Orale Fumarsäureester-Therapie bei schubförmig

________________________________1______________________________
Aus der Neurologischen Klinik
der Universitätsklinik St. Josef-Hospital
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. H. Przuntek
Orale Fumarsäureester-Therapie bei schubförmig-remittierender Multipler Sklerose
-Klinische und Immunologische Ergebnisse-
Inaugural-Dissertation
Zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Nils Brune
aus Essen
2002
________________________________2______________________________
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. H. Przuntek
Korreferent:
Prof. Dr. med. W. Gehlen
Tag der mündlichen Prüfung:
12.11.02
________________________________3______________________________
Inhaltsverzeichnis
VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN ...............................................5
1.0 EINLEITUNG.....................................................................................................................6
1.1 DIE GESCHICHTE DER MS ..................................................................................................7
1.2 KLINISCHES KRANKHEITSBILD DER MS ..............................................................................7
1.2.1 Verlaufsformen der MS..............................................................................................7
1.2.1.1 Schubförmig-remittierender Verlauf (SRMS)...........................................................8
1.2.1.2 Chronisch-progredienter Verlauf (PPMS, SPMS) .....................................................8
1.2.1.3 Benigne/Maligne MS..............................................................................................9
1.2.2 Altersverteilung bei Krankheitsbeginn.........................................................................9
1.2.3 Typische Symptome der Erkrankung ...........................................................................9
1.2.3.1 Frühsymptome .......................................................................................................9
1.2.3.2 Symptome während des Krankheitsverlaufs ........................................................... 10
1.2 DIAGNOSESTELLUNG DER MS .......................................................................................... 10
1.3 EPIDEMIOLOGIE UND GENETIK DER MS............................................................................. 12
1.3.1 Geschlechtsverteilung ..............................................................................................12
1.3.2 Geographisches Vorkommen....................................................................................12
1.3.3 Migrationsstudien....................................................................................................12
1.3.4 Genetische Faktoren................................................................................................12
1.3.5 Weitere Risikofaktoren.............................................................................................13
1.4 P ROGNOSE DER UNBEHANDELTEN MS............................................................................... 13
1.5 SCHUBBEHANDLUNG UND INTERVALLTHERAPIE DER MS................................................... 14
1.6 P ATHOLOGIE UND PATHOGENESE DER MS......................................................................... 14
1.6.1 Makropathologische Befunde ...................................................................................14
1.6.2 Histopathologische Befunde.....................................................................................14
1.6.3 Tiermodelle der MS .................................................................................................16
1.6.4 Immunpathogenese der MS: Ausgesuchte tierexperimentelle und humane Befunde.......16
1.6.4.1 Physiologische Grundlagen der Immunantwort...................................................... 16
1.6.4.1.1
1.6.4.1.2
1.6.4.1.3
1.6.4.1.4
T-Zellpopulation und Antigenpräsentation ..................................................................................17
TH1/TH2 Dichotomie......................................................................................................................17
Apoptose als Regulator der inflammatorischen Immunantwort ...............................................20
Bedeutung des sICAM-1 .................................................................................................................20
1.6.4.2 Die pathogene Inflammation ................................................................................ 21
1.6.4.2.1
1.6.4.2.2
1.6.4.2.3
1.6.4.2.4
1.6.4.2.5
Autoreaktive T-Zellen......................................................................................................................21
Induktionsphase des Inflammationsschubs- die periphere Aktivierung...................................22
Induktionsphase des Inflammationsschubs- die Überwindung der Blut/Hirnschranke.........23
Effektorphase des Inflammatiosschubs- TH1, die proinflammatorische Reaktion................24
Effektorphase des Inflammationsschubs- TH2/TH3, die antiinflammatorische Reaktion....27
1.7 FUMARSÄUREESTER (FAE) .............................................................................................. 29
1.7.1 Geschichte der FAE.................................................................................................29
1.7.2 Wirksamkeit und Verträglichkeit der FAE .................................................................30
1.7.3 Molekulare und immunologische Wirkmechanismen der FAE.....................................31
1.8 ZIEL DER VORLIEGENDEN UNTERSUCHUNG ....................................................................... 35
2.0 MATERIAL, METHODEN UND PATIENTENKOLLEKTIV.........................................36
2.1 STUDIENDESIGN .............................................................................................................. 36
2.2 P ATIENTENKOLLEKTIV..................................................................................................... 36
2.3 EIN/AUSSCHLUßKRITERIEN............................................................................................... 37
2.4 MEDIKATIONSSCHEMA..................................................................................................... 38
2.5 UNTERSUCHTE PARAMETER ............................................................................................. 39
2.5.1 Klinisch-neurologische Zielparameter ......................................................................39
2.5.1.1 Expanded Disability Status Scale (EDSS) ............................................................. 39
2.5.1.2 Ambulation Index (AI) ........................................................................................ 39
2.5.1.3 9-hole Pegboard Test (9-HPT).............................................................................. 39
2.5.1.4 Schubrate............................................................................................................ 40
________________________________4______________________________
2.5.2 Immunologische Zielparameter ................................................................................40
2.5.2.1 Technik der Durchflußzytometrie ......................................................................... 40
2.5.2.2 Experimentelle Vorgehensweise........................................................................... 43
2.5.2.3 Isolierung von Serum und peripheren Blutlymphozyten (PBL)............................... 43
2.5.2.4 Messung intrazellulärer Zytokinproduktion (ICCS) von PBL.................................. 44
2.5.2.5 Messung der Apoptoserate von PBL..................................................................... 47
2.5.2.6 Auswertung der ICCS von PBL............................................................................. 48
2.5.2.7 Auswertung der Apoptoserate von PBL ................................................................ 49
2.5.2.8 Messung der Serumkonzentration von sICAM-1.................................................... 49
2.5.2.9 Auswertung der Serumkonzentration von sICAM-1............................................... 50
2.5.3 Sicherheitslabor und Nebenwirkungsprofil................................................................50
2.6 MATERIALIEN.................................................................................................................. 51
2.6.1 Materialien für die Messung der ICCS ......................................................................51
2.6.2 Materialien für die Messung der Apoptoserate ..........................................................51
2.7 STATISTISCHE DATENANALYSE ........................................................................................ 52
3.0 ERGEBNISSE...................................................................................................................53
3.1 KLINISCH-NEUROLOGISCHE ZIELPARAMETER.................................................................... 53
3.2 SICHERHEITSPROFIL UND NEBENWIRKUNGEN.................................................................... 54
3.3 ERGEBNISSE DER SICAM-1 MESSUNG .............................................................................. 56
3.4 ERGEBNISSE DER ICSS MESSUNG ..................................................................................... 57
3.4.1 TH1-Zellpopulationen..............................................................................................57
3.4.2 TH2/TH3-Zellpopulationen ......................................................................................61
3.5 ERGEBNISSE DER APOPTOSEMESSUNG............................................................................... 64
4.0 DISKUSSION....................................................................................................................67
4.1 BEDEUTUNG DER KLINISCHEN MEßPARAMETER IN DER FAE-THERAPIE .............................. 68
4.2 BEDEUTUNG DES SICHERHEITSPROFILS UND DER NEBENWIRKUNGEN IN DER FAETHERAPIE...................................................................................................................................70
4.3 BEDEUTUNG DER SICAM-1 SERUMSPIEGEL IN DER FAE-THERAPIE.................................... 72
4.4 BEDEUTUNG DER ICSS IN DER FAE-THERAPIE .................................................................. 76
4.5 BEDEUTUNG DER APOPTOSE IN DER FAE-THERAPIE .......................................................... 83
4.6 FAZIT .............................................................................................................................. 86
5.0 ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................................88
6.0 ANHANG..........................................................................................................................89
7.0 LITERATURVERZEICHNIS...........................................................................................91
________________________________5______________________________
Verzeichnis häufig verwendeter Abkürzungen
CD
Cluster Of Differentation (Oberflächenmoleküle auf Zellen)
CD4
Oberflächenmarker der T-Helferzelle
EAE
Experimentelle Allergische Enzephalomyelitis
EDSS
Expanded Disability Status Scale
FL1-3
Fluoreszenz 1-3
FITC
Fluoreszeinisothiozyanat
FSC
Forward Scatter
ICAM-1
Interstitielles-Adhäsionsmole kül-1
ICCS
Intrazelluläre Zytokinproduktion
IL-2,-4,-10
Interleukin-2,-4,-10
INF-γ
Interferon-γ
MHC
Major-Histocompatability-Complex
MS
Multiple Sklerose
PBL
Periphere Blutlymphozyten
PBMC
Periphere, mononukleäre Blutzellen
PE
Phykoerythrin
PE-Cy5
Phykoerythrin-Zyanin-5
PPMS
Primär-Progressive Multiple Sklerose
SCC
Sideward Scatter
SPMS
Sekundär-Progressive Multiple Sklerose
SRMS
Schubförmig-Remittierende Multiple Sklerose
TGF-β
Transforming-Growth-Factor-β
TH1
T-Helferzell-Subtyp-1
TH2
T-Helferzell-Subtyp-2
TH3
T-Helferzell-Subtyp-3
TH-Zelle
T-Helferzelle
TNF-α
Tumor-Nekrose-Faktor-α
________________________________6______________________________
1.0
Einleitung
Die multiple Sklerose (MS) ist die häufigste neurologische Erkrankung des jungen
Erwachsenenalters. Weltweit sind etwa 1,2 Millionen Personen, in Deutschland etwa 120.000 an
MS erkrankt (Haupts 1994). Nach dem derzeitigen pathogenetischen Verständnis ist die MS eine
durch T-Lymphozyten modulierte Autoimmunerkrankung bei genetisch prädisponierten Personen,
die zu einer Fehlregulation des Immunsystems führt (Noseworthy, 2000). Letztendlich sind aber
die exakten Enstehungsmechanismen bisher größtenteils unbekannt. Aufgrund der noch zu
erläuternden klinischen, pathologischen und kernspintomographischen Heterogenität der MS,
handelt es sich aus dem heutigen Verständnis heraus um eine multifaktorielle Erkrankung in der
verschiedene pathogenetische Mechanismen ein ähnliches Gewebsschädigungsmuster verursachen.
Es gibt unterschie dliche Verlaufsformen, wobei die schubförmig-remittierende MS (SRMS) am
häufigsten anzutreffen ist. Hier führt eine Dysbalance zwischen pro- und antiinflammatorischen
körpereigenen T-Lymphozyten zu entzündlichen, vernarbenden und degenerativen Prozessen im
zentralen Nervensystem (ZNS), die klinisch als motorische, sensitive und kognitive Defizite
imponieren (Noseworthy, 2000). Somit ist die MS nicht nur eine entzündlich–demyelinisierende,
sondern auch eine axonal-degenerative Erkrankung.
T-Helfer-Zellen des Subtyps I (TH1-Zellen) die Botenstoffe wie Tumor-Nekrose-Faktor-α,
Interferon-γ bzw. Interleukin-2 sezernieren (TNF-α, IFN-γ, IL-2) sind die proinflammatorischen
Effektoren, welche mit Krankheitsschüben bzw. hoher Krankheitsaktivität einhergehen (Clerici,
2001). T-Helfer-Zellen des Subtyps II (TH2-Zellen) die Botenstoffe wie Interleukin-4,
Transforming-Growth-Factor-β und Interleukin-10 sezernieren (IL-4, TGF-β, IL-10) sind die
antiinflammatorischen Effektoren, welche mit einer stabilen Krankheitsphase einhergehen.
Die im Rahmen der Schuppenflechte (Psoriasis) eingesetzten Fumarsäureester (FAE), modulieren
die bei dieser entzündlichen Autoimmunerkrankung dysregulierten T-Lymphozyten (Ockenfels,
1998). Die orale Einnahme von Fumarsäureestern führt zu einer Suppression von TH1-Zytokinen
und einer vermehrten Sekretion von antiinflammatorischen TH2-Zytokinen und somit zur
Abheilung der entzündlichen Hautveränderungen.
Aufgrund der pathogenetischen Similarität beider Autoimmunerkrankungen, wurde im Rahmen der
vorliegenden Arbeit untersucht, ob der bei der Psoriasis beobachtete antientzündliche,
immunmodulatorische Effekt der FAE, ebenfalls bei Patienten mit schubförmig-remittierender MS
(SRMS) zu finden ist. Zusätzlich sollte die Sicherheit und Verträglichkeit der FAE in der
Anwendung bei MS Patienten untersucht werden.
Die dezidierte Fragestellung zur Zielsetzung dieser Dissertation (Kapitel 1.8) soll am Ende des
einleitenden Kapitels erörtert werden, nachdem das Krankheitsbild der MS (Kapitel 1.1-1.6) und
die Prüfsubstanz der Fumarsäureester (Kapitel 1.7) zunächst ausführlich dargestellt worden sind.
________________________________7______________________________
1.1
Die Geschichte der MS
Die Historie der MS ist eine Geschichte der Entwicklung pathogenetischer Modelle. Sie umfaßt
unterschiedlichste Vorstellungen, die sich mit der Entwicklung neuer Untersuchungstechniken
zunehmend spezialisierten. Eine erste Umschreibung des Krankheitsbildes der MS findet sich im
Lebenslauf der Heiligen Lidwina von Schiedham (1380-1433), einer holländischen Nonne die
Ausfallserscheinungen verschiedenster Anteile des ZNS ( bilateraler Sehverlust, Paraparese)
während ihres Lebens erfuhr (Medaer, 1979).
In der medizinhistorischen Literatur wird allerdings Jean Cruveilhier (1791-1873), Professor der
pathologischen Anatomie in Paris, als Erstbeschreiber der Erkrankung genannt (de Jong, 1970,
Poser, 1986). Cruveilhier beschrieb bereits die harte Konsistenz der Flecken des Gehirns und
ordnete diese Erkrankung als Folge einer unterdrückten Schweißsekretion in den rheumatischen
Formenkreis ein.
Die klinische Erstbeschreibung erfolgte Mitte des 19. Jahrhunderts durch Frerichs in Göttingen, der
auch den Begriff der Hirnsclerose prägte. Es folgten die umfassenden Darstellungen des
Krankheitsbildes durch Jean Marie Charcot (1825-1893), welcher Abgrenzungen der MS zur
Amyotrophen Lateralsklerose und zum Morbus Parkinson vornahm, und die heute noch nach ihm
benannte klinische Trias von Nystagmus, Intentionstremor und skandierender Sprache zur
Diagnosestellung einführte (Charcot, 1872). Ebenfalls nahm Charcot bereits damals an, daß die MS
eine Infektionskrankheit sei, eine ätiologische Vorstellung die bis heute anhält (Waksman, 1984).
Weitere kausalpathogenetische Annahmen glaubten an eine Toxintheorie der MS (Baasch, 1966),
eine Schlußfolgerung, die später widerlegt wurde.
In den dreißiger Jahren des 20. Jahrhunderts wurde durch die Beobachtung, daß
in
Tierexperimenten gegen körpereigenes basisches Myelinprotein sensibilisierte Lymphozyten eine
Autoimmunkrankheit
die
der
MS
sehr
ähnlich
war
hervorriefen,
die
sogenannte
Autoimmunpathogenese der Krankheit erstmalig entwickelt (Rivers 1933). Die experimentelle,
allergische Enzephalomyelitis (EAE) ist bis heute die wesentliche Grundlage pathogenetischer
Forschung geblieben.
1.2
Klinisches Krankheitsbild der MS
1.2.1 Verlaufsformen der MS
Der Krankheitsverlauf der MS bzw. die Krankheitsaktivität ist höchst variabel und im Einzelfall
nur schwer zu prognostizieren. Der Verlauf bewegt sich zwischen den zwei Extremvarianten
schubförmig-remittierend und chronisch-progredient, kann aber auch etwaige Zwischenformen
annehmen (Lublin, 1996).
Neurologisches Defizit
________________________________8______________________________
A
B
C
D
E
F
G
H
Zeit
Abbildung 1: Darstellung zeitlicher Verlaufsformen der MS (Flachenecker, 1996)
1.2.1.1
Schubförmig-remittierender Verlauf (SRMS)
Als Schub wird nach Ausschluß physiologischer Variabilität eine akut, ohne assoziierte, akute
Infekte oder Fieber auftretende neurologische Ausfallserscheinung definiert. Weiterhin beinhaltet
diese Definition eine Verschlechterung vorbestehender Symptome, die mindestens 24 Stunden
anhält. Als Folge schubförmiger Ereignisse kann es entweder zur vollständigen Rückbildung der
Symptome kommen, oder nur eine Teilremission eintreten (siehe Abbildung 1A und B). In den
unterschiedlichsten Studien weisen initial zwischen 68 und 85% einen schubförmig-remittierenden
Verlauf auf (Weinshenker, 1989). Die Schubrate variiert in den publizierten Untersuchungen
zwischen 0,2-1,15 Schüben pro Jahr. Interessant ist hierbei die Beobachtung, daß die Frequenz der
Schübe im ersten Jahr nach der Krankheitsdiagnose am höchsten und im Verlauf der weiteren Jahre
abnimmt ({Regression to the mean}Confraveux, 1980).
1.2.1.2
Chronisch-progredienter Verlauf (PPMS, SPMS)
Die chronisch-progrediente MS zeichnet sich durch eine unterschiedlich rasch zunehmende
Verschlechterung des neurologischen Befundes aus. Entsprechend den unten aufgeführten
Definitionskriterien, spricht man von einem chronisch-progredienten Verlauf, wenn die
Symptomatik über mindestens 6 Monate kontinuierlich fortschreitet. Dies kann sich bei 41% der
Patienten im Anschluß an eine initial schubförmig-verlaufende MS innerhalb von 6-10 Jahren
entwickeln (Weinshenker, 1989), so daß in diesem Fall von einer sekundär chronischprogredienten Verlaufsform (SPMS, siehe Abbildung 1 E und F) gesprochen wird. Gelegentlich
können
sich
auch
im
chronisch-progredienten
Verlauf
noch
leicht
schubförmige
Verschlechterungen ergeben (siehe Abbildung 1 F). Bei ca. 5 bis 10% der MS Patienten nimmt die
________________________________9______________________________
Erkrankung von Beginn an einen primär chronisch-progredienten Ablauf (PPMS, siehe Abbildung
1 C und D).
1.2.1.3
Benigne/Maligne MS
10% der Erkrankten erfahren eine benigne MS, da sie 10 Jahre nach Beginn der Erkrankung noch
einen geringen Behinderungsgrad (EDSS < 3) haben (Weinshenker, 1989). Die maligne
Verlaufsform der MS, ist durch einen rasch progressiven Verlauf gekennzeichnet, mit einem EDSS
>7 nach 5 Jahren (Lublin, 1996).
1.2.2 Altersverteilung bei Krankheitsbeginn
70% aller Patienten erkranken zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr (Confraveux, 1980). Das
Alter zu Beginn der schubförmig-remittierenden Verlaufsform liegt mit 28,8 Jahren im Vergleich
zur sekundär chronisch-progredienten mit 35,7 und der primär chronisch-progredienten
Verlaufsform mit 40,3 Jahren deutlich niedriger (Kesselring, 1997).
1.2.3 Typische Symptome der Erkrankung
Die MS als entzündliche Erkrankung der weißen Substanz des ZNS präsentiert Symptome, die
entweder durch eine Demyelinisierung mit Leitungsverlangsamung bzw. Leitungsblock oder durch
eine axonale Schädigung ausgelöst werden. Prädilektionsstellen der Inflammation in der weißen
Substanz sind z.B. der Nervus opticus, das ventrikelnahe Marklager, das Kleinhirn und der
Hirnstamm. Hieraus resultierend ergeben sich klinische Symptome wie spastische Paresen, Gangund Extremitätenataxie, Sensibilitätsstörungen, zentrale Visusminderung, Sexualitätsstörungen,
Blasenstörungen etc. Letztlich sind solche Symptome nicht spezifisch für die MS, können aber in
ihrer Kombination als typisch für die Erkrankung angesehen werden.
1.2.3.1 Frühsymptome
Frühsymptome
sind
abhängig
vom
Erkrankungsalter,
und
v.a.
Folge
der
axonalen
Demyelinisierung im ZNS, die zur Verlangsamung bzw. Blockade der nervalen Erregungsleitung
führt. Bei Patienten die vor dem 30. Lebensjahr erkranken und eher eine SRMS erleiden, ist die
Optikusneuritis mit 22 % oder eine Sensibilitätsstörung mit 46,5 % das führende Symptom
(Weinshenker,
1989).
Häufig
finden
sich
initial
Doppelbilder,
Gleichgewichtsstörungen,
Gliedataxie, positives Lhermitte Zeichen (Extremitäten/Rumpfparästhesien bei Nackenflexion) und
das Uhthoff-Phänomen, also die Verschlechterung von Krankheitszeichen bei steigender
Körpertemperatur. Kortikale (Aphasie, Apraxie, epileptische Anfälle) und extrapyramidale Zeichen
(choreatische/hypokinetische Bewegungsstörungen) sind wie akute motorische Lähmungen (6 %)
extrem selten. Langsam progrediente Lähmungen der unteren Extremitäten (Syndrom des oberen
Motoneurons) bei 30 % der Patienten, sind v. a. eine Manifestation bei Patienten mit SPMS, v.a.
jenseits des 30. Lebensjahres (Thompson, 1992).
________________________________10______________________________
1.2.3.2
Symptome während des Krankheitsverlaufs
Im Laufe der Erkrankung treten eine Vielzahl von Erscheinungen auf, die durch
Entzündungs/Entmarkungs- und Axonschädigungsvorgänge in den betroffenen ZNS-Regionen
erklärt werden können. Die Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die charakteristischen, klinischen
Symptome und deren Häufigkeit im Verlauf der Erkrankung.
Tabelle 1: Symptome im Krankheitsverlauf (Bates, 1994, Poser, 1986)
Symptome
Häufigkeiten (%)
1. Pyramidenbahnläsion
> 80
2. Visus- und Augenmotilitätsstörungen
Ca. 80
3. Blasenstörungen
57
4. Hirnstamm/Kleinhirnstörungen
75
5. Sensibilitätsstörungen, Parästhesien
83
6. Vibrations/Lagesinnbeinträchtigung
71
7. Paroxysmale Phänomene
04
8. Störungen des vegetativen Systems
60
9. Psychische/Kognitive Ausfälle
45
10. Fatigue-Syndrom
bis 78
1.2
Diagnosestellung der MS
Die Standardisierung diagnostischer Kriterien dient dazu, die Diagnosesicherheit zu erhöhen. Die
gängige Klassifikation beruht auf der Forderung der örtlichen und zeitlichen Dissemination der
Entzündungsherde im ZNS. Die den international durchgeführten Studien zugrundeliegenden Poser
Kriterien (Poser, 1983), erlauben eine Einteilung der Patienten in 2 Hauptgruppen (siehe Tabelle
2):
Patienten mit gesicherter und Patienten mit wahrscheinlicher MS.
Eine weitergehende Subklassifikation der Poser-Kriterien erlaubt die Unterscheidung der
obengenannten
Gruppen
in
2
zusätzliche
Gruppen
diagnostischer
Zuverlässigkeit:
klinisch/laborunterstützt sichere und klinisch/laborunterstützt wahrscheinlich sichere MS
(siehe Tabelle 2).
Tabelle 2: Poser-Kriterien
Kategorie
Klinisch sicher
1:
2:
Laborunterstützt sicher
1:
2:
3:
Klinisch wahrscheinlich
1:
2:
3:
Laborunterstützt wahrscheinlich
1:
Schübe
Nachweis von Läsionen
Klinisch
Paraklinisch
2
2
2
1 und
2
1
1
1 oder
2
1 und
2
1
1
1
2
1 und
2
Liquor
(oligoklonale
Banden)
1
1
1
+
+
+
1
+
________________________________11______________________________
Die heutigen, zusätzlichen diagnostischen Möglichkeiten, sogenannte „paraklinischen“ Methoden,
nämlich die Kernspintomographie (MRT), die Elektrophysiologie und die Liquoruntersuchungen
erlauben es durch Auffinden klinisch stummer Läsionen die Diagnosestellung zu unterstützen. Die
Liquordiagnostik ergibt als wesentlichen Befund die Produktion oligoklonaler Banden, als Zeichen
der selektiven, infla mmatorischen Immunreaktion des ZNS (Gold, 1998). Entscheidende
Bedeutung besitzt die elektrophysiologische Diagnostik im aufdecken von klinisch stummen
Läsionen. Insbesondere die visuell evozierten Potentiale, die bei 75-97% der Erkrankten
typischerweise eine Verzögerung der Reizantwort aufgrund einer stattgehabten Demyelinisierung
zeigen, besitzen besondere Relevanz für die Diagnosestellung (Matthews, 1991).
Die Kernspintomographie zeigt die räumliche und zeitliche Dissemination der ZNS Herde der
weißen Substanz, anhand ihrer unterschiedlichen Untersuchungssequenzen. Insbesondere die
Darstellung
der
kontrastmittelanreichernden
elektronenmikroskopische
bzw.
Läsionen,
die
wie
vergleichende
MRT-Studien zeigen konnten, neben der entzündlichen
Schädigung der Blut/Hirnschranke die Phase der Demyelinisierung der Oligodendroglia sowie der
zellulären Infiltration der perivaskulären Areale erfaßt (Samia, 1998), hat in den letzten Jahren an
Bedeutung für die Diagnose zugenommen. Dem versucht aktuell eine Konsensusgruppe unter
Leitung von Ian McDonald Rechnung zu tragen, in dem es überarbeitete Richtlinien zur
Diagnosestellung gibt (Mc Donald, 2001), die bisher aber noch keinen Einzug in Studien erhalten
haben. Hier findet eine besondere Betonung der MRT-Untersuchungen statt, so daß mit einer
Sensitivität von 82% und einer Spezifität von 78% folgende Kriterien (3 von 4 Kriterien müssen
erfüllt sein) die räumliche Dissemination beweisen:
§
≥ 1 Kontrastmittel aufnehmende Läsion, bzw. 9-T2-hyperintense, supratentorielle Läsionen
§
≥ 1 infratentorielle Läsion
§
≥ 1 juxtakortikale Läsion im Bereich der subkortikalen U-Fasern
§
≥ 3 periventrikuläre Läsionen, größer als 3 mm
Vereinfacht läßt sich sagen, daß durch einen charakteristischen MRT und/oder Liquorbefund die
Notwendigkeit einer zweiten schubförmigen Verschlechterung entfällt und somit „paraklinisch“ die
Diagnose einer MS gestellt werden kann (Mc Donald, 2001).
Grundsätzliche Voraussetzung der Diagnosestellung ist allerdings der Ausschluß multipler
Differentialdiagnosen, für die hier einige beispielhaft genannt werden:
§
metabolische Erkrankungen (Leukodystrophien)
§
Autoimmunerkrankungen (Kollagenosen, Antiphospholipid-Antikörper-Syndrom)
§
Infektionen (Neuroborreliose, HIV-Enzephalopathie, Syphilis)
§
Vaskuläre Erkrankungen (primäre ZNS-Vaskulitis, CADASIL-Syndrom)
§
Genetische Syndrome (Lebersche Optikusatrophie)
§
Läsionen der hinteren Schädelgrube (Arnold-Chiari-Malformation)
§
Psychiatrische Erkrankungen (Konversionsreaktion)
§
Paraneoplastische Erkrankungen (Limbische Enzephalitis)
________________________________12______________________________
1.3
Epidemiologie und Genetik der MS
1.3.1 Geschlechtsverteilung
Die MS zeigt eine deutliche Bevorzugung des weiblichen Geschlechts. Große Studien der
vergangenen 20 Jahre erbrachten eine Verhältnissmäßigkeit von 1,9 bis 3,1 im Sinne eines
erhöhten MS-Risikos für Frauen, v.a. für die SRMS (Noseworthy, 2000). Diese Daten sprechen am
ehesten für einen bis dato unbekannten hormonellen Faktor, welcher die erhöhte Suszeptibilität der
Frauen erklären könnte. Unterstützt wird diese These durch die Beobachtung, daß nur 10% der
Erkrankten ihre Krankheitsmanifestation während einer Schwangerschaft erlebten (Davis, 1992).
1.3.2 Geographisches Vorkommen
Untersuchungen der geographischen Verteilung zeigen ein typisches Verteilungsmuster. Die
Prävalenz der MS ist in südlichen Breitengraden extrem gering, beispielsweise in der weißen
Bevölkerung Südafrikas 10 pro 100000. Es ergibt sich ein deutlicher Anstieg der Prävalenz
nördlich des Äquators, so daß in Mitteleuropa eine Prävalenz von 30-110 pro 100000 Personen
angegeben werden kann. In Bochum finden wir eine Prävalenz von 95 pro 100000 Einwohner
(Haupts, 1994), die somit den bekannten Zahlen für Deutschland entspricht.
1.3.3 Migrationsstudien
Aus großen Untersuchungen ist bekannt, daß Personen die aus Hochrisikoregionen für die MS wie
Nordeuropa in Äquatorbereiche umsie deln, ein sinkendes Erkrankungsrisiko erfuhren. Umgekehrt
führt die Einwanderung aus Regionen niedriger in solche hoher Prävalenz zu einem deutlichen
Anstieg des Risikos. Dieses Phänomen wurde v.a. in der zweiten Generation deutlich (Noseworthy,
2000). Ein zweiter Risikofaktor ist das Alter während der Migration. Bei einer Migration vor dem
15. Lebensjahr paßte sich die Prävalenzrate der MS Erkrankung derjenigen des neuen
Heimatlandes an. Erfolgte die Umsiedlung nach dem 15. Lebensjahr, blieb das Erkrankungsrisiko
des Geburtslandes erhalten. Diese Daten wurden als Hinweis auf einen lokalen Umwelteinfluß wie
z.B.
eine
neurotrope
Virusinfektion
gesehen.
Interessanterweise
besitzen
Regionen
unterschiedlicher Prävalenz allerdings die gleiche Altersverteilung der MS-Inzidenz, ein Faktum
das eher für einen genetischen als einen lokalen Umwelteinfluß spricht (Noseworthy, 2000).
1.3.4 Genetische Faktoren
Ein deutlicher Hinweis auf die Beteiligung genetischer Faktoren an der Prädisposition zur MS ist
das Phänomen, daß schwarze US-Amerikaner unabhängig von ihrem Lebensraum ein um 50%
reduziertes Erkrankungsrisiko im Vergleich zu weißen Amerikanern besitzen. Aus Familien und
Zwillingsuntersuchungen ist bekannt, daß das Erkrankungsrisiko bei Verwandten von MSErkrankten 20-40 mal höher liegt als in der Normalbevölkerung. Das Konkordanzrisiko bei
eineiigen Zwillingen liegt mit 26% um den Faktor 10 höher als bei zweieiigen Zwillingen
________________________________13______________________________
(Sadovnik 1996). Das absolute Risiko an MS zu erkranken ist bei erstgradig Verwandten ca. 5 %,
und somit 20-40 mal höher als in der Normalbevölkerung.
Kanditatengenuntersuchungen mit Mikrosatellitenmarkern führten zum Human-Leukocyte-Antigen
(HLA) Locus auf Chromosom 6. Dieser kodiert
für die Schlüsselmoleküle einer T-Zell
vermittelten Immunantwort, die in HLA Klasse 1 und 2 Moleküle unterteilt werden. HLA
Moleküle der Klasse 2 der Untergruppe DR2 spielen eine wesentliche Rolle bei der durch CD4positive TH-Zellen vermittelten Immunreaktion, und sind signifikant assoziiert mit der MS.
Individuen die homozygot für HLA-DR 2 sind tragen ein 4-fach erhöhtes Risiko an einer MS zu
erkranken. Die Größe des relativen Risikos zu erkranken, hängt von der Allelfrequenz von HLADR2 in der Bevölkerung ab (Noseworthy, 2000). Assoziationen der HLA-Allele zur Schwere der
Erkrankung fanden sich nicht. Bisher konnten für weitere Kandidatengene keine formell
signifikanten Assoziationen mit der MS-Prädisposition gefunden werden, ein Umstand der auf
einen polygenen Vererbungsmodus schließen läßt (Xu, 1999).
