen. Wenn es zu einem Defekt im HEXAGen und somit zu einem Verlust der Enzymaktivität von HEXA kommt, spricht man von der Tay-Sachs-Erkrankung (Okada und O’Brien, 1969). Kommt es zu einer Mutation im HEXB-Gen, so führt dies zum Verlust der Aktivität beider Hexosaminidasen und es entwickelt sich das Krankheitsbild des M. Sandhoff (Sandhoff et al., 1968). Grundlage der lysosomalen Speicherkrankheiten ist eine Akkumulation von nicht weiter abbaubaren Sphingolipiden. Durch deren vermehrtes Vorhandensein werden die typischen Symptome hervorgerufen. Die gemeinsamen Symptome der Sphingolipidosen umfassen geistige Retardierung, Organomegalie von Leber und Niere sowie den typischen kirschroten Makulafleck. Bei diesen neurodegenerativen Erkrankungen sind besonders die Nervenzellen des Gehirns betroffen (Sandhoff et al., 1968). Bei der infantilen Form entwickeln sich die betroffenen Kinder in den ersten drei bis fünf Lebensmonaten meist noch normal, bis es schließlich zu einem Entwicklungsstillstand mit anschließender geistiger und motorischer Regression kommt (Okada und O’Brien, 1969; Sandhoff, 1969; Sandhoff et al., 1968; Sandhoff et al., 1969). Erste Kennzeichen sind eine muskuläre Hypotonie und ein Vorliegen abnormer Schreckreaktionen. Im Verlauf kommt es zur Erniedrigung der Krampfschwelle sowie zur progressiven Erblindung und einer Makrocephalie aufgrund der Gliose. Später kann eine schwere Demenz vorliegen. Krivit et al. beschrieben eine mögliche Manifestation am Herzen, die der neurologischen Manifestation vorausgehen kann (Krivit et al., 1972). Bei der juvenilen Verlaufsform treten die ersten Symptome erst zwischen dem dritten und fünften Lebensjahr auf, der Verlauf ist langsamer und milder und die Lebenserwartung liegt bei etwa 15-20 Jahren. 11 Kennzeichen der adulten Form sind verschiede psychiatrische und neurologische Auffälligkeiten (Frey et al., 2005). Sehvermögen und Intelligenz können in einzelnen Fällen unbeeinträchtigt sein. Die Lebensdauer ist meist nicht beeinträchtigt. Der Schweregrad und die Ausprägung der Symptome stehen in unmittelbarem Zusammenhang mit der Restaktivität der Enzyme HEXA und HEXB (Leinekugel et al., 1992). Patienten mit einer Restaktivität von ca. 10-20% erscheinen klinisch gesund (Leinekugel et al., 1992). Diagnostisch steht die Bestimmung der Enzymaktivität im Serum aus Leukozyten, aus Fibroblastenkulturen sowie ggf. aus Material einer Chorionzottenbiopsie und Amnionzellkulturen im Vordergrund. Eine gänzlich fehlende oder stark herabgesetzte Aktivität der HEXA bei normaler HEXB-Aktivität deutet auf M. TaySachs hin, während bei M. Sandhoff die Aktivität beider Enzyme eingeschränkt bzw. nicht vorhanden ist. Bisher existieren Therapieversuche nur mit symptomatische Therapie-Optionen. Knochenmarktransplantation (Norflus Es et al., wurden 1998), Gentherapie (Cachón-González et al., 2006), Enzymsubstitution (Tsuji et al., 2011), Stammzellen (Arthur et al., 2012) und Gentherapie (Cachón-González et al., 2006) unternommen, die sich bisher noch nicht etablieren konnten. Bei infauster Prognose kommt es zum frühzeitigen Versterben der Patienten mit infantiler Form etwa mit 2 bis 4 Lebensjahren (www.omim.org, #268800; Okada und O’Brien, 1969). Das HEXB-Gen befindet sich auf dem kurzen Arm des Chr. 5 und ist 35-40kb groß (NM_000521). Die molekulargenetische Diagnose erfolgte bisher durch direkte Sequenzanalyse der 14 Exons des HEXB-Gens. 3.1.2 M. Tay-Sachs Typ AB (OMIM: 272750 (GM2-Gangliosidosis, AB Variant); 613109 (GM2A)) Bereits Ende des 19. Jahrhunderts wurde von Tay (Tay, 1881) und von Sachs (Sachs, 1892) die Erkrankung unabhängig voneinander beschrieben. Es handelt sich um eine angeborene, autosomal-rezessiv vererbte Beeinträchtigung des GM2-Gangliosidabbaus, die von Sandhoff und Harzer von den anderen Gangliosidosen (M. Sandhoff, M. Tay-Sachs Typ B) unterschieden wurde (Sandhoff und Harzer, 1971). Die Erkrankten weisen eine normale Aktivität der Hexosaminidasen A und B auf, jedoch fehlt die Fähigkeit, einen funktionalen GM2Aktivatorkomplex zu formen. Dieser GM2-Aktivator stellt einen wichtigen CoFaktor für den Gangliosidabbau dar, indem er den Transport der Ganglioside 12 ermöglicht. So sind zwar beide Enzyme vorhanden, aber ein Abbau ist dennoch nicht möglich. Wie bei M. Sandhoff kommt es auch bei M. Tay-Sachs Typ AB zu einer Akkumulation in den Lysosomen, vornehmlich in Neuronen. Die klinische und biochemische Ausprägung ist der der klassischen Tay-Sachs-Variante sehr ähnlich (Gravel et al., 2001). Entsprechend sind auch die Therapieoptionen vergleichbar. Das GM2A-Gen befindet sich ebenfalls auf dem kurzen Arm des Chr. 5 und umfasst 4 Exons (NM_000405). Die Größe bemisst sich auf 16kb. Bisher wird zur Diagnose eine Sequenzanalyse durchgeführt. 3.2 M. Schimke (OMIM: 242900 (Schimke Dysplasia); 606622 (SMARCAL1)) M. Schimke wird auch Schimke-Dysplasie oder immuno-ossäre Dysplasie Typ Schimke (Schimke immuno-osseous dysplasia; SIOD) genannt. Es handelt sich um eine seltene (<50 Fälle weltweit) autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung mit verschiedenen Manifestationsorganen. Mutationen im SMARCAL1-Gen (Boerkoel et al., 2002) verursachen M. Schimke, gemäß dem Erstbeschreiber benannt (Schimke et al., 1971). Die genaue Pathologie ist bisher nicht endgültig geklärt. Klinisch kann man von einer Trias aus spondylo-epiphysärer Dysplasie, progressiver Nephropathie und einer Immunopathie im Sinnes eines T-ZellDefektes sprechen. Bei 50% der Betroffenen lassen sich auch neurologische Symptome nachweisen (Lücke et al., 2003). Bereits intrauterin ist Wachstumsretardierung feststellbar. SIOD-Patienten haben eine charakteristische dreiecksförmige Gesichtsdysmorphie. Im weiteren Verlauf kommt es zu Veränderungen am Skelettsystem (dysproportionierter Kleinwuchs, spondyloepiphysäre Dysplasie), an den Nieren (therapieresistentes nephrotisches Syndrom, Niereninsuffizienz), am hämatopoetischen System (Anämie), am ZNS (migräne-ähnlicher Kopfschmerz, Doppelbilder, motorische Aphasie, Hemiparästhesie oder Hemiparesen, die auf transitorische ischämische Attacken (TIA) oder zerebrale Ischämien aufgrund einer frühen generalisierten schweren