1.3.5 Weitere Risikofaktoren
Studien vergangener Jahre haben gezeigt, daß während einer Schwangerschaft die Schubrate etwa
30-50% niedriger ist als bei Nichtschwangeren, vor allem während des letzten Trimenons (Damek,
1997). In der Phase nach der Entbindung ist das Schubrisiko allerdings kurzfristig 2-3 fach erhöht.
Immunologisch scheint die reduzierte Erkrankungswahrscheinlichkeit in der Schwangerschaft mit
einer stark ausgeprägten TH2-Reaktivität des Immunsystems erklärbar zu sein (Rhagupathy, 1997).
Von den direkten Umweltfaktoren, die gehäuft einem Schub vorangingen, fand sich die strengste
Korrelation mit einer Virusinfektion des Respirationstraktes des Patienten. Dies kann als
zusätzlicher Hinweis auf eine immunogene Pathogenese gesehen werden, da ein Virusinfekt
gemeinhin zu einer TH1-Reaktion des Immunsystems führt, eine Reaktion die bei der Entstehung
der MS-Läsion eine entscheidende Rolle spielt (Kesselring, 1997).
1.4
Prognose der unbehandelten MS
Die mittlere Lebenserwartung eines MS-Patienten nach Diagnosestellung beträgt 25-35 Jahre, d.h.
eine Reduktion der Lebenserwartung von etwa 7 Jahren im Vergleich zu gesunden Personen (Paty,
1999). Relevante klinische Risikofaktoren sind in der Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3: Prognostische Faktoren der MS (Kesselring, 1997)
Prognostische Faktoren des
Günstige Faktoren
Krankheitsverlaufs
1.
Erhaltene Gehfähigkeit
2.
3.
4.
Alter bei Krankheitsmanifestation
von < 35 Jahren
Monosymptomatischer Beginn
Kurze Dauer des letzten Schubes
5.
Ausschließlich sensible Symptome
Ungünstige Faktoren
Frühe motorische/zerebelläre
Störungen
Rasche initiale Schubfolge
Lange Dauer des Schubs
Schlechte Rückbildungstendenz
nach den ersten Schüben
Initial multiple MRT-Läsionen
________________________________14______________________________
1.5
Schubbehandlung und Intervalltherapie der MS
Nach einem Konsensus deutscher Neurologen, folgt die derzeitige immunmodulatorische
Stufentherapie der MS einem Eskalationsschema (MSTKG, 2001). Entsprechend der
Krankheitsprogression, werden in Tabelle 4 genannte immunmodulierende Substanzen eingesetzt.
Die Therapie orientiert sich dabei an den verschiedenen Verlaufstypen als auch an der
Krankheitsaktivität.
Tabelle 4: Vereinfachtes Eskalationsschema der MS -Therapie (MSTKG 2001)
Krankheitsphase/Verlaufstyp
Therapieindikation
Therapie
§ Akuter Schub
§ Akuter Schub
Kortikoid-Stoßtherapie
§ SRMS, häufige Schübe
§ EDSS<2-3
1. Wahl: Interferon-β oder
Glatirameracetat
(Copolymer-1)
2. Wahl: Azathioprin,
Immunglobuline
§ SRMS, häufige Schübe
§ EDSS>2-3
1. Wahl: Mitoxantron
§ EDSS Progression um 1 Punkt
2. Wahl: Cyclophosphamid,
innerhalb 6-12 Monaten
Plasmapherese
§ Versagen der Interferon- bzw.
Glatirameracetat-Therapie
§ SPMS, PPMS
§ EDSS Progression um 1 Punkt
1. Wahl: Mitoxantron
innerhalb 6-12 Monaten
2. Wahl: Cyclophosphamid,
Plasmapherese
1.6
Pathologie und Pathogenese der MS
1.6.1 Makropathologische Befunde
Makroskopisch-pathologische Befunde der Veränderungen des ZNS bei der MS wurden bereits zu
Beginn des 19. Jahrhunderts beschrieben. Der hauptsächliche Befallsort ist die weiße Substanz des
Gehirns, und hier v.a. die periventrikuläre Region des 1. und 2. Ventrikels. Es finden sich typische
periventrikuläre Entmarkungsherde (Plaques) sowie sich radial nach außen fortsetzende
Demyelinisierungsherde, welche im Verlauf postkapillärer Venolen liegen („Dawson Finger“).
Hier scheint der Nidus der Plaqueentstehung zu liegen. Die Demyelinisierungsherde führen zu
einer sichtbaren Schrumpfung der betroffenen Regionen. Diese atrophischen Veränderungen lassen
sich überall im ZNS finden. Aufgrund der gliösen Narbenbildung innerhalb der beschriebenen
Plaques zeigen diese Herde palpatorisch eine Verhärtung (Sklerose). Makroskopisch imponieren
akut entzündliche Läsionen als rosafarbene und unscharf begrenzte Läsionen. Chronisch
entzündliche Plaques stellen sich dar als gräulich, hyaline, polygonale und gut abgegrenzte Herde
die häufig miteinander konfluieren. Der Durchmesser der Entmarkungsherde beträgt zwischen
1mm bis mehrere cm (Gold, 1998).
1.6.2 Histopathologische Befunde
Die essentiellen Läsionen im ZNS von MS-Erkrankten sind die disseminiert verteilten
Demyelinisierungsherde, die sich in ihrer Verteilung an keiner anatomischen Struktur orientieren.
________________________________15______________________________
Histologisch lassen sich aktive (mit aktiven Demyelinisierungsherden) und inaktive (ohne aktive
Demyelinisierungsherden) MS-Plaques differenzieren, wobei die aktiven Plaques 4 pathogenetisch
relevante Subtypen zeigen (Lucchinetti, 2000). Generell zeigt die aktive Läsion ein perivenöses
Infiltrat aus T-Lymphozyten und Makrophagen, sowie eine graduell differente Myelinzerstörung.
Neben Makrophagen die aktiv die Myelinbestandteile phagozytieren und zersetzen, findet sich eine
von den Subtypen abhängige quantitative Reduktion der Oligodendroglia. Weitere Untersuchungen
zeigten, daß entgegen bisheriger Annahmen ein signifikanter Anteil an Axonzerstörung bereits in
solchen Plaques zu finden ist (Trapp, 1998). Folge der beschriebenen Vorgänge ist eine sich
entwickelnde Astrogliareaktion mit protoplasmatischer Gliose. Die Muster der Demyelinisierung
zwischen verschiedenen Patienten sind heterogen, allerdings intraindividuell immer homogen.
Hieraus läßt sich die Möglichkeit von mindestens 4 pathogenetisch differenten klinischen Subtypen
bezüglich der Multiplen Sklerose und der Krankheitsphase ableiten (Lucchinetti, 2000). Ob die
Muster Abbild einer unterschiedlichen zeitlichen Entwicklung im Sinne eines noch zu erläuternden
„Antigen-Sprouting“ sind, oder nur Folge eines differenten Schädigungsgrades der Inflammation
ist derzeit noch unbekannt.
Aktive Plaques: Subtyp I und II sind nach derzeitigem pathogenetischem Verständnis TH-Zell
bzw. TH-Zell und Antikörper vermittelte autoimmune Enzephalomyelitiden. Klinisch imponieren
vor allem die schubförmig-remittierenden Verlaufstypen. Die aktive SRMS Läsion zeigt ein
Gewebsbild das ödematös aufgelockert ist, mit einem vorwiegenden Infiltrat aus T-Lymphozyten
und Makrophagen sowie einer Endothelzellaktivierung. Im Zentrum der Plaques finden sich Venen
mit neu immigrierten Oligodendrozyten, der Rand des Plaques zeigt einen Oligodendrogliaverlust
und ist scharf demarkiert. Diese Plaques zeigen den größten Anteil an axonaler Zerstörung, im
Vergleich zu den anderen hier besprochenen. Aber es finden sich auch eine große Anzahl von
„Shadow-Plaques“, welche durch remyelinisierte, dünne Myelinscheiden, die eine unscharfe
Begrenzung zum umliegenden Gewebe bedingen, charakterisiert sind. Diese Plaques zeigen keine
Hinweise für axonale Zerstörung (Korneck, 2000). Innerhalb des Demyelinisierungsplaques finden
sich diffuse Immunglobulin und verschiedenste Komplementablagerungen als Zeichen der
Blut/Hirn-Schrankenstörung. Subtyp II zeigt als wesentlichen Unterschied zu Typ I eine
Ablagerung von Immunglobulinen (v.a. IgG und Komplementfaktor C9 im Bereich der aktiven
Myelindestruktion. Subtyp III und IV sind nach derzeitigem pathogenetischem Verständnis
primäre Oligodendrozytendystrophien, die eher durch eine Virusinfektion bzw. durch eine toxische
Schädigung der Oligodendrozyten bedingt sind. Subtyp III ist klinisch eher den malignen
Verlaufsformen der MS zugeordnet, Subtyp IV einer Gruppe von PPMS. Subtyp III präsentiert
auch
ein
lymphozytär/monozytäres
Infiltrat,
wobei
sich
unscharf
begrenzte
Demyelinisierungszonen diffus von der Vene ausbreiten. Die betroffenen Oligodendrozyten zeigen
apoptotische Veränderungen und einen selektiven Verlust von Myelinantigenen (MAG), im Sinne
einer „Dying-Back“ Oligodendropathie (Lucchinetti, 2000). An der Plaquegrenze finden sich
konzentrische Areale aus demyelinisierten und myelinisierten Axonen, wobei das Plaquezentrum
________________________________16______________________________
frei von Oligodendrozyten ist. Subtyp IV zeigt vor allem Demyelinisierungszonen mit ausgeprägter
Oligodendrozytennekrose, und keine Remyelinisierungszeichen im Sinne von „Shadow-Plaques“.
Subtyp III und IV zeigen beide ebenfalls Zeichen der axonalen Zerstörung.
Inaktive Plaques: Der chronisch-inaktive Plaque ist vereinfacht gesehen eine gliöse Narbe. Diese
sogenannten „Burn-Out“ Läsionen zeigen äußerlich eine abrupte Grenze zerstörten zu normalem
Myelin (Trapp, 1998). Innerhalb des Plaques herrschen reaktive Astrozyten die eine massive
Gliosezone erzeugen vor, bei fehlenden Oligodendrozyten. Es finden sich vereinzelt Makrophagen,
Lymphozyten und zusätzlich auch Plasmazellen. Der Plaque zeigt ein quantitatives Spektrum von
gering reduzierten Axonzylindern bis hin zum völligen Fehlen derselben. Die Blutgefäße werden
durch das umliegende Bindegewebe hyalinisiert.
1.6.3 Tiermodelle der MS
Die Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist das am weitesten verbreitete
Tiermodell der MS (Rivers, 1933). Es dient der Untersuchung von Immunreaktionen gegen
Autoantigene im ZNS sowie der daran anschließenden Testung von immunmodulatorischen
Therapien. Eine solche Autoimmunreaktion kann einerseits durch eine aktive Immunisierung gegen
ein
ZNS
Protein,
andererseits
anhand
eines
passiven
Transfers
von autoreaktiven,
myelinspezifischen T-Zellen erreicht werden (Paterson, 1960). Es existieren multiple Spezies bei
denen eine solche Erkrankung evoziert werden kann. Die bekanntesten sind die Lewis-Ratte und
SJL-Mäuse. In Abhängigkeit von der Spezies dem Antigen und der Art der Sensibilisierung, lassen
sich verschiedene, zur klinischen Verlaufsform der MS kongruente Verlaufstypen provozieren:
§
ein monophasisch-akuter
§
ein chronisch remittierender
§
ein primär progressiver klinischer Verlauf.
Ein anderes tierexperimentelles Modell ist das „Theiler Murine Encephalomyelitis Virus“ (TMEV),
ein Picornavirus der Maus welches eine chronisch demyelinisierende Erkrankung des Tieres
erzeugt, die eine große Vergleichbarkeit zur PPMS hat. Hierbei erzeugt die Viruspersistenz im
ZNS des Tieres die chronische Demyelinisierung (Miller, 1997). Relevante pathogenetische
Befunde der verschiedenen EAE Modelle, werden im Folgenden zur Erklärung der
Immunpathogenese der MS berücksichtigt.
1.6.4 Immunpathogenese der MS: Ausgesuchte tierexperimentelle und humane
Befunde
1.6.4.1
Physiologische Grundlagen der Immunantwort
Der folgende Abschnitt versucht anhand tierexperimenteller Daten verschiedener EAEUntersuchungen, in vivo Befunden an MS-Erkrankten sowie anhand von experimentellen Daten
aus in vitro Untersuchungen, ein einheitliches Bild der MS Immunpathogenese zu zeichnen. Im
Besonderen
wird
nach
einem
einleitenden
Grundlagenabschnitt
zur
Immunologie,
der
________________________________17______________________________
histopathologisch einheitliche Typ I und II, dem das klinische Bild der SRMS entspricht,
berücksichtigt.
1.6.4.1.1
T-Zellpopulation und Antigenpräsentation
T-Zellpopulationen lassen sich anhand ihrer Differenzierungstufe verschiedenen Subgruppen
zuordnen. Klassifikationsmerkmale sind die Oberflächenmoleküle (Cluster of differentation, CD)
mit ihrer entsprechenden Nummerierung. Reife T-Lymphozyten tragen die CD-Moleküle CD2,
CD3, CD5, CD7, sowie entsprechend ihrer Funktionalität das CD4-Molekül als T-Helferzelle (THZelle) bzw. das CD8-Molekül als zytotoxische T-Zelle. Weiterhin unterscheidet man die naiven,
nicht durch Antigenkontakt aktivierten CD45RA-T-Zellen, sowie die CD45RO-Memory-T-Zellen.
T-Zellen tragen einen T-Zell-Rezeptor (TCR) der ultrastrukturell entweder aus einer α und β Kette
bzw. aus einer δ und γ Kette aufgebaut ist. CD4 bzw. CD8-positive T-Lymphozyten tragen
natürlicherweise zu 95% den α-β TCR, natürliche Killerzellen (CD4, CD8 negativ) v.a. den δ-γ
TCR (Janeway, 1995). Die T-Zellaktivierung im Rahmen einer regulierten, entzündlichen
Immunreaktion via antigenpräsentierender Zellen (APC) erfolgt über die Präsentation intrazellulär
prozessierter Antigene, die mittels MHC-Molekülen (Major-Histocompatibility-Complex) den TZellen präsentiert werden. Beispiele für APC im ZNS sind Mikroglia, Astrozyten, Makrophagen,
B-Zellen und dendritische Zellen.
Es existieren 2 verschiedene Klassen von MHC-Molekülen (MHC-I und MHC-II). MHC-II
Moleküle, die v.a. von Makrophagen exprimiert werden, aktivieren selektiv CD4-Lymphozyten
und regen diese zur Zytokinproduktion an. MHC-I Moleküle restringieren ihre Aktivierung auf
CD8-Lymphozyten. Der MHC-Komplex präsentiert das antigene Peptid dem TCR. Das
dargebotene Protein im MHC-Komplex geht mit den α/β Ketten des TCR eine Bindung ein; den
trimolekularen Komplex. Diese Bindung wird nun durch das Anlagern des CD4 oder CD8-Molekül
gefestigt. Wesentlich verstärkt wird die Interaktion von APC (MHC-II) und TH-Zellen durch
kostimulatorische Moleküle, die ebenfalls als Oberflächenrezeptoren auf den Zellen sitzen und
miteinander interagieren, wobei es zu intrazellulärer Aktivierung von Tyrosinkinasen kommt. Eines
für die Aktivierung von TH-Zellen relevantes kostimulatorisches Molekül ist das interstitielle
Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1), daß membranständig auf APC gebunden ist. Im Rahmen der THZellaktivierung interagiert es mit dem Leukozyten-Funktions-Antigen-1 (LFA-1) auf TH-Zellen
und es erfolgt hierdurch eine selektive Genaktivierung und Produktion noch zu erläuternder
Zytokinmoleküle (Janeway, 1995),. Somit legt die MHC-Subklasse (MHC-Restriktion) die
Spezifität der beteiligten Lymphozyten an der Immunantwort fest und führt zur Aktivierung naiver
T-Zellen im Rahmen einer Immunreaktion.
1.6.4.1.2
TH1/TH2 Dichotomie
Die aktivierten CD4-Lymphozyten lassen sich anhand ihrer Zytokinproduktion, funktionell in zwei
Subklassen differenzieren: die T-Helferzell-1- (TH1) und T-Helferzell-2- (TH2) Population.
Zytokine sind niedermolekulare Proteine, welche die Kommunikation zwischen T-Lymphozyten
________________________________18______________________________
und Effektorzellen einer Immunreaktion regulieren. Sie werden als Polypeptide sezerniert, und
üben über eine spezifische Rezeptorbindung an Ihren Zielzellen ihre biologische Wirkung aus
(siehe Tabelle 5, Seite 19). Über eine Vielzahl solcher Botenstoffe kommunizieren die Zellen des
Immunsystems miteinander, und bilden dadurch ein komplexes Netzwerk zur Regulation von
Entzündungsvorgängen.
Das Zytokinsekretionsmuster der TH1-Population umfaßt die Zytokine TNF-α, IFN-γ und IL-2.
Die TH2-Population sezerniert IL-10 und IL-4, wobei eine weitere Subpopulation die TH3Lymphozyten über eine TGF-β Produktion charakterisiert wird. Hieraus erwächst eine Dichotomie
der Antigenantwort mit den TH1-Zellen auf der einen und den TH2/TH3 auf der anderen Seite
(siehe Abbildung 2, Seite 19). Natürlicherweise führen die Zytokine der TH1-Lymphozyten, zu
einer Aktivierung seitens der APC (v.a. Makrophagen) und zytotoxischen T-Lymphozyten
dominierten zellvermittelten Immunität, so wie es in Abbildung 2 dargestellt ist (Muraille, 1998).
Ebenfalls induzieren sie die Synthese von Immunglobulin G1 , ein Umstand der im Rahmen der
MS-Pathogenese des histologischen Subtyps II eine wesentliche Rolle spielt. Die Botenstoffe der
TH2/TH3-Zellen induzieren bei Stimulation seitens der APC eine B-Zell und Antikörper
dominierte humorale Immunreaktion. Vorläuferzellen dieser Subtypen sind die naiven TH0-Zellen,
die alle erwähnten Zytokine produzieren können, aber durch gezielte Stimulation mittels in Tabelle
5 erwähnter Botenstoffe, sich in eine der beiden Richtungen differenzieren (Mosmann, 1996). Es
existieren noch alternative Wege, um eine TH0-Zelle in eine TH1 bzw. TH2/3-Zelle zu
differenzieren. Genannt seien hier die Sekretion der in Tabelle 5 genannter Zytokine durch APC,
die kostimulatorischen Moleküle sowie Chemokine als sekundäre Immunmediatoren (Sallusto,
1998).
Es zeigt sich, daß sich die Zytokinwirkungen der TH1 und TH2/TH3 Lymphozyten reziprok
hemmen. Dies geschieht einerseits in direkter Einwirkung der Zytokine auf die TH-Zelle,
anderseits in der Einwirkung der Botenstoffe auf die APC. Wichtige Besonderheit der TH2Zytokine ist einerseits die autokatalytische Eigenschaft von IL-4, die zu einer TH2Zellproliferation führt. Andererseits die Fähigkeit von IL-10 alle inflammatorischen Reaktionen ob
TH1 oder langfristig auch TH2 zu terminieren und somit eine Immunantwort zu beenden (Muraille,
1998). Letztendlich ist die strenge Dichotomie des TH1/TH2 bzw. TH3-Konzeptes als eine
dynamische Hypothese zur Verdeutlichung der Pathogenesemechanik von inflammatorischen
Reaktionen zu verstehen, da in vivo auch bereits differenzierte TH-Zellen unter geeigneten
kostimulatorischen Bedingungen sich in den gegenteiligen TH-Subtyp differenzieren können
(Muraille, 1998).
________________________________19______________________________
TH0
+
+
+
IL-12
)
IL-4
) IL-10
APC
*
IFN- γ
IL-10
IL-10
)IL-10
)
TGF- β
+
IFN-γγ
TNF- α
)
TN
+
Zytotoxische
T-Zelle
IL-4
+
Stimulierende Zytokinwirkung
)
IL-4
IL-10
)
+
+
Zelldifferenzierung
Hemmende Zytokinwirkung
TH3
TH2
TH-Differenzierung
IL-2
Fα
IL-10
TH1
TGF- β
IL-4
B -Zelle
B -Zelle
B -Zelle
B -Zelle
Abbildung 2 (modifiziert nach Muraille, 1998): Das regulatorische Zytokinnetzwerk der TH1/TH2 und
TH3-Zellen. TH1 können eine inflammatorische Immunreaktion der zellulären Immunantwort erzeugen, die
durch TH2/TH3-Zellen antagonisiert wird. TH2/TH3-Zellen vermitteln eher die humorale Immunantwort.
Tabelle 5: Zytokinwirkungen: Ursprungs-und Effektorzellen
Zytokin
Ursprungszelle
Wirkung
IL-2
§ TH1 und TH2
§ Wachstumsfaktor für TH1
§ Sensitivierung von TH1/2-Zellen zur Apoptose
§ B-Zellproliferation
§ TH1, NK-Zellen
§ Aktivierung/Differenzierung von Makrophagen und APC
IFN-γγ
(MHC I/II-Expression)
§ Anregung der Makrophagen zur Produktion von IL12 die
zur Differenzierung von TH0 zu TH1 führt
§ Hemmung der Differenzierung von TH0 zu TH2
§ TH1, Makrophagen
§ Zytotoxizität
TNF-α
α
§ Aktivierung von Makrophagen, zytotoxischen T-Zellen
IL-4
§ TH2
§ Hemmung der Differenzierung von TH0 zu TH1
§ Differenzierung von TH0 zu TH2 und TH3
§ Antikörperisotypenswitch/Aktivierung von B-Zellen
§ Wachstumsfaktor für TH2
IL-10
§
TH2
§
§
§
TGF-β
β
§
TH3
IL-12
§
APC
§
§
§
§
Hemmung der Differenzierung von TH0 zu TH1
Hemmung der Zytokinproduktion von TH1 und TH2
Hemmung der Makrophagenfunktion und IL 12
Produktion
Hemmung der Differenzierung von TH0 zu TH1
Differenzierung von TH0 zu TH2
Differenzierung von TH0 zu TH1
Wachstumsfaktor für TH1
________________________________20______________________________
1.6.4.1.3
Apoptose als Regulator der inflammatorischen Immunantwort
Wesentlicher Mechanismus zur Begrenzung einer TH-Zell mediierten Immunreaktion ist die
Apoptose, also der programmierte Zelltod der T-Zellen. Nach Aktivierung und klonaler Expansion
der TH-Zelle ist die Apoptose die Basis zu Erhaltung der Immunhomöostase, und zur Begrenzung
der Inflammation (Janssen, 2000). Entscheidender Unterschied zur Nekrose, die als Folge einer
unphysiologischen Zellschädigung mit irreversibler, osmotisch vermittelter Schwellung und
Zelllyse einhergeht, verläuft die Apoptose mit einer energieverbrauchenden, geordneten Sequenz
morphologischer unterscheidbarer Phasen. Nucleuskondensation, Verlust des Membranpotentials
von
Mitochondrien,
Chromatinkondensation,
Zellschrumpfung
und
die
Verteilung
der
Zellorganellen auf membranummantelte apoptotische Vesikel, sind die zytologischen Kennzeichen
des Vorgangs. Die Vesikel werden durch Makrophagen aufgenommen, so daß keine sekundäre
inflammatorische Reaktion zur Beseitigung der Zelltrümmer entsteht.
Im Rahmen einer physiologischen Immunreaktion exprimiert die bereits aktivierte TH-Zelle unter
dem Einfluß von IFN-γ und TNF-α eine vermehrte Menge von CD95-Oberflächenmarkern sowie
deren Bindungspartner, den CD95-Ligand (CD95-L) (Janssen, 2000). Der CD95-L wird ebenfalls
unter dem Einfluß der genannten Zytokine durch umgebende APC (v.a. Makrophagen, dendritische
Zellen, Astrozyten) des Mikromilieus an der Oberfläche exprimiert. Über den Kontakt von CD95
und CD95-L kommt es zur Aktivierung eines Kinasenzyklus innerhalb der TH-Zellen mit der
Folge ihrer Apoptose. Dieser Vorgang, der den wesentlichen Apoptosemechanismus von THZellen
darstellt,
wird
Aktivierungs-Induzierter-Zelltod
unterschiedlichen TH-Zellpopulationen
gibt
es
(AICD)
allerdings
genannt.
quantitative
Bezüglich
der
Unterschiede
der
Apoptosesensitivität (Oberg, 1997). IL-2 sensibilisiert im Rahmen einer inflammatorischen
Immunreaktion die TH-Zellen für den AICD. TH1 und TH0-Zellen exprimieren nach Stimulation
signifikant mehr CD95-L auf ihrer Oberfläche als TH2-Lymphozyten, so daß sie folglich auch
sensitiver gegenüber dem AICD als TH2-Zellen sind. Über den AICD kommt es also zu einer
Terminierung einer TH1-Zell mediierten Inflammation, über eine erhöhte Apoptoserate der TH1Lymphozyten die zum Überwiegen der antiinflammatorischen TH2-Zellen führt (Oberg, 1997).
1.6.4.1.4
Bedeutung des sICAM-1
Im Rahmen von entzündlichen Immunreaktionen spielen Adhäsionsmoleküle, eine entscheidende
Rolle für die Interaktion zwischen Entzündungszellen untereinander und in der Interaktion
zwischen Zellen und extrazellulärer Matrix. Die Adhäsionsmoleküle werden in 3 Gruppen
eingeteilt.
§
Selektine
§
Moleküle der Immunglobulin Superfamilie
§
Integrine
Das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) ist eine Oberflächenprotein von Endothelzellen
und
gehört
zur
Immunglobulin
Superfamilie.
Physiologischerweise
interagiert
es
mit
________________________________21______________________________
membrangebundenen Liganden wie LFA-1 auf TH-Zellen. ICAM-1 spielt eine wesentliche Rolle
in der Interaktion von TH-Lymphozyten und Gefäßendothel, im Rahmen der Extravasation der
Entzündungszellen bei einer Immunreaktion (Sleigh, 1993). TH1-Zytokine wie TNF-α und INF-γ
induzieren im Rahmen einer Inflammation die Expression von ICAM-1 auf Gefäßendothel, die
durch TH2-Zytokine wie TGF-β gehemmt werden kann (Lee, 1999). Über die Rezeptorinteraktion
von LFA-1 auf TH-Zellen und ICAM-1 auf Endothelzellen durchwandern die TH-Zellen die
Gefäßwand und dringen ins Gewebe ein, indem es durch die ICAM-1 Aktivierung zu einer
zytoskeletalen Reorganisation der Endothelzellen kommt. Im gesunden ZNS wird ICAM-1 nur im
geringen Maße auf Gefäßendothel der Hirngefäße gefunden, wobei die physiologische Rolle hier in
der
Möglichkeit
des
Einwanderns
von
T-Zellen im Rahmen einer immunologischen
Abwehrreaktion liegt (Lee, 1999).
1.6.4.2
1.6.4.2.1
Die pathogene Inflammation
Autoreaktive T-Zellen
Untersuchungen von EAE Spezies und histopathologische Studien an humanen MS-Geweben
lieferten die ersten Hinweise, daß den TH-Zellen als Träger der zellulären Immunantwort eine
entscheidende pathogene Bedeutung im Krankheitsgeschehen der SRMS zukommt. Die EAE kann
durch eine Vielzahl von gereinigten Myelinbestandteilen (siehe Tabelle 6) hervorgerufen werden,
die nach Inokulation in das Empfängertier MS typische Veränderungen hervorrufen. Ebenfalls
ließen sich Entzündungsschübe und Demyelinisierungen durch den isolierten Transfer
autoreaktiver MBP-spezifischer TH-Zellen in ansonsten immundefizienten (Abwesenheit von
Makrophagen, B-Zellen, zytotoxische T-Lymphozyten) Mäusen hervorrufen (Jones, 1999).
Tabelle 6: Autoantigene autoreaktiver TH-Zellen bei Multipler Sklerose (Hartung 1996)
Protein
Molekulargewicht
Lokalisation
(kDA)
Myelin Basisches Protein
18.5
Myelinmembranen und Zytoplasma von
(MBP)
Oligodendrozyten
Proteolipidprotein
30
Innerhalb von Myelinmembranen
(PLP)
Myelin-Oligodendrozyten54
Myelinmembran auf der Oberfläche von
Glykoprotein
Oligodendrozyten
(MOG)
Myelin-Assoziiertes-Glykoprotein
100
Periaxonale Myelinscheide
(MAG)
2,3-Cyclic Nucleotide 346
Zytoplasmatisch in Oligodendrozyten/
Phosphodiesterase
Myelinscheide
(CNPase)
21
Zytosolisches kalziumbindendes Protein
S 100β
in Astrozyten
Damit den autoreaktiven T-Zellen pathogene Eigenschaften zukommen, müssen sie aktiviert sein.
Dies geschieht wie Eingangs bereits erläutert über eine MHC restringierte Interaktion von APC und
T-Zelle. Die bei der MS aktivierten T-Lymphozyten gehören zur Subgruppe der CD4-positiven,
also der T-Helferzellen (Wingerchuk 2001). Die experimentell am besten charakterisierte,
________________________________22______________________________
autoreaktive
TH-Population
ist
die
MBP-spezifische,
die
sich
auch
bei
gesunden
Vergleichspopulationen finden läßt. Die im ZNS bei MS-Erkrankten gefundenen MBPspezifischen T-Helferzellen, zeigen allerdings eine von den kostimulatorischen Faktoren
unabhängige Aktivierung. Dies ist im Vergleich zu den naiven, MBP-spezifischen TH-Zellen bei
Gesunden als Hinweis auf eine frühere, periphere Aktivierung zu sehen (Scholz, 1998). Dies wird
unterstützt durch die Beobachtung das 84% der gefundenen autoreaktiven TH-Zellen bei der MS,
sich aus dem Kompartiment der Gedächtnisszellen rekrutieren (Burns, 1999). Die Produktion von
IFN-γ ist erhöht und die Produktion von IL-4 ist erniedrigt in den MBP spezifischen TH-Zellen
MS-Erkrankter. In Phasen der akuten Inflammation präsentieren die MBP spezifischen TH-Zellen
somit einen prädominanten TH1-Zelltyp (Clerici, 2001). Die MBP spezifischen TH-Zellen
gesunder Personen haben dagegen einen prädominanten TH2-Phänotyp (Rohowsky-Kochan,
2000).
Es
existieren
3
wesentliche,
immunodominante
Regionen
des
MBP-Moleküls
(Aminosäuresequenz: N-terminal 80-99, C-terminal 140-170), die via MHC-II Rezeptor erkannt
werden. Diese immunogenen Areale lassen sich mit den MHC-II Rezeptorsubtypen der HLA-DR
Klasse korrelieren, ein Zusammenhang der bei genetischen Dispositionsstudien ebenfalls gezeigt
werden konnte (siehe Genetische Faktoren der MS). Die Restriktion der autoimmunen Reaktion
durch den MHC-II Rezeptor bestätigt, daß der initial pathogene T-Zell Subtyp der TH-Population
angehören muß. Eine weitere Besonderheit der pathogenen TH-Zellen liegt in der Struktur ihres TZellrezeptors (TCR). Die Mehrzahl der T-Zellrezeptoren Gesunder besteht aus dem αβ-T-ZellRezeptor. TH-Zellen an SRMS-Erkrankter präsentieren allerdings mit deutlich höherer Frequenz
γδ-T-Zell-Rezeptoren (Al-Omaishi, 1999). Dieser besondere TCR-Aufbau verleiht den
autoreaktiven TH-Zellen zusätzlich die Fähigkeit Oligodendrozyten als Myelindonor selektiv, d.h.
nicht
MHC-restringiert
zu
erkennen,
und
somit
die
pathogenetisch
bedeutsame
Entzündungsreaktion des MS-Plaques via proinflammatorischer Zytokinausschüttung durch IFN-γ
und TNF-α, wie später noch zu erläutern ist, zu unterhalten (Zeine, 1998, Rajan, 1998).
1.6.4.2.2
Induktionsphase des Inflammationsschubs - die periphere
Aktivierung
Die Frage nach der Entstehung der autoreaktiven TH-Zellen ist bisher ungeklärt. Es existieren
differente experimentelle Hinweise, wie eine solche TH-Population entstehen könnte. Die für die
MHC/TCR-Bindung entscheidende Aminosäuresequenz des MBP-Moleküls findet sich in der
Position 82-100. Ein TCR kann mit einer großen Vielfalt von MHC-II/Peptid Komplexen in
Kontakt treten. Exogene Antigene bzw. Autoantigene die Aminosäuresequenzhomologien mit dem
MBP-Peptid teilen, können MBP spezifische TH-Zellklone entstehen lassen bzw. bereits
Vorhandene aktivieren (Wucherpfennig, 1997). Die Homologien der Sequenzen bedürfen nicht mal
einer exakten Übereinstimmung, so daß eine ganze Reihe verschiedener bakterieller und viraler
Peptide in Frage kommen. MBP-spezifische Autoantikörper aus MS-Hirngewebsproben zeigen
________________________________23______________________________
eine Kreuzreaktivität mit entsprechenden mikrobiellen Antigenen, so daß die hier gefundene
Strukturhomologie von Epitopen mikrobieller Erreger und MBP das Phänomen der molekularen
Mimikry als Prinzip der Entstehung autoreaktiver TH-Zellen plausibel erscheinen läßt (Conlon,
1999). Ein alternativer Enstehungsmechanismus autoreaktiver TH-Zellen ist das Vorkommen von
Superantigenen. Unter Superantigenen versteht man mikrobielle Proteine, die anders als normale
Peptidantigene mit dem MHC II/TCR-Komplex interagieren und dadurch zur Stimulation einer
sehr großen Anzahl von TH-Lymphozyten führen. Sie binden weit entfernt von der
komplementaritätsbestimmenden Region an die β-Kette des TCR, sowie weit entfernt der
peptidbindenden Furche an die Außenseite des MHC-II Moleküls. Die Bindung solcher
Superantigene ist somit nicht auf einzelne TH-Zellklone beschränkt, da sich die benutzten
Bindungssequenzen auf nahezu allen TCR finden. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit einen
autoreaktiven Zellklon zu aktivieren. Experimentell ließ sich eine EAE in Mäusen durch
Inokulation von Superantigenen reaktivieren (Sörensen, 1998). Eine weiteres Prinzip der
Entstehung autoreaktiver TH-Zellen ist die sogenannte „Bystander“-Aktivierung. Dies bedeutet,
daß eine antigenunabhängige Stimulierung vorhandener TH-Lymphozyten des Kompartiments der
Gedächtnisszellen zu autoreaktiven T-Zellen führt. MBP-spezifische T-Lymphozyten von MSErkrankten zeigen bei einer Inkubation mit bakteriellen Lipoplysacchariden bzw. DNS, anhand
ihres sezernierten Zytokinspektrums einen proinflammatorischen TH1-Subtyp (Conlon, 1999).
Derselbe TH-Subtyp führt auch im Tiermodell zur Auslösung einer EAE (Segal, 1997).
1.6.4.2.3
Induktionsphase des Inflammationsschubs - die Überwindung
der Blut/Hirnschranke
Das ZNS wird mit seiner Blut/Hirnschranke als privilegiertes Organ der Immunüberwachung
angesehen. Aktivierten, autoreaktiven TH-Zellen ist es allerdings möglich die Blut/Hirnschranke zu
überwinden und so im ZNS einen Entzündungsvorgang in Gang zu setzen, respektive ihn zu
unterhalten (Martino, 2000). Bei der SRMS können aktivierte TH-Zellen unabhängig ihrer
Spezifität ins ZNS einwandern, ein Prozeß der etwa 9-12 Stunden dauert (Wucherpfennig, 1997).
Die aktivierten TH-Lymphozyten exprimieren große Mengen von Leukointegrinen wie LFA-1 und
Selektinliganden wie sLE (Selektin-Ligand-E). Diese treten in Kontakt mit dem Adhäsionsmolekül
ICAM-1, daß auf Endothelzelloberflächen v.a. postkapillärer Venolen im ZNS in zunächst geringer
Menge exprimiert wird (Conlon, 1999). Es folgt eine vielstufige Interaktion zwischen TH-Zellen
und Endothelzell-Adhäsionsmolekülen, welche die Migration der autoreaktiven TH-Zellen ins ZNS
mediiert.
Zunächst etabliert sich ein reversibler Kontakt zwischen Endothelzellselektin E-Selektin und dem
TH-Zell-Liganden sLE. Dieser in der Literatur als „Rolling“ bekannte Schritt, wird durch ein
irreversible Bindung von dem Integrin LFA-1 mit dem endothelialen Adhäsionsmolekül ICAM-1
gefolgt (Lee, 1999). Damit die dritte Phase der ZNS Infiltration, die Diapedese abgeschlossen
werden kann, müssen die TH-Lymphozyten nun die extrazelluläre Matrix aus Typ 4 Kollagen
________________________________24______________________________
durchdringen. Hierbei spielen die von den TH-Zellen sezernierten Matrix- Metalloproteinasen 2
und 9 (Gelatinase A und B) eine wesentliche Rolle (Conlon, 1999). Sie eröffnen die kollagene
Basalmembran, und führen so zum Durchtritt der TH-Zellen. Damit ist die sogenannte
Induktionsphase der MS-Pathogenese abgeschlossen, ein Prozeß der im EAE Modell histologisch
bereits gezeigt werden konnte (Wingerchuk, 2001).
Der beschriebene Prozeß der Durchwanderung der Blut/Hirnschranke wird durch die nachfolgend
zu beschreibende, entstehende Inflammation noch wesentlich verstärkt und vollzieht sich im
Verlaufe der Erkrankung immer wiederkehrend (Martino, 2000). Dadurch kommt es zum
Zusammenbruch der Blut/Hirnschranke, wie in EAE Modellen und MS-Biopsien mittels MRT und
Immunhistochemie gezeigt werden konnte. Ursächlich für die im folgenden rekurrierenden
Migrationen der TH-Zellen über die Blut/Hirnschranke können banale virale bzw. bakterielle
Infekte sein, die zur erneuten Aktivierung autoreaktiver TH-Zellen bei MS-Erkrankten führen.
Somit wird der initiale, hier noch zu beschreibende inflammatorische, lokale ZNS-Prozeß, durch
rezidivierende, periphere Inflammationen reaktiviert. Dieses Prinzip der „dualen InflammationsHypothese“
nach
Martino
und
Mitarbeitern
(Martino,
2000),
erlaubt
die
langfristige
Chronifizierung der SRMS lediglich auf der Grundlage der rekurrenten inflammatorischen
Reaktion.
1.6.4.2.4
Effektorphase des Inflammationsschubs- TH1, die
proinflammatorische Reaktion
Die ins ZNS eingedrungenen TH-Zellen werden hier noch einmal reaktiviert, und setzen so eine
Entzündungsreaktion in Gang. Diese Reaktivierung geschieht perivaskulär und MHC-II restringiert
durch
vom
Knochenmark
eingewanderte,
antigenpräsentierende
Mikrogliazellen
und
Makrophagen. Die eingewanderten TH-Populationen proliferieren klonal, und lassen sich anhand
der von ihnen sezernierten Zytokine als TH-1 Subtyp klassifizieren (Carson, 1999). Die
Proliferation der TH1-Zellen geschieht mikroglial gestützt im perivenösen Bereich der lateralen
Hirnventrikel, durch Sekretion von IL-2 als autokrinem Wachstumsfaktor (Muraille, 1998). Die
entstehenden TH1-Zellklone sezernieren mit IFN-γγ ein pleiotropes Zytokin, daß eine verstärkte
Exprimierung von Adhäsionsmolekülen wie ICAM-1 auf Endothelzellen zur Folge hat. Dies führt
zu einer verstärkten Immigration von TH-Lymphozyten und Makrophagen in das ZNS und somit
zu
einer
exponentiellen
Verstärkung
der
folgenden
Inflammationsreaktionen.
Erhöhte
Serumkonzentrationen von löslichem ICAM-1 korrelieren bei SRMS mit der Krankheitsaktivität
(Giovannoni, 2001), und IFN-γ wird in hohen Konzentrationen in aktiven Plaques von MSGehirnen exprimiert (Conlon, 1999). Unter dem Einfluß der proinflammatorischen Zytokine INF-γ
und TNF-α kommt es zu einer verstärkten MHC-II Expression und Autoantigenpräsentation der
APC (Wingerchuk, 2001). Wie bereits erläutert, ist MBP ein relevantes, präsentiertes Autoantigen.
Die verstärkte Autoantigenpräsentation führt wiederum zu einer Steigerung der TH-1 Aktivierung
und über die nun ebenfalls vermehrt exprimierten MHC-I Rezeptoren der APC, zu einer
________________________________25______________________________
Stimulierung zytotoxischer T-Lymphozyten (Lee, 1999). IFN-γ steigert zusätzlich die Expression
von FC-Rezeptoren auf Mikrogliazellen, so daß diese später mit Autoantikörpern beladendes
Myelin phagozytieren können (Conlon, 1999). Weiterhin aktiviert INF-γ die intrazelluläre Funktion
von NADPH-Oxidase und induzierbarer Nitratoxid-Synthetase in Makrophagen bzw. Mikroglia.
Die genannten APC sezernieren daraufhin verstärkt oxidative Radikale wie Stickstoffmonoxid
(NO•), Wasserstoffperoxid (H2 O2 ) und TNF-α (Trapp, 1999). Resultat der Sekretion dieser
neurotoxischen Produkte von Makrophagen ist eine noch genauer zu beschreibende
Demyelinisierung via Lipidperoxidation, sowie die axonale Zerstörung im Bereich eines MS
Plaques.
Ein Teil der Demyelinisierung verläuft über direkt zytotoxische Effekte des INF-γ
auf
Oligodendrogliazellen, ein Effekt der durch das gleichzeitige Einwirken von TNF-α noch deutlich
verstärkt wird (Popko, 1999).
IFN-γ und TNF-α führen bei Oligodendrozyten zu einer Expression des CD95-Liganden, der bei
Bindung des auf aktivierten TH-Zellen exprimierten CD95-Rezeptors eine Apoptose der
myelinbildenden Zellen des ZNS einleitet (Liblau, 1998). INF-γ fördert weiterhin die
Differenzierung von TH0 zu TH1-Lymphozyten (Mosmann, 1996), so daß resultierend eine
weitere Verstärkung der proinflammatorischen Situation eintritt. Der deutlichste Hinweis einer
pathogenen Bedeutung des genannten Interferons bei der SRMS lieferte eine klinische Studie, in
deren Rahmen eine therapeutische Applikation des IFN-γ zu einer vermehrten Zahl von Schüben
im Zusammenhang mit einer Makrophagenaktivierung führte (Panitch, 1987).
TNF-α
α
ebenfalls Zytokin des TH1-Subtyps ähnelt in seiner Multifunktionalität dem
Vorhergenannten. Es vermittelt seine Wirkungen über 2 Rezeptoren: p55 und p75. Die wichtigste,
pathogene Eigenschaft des TNF-α ist ebenfalls seine Myelintoxizität. Ein bereits erläuterter
Mechanismus ist die induzierte Apoptose der Oligodendrozyten, die zu einer reduzierten Anzahl
derselben im MS Plaque führt. Der andere wesentliche Mechanismus ist die direkte Myelotoxizität
(Ledeen, 1998). TNF-α erzeugt eine Kalium-Kanal Dysfunktion in Oligodendrozyten, die eine
Schwellung des Myelins aufgrund einer Elektrolytdysbalance erzeugt. Über eine Aktivierung einer
Myelin assoziierten Sphingomyelinase (Smase), entsteht daraufhin eine Hydrolyse des
Sphingomyelinanteiles innerhalb des Myelins. Als Reaktion hierauf kommt es zur Instabilität der
Myelinscheide und zur Präsentation von Neoautoantigenen wie MBP, PLP, MOG, MAG an der
Myelinoberfläche. Hier liegen sie als Angriffspunkte von phagozytierenden Makrophagen und
komplementbindenden Autoantikörpern bereit. Folge der Myelindestruktion mit Freisetzung der
genannten Neoautoantigenen, ist die erneute Prozessierung der Neoautoantigene durch APC, die zu
einem „Antigen-Sprouting“ führt (Conlon, 1999). Folge hieraus ist eine Vermehrung von
Zielantigenen und Effektorwegen. Neuere Daten zeigen, daß es im Rahmen der genannten
Makrophagenattacke der Myelinscheide und der damit verbundenen Ausschüttung neurotoxischer
Effektoren, bereits in der Frühphase der MS zu einer irreversiblen Zerstörung von Axonen kommt
die deutlich mit dem klinischen Grad der Behinderung korrelieren (Trapp, 1999). Der genaue
________________________________26______________________________
Vorgang einer derartigen Zerstörung von Axonen, ist noch unklar. Neben den myelintoxischen
Molekülen wie NO, H2 O2 , IFN-γ und TNF-α, scheint die chronische Demyelinisierung selber ein
weiterer Mechanismus der Axonpathologie zu sein (Rieckmann, 2001). Myelinbestandteile, v.a.
MAG und PLP senden trophische Signale an das Axon via Aktivierung axonaler Kinasen und
Phosphatasen, und aktivieren so die Hydrolyse von Acetylaspartat als Energiespeicher von
Axonen. Dieser Mechanismus ist in demyelinisierten Axonen gestört, so daß die nötige Energie zur
Aufrechterhaltung
wesentlicher
zytoskeletaler
Proteine
wie
Neurofilamente
fehlt.
Die
Demyelinisierung führt also schon in einer frühen Phase der Erkrankung zur axonalen Zerstörung.
Andererseits induzieren IFN-γ und TNF-α in Neuriten eine MHC I Expression, so daß diese über
zytotoxische T-Lymphozyten
selektiv zerstört werden (Medana, 2001). Demyelinisierte
Oligodendrozyten exprimieren Hitze-Schock-Proteine (HSP) wie αβ-Crystallin auf ihrer
Oberfläche als Folge der Entmarkungsvorgänge. Diese HSP sind Rezeptormoleküle für γδ-THZellen, die ohne MHC-Restriktion über die Sekretion von TNF-α direkt myelintoxisch sind
(Wingerchuk, 2001). Die beschriebenen molekularen Mechanismen sind korrelierbar mit der
klinischen Beobachtung, daß die TNF-α Konzentrationen im Liquor, in PBL und im Gewebe mit
der Schubrate und dem EDSS positiv korreliert sind (Ledeen, 1998).
Die Rolle der humoralen Immunantwort in der Pathogenese der MS ist nicht so eindeutig wie die
der zuvor beschriebenen zellulären Immunantwort. Im ZNS Erkrankter findet sich eine
oligoklonale Immunglobulinproduktion seitens aktivierter B-Zellen (Plasmazellen). Es finden sich
Autoantikörper v.a. der Klasse IgG1 gegen MBP, PLP und
im Besonderen gegen auf
Oligodendrozytenoberflächen lokalisiertes MOG (Wingerchuk, 2001). Die Liquoranalyse von MSPatienten zeigt aber auch hier eine Prädominanz von IgG1 im Sinne einer TH1 mediierten
Immunreaktion, und eine signifikant reduzierte IgE Konzentration als biologischer Marker einer
TH2 mediierten Reaktion (Greve 2001). Das Immunglobulin dominierte histopathologische
Schädigungsmuster entspricht dem Subtyp II der SRMS nach Lucchinetti und Mitarbeitern
(Lucchinetti 2000). Anti-MOG-Immunglobuline binden an die Myelinoberfläche und aktivieren
über ihren FC-Rezeptor bereits aktivierte Makrophagen zu einer weiteren Verstärkung axon-bzw.
myelintoxischer
Effektorprodukte.
Parallel
hierzu
kommt
es
zur
Aktivierung
des
Komplementsystems, daß über seinen Membrane-Attack-Komplex eine Myelinzytolyse verursacht
(Hartung, 1996). Weitere Komponenten des Komplementsystems wie C3a, C5a und C3b wirken
als chemotaktische Faktoren der Makrophagen/Mikrogliaattraktion. Zusätzlich vermitteln die
benannten Autoantikörper einen FC-Rezeptor gesteuerten Phagozytosemechanismus von
Myelinkomponenten seitens der Makrophagen/Mikrogliapopulation des ZNS. Folge der
Phagozytose und intrazellulären Prozessierung von Myelinbestandteilen, ist hier wiederum das
inter- bzw. intramolekulare „Antigen-Sprouting“. Dies bedeutet nun, daß weitere autoreaktive
TH1-Zellklone aktiviert werden und die Immunantwort sich im Verlauf von Erkrankungsschüben
somit gegen ein zunehmend breiteres Spektrum von Autoantigenen richtet (Wingerchuk 2001).
________________________________27______________________________
Endstadium aller erläuterten Prozesse ist somit eine seitens der TH1-Zellen vermittelte Myelin- und
Axonschädigung unter Einbeziehung der Makrophagen und Mikrogliapopulationen.
1.6.4.2.5
Effektorphase des Inflammationsschubs - TH2/TH3, die
antiinflammatorische Reaktion
Das Immunsystem MS-Erkrankter besitzt eingeschränkte, physiologische Regulationsmechanismen
um einen induzierten Entzündungsschub zu beenden. Ein wesentlicher Aspekt ist der
programmierte Zelltod autoreaktiver TH-Zellen. In Entzündungsplaques von MS-Erkrankten findet
eine Elimination von aktivierten, autoreaktiven TH-Lymphozyten über den AICD (Liblau, 1998)
statt. Dieser Vorgang ist allerdings unvollständig und somit möglicherweise ein Grund von
wiederkehrenden Entzündungsschüben. Ursächlich ist eine geringere CD95 Expression auf
aktivierten TH-Zellen MS-Erkrankter im Vergleich zu Gesunden, als auch die Produktion
antiapoptotischer Proteine wie IAP (Inhibitors of Apoptosis Proteins) (Sharief, 2001). Allerdings
sind TH1-Lymphozyten deutlich sensitiver für den Apoptoseprozeß, so daß es im Rahmen eines
singulären Inflammationsschubs zum Überwiegen MBP spezifischer TH2- Zellklone kommt (Zang,
1999). Diese sezernieren mit IL-10 und IL-4 zwei noch zu erläuternde antiinflammatorische
Zytokine die den axon- und myelindestruktiven Vorgang beenden, ein Vorgang der als „Bystander
Supression“ bekannt ist. Apoptotische TH1- und TH2-Zellen sezernieren verstärkt IL-10, welches
die erhöhte Apoptoserate über eine verstärkte Genexpression des apoptosehemmenden Gens Bcl-2
wieder senkt (Gao, 1998). Zusätzlich hemmt IL-10 die Sekretion der Zytokine differenzierter TH1Populationen sowie die Differenzierung von TH0 zu TH1-Zellen (Cohen, 1997). Resultat dieser
Mechanismen ist ein nun deutliches Überwiegen der TH2-Lymphozyten, ein Befund der bei MSErkrankten mit SRMS mit einer Remission bzw. stabilen Krankheitsphase assoziiert ist
(Wingerchuk, 2001). Ein wesentlicher Botenstoff der nun dominierenden TH2-Zellen ist IL-4. Es
hemmt die Differenzierung von ins ZNS eingewanderten TH0 zu TH1-Zellen und fördert als
autokriner Wachstumsfaktor von TH2-Lymphozyten die klonale Proliferation von TH2 Zellen
(Link, 1998).. IL-4 greift zusätzlich direkt in das pathogenetische Geschehen ein, indem es
Makrophagen zur Apoptose bringt und damit eine wichtige Effektorzelle der Demyelinisierung
ausschaltet (Estaquier, 1997). Es existieren auch Hinweise, daß eine B-Zell Stimulation über IL-4
und eine dadurch bedingte Autoantikörperproduktion möglicherweise eine protektive Rolle in der
Demyelinisierung einnimmt. In den sogenannten „Shadow-Plaques“ findet sich eine deutliche
Remyelinisierungstendenz der geschädigten Axone. Diese kann möglicherweise über einen MBPspezifischen Autoantikörper erklärt werden, der remyelinisierungsfördernd ist (Asakura, 1998). Die
durch IL-4 vermittelte Differenzierung von TH0 zu TH3, resultiert in einem gesteigerter Auftreten
der TGF-β Produktion.
TGF-β
β ist ein chemotaktischer Faktor für das Einwandern von Astrozyten in den
Inflammationsprozeß, letztendlich also mitverantwortlich für die entstehende Glianarbe.
Wesentlichster Effekt in Kombination mit IL-10 ist allerdings die Funktionshemmung von
________________________________28______________________________
Mikroglia und Makrophagen. Der Ausstoß axon- und myelintoxischer Produkte wie NO, NO3 ,
H2 O2 wird blockiert. Dieser experimentell belegbare Effekt korreliert invers mit der Schwere der
Krankheitsprogression, so daß vermehrte TH3-Zellen offensichtlich die Remissionsphase des
Entzündungsschubes
einleiten
(Pratt,
1998).
TGF-β
senkt
zusätzlich
die Potenz zur
Autoantigenpräsentation von APC, indem es die Expression von MHC-II Molekülen hemmt.
Weiterhin blockiert TGF-β die klonale Expansion von B-Zellen und fördert die Differenzierung
von TH0 zu TH2-Lymphozyten. Im Gegenzug hemmt TGF-β die Zytokinsekretion von TH1 und
blockiert deren Differenzierung (Link, 1998).
Die proliferierenden TH2-Lymphozyten sezernieren massiv IL-10, einen Botenstoff der die stark
gesteigerte Migration der autoreaktiven T-Zellen durch die Blut/Hirnschranke hemmt. IL-10 wie
auch TGF-β antagonisieren den expressionsteigernden Effekt von TNF-α und IFN-γ auf die
endotheliale Adhäsionsmolekülproduktion, v.a. von ICAM-1 und unterbinden dadurch den
Initialschritt der Migration durch die Blut/Hirnschranke (Lee, 1999). Darüber hinaus hemmt IL-10
die TNF-α und IFN-γ induzierte IL-12 Produktion von Makrophagen, wodurch die Proliferation
und die Differenzierung von TH1-Lymphozyten gehemmt wird (Muraille, 1998).
Ein weiterer regulativer Mechanismus der Entzündungsbegrenzung, ist durch das verstärkte
Auftreten eines löslichen ICAM-1 (sICAM-1) Moleküls im Serum und Liquor während der
Remissionsphase der Inflammation gekennzeichnet (Lee, 1999). Die bei der Migration durch die
Blut/Hirnschranke von TH-Zellen sezernierten Metalloproteinasen lösen die an den Endothelzellen
massenhaft präsentierten Adhäsionsmoleküle enzymatisch ab, und erzeugen damit deutlich erhöhte
Plasma und Liquorspiegel. Die löslichen Formen des ICAM-1 sind nun in der Lage über ihre
Bindung mit dem Oberflächenmolekül LFA-1 auf im Blut zirkulierenden TH-Lymphozyten, die
Bindungsstellen für die Adhäsion an die Endothelzelloberfläche zu blockieren. Folglich wird
dadurch die Invasion autoreaktiver TH-Zellen in das ZNS reduziert (Rieckmann, 1995).
Zusammenfassend herrscht jetzt ein Klima in dem die oben beschriebenen inflammatorischen
Prozesse gehemmt werden, aber nur solange bis es zu einer erneuten peripheren Aktivierung
autoreaktiver TH1-Lymphozyten kommt. Die graphische Zusammenfassung der MS-Pathogenese
gibt Abbildung 3 wieder.
Das beschriebene „Epitope -Spreading“ führt im Verlaufe rezidivierender Entzündungsschübe zu
einer Aktivierung von immer mehr Effektormechanismen gegen eine immer größere Anzahl von
Autoantigenen. Dies führt zum langfristig zum Versagen der antiinflammatorischen Mechanismen
und damit zur
Krankheitsprogression (Weiner, 1998, Conlon, 1999, Wingerchuk, 2001). Die
initiale, inflammatorische axonale Zerstörung reduziert die funktionelle Reserve des ZNS. Die
kontinuierlich fortschreitende Demyelinisierung, die eine weitere Axonschädigung bedingt, erreicht
irgendwann einen Grenzwert der axonalen Zerstörung. Dann erreicht der Patient die sekundärprogrediente Phase der Erkrankung (Trapp, 1999).
________________________________29______________________________
1
M
A
Interaktion von TH und
Endothelzelle bei ZNSMigration
C
ZNS
I
TH 1
LFA-1
Endothel
IL12
_TGF β
APC
TGF β
IFN γ
_
Migration
APC
Periphere
Aktivierung
IL10
Y
B
+
IL 4
TNF α
Myelinphagozytose
O H • , NO •
MYELIN
v.a. MBP
TH3
+
IL10 T H 2
Blut/Hirnschranke
BLUT
_
_
Axon
B
YY
Y
MA
P
TH1
+
IFN γ
TH 1
TH1
IL2
TNF α
Endothel
MB
+
IgG1,
IgG4-AK
Opsonierung
Aktivierung zytotoxischer
T-Zellen und
Axonzerstörung
Abbildung 3: Zusammenfassung der MS-Pathogenese: Darstellung der proinflammatorischen TH1-Zellen
und ihrer Effektormechanismen, sowie der antiinflammatorischen TH2/TH3-Zellen mit ihren
Zytokinwirkungen.
1.7
Fumarsäureester (FAE)
1.7.1 Geschichte der FAE
Die Fumarsäure (trans-Butadiensäure) ist eine alipathische Dicarbonsäure, welche im menschlichen
Stoffwechsel (Zitratzyklus, Harnstoffzyklus und Tyrosin/Phenylalaninabbau) ubiquitär vorhanden
ist. Die Fumarsäure wird in ihrer therapeutischen Anwendung meist als Mischpräparat aus
Fumarsäuremonoethylester und Fumarsäuredimethylester bzw. in ihrer Salzform appliziert, so wie
es in Tabelle 7 aufgeführt ist (Altmeyer, 1994). Pharmakodynamische Wirkkomponente ist das
Monomethylfumarat (MMF), daß aus Dimethylfumarat (DMF) intrazellulär nach Esterhydrolyse
freigesetzt wird (Vandermeeren, 1997).
Tabelle 7: Fumarsäure und ihre Ester
Substanz
Fumarsäure
Fumarsäuremonoethylester
Fumarsäuredimethylester
Strukturformel
HOOC-HC=CH-COOH
HOOC-HC=CH-CO-O-CH2 -CH3
CH3 -O-OC- HC=CH-CO-O-CH3
Die humanmedizinische Bedeutung der FAE wurde erstmals durch den Chemiker Schweckendiek
1959 entdeckt. Schweckendiek war schwer an der Psoriasis (Schuppenflechte) erkrankt, und
glaubte den pathogenetisch bedeutsamen Stoffwechseldefekt im Zitratsäurezyklus zu lokalisieren.
In seinen Selbstversuchen mit einer täglichen Einnahme von 900 mg Fumarsäure per os, erzielte
________________________________30______________________________
der Chemiker ein Abheilen der krankheitsbestimmenden Effloreszenzen nach einigen Tagen
(Schweckendiek, 1959).
In folgenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß insbesondere FAE und deren Salze
aufgrund ihrer höheren Lipidlöslichkeit und der damit verbundenen Resorption, eine bessere
systemische Wirksamkeit zeigten. Der hohe antipsoriatische Effekt der FAE konnte erstmals durch
Dubiel und Happle bestätigt werden (Dubiel, 1972). In den Studien der folgenden Jahre wurden die
Therapiekonzepte kontinuierlich optimiert, bis Altmeyer und Mitarbeiter 1994 in einer
multizentrischen, plazebokontrollierten Studie das heutige gültige Therapieregime entwickelten
(Altmeyer,
1994).
Die
derzeitig
zugelassenen
Präparate
Fumaderm
initial
(Fumarsäuredimethylester: 30 mg, Ethylhydrogenfumarat: Calciumsalz 67 mg, Magnesiumsalz 5
mg, Zinksalz 3 mg) und Fumaderm (Fumarsäuredimethylester: 120 mg, Ethylhydrogenfumarat:
Calciumsalz 87 mg, Magnesiumsalz 5 mg, Zinksalz 3 mg) werden nach einem festen Schema, wie
in der vorliegenden Arbeit durchgeführt, dosiert. In einer 1996 veröffentlichen Untersuchung der
Arbeitsgruppe um P. Altmeyer, konnte die Wirksamkeit der Therapie bestätigt werden (90%
Ansprechrate der Therapie) und gleichzeitig ein später zu erläuterndes Nebenwirkungsprofil
erarbeitet werden (Altmeyer, 1996).
Die Fumarsäurederivate werden nicht nur in der Humanmedizin, sondern auch als
Futtermittelzusatz in der Tierindustrie und als Säuerungsmittel, Geschmacksverstärker und
Antioxydans in der Lebensmittelindustrie eingesetzt. Im pharmazeutischen Bereich werden sie als
Additiva in der Medikamentenherstellung genutzt.
1.7.2 Wirksamkeit und Verträglichkeit der FAE
Indikation einer FAE-Therapie bei der Psoriasis ist die schwerverlaufende, schubförmige und
therapierefraktäre Psoriasis vulgaris, als auch die Psoriasis-Arthritis. Die Wirksamkeit der FAETherapie ließ sich durch verschiedenste Studien belegen (Altmeyer, 1996). Diese Studien zeigten in
71% der Fälle eine Besserung des Krankheitsbildes der Psoriasis. Die therapeutische Wirksamkeit
stellt sich erfahrungsgemäß erst nach der 2. bis 12. Woche ein, in 30% zwischen der 2.- 4. Woche.
FAE zeigen eine bessere intestinale Resorption als nicht veresterte Fumarsäure, ein Grund für
deren Applikation als Ester. Das Nebenwirkungsspektrum läßt zwischen für den Patienten leichte
und potentiell schwere Wirkungen unterscheiden.
Zu den leichten, ungefährlichen Nebenwirkungen zählen in 27% Diarrhoen, in 35%
Magenbeschwerden, in 21% Flush, in 2% Hautbrennen, in 94% leichte Lymphopenie und in 50%
eine transiente Eosinophilie (Altmeyer, 1996). Als potentiell schwere und gefährliche
Nebenwirkung tauchen in der Literatur immer wieder Einzelfallbeschreibungen über eine
Nephrotoxizität der FAE auf. Sie berichten von einem reversiblen, tubulären Nierenversagen
(Roodnat, 1982). Bisher gibt es hier keinen schlüssigen pathogenetischen Erklärungsmechanismus,
jedoch scheinen diese Fälle im Zusammenhang mit einer Überdosierung von FAE durch
zusätzliche kutane Applikation zu stehen. Aufgrund der geringen Molekülgröße der FAE kommt es
________________________________31______________________________
zu einer Resorption über die Kutis, so daß die rasche Anflutung hoher FAE-Konzentrationen in der
Niere aufgrund der ungewollten Dosissteigerung zu einer Niereninsuffizienz führt (Matthes, 1995).
Die erste systematische Untersuchung einer potentiellen Nephrotoxizität der FAE bei 47 Patienten
mit einer mindestens dreimonatigen Therapie, zeigte bei 50% eine passagere tubuläre Insuffizienz
aber keine schwerwiegenden nephrologischen Komplikationen (Boesken, 1998).