Arteriosklerose zurückzuführen sind), der Haut (hyperpigmentierte Makulae, multiple Lentigines, (Hypertonie, Stenosen Café-au-lait-Flecken), und Ektasien der des Gefäße) Herz-Kreislauf-Systems sowie zu massiven Veränderungen des Immunsystems (Knochenmarkinsuffizienz). In der Literatur sind zwei verschiedene Verlaufsformen beschrieben, eine schwere und eine milde (Saraiva et al., 1999; Boerkoel et al., 2002). Von schwerer SIOD betroffene 13 Patienten versterben meist in der Adoleszenz (Saraiva et al., 1999; Boerkoel et al., 2000) an schweren Infektionen, Hirninfarkt oder Nierenversagen (Lou et al., 2002). Eine kausale Therapie gibt es nicht. Die symptomatische Therapie besteht aus Infektionsprophylaxe, antihypertensiver Therapie, Thromboseprophylaxe, Dialyse, ggf. Transplantation der Nieren (dabei keine Rekurrenz im Transplantat) sowie hämatopoetischer Stammzellen. Strittig ist die Wirksamkeit der Genotropinbehandlung. Eine Phänotyp-Genotyp-Korrelation besteht, insofern als klinisch schwerer betroffene auf beiden Allelen nonsense-, frameshift- oder splicing-Mutationen des SMARCAL1-Gens aufweisen, wohingegen Patienten mit milden Verläufen eher missense-Mutationen auf jedem Allel zeigen (Boerkoel et al., 2002, Lücke et al., 2003). Ursache der SIOD-Erkrankung sind Mutationen im SMARCAL1-Gen, dessen Genprodukt Bestandteil eines Multiproteinkomplexes ist, der eng mit der Funktion und Struktur des Chromatins verbunden ist. Das Gen befindet sich auf Chr. 2 und umfasst 18 Exons (NM_014140). Bisher sind mehr als 44 verschiedene Mutationen im SMARCAL1-Gen veröffentlicht (Yue et al., 2010). 3.3 M. Canavan (OMIM: 271900 (Canavan Disease); 608034 (ASPA)) Bei M. Canavan, auch spongioforme Leukodystrophie genannt, handelt es sich um eine autosomal-rezessive (Matalon et al., 1988) Stoffwechselstörung der weißen Substanz des Gehirns und des Rückenmarks. Hauptcharakteristikum ist eine schwammartige Veränderung des Gehirns inklusive ödematöser Schwellung. Neurologische Symptome wie Demyelinisierung, Leukodystrophie mit Megalenzephalie, Blindheit und Spastik treten meist in den ersten Lebensmonaten auf (Matalon et al., 1988). Die Betroffenen leiden unter Atonie der Nackenmuskulatur sowie unter Hypotonie und einer Hyperextension der Beine und einer Flexion der Arme. Steht anfänglich noch die Hypotonie im Vordergrund, so kommt es im Verlauf zur Spastik. Seltener kommt es zu einer Fehlanlage des Corti-Organs (Ishiyama et al., 2003). Mit der strukturellen Veränderung der Gehirnsubstanz lassen sich gelegentliche Krampfanfälle erklären. Die durchschnittliche Lebenserwartung beträgt in etwa 18 Monate (http://omim.org „Canavan“). Es lassen sich infantile, kongenitale und juvenile Formen unterscheiden (Adachi at al., 1973). Bereits in der frühen Kindheit erlernte Fähigkeiten (z.B. Kopfhalten, Drehen, Sitzen) werden in den ersten 9 Monaten 14 wieder verlernt und es zeigt sich eine schwerer werdende mentale Retardierung. Generell gehört M. Canavan zu den selteneren genetischen Erkrankungen, die etwas häufiger in der Bevölkerung der Aschkenasi-Juden auftritt. In der Histopathologie lässt sich eine Schwellung der Astrozyten bei gleichzeitig normal aussehenden Neuronen ausmachen (Matalon et al., 1988). Bei dieser Erkrankung lässt sich ein Defekt, meist eine Punktmutation (Kaul et al., 1993), des ASPA-Gens auf dem kurzen Arm des Chr. 17 ausmachen (NM_000049) (Kaul et al., 1994). Das daraus resultierende Fehlen der Aspartoacylase (ASPA, auch Aminocylase-2) führt zu einer Akkumulation von NAcetylaspartat-Säure (NAA, N-acetyl L-aspartic acid) in Blut und Urin, da kein Abbau der N-Acetylaspartat-Säure zu Aspartat und Acetat mehr stattfinden kann (Matalon et al., 1988). Durch die vermehrte Anhäufung von NAA wird die Myelinschicht der Neurone angegriffen. Es kommt zur Degeneration im Sinne einer schwammartigen Auftreibung. Die Diagnosestellung erfolgt durch die Bestimmung von NAA in Urin und Serum sowie durch eine Enzymbestimmung von ASPA in Fibroblasten und durch MRT-Bildgebung. Molekulargenetische Untersuchungen ergänzen die Diagnostik. Durch Boerkoel et al. wurde der Aufbau des ASPA-Gens als aus sechs Exons bestehend beschrieben (Boerkoel et al., 2002). Derzeit sind mindestens 55 Mutationen bekannt. Eine Genotyp-PhänotypKorrelation mit weniger signifikanten NAA-Spiegeln wurden von Janson et al. und von Velinov et al. beschrieben (Janson et al., 2006; Velinov et al., 2008). 4 Material und Methoden 4.1 Historisches und Hintergründe zur MLPA Methode Die multiplex amplifiable probe hybridisation (MAPH) wurde erstmals von Armour et al. beschrieben und stellt die Grundlage der MLPA-Methode dar (Armour et al., 2002). Es handelt sich um ein Verfahren, welches PCR-basierend für die Amplifikation vieler Einzelproben nur ein Primerpaar benötigt. Quantitative Aussagen über mehrere analysierte Gensequenzen konnten nun auf der Grundlage von nur einer Reaktion getroffen werden. Ein weiterer Vorteil liegt in der Zeitersparnis, da in einem Ansatz mehrere Proben untersucht werden können. Die MAPH fand allerdings zunächst keine Verwendung in der diagnostischen Routine. Die Immobilisation der Proben machte das Verfahren kompliziert und fehleranfällig (Schouten et al., 2002). Erst durch die Weiterentwicklung zur MLPA durch Schouten et al. fand dieses Verfahren indirekt einen Eingang in die 15 Routinediagnostik (Schouten et al., 2002). Mittels der MLPA können bis zu 40 Proben zeitgleich und Kosten-Nutzen-effizient untersucht werden. Dabei wird nicht mehr die zu analysierende DNA selbst amplifiziert. Es werden stattdessen den ausgesuchten DNA-Abschnitten komplementäre Sonden untersucht, die an die fraglichen DNA-Abschnitte binden. In den meisten Fällen handelt es sich um exonische Abschnitte. Bei den Sonden handelt es sich um dem jeweiligen DNAAbschnitt komplementäre Teile (jeweils eine linke und eine rechte Sonde), die in einer Ligationsreaktion miteinander verbunden werden. Diese Ligationsreaktion ist Voraussetzung für die Amplifikation der Abschnitte im Verlauf der danach notwendigen PCR. Nach elektrophoretischer Trennung der Amplifikationsprodukte und einer Zuordnung der einzelnen Sonden zu spezifisch festgelegten Längen lassen sich die einzelnen Genomabschnitte identifizieren und quantitativ erfassen. Rückschlüsse auf Veränderungen der Kopienanzahl können folglich getroffen werden. 