1.7.3 Molekulare und immunologische Wirkmechanismen der FAE
Erste pathogenetische Überlegungen von Schweckendiek postulierten einen Mangel an Fumarsäure
als Ursache der Psoriasis, so daß eine erhöhte Zufuhr derselben diese Defizit beheben sollte
(Schweckendiek, 1967). Es wurde noch weitere 10 Jahre über Stoffwechseldefekte im Zitratzyklus
spekuliert, bis dann 1975 die ersten zellulären Studien durchgeführt wurden. Es konnte eine
dosisabhängige Reduktion des Einbaus von radioaktiv-markiertem
14
C-Thymidin in die DNA, und
radioaktiv markierter Aminosäuren in Proteine humaner Lymphozyten gezeigt werden (Petres,
1997). Der gefundene antiproliferative Effekt, gab den ersten Hinweis auf eine immunsuppressive
Wirkung der FAE.
1994 wurde die bekannte Nebenwirkung einer Lymphopenie im Rahmen einer 12 wöchigen FAETherapie
systematisch
untersucht
(Bacharach-Buhles, 1994). In der inflammatorischen
psoriatischen Läsion fand sich eine disproportionierte überdeutliche Reduktion der TH-Zellen von
84% im Vergleich zu dem übrigen zellulären Infiltrat. Resultat dieser Beobachtung war die
Feststellung, daß FAE offensichtlich eine selektive und antiproliferative Wirkung auf TH-Zellen
besitzen, ein Effekt welcher dem klinischen Heilungsprozeß vorangeht. Eine weitergehende
Untersuchung differenzierte den Einfluß der FAE auf unterschiedlichen Lymphozytenpopulationen
in einer 12-monatigen Dauertherapie von Psoriatikern (Höxtermann, 1998). Periphere
Blutlymphozyten (PBL) wurden durchflußzytometrisch analysiert. Im Verlauf der Untersuchung
zeigte sich auch hier eine überproportionale Suppression der Lymphozyten im Vergleich zu den
Leukozyten. TH-Zellen und NK-Zellen erreichten am Ende der Studie etwa 30% ihres
Ausgangsniveaus. Besonders eindrucksvoll war die Reduktion bei den Zytotoxischen bzw.
Suppressor-T-Zellen und den TH-Zellen. Ursächlich scheint nach neueren experimentellen Daten,
eine Induktion von Apoptose in Lymphozyten zu sein (Sebök, 2000), wobei die Untersuchung
allerdings keine Differenzierung der Subpopulationen vornahm.
Die Suche nach der molekularen Wirkung von FAE auf Immunzellen, führte zur Entdeckung von
spezifischen Monomethylfumaratrezeptoren auf Leukozyten, die allerdings auf TH-Lymphozyten
bisher nicht nachgewiesen wurden (Nibbering, 1997). Monomethylfumarat (MMF) ist laut der
Herstellerinformation der aktive Metabolit der FAE. Er bindet an bisher nicht näher charakterisierte
Rezeptoren auf der Leukozytenmembran. Folge hieraus ist eine Aktivierung von Pertussistoxin
sensitiven
G-Proteinen,
die
eine
Induktion
von
intrazellulärer
Tyrosinkinase
und
Histonproteinkinase 4 evozieren. Resultierend kommt es zu einer Beeinflussung von
________________________________32______________________________
Transkriptionfaktoren wie dem Nukleären Faktor κB (NFκB). Somit entsteht eine veränderte
Genexpression, die zu einer veränderten Zytokinproduktion führt (Vandermeeren, 2001).
Die Arbeitsgruppe um de Jong zeigte (De Jong, 1996), daß MMF eine dosisabhängige Induktion
der IL-4 Produktion bei TH-Zellen gesunder Probanden erzeugte. Zehnfach erhöhte IL-4 Werte
wurden bei Konzentrationen von 200 µM MMF erreicht, wobei die IL-2, IFN-γ Produktion und die
TH-Zellproliferation in diesen Kulturen nicht verändert wurden. Eine gleichartige Veränderung
wurde auch bei geringeren Konzentrationen (36-108 µM) gesehen, Konzentrationen die dem
Blutspiegel bei der Standardtherapie mit Fumaderm initial und Fumaderm entsprachen. Weitere
Analysen zeigten, daß die oben beschriebene Zytokinveränderung nur bei bereits antigenaktivierten
TH-Zellen zustande kam. Differenzierte TH1- und naive TH0 -Zellen exprimierten nach Inkubation
mit MMF ebenfalls zehnfach erhöhte Konzentrationen von IL-4. Das Fazit aus diesen
Beobachtungen war, daß MMF unabhängig von der Anwesenheit von APC die TH-Zell-Aktivität
beeinflussen konnte (De Jong, 1996). Die Induktion des TH2-Zelltyp definierenden Zytokins IL-4
geschah nicht indirekt über eine Hemmung von TH1-Zytokinen (hier: IFN-γ), sondern direkt über
den oben beschriebenen molekularen Wirkmechanismus. Dadurch wurde deutlich, daß MMF
bereits differenzierte TH1-Zellen zu einer zusätzlichen Sezernierung von IL-4 veranlaßte, so daß
diese Zellen nun eher als TH0-Zelltyp klassifiziert werden mußten. Klinisch gingen diese
Veränderungen mit einem Abheilen des Psoriasis-Plaques einher, so daß die gefundene selektive
Induktion von TH2-Zytokinen, die bei der Psoriasis pathogenetisch bedeutsame, inflammatorische
TH1 Reaktion hemmte ( de Jong, 1997).
Asadullah (Asadullah, 1997) und seine Arbeitsgruppe unterstützten durch ihre Forschungen, die
Beobachtung einer selektiven TH2-Zytokininduktion im Blut Gesunder und Psoriatiker. MMF
erhöhte die Sekretion von TNF-α und IL-10 in TH-Lymphozyten als auch in Monozyten bzw.
Makrophagen, ohne die IL-12 Sekretion der Monozyten zu beeinflussen.
Nach einer initialen Induktion der TNF-α Sekretion in den ersten 2 Tagen der FAE- Therapie,
verlor sich dieser Effekt nach 15 Tagen. Im Gegensatz hierzu blieb die IL-10 Produktion über die
15 Tage deutlich gesteigert, so daß es im Verlaufe der Therapie zu einem Überwiegen der
antiinflammatorischen Zytokine und somit zum Überwiegen einer TH2-Zellantwort kam. Die zu
Beginn der Therapie auftretenden abdominellen Beschwerden und Flush-Symptomatik, ließen sich
über eine initiale Induktion der TNF-α Produktion erklären, die allerdings im Verlauf der Therapie
wie die gastrointestinalen Beschwerden einer „Tachyphylaxie“ unterlagen (Asadullah, 1997).
Die selektive Induktion von TH2-Zytokinen durch MMF konnte durch eine weitere in vitro Studie
belegt werden (Ockenfels, 1998). Hier zeigte sich allerdings eine Suppression von IFN-γ bei einer
selektiven Induktion von IL-10 in Lymphozyten die mit psoriatischen Keratinozyten kokultivie rt
wurden. Der beobachtete TH1/TH2 „shift“ ging einher mit der klinischen Abheilung der
psoriatischen Läsionen. Die zu den vorhergehenden Studien differente Beobachtung einer TH1Suppression
(IFN-γ),
erklärten
die
Autoren
über
differente
Zellkulturbedingungen
(Lymphozytenzelllinie war eine experimentelle von Lymphomzellen abstammende) und über einen
________________________________33______________________________
verkürzten Beobachtungszeitraum. Als Fazit ihrer Studie erklärten sie, daß die TH2-Zellinduktion
der entscheidende Langzeiteffekt der Therapie mit FAE sei (Ockenfels, 1998).
Neben dem beschriebenen TH2-Zell mediierten antiinflammatorischen Effekt, besitzt MMF einen
weiteren entzündungshemmenden Mechanismus. Das Einwandern immunmediierender TH-Zellen
in ein Zielgewebe verlangt die Migration der Effektorzellen aus dem Gefäß in das Parenchym des
Organs. Wie bereits in der Pathogenese der MS beschrieben, bedarf es innerhalb des Blutgefäßes
der Exprimierung endothelialer Adhäsionsmoleküle wie E-Selectin und ICAM-1. MMF ist in der
Lage die endotheliale, durch TNF-α induzierte ICAM-1 Expression zu hemmen, und dadurch die
Adhäsion von Lymphozyten an das Endothel deutlich zu verringern (Vandermeeren, 1997). Der
molekulare Wirkmechanismus scheint in der Beeinflussung von NFκB zu liegen.
TNF-α stimuliert die E-Selectin und ICAM-1 Produktion von Endothelzellen, über eine
Beeinflussung der Promoterregion der Adhäsionsgene. Diese Regionen werden alle durch den
NFκB kontrolliert. Bisherigen experimentellen Daten zufolge induzieren FAE in Lymphozyten
über eine Induktion der Glutathionsynthetase, intrazellulär erhöhte Glutathionspiegel. Die erhöhten
Glutathionspiegel
hemmen
eine
NFκB
Aktivierung,
und
daher
die
angesprochene
Adhäsionsmolekülexpression. Folglich resultiert eine verminderte Migration inflammatorischer
Lymphozytenpopulationen in das Zielorgan (Vandermeeren, 1997).
Ebenfalls beeinflußt MMF die Antigenprozessierung im Rahmen einer Inflammation. Die
Differenzierung von APC und im Besonderen die Antigenpräsentation über MHC-II Komplexe,
wird in vitro durch niedrige Konzentrationen von MMF (siehe Tabelle 8, Seite 34) gehemmt. Dies
führt zu einer reduzierten TH-Zellaktivierung in der Zellkultur (Zhu, 2001). Höhere
Konzentrationen von MMF (siehe Tabelle 8, Seite 34) verstärken diesen Effekt über eine Apoptose
der Monozyten.
Ein weiterer Effekt von MMF ist seine Wirkung als Radikalfänger bei neurodegenerativen
Erkrankungen (Duffy, 1998). MMF induziert erhöhte Glutathionspiegel auch in Nervenzellen.
Zusätzlich kommt es zu einer Induktion neuroprotektiver, antioxidativer Enzyme wie QuinonReduktase,
Glutathion
S-Transferase,
Glutathion-Reduktase
und
Glucose-6-Phosphatase.
Resultierend folgt eine verminderte Vulnerabilität neuronaler Zellen gegen Sauerstoffradikale wie
H2 O2 . Wie in der Pathogenese der MS beschrieben führen freie Radikale zu einer oxidativen
Schädigung von Proteinmembranen und DNA. MMF scheint die Wirkung solcher Metaboliten zu
hemmen. Die immunmodulierenden Effekte der FAE in sind in der folgenden Tabelle 8 noch
einmal zusammengefaßt.
________________________________34______________________________
Tabelle 8: Molekulare/Immunologische Wirkmechanismen von FAE.
Erläuterungen: DMF(Dimethylfumarat), MMF (Monomethylfumarat)
Zielzelle
Zelluläre
ImmunoloMolekularer
Aktivität
gischer Effekt Mechanismus
§ Lymphozyten
§ Hemmung des
Immun§ Unklar, anti(Petres, 1997)
Einbaus von
suppression
proliferative
§ Lymphozyten
Thymidin in
Wirkung
(Sebök, 2000)
DNA
§ Unklar
§ Apoptoseinduktion
§ TH-Zellen
Hemmung der THImmunUnklar, selektiv
(Baccharah-Buhles,
Zellproliferation
suppression
für TH-Zellen
1994, Höxtermann,
(bis 30% des
1998)
Ausgangsniveaus)
§ Aktivierte
Steigerung bzw.
Selektive
RezeptorTH-Zellen,
Neuinduktion der
Induktion des
aktivierung,
TH1- und
Produktion von
antiinflammaAnstieg von
TH0-Zellen
IL-4, keine
torischen TH2cAMP und Ca2+,
(De Jong, 1996)
Beeinflussung der
Zytokinmusters veränderte
Genexpression
IFN-γ und IL-2
Sekretion
§ TH-Zellen
§ Steigerung/
Selektive
Rezeptor(Asadullah, 1997)
Neuinduktion
Induktion des
aktivierung,
§ Lymphoder Produktion antiinflammaAnstieg von
blastische THvon IL-10
torischen TH2cAMP und Ca2+,
Zellen
§ Hemmung der Zytokinmusters veränderte
(Ockenfels, 1998)
Hemmung des
Genexpression
IFN-γ
TH1Sekretion,
Zytokinmusters
Induktion von
IL-10
Produktion
§ Gefäßendothel Hemmung durch
Blockade der
Glutathion(Vandermeeren,
Migration von
induktion,
TNFα-induzierter
1997)
inflammaHemmung der
ICAM-1
torischen THAktivierung von
Expression
Zellen in das
NFκB
Zielgewebe
§ APC
§ Hemmung der
Hemmung der
unklar
(Zhu, 2001)
MHC-II
THExpression
Zellaktivierung
§ Apoptose der
Monozyten
§ Neuron
RadikalfängerVerhinderung
Induktion von
(Duffy, 1998)
funktion
von LipidperGlutathion sowie
oxidation und
antioxidativer
NeuroEnzyme
degeneration
In vitro/
In vivo
§ in
vitro
§ in
vitro
Benutzte
Konzentration
§ 1000 µM
MMF
§ 100 µM
MMF
§
in
vivo
§
Ca. 30-100
µM MMF
§
in
vitro
§
100-200
µM MMF
§
in
vivo
in
vitro
§
100µM
MMF
30 µM
MMF
§
in
vitro
§
100µM
MMF
§
in
vitro
§
< 50 µM
MMF
>50 µM
MMF
§
§
§
§
in
vitro
§
30 µM
MMF
________________________________35______________________________
1.8
Ziel der vorliegenden Untersuchung
Die MS, insbesondere die schubförmige Verlaufsform, ist eine TH-Zell mediierte Erkrankung.
Zentrales Regulationselement ist eine Immundysbalance, die als wesentlichen pathogenetischen
Schritt ein Überwiegen proinflammatorischer TH1-Zellen gegenüber antiinflammatorischen TH2Zellen beinhaltet (Noseworthy, 2000).
Eine selektive Stimulation TH2-typischer Zytokine hat einen krankheitslimitierenden Effekt
(Wingerchuk, 2001).
Die derzeitige schubprophylaktische Standardtherapie der MS mittel Interferon-β und Copolymer-I
hat als entscheidenden gemeinsamen Wirkmechanismus, die Induktion von IL-4 und IL-10 in MBP
reaktiven TH-Zellklonen von SRMS-Patienten (Kozovska, 1999). Sie erreicht also einen
wesentlichen krankheitsmodulierenden Effekt, über eine selektive Induktion von TH2-Zellklonen.
FAE sind in der Lage eine TH2-Zytokininduktion bei Gesunden bzw. Psoriatikern zu induzieren
(siehe Tabelle 8). Ihre antiinflammatorische Potenz im Rahmen der TH1-Zell mediierten
Autoimmunerkrankung Psoriasis, ließ uns die bisher nicht bei MS experimentell bzw. klinisch
untersuchte Substanz in dieser offenen, prospektiven, klinischen Studie der Phase-II prüfen.
Wesentliche Prüfinhalte sollten die Medikamentensicherheit, Wirkung, Nebenwirkung sein.
Aufgrund dessen ließen sich die wesentlichen Fragestellungen für eine FAE-Therapie bei SRMS
nach verschiedenen Aspekten gliedern.
Medikamentensicherheit und Verträglichkeit:
§
Wird die gängige Standarddosierung der FAE gut vertragen und ist die Applikation sicher ?
§
Welche Nebenwirkungen treten auf ?
§
Finden
sich
in
den
klinischen
Kontrolluntersuchungen
Hinweise
für
eine
Krankheitsstabilisierung bezüglich Schubrate und klinischer Meßskalen?
Immunmodulatorische Wirkungen:
§
Führt die Gabe der FAE in der Standarddosierung bei Patienten mit SRMS zu einer selektiven
Induktion von TH2-Zellen im Sinne einer antiinflammatorischen Wirkung ?
§
Läßt sich eine Suppression der Lymphozyten- bzw. der TH-Zellzahl über eine erhöhte
Apoptoserate in vivo als möglicher immunologischer Wirkmechanismus verifizieren ?
§
Hemmt die FAE-Therapie die endotheliale ICAM-1 Produktion? Korrelieren sinkende
Serumspiegel des sICAM-1 im Sinne eines biologischen Aktivitätsmarkers (Khoury, 1999),
mit der sinkenden Krankheitsaktivität bei SRMS?
________________________________36______________________________
2.0
Material, Methoden und Patientenkollektiv
2.1
Studiendesign
Die orale Langzeittherapie mit Fumaratderivaten zur Behandlung der SRMS wurde in einer
prospektiven,
offenen
Krankheitssuppression,
Pilotstudie
die
der
Phase-II
Beeinflussung
des
bezüglich
ihrer
Immunsystems
Effektivität
Erkrankter
auf
die
und
die
Arzneimittelsicherheit und Verträglichkeit überprüft. Der Prüfmodus dieser Pilotstudie war ein
„Basisuntersuchung versus 24 Wochen“ Therapievergleich, ein Studiendesign das bereits bei FDA
(Federal-Drug-Administration, Amerikanische Gesundheitsbehörde) geprüften Studien verwendet
wurde (Walker, 2001). Für die durchzuführende Studie lag das Einverständnis der
Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum vor.
Zunächst wurden, zwei Basisuntersuchungen im Abstand von 6 Wochen durchgeführt. Diese
Untersuchungszeitpunkte beinhalteten die Bestimmung von später noch zu erläuternden
immunologischen
Bestimmungen
Parametern,
sowie
klinische-neurologische
kernspintomographische
Untersuchungen,
Messungen.
Es
laborchemische
folgten
6
weitere
Untersuchungszeitpunkte unter medikamentöser Therapie, deren Inhalte der folgenden Tabelle 9 zu
entnehmen sind. Nach Abschluß der Medikamenteneinnahme erfolgte eine Nachuntersuchung, die
4 Wochen später eine Überprüfung der Krankheitsaktivität durch oben genannte Parameter, sowie
die Beurteilung einer eventuell, prolongie rten Immunmodulation sichern sollte.
Tabelle 9: Zeitplan der Studiendurchführung
BasisUntersuchungen
Woche
(Studienwoche)
Sicherheitslabor/
Nebenwirkung
KlinischNeurologische
Untersuchung
Bestimmung
immunologischer
Parameter
Kernspintomographie (MRT)
2.2
0
6
X
Nachuntersuchung
Studienphase (Medikation)
7
10
12
X
X
X
X
X
X
X
X
X
15
18
24
28
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Patientenkollektiv
Die Rekrutierung der Patienten erfolgte nach Aufklärung über den Studienablauf, aus dem
Patientenpool der MS-Ambulanz der Neurologischen Universitätsklinik St. Josef-Hospital zu
Bochum. Es wurden 10 Patienten in die Studie unter Berücksichtigung der unten erläuterten Einund Auschlußkriterien aufgenommen. Das Geschlechterverhältnis betrug 1:1 und die mittlere
Erkrankungsdauer bei Studieneinschluß betrug 4,8 Jahre. Der mittlere EDSS der Patienten bei
________________________________37______________________________
Studieneintritt betrug 2,5 Punkte und der Ambulation Index 2,0 Punkte. Kein Patient erhielt vor
Studieneintritt eine immunmodulierende Therapie und die mittlere Schubrate vor Studieneintritt
betrug 1,8 Schübe/Jahr. Kein Patient erhielt eine Begleitmedikation im Rahmen der Studie. Im
Folgenden soll eine kurze Charakterisierung der einzelnen Patienten in Tabelle 10 gegeben werden.
Tabelle 10: Kurzcharakterisierung des Patientenkollektivs
Erläuterungen: m ≅ männlich, w ≅ weiblich
Patient
Alter in
Schubrate/
EDSS bei
Jahren,
Jahr vor
Studienbeginn
Geschlecht
Studienbeginn
Patient 1
31, m
2
2,0
Krankheitsdauer
bei Studienbeginn
Bestimmendes
klinisches Symptom
1 Jahr
Leichte Reduktion des
Berührungsempfindens
Mittelgradige Rumpfund Gangataxie
Hypästhesie des
Rumpfes und leichte
Paraspastik
Leichte Verminderung
des Berührungsempfindens
Pallhypästhesie aller
Extremitäten
Leichtgradige
Paraparese
Leichtgradige
Paraparese
Leicht- bis
mittelgradige
Paraparese
Leichtgradige
spastische Paraparese
Visus von 0.2 und
Zentralskotom
Patient 2
28, m
2
4,0
8 Jahre
Patient 3
38, m
1
2,5
11 Jahre
Patient 4
32, m
2
2,0
8 Jahre
Patient 5
33, m
1
2,0
4 Jahre
Patient 6
33, w
1
2,0
1 Jahr
Patient 7
28, w
3
2,0
6 Jahre
Patient 8
29, w
1
3,5
5 Jahre
Patient 9
29, w
2
2,0
1 Jahr
Patient
10
35, w
3
4,5
4 Jahre
2.3
Ein/Ausschlußkriterien
Aufgrund der heterogenen Verlaufsformen der MS bedurfte es strenger Auswahlkriterien für den
Studieneinschluß, so daß folgende Kriterien zur Patientenauswahl angelegt wurden.
Einschlußkriterien
§
sichere SRMS nach Poser-Kriterien (Poser, 1983)
§
mindestens 1 kontrastmittelanreichender Herd im MRT bei der Basisuntersuchung und
mindestens 1 Schub im Jahr vor Studieneinschluß
§
Alter zwischen 18 und 60 Jahren
§
EDSS zu Studienbeginn ≥2 und <6
§
schubfreies Intervall vor Studienbeginn von mindestens 6 Wochen
§
keine Infektzeichen bei Studieneinschluß
§
Konzeptionsschutz für Frauen
§
keine Vorbehandlung mit immunmodulierenden Therapien (z.B. Interferon, Copolymer,
Mitoxantron etc.)
________________________________38______________________________
§
keine Kortisontherapie innerhalb der letzten 30 Tage vor Studienbeginn
§
keine schweren hämatologischen bzw. gastroenterologischen Erkrankungen
Ausschlußkriterien
§
hirnorganischen Wesensveränderung und andere neurologische bzw. immunologische
Erkrankungen, welche die klinische Symptomatik ungünstig beeinflussen können
§
Nierenerkrankung, Begleittherapie mit nephrotoxischen Substanzen
§
Schwangerschaft und Stillzeit
§
Ausschluß von Patienten mit allergischen Diathese, und anamnestischer Anaphylaxie (Rojas,
1999)
§
Medikamenten-bzw. Alkoholabusus
§
Gastrointestinale Erkrankungen, Hämatologische Erkrankungen
2.4
Medikationsschema
Die Medikamentenapplikation erfolgte entsprechend der Empfehlung der Deutschen Konsensus
Konferenz für die FAE-Therapie (Mrowietz, 1999). Benutzt wurden die Studienpräparate
Fumaderm mite und Fumaderm forte, die den in Deutschland zugelassenen Präparaten
Fumaderm initial und Fumaderm in Dosierung und Zusammensetzung entsprechen (siehe
Tabelle 11).
Tabelle 11: Zusammensetzung der Studienmedikation
Inhaltsstoffe
Fumaderm mite 
Fumarsäuredimethylester
30 mg
Ethylhydrogenfumarat/
67 mg
Calciumsalz
Ethylhydrogenfumarat/
5 mg
Magnesiumsalz
Ethylhydrogenfumarat/
3 mg
Zinksalz
Fumaderm forte 
120 mg
87 mg
5 mg
3 mg
Das Applikationsschema beginnt mit einer Tablette Fumaderm mite pro Tag in der ersten
Therapiewoche (7. Studienwoche). Anschließend wird die Dosis um eine Tablette pro Woche, bis
auf eine Dosis von drei Tabletten Fumaderm initial täglich gesteigert. Dann wird die Medikation
auf eine Tablette Fumaderm forte pro Tag
in der nächsten Woche umgestellt, mit einer
Steigerung von jeweils einer Tablette pro Woche.
Die Maximaldosierung von 3x3 Tabletten täglich wurde nach 12 Therapiewochen (18.
Studienwoche) erreicht, und bis zum Ende der Medikamenteneinnahme (24. Studienwoche)
beibehalten. Die Serumspiegel des Metaboliten MMF liegen bei Patienten dann im Bereich von 36108 µM (de Jong, 1996) und entsprechen damit den experimentell eingesetzten Konzentrationen
die Tabelle 8 zu entnehmen sind.
________________________________39______________________________
2.5
Untersuchte Parameter
2.5.1 Klinisch-neurologische Zielparameter
Die körperliche Untersuchung des Patienten diente der Erhebung eines internistischen bzw.
neurologischen Standardbefundes zu den in Tabelle 9 angegebenen Zeitpunkten. Zur
Standardisierung der Untersuchungsbefunde wurden folgende neurologische Skalen verwendet,
die als Meßinstrumente klinischer Veränderungen bei den meisten international publizierten
Studien genutzt werden (PRISMS, 1998).
2.5.1.1
Expanded Disability Status Scale (EDSS)
Der EDSS ist ein Meßinstrument der neurologischen Symptomatik bei der MS (Kurtzke, 1983). Er
mißt den Grad der Behinderung („impairment“, Funktionsdefizit), und den Grad der Einschränkung
(„disability“, als Einschränkung des täglichen Lebens bedingt durch „impairment“).
Der EDSS ist in eine nicht lineare 20 Punkteskala mit 0,5 Punktschritten unterteilt, die von 0-10
reicht. Eine äquivalente Skalierung existiert für 8 sogenannte Funktionelle Systeme (FS), welche
anhand der klinisch-neurologischen Untersuchung bestimmt werden. Sie umfassen das pyramidale,
zerebelläre, sensorische, visuelle und zerebrale System sowie die Hirnstammfunktion,
Blasen/Mastdarmfunktion und die Kategorie andere Systeme. Jedem Patienten wird, entsprechend
dem klinischen Befund, in einem Funktionssytem ein Punktwert zugeordnet, der letztendlich in
einen abschließenden Gesamtwert eingeht (siehe Anhang: Übersicht 1). Dieser Gesamtwert
beschreibt den Grad der Behinderung, wobei die niedrigen Punktwerte bis etwa 3,5 v.a. von den
Funktionellen Systemen, die höheren Grade fast ausschließlich anhand der Gehfähigkeit bestimmt
werden. Im Rahmen der Studie wurden Bestimmungen des EDSS-Werts zu den in Tabelle 9
angegebenen Zeitpunkten durchgeführt.
2.5.1.2
Ambulation Index (AI)
Der AI ist eine objektive, semiquantitative Skala, welche die Gehfähigkeit mißt. Sie tut dies auf der
Grundlage von benötigter Zeit und eventueller Hilfsmittel für eine Gehstrecke von ca. 7.6 m (25
feet). Es existieren 10 verschiedene Punktewerte von Punktwert 0 (asymptomatisch, voll aktiv) bis
Punktwert 9 (gebunden an den Rollstuhl, unfähig zu selbstständigem Transfer). Diese Skala (siehe
Anhang, Übersicht 2) erreicht eine präzisere Messung der Gehfähigkeit als der EDSS im Bereich
der niedrigen EDSS Punktwerte, v.a. im Bereich von 4.0-6.0 (Paty, 1992). Es besteht eine strenge
Korrelation zwischen dem EDSS und dem AI. Im Rahmen der Studie, wurde jeweils eine Messung
pro Untersuchungszeitpunkt (siehe Tabelle 9) durchgeführt.
2.5.1.3
9-hole Pegboard Test (9-HPT)
Der 9-HPT dient als Messinstrument zur Prüfung der Behinderung der oberen Extremität. Der
Patient soll Holzstäbchen, die in einer Vorrichtung untergebracht sind, aus dieser entfernen und
dieselben wieder hinzufügen. Im Rahmen der Studie wurde die individuell benötigte Zeit pro
________________________________40______________________________
Extremität zweimalig gemessen, und aus beiden Meßdurchläufen ein Mittelwert gebildet. Der 9HPT kann im Verlauf der Erkrankung als ein sensitiverer Parameter als der EDSS Punktwert
genutzt werden um den Grad der Behinderung der oberen Extremität zu messen (Goodkin, 1988).
Eine exaktere Messung der Behinderung ist v.a. im EDSS Bereich von 1.0-3.5 möglich.
2.5.1.4
Schubrate
Im Rahmen der Untersuchungstermine wurden die Patienten ausführlich über eventuelle Schübe
befragt. Als Definitionskriterium eines Schubes wurde die international anerkannte Schubdefinition
gewählt (Lublin, 1996).
Als Schub wird nach Ausschluß physiologischer Variabilität eine akut, ohne assoziierte Infekte
oder Fieber auftretende neurologische Ausfallserscheinung definiert. Weiterhin beinhaltet diese
Definition eine Verschle chterung vorbestehender Symptome, die mindestens 24 Stunden anhält.
Kommt es im Rahmen von 30 Tagen zu einer Häufung neuer Symptome, so werden diese zu dem
bestehenden Schub hinzugerechnet.
2.5.2 Immunologische Zielparameter
Zur Feststellung von Alterationen des Immunsystems MS-Erkrankter durch die FAE-Therapie,
wurden folgende Untersuchungen durchgeführt:
§
Messung intrazellulärer Zytokinproduktion (ICCS) in peripheren, mononukleären Blutzellen
(PBMC)
und
Subklassifikation
von
Lymphozytenpopulationen
anhand
der
Durchflußzytometrie (FACScan).
§
Messung der Apoptoserate von PBMC mittels der Annexin-V Methode und Subklassifikation
apoptotischer Lymphozytenpopulationen anhand der Durchflußzytometrie.
§
Bestimmung der Plasmakonzentration von sICAM-1 anhand eines „Enzyme-LinkedImmunosorbent-Assay“ (ELISA).
Die genannten Untersuchungsmethoden, die das Kernstück dieser Arbeit bilden, sollen im
Folgenden erläutert werden.
2.5.2.1
Technik der Durchflußzytometrie
Für die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen, verwendeten wir ein FACScan Gerät
der
Firma
Becton
Dickinson,
Heidelberg.
Grundlegendes
Funktionsprinzip
ist
ein
fünfparametrisches Analysegerät auf Laserbasis; die weiterführende Funktionsweise erläutert
Abbildung 4 (Teil A und B, Seite 41). Ein Flüssigkeitsystem (Teil A) führt die zu analysierenden
Zellen aus dem Probenröhrchen durch den Laserstrahl. Dazu wird der Probenstrahl von einem
Hüllstrom zu einem sehr dünnen Flüssigkeitsfaden auseinandergezogen. Durch den Eintritt der
Zellen in die konisch geformte Meßküvette, werden diese beschleunigt und einzeln hintereinander
aufgereiht (Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung).
________________________________41______________________________
A
B
Computer
Farbfilter
Fluoreszenz 1/2/3
Detektor
Teilerspiegel
SCCDetektor
Teilerspiegel
Objektivsystem
FSCDetektor
Laser
Probenröhrchen
Abbildung 4 (Teil A und B): Funktionssystem eines FACScan

________________________________42______________________________
Das von der Zelle in Richtung des Laserstrahls gestreute Licht (Teil B) wird vom FSC-Detektor
(Forward Scatter), das Seitwärtsstreulicht (SSC-Detektor, Sideward Scatter) und verschiedene
Fluoreszenzfarben rechtwinklig zum Laserstrahl aufgenommen und durch ein Objektivstem,
verschiedene Farbfilter und Teilerspie gel auf die verschiedenen Detektoren (Photomultiplier)
gelenkt. Die Signale der Photomultiplier werden verstärkt und können im Computer ausgewertet
und dargestellt werden.
Betriebs-und Meßparametereinstellung sowie Ergebnissauswertung erfolgte anhand eines
integrierten Softwarepackets CellQuest unter Nutzung eines Apple  Macintosh Quadra 650. Die
Auswertungssoftware erlaubt die Erstellung standardisierter Analysen von Zelluntersuchungen auf
Einzelzellniveau. Initiale Analyse einer Zellprobe erfolgt durch die Intensitäten der Forward Light
Scatter (FCS) und Sideward Light Scatter (SCC) Detektoren, wobei das FCS-Signal Rückschlüsse
auf
die
Zellgröße
und
das
SSC-Signal
Rückschlüsse
über
die
Granularität
(Oberflächenbeschaffenheit und intrazelluläre Einschlüsse) erlaubt.