4.2 Materialien Folgende Materialien wurden in den dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimenten verwendet: • zu untersuchende DNA • final probe mix bestehend aus den einzelnen LPOs und RPOs sowie TE und P200 kit • SALSA® Puffer • TE (TRIS-EDTA) • Ligase 65 • Ligase 65 Puffer A • Ligase 65 Puffer B • SALSA® PCR Puffer • SALSA® Enzyme Dilution Buffer • SALSA® PCR Primer • SALSA® Polymerase • Beckmann Size Standard-400 • SLS (sample loading solution) • pUC 19 (MSP 1 geschnitten) • ALP-BPB Ladepuffer (0,25% Bromphenolblau, 34,5ml Glycerin) 16 Alle Reagenzien wurden über die Firma MRC-Holland (Amsterdam, Niederlande) bezogen bis auf die Oligonukleotidsonden, welche durch Metabion (Martinsried, Deutschland) hergestellt wurden. SALSA MLPA kit P200-A1 Human DNA Reference 1 Eine von MRC-Holland angebotene Zusammenstellung von elf Referenzproben, die Q-Fragmente, ein D-Fragment sowie X- und eine Y-Chromosom-spezifische Kontrollproben, die sich in Testungen als besonders gut geeignet für synthetische Sonden erwiesen hat (www.mlpa.com, SALSA® MLPA® kit P200). Die QFragmente dienen als Kontrolle, ob genügend DNA in der Probe enthalten ist, und die D-Fragmente geben Hinweise auf nicht vollständig denaturierte DNA in den Proben. Die synthetisch hergestellten Proben können sich, durch den P200 Standard begrenzt, nur im Bereich zwischen 88nt und 168nt befinden. Tab. 1: Aufstellung des P200 kit (www.mlpa.com) Länge (nt) SALSA MLPA-Sonde 64-70-7682 Q-Fragmente: DNA-Quantität; nur sichtbar mit weniger als 100ng DNA-Sonde 173 179 184 # 190 196 202 208 214 220 226 233 240 244 250 Referenz-Sonde 03578-L02939 Referenz-Sonde 03139-L02607 D-Sonde 08865-L08987: Schwaches Signal weist auf eine inkomplette Denaturierung hin Referenz-Sonde 09561-L10015 Referenz-Sonde 05371-L04762 Referenz-Sonde 02213-L01217 X-Chromosom-Sonde 05005-L04391 Referenz-Sonde 08172-L08052 Referenz-Sonde 09841-L10251 Referenz-Sonde 09100-L09159 Referenz-Sonde 05737-L05176 Y-Chromosom-Sonde 01071-L00464 Referenz-Sonde 08051-L07832 Referenz-Sonde 08590-L08591 chromosomale Position andere Referenz MV36 * 7q31 14q22 117,09 Mb 54,40 Mb 103,25 Mb 20p13 13q12 20p12 3,84 Mb 19,70 Mb 10,57 Mb 132,50 Mb 13,18 Mb 129,42 Mb 110,91 Mb 13,87 Mb 14,10 Mb 13,82 Mb 17,07 Mb 14q32 Xq26 10p13 12q24 4q25 18q11 Yq11 5p15 17p11 * Abstand zum p-Telomer # Diese Denaturierungs-Warnungs-Sonde kann, wenn für die Methylierungs-Quantifizierung (MSMLPA) verwendet, auch als Aufschlüsselungs-Kontroll-Sonde (bzgl. unzureichender Hha1Aufschlüsselung) verwendet werden. Die Aufschlüsselung der Sonden-Hybride durch Hha1 wird durch die Sonde nicht angezeigt. 17 4.3 Herstellung der synthetischen Sonden Für diese Arbeit wurden insgesamt 38 Sonden hergestellt, die sich wie folgt zusammensetzen: 4 Sonden für die Exons 1-4 des Gens GM2A, 15 Sonden für die Exons 1-14 des Gens HEXB, 19 Sonden für die Exons 1-18 des Gens SMARCAL1. Zunächst wurde auf Basis der einzelnen Exons und Introns nach der Anleitung für die Herstellung von synthetischen Oligos von MRC-Holland jeweils eine linke (LPO) und eine rechte (RPO) Sonde erstellt. Eine Sonde setzt sich jeweils zusammen aus der linken und der rechten Hybridisierungssequenz (LHS und RHS; Stelle der Bindung an die Ziel-DNA) sowie einem von MRC-Holland vorgegebenen F- (5’ GGGTTCCCTAAGGGTTGGA 3’) und R- (3’ TCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC 5’) Primer. So ergibt sich, dass z.B. der LPO am 5’-Ende aus dem F-Primer, einer optionalen stuffer-Sequenz und der linken Hybridisierungssequenz (LHS) inklusive der Ligationsstelle besteht. Die Zusammensetzung der Sonden ist in Abb. 1 erklärt. Abb. 1: MLPA-Sonden-Benennung (in MRC-Holland, Synthetic Probe Design V.12) Als Stuffer-Sequenzen wurden Teilsequenzen des 5’ M13-Sequenzierprimers (Ansorge et al. 1986) verwendet: 5’ Vorwärts-Primer GTAAAACGACGGCCAGT und 5’ Rückwärts-Primer CAGGAAACAGCTATGAC. Die optional einzusetzenden Stuffer wurden verwendet, um die Sondenlänge einer vorgegebenen Position anzupassen. Ausnahmen bildeten Exon 1 des HEXB-Gens und Exon 3 des SMARCAL1-Gens. Ob der Exon-Länge und der jeweiligen Sequenzzusammenstellung wurden für diese beiden Bereiche der Gene zwei Sonden erstellt. Folgende Aspekte galt es bei der Auswahl der Sonden zu beachten: 18 Die Sonden sollten möglichst im Bereich der Exons liegen. Bei Exon 14 des SMARCAL1-Gens war dies wegen der Nukleotidzusammensetzung des Exons nicht möglich und die Ligationsstelle wurde in das Intron 14 verschoben. Jede Sonde (LPO+RPO) musste eine individuelle Länge haben. Die gesamte Sonde setzte sich aus den Längen von LHS und RH sowie 42nt für die beiden von MRC-Holland vorgegebenen Primer (F- und R-Primer) zusammen. Die Sondenlänge durften nur max. 168nt (F-Primer+LHS+RHS+R-Primer) umfassen, da diese durch den von MRC-Holland kommerziell für die MLPA als Kontrolle zur Verfügung gestellten P200-Mix (Länge des kleinsten Referenzwertes 172nt) eingegrenzt wurde. Durch die im P200-Mix enthaltenen Q-Fragmente wurde die Länge der kürzesten Sonde mit mind. 46nt vorgegeben, wobei jedoch die Länge von LPO bzw. RPO die Länge von 21nt nicht unterschreiten sollte. Daraus ergab sich, dass zwei Sätze von Sonden hergestellt wurden. Jeder Satz bestand aus 19 Sondenpaaren (je LPO und RPO). Ein Satz enthielt die Sonden für die Exons der Gene HEXB und GM2A, da sich die Kombination der Gene HEXB und GM2A aus folgenden Gründen als günstig erwies. Einerseits besteht das GM2A-Gen nur aus vier Exons, ein eigenständiger Satz wäre damit nicht Kosten-Nutzen effizient gewesen. Andererseits stellen M. Sandhoff und M. TaySachs Typ AB Differentialdiagnosen dar. Ein zweiter Satz umfasst die Sonden für die Exons des SMARCAL1-Gens. Damit die Banden in der Auswertung sich nicht überschneiden, sollten sich die Sonden in ihrer Länge um mindestens 4nt unterscheiden. Es sollten möglichst keine SNPs im Bereich der Sonden liegen. War dieser Anforderung nicht zu erfüllen, so wurde darauf geachtet, dass der SNP mindestens 21nt von der Ligationsstelle entfernt lag. Eine Ausnahme bildete Exon 6 des SMARCAL1-Gens. Aufgrund der Kürze des Exons war es nicht möglich, eine Ligationsstelle 21nt von einem SNP entfernt zu bestimmen. So wurde zwangsläufig eine Stelle nur 6nt vom SNP entfernt gewählt. Dieser SNP (rs2066518) konnte jedoch toleriert werden, da er laut NCBI (vgl. hierzu http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2066518) bisher extrem selten bei Afroamerikanern und Asiaten nachgewiesen wurde. Die Region der Ligationsstelle sollte sich möglichst in einem AT-haltigen Bereich befinden und auf keinem anderen Chromosom des menschlichen Genoms zu finden sein. Zur Beurteilung wurde die BLAT-Funktion der UCSC Datenbank benutzt. 19 Der G/C-Quotient der LHS und RHS sollte bei etwa 50% liegen. Zur Abschätzung dieses Quotienten wurde das von MRC-Holland empfohlene RAW-Programm genutzt. Eine Überlappung mit anderen Sonden sollte ebenfalls ausgeschlossen sein. Laut Protokoll von MRC-Holland zur Herstellung synthetischer Oligos sollte der Schmelzkurven- (Tm)-Wert einen Wert von 75°C möglichst nicht überschreiten. Teilweise mussten aber auch Tm-Werte der einzelnen Sonden (LPO und RPO) von bis zu 80°C toleriert werden. Zur Bestimmung der Schmelztemperatur (TmWert) der einzelnen Sonden wurde eine RAW-Probe durchgeführt. Das von MRCHolland zur Verfügung gestellte Programm basiert auf einem Algorithmus, um den Tm-Wert zu bestimmen. Der Tm-Wert gibt die Temperatur an, bei der 50% der DNA-Kopien als Doppelstrang und 50% als Einzelstränge vorliegen. Um das Vorhandensein von sekundären Strukturen wie Schleifenbildung der Sequenz der (hairpins) oder Dimeren auszuschließen, wurde die von Northwestern University of Chicago kostenfrei zur Verfügung gestellte Webseite Oligocalc verwendet sowie das ebenfalls kostenfreie MLPA Probe VerificationProgramm. Es wurde darauf geachtet, dass ΔG>0 war, denn für ΔG>0 gilt: Die Reaktion läuft „freiwillig“, d.h. ohne Zuführung von Energie ab (exergone Reaktion). Für ΔG<0 bedarf es einer zusätzlichen Aufwendung von Energie, um die Reaktion anzustoßen (endergone Reaktion). Daher galt es, diesen Zustand zu vermeiden. Das 5’-Ende der RHS musste phosphoryliert sein, wenn eine suffiziente Ligation stattfinden sollte. Diese RPO’s wurden HPLC-gereinigt bestellt, ebenso die LPOs >60nt. Die Proben wurden von Metabion in 100pmol/µl bereitgestellt. 20 Abb. 2: Flussdiagramm zum suffizienten Erstellen synthetischer Oligosonden (Zhi, 2010). 21 Eine Übersicht über die Sondenzusammensetzung bietet Tabelle A1 (im Anhang, S. 38). 4.4 Patientenkohorten Die Kohorten setzen sich aus bereits für die Routinediagnostik untersuchten Patienten zusammen. Sowohl Indexpatienten wie auch deren Familienmitglieder sind den Kohorten zugehörig. Für MLPA-Analysen kamen diejenigen Patienten in Betracht, bei denen in der Routinediagnostik untersuchten Blut- oder DNA-Proben entweder keine Mutation oder nur eine Mutation im homozygoten Zustand oder eine Mutation im heterozygoten Zustand nachgewiesen wurde. Aus der Kohorte der M. Sandhoff-Patienten wurde die MLPA-Analyse bei 23 DNA-Proben angewendet. Bei 12 Patienten mit M. Tay-Sachs Typ AB, bei fünf M. SchimkeProben und bei sechs Patienten aus der M. Canavan-Kohorte wurde die Methode ebenfalls ergänzend zur Routinediagnostik durchgeführt. 4.5 Methodik Im Folgenden werden die eingesetzten Untersuchungsverfahren dargelegt. 4.5.1 MLPA Bei der von Schouten et al. erstmals beschriebenen Methode der MLPA handelt es sich um ein Verfahren, welches sich aus mehreren Arbeitsschritten zusammensetzt (Schouten et al., 2002). Initial wird die zu untersuchende DNA (100ng) erhitzt, sodass sie denaturiert. Anschließend werden die synthetisch hergestellten Sonden, die sich neben TE und dem P200-kit in einem final probemix (FPM), befinden, zusammen mit einem SALSA Puffer zur DNA hinzugegeben. Der BPM (basic probe mix) für den Satz 1 hat ein Gesamtvolumen von 250µl. Dieses setzt sich wiederum zusammen aus 212µl TE und je einem 1µl pro LPO und RPO in einer Konzentration von 0,1µM. Eine Ausnahme bildet Exon 1 des GM2A-Gens, dessen LPOs und RPOs lediglich in einer Konzentration von 0,5µM integriert sind. Das Gesamtvolumen des BPM von Satz 2 beträgt 246µl. Enthalten sind 212µl TE und 1µl pro LPO und RPO, die in folgenden Konzentrationen enthalten sind: Exon 15 in 1µM, Exons 6, 3.2, 13 in 0,5µM, Exons 2, 3.1, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 17, 18 in 0,1µM und Exons 1, 8, 12, 14, 16 in 0,05µM. Der FPM wurde für jede Reaktion neu angesetzt und bestand aus BPM und P200Standard in einem Verhältnis von 1:3. Über den Zeitraum von 16h wird die Probe bei 60°C hybridisiert. Bei diesem Prozess lagern sich die Sonden an die zu untersuchende DNA an. Im nächsten Schritt, der Ligation, kommt es nach Zugabe 22 von Ligase 65 und den beiden Ligase-Puffern A und B zur Verbindung der beiden Sonden an den dafür bestimmten Ligationsstellen (15 min bei 54º C und dann 5 min bei 98ºC). In der anschließenden PCR kommt es zur Amplifikation der zu untersuchenden Proben (40 Zyklen). Mittels Agarosegelelektrophorese wird die Ligation überprüft. Im Beckman CEQ 8000 werden für die Fragmentanalyse die Proben per kapillärer Elektrophorese (Beckmann CEQ 8000-Einstellungen: Capillary (50º C), Denaturierung (90º C, 120sek), Injektion (2,0kV, 60sek), Separation (4,8kV, 35min)) vereinzelt. Dazu werden 2µl des PCR Aliquods jeweils mit 37,5µl SLS und 0,5µl size standard 400 (Beckman Coulter Inc., USA) vermischt und mit dem Standardprogramm analysiert. In jedem Untersuchungslauf waren eine positiv- (HEXB-Deletion der Exons 1-5) und drei negativ-Kontrollen integriert, um eine Referenz für die Auswertung mitzuführen. Abb. 3: Arbeitsschritte der MLPA (www.mlpa.com) 23 4.5.