Mittels dieser Information, läßt sich in der Analysesoftware mittels Dot-Plot-Graphik
Zellpopulationen differenzieren; im Besonderen die Subpopulation der peripheren Lymphozyten
(PBL) wie in Abbildung 5 dargestellt.
Abbildung 5: Beispiel für Dot-Plot Graphik
Detektierte Zellen werden der Größe (FSC) und der Granularität (SCC) nach geordnet, und mit Hilfe des
„gating“ selektiert. Das angegebene Gate G1 beinhaltet die PBL-Gesamtpopulation.
Um die Subpopulation der isolierten peripheren mononukle ären Blutzellen, läßt sich mit Hilfe
eines umgebenden Fensters, die zu analysierende PBL-Population „gaten“. Hierdurch wird diese
als Ausgangspopulation (100%) für weitere Analysen erkannt. Zur weiteren Subklassifizierung der
PBL, können nun fluoreszenzmarkierte Antikörper dienen, so daß die Zellen anhand von 3
weiteren Lichtsignalen analysiert werden können. Diese Antikörper können Oberflächenstrukturen
der Zellen binden (Apoptosemessung) bzw. nach entsprechender Aufbereitung intrazelluläre
Antigene binden (intrazelluläre Zytokinmessung).
Der an den Antikörper konjugierte Fluoreszenzfarbstoff wird durch monochromatisches Licht zur
Emission
von
Licht
definierter
Wellenlänge
angeregt,
daß
durch
3
unterschiedliche
Photodetektoren erfaßt werden kann. Aufgrund dieses Sachverhaltes existieren für jeden
Fluoreszenzfarbstoff charakteristische Emissionsspektren (siehe Tabelle 12).
________________________________43______________________________
Tabelle 12: Farbstoffmarkierte AK mit detektierbarem Emissionspektrum
Fluoreszenzen (Emissionsspektrum)
Antikörper-konjugierter Farbstoff
FITC (Fluoreszeinisothiozyanat)
FL1 (Wellenlänge λ= 515-545 nm)
FL2 (Wellenlänge λ= 564-606 nm)
PE (Phykoerythrin)
FL3 (Wellenlänge λ> 650 nm)
PE-Cy5 (Phykoerythrin Zyanin-5)
Das FACScan verfügt über drei Photodetektoren (3 Kanäle: FL1, 2, 3), welche die empfangenen
Emissionen quantitativ erfassen können. Die Daten der Fluoreszenzanalyse werden durch
CellQuest als Histogramm der entsprechenden Fluoreszenzintensität gegenüber der Zellzahl
dargestellt. Zur Unterscheidung der Spezifität dieser Signale gegenüber der unspezifischen
Autofluoreszenz der Zellen werden Negativkontrollen genutzt. Hierzu gebraucht man isotypische
Kontrollantikörper, die das Maß der unspezifischen Autofluoreszenz der PBL widerspiegeln.
CellQuest berücksichtigt die ermittelte Autofluoreszenz, und erzeugt abhängig von diesen
Schwellenwerten prozentuale Verteilungen von fluoreszenzmarkierten positiven und negativen
PBL. Die Expressionsdichte des antikörpermarkierten Antigens wird durch die Höhe der mittleren
Fluoreszenzdichte repräsentiert.
2.5.2.2
Experimentelle Vorgehensweise
Blutentnahme
Isolierung der PBL
Asservierung von Serumproben
Apoptosepräparation
Markierung
Zytokinpräparation
Stimulation-Zellisolierung
Fixierung-Permeabilisierung
Markierung
sICAM-Präparation
Inkubation
Durchflußzytometrische Messung mittels
FACScan
Durchflußzytometrische Messung mittels
FACScan
ELISA-Messung
Abbildung 6: Übersicht über die experimentelle Methodik
2.5.2.3
Isolierung von Serum und peripheren Blutlymphozyten (PBL)
Nach der Entnahme von 20 ml heparinisiertem Blut pro Patient, wurden die Proben innerhalb einer
Stunde unter sterilen Bedingungen (Sterilbank Heraeus Laminair Typ HB 2460, Deutschland)
verarbeitet. Einerseits wurden 10ml Frischblut zur Gewinnung von Serum mittels Zentrifugation
weiterverarbeitet (700g, 2000 U/min für 10 min). Andererseits erfolgte die Isolierung der PBL aus
Vollblut, über einen Ficoll-Dichtegradienten. Unter der Sterilbank wurden 2x10ml Ficoll-Lösung
(Ficoll Seperating Solution, Biochrom KG, Deutschland) in zwei 50ml Falcon-Tubes (Becton-
________________________________44______________________________
Dickinson, USA) eingefüllt, und jeweils mit 10ml Vollblut beschichtet. Anschließend erfolgte bei
700g für 20 min. eine ungebremste Zentrifugation (2000 U/min, Heraeus Sepatech Minifuge RF,
Deutschland). Durch die Zentrifugation kam es aufgrund des unterschiedlichen Dichtegradienten
der Blutzellen, zu einer differenten Schichtung wobei die Interphase die PBMC mit den PBL
beinhaltet. Der Reinheitsgrad an PBL beträgt durch die genannte Isolationsmethode > 95% (Jung,
1993). Der Interphasering mit PBL wurde abpippetiert und in ein mit 20ml Medium (RPMI-1640
mit L-Glutamin + 7% FBS, Life-Technologies, USA) befülltes Falcon Tube gegeben.
Anschließend folgten 2 Waschschritte (Zentrifugation mit 1200 U/min für 5 min.) in oben
genanntem Medium, zur Entfernung überzähliger Blutzellen und Ficollresten. Dann erfolgte die
Resuspendierung der PBL in 1ml Medium.
Zur Bestimmung der Zellzahl wurden die PBL in einer Neubauer-Zählkammer (GLW,
Deutschland) mittels eines Mikroskops (Zeiss Mikroskop Standard, Deutschland) gezählt. Zunächst
erfolgte eine Färbung von 10 µl Zellsuspension mit 0,4 % Trypanblau-Lösung (Life-Technologies,
USA) im Verhältnis 1:20, so daß einerseits die Zellanzahl pro µl und andererseits die Vitalität der
Zellen beurteilt werden konnte. Im Endergebnis konnte somit die Zellzahl der Zellsuspension auf
2x106 PBL/ml Medium eingestellt werden, um später adäquate AK-Konzentrationen zu ergänzen.
2.5.2.4
Messung intrazellulärer Zytokinproduktion (ICCS) von PBL
Einleitung
Die Charakterisierung von PBL-Subpopulationen kann wie bereits zuvor beschrieben, durch die
durchflußzytometrische Bestimmung von Oberflächenmarkern (CD4 für TH-Zellen) und
intrazellulärer Zytokinproduktion (TH1 versus TH2-Zellen) erfolgen (Krouwels, 1996). Die
Erstbeschreibung der durchflußzytometrischen Bestimmung intrazellulärer Zytokine geht auf Jung
und Mitarbeiter (Jung, 1993) und Andersson und Mitarbeiter (Andersson, 1988) zurück. Der
Messung der ICCS geht ein komplexes Protokoll der Zellbearbeitung voraus.
Zunächst müssen die Zellen zur verstärkten Zytokinproduktion angeregt werden, da in PBL
aufgrund der zelleigenen Regulation der Proteinbiosynthese nur geringe Mengen an Zytokinen
unstimuliert hergestellt werden, und somit teilweise unter der Nachweisgrenze liegen. Die
unspezifische, polyklonale Stimulierung der Lymphozyten erfolgt durch Ionomycin und PMA
(Phorbolmyristatazetat). Anschließend wird durch die Zugabe des Proteintransportinhibitors
Monensin, eine Akkumulation der intrazellulär produzierten Zytokine im Golgi Apparat erreicht.
Die Einwirkung von Monensin auf die PBL führt zu einer Aufhebung der Ionengradienten in den
zellulären Membranen. Als Folge hieraus kommt es zu einem Zusammenbruch der
Transportmechanismen zwischen Golgi-Komplex und Zellmembran, so daß es zu einer
Akkumulation von Zytokinen innerhalb der Zelle kommt. Resultierend führt dies zu einer
gesteigerten
Fluoreszenzintensität
und
zu
einer
erhöhten
Anzahl
von
wahrnehmbaren
Fluoreszenzsignalen bei der Messung der antikörpermarkierten PBL (Lee, 1990). Um letztendlich
die intrazelluläre Antiköperbindung an die Zytokine zu ermöglichen, muß der Lymphozyt zur
________________________________45______________________________
Erhaltung seiner strukturellen Integrität mit Paraformaldehyd fixiert werden. Paraformaldehyd
bewahrt trotz der artifiziellen Fixierung der PBL, die Antigeneigenschaften ohne die
Autofluoreszenz zu stark zu erhöhen (Pala, 2000). Dann kann die Zelle für die
fluoreszenzmarkierten Antikörper mittels Saponin permeabilisiert werden. Abschließend erfolgt die
intrazelluläre Markierung der Zytokine über direkt fluorochrom-markierte Antikörper, so daß die
Zahl falsch positiv markierter Lymphozyten unter 0.1% liegt (Prussin, 1995). Mit dieser
Nachweisprozedur
gelingt
die
Subklassifikation
von
Lymphozytenpopulationen
mittels
Oberflächenmarker und intrazellulären Zytokinen.
Praktische Durchführung
Stimulation: Es werden jeweils 200 µl der isolierten Zellsuspension auf 8 wells einer 96 FalconMikrotiterplatte (Becton-Dickinson, USA) verteilt, und jeweils 2 µl der Stimulatoren PMA
(10ng/ml, Hölzel-Diagnostika, Deutschland), Ionomycin (1µM, Hölzel-Diagnostika, Deutschland)
und Monensin (3 µM, Hölzel-Diagnostika, Deutschland) hinzugegeben. Anschließend werden die
Zellen für 5 Stunden in einem Brutschrank bei 37° C und einem CO2 Atmosphärenanteil von 7%
inkubiert.
Fixation: Nun wird die Zellsuspension abpipettiert und in 4 Polystyrenreagenzgläser (FalconTubes, Becton-Dickinson, USA) umgefüllt, so daß auf jedes Reagenzglas der Inhalt zweier wells
verteilt wird. Nach einem zweimaligen Waschvorgang mit 4 ml HBSS-Lösung (Hanks Balanced
Salts, Sigma Chemical, USA) und anschließender Zentrifugation für 5 Minuten bei 1200 U/min,
wird das verbleibende Zellpellet mit jeweils 1 ml Fixierungslösung (1% Paraformaldehyd-Lösung,
Hölzel-Diagnostika, Deutschland) für 5 Minuten inkubiert.
Permeabilisation: Nun folgen 3 weitere oben erläuterte Waschschritte, nach denen die
verbleibende Zellsuspension in jeweils 100 µl Permeabilisierungslösung (1% Saponin-Lösung,
Hölzel-Diagnostika, Deutschland) resuspendiert wird, und bei 4°C mindestens 60 Minuten gelagert
wird.
Antikörperfärbung und Fixierung der PBL
Für jeden Patienten wurden pro Meßzeitpunkt, die intrazelluläre Produktion von IL-2, IL-4, IL-10,
TNF-α, TGF-β, IFN-γ und der CD4-Oberflä chenmarkerstatus erhoben. Mittels FACScan
Messung konnten simultan, multiparametrische (3 Floureszenzen) Analysen durchgeführt werden.
Mittels der FL3 (CD4-Marker) wurde jeweils die TH-Zellpopulation bestimmt, so daß über die
restlichen zwei Fluoreszenzkanäle (FL1, FL2) die intrazellulär akkumulierten Zytokine bestimmbar
waren. Hierfür verwendeten wir vornehmlich direkt fluoreszenzmarkierte Antikörper wegen der
oben genannten hohen Spezifität. Aufgrund fehlender industrieller Herstellung benötigten wir bei
TGF-β eine indirekte Markierung über einen antiidiotypischen, fluoreszenzmarkierten Ratte-AntiMaus-IgG1-AK (RAM). Dieser wurde in einem zweiten Inkubationsschritt wie unten beschrieben,
an den primären Maus-Anti-Human TGF-β-AK der Klasse IgG-1 gebunden.
Ebenfalls indirekt markiert wurde IL-10 über einen initialen biotinylierten AK, der anschließend
durch Streptavidin-Phykoerythrin (Steptavidin-PE) der Lasermessung zugänglich gemacht wurde.
________________________________46______________________________
Meßansatz 1 diente als Negativkontrolle, und somit der Feststellung des Grades der
Autofluoreszenz. Meßansatz 2, 3 und 4 dienten der Subklassifizierung des TH-Subtyps anhand der
ICSS (siehe Tabelle 13).
Tabelle 13: Übersicht über verwendete Fluoreszenz-AK
Versuchsansatz
FL1/(Farbstoff)
1
Isotypen-AK-(FITC)
2
Anti-INF-γ (FITC)
3
Anti-TNF-α (FITC)
4
Anti-TGF-β (indirekt über
RAM-FITC)
FL2/(Farbstoff)
Isotypen-AK-(PE)
Anti-IL-4 (PE)
Anti-IL-10 (indirekt
über Streptavidin-PE)
Anti-IL-2
FL3/(Farbstoff)
Isotypen-AK-(PE-Cy5)
Anti-CD4 (PE-Cy5)
Anti-CD4 (PE-Cy5)
Anti-CD4 (PE-Cy5)
Die technische Durchführung zeigt Tabelle 14.
Tabelle 14: Präparationsprotokoll zur ICCS, 1. Teil
Ansätze
1.
2.
1.Schritt
§ 10µl Isotypen-AK § 10 µl Anti-IFN-γ
+10µl Isotypen-AK
+10 µl Anti-IL-4
+10µl Isotypen-AK
+5 µl Anti-CD4
3.
§
10 µl AntiTNF-α
+2 µl Anti-IL-10
+5 µl Anti-CD4
4.
§
1 µl AntiTGF-β
Es folgte nun ein 20 minütiger Inkubationsvorgang in Dunkelheit bei 4°C zur Antikörperbindung.
Nach Zugabe von 4 ml Permeabilisierungslösung folgt ein weiterer Waschschritt wie oben
erläutert.
Nachdem
der
Flüssigkeitsüberstand
dekantiert
wurde,
folgt eine neuerliche
Antikörpermarkierung (siehe Tabelle 15).
Tabelle 15: Präparationsprotokoll zur ICCS, 2. Teil
Ansätze
1.
2.
2.Schritt
+500µl HBSS-Lsg.
+500µl HBSS-Lsg.
§ Probe meßfertig
§ Probe meßfertig
3.
+2 µl StreptavidinPE
4.
+10 µl RAM
Nach einem weiteren Zyklus von Inkubation, Waschschritt und Dekantierung, folgt eine letzte
Antikörpermarkierung (siehe Tabelle 16).
Tabelle 16: Präparationsprotokoll zur ICCS, 3. Teil
Ansatz
3.
3.Schritt
+500 µl HBSS-Lsg.
§ Probe meßfertig
4.
+10 µl Anti-IL-2
+5 µl Anti-CD 4
§ 1 Bearbeitungszyklus
(Inkubation, Waschen,
Dekantieren, +500 µl
HBSS-Lsg.)
§ Probe meßfertig
________________________________47______________________________
2.5.2.5
Messung der Apoptoserate von PBL
Einleitung
Die durchflußzytometrische, durch Annexin-V markierte Apoptosemessung ist ein einfaches,
modernes Verfahren der auf Einzelzellbasis fußenden Apoptosemessung (Koopmann, 1994).
Annexin-V wurde ursprünglich als ein stark antikoagulatorisch wirksames Gefäßprotein entdeckt.
Es handelt sich vor allem um ein Phospholipid bindendes Protein, mit einer hohen Spezifität für
cholintragende Phospholipide wie Phosphatidylserin. Normale PBL präsentieren auf ihrer
Phospholipidplasmamembran
eine
signifikante
Asymmetrie.
Die
äußere
Schicht
der
Doppelmembran beinhaltet vor allem Phosphatidylcholin und Sphingomyelin. Dagegen besitzt die
innere Schicht hauptsächlich Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin (Op den Kamp,
1979). In der frühen Phase der Apoptose verliert ein PBL seine Phospholipidmembranasymmetrie.
Es kommt zu einer Präsentation von Phosphatidylserin auf der Oberfläche der äußeren
Plasmamembran. Diese Beobachtung gilt universell für alle kernhaltigen Zellen ( Zachowski,
1993).
Annexin-V bindet mit hoher Spezifität an negativ geladene Phospholipidspezies wie
Phosphatidylserin. Allerdings wird Phosphatidylserin während der gesamten Phase des
Apoptoseprozesses bis zur Zerstörung der Einheit der Zellstruktur, d.h. der Zerteilung der Zelle in
apoptotische Vesikel, auf der Oberfläche der Membranen dargestellt. Hieraus ergibt sich ein
methodisches Problem, da Annexin-V in nekrotischen Zellen ebenfalls in der Lage ist
Phosphatidylserinreste der inneren Schicht der Doppelmembran zu markieren, da bei
abgestorbenen Zellen die Integrität der Plasmamembran verloren gegangen ist. Um nun zwischen
apoptotischen und nekrotischen Zellen zu differenzieren, erweitert man die Messung um einen
weiteren Fluoreszenzfarbstoff.
Propidium Iodide (PI) ist ein für die Plasmamembran impermeabler DNA-Farbstoff der nur dann
zu einem Fluoreszenzsignal führt, wenn er in nekrotischen Zellen die zerstörte Membran
durchdringen kann. Anhand dieser 2 Färbungen lassen sich also nekrotische und apoptotische
Zellen differenzieren. Da die Präsentation von Phosphatidylserinresten ein sehr frühes Ereignis in
der Apoptose von PBL ist, waren wir somit in der Lage sehr sensitiv und quantitativ apoptotische
PBL zu erkennen.
Praktische Durchführung
In der durchflußzytometrischen Apoptosemessung waren Annexin-V mit dem Fluoreszenzfarbstoff
FITC markiert (FL1), und der Oberflächenmarker Anti-CD4 mit PE-Cy5 (FL3). PI als DNAFluoreszenzfarbstoff der aufgrund seines Emissionsspektrums in Kanal 2 (FL 2) gemessen wurde,
brauchte keinen eigenen farbstoffmarkierten AK. Zur Bestimmung der Autofluoreszenz im Sinne
einer Negativkontrolle, wurden bei jeder Messung die Ansätze 1 (Annexin-V), 2 (PI) und 3
(Isotypen-IgG1-AK) mitgeführt. Als Ergebnis der Messungen lassen sich in der Tabelle 17
gezeigte Populationen bestimmen.
________________________________48______________________________
Tabelle 17: Dikrimination von Vitalitätsstadien PBL durch Annexin-V Messung
Zelltyp: CD4 (PE-Cy5)
Vitalitätsstadium
Annexin-V (FITC)
TH-Zelle
Intakte Zelle
negativ
TH-Zelle
Apoptotische Zelle
positiv
TH-Zelle
Nekrotische Zelle
positiv
PI
negativ
negativ
positiv
Zunächst wurden 500 µl der vorher erstellten Zellsuspension (2x106 PBL/ml Medium) auf 4
Polystyrenreagenzgläser
gegeben,
und
10
min
bei
1200
U/min
zentrifugiert
(Zentrifugationsschritt). Anschließend wurde der Überstand dekantiert, und zu jedem Ansatz 200
µl HEPES-Puffer (HEPES-Reagenz auf 1000ml Aqua bidest, Life-Technologies, USA) und die
entsprechenden Antikörper (siehe Tabelle 18) hinzugefügt.
Tabelle 18: Übersicht über verwendete Immunfluoreszenz-AK
1. Ansatz (FL3)
2. Ansatz (FL1)
3. Ansatz (FL2)
+10µl Anti-Isotypen+10µl Annexin-V (FITC)
+20µl PI
AK (PE-CY 5)
4. Ansatz (FL1, 2, 3)
+10µl Annexin-V (FITC)
+20µl PI,
+10 µl Anti-CD4 (PE-CY5)
Anschließend wurden die 4 Ansätze zur Inkubation ohne Lichteinfluß bei 4o C für 20 min. in einen
Kühlschrank gegeben. Dann wurden 3ml HEPES-Puffer hinzugefügt und wie oben beschrieben
zentrifugiert und dekantiert. Nach Auffüllen der Ansätze mit jeweils 500 µl HEPES-Puffer wurden
die Proben innerhalb von 60 min. durchflußzytometrisch ausgewertet.
2.5.2.6 Auswertung der ICCS von PBL
Nachdem die entsprechend charakterisierten Proben vorbereitet wurden, erfolgte binnen 60 min.
die Auswertung mittels FACScan um somit einer Beeinflussung der Meßergebnisse durch
Lagerungsschäden vorzubeugen.
Zunächst
wurde mit Hilfe der Negativkontrollen die Autofluoreszenz der untersuchten PBL
bestimmt, und anschließend die Geräteeinstellung überprüft. In dem folgenden Meßvorgang
wurden anhand der Proben 2, 3 und 4 die Rohdaten ermittelt, die anschließend mittels Cell Quest
Software
analysiert
wurden.
Zunächst
wurde
wie
in
der
Beschreibung
der
durchflußzytometrischen Technik erwähnt, die PBL-Gesamtpopulation über FSC und SCC
ermittelt. Die durchgeführte Zählung wurde nach 10.000 registrierten PBL beendet. Dann erfolgte
das „gating“ durch die Dot-Plot Graphik (G1). Mit Hilfe eines Histogramms wurde innerhalb der
PBL-Population (G1), die TH-Zellpopulation (Anti-CD4-AK) im Kanal 3 (FL3) als Gate 4 (G4)
definiert. Durch weitere Auswertehistogramme konnte nun durch die quantitative Erfassung der
Anzahl Anti-Zytokin-AK positiver Zellen (FL1, FL2) in G1 und G4, die prozentuale Verteilung der
Zytokinproduktion (IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α, TGF-β, INF-γ) der Lymphozytengesamt- und die
TH-Zellpopulation erfaßt werden. Hierdurch wurde eine Subklassifikation der TH-Zellen möglich.
Die ermittelten Daten konnten anschließend statistisch und graphisch analysiert werden.
________________________________49______________________________
2.5.2.7
Auswertung der Apoptoserate von PBL
Nachdem die entsprechend charakterisierten Proben vorbereitet wurden, erfolgte binnen 60 min.
die Auswertung mittels FACScan um somit einer Beeinflussung der Meßergebnisse durch
Lagerungsschäden vorzubeugen.
Zunächst
wurde mit Hilfe der Negativkontrollen (Ansatz 1, 2, 3) die Autofluoreszenz der
untersuchten PBL bestimmt, und die Geräteeinstellung überprüft. In dem folgenden Meßvorgang
wurden anhand der Probe 4 die Rohdaten ermittelt, die anschließend mittels Cell Quest Software
analysiert wurden. Zunächst wurde wie bereits oben erläutert, die PBL-Gesamtpopulation über
FSC und SCC ermittelt. Die durchgeführte Zählung wurde nach 10.000 registrierten PBL beendet.
Dann erfolgte das „gating“ (G1) und die Definition der TH-Zellpopulation (G4) in der gleichen
Weise wie bereits beschrieben. Durch ergänzende Auswertehistogramme konnte nun durch die
quantitative Erfassung der Anzahl Annexin-V bzw. PI positiver Zellen (FL1, FL2) in G1 und G4,
die prozentuale Verteilung von apoptotischen versus nekrotischen Lymphozyten und TH-Zellen
ermittelt werden. Die Daten konnten anschließend statistisch und graphisch analysiert werden.
2.5.2.8
Messung der Serumkonzentration von sICAM-1
Einleitung
ICAM-1 ist ein Mitglied der Immunglobulinsuperfamilie von Adhäsionsmolekülen, welche
gemeinsame
Immunglobulindomänen einer Länge von 90-100 Aminosäuren besitzen. ICAM-1
besitzt 5 solcher extrazellulärer Domänen die, wenn ICAM-1 in löslicher Form (sICAM-1) im
Serum vorhanden ist, als eine einzige intakte Kette vorliegen. ICAM-1 ist ein wichtiger Marker
einer inflammatorischen Immunreaktion und dient der Emigration von Lymphozyten in entzündlich
geprägtes Gewebe (Frennette, 1996).
Der benutzte ELISA (Medgenix sICAM-1 EASIAKit, Bio Source, Belgien) diente der Ermittlung
der Plasmakonzentration des sICAM-1 in heparinisiertem, humanem Plasma. Hierbei handelte es
sich um einen enzymamplifizierten „Sandwich-ELISA“. Innerhalb der 96-well Mikrotiterplatte
(Medgenix sICAM-1 EASIAKit) war ein monoklonaler Anti-ICAM-1-Antikörper fest an den
polystyrolhaltigen Boden eines wells fixiert. Nachdem die verdünnten Plasmaproben hinzugegeben
worden waren, wurde unmittelbar ein monoklonaler, enzymkonjugierter Anti-ICAM-1-AK in das
well gefüllt. Das in den Plasmaproben enthaltene sICAM-1 band nun an den fixierten Antikörper,
während der konjugierte Antikörper an ein weiteres Epitop des löslichen ICAM-1 Moleküls band,
und somit den „Sandwich“ vervollständigte. Durch einen folgenden Waschschritt wurden nicht
reagierende Komponenten entfernt. Eine chromogene Reaktionslösung wurde hinzugefügt
(Tetramethylbenzidin{TMB}+ Wasserstoffperoxid {H2 O2 }), die in der folgenden Inkubationsphase
mit dem Enzym des freien, hinzugegebenen Antikörpers (Horseradish peroxidase: HRP) reagierte.
Diese enzymatische Reaktion wurde durch den Einsatz von Schwefelsäure (H2 SO4 ) gestoppt, so
daß die Mikrotiterplatte anschließend mit der entsprechenden Wellenlänge abgelesen werden
________________________________50______________________________
konnte. Hierbei war der Grad des Substratumsatzes, der proportional zur vorhandenen sICAM-1
Menge ist, kolorimetrisch durch Absorptionsmessung des bläulich gefärbten Reaktionsansatzes zu
bestimmen. Die Messung wurde bei einer Wellenlänge von 450nm und einem Referenzfilter von
650 nm vorgenommen (Medgenix EASIA Reader).
Praktische Durchführung
Die asservierten Serumproben der Patienten wurden zunächst mit der dem Reaktionskit (Medgenix
sICAM-1 EASIAKit)
eigener Verdünnungslösung
1/100 verdünnt. Anschließend wurden
jeweils 25µl der verdünnten Proben und der mitgelieferten Standards in jeweils 1 well der 96Mikrotiterplatte gegeben. Dann wurden 75 µl des Anti-sICAM-1-AK in jedes well gegeben, und
bei Raumtemperatur für 2 h inkubiert. Die Inkubationsphase erfolgt unter Einsatz eines
horizontalen Tischschüttlers bei 700 U/min (EASIAShaker, Medgenix). Nach 2 Stunden wurde
der Überstand jeder Probe aspiriert, und die Mikrotiterpla tte mit 0.4ml Waschlösung (Medgenix
sICAM-1 EASIAKit) überschichtet. Es folgten 2 weitere Waschschritte wie bereits beschrieben.
Anschließend wurden 200 µl chromogene Reaktionslösung (Medgenix sICAM-1 EASIAKit)
hinzugegeben, und die Platte unter Lichtschutz, 30 min unter horizontaler Schüttelbewegung bei
Raumtemperatur mit 700 U/min inkubiert. Nachdem 50 µl Stoplösung (Medgenix sICAM-1
EASIAKit) hinzupipettiert wurden, konnte die Auswertung der Platte innerhalb von 3 h erfolgen.
2.5.2.9
Auswertung der Serumkonzentration von sICAM-1
Die Mikrotiterplatte wurde nun kolorimetrisch durch Absorptionsmessung (Medgenix Reader)
ausgewertet. Hierfür wird die Mikrotiterplatte bei 450 nm (Referenzfilter 630nm) ausgelesen. Da
wie bereits in der Einleitung zur ELISA Methodik erwähnt der Grad des Substratumsatzes
proportional zur vorhandenen sICAM-1 Menge war, mußte zunächst anhand der mitbestimmten
Standards eine Standardkurve erstellt werden. Hierfür wurden die Absorptionsmessungen auf der
Ordinate gegen die Standardkonzentrationen auf der Abszisse aufgetragen. Anschließend wurden
die
Meßergebnisse
des
Patientenplasmas
auf
der
Ordinate
des
semilogarithmischen
Koordinatensystems gegen die auf der Abszisse liegenden Werte der Standardlösungen aufgetragen
und so eine Kurve konstruiert. Die im Plasma vorhandenen sICAM-1 Konzentrationen waren so
direkt ablesbar.
2.5.3 Sicherheitslabor und Nebenwirkungsprofil
Das Sicherheitslabor (siehe Anhang, Übersicht 3) und die Erfassung von unerwünschten
Nebenwirkungen, orientierten sich in Ihrer Dokumentation an bereits bekannten klinischlaborchemischen Alterationen unter Therapie sowie an bekannten klinischen Nebenwirkungen
(Altmeyer, 1996). Die Referenzintervalle des Sicherheitslabors, entsprechen denen im St. JosefHospital Bochum, Universitätsklinik vorgegebenen Intervallen. Zusätzlich wurde neben den bereits
erwähnten klinisch-neurologischen Untersuchungen, zur Erfassung von Nebenwirkungen eine
________________________________51______________________________
internistische
Kontrolluntersuchung,
die
Erhebung
eines
EKG,
Blutdruckmessung
und
Gewichtsmessung durchgeführt. Die klinischen Nebenwirkungen wurden frei formuliert, und
subjektiv durch den Patienten in 3 Grade (leicht, mittel, schwer) eingeteilt. Des weiteren erfolgte
eine Erfassung der Dauer der Nebenwirkung sowie des Folgezustandes des Patienten (erholt, nicht
erholt).
2.6
Materialien
2.6.1 Materialien für die Messung der ICCS
§
Antikörper: siehe Tabelle 19
Tabelle 19: Fluoreszenzantikörper und Proteine
BD (Becton Dickinson, USA), Hölzel (Hölzel Diagnostika, Köln), Immunt. (Immunotech, Frankreich), GZ
(Genzyme Diagnostics, USA), Bender (Bender Med-Systems, Österreich)
Antikörper
Herkunftsspezies
Fluoreszenzmarkierung
Hersteller
Maus
FITC
BD
Isotypen IgG γ2a
Maus
PE
BD
Isotypen IgG γ1a
Maus
PE-Cy5
Immunt.
Isotypen IgG γ1a
Streptavidin
PE
Hölzel
Ratte-Anti-Maus (RAM)
Ratte
PE
BD
Annexin-V
E.Coli
FITC
Bender
PI
Autofluoreszenz
Bender
Anti-IL2-IgG
Maus
FITC
BD
Anti-IL4-IgG
Maus
PE
BD
Maus
FITC
BD
Anti-IFNγ-IgG
Anti-IL10-IgG
Maus
Biotin
Hölzel
Maus
FITC
BD
Anti-TNFα-IgG
Maus
PE
Genzyme
Anti-TGFβ1-3
Anti-CD4-IgG
Maus
PE-Cy5
Immunt.
2.6.2 Materialien für die Messung der Apoptoserate
§
Antikörper: siehe Tabelle 20
Tabelle 20: Fluoreszenzantikörper und Proteine
Immunt. (Immunotech, Frankreich), BioP (Bioproducts Boehringer Ingelheim)
Antikörper
Herkunftsspezies
Fluoreszenzmarkierung
Annexin-V
E.Coli
FITC
PI
Autofloureszenz
Anti-CD4-IgG
Maus
PE-Cy5
Maus
PE-Cy5
Isotypen IgG γ1a
Hersteller
BioP
BioP
Immunt.
Immunt.