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Agarosegelelektrophorese Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ist ein Verfahren, das zur Vervielfältigung eines definierten DNA-Fragments dient. Als Substrate werden isolierte DNA, hitzestabile Taq-Polymerase und zwei der DNAStelle komplementäre Primer verwendet. Das Grundprinzip der PCR besteht aus drei Phasen: Der Denaturierung (durch Hitzeeinwirkung wird die DNA in Einzelstränge aufgetrennt), der Annealing-Phase (Bindung der Primer an die DNA) und der Amplifikation (Vermehrung des spezifischen DNA-Stücks). Meist folgt diesem Schritt die Agarosegelelektrophorese. Die DNA wird auf ein Agarosegel aufgetragen, welches von einem TBE-Puffer umgeben und an einen Spannungsgeber von 220V angeschlossen ist. Durch die Spannung wandern die DNA-Fragmente hin zur Anode. Da große Fragmente schneller als kleine wandern, lassen sich die nun aufgetrennten Fragmente nach einer Anfärbung im EtBr-Bad unter UV-Licht als Banden sichtbar machen. Zur Größenbestimmung des DNA-Fragments wird ein pUC-Marker mitgeführt. 4.5.3 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse Der Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus resultiert aus unterschiedlichen DNA-Sequenzen homologer DNA-Abschnitte, die ursprünglich durch Mutationen bzw. SNPs verursacht sein können. Durch den Einsatz von Restriktionsenzymen macht die RFLP-Analyse solche Unterschiede evident. Restriktionsenzyme schneiden Doppelstrang-DNA an typischen Basen-Sequenzen hochspezifisch, sodass bei Verwendung eines speziellen Enzyms ein typisches Muster verschieden großer Fragmente entsteht, welches mittels Gelelektrophorese dargestellt werden kann. Veränderungen der Ursprungssequenz durch Mutationen oder SNPs können das Schneiden des Enzyms verhindern. Andererseits kann so eine Veränderung in einem anderen DNA-Abschnitt eine neue Zielsequenz für das Restriktionsenzym herstellen. So entsteht ein spezielles Schnittmuster, das auf das zugrunde liegende Allel rückschließen lässt. 4.6 Datenanalyse Zur Fragmentlängenanaylse wurde das Beckman Coulter-System und zur Analyse der Daten die CEQ-Software verwendet. Um eine probenspezifische Analyse der Kopienanzahl durchzuführen, wurde eine Excel-Auswertetabelle nach den Vorgaben von Schouten et al. und Yau et al. verwendet (Schouten et al., 2002; Yau et al., 1996). Die detaillierten Formeln sind bei Wildförster und Dekomien zu 24 finden (Wildförster und Dekomien, 2009). Bei der Datenanalyse bilden die Kontrollproben des P200-kit 14 Banden im Bereich zwischen 173nt und 250nt. Die oben beschriebenen Q-Fragmente bilden die Banden 64, 70, 76 und 82. Die Proben wurden gegen die Negativkontrollen und diese wiederum gegen den P200 Standard gerechnet. Werte unter 0,35 wurden als Deletion im homozygoten Zustand, Werte zwischen 0,36 und 0,65 als Deletion im heterozygoten Zustand gewertet. Werte zwischen 0,8 und 1,2 wurden als Normalzustand, Werte zwischen 1,3 und 1,7 als Duplikation im heterozygoten Zustand gewertet. 4.7 Verifikation der gefundenen Mutationen Sofern es zu Basenpaaraustauschen direkt an der Ligationsstelle kommt, kann es zu einer Verhinderung der Ligation kommen, welche daraufhin in der Auswertesoftware fälschlicherweise als Deletion im homozygoten Zustand angezeigt wird. Um solchermaßen falsche Resultate auszuschließen, wurden alle Fälle, in denen scheinbar ein Exon deletiert war, noch einmal mittels Sequenzanalyse nachuntersucht. Auf diese Weise ließ sich eine tatsächliche Deletion bestätigen. 4.8 Software RAW-Probe (Download von der MRC-Holland Webseite (http://www.mlpa.com)) Version 0.15ß ist ein Programm der Firma 2000 RAW-Soft, mit welchem sich die Längen der synthetischen Oligosonden sowie der Tm-Wert und der jeweilige G/CGehalt bestimmen lassen. 4.9 Datenbanken • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ Pubmed ist eine Datenbank der nationalen medizinischen Bibliothek der USA (U.S. National Library of Medicine; NML). In dieser Datenbank befinden sich Auswertungen von mehreren Tausend medizinischen Fachzeitschriften aus der ganzen Welt, welche bis in die frühen fünfziger Jahre zurück reichen. • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim Ebenfalls von der NML betrieben wird die Online Mendelian Inheritance in Men (OMIM) Datenbank, in der über 12.000 Gene und genetische Erkrankungen erfasst und kurz beschrieben sind. Es besteht eine Kooperation mit der Johns Hopkins University, Baltimore, Maryland. Die Datenbank wird täglich aktualisiert. 25 • http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Das National Center for Biotechnology Information (NCBI) ist eine weitere Datenbank, welche von der NML betrieben wird. Diese Datenbank bietet molekularbiologische und biomedizinische Informationen und Software zur Analyse genomischer Daten wie z. B. zur Bestimmung von SNPs. • http://genome.cse.ucsc.edu/ Diese frei zugängliche Datenbank wird von der University of California Santa Cruz (UCSC) zur Verfügung gestellt. Bei dem Human Genome Working Draft handelt es sich um eine Datenbank, die verschiedene Programme zur Genomanalyse beinhaltet. Es findet sich u.a. eine BLAT-Funktion, sowie ein Genombrowser. • http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html Mit diesem von der Northwestern University of Chicago entwickelten Programm, dem Oligo Calc: Oligonucleotide Properties Calculator, lassen sich z. B. synthetische Oligonukleotide auf sekundäre Strukturen wie hairpins oder Dimere untersuchen. • http://bioinform.arcan.stonybrook.edu/mlpa2/cgi-bin/probeCheck.cgi Dieses Programm der Bioinfomatics Core Facility, Stony Brook University nennt sich MLPA Probe Verification und dient als Unterstützung bei der Verifizierung der synthetischen Oligonukleotide. Mit seiner Hilfe lassen sich potentielle Dimere herausfinden. 