________________________________52______________________________
2.7
Statistische Datenanalyse
Die Auswertung der ermittelten Daten erfolgte unter zur Hilfenahme des Statistikprogramms SPSS
10.0 (SPSS, München). Analytisch genutzt wurde eine deskriptive Statistik, mit dem Median als
Lagemaß und dem mittleren empirischen Quartilsabstand (MEQ) als Streuungsmaß:
§
(MEQ =0.5*({50.-25. Perzentile}+{75.-50. Perzentile}).
Aufgrund der nichtnormalverteilten Daten wurden Boxplot Diagramme zur graphischen Analyse
verwendet. Innerhalb eines solchen Diagramms markiert die Box den Bereich der 25.-75.
Perzentile, wobei der Median (50. Perzentile) durch die horizontal verlaufende Strichmarkierung
symbolisiert wird. Die 5.-95 Perzentile wird durch vertikale aus der Box reichende Marker
dargestellt (siehe Ergebnissteil dieser Arbeit). Die Analyse der verschiedenen Meßparameter wurde
wie folgt durchgeführt.
Um innerhalb der Studienpopulation den Einfluß der Medikation auf das Spektrum der
Zytokinsekretion und die Apoptoserate in den Untergruppen TH-Lymphozyten (TH) und sonstige
Lymphozyten (PBL) zu erfassen, wurde bei nichtnormalverteilten Daten der nichtparametrische
Wilcoxon-Test für verbundene Stichproben verwendet. Die Basisuntersuchungen (Zeitpunkt: 0.
und 6. Studienwoche) wurden als geometrisches Mittel zusammengefaßt, und mit dem Meßwert
zum Zeitpunkt 24. Studienwoche (medikamentöse Höchstdosis) verglichen. Anschließend wurde
der Meßwert zum Zeitpunkt 24. Studienwoche mit der Messung zum Zeitpunkt 28. Studienwoche
(4 Wochen Therapiepause) in Beziehung gesetzt. Das Signifikanzniveau wurde bei α = 0,05
festgelegt. Mittels Boxplot-Diagrammen wurde der Verlauf der Meßparameter über den gesamten
Studienzeitraum (0-28 Wochen) visualisiert. Die Analyse der klinischen Verlaufsparameter (9HPT, AI, EDSS) erfolgte aufgrund der nichtnormalverteilten Daten, unter Anwendung des
Wilcoxon-Tests für verbundene Stichproben. Die Basisuntersuchungen wurden als arithmetisches
Mittel zusammengefaßt, und nach oben beschriebenem Schema statistisch und graphisch
dargestellt. Um den Einfluß der Studienmedikation auf den Serumspiegel von sICAM-1 und die
Zellzahlen von TH-Zellen und PBL zu analysieren, wurde hier bei normalverteilten Meßdaten der
t-Test für verbundene Stichproben gewählt. Die analysierten Zeitpunkte, und das Vorgehen
entsprechen den zuvor dargestellten. Das Sicherheits- und Nebenwirkungsprofil wurde in
tabellarischer Form erstellt.
________________________________53______________________________
3.0
Ergebnisse
3.1
Klinisch-neurologische Zielparameter
7 Patienten beendeten die Studie, 3 Patienten traten auf eigenen Wunsch aus der Studie vor Beginn
der
Medikamenteneinnahme
aus. Grund für den Studienaustritt waren jeweils nicht
studienbezogene Gründe (Umzug, hohe Krankheitsaktivität zwischen Zeitpunkt 0 und 6 Wochen,
Hepatitis C Infektion {Zufallsbefund} zwischen Zeitpunkt 0 und 6 Wochen). Die statistische
Analyse erfolgte in der gleichen Art und Weise wie bei den noch folgenden Zytokindaten. Die
Anwendung der statistischen Tests wird dort eingehend erläutert. Bei den 7 analysierten Patienten,
welche die klinische Studie nach Einschlußphase beendeten, zeigten sich die klinischen
Kontrollparameter der Krankheitsprogression über den Verlauf der 28 Studienwochen
weitestgehend konstant, teilweise sogar verbessert. Die Tabelle 21 zeigt einen Überblick der
erhobenen Parameter zu den unterschiedlichen Zeitpunkten.
Tabelle 21: Verlauf klinischer Kontrollparameter unter Fumarattherapie
P (Signifikanzniveau), n.s. (nicht signifikant), MQS (mittlerer empirischer Quartilsabstand),
*1 (mittlerer Wert auf 1 Jahr extrapoliert)
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12.
18. W
(Studienwoche)
0.+6.
W
W
Median des EDSS
2,0
2,0
2,0
MQS
0,3
0,5
0,2
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
Wilcoxon-Test (Woche 24/28), p-Wert
Median des Ambulation Index
2,0
2,0
2,0
MQS
0,2
0,5
1,0
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
Wilcoxon-Test (Woche 24/28), p-Wert
Median des 9-HPT, rechte Extremität
22
20
20,5
(in Sekunden)
MQS
2,5
2,2
2,7
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
Wilcoxon-Test (Woche 24/28), p-Wert
Median des 9-HPT, linke Extremität
21
20,5
20,5
(in Sekunden)
MQS
2,3
1,5
2,7
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
Wilcoxon-Test (Woche 24/28), p-Wert
Schubrate * 1 (mittlere Schubrate/Patientenjahr)
1,8
24. W
28. W
1,5
0,2
0,026
n.s.
1,0
1,0
n.s.
n.s.
17
1,5
0,5
0,2
0,028
n.s.
18
2,0
1,0
0,028
n.s.
0,8
1,2
2,0
1,0
19
19
0,7
Bezüglich des EDSS kam es zu einer leichten Verbesserung um 0,5 Punkte bis zum Therapie und
Studienende (24. und 28. Studienwoche), allerdings war die Besserung nicht signifikant. Der
Ambulation Index (AI) als sensitiveres Maß der Behinderung der unteren Extremität zeigte
ebenfalls eine nicht signifikante Verbesserung um einen Punkt bis zur 24. Woche. In der 28.
Woche war der AI identisch mit der Basisuntersuchung. Der 9-HPT als sensitiveres Maß der
Behinderung der oberen Extremität, zeigte für beide Extremitäten signifikante Verbesserungen der
Meßwerte in der 24. Woche im Vergleich zur Basisuntersuchung (siehe Tabelle 21). Zum Ende
der Studie, kam es zu keiner signifikanten Zunahme der Testwerte im Rahmen der 4 wöchigen
________________________________54______________________________
Therapiepause. Insgesamt gesehen hatte kein untersuchter Patient eine Verschlechterung der oben
genannten klinischen Tests.
Die mittlere Schubrate/Patientenjahr nahm von 1,8 auf 0,8 (nach 24 Studienwochen) bzw. 0,7
(nach 28 Studienwochen) ab. Diese Unterscheidung der mittleren Schubrate zwischen dem Ende
der Medikationseinnahme und dem Studienende wurde getroffen, um eine eventuelle Zunahme der
Schubinzidenz nach Medikationsende zu detektieren. Im Rahmen der Studie traten insgesamt 3
Schübe auf, wobei 1 Schub vor Medikamenteneinnahme zwischen 2 Basisuntersuchungen auftrat,
die anderen beiden Schübe in der 24. Woche unter Studienmedikation auftraten. Es handelte sich
jeweils um klinisch leichtgradige Schübe mit lokalisierten Sensibilitätsstörungen der Extremitäten,
ohne weitere Beeinträchtigung anderer funktioneller Systeme. Nach standardisierter Schubtherapie,
dem Schema der deutschen MS-Therapie Konsensus Gruppe folgend (MSTKG, 1999), bildeten
sich die Schubsymptome vollständig zurück.
3.2
Sicherheitsprofil und Nebenwirkungen
Der Tabelle 22 (Seite 55) ist eine Auflistung aller relevanten laborchemischen und sonstigen
Nebenwirkungen zu entnehmen. Therapieabbrüche aufgrund von klinischen bzw. laborchemischen
Veränderungen traten in dieser Untersuchung nicht auf. Internistische Untersuchungen, EKG,
Blutdruck und Gewichtsmessungen, zeigten sich im Verlauf der Therapie (6.-24. Studienwoche) als
auch nach Therapieende (28. Studienwoche) unverändert.
Hauptnebenwirkung waren Magenbeschwerden bei 6/7 Patienten, die bei 2 Patienten als
mittelgradig, ansonsten als leichtgradig angegeben wurden. Alle Patienten erholten sich von der
entsprechenden Nebenwirkung, die nur diskontinuierlich für maximal 6 Stunden auftrat. Allerdings
persitierten die Beschwerden über den gesamten Zeitraum der Medikationseinnahme (bis zur 24.
Woche), ohne in der Häufigkeit abzunehmen.
Leberwerterhöhungen fanden sich in dieser Arbeit bei 2 Patienten, die allerdings als leichtgradige
Laborwertabweichungen imponierten. Lediglich 1 Patient zeigte intermittierend eine GPT
Erhöhung um 290% des Referenzwertes, die sich aber in einer kurzfristigen Kontrolluntersuchung
rückläufig zeigte. Eine Flush-Symptomatik, intermittierend auftretend für Minuten bis Sekunden,
fand sich bei 3/7 Patienten. Die Flush-Symptomatik trat ebenso wie die zuvor berichteten
Magenbeschwerden bereits in der 12. Woche auf, nahm aber gegen Ende der Medikationseinnahme
in der 24. Woche an Frequenz (1 Patient) ab. Das Auftreten von Diarrhoen bei 3/7 Patienten, zeigte
sich ebenfalls als relevante Nebenwirkung, die maximal für einen Tag anhielt. Die Durchfälle
traten zu Beginn der Studie in der 12. Woche auf, waren leichtgradig und verschwanden komplett
bis zur 24. Woche (Medikationsende).
Eine Zunahme der Eosinophilen Granulozyten, konnte bei 3/7 Patienten beobachtet werden. 1
Patient hatte einen Anteil von 15 % Eosinophiler an der Gesamtleukozytenzahl (12. Woche), ein
Wert der als schwere Eosinophilie zu werten war. Diese Blutbildveränderung bildete sich aber
bereits unter Therapie vollständig zurück, ohne daß vermehrt allergische Reaktionen bei den
________________________________55______________________________
Patienten auftraten. Ein Studienausschluß aufgrund einer Eosinophilie, mußte nicht vollzogen
werden. Eine leichte Lymphozytopenie bestand bereits bei 3/7 Patienten vor Medikationsbeginn
(Basisuntersuchungen), und nahm bei allen Untersuchten bis zum Medikationsende deutlich zu.
Unter der mittleren Abnahme der Lymphozytenzahl von 57%, traten in dieser Studie keine Zeichen
einer erhöhten Infektionsneigung auf. Nach Medikationsende paßten sich die Lymphozytenzahlen
wieder dem Ausgangsniveau an.
Untersuchungen bezüglich der Nephrotoxizität, zeigten nur bei einem Patienten eine
vorübergehende, leichtgradige Albuminurie von <100mg/dl. Diese Veränderung war bereits unter
Therapie komplett rückläufig, und ergänzende Parameter der Nephrotoxizität wie Harnstoff,
Kreatinin, Urinstix und Sediment waren gänzlich ohne pathologischen Befund. Alle weiteren
erhobenen klinischen/laborchemischen Sicherheitsparameter waren unter der Therapie unverändert
im Normwertbereich angesiedelt. Grundsätzlich zeigten sich sämtliche Nebenwirkungen von den
Patienten als tolerabel und als leicht bis mittelgradig klassifiziert. Nach Beendigung der Therapie in
der 24. Woche, bildeten sich alle klinischen und laborchemischen Veränderungen
vollständig
zurück (28. Woche).
Tabelle 22: Verlauf relevanter Nebenwirkungen unter Fumarattherapie
N.W. (Nebenwirkungen)
Meßparameter
Anzahl veränderter Werte bei
Anzahl veränderter Werte
Patienten vor Medikation
bei Patienten bis
(Basisuntersuchungen)
Medikationsende
(24. Woche)
GPT
Erhöhung bei 0/7 Patienten
GGT
Bei 2/7der Patienten Erhöhungen um
bis zu 42 % des Normwerts
Albumin im
Urin
Eosinophile
Granulozyten
Bei 1/7 Patienten <100mg/dl
Bei 0/7der Patienten geringfügige
Erhöhungen
Bei 2/7 der Patienten
Erhöhungen bis zu
290 % des Normwerts
Bei 2/7der Patienten
Erhöhungen um bis zu
135 % des Normwerts
Bei 2/7 Patienten
<100mg/dl
Bei 3/7der Patienten
Erhöhungen um bis zu
360 % des Normwerts
Bei 4/7 Patienten
Erniedrigungen um bis zu
60% des Normwerts
Lymphozyten
Bei 3/7 Patienten Erniedrigungen um
bis zu 50% des Normwerts
Diarrhöe
Bei 0/7der Patienten
Bei 3/7der Patienten
Flush
Bei 0/7der Patienten
Bei 3/7der Patienten
Magenschmerzen
Bei 0/7der Patienten
Bei 6/7der Patienten
Anzahl
veränderter
Werte bei
Patienten
bei Studienende
(28. Woche)
0/7 Patienten
Bei 2/7 Patienten
Erhöhungen um
bis zu 95 % des
Normwerts
Bei 1/7 Patienten
<100mg/dl
0/7 Patienten
Bei 3/7 Patienten
Erniedrigungen um
bis zu 48% des
Normwerts
Bei 0/7der
Patienten
Bei 0/7der
Patienten
Bei 0/7der
Patienten
________________________________56______________________________
3.3
Ergebnisse der sICAM-1 Messung
Die Tabelle 23 faßt die ermittelten Serumkonzentrationen für sICAM-1 zu den unterschiedlichen
Studienzeitpunkten zusammen. Mittels t-Test für verbundene Stichproben wurde der Meßwert der
Basisuntersuchungen (0. und 6. Woche.) mit dem Meßwert bei Medikationsende (24. Woche)
verglichen. Zusätzlich erfolgte ein Vergleich von Meßwert bei Medikationsende (24. Woche) und
erhobenen Daten bei Studienende (4 Wochen ohne Medikation, 28. Woche). Wie aus der Tabelle
hervorgeht, kommt es unter FAE-Therapie zu einer weitestgehend kontinuierlichen Abnahme der
sICAM-1 Serumkonzentrationen, so daß zum Zeitpunkt des Therapieendes (24. Woche) eine
statistisch signifikante Abnahme nachgewiesen werden konnte (Tabelle 23).
Tabelle 23: sICAM-1 Serumkonzentrationen:
p (Signifikanzniveau), n.s. (nicht signifikant), MQS (mittlerer empirischer Quartilsabstand)
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
(Studienwoche)
0.+6. W
Median der sICAM-1
342
362
335
Serumkonzentration (pg/ml)
MQS
185
117
113
T-Test (Woche 0/24), p-Wert
T-Test (Woche 24/28), p-Wert
24. W
28. W
265
360
114
0,046
n.s.
63
Zur Visualisierung der Resultate folgte eine Boxplot Darstellung (siehe Abbildung 7), in der die
Serumkonzentrationen gegen die Untersuchungszeitpunkte aufgetragen sind. Hier ist zu erkennen,
daß nach 4-wöchiger Medikationspause, die sICAM-1 Konzentrationen nahezu wieder die
Ausgangskonzentrationen zu Beginn der Studie erreicht haben, ein Effekt der allerdings statistisch
nicht signifikant ist (siehe Tabelle 23).
750
sICAM-1 Serumkonzentrationen (pg/ml)
700
650
#
600
550
500
450
400
350
300
250
200
150
100
Basis
12W
18 W
24 W
28 W
Untersuchungszeitpunkte (Wochen)
Abbildung 7: Verlauf der Serumkonzentrationen von sICAM-1, # (statistisch signifikanter Wert)
________________________________57______________________________
3.4
Ergebnisse der ICSS Messung
In der Darstellung der ermittelten Meßergebnisse der intrazellulären Zytokinmessung wurde nach
TH1 bzw. TH2/TH3 Lymphozytensubtyp unterschieden. Um einen eventuellen, spezifischen Effekt
der Fumarsäureester auf TH-Zellen (CD4-positiv) zu erfassen, wurden die Ergebnisse tabellarisch
und in ausgewählten Fällen graphisch mit der Gruppe der separat analysierten sonstigen
Lymphozyten (PBL, CD4-negativ) verglichen. Die Tabellen umfassen jeweils die ermittelten
Frequenzen Zytokin produzierender Zellen der Subgruppen TH-Zellen und PBL zu den
unterschiedlichen Meßzeitpunkten. Mittels des Wilcoxon-Tests für verbundene Stichproben wurde
die Meßwerte der Basisuntersuchungen (0. und 6. Woche) mit den Meßwerten bei
Medikationsende (24. Woche) verglichen. Ergänzend erfolgte ein Vergleich von Meßwerten bei
Medikationsende (24.Woche) und erhobenen Daten bei Studienende (4 Wochen ohne Medikation,
28. Woche). Im Falle einer sinnvollen Ergänzung der zu treffenden Aussage, erfolgte die
statistische Analyse zu anderen Zeitpunkten. Zur Visualisierung der Resultate folgte dann jeweils
eine Boxplot Darstellung, in der die Frequenzen der Zytokin produzierenden Zellen der Subgruppe
TH-Zellen gegen die unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkte aufgetragen wurden. Ergänzend
wurde zur Verdeutlichung der Aussagekraft, in einzelnen Fällen die Subgruppe der PBL, parallel
graphisch dargestellt.
3.4.1 TH1-Zellpopulationen
Interferon γ (IFN-γγ )
Der Verlauf des Anteils IFN-γ sezernierender Zellen beider Gruppen zeigte keine statistisch
signifikanten Veränderungen. Allerdings zeigte die Gruppe der TH-Zellen zum Zeitpunkt des
Medikationsendes eine Tendenz zur Abnahme der IFN-γ produzierenden Zellen (siehe Tabelle 24
und Abbildung 8). Dieser Effekt, konnte in der Gruppe der PBL nicht gesehen werden. Die
Meßwerte nach Studienende (28. Woche) entsprachen wieder denen zu Studienbeginn
(Basisuntersuchungen, 0. und 6. Woche), als Hinweis für die Vergleichbarkeit der Messungen ohne
Medikamentenwirkung.
________________________________58______________________________
Tabelle 24: Frequenzen IFN-γγ produzierender Zellen
Erläuterungen: p (Signifikanzniveau), n.s. (nicht signifikant), MQS (mittlerer empirischer Quartilsabstand)
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(Studienwoche)
0.+6. W
10,9
8,4
11,4
8,4
Median der IFN-γγ produzierender PBL
(in %)
MQS
10,3
6,9
7,7
3,1
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
n.s.
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
n.s.
p-Wert
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(Studienwoche)
0.+6. W
9,7
7,2
9,0
5,9
Median der IFN-γγ produzierender THZellen (in %)
MQS
3,8
3,0
4,2
2,6
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
n.s.
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
n.s.
p-Wert
Anteil IFN-gamma produzierender TH-Zellen (%)
20
10
0
Basis
12 W
18 W
24 W
Untersuchungszeitpunkte (in Wochen)
Abbildung 8: Frequenzen IFN-γγ produzierender TH-Zellen
28 W
28. W
11,6
5,1
28. W
8,7
5,5
________________________________59______________________________
Interleukin 2 (IL-2)
Es fand sich eine signifikante Abnahme des Anteils IL-2 sezernierender PBL zum Therapieende
(24. Woche) unter maximaler Dosierung der Medikation (siehe Tabelle 25 und Abbildung 9). Eine
vergleichbare Wirkung zeigte sich auf die TH-Zellen nicht. Vor (Basisuntersuchung) und nach
Therapie (28. Woche) fanden sich erneut äquivalente Zellzahlen für beide betrachtete Subgruppen.
Tabelle 25: Frequenzen IL-2 produzierender Zellen
Erläuterungen: p (Signifikanzniveau), n.s. (nicht signifikant), MQS (mittlerer empirischer Quartilsabstand)
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(Studienwochen)
0.+6. W
Median der IL-2 produzierender PBL
4,8
3,8
3,8
2,0
(in %)
MQS
1,3
1,5
2,2
1,9
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
0,028
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
n.s.
p-Wert
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(in Wochen)
0.+6. W
Median der IL-2 produzierender TH20,9
21,5
27,8
18,1
Zellen (in %)
MQS
4,8
7,9
5,7
10,6
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
n.s.
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
n.s.
p-Wert
4,0
5,8
28. W
21,2
18,2
16
Anteil IL-2 produzierender PBL (%)
Anteil IL-2 produzierender TH (%)
60
28. W
50
40
30
20
10
0
14
12
10
8
6
#
4
2
0
Basis
12 W
18 W
24 W
28 W
Untersuchungszeitpunkte (in Wochen)
Abbildung 9: Anteil IL 2 produzierender TH-Zellen und PBL
# (statistisch signifikanter Meßwert)
Basis
12 W
18 W
24 W
28 W
Untersuchungszeitpunkte (in Wochen)
________________________________60______________________________
Tumor-Nekrose-Faktor-α
α (TNF-α
α)
Die Frequenz der TNF-α produzierenden PBL zeigte sich im Verlauf der Therapiephase (Basis bis
24.Woche) unbeeinflußt auf niedrigem Niveau. Lediglich die TH-Zellen zeigten einen statistisch
nicht signifikanten Trend, im Sinne einer erhöhten Anzahl von TNF-α sezernierender Zellen zum
Zeitpunkt 18. Woche (siehe Tabelle 26).
In der 28. Woche, nach 4 wöchiger Therapiepause zeigten sich ebenfalls nahezu identische
Meßwerte im Vergleich zu den Basisuntersuchungen (siehe Abbildung 10).
Tabelle 26: Frequenzen TNF-α
α produzierender Zellen
Erläuterungen: p (Signifikanzniveau), n.s. (nicht signifikant), MQS (mittlerer empirischer Quartilsabstand)
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(Studienwochen)
0.+6. W
2
1,5
1,1
1,2
Median der TNF-α
α produzierender
PBL (in %)
MQS
1,5
1,0
1,3
1,4
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
n.s
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
n.s.
p-Wert
Untersuchungszeitpunkte
(Studienwochen)
Median der TNF-α
α produzierender THZellen (in %)
MQS
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
p-Wert
Anteil TNF-alpha produzierender TH (%)
0,4
12. W
18. W
24. W
28. W
5,9
6,3
4,7
5,0
1,1
2,0
2,8
2,8
n.s.
n.s.
1,8
10
8
6
4
2
0
12 W
1,7
Basis
0.+6. W
5,0
12
Basis
28. W
18 W
24 W
Untersuchungszeitpunkte (in Wochen)
Abbildung 10: Anteil TNF-α
α sezernierender TH-Zellen
28 W
________________________________61______________________________
3.4.2 TH2/TH3-Zellpopulationen
Interleukin 4 (IL-4)
Der Anteil IL-4 sezernierender TH-Zellen stieg unter Medikation kontinuierlich bis zum Ende der
medikamentösen Therapie (24. Woche) um 247 % an, eine Veränderung die sich statistisch
signifikant zeigte (siehe Tabelle 27). 4 Wochen nach Beendigung der medikamentösen Therapie,
hatte der Anteil IL-4 produzierender TH-Zellen wieder um 54% abgenommen (siehe Abbildung
11), ebenfalls ein statistisch signifikant Effekt. Die Gruppe der PBL zeigte keine Veränderung ihres
IL-4 Anteils, so daß die Induktion des TH2-Zytokins IL-4 spezifisch für die TH-Zellen war.
Tabelle 27: Frequenzen IL-4 produzierender Zellen
Erläuterungen: p (Signifikanzniveau), n.s. (nicht signifikant), MQS (mittlerer empirischer Quartilsabstand)
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(Studienwoche)
0.+6. W
Median der IL-4 produzierender PBL
1,3
0,8
1,2
1
(in %)
MQS
1,3
0,5
0,2
0,4
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
n.s.
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
n.s.
p-Wert
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(Studienwoche)
0.+6. W
Median der IL-4 produzierender TH2,3
4,3
5,3
6,3
Zellen (in %)
MQS
2,1
2,4
1,5
1,4
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
0,028
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
0,028
p-Wert
12
Anzahl IL-4 produzierender TH (%)
10
#
8
#
6
4
2
0
Basis
12 W
18 W
24W
Untersuchungszeitpunkte (in Wochen)
Abbildung 11: Frequenz IL-4 produzierender TH-Zellen
# (statistisch signifikanter Wert)
28 W
28. W
1,8
0,5
28. W
3,4
1,0
________________________________62______________________________
Interleukin 10 (IL-10)
Der Anteil IL-10 sezernierender TH-Zellen stieg unter Medikation bis zur 12. Woche um 212% an,
und blieb auf dem erhöhten Niveau bis zum Ende der medikamentösen Therapie (24. Woche).
Diese Veränderung war statistisch signifikant (siehe Tabelle 28). 4 Wochen nach Beendigung der
medikamentösen Therapie, hatte der Anteil IL-10 produzierender TH-Zellen wieder um 55%
abgenommen (siehe Abbildung 12), ein ebenfalls statistisch signifikant Effekt. Die Gruppe der PBL
zeigt keine Veränderung ihres IL-10 Anteils während der Therapie, so daß die Induktion des TH2-
Zytokins IL-10 spezifisch für die TH-Zellen zu sein schien.
Tabelle 28: Frequenzen IL-10 produzierender Zellen
Erläuterungen: p (Signifikanzniveau), n.s. (nicht signifikant), MQS (mittlerer empirischer Quartilsabstand)
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(Studienwoche)
0.+6. W
Median der IL-10 produzierender PBL
1,5
0,8
1,2
0,8
(in %)
MQS
0,3
1,0
0,9
0,3
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
n.s
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
n.s.
p-Wert
Untersuchungszeitpunkte
(Studienwoche)
Median der IL-10 produzierender THZellen (in %)
MQS
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
p-Wert
Basis
0.+6. W
2,4
24. W
28. W
5,4
5,1
5,1
2,8
Anteil IL 10 produzierender TH (%)
8
#
#
4
2
0
12 W
18 W
24 W
Untersuchungszeitpunkte (in Wochen)
Abbildung 12: Anteil IL-10 produzierender TH-Zellen
# (statistisch signifikanter Wert)
0,6
18. W
10
Basis
1,0
12. W
0,043
0,028
6
28. W
28 W
________________________________63______________________________
Tumor-Growth-Faktor-β
β (TGF-β
β)
Der Anteil TGF-β sezernierender TH-Zellen stieg unter Medikation kontinuierlich bis zur 18.
Woche um 426% an, und nahm bis zum Therapieende (28. Woche) leicht um 62% ab, verblieb
aber im Vergleich zur Basisuntersuchung um 373% erhöht. Dieser Effekt war statistisch signifikant
(siehe Tabelle 29). 4 Wochen nach Beendigung der medikamentösen Therapie, hatte der Anteil
TGF-β produzierender TH-Zellen wieder um 188% abgenommen (siehe Abbildung 13), ein
ebenfalls statistisch signifikanter Effekt. Die Gruppe der PBL zeigte keine Veränderung ihres TGFβ Anteils während der Therapie, so daß die Induktion des TH2-Zytokins TGF-β spezifisch für die
TH-Zellen zu sein schien.
Tabelle 29: Frequenzen TGF-β
β produzierender Zellen
Erläuterungen: p (Signifikanzniveau), n.s. (nicht signifikant), MQS (mittlerer empirischer Quartilsabstand)
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(Studienwoche)
0.+6. W
1,0
2,0
0,8
0,8
Median der TGF-β
β produzierender
PBL (in %)
MQS
0,7
0,9
0,7
1,4
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
n.s
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
n.s.
p-Wert
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(Studienwoche)
0.+6. W
1,9
6,6
8,1
5,1
Median der TGF-β
β produzierender THZellen (in %)
MQS
0,8
1,5
2,5
2,2
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
0,018
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
0,028
p-Wert
10
Anteil TGF-beta produzierender TH (%)
#
#
5
0
Basis
12 W
18 W
24 W
Untersuchungszeitpunkte (in Wochen)
Abbildung 13: Anteil TGF β produzierender TH-Zellen
# (statistisch signifikanter Wert)
28 W
28. W
0,7
0,7
28. W
2,7
1,1
________________________________64______________________________
3.5
Ergebnisse der Apoptosemessung
Einleitender Schritt zur Darstellung der Apoptoserate der TH-Zellen bzw. PBL, ist zunächst der
Vergleich der Absolutzahlen beider Gruppen während der Studie. Mittels des t-Tests für
verbundene Stichproben (Absolutzahlen) bzw. Wilcoxon-Test für verbundene Stichproben
(Apoptoserate), wurden die Meßwerte der Basisuntersuchungen mit den Meßwerten bei
Medikationsende
verglichen.
Ergänzend
erfolgte
ein
Vergleich
von
Meßwerten
bei
Medikationsende und erhobenen Daten bei Studienende. Im Falle einer sinnvollen Ergänzung der
zu treffenden Aussage, erfolgte die statistische Analyse zu anderen Zeitpunkten. Zur Visualisierung
der Resultate folgte dann jeweils eine Boxplot Darstellung, in der die Absolutzahlen bzw. die
Apoptoserate der TH-Zellen gegen die Untersuchungszeitpunkte aufgetragen wurden. Die Tabelle
30 zeigt die Entwicklung der Absolutzahlen der TH-Zellen und der PBL über die Zeit. Initial
zeigten beide Subgruppen einen nicht signifikanten Anstieg der Zellzahl bis zu 12. Woche.
Anschließend zeigten die PBL einen statistisch nicht signifikanten Trend zur Lymphopenie bis zum
Zeitpunkt des Therapieendes. Im Vergleich dazu fand sich eine statistisch signifikante
Erniedrigung der TH-Zellen in der 24. Woche um 65% im Vergleich zur Basisuntersuchung (siehe
Abbildung 14). Nach 4 wöchiger Therapiepause (28. Woche) entsprachen die Zellzahlen von PBL
und TH-Zellen in etwa wieder denen der Basisuntersuchung. Die TH-Zellzahl war wieder um 38%
angestiegen im Vergleich zur 24. Woche, allerdings statistisch nicht signifikant.
Tabelle 30: Absolutzahlen von TH-Zellen und PBL
Erläuterungen: p (Signifikanzniveau), n.s. (nicht signifikant), MQS (mittlerer empirischer Quartilsabstand)
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(Studienwoche)
0.+6. W
Median der PBL-Anzahl
1948
2565
1584
1006
MQS
1130
1309
1232
730
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
n.s.
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
n.s.
p-Wert
Untersuchungszeitpunkte
(Studienwoche)
Median der TH-Zellzahl
MQS
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
Wilcoxon-Test (Woche 24/28),
p-Wert
Basis
0.+6. W
1005
419
28. W
1679
930
12. W
18. W
24. W
28. W
1308
429
935
615
654
277
0,05
n.s.
906
533
________________________________65______________________________
2500
Zellzahl TH-Zellen (absolut)
2000
1500
#
1000
500
0
Basis
12 W
18 W
24 W
28 W
Untersuchungszeitpunkte (Wochen)
Abbildung 14: Zellzahl der TH-Zellen
# (statistisch signifikanter Wert)
Parallel hierzu erfolgt die Darstellung der Apoptoserate der PBL und TH-Zellen (siehe Tabelle 31).
Während der Verlauf der Apoptoserate der PBL keine signifikanten Unterschiede aufwies, fand
sich eine statistisch signifikant erhöhte Apoptoserate der TH-Zellen zum Zeitpunkt der 12. Woche
(+108%). Anschließend senkten sich die TH-Apoptoseraten wieder kontinuierlich auf das Niveau
der Basisuntersuchung (siehe Abbildung 15).
Tabelle 31: Apoptoseraten von TH-Zellen und PBL
Erläuterungen: p (Signifikanzniveau), n.s. (nicht signifikant), MQS (mittlerer empirischer Quartilsabstand)
Untersuchungszeitpunkte
Basis
12. W
18. W
24. W
(Studienwoche)
0.+6. W
Median apoptotischer (in %) PBL
11,3
14,8
13,6
12,6
MQS
4,0
5,3
5,6
2,7
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
n.s.