5 Ergebnisse und Diskussion Ziel dieser Promotionsarbeit war es, das Deletionsscreening für die drei Gene HEXB, GM2A und SMARCAL1 zu etablieren. Bislang erfolgte die Diagnostik der Erkrankungen M. Sandhoff, M. Tay-Sachs Typ AB und M. Schimke mittels Sequenzanalyse, was zu möglichen Fehlinterpretationen des Genotyps führte, wenn zusätzlich größere Deletionen oder Insertionen der Grund für die Krankheitsentstehung sind. Für kleinere Veränderungen (Punktmutationen, kleine Deletionen oder Insertionen) stellt die Sequenzanalyse ein probates Diagnostikum dar. Größere Deletionen/Duplikationen außerhalb der Primerbindestellen werden durch die Sequenzanalyse und die für ein Vorscreening genutzte DHPLC (denaturing high-performance liquid chromatography) möglicherweise nicht 26 erkannt. MLPA ist eine Methode, die sich zum Nachweis von CNVs in der Humangenetik RUB bereits bewährt hat (Wildförster und Dekomien, 2009) und als eine diagnostische Ergänzung eingesetzt werden kann. Für die Etablierung dieser Methode war von großer Bedeutung, dass die hergestellten Sonden in jedem Fall ein interpretierbares Produkt in der Fragmentanalyse lieferten. Nur selten konnte ein Fragment nicht dargestellt werden. Dieses konnte nach Korrektur der Ligationsstelle einer Sonde, durch Verschieben der Sondensequenzen, auch gewährleistet werden. Im Verlauf zeigte sich die MLPA-Analyse als zuverlässiges Instrument, um besonders Deletionen aufzuspüren. Im Rahmen der M.Sandhoff-Diagnostik, bevor die MLPA etabliert war, wurde mittels Real-Time-PCR im Exon 1 des HEXB-Gens eine Deletion im heterozygoten Zustand ermittelt. Diese konnte mit der MLPA-Analyse im Mehrfachansatz nicht bestätigt werden und ist somit als falsch positives Ergebnis der Real-Time-PCR zu werten. Aus diesem Fall lässt sich schließen, dass positive Ergebnisse mit einer alternativen Methode überprüft werden sollten. Aus der 73 Patienten umfassenden M. Sandhoff-Kohorte wurden mittels MLPAMethode 23 Patienten nachuntersucht. Alle Proben waren mittels Exonspezifischer Sequenzierung des HEXB-Gens bereits im Rahmen der Routinediagnostik voruntersucht. Dabei wurden insgesamt fünf bereits bekannte und 12 bislang unbekannte Mutationen und einige SNPs gefunden (siehe Tabelle 2 und 3). Mit etwas über einem Prozent liegen die SNPs rs41271747 in Exon 2, rs10805890 in Exon 4/5 sowie c.1614-14C>A in Exon 14 in der Kohorte vor (vgl. Tabelle 3). Der am häufigsten gefundene SNP ist rs1665894 in Exon 4/5 mit einem Auftreten von 8,7% in der Kohorte. In zwei Fällen waren DNA-Qualität und Quantität nicht ausreichend, um valide Ergebnisse zu generieren. Die MLPA ist nur mit guter DNA-Qualität durchführbar und auswertbar. Bei Verunreinigungen oder degradierter DNA sind die Gipfelhöhen während der Fragmentanalyse uneinheitlich und nicht reproduzierbar, so dass es zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse kommen kann. 27 Tab. 2: Übersicht über die gefundenen HEXB-Mutationen (Es handelt sich um eine stellenweise korrigierte Version der in der Veröffentlichung (Sobek et al., 2013) abgedruckten Version.) Index -ID cDNA Protein veröffentlicht Variation Art der Mutation 1 c.[552T>G] + c.[552T>G] p.Tyr184* - rs1665894 Stopp- 2 c.[1509-26G>A] + c.[1509-26G>A] p.Trp503_Pro5 04ins8 Nakano und Suzuki; Mitsuo et al. rs1665894 missense- 3 c.[1514G>A] + c.[1514G>A] p.Arg505Gln Bolhuis et al. rs1665894 missense- 4 c.[1509-26G>A] + c.[1509-26G>A] p.Trp503_Pro5 04ins8 Nakano und Suzuki; Mitsuo et al. rs1665894 Insertion 5 c.[850C>T] + c.[117_669del] 6• c.[1078T>C] + c.[=] 7• c.[-117_669del] + c.[=] 8 c.[851G>A] + c.[851G>A] 9 c.[902-2A>G] + c.[902-2A>G] 10 c.[850C>T] + c.[1597C>T] 11 c.[1538T>C] + c.[1538T>C] 12 13 14 15 c.[1242G>A] + c.[117_669del] c.[289G>C] + c.[289G>C] c.[1058_1060delG AG] + c.[1484_1486dupC AA] c.[15797C>T] + c.[15797C>T] rs11556045, rs35711978, Zampieri et al. rs1665894, c.1614-14C>A rs41271747, rs1756100, p.Cys360Arg c.150964_1509_65insT CTAA rs41271747, p.? rs1665894, c.1614-14C>A rs1665894, p.Arg284Gln Wortmann et al. rs10805890 rs1665894, p.? rs10805890, rs35491723 rs35711978, p.Arg284* + Zampieri et al.; rs11556045, p.Arg533Cys Kaya et al. rs1665894 rs1665894, p.Leu513Pro c.1508+50C>G rs1665894, p.Leu453Phe*2 rs1665894, + p.? c.1614-14C>A rs1665894, p.Ala97Pro rs10805890 p.Arg284* + p.? Stopp-, Deletion missense- Deletion missenseSpleißStopp-, missensemissenseStopp-, Deletion missense- p.Gly353del + p.Thr496dup - rs1665894 Deletion, Duplikation p.Arg533Cys Kaya et al. rs1665894 missense- 28 Tab. 2: Fortsetzung Index -ID cDNA veröffentlicht Variation Art der Mutation 16 c.[1243-3T>G] + c.[1243-3T>G] p.? - rs35711978, rs11556045, rs1665894, rs141762746 Spleiß- 17 c.[850C>T] + c.[850C>T] p.Arg284* Zampieri et al. rs1665894 Stopp- 18 - - - rs41271747, rs1665894 19 c.[850C>T] + c.[850C>T] p.Arg284* Zampieri et al. rs1665894 Stopp- 20 c.[884C>G] + c.[1507T>C] p.Thr295Arg + p.Trp503Arg - rs6236821, rs1665894, rs10805890, rs35491723 missense- 21 c.[902-2A>G] + c.[902-2A>G] p.? - p.? - 22 Protein c.[-117_669del] + c.[-117_669del] Spleiß- c.1614-14C>A Deletion rs41271747, c.300-46T>A, 23 rs1665894, rs17561000 • Familienmitglieder eines bereits an M. Sandhoff verstorbenen Kindes. Tab. 3: Übersicht über die gefundenen HEXB-Variationen Exon Beschreibung rs-Nummer Allelfrequenz 1 c.165G>A; p.Ala55= rs62368217 0,04 2 c.300-46T>A rs41271747 0,11 2 c.300-32C>T rs35711978 0,09 2 c.362A>G; p.Lys121Arg rs11556045 0,07 4/5 c.619A>G; p.Ile207Val rs10805890 0,15 4/5 c.558+45G>A rs1665894 0,87 7 c.772-4A>G rs17561000 0,04 29 Tab. 3: Fortsetzung Exon Beschreibung rs-Nummer Allelfrequenz 12-13 c.1508+50C>G - 0,04 14 c.1614-14C>A - 0,11 14 c.1614-66A>C rs141762746 0,04 14 c.*81_*82delTG rs35491723 0,07 14 c.1509-64_1509-65insTCTAA - 0,02 - rs-Nummer unbekannt Bei drei Indexpatienten wurde eine Deletion der Exons 1-5 (c.-117_669del; Bikker et al., 1989; Neote et al., 1990) des HEXB-Gens ausgemacht. Daraufhin wurden sieben Familienmitglieder untersucht, bei denen diese Deletion ebenfalls bestätigt werden konnte. So konnte diese Deletion in 43% der untersuchten Fälle zusätzlich zu einer zweiten, vermutlich pathogenen Mutation nachgewiesen werden. In jedem dieser Fälle lag zudem in mindestens einem Allel ein Nukleotidaustausch im Intron 13 vor (c.1614-14C>A). So konnten die Deletion der Exons 1-5 und die c.1614-14C>A Variation in einen direkten Zusammenhang gebracht werden (Sobek et al., 2013). Dieser Basenaustausch im Intron 13, der bereits in der Routinediagnostik aufgefallen war, wurde in der Literatur bisher noch nicht beschrieben. Bei einer RFLP-Analyse in einer Kontrollgruppe von 200 Personen konnte dieser Basenaustausch nicht nachgewiesen werden. Nachdem bereits Spleißmutationen für Intron 12 des HEXB-Gens bekannt sind (Nakano und Suzuki, 1989), wurde eine RNA-Analyse durchgeführt, um festzustellen, ob die c.161414C>A Variation den normalen Spleißvorgang beeinträchtigt. Jedoch konnte keine Beeinflussung des Spleißens festgestellt werden. Eine weitere Hypothese ist, dass diese Variation mit einer Mutation, die in einem kritischen regulatorischen Element lokalisiert ist oder mit einer größeren Deletion gekoppelt ist. Erst mittels der entwickelten MLPA-Analyse konnte die Kopplung der Intron 13 Variante mit einer großen Deletion bestätigt werden. Eine Untersuchung der Deletions-Bruchpunkte mittels DNA-Sequenz- und Restriktionsanalysen konnte eine Lokalisation innerhalb zweier Alu-Elemente, die bereits von Neote et al. beschrieben wurde (Neote et al., 1990), bestätigen. Die 16kb umfassende Deletion der Exons 1-5 wurde von Neote et al. vornehmlich bei Franzosen und kanadischen Franzosen 30 gefunden (Neote et al., 1990). Die Vermutung lag nahe, dass diese Mutation über eingewanderte Hugenotten verbreitet wurden. In der M. Sandhoff-Kohorte, die dieser Arbeit zugrunde lag, wurde die gleiche Deletion in deutschstämmigen Patienten nachgewiesen. Ein Gründereffekt erscheint daher sehr wahrscheinlich. Diese These kann bisher allerdings nicht untermauert werden, da außer den Hausnamen keine detaillierten Informationen über die Abstammung der Familien zur Verfügung stehen. Aus der 16 Patienten zählenden Kohorte der M. Tay-Sachs Typ AB-Patienten wurden mittels MLPA-Methode 12 Patienten getestet. Es wurden jedoch keine weiteren Deletionen oder Insertionen festgestellt, sodass die MLPA-Analyse zwar eine Komplettierung der Routinediagnostik darstellte, aber den Patienten keine Erklärung für ihre Krankengeschichte liefert. In der M. Schimke-Kohorte konnten aus fünf Indexpatienten mit klinischen Symptomen nur bei drei Patienten Mutationen mittels der Sequenzanalyse nachgewiesen werden. In den anderen zwei Fällen konnten lediglich SNPs festgestellt werden. Die durchgeführte MLPA-Analyse ergab jedoch keinen Hinweis auf Abweichungen von der normalen Kopienzahl. Für die Untersuchung auf M. Canavan wurden sechs Proben ergänzend zur Routinediagnostik mit der MLPA-Methode untersucht. Eine bereits bekannte Deletion des Exons 5 wurde bestätigt, aber keine weitere Deletion oder Insertion identifiziert. Für die Validierung wurden die Ergebnisse aus den Untersuchungen der Gene HEXB, GM2A und SMARCAL1 mit den Resultaten aus der ASPAAnalyse verglichen. Dazu ist festzuhalten, dass die Darstellung der Gipfelhöhen des kommerziell erhältlichen Untersuchungssets gleichmäßiger war und somit die gewonnenen Ergebnisse eine etwas größere Konstanz in der Reproduzierbarkeit aufwiesen. Allerdings kam es trotz des etwas uneinheitlichen Bildes bei der selbst etablierten MLPA unterschiedlichen zu Läufen einem charakteristischen reproduzierbar war. Muster, Beim welches in kommerziellen Untersuchungsset kam es bei der Auswertung nur in einem geringeren Maße zu einer größeren Genauigkeit. Somit ist auch das selbst etablierte MLPAUntersuchungsset mit synthetischen Oligosonden für die Diagnostik sicher einsetzbar. 31 6 Literaturverzeichnis Adachi, M., Schneck, L. und Cara, J. (1973). Spongy degeneration of the central nervous system (Van Bogaert and Bertrand type; Canavan’s disease). A review. 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Exon Position auf Chr. 5 LPO (5'-3') HEXB 1.1 HEXB 1.2 HEXB 2 HEXB 3 HEXB 4 HEXB 5 HEXB 6 HEXB 7 HEXB 8 HEXB 9 73981141-73981186 73981291-73981343 73985234-73985312 73989455-73989529 73992479-73992603 73992879-73992962 74001014-74001113 74009336-74009418 74011350-74011466 74012365-74012471 HEXB 10 HEXB 11 HEXB 12 HEXB 13 HEXB 14 GM2A 1 GM2A 2 GM2A 3 GM2A 4 74014069-74014173 74014677-74014756 74016239-74016329 74016486-74016555 74016951-74017015 150632671-150632731 150639298-150639348 150646325-150646381 150646928-150646988 TGGCGACACTGCTGGCGGCGAT GTAAAACGACGGCCAGTTGCTGCATCTCGCCCCGGAGAACTTC TCTTGTCTCAATCACCCTTCAGTCAGAGTGTG TCAATACAGATACTTTACTTGTGAAAGAACCAGTGGCTGTCCTT TGATTTATAAATTAATGCAATAAATTTTACTTTCCTCAGGTTTAGAGACCTTTAGCCAGTTAGTTT GTAAAACGACGGCCAGTTGATTGATACATCCAGACATTATCTGCCAGTT TAAATAATTTTTAAATATGTTTGCTTGCAGGATGCCATGGCTTTTAATAAGTTTA CTATTCTTTGTCTCATGTTTATACACCAAATGATGTCCGTATGGTG TGACTCCATGTTACAGTAGACAAAACAAGTTGGACTCTTTTGGACCTATA AAACGACGGCCAGTTGAGCATATCAAACTTCTAATGAAATTTTAATCACTTTTTGCTTCAGGGAATCAA ATCCAA TGTTAAGCTTATGATCTAAAATAACTATAATTTTTTTGTAATACTAGGGTTTTGGATATTATTGCA GTAAAACGACGGCCAGTTCAGTAGAGTCACAGCATCTGGCTTCCCTGTAA TGATTTTAATTTAGGTACTCAGAAACAGAAACAACTTTTCATTGGTGGAG TGGTGAGAGACTCTGGAGTTCCAAAGATGTCAGAGAT TAGCTGCACAACCTCTTTATGCTGGATATTG CAGTGACTGGACTCAGCTTCTTTGCGTA CTGCCTGATTGTCCCCAGCCA CTCTGGATCAAGATCCCATGCACAGAC GTAAAACGACGGCCAGTGAACTACCGCATAGAGAGCGTCCTGAGCAGCA 39 Tab. A1: Fortsetzung Exon Position auf Chr. 5 RPO (5'-3') HEXB 1.1 HEXB 1.2 HEXB 2 73981141-73981186 73981291-73981343 73985234-73985312 GTTGGCGCTGCTGACTCAGGTGGC TACATCAGCCACAGCCCCAATTCCACGCAGGAAACAGCTATGAC ATGCTTTCCCCAACATATCTTCAGATGAGTCTTGTAAGTACCTATGC HEXB 3 HEXB 4 HEXB 5 HEXB 6 73989455-73989529 73992479-73992603 73992879-73992962 74001014-74001113 AAGGCCAACAGAGTTTGGGGAGCATTACGAG ATCAAGATTCTTATGGAACTGGTAAGTATGATTATTATATGTTACTAAAAATTGTTAGAC AAGATTATTCTTAAAACTCTGGTAAGTAATTACTTCATTCTAATCTGTTGTCCAGGAAAC ATGTTCTTCACTGGCACATAGTTGATGACCAGTCTTTCCCATATC HEXB 7 HEXB 8 HEXB 9 HEXB 10 74009336-74009418 74011350-74011466 74012365-74012471 74014069-74014173 ATTGAATATGCCAGATTACGAGGAATTCGAGTCCTGC AACCCTACTCTGAATACAACATACAGCTTCCTTACTACATTTTTCAAAGAAATTAGTGAGGTGTTTC AAATTCAAGATTTCATGAGGCAAAAAGGCTTTGGCACAGATTTTAA ACCATAAACAAGGGATCCATTGTCTGGCAGGAGGTTTTT HEXB 11 HEXB 12 HEXB 13 HEXB 14 74014677-74014756 74016239-74016329 74016486-74016555 74016951-74017015 TCCTTTCTGCTCCTTGGTACTTAGATTTGATTAGCTATGGACAAGATCAGGAAACAGCTATGA AAGCTTGTCTATGGGGAGAATATGTGGATGCAACTAACCTC ATGGATGACGCCTATGACAGACTGACAAGGCAC TAACCATGAGAACATGTAAAAAATGGAGGGGAAA GM2A 1 GM2A 2 GM2A 3 150632671-150632731 150639298-150639348 150646325-150646381 ACCAATACTGGAAGGCATTTAAAGGCACCTCTG TCCCAGCTCAGTAGCTTTTCCTGGGATAAC TACATTGGCAGCTGTACCTTTGAACACTTC GM2A 4 150646928-150646988 GTGGGAAGCGTCTGGGCTGCATCAAGATCCAGGAAACAGCTATGAC 40 Tab. A1: Fortsetzung Exon Position auf Chr. 2 SMARCAL 1 SMARCAL 2 SMARCAL 3.1 SMARCAL 3.2 SMARCAL 4 SMARCAL 5 SMARCAL 6 SMARCAL 7 SMARCAL 8 SMARCAL 9 SMARCAL 10 SMARCAL 11 SMARCAL 12 SMARCAL 13 SMARCAL 14 SMARCAL 15 SMARCAL 16 SMARCAL 17 SMARCAL 18 217277336-217277388 217278548-217278629 217279613-217279694 217279883-217279954 217280935-217281026 