Wilcoxon-Test (Woche 24/28), p-Wert
n.s.
Untersuchungszeitpunkte
0. W
12. W
18. W
24. W
(Studienwoche)
Median apoptotischer (in %) TH-Zellen
4,7
9,8
7,1
4,2
MQS
1,7
3,5
3,2
2,2
Wilcoxon-Test (Woche 0/24), p-Wert
n.s.
Wilcoxon-Test (Woche 24/28), p-Wert
n.s.
Wilcoxon-Test (Woche 0/12), p-Wert
0,043
28. W
11,3
2,7
28. W
4,7
1,5
________________________________66______________________________
Anteil apoptotischer TH-Lymphozyten (%)
16
14
12
10
8
6
4
#
2
0
Basis
12 W
18 W
24 W
Untersuchungszeitpunkte (Wochen)
Abbildung15: Apoptoserate der TH-Zellen
# (statistisch signifikanter Wert)
28 W
________________________________67______________________________
4.0
Diskussion
Der Einordnung der ermittelten Ergebnisse in die Pathogenese der SRMS, soll eine tabellarische
Übersicht der immunologischen und klinischen Meßwerte vorangestellt werden.
Tabelle 32: Meßergebnisse
Immunologische
Änderungen der
Meßparameter
TH-Zellen
IL-2
Niedrige Anzahl,
konstant
Statistisch
signifikant
n.s.
Änderung der PBL
Abnahme der
Anzahl bis
Therapieende
Niedrige Anzahl,
konstant
Niedrige Anzahl,
konstant
Niedrige Anzahl,
konstant
Niedrige Anzahl,
konstant
Niedrige Anzahl,
konstant
Gleichbleibende
Apoptoserate
Statistisch
signifikant
signifikant
Niedrige Anzahl,
n.s.
konstant
Abnahme der Anzahl
n.s.
bis Therapieende
Zunahme der Anzahl
signifikant
bis Therapieende
Zunahme der Anzahl
signifikant
bis Therapieende
Zunahme der Anzahl
signifikant
bis Therapieende
Erhöhte
signifikant
Apoptoserate in der
12. Woche und
Abnahme bis zur 24.
Woche
Signifikante Abnahme der Serumkonzentration bis Therapieende
TNF-α
IFN-γ
IL-4
IL-10
TGF-β
Apoptose
SICAM-1
Klinische
Meßparameter
EDSS
AI
9-HPT
Änderung
Statistisch signifikant
Besserung um 0.5
Punkte
Konstanter Befund
Besserung beider
Extremitäten
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
n.s.
Signifikant
Kernstück der Diskussion der gewonnenen Meßergebnisse, sollen die immunologischen
Meßparameter sein, die auch zentraler Punkt der gegenwärtigen Arbeit sind. Vorangestellt werden
sollte allerdings eine kritische Würdigung der klinischen Ergebnisse, sowie der Sicherheitsaspekte
der FAE-Therapie.
Zunächst werden aber einige grundsätzliche Aspekte der Studie erläutert. Das Patientenkollektiv ist
mit 7 Patienten relativ klein und ohne placebokontrollierte Kontrollgruppe untersucht worden.
Allerdings sind die Kriterien die an diese Arbeit angelegt wurden die einer Phase II-Studie, wobei
Patientenanzahl und Studiendesign international vergleichbaren Untersuchungen entsprechen
(Walker, 2001). Es handelte sich bei dem untersuchten Kollektiv um eine immunologisch
homogene Kohorte, die bisher nicht medikamentös, immunmodulatorisch behandelt worden war.
Somit war von einem artifiziell „unbeeinflußten“ Immunsystem der Betroffenen auszugehen, ein
Umstand der die Aussagekraft der Untersuchung erhöhte. Alle Patienten wiesen MRT kontrolliert
eine aktive Erkrankung auf (siehe Einschlußkriterien), so daß, bei aus der Literatur bekannten
Vergleichsdaten zu gemessenen Immunparametern, immunmodulatorische Einflüsse der FAETherapie eindeutig gezeigt werden konnten (siehe Fazit dieser Arbeit).
________________________________68______________________________
4.1
Bedeutung der klinischen Meßparameter in der FAE-Therapie
EDSS: Die EDSS-Werte als Gradmesser des Funktionsdefizits bzw. der täglichen Behinderung,
verbesserten sich im Verlaufe der Therapie um 0,5 Punkte. Für den Untersuchungszeitraum konnte
also eine Progredienz der Erkrankung verneint werden. Das Phänomen der Besserung des EDSS
Werts, das im Rahmen von multizentrischen Phase-III Studien bekannt ist, wird auf eine optimierte
Begleittherapie im Rahmen der symptomatischen MS-Therapie (z.B. Krankengymnastik,
antispastische medikamentöse Therapie) zurückgeführt. (Calzada, 2001). Kritisch zu bemerken ist
allerdings, daß der Gebrauch des EDSS einige Schwächen in der Therapiebeurteilung dieser
Untersuchung beinhaltet. Die beiden Relevantesten seien im Folgenden erwähnt.
Der EDSS-Wert hat eine gewisse Unschärfe um diskrete Krankheitsprogressionen darzustellen, v.a.
im Bereich der Extremitätenfunktion (Goodkin, 1997). Dieses Defizit konnte allerdings durch die
Nutzung des 9-HPT und des AI umgangen werden. Die Verweildauer eines Patienten in
verschiedenen Bereichen des EDSS ist unterschie dlich, so daß an MS-Erkrankte im EDSS-Bereich
zwischen 1-2,5 Punkten ca. 3,2 Jahre und im EDSS-Bereich von 3-5 Punkten nur 1,5 Jahre
verweilen (Goodkin, 1997). So gesehen war eine Beobachtungszeit von 28 Wochen bei einer
mittleren Erkrankungsdauer von 4,8 Jahren vor Studieneintritt, zur sicheren Detektion einer
Krankheitsprogression zu knapp bemessen. Allerdings liegen aktuell Daten von 5 Patienten über
eine Nachbeobachtungszeit von 1,5 Jahren vor (Daten nicht Gegenstand dieser Dissertation), die
konstante EDSS-Werte über diesen Zeitraum zeigen.
Ambulation Index und 9-HPT: Die Meßergebnisse des Ambulation Index als sensitiveres Maß
der Behinderung der unteren Extremität (Paty, 1992), zeigten keine Krankheitsprogredienz über
den untersuchten Zeitraum bei allen Patienten. Da dieser Test auch kurzfristige Änderungen der
Progredienz, innerhalb von 6 Monaten und doppelt so sensitiv wie der EDSS mißt (Schwid, 2000),
konnte eine stabile Krankheitsphase bei den untersuchten Patienten konstatiert werden. Allerdings
ist zu berücksichtigen, daß die hohe Sensitivität des Tests vor allem in EDSS-Bereichen von 4,06,0 Punkten experimentell gesichert ist (Paty, 1992), und die untersuchten Patienten einen mittleren
EDSS von 2,0 Punkten bei Studieneinschluß hatten.
Die Meßergebnisse des 9-HPT, die als sensitiveres Maß der Behinderung der oberen Extremität in
EDSS-Bereichen von 1-3,5 Punkten gelten (Goodkin, 1988), zeigten statistisch signifikante
Besserungen der Testzeit für beide Extremitäten. Da der 9-HPT eine Krankheitsprogression
innerhalb von 6 Monaten dreifach sensitiver als der EDSS detektieren kann (Schwid, 2000), ist von
einer stabilen Krankheitsphase bei allen Patienten auszugehen. Der optimale EDSS-Bereich der
Sensitivität des 9-HPT war deckungsgleich mit dem EDSS bei Patienteneinschluß, so daß von der
oben angegebenen Sensitivität zur Progressionsdetektion in der vorliegenden Studie ausgegangen
werden kann. Die Verbesserung der Testzeiten im Verlaufe der FAE-Therapie, könnte als Retest
Phänomen interpretiert werden (Kalkers, 2001). Da die Meßergebnisse des 9-HPT, mit seiner
hohen Sensitivität für die Krankheitsprogression, positiv mit einer kernspintomographisch
________________________________69______________________________
gemessenen Krankheitsprogression (mittels „Lesion Load“-Messung) korrelieren (Kalkers, 2001),
ist dieser Test zusammenfassend als sensitivster klinischer Kontrollparameter zu betrachten.
Schubrate: Die mittlere Schubrate/Jahr im Verlauf der Studie, wurde aufgrund der
Untersuchungszeit von 28 Wochen auf 1 Jahr approximiert. Im Vergleich zur mittleren
Schubrate/Jahr bei Studieneinschluß, zeigte sich eine deutliche Reduktion der Schubhäufigkeit um
83%. Dieser Wert muß aber aufgrund der kurzen Beobachtungszeit und der Approximation auf 1
Jahr äußerst kritisch betrachtet werden. Die reduzierte Schubrate sollte lediglich unter dem Aspekt
der Arzneimittelsicherheit interpretiert werden, und somit als Meßparameter verstanden werden der
zeigt, daß es unter FAE-Therapie bei SRMS nicht zu einer Schubinduktion kommt.
Möglicherweise ist die deutliche Reduktion der Schubrate jedoch ein Ausdruck der Reduktion der
inflammatorischen Aktivität der Erkrankung, ein Befund der in der immunologischen Diskussion
noch eingehend erörtert wird. Ergänzend kann aber hinzugefügt werden, daß parallel durchgeführte
MRT Untersuchungen, die nicht Gegenstand dieser Dissertation sind, eine Abnahme der
kontratmittelaufnehmenden Läsionen um 90% (als Maß für die Entzündungsaktivität) zum
Therapieende im Vergleich zur Basisuntersuchung zeigten (Schimrigk, 1999). Wichtig ist auch zu
erwähnen, daß innerhalb von 4 Wochen nach Medikationsende (24.-28. Studienwoche), keine
neuen Entzündungsschübe als Zeichen einer fehlenden Reaktivierung der Entzündungsaktivität
auftraten. Dies kann ebenfalls als Aspekt einer hohen Arzneimittelsicherheit der FAE-Therapie bei
SRMS begriffen werden. Weitere Aspekte der Sicherheit der Studienmedikation, werden im
folgenden Diskussionskapitel besprochen. Die 3 aufgetretenen Schübe, von denen 2 unter
Medikation auftraten, waren leichtgradige klinische Schübe ohne relevante Beeinträchtigung des
EDSS. Sie bildeten sich ohne Residualsymptomatik zurück.
Methodologisch kritisch anzumerken ist, daß die Schubrate im Verlauf der Erkrankung
natürlicherweise abnimmt, und das die Schubrate nur schwach mit der Krankheitsprogression
korreliert ist (Goodkin, 1997). Somit war die hier beobachtete Abnahme der Schubrate,
möglicherweise mit dem natürlichen Verlauf der Erkrankung zu erklären. Wesentlicher Aspekt des
betrachteten Meßparameters Schubrate, war also die fehlende Induktion von Schüben bzw. ein
fehlender „Rebound-Effekt“ 4 Wochen nach Medikationsende. Abschließend läßt sich somit
zusammenfassend feststellen, daß alle erhobenen klinisch-neurologischen Meßparameter während
der Studie eine stabile Krankheitsphase konstatierten.
________________________________70______________________________
4.2
Bedeutung des Sicherheitsprofils und der Nebenwirkungen in der FAETherapie
Grundsätzlich zeichnen sich die Fumarsäureester durch ihre hohe Arzneimittelsicherheit bezüglich
ihrer Langzeittoxizität aus. Die FAE werden seit den sechziger Jahren therapeutisch angewandt,
ohne daß eine tumorinduzierende Wirkung nachgewiesen worden wäre (Mrowietz, 1999). Die
bisher einzige Langzeittherapiestudie mit FAE über 12 Monate, soll als Vergleichsstudie zu den in
dieser Arbeit gemessenen Nebenwirkungen im Rahmen der Diskussion herangezogen werden
(Altmeyer, 1996). Benutzte Medikation als auch deren Dosierung in der Vergleichsstudie waren
äquivalent zu denen der vorliegenden Arbeit.
Wie bereits im Ergebnisteil erwähnt, zeigten sich alle Nebenwirkungen als durch die Patienten
tolerabel und vollständig reversibel nach der Therapie. Für die Nebenwirkungen wie FlushSymptomatik, Diarrhöe, Leberwerterhöhungen und Eosinophilie zeigte sich im Verlauf der
Therapie in beiden Studien eine „Adaptation des Organismus an das Therapieregime“ (Altmeyer,
1996). Dies bedeutet, daß oben genannte Nebenwirkungen initial in der Studie präsent waren, und
nach einiger Zeit unter Therapie verschwanden. Diese „Tachyphylaxie“ der Nebenwirkung läßt
sich bezüglich der immunmodulatorischen Wirksamkeit der FAE allerdings in beiden Studien nicht
beobachten (Altmeyer, 1996). Vermittelt werden die transienten Nebenwirkungen wie
Bauchschmerz, Diarrhöe, Flush vermutlich über eine initiale Induktion der TNF-α Sekretion von
Lymphozyten (Asadullah, 1997). Diese erhöhte Sekretion wird nach einigen Wochen antagonisiert
über eine nun verstärkte IL-10 Sekretion in vivo, die dann zu einer Prädominanz der TH2-Zellen
führt (Asadullah, 1997). Klinisch ist das Überwiegen der TH2-Zytokinantwort mit einem
Rückgang der Nebenwirkungen vergesellschaftet.
Diese vorbeschriebene, initiale Induktion der TNF-α produzierenden TH-Zellen konnte bestätigend
in der vorliegenden Arbeit bis zur 18. Studienwoche ebenfalls gesehen werden, war aber statistisch
nicht signifikant. Anschließend kam es zur Abnahme der TNF-α produzierenden TH-Zellen, und
zu einer Induktion einer TH2-Reaktion (siehe weitere Diskussion). Somit entsprachen die
vorliegenden Meßdaten der Studie von Asadullah und Mitarbeitern (Asadullah 1997), und
bestätigten deren Hypothese zur „Tachyphylaxie“ der Nebenwirkungen.
Die Magenbeschwerden (6/7 Patienten) in der vorliegenden Arbeit zeigten sich mit deutlich
höherer Rate als in der Vergleichsstudie von Altmeyer und Mitarbeitern (12/83 Patienten), ein
Phänomen daß möglicherweise auf das kleinere Patientenkollektiv in der vorliegenden
Untersuchung zurückzuführen war. Leberwerterhöhungen fanden sich in dieser Arbeit in ähnlicher
Frequenz wie in der Vergleichsstudie von Altmeyer und Mitarbeitern. Gleiches galt auch für die
Flush-Symptomatik. Das Auftreten einer Diarrhöe bei 3/7 Patienten entspricht ebenfalls den
vorbekannten Häufigkeiten der Vergleichsstudie . Eine über eine Induktion von IL-4 vermittelte
Zunahme der eosinophilen Granulozyten (Mrowietz, 1998), konnte in beiden Studien bei ca. 42%
der Patienten beobachtet werden. Es traten aber keine vermehrten allergischen Reaktionen auf, so
daß die Blutbildveränderungen zwar detektierbar waren, aber keine relevante klinische Gefährdung
________________________________71______________________________
des Patienten darstellten. Ein Studienausschluß aufgrund einer Eosinophilie, mußte wie aus der
Vergleichsstudie bekannt, in der vorliegenden Studie nicht vorgenommen werden. Ebenfalls blieb
die Eosinophilie nur transient detektierbar, so wie es bereits in anderen Studien gesehen werden
konnte (Mrowietz, 1999). Die initial auftretende Eosinophilie sollte auch nicht nur als
unerwünschte Nebenwirkung, sondern gleichfalls als Marker einer therapeutischen Induktion von
TH2-Zytokinen verstanden werden (Mrowietz, 1998). Somit kann die medikamentös induzierte
Eosinophilie, gleichfalls als biologischer Effektivitätsmarker der FAE-Therapie interpretiert
werden (Mrowietz, 1998).
Eine leichtgradige Lymphozytopenie bestand bereits bei 3/7 Patienten vor Medikationsbeginn, und
nahm bei allen Untersuchten bis zum Medikationsende deutlich zu. Es traten auch in der hier
vorliegenden Studie keine Zeichen einer erhöhten Infektionsneigung auf, ebenfalls als Zeichen
therapeutischer Wirksamkeit bei gleichzeitig hoher Arzneimittelsicherheit (Altmeyer, 1996).
Untersuchungen bezüglich der Nephrotoxizität zeigten im wesentlichen keine pathologischen
Befunde, dies auch in Kongruenz zu Untersuchungsdaten die bereits bei der PsoriasisLangzeittherapie von Altmeyer und Mitarbeitern (Altmeyer, 1996) erhoben wurden. Die FAETherapie scheint keine relevanten nephrotoxischen Effekte zu besitzen, wenn sie wie nach dem
Dosierungsschema dieser Arbeit appliziert wird (Mrowietz, 1999). Die in Einzelfallbeschreibungen
dokumentierten Fälle eines akuten Nierenversagens, ließen sich vor allem auf die gleichzeitige
Applikation von oral und kutan applizierten FAE, im Sinne einer Überdosierung zurückführen
(Matthes, 1995). Allerdings existiert eine aktuelle Falldemonstration, die nach 5-jähriger FAETherapie in der Studiendosierung eine Assoziation mit einem Fall chronischen Nierenversagens
beschreibt (Raschka, 1999). Somit sollten bei einer Langzeittherapie mit FAE bei SRMS-Patienten,
über
Jahre
regelmäßige
Kontrollen
von
Urin,
glomerulärer
Filtrationsrate
und
Nierenretentionsparameter als essentiell betrachtet werden.
Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß das hier dokumentierte Nebenwirkungsspektrum dem
vorbekannten nahezu äquivalent ist, und somit die Applikation der FAE bei SRMS als sicher und
gut verträglich zu charakterisieren ist. Wenn nun abschließend ein Vergleich mit den derzeitigen
Standardtherapeutika der SRMS gezogen wird, läßt sich unter Berücksichtigung derer
Nebenwirkungsraten (siehe Tabelle 33) ein tolerables Nebenwirkungsprofil der FAE-Therapie
konstatieren. Im Besonderen soll die hohe Sicherheit der FAE bezüglich der Langzeittoxizität noch
einmal hervorgehoben werden, da das Präparat bereits seit 40 Jahren in der Psoriasistherapie
verwendet wird. Langzeitdaten über 10 Jahre hinaus bezüglich Tumorinduktion bzw. Induktion von
Autoimmunkrankheiten, existieren für die aktuellen Standardtherapeutika bisher nicht.
________________________________72______________________________
Tabelle 33: Hauptnebenwirkungen der Standard MS -Therapeutika nach Herstellerangaben
(Auswahl)
Präparat (Wirkmechanismus)
Hauptnebenwirkungen (in %)
Copolymer-I (Immunmodulator)
§ Flush, thorakales Engegefühl, Palpitationen, Dyspnoe
(10%)
§ Entzündungen an der Injektionsstelle (60%)
§ Vasodilatationen (20%)
§ Übelkeit, Durchfall (15%)
§ Arthralgien (25%), Spastikzunahme (20%)
§ Angstgefühle (25%)
§ Grippeähnliches Syndrom (58%)
Interferon-β
β (Immunmodulator)
§ Fieber (30%)
§ Kopfschmerz (70%)
§ Leukopenie, Thrombozytopenie, Lymphopenie (28%)
§ Erhöhte Werte der AST, ALT, GGT, AP (30%)
§ Fatigue-Syndrom (40%)
§ Entzündungen an der Injektionsstelle (65%)
§ Übelkeit, Bauchschmerz, Durchfall (20%)
§ Muskelschmerzen (30%), Depressionen (20%)
Mitoxantron (Chemotherapeutikum)
§ Dosisabhängige Myelonsuppression (10%)
§ Übelkeit, Erbrechen (50%)
§ Leberwerterhöhungen (30%)
§ Dosisabhängige Kardiotoxizität (20%)
4.3
Bedeutung der sICAM-1 Serumspiegel in der FAE-Therapie
Anlaß zur Untersuchung der sICAM-1 Serumkonzentrationen bei den SRMS-Patienten dieser
Studie,
waren
experimentelle
Untersuchungen
von
Vandermeeren
und
Mitarbeitern
(Vandermeeren, 1997) über die Wirkung von Fumarsäureestern (FAE) auf die endotheliale ICAM1 Expression. Fumarsäureester zeigten in vitro eine Hemmung der durch TNF-α induzierten
ICAM-1 Expression auf humanen Endothelzellen der Blutgefäße. Entscheidender Wirkstoff der
FAE war Dimethylfumarat (DMF) und damit dessen Metabolit MMF, der nach 72 h der Inkubation
eine Hemmung der Endothelrezeptorexpression erzeugte. Eingesetzte Konzentrationen waren 100
µM DMF, also Konzentrationen die etwa den erreichten Serumkonzentration bei Einsatz der FAEDerivate Fumaderm mite und Fumaderm forte entsprachen (Ockenfels, 1998). Der durch
Vandermeeren dokumentierte Effekt des DMF, konnte bisher nur nach kurzzeitiger in vitro
Stimulation gezeigt werden.
Welche Bedeutung hatten nun die sICAM-1 Konzentrationen bei der SRMS und wie war deren
Verhalten im Rahmen der vorliegenden Studie zu interpretieren? Eine erhöhte ICAM-1 Expression
auf Endothelzellen des ZNS, ist einer der relevanten Schritte der Migration autoreaktiver THZellen durch die Blut/Hirnschranke (Lee, 1999). Zeitliche und örtliche Expression auf
Endothelzellen in humanen MS-Plaques korrelieren mit dem Grad der Entzündung im ZNS
(Washington, 1994). Induzieren lassen sich die erhöhten Adhäsionsmolekülkonzentrationen durch
proinflammatorische Zytokine wie TNF-α und IFN-γ, die durch autoreaktive TH1-Zellen
________________________________73______________________________
exprimiert werden (Wong, 1992). Im EAE-Mausmodel geht die endotheliale Expressionssteigerung
von ICAM-1, dem Entzündungsschub voraus. Antikörper gegen ICAM-1 verhindern denselben
(Archelos, 1993).
Lösliche Formen des ICAM-1 (sICAM-1) finden sich im Serum bei Gesunden und in signifikant
höheren Konzentrationen bei MS-Erkrankten (Lee, 1999). Die Entstehung dieser Form des
Adhäsionsmoleküls, ist auf eine proteolytische Ablösung des membranständigen Moleküls durch
Matrix-Metalloproteinasen (MMP) im Rahmen der Induktionsphase der MS-Pathogenese (siehe
Einleitung dieser Arbeit) zurückzuführen. Geringe Konzentrationen entstehen durch alternatives
„Splicing“ und Sekretion des ICAM-1 durch endotheliale Zellen auch bei Gesunden (Trojano,
1998). Die Konzentrationen des zirkulierenden sICAM-1 korrelieren direkt mit denen des
endothelständigen Adhäsionsmoleküls.
Weiterhin korrelieren erhöhte Konzentrationen des sICAM-1 positiv mit der Entzündungsaktivität
und Schubaktivität der SRMS (Rieckmann, 1994). Bei SRMS geht ein Anstieg der sICAM-1
Serumkonzentration dem Anstieg der Entzündungsaktivität im MRT direkt voraus, und Phasen der
klinischen Stabilität korrelieren mit gleichbleibenden Serumkonzentrationen (Giovannoni, 1997).
Allerdings korrelieren höhere, gleichbleibende sICAM-1 Serumkonzentrationen mit einem
schwereren Krankheitsverlauf (Giovannoni, 1997). Somit kann sICAM-1 als biologischer Marker
der Krankheitsaktivität und Progressionsdynamik angesehen werden kann (Khoury, 1999).
Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigten eine statistisch signifikante Abnahme der
sICAM-1 Konzentration in der 24. Studienwoche im Vergleich zu den Basisuntersuchungen. Zu
diesem Zeitpunkt erhielten alle Patienten die Höchstdosis des Medikaments, wobei die
Serumspiegel dann etwa im Bereich von 30-100 µM liegen dürften (Ockenfels, 1998). Nach 4
wöchiger Therapiepause, war die mediane Serumkonzentration von sICAM-1 wieder äquivalent
mit der Basisuntersuchung, ein weiterer Hinweis, daß die vorangehende Reduktion der sICAM-1
Serumkonzentration ein spezifischer Medikamenteneffekt war. Schlußfolgernd konnte der
reduzierte Serumspiegel des löslichen Adhäsionsmoleküls zum Zeitpunkt 24. Studienwoche, als
biologischer Marker der reduzierten Krankheitsaktivität unter FAE-Therapie angesehen werden.
Darüber hinaus stellte die reduzierte sICAM-1 Konzentration, und damit die reduzierte ICAM-1
Expression auf den Endothelzellen des ZNS, einen möglichen immunologischen Wirkmechanismus
der FAE bei SRMS, vermittelt über Hemmung der Migration autoreaktiver T-Zellen durch die
Blut/Hirnschranke, dar.
Würde der von Vandermeeren und Mitarbeitern (Vandermeeren, 1997) beschriebene
Hemmechanismus der ICAM-1 Expression auf den Endothelzellen des ZNS die hier gemessene
Wirkung der FAE begründen, so hätte der abgesunkene sICAM-1 Spiegel bereits nach 12 Wochen
detektierbar sein sollen. Da der entsprechende Effekt allerdings erst nach 24 Studienwochen
signifikant detektierbar war, die Serumspiegel von DMF im Bereich von 30-100 µM aber bereits
nach 18 Wochen erreicht worden waren, sind 2 mögliche alternative Erklärungsmodelle denkbar:
________________________________74______________________________
1. Der Effekt der FAE auf die ICAM-1 Expression ist in vivo bei MS-Erkrankten ein
prolongierter Effekt. Bei den in die Studie eingeschlossenen Patienten lag eine erhöhte
Krankheitsaktivität vor, die durch das Einschlußkriterium von mindestens einer entzündlichen,
kontrastmittelaufnehmenden Läsion im MRT kontrolliert wurde. Das Immunsystem solcher
Patienten ist vornehmlich über die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen von TH1Zellen charakterisiert, die IFN-γ, TNF-α und IL-2 sezernieren (Killestein, 2001). Hier ist es
denkbar, daß aufgrund der kontinuierlichen Zytokinstimulation der Endothelzellen des ZNS,
die Wirkung der FAE erst prolongiert einsetzte. Insbesondere die Berücksichtigung des
molekularen Wirkmechanismus der FAE macht diese These plausibel. Oben erwähnte
Zytokine vermitteln über eine Aktivierung des Trankriptionsfaktors NF-κB die vermehrte
Expression des ICAM-1 auf dem Endothel. Die Aktivierung des NF-κB wird durch DMF über
eine Induktion erhöhter Glutathionspiegel in vitro gehemmt (Vandermeeren, 2001). Der
prolongierte Effekt der FAE ist in vivo vermutlich auf ein sich einstellendes Gleichgewicht der
NF-κB Aktivierung/Deaktivierung bei dauerhafter Zytokinstimulation zurückzuführen.
2. Alternatives Erklärungsmodell ist eine noch zu erläuternde Induktion der TH2/TH3Zytokinantwort durch die FAE-Therapie, welche über eine Freisetzung von TGF-β zu einer
Hemmung der ICAM-1 Synthese des Endothels führte (Carrieri, 1997). Wie bereits berichtet,
induzieren FAE initial in vivo und in vitro eine erhöhte TNF-α Sekretion von Lymphozyten,
die erst nach einigen Wochen durch eine erhöhte IL-10 Sekretion derselben Lymphozyten
supprimiert wird (Asadullah, 1997). Die verzögerte Suppression der TNF-α Produktion von
TH1-Lymphozyten, könnte dann zur verminderten ICAM-1 Expression auf Endothelzellen von
Blutgefäßen führen.
Betrachtet man nun die oben getroffene Aussage, daß die sinkenden sICAM-1 Spiegel als Marker
einer verminderten Migration von TH-Zellen ins ZNS zu verstehen sind, so müssen inhaltlich
einige kritische Anmerkungen gemacht werden. Erhöhte sICAM-1 Molekülkonzentrationen im
Serum binden an den LFA-1 Rezeptor von im Blut zirkulierenden TH-Zellen, und blockieren somit
die Rezeptoren dieser T-Zellen als auch deren Migration ins ZNS. Dieser physiologische
Mechanismus der Entzündungsbegrenzung ist allerdings unvollständig, so daß 30-40 % der
autoreaktiven T-Zellen weiterhin über alternative Adhäsionsmoleküle ins ZNS einwandern
(Rieckmann, 1995). Somit ist die reduzierte ICAM-1 Expression unter FAE-Therapie, nicht mit
einer vollständigen Hemmung der Migration autoreaktiver Zellen in das ZNS gleichzusetzen.
Andere vorliegende Studien berichten über eine inverse Korrelation zwischen sICAM-1
Serumspiegeln und den progressiven Verlaufstypen der Multiplen Sklerose (Khoury, 1999). Bei
SPMS und PPMS korrelieren niedrige sICAM-Spiegel mit hoher Entzündungsaktivität im MRT.
Diese Diskrepanz zwischen den progressiven und schubförmigen Formen der MS erklärt sich aber
möglicherweise über differente Immunpathologien (siehe Einleitung, histologischer Subtyp III und
IV) der unterschiedlichen klinischen Verlaufstypen der MS.
________________________________75______________________________
Zusätzlich existieren experimentelle Hinweise, daß inflammatorische Reaktionen in der
Pathogenese der MS auch günstig seien können. MBP-spezifische T-Zellen besitzen
möglicherweise auch neuroprotektive Eigenschaften über die Sekretion von neurotrophen Faktoren.
Diese Wirkung wird aber vermutlich über die Induktion von TH2-Zytokinen vermittelt (Hohlfeld,
2001), ein Befund der im weiteren wesentliche Relevanz in der Beurteilung der FAE-Therapie
besitzt (siehe Diskussion der ICSS). Letztendlich stellt sich somit die Frage, ob das Auftreten
erniedrigter sICAM-1 Spiegel in der vorliegenden Untersuchung, einen Marker einer reduzierten
Entzündungsaktivität darstellt. Die Beantwortung dieser Frage kann letztendlich nur in der
Diskussion der noch folgenden Meßergebnisse erreicht werden.
Methodologisch ist zu beachten, daß die gemessenen Serumkonzentrationen von sICAM-1 mit dem
freigesetzten sICAM-1 zwar korrelieren, daß aber der Anteil der mit dem LFA-1 Rezeptor
interagiert, nicht in die Meßwerte miteingeht. Dies kann zu einem Meßfehler führen, der aber
systematisch gemacht wird, und somit alle Messungen betrifft. Das die gemessenen sICAM-1
Serumkonzentrationen nicht durch sezernierte, kostimulatorisch wirksame sICAM-1 Moleküle von
TH-Zellen beeinflußt werden, konnte durch frühere in vitro Studien gezeigt werden (Rieckmann,
1997).
Ebenfalls
ist
zu
berücksichtigen,
daß
sICAM-1
ein
Marker
einer
akuten
Entzündungsreaktion ist, so daß die gemessenen Serumspiegel vor allem mit der Dauer von akuten
Entzündungsreaktionen (meist nur einige Tage) korrelieren. Die hier durchgeführten Messungen
erfolgten aber in Abständen von 4-6 Wochen. Allerdings scheint die immunologische
Entzündungsaktivität bei Multipler Sklerose subklinisch dauerhaft erhöht zu sein (Martino, 2000),
so daß sinkende sICAM-1 Serumspiegel in longitudinalen Untersuchungen, als Marker einer
reduzierten Krankheitsaktivität angesehen werden können (Giovannoni, 1997).
Im Kontrast hierzu, sind im Serum gemessene Überstände von Zytokinen im Vergleich zu den
stabilen Adhäsionsmolekülen wie
sICAM-1,
kein
relevanter
biologischer
Marker
der
Krankheitsaktivität, da sie eine kurze biologische Halbwertszeit besitzen und ihr Nachweis durch
zirkulierende Zytokinrezeptoren verhindert wird (Rieckmann, 1997).