217285171-217285255 217288343-217288388 217293443-217293513 217297564-217297617 217300151-217300228 217303109-217303195 217311796-217311865 217315682-217315731 217329335-217329408 217332752-217332821 217340121-217340183 217341864-217341917 217342940-217343018 217347430-217347530 LPO (5'-3') CCAGTGGGGGCGAATGTGGCTCGCGTT TGGGAGGCTAATGCTTTTTTCCTTCTTCTAGGTTGGAAAAAGACTATGT GTAAAACGACGGCCAGTTAAGCCAGTGAGCCATGGTGTCATTTTCAAGCAACAGA GACGGCCAGTTGAGATCAGGTTCACACCCTTTGCTAACCCAACTCAT GTAAAACGACGGCCAGTTAAGTACAAATTGTCAACAGTCATCAGTCCTCTGTTTTGTTTCAGATCCTG AACGACGGCCAGTATCTCCAGGGCCTACTTCGAGGCAGACATCAGTTA CTTGTCATTGCAGATGTCAAGAC AACGACGGCCAGTCCTTTCTGAAGTGGACCCCAAGCTCGTGTC CGGCCAGTATCCTCCGTGCGCTTCACCTGGGAG ATTGTCAGCTTTGACCTTCTTAGCAAGTTGGAAAAACAGCTA GATCTTGTACACTTATGTGGCTACTTCTTTTCAGGATGAATCTCACTTCCTC AACGACGGCCAGTAGCTCTACACGCAGATCATCGCAGTCAAGCCAACTT TGCCAAGCAGCGCAAGATAGTGGTGAT GATGCCCTCATTCTCTTCTTCAACAGAACAGCTGAAGCTA CAAGAGCTTGAGAGAAAGGTGAGCTCCCTTTGAA AGTACCTTCTCCTCGGCTGACCTGGTGGTGTT CATTGGACAGACCAGCTCCGTGGGCAT TAAAACGACGGCCAGTAGAAGATTAAAGTTCTGGCAGAAGCCGGGCTTTCTGAG TTTTATCTTTTGTTTTCTTTCTCTGATGAAGGACCCAAAGCAGCAGAAGATCTAC 41 Tab. A1: Fortsetzung Exon SMARCAL 1 SMARCAL 2 SMARCAL 3.1 SMARCAL 3.2 SMARCAL 4 SMARCAL 5 SMARCAL 6 SMARCAL 7 SMARCAL 8 SMARCAL 9 SMARCAL 10 SMARCAL 11 SMARCAL 12 SMARCAL 13 SMARCAL 14 SMARCAL 15 SMARCAL 16 SMARCAL 17 SMARCAL 18 Position auf Chr. 2 217277336-217277388 217278548-217278629 217279613-217279694 217279883-217279954 217280935-217281026 217285171-217285255 217288343-217288388 217293443-217293513 217297564-217297617 217300151-217300228 217303109-217303195 217311796-217311865 217315682-217315731 217329335-217329408 217332752-217332821 217340121-217340183 217341864-217341917 217342940-217343018 217347430-217347530 RPO (3'-5') CTAGGCCTCCCTGGGTGAGAAAGTGGTAGAC TAGCAAGTGTCACGCCATGGTATGTGGTTGGTT ATCTCAGTAGCTCATCTAATGCTGACCAAAGACCTCATGATTCCCAGGAAACAGCTATGAC AAGCCTCTGGCCAAACCAAAGAGTTCCCAAGAGACCAGGAAACA ACACCAAGACGTGGAACTTCAGCATGAATGACTATAGTGCCCAGGAAACAGCTATGAC TTCACAGGACCTTATTGCGCTTTTTAAACAGATGGATTCCAGAAGATATGCAGGAAACAGCTA CAGGAAGTGGAGCTTTCTCTTGG TAATCTGATGCCCTTTCAGAGAGCTGGAGTCAAGTAGGTTCCAGGAAACAGCT CAGGTTAATGGTCTTCAAATTGCAGTTTT AAAACCCCTTTTAAAGTTGTCATCATTGTAAGAAAC AAAAACAGTAGGACTGCCCGCTGTCGAGCAGCTAT TCTTCCCCCAGTTTCATGCCTTTGGACTTCGCTACAG TGCCCCAGGACGGATCAATGCCA AAATCCCATCTGTCATGTAAGTGGTCACTAAGTG ATTCACCATGGGCTACTTTTGCCATGTCCCAAGTTG TGCTGAGCTGTTTTGGAACCCAGGGGTAAGAGAC TCACTACCTCGTGGCAAAGGGCACAGC ACCAATTTTTCAGAAATGACAGAATCCACTGATTACCTCTACAGGAAACAGC GACCTATTCCAGAAGTCCTTTGAGAAAGAAGGAAGTGATATGGAGC Die Ligationsstelle ist blau, Teile des M13-sequencing primers grün und SNPs sind rot markiert. 42 Danksagung Die vorliegende Arbeit entstand mit maßgeblicher Unterstützung durch die Heinrich und Alma Vogelsang Stiftung, der ich zu großem Dank verpflichtet bin. Ich möchte darüber hinaus allen, die an der Entstehung dieser Arbeit beteiligt waren, herzlich danken. Besonders hervorzuheben sind: Herr Prof. Dr. Jörg T. Epplen, der mir die Möglichkeit der Promotion an seinem Lehrstuhl eingeräumt hat, und mich stets zu wissenschaftlichem Denken angeregt hat. Frau Dr. Gabriele Dekomien, die nie müde geworden ist, sich meinen Problemen zu stellen und mich stark dabei unterstützt hat, die großen und kleineren Hürden dieser Arbeit zu meistern. Frau Michaela Hagedorn und Frau Manuela Meyer, die mir eine große Hilfe bei der Laborarbeit waren. Ebenfalls gilt mein Dank dem gesamten Team des Lehrstuhls für Humangenetik der Ruhr-Universität für die stets freundliche Atmosphäre und das Beantworten sämtlicher Fragen. Mein ganz besonderer Dank gilt meinem Mann Martin, der mich in jeder Hinsicht unterstützt und immer wieder ermutigt hat. Zuletzt möchte ich die Pippertiervirtuosin Carolin Andrea Husmann hervorheben, durch die ich tägliche Aufheiterungen und Motivation erfahren habe. Lebenslauf Anna Kathrin Ulrike Sobek Persönliche Daten Geburtsdatum 06. Juni 1985 Geburtsort Solingen Beruflicher Werdegang seit 01.2013 Assistenzärztin in der Frauenklinik am Marienhospital Witten 10.2012 – 12.2012 Assistenzärztin in der Frauenklinik am Marienhospital Gelsenkirchen 08.2010 – 07.2011 Praktisches Jahr im Marienhospital Witten und an der Rosalind Franklin University, Mount Sinai Hospital, Chicago, USA Hochschulbildung seit 01.2012 Anfertigung einer Dissertation am Lehrstuhl für Humangenetik an der Ruhr-Universität Bochum 10.2008 – 09.2012 Studium der Philosophie an der RuhrUniversität Bochum; Abschluss: Baccalaurea Artium (B.A.) (Note: sehr gut) 10.2005 – 12.2011 Studium der Human-Medizin an der Ruhr-Universität Bochum; Abschluss: Staatsexamen (Note: sehr gut) 10.2004 – 09.2005 Studium der Chemie an der RuhrUniversität Bochum Schulbildung 08.2001 – 01.2002 Auslandsaufenthalt in Chicago, IL, USA; Besuch des St. Ignatius College Prep. 08.1995 – 06.2004 Besuch Witten; des Ruhr-Gymnasiums Abschluss: in Allgemeine Hochschulreife (Note: 1,7) Stipendien 01.2012 – 09.2012 Promotionsstipendium der Heinrich und Alma Vogelsang Stiftung, Bochum 02.2010 – 04.2010 PROMOS Stipendium des DAAD für Auslandstertial in Chicago, USA im Rahmen des praktischen Jahres Veröffentlichungen Sobek, A. K. U., Evers, C. und Dekomien, G. (2013). Integrated multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA) assays for the detection of alterations in the HEXB, GM2A and SMARCAL1 genes to support the diagnosis of Morbus Sandhoff, M. Tay-Sachs variant AB and Schimke immuno-osseous dysplasia in humans. Molecular and cellular probes 27(1), 32–37. Posterpräsentation im Rahmen der 24. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Humangenetik gemeinsam mit der Österreichischen Gesellschaft für Humangenetik und der Schweizerischen Gesellschaft für Medizinische Genetik mit dem Titel „MLPA assay for HEXB and GM2A genes“ im März 2013 in Dresden. Bochum, November 2013 Publikation Sobek, A. K. U., Evers, C. und Dekomien, G. (2013). Integrated multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA) assays for the detection of alterations in the HEXB, GM2A and SMARCAL1 genes to support the diagnosis of Morbus Sandhoff, M. Tay-Sachs variant AB and Schimke immuno-osseous dysplasia in humans. Molecular and cellular probes 27(1), 32–37.