Somit war die von uns gewählte Vorgehensweise zum Monitoren von inflammatorischer Aktivität
der SRMS mittels sICAM-1 Bestimmung, als sensitive und reliable Methodik zu interpretieren
(Rieckmann, 1997).
________________________________76______________________________
4.4
Bedeutung der ICCS in der FAE-Therapie
Wesentlicher Aspekt dieser Dissertation war die Untersuchung der TH1 versus TH2/TH3-Balance
von SRMS-Patienten unter FAE-Therapie. Die Krankheitsaktivität bei SRMS wird mediiert durch
TH1-Zellen, die über ihre Zytokinproduktion charakterisiert sind, und wird insuffizient durch TH2Zellen gegenreguliert (Killestein, 2001). Gestützt wurde dieses pathogenetische Konzept über
serologische Untersuchungen auf mRNA-Niveau von SRMS-Patienten, in denen sich eine erhöhte
TNF-α Expression mit der Krankheitsprogression assoziiert fand (Van Osten, 1998). Eine erhöhte
serologische Interleukin-10 Produktion ging mit einer stabilen Krankheitsphase und fehlender
Entzündungsaktivität im MRT einher (Van-Boxel-Dezaire, 1999).
Die weitergehende Spezifizierung dieses Krankheitskonzeptes zeigte, daß TH1-Zellen über IFN-γ
bzw. TNF-α antigenunabhängig (nicht MHC restringiert), 2 Wochen vor einem Schub bzw.
vermehrter inflammatorischer Aktivität im MRT aktiviert wurden (Martino, 1998). Die weitere
phänotypische und funktionelle Differenzierung der zirkulierenden TH-Zellen von SRMSPatienten erfolgte dann anhand der Durchflußzytometrie, methodologisch vergleichbar mit den in
dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen.
Es zeigte sich, daß während einer aktiven, MRT-detektierten Krankheitsphase und in einer Phase
des akuten klinischen Schubs, die Anteile der IL-2, IFN-γ und TNF-α produzierender TH1-Zellen
im Vergleich zu einer stabilen Phase der Erkrankung deutlich erhöht waren (Clerici, 2001).
Kontrastierend dazu waren die Anteile IL-10 produzierender TH2-Zellen in einer aktiven
Krankheitsphase erniedrigt. Die Anteile der IL-4 sezernierenden TH2-Zellen bewegten sich
während der aktiven und stabilen Krankheitsphasen auf gleichbleibend niedrigem Niveau.
Gleichartige Veränderungen ließen sich bei der Betrachtung der Subgruppe der MBP-spezifischen
TH-Zellen zeigen (Clerici, 2001). Im Rahmen dieser longitudinalen Studie von Clerici und
Mitarbeitern zeigte sich weiterhin, daß Patienten die aus einer stabilen in eine aktive Phase oder
eine Schubphase der SRMS wechselten, dasselbe Verhältnis von TH1 und TH2-Zellen
entwickelten welches für die oben erläuterten aktiven Krankheitsphasen beschrieben wurde
(Clerici, 2001). In einer stabilen Krankheitsphase kehrten sich die Verhältnisse dann wieder um. Es
reduzierten sich die TH1-Zellen und die IL-10 sezernierenden TH2-Zellen nahmen wieder zu.
Unter IFN-β Therapie, einem in Phase-III Studien nachgewiesen wirksamen Schubprophylaktikum,
zeigte sich bei klinisch stabilen Patienten ebenfalls die gleiche TH2-Induktion der oben
charakterisierten, stabilen Krankheitsphase (Kozovska, 1999).
Zusammenfassend belegen diese Untersuchungen den günstig wirkenden, hemmenden Einfluß von
natürlich bzw. therapeutisch induzierten TH2-Zytokinen auf die Krankheitsaktivität der SRMS
(Clerici, 2001).
Betrachtet man die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit vor dem Hintergrund der Studie von Clerici
und Mitarbeitern, so ergeben sich erstaunliche Similaritäten. Bereits in der 12. Studienwoche der
oralen FAE-Therapie fanden sich erhöhte Anteile von TGF-β und IL-10 sezernierenden TH2Zellen. TGF-β produzierende TH3-Zellen nahmen um 347% im Vergleich zur Basisuntersuchung
________________________________77______________________________
zu,
und
IL-10
produzierende
TH2-Zellen
um
225%.
Diese
dramatische
Induktion
antiinflammatorischer TH2/3-Zellen, blieb bis zum Zeitpunkt des Medikationsendes (24.
Studienwoche) persitent und war für beide TH-Zelltypen statistisch signifikant. Vergleichend
zeigte die Population der übrigen Lymphozyten (PBL) keine gleichartigen Veränderungen, so daß
die Vermehrung antiinflammatorischer TH2-Zellen ein spezifischer Therapieeffekt der FAE sein
mußte. Wie bereits durch Clerici und Mitarbeiter festgestellt (Clerici, 2001) korrelieren stabile
Krankheitsphasen (ohne jegliche Entzündungsaktivität im MRT) der SRMS mit erhöhten Anteilen
IL-10 sezernierender TH2-Zellen.
Die entzündungshemmenden Wirkungen des IL-10 werden vor allem über eine Hemmung der IL12 Sekretion von APC mediiert, aufgrund derer es zur Hemmung der Differenzierung von TH0Zellen zu TH1-Zellen, und somit zu einem Überwiegen von TH2-Zellen kommt (Muraille, 1998).
Zusätzlich hemmt IL-10 die Funktion zytotoxischer T-Zellen, als auch die Sekretion von TNF-α
und IFN-γ durch TH1-Zellen. Im Tiermodell der EAE gehen erhöhte Zellzahlen von IL-10
sezernierenden TH-Zellen mit einer Terminierung der EAE einher, in humanen Untersuchungen
sind in Phasen der klinischen Remission nach Entzündungsschüben, ebenfalls erhöhte Anteile IL10 produzierender TH-Zellen im Blut präsent (Wingerchuk, 2001).
Die antiinflammatorische Potenz von TH2-Zellen verdeutlichen im Besonderen humane
Genetikstudien, da Familie n deren TH-Zellen hohe IL-10 Mengen sezernieren, ein 4-fach
geringeres Risiko besitzen an SRMS zu erkranken (de Jong, 2000).
Erhöhte Anzahlen von IL-10 sezernierenden TH2-Zellen, wie sie in der vorliegenden Untersuchung
gefunden wurden, führen also zur Terminierung der proinflammatorischen, gewebsdestruktiven
Autoimmunreaktion bei SRMS (Wingerchuk, 2001). Das hier detektierte, therapeutisch wirksame
Überwiegen von TH2-Zellen in der Immunbalance der SRMS, wird in der Literatur als „Bystander
Suppression“ bezeichnet (O`Connor 2001).
Das die gefundene, persitent erhöhte Anzahl von TH2-Zellen ein spezifischer Effekt der FAE war,
konnte durch Asadullah und Mitarbeiter bereits bei Lymphozyten von Gesunden und Psoriatikern
gezeigt werden (Asadullah, 1997). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigten Asadullahs
Befunde, und konnten sie erstmals für SRMS-Patienten verifizieren. Der molekulare Mechanismus
der IL-10 Induktion könnte nach Asadullahs Meinung über eine intrazelluläre cAMP Erhöhung
erzeugt werden (Asadullah 1997). Unserer Meinung nach spielt allerdings die Apoptose von TH1Zellen eine entscheidende Rolle in dem vermehrten Auftreten von IL-10 sezernierenden TH2Zellen unter FAE-Therapie. Die ser Umstand wird im folgenden Kapitel der Diskussion
eingehender besprochen.
Die gefundene, erhöhte Anzahl von TGF-β
β sezernierenden TH3-Zellen in der vorliegenden
Untersuchung, festigt nach experimenteller Vorstellung, die therapeutisch erzeugte TH2-Dominanz
und damit die gewebsbewahrende Antiinflammation über folgende Mechanismen.
Hemmung der Makrophagenfunktion, Hemmung der Ausschüttung von gewebstoxischem TNF-α
und IFN-γ durch APC (Pratt, 1998), Hemmung der ICAM-1 Expression von Endothelzellen des
________________________________78______________________________
ZNS (Lee, 1999), Schutz neuronaler Zellen vor Glutamat induzierter Neurotoxizität (Pratt, 1998)
und Förderung der Differenzierung von TH0 zu TH2-Zellen (Link, 1998). Erhöhte Anteile von
TH3-Zellen im Blut von MS-Erkrankten, korrelieren mit einer geringeren Krankheitsprogression
und Aktivität (Pratt, 1998). Deshalb werden TH3-Zellen als Marker eines benignen Verlaufs der
SRMS interpretiert (Link, 1998). Im EAE-Modell hemmt TGF-β den Entzündungsschub, und hohe
Anzahlen von TH3-Zellen verhindern die Manifestation der EAE im Experiment (Pratt, 1998).
Die gefundene Erhöhung des Anteils von TH3-Zellen unter FAE-Therapie, war ein bisher
experimentell
nicht
immunmodulatorischen
untersuchter
und
Mechanismus
der
beschriebener
FAE
Befund,
darstellte.
der
Auch
einen
dieser
zusätzlichen
Befund stand
möglicherweise im Zusammenhang mit der Apoptose von TH1-Zellen, und wird ebenfalls in dem
folgenden Kapitel weiter erläutert.
Der Anteil IL-4 sezernierender TH2-Zellen nahm in der vorliegenden Untersuchung einen zeitlich
differenten Verlauf im Vergleich zu den vorher beschriebenen TH2/3-Zellen. Der Anteil IL-4
positiver TH2-Zellen stieg kontinuierlich unter medikamentöser Therapie, bis zum Zeitpunkt des
Medikationsendes (24. Studienwoche) um 273% statistisch signifikant an. Nach 4 Wochen FAETherapiepause näherte er sich dem Wert der Basisuntersuchung wieder an, so daß die beobachtete
Zunahme als spezifischer Effekt der FAE-Therapie angesehen werden konnte. Wiederum zeigte die
Gruppe der PBL keine äquivalenten Veränderungen. Da IL-4 als autokriner Wachstumsfaktor von
TH2-Zellen verstanden wird (Muraille, 1998), war der kontinuierlich steigende Anteil der IL-4
sezernierenden TH2-Zellen, als Hinweis auf eine sich etablierende TH2-Dominanz unter FAETherapie
bei
SRMS
zu
interpretieren.
Die
Stabilisierung
der
oben
beschriebenen,
antiinflammatorischen „Bystander Suppression“, setzte sich somit kontinuierlich unter FAETherapie fort.
Die hier konstatierte, dauerhaft verschobene Immunbalance, korrespondierte mit immunologischen
Veränderungen unter Copolymer-I Therapie. Das Standardtherapeutikum der aktuellen SRMSTherapie , bewirkt seine entzündungshemmenden Wirkungen bei SRMS ebenfalls über den
erläuterten TH2-„Shift“ (Miller, 1989).
In der EAE zeigen die Phasen der klinischen Remission, ebenfalls erhöhte Anzahlen IL-4
sezernierender Zellen (Ledeen, 1998). Die Zahlen IL-4 sezernierender TH-Zellen in SRMSPatienten unterscheiden sich in Phasen aktiver und stabiler Erkrankung nicht (Cleric i, 2001), als
Hinweis auf eine defekte „Bystander Suppression“ Funktion bei SRMS-Patienten (O`Connor,
2001). So gesehen ist die therapeutische Induktion IL-4 sezernierender TH2-Zellen durch FAE, ein
wichtiger Mechanismus zur Terminierung der Inflammation (Noseworthy, 2000).
Die Induktion von IL-4 in aktivierten, humanen TH0-Zellen und TH1-Zellen durch FAE, wurde
von de Jong und Mitarbeitern (de Jong, 1996) in vitro beschrieben. Sie werteten dieses Phänomen
als selektiven, unabhängig von APC vermittelten Effekt der FAE. Die TH-Zellen wurden daraufhin
als TH2 und TH0 Zellen charakterisiert. Die in der vorliegenden Studie erhöhten Anteile IL-4
produzierender TH2-Zellen, korrespondieren mit den von de Jong beschriebenen Ergebnissen.
________________________________79______________________________
Die oben erwähnte "Bys tander Suppression" wird also nicht nur durch die Stimulation des
Wachstums der TH2-Zellen gefestigt, sondern vermutlich auch über eine Umwandlung bereits TH1
differenzierter TH-Zellen in TH0-Zellen bewirkt. Molekular scheint dieser Effekt über erhöhte
intrazelluläre cAMP Spiegel induziert zu werden (de Jong, 1996).
Die IFN-γ Expression der TH-Zellen blieb in den Untersuchungen von de Jong und Mitarbeitern
unbeeinflußt (de Jong, 1996), ein Befund der in der vorliegenden Arbeit gleichsam gesehen wurde.
Gleiches galt für den Anteil TNF-α und IL-2 sezernierender TH-Zellen.
Die Gruppe der CD4-negativen Lymphozyten (PBL), zeigte gegen Ende der Therapiephase in der
24. Studienwoche eine statistisch signifikante Abnahme IL-2 sezernierender PBL um ca. 60%. Dies
könnte möglicherweise als Hinweis einer reduzierten zellulären Proliferation von CD4-negativen
Lymphozyten
(zytotoxische
T-Lymphozyten,
Suppressor-T-Lymphozyten,
B-Lymphozyten)
angesehen werden, da IL-2 Wachstumsfaktor der genannten T und B-Zellen ist (Muraille, 1998).
Dies ist möglicherweise ebenfalls Folge der hemmenden Einflüsse von IL-10 auf die T- und BZellproliferation (Muraille, 1998).
Eine initial erhöhte Anzahl an TNF-α produzierenden TH1-Zellen, die sich nach kontinuierlicher
Applikation von FAE zurückbildete (Asadullah, 1997),
konnte unsererseits nicht statistisch
signifikant detektiert werden. Allerdings wurden die ersten Messungen nach 6 wöchiger FAETherapie (12. Studienwoche) durchgeführt, so daß die Veränderungen der TNF-α produzierenden
TH1-Zellen möglicherweise nicht erfaßt wurden.
Resümierend ließ sich in der vorliegenden Studie eine selektive Induktion von TH2/TH3-Zellen
durch FAE-Therapie bei SRMS-Patienten konstatieren, ohne wesentliche Beeinflussung des
Anteils der TH1-Zellen. Die Induktion einer TH2 bzw. TH3 Immunantwort geht wie oben erläutert,
in der Literatur mit einer stabilen, nicht inflammatorischen Krankheitsphase einher. Insbesondere
die Erhöhung von TH3-Zellen, gilt als Marker einer benigne verlaufenden SRMS (Link, 1998). Die
in dieser Arbeit detektierte „Bystander Suppression“ ging dann auch mit stabilen klinischen
Meßparametern und abnehmenden sICAM-1 Serumspiegeln, als Marker der reduzierten
Krankheitsaktivität einher. Bestätigend ist die um 90% reduzierte Entzündungsaktivität der SRMS
in den MRT Kontrollen der observierten Patienten zu nennen (Schimrigk, 1999). Dadurch kann die
FAE-Therapie als effektive, antiinflammatorische Immunmodulation bei SRMS durch die
vorliegende Arbeit erstmals propagiert werden.
Die Eindeutigkeit der Assoziation erhöhter Anteile an TH2-Zellen im Blut von SRMS-Patienten,
und reduzierter Krankheitsaktivität der SRMS, wird in der Literatur aber auch kritisch betrachtet.
Es existieren Untersuchungen bei MS-Patienten und Gesunden, die signifikante Unterschiede in
dem Anteil der TH1 versus TH2-Zellen zwischen nicht therapierten SRMS-Patienten und
Gesunden Probanden nicht zeigen konnten (Duran, 2001). Bei genauer Betrachtung wurden hier
allerdings
methodologische
Mängel
in
den
Untersuchungen
offenbar.
Die
aktuelle
________________________________80______________________________
inflammatorische Aktivität, also die Krankheitsphase der Erkrankung wurde nicht berücksichtigt,
da keine Korrelation mit der Krankheitsaktivität wie in den Untersuchungen von Clerici und
Mitarbeitern durchgeführt wurde (Clerici, 2001). Dies verdeutlicht die Bedeutung der Messung der
intrazellulären Zytokinproduktion bei SRMS als Aktivitätsmarker der Erkrankung.
In der vorliegenden Arbeit zeigte die statistisch signifikante, dauerhafte TH2-Induktion durch die
FAE-Therapie im Vergleich zu den Basisuntersuchungen dadurch im Besonderen, daß es sich um
einen spezifischen Therapieeffekt handeln mußte.
Weiterer Kritikpunkt der aktuellen Literatur ist, daß die strenge Dichotomie der TH1 versus
TH2/TH3 Immunreaktion, also die strenge Unterscheidung von proinflammatorischer TH1Reaktion und antiinflammatorischer TH2-Reaktion in der MS-Pathogenese, für das EAETiermodell und bei MS-Patienten, in dieser Eindeutigkeit nicht richtig ist (Lucchinetti, 2001).
In einem EAE Modell der Maus, in dem Myelin-Oligodendrozyten-Protein (MOG) das wesentliche
Enzephalitogen ist, wird die Entzündung im wesentlichen durch Antikörper (AK) vermittelt. Bei
parallelem Nachweis von MOG-AK in MS-Hirnschnitten, wurden diese AK als relevanter Faktor
der
Myelin-
und
Axonzerstörung
angeschuldigt.
Die
These
der
AK-vermittelten
Gewebsschädigung bei SRMS deckte sich auch mit dem histologischen Typ II nach Lucchinetti,
der in der Einleitung der MS beschrieben worden ist (Lucchinetti, 2000). Allerdings finden sich
Anti-MOG-AK
auch
im
Serum
bei
anderen,
nichtdemyelinisierenden,
neurologischen
Erkrankungen (Karni, 1999). Aufgrund der AK vermittelten Gewebsschädigung, wurde spekuliert
das TH2-Zellen, die vor allem die humorale Immunreaktionen steuern, die pathogenetisch
relevanten Zellen sind (Conlon, 1998). Initial erfährt die Maus im MOG-EAE Modell zwar eine
Hemmung des akuten Entzündungsschubs über TH2-Zellen, aber später tritt eine schwere
Demyelinisierung im Tier auf. Untersuchungen konnten allerdings zeigen, daß IL-10 Knock-out
Mäuse, also TH2-Zytokindefiziente Mäuse gleichfalls diese Demyelinisierung erfahren, und sich
nicht spontan von dem Entzündungsschub erholen (Samoilova, 1998). Der Entzündungsschub ging
mit einer Zunahme der IFN-γ Produktion und Abnahme der IL-4 Produktion der TH2-Zellen
einher, so daß letztendlich TH1/TH0-Zellen die pathogenetisch relevanten waren.
Da IFN-γ die Produktion von IgG1 und IgG3-AK induziert, wurde das Immunglobulinspektrum im
Liquor von MS-Patienten untersucht (Greve, 2001). Hier fand sich eine AK-Produktion mit
deutlich erhöhten IgG1 und IgG3-AK und stark supprimierten IgE und IgG4-AK, als Hinweis auf
eine TH1-Zell vermittelte AK-Reaktion (Greve, 2001). Somit scheint sich trotz aller Kritik am TH1
versus TH2/TH3-Modell, das Überwiegen der antiinflammatorischen TH2/TH3-Zellen bei der
SRMS als günstig zu erweisen.
Ergänzend hierzu zeigten verschiedene EAE-Modelle, Remyelinisierungen von Axonen durch
IgM-AK gegen MBP und diverse andere Enzephalitogene (Wingerchuk, 2001). Dieser Effekt ist
allerdings nur im Hirngewebe von Mäusen ohne infla mmatorisches TH1-Zellinfiltrat nachweisbar,
ein wesentlicher Hinweis für die Bedeutung antiinflammatorischer Vorgänge für die Regeneration
nach Gewebedestruktion bei der SRMS (Wingerchuk, 2001). Der hier angedeutete neuroprotektive
________________________________81______________________________
Effekt einer antiinflammatorischen TH2-Zytokinsekretion, wird auch durch Hohlfeld und Wekerle
berichtet (Hohlfeld, 2001). Experimentelle Hinweise auf eine physiologische, neuroprotektive
Wirkung von MBP-spezifischen TH-Zellen in Tiermodellen zeigten, daß die neuroprotektiven
Eigenschaften über die Sekretion von Nervenwachstumsfaktoren vermittelt werden. Diese
wiederum erzeugten einen TH1 zu TH2 „shift“ im Immunsystem des untersuchten EAE-Modells.
Das eine ausschließliche TH2-Immunreaktion bei SRMS nicht günstig ist, zeigte eine klinische
Studie mit einem Antikörper gegen T-Zellen (Anti-CD 25). Nach Einsatz des Antikörpers kam es
zu einer nahezu vollständigen Depletion von TH1-Zellen und dadurch zu einem ausschließlichen
Überwiegen von TH2-Zellen. In dieser Studie konnte zwar die Schubrate und die MRTkontrollierte Krankheitsaktivität reduziert werden, die Krankheitsprogression konnte aber nicht
aufgehalten werden. Insbesondere resultierte die nahezu vollständige Eradikation von TH1-Zellen
in einer nun „TH2-Zell dysregulierten“ Immunantwort, die eine Rate von 40% an autoimmunen
Schilddrüsenerkrankungen erreichte (Lucchinetti, 2001).
Hieraus läßt sich die Feststellung ableiten, daß eine durchgeführte immunmodulatorische Therapie
bei SRMS einen Ausgleich einer TH1 versus TH2/3 Immundysbalance erreichen, und nicht eine
komplette Depletion eines der beiden Mechanismen erzeugen sollte (Wingerchuk, 2001). Dieses
Ziel wird wie erläutert durch die FAE-Therapie bei SRMS erreicht.
Weiteres Argument in der Literatur gegen die Bedeutung antiinflammatorischer, therapeutischer
Mechanismen bei der SRMS ist, daß die axonale Zerstörung auch in normaler weißer Substanz des
ZNS, im MRT durch „Magnetisation Transfer“ Technik und Spektroskopie dargestellt, vorkommt
(Noseworthy, 2000). Demgegenüber konnten Bitsch und Mitarbeiter aber zeigen, daß einerseits der
höchste Grad an axonaler Schädigung im aktiven Plaque zu finden ist, andererseits der Grad der
axonalen Schädigung bei MS-Patienten, mit der Anzahl der durch TH1-Zellen rekrutierten
zytotoxischen T-Lymphozyten und Makrophagen im MS-Plaque und der normalen weißen
Substanz, korreliert (Bitsch, 2000). Da der Grad der axonalen Schädigung hochgradig mit dem
klinischen Grad der Behinderung der Patienten assoziiert ist, zeigte diese Studie eindeutig die
Bedeutung der Inflammation und der TH1-Zellen für die Krankheitsprogression der SRMS
(Lucchinetti, 2001).
Die kritische Würdigung der durchflußzytometrischen Meßmethodik von intrazellulär produzierten
Zytokinen, soll dieses Kapitel der Diskussion abschließen. Die hier verwandte Methode erlaubt die
Subklassifikation von Zellpopulationen auf Einzelzellniveau (Duran, 2001). Das bedeutet, daß
anders als bei der Messung von Zytokinen im Kulturüberstand mittels ELISA oder ELISPOT, die
Durchflußzytometrie die Identifikation der Zellpopulation erlaubt, die zum Meßzeitpunkt das
Zytokin wirklich produziert. Dadurch gelingt die Erfassung des heterogenen Spektrums von THZellpopulationen mit hoher Genauigkeit, und eine exaktere Einteilung von pathogenetisch
relevanten Zellpopulationen kann vorgenommen werden (Duran, 2001).
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Gleichfalls spiegelt die durchflußzytometrische Methode den „in vivo“ Zustand besser wieder als
Messungen
von
Zytokinproteinen
im
Überstand,
da
Zytokine
häufig
mit
löslichen
Zytokinrezeptoren in Zellkulturen interagieren, und somit der Messung nicht mehr zugänglich sind
(Rieckmann, 1997). Zytokine wirken auch vor allem in autokriner und parakriner Weise in einem
Zytokinnetzwerk, so daß die akkurateste Methode zur Erfassung der komplexen Zytokinwirkung
die Messung auf Einzelzellniveau ist (Link, 1998). Im Vergleich zur Messung von mRNA in
Einzelzellen, zeigt die hier durchgeführte Methode das Endprodukt der Proteinbiosynthese, das
fertige Protein. Da die mRNA über „Splicing“ Vorgänge intrazellulär modifiziert werden kann, gibt
die Akkumulation von Zytokinprotein im Golgi-Apparat durch Monensin, eher den aktuellen
Synthesezustand der Einzelzelle wieder (Crucian, 1996). Somit erlaubt die Klassifikation von TZellen über intrazelluläre Zytokinproduktion, die möglichst realitätsnahe Erfassung differenter
Zellpopulationen (Crucian, 1996).
Die artifizielle Präparation der zu untersuchenden Zellpopulationen, beeinflußt allerdings in
gewissem Maße die Aussagekraft der Untersuchung (Pala, 2000). Der Stimulationsschritt zur
Detektierung der intrazellulären Zytokine, erfolgte nicht antigenspezifisch (beispielsweise mit
MBP), aber verschiedene Studien konnten zeigen das die Stimulation mit PMA und Ionomycin das
physiologische Spektrum der Zytokinsynthese der Einzelzelle nicht verändert (Killestein, 2001).
Der Einsatz der Fixierungslösung beeinträchtigt das Bindungsverhalten der Oberflächenmarker, so
daß eine reduzierte Sensitivität in der Markierung von TH-Zellen durch den Präparationsvorgang
nicht gänzlich auszuschließen ist (Pala, 2000). Allerdings wird dieser systematische Fehler
aufgrund der Standardisierung der Präparation gering gehalten.
Verschiedene Zytokine haben unter Stimulationsverhältnissen eine differente Expressionskinetik,
so daß die gewählte Dauer der Stimulationszeit nur einen Kompromiss darstellt. Der resultierende
Meßfehler ist allerdings im Vergleich zur „in vivo“ Expression der Zytokine gering, da letztendlich
nur eine Ja/Nein Antwort der Zytokinexpression in TH-Zellen betrachtet wird (Pala, 2000).
Besondere Beachtung verdient der Umstand, daß generell die intrazelluläre Zytokinproduktion von
TH2-Zellen aufgrund der geringen in vivo Konzentrationen von TH2-Zytokinen, trotz Stimulation
nur schwer zu detektieren ist (Pala, 2000), so daß die Meßergebnisse der vorliegenden Studie umso
eindrücklicher wirken.
Grundsätzlich ist die durchflußzytometrischen Messung intrazellulär produzierter Zytokine,
vergleichbar sensitiv in der Detektion von Zytokinen wie die Immunfluoreszenzmikroskopie
(Schauer, 1993). Sie ist somit ein reliables Untersuchungsinstrument zur Charakterisierung von
Immunphänomenen.
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4.5
Bedeutung der Apoptose in der FAE-Therapie
Die Ergebnisse der Apoptosemessung in der vorliegenden Arbeit ergänzen möglicherweise die
Befunde der ICSS-Messung. Bezüglich der Absolutzahlen der TH-Zellen zeigte sich nach einer
geringfügigen Zunahme der Zellzahl, eine statistisch signifikante Abnahme der TH-Zellen um 45%
bis zum Zeitpunkt des Therapieendes. Dies wurde als Hinweis auf eine selektive Elimination von
TH-Zellen durch die FAE-Therapie gewertet, da die PBL-Vergleichspopulation keine statistisch
signifikante Zellzahlabnahme zeigte.
Hier decken sich die von uns gemachten Beobachtungen mit den Untersuchungen von Höxtermann
und Bacharach-Buhles (Höxtermann, 1998, Bacharach-Buhles, 1994). Bacharach-Buhles konnte
eine überproportionale Reduktion von TH-Zellen um 85%, in psoriatischen Hautläsionen in den
ersten 8 Wochen der Therapie finden. Genutzte Präparate und Dosierungen entsprachen denen der
vorliegenden Arbeit, wobei die wirksamen Blutspiegel von DMF ca. 30-100 µM betrugen. Hier
wurde über einen proliferationshemmenden Effekt der FAE spekuliert, der allerdings in Arbeiten
von Petres und Mitarbeitern unter 10 fach höheren Dosierungen (1000 µM) des Medikaments in
vitro gezeigt werden konnten (Petres, 1997).
Höxtermann und Mitarbeiter fanden in ihrer FAE-Langzeitstudie über 12 Monate, eine
kontinuierliche Abnahme der TH-Zellen bis zum 3. Monat der Therapie unter den gleichen
Dosierungen wie Bacharach-Buhles (Höxtermann, 1998). Sie spekulierten über eine initiale
Apoptose von TH-Zellen, ausgelöst durch FAE die zur Reduktion der TH-Zellzahl führen sollte,
sowie über „modifizierende Zytokineffekte“ die zu einer weiteren TH-Zellzahl Abnahme führen
sollten (Höxtermann, 1998). Erst kürzlich konnte gezeigt werden, daß FAE in vitro, in
lymphozytären Zellen, einen apoptotischen Zelltod bei DMF Konzentrationen von 100 µM
auslösen können (Sebök, 2000). Der Mechanismus der Apoptoseinduktion in dieser Studie , wurde
von Sebök nicht untersucht.
Aufgrund der Untersuchungen der Apoptoserate von TH-Zellen in der vorliegenden Arbeit, ist
folgender immunologischer Wirkmechanismus der FAE denkbar.
6 Wochen nach Therapiebeginn (12. Studienwoche), fanden wir ausschließlich in der Gruppe der
TH-Zellen eine statistisch signifikante, um 108% gesteigerte Apoptoserate. Diese Steigerung des
TH-Zelltodes nahm bis zum Ende der Therapiephase (24. Studienwoche) wieder auf das
Basisniveau ab. Zunächst erlaubte diese Beobachtung festzustellen, daß die FAE-Therapie eine
erhöhte Rate an programmiertem Zelltod bei TH-Zellen innerhalb von 6 Wochen auslöste, wobei
ein molekularer Mechanismus für dieses Phänomen bisher nicht bekannt ist (Sebök 2000).
Zang und Mitarbeiter (Zang, 1999) berichteten über eine selektive Empfindlichkeit differenzierter,
humaner TH-Zellen von MS-Kranken für die Apoptose. Es zeigte sich eine erhöhte Vulnerabilität
der TH1-Zellen im Vergleich zu den TH2-Zellen bezüglich des AICD. Somit könnte die durch
FAE induzierte erhöhte Apoptoserate prädominant TH1-Zellen treffen, und so zu einem
Überwiegen der TH2-Zellen in der 12. Woche der Therapie geführt haben.
________________________________84______________________________
Ursächlich für die erhöhte Apoptoserate der TH-Zellen könnte eine vermehrte Expression von
TGF-β gewesen sein, da erhöhte TGF-β Spiegel mit einer erhöhten Apoptoserate von TH1-Zellen
tierexperimentell korrelieren (Xu, 2000). Die erhöhte Anzahl der TH3-Zellen (TGF-β) in der
vorliegenden Arbeit, scheint über eine selektive Induktion der TGF-β Produktion durch FAE in
TH-Zellen zustande gekommen zu sein.
Somit führt die Induktion von TGF-β sezernierenden TH3-Zellen durch die FAE-Therapie, zu einer
Verschiebung der TH1 versus TH2/TH3 Bilanz via Apoptose. In einem zweiten Schritt senken
apoptotische TH1- und TH2/3-Zellen, über eine unter apoptotischen Bedingungen gesteigerte IL10 Sekretion, die hier gemessene erhöhte Apoptoserate von TH-Zellen, im Sinne einer
physiologischen
Gegenregulation.
Dieses
wird
durch
die
gesteigerte
Expression
von
antiapoptotischen Proteinen wie bcl-2 in TH-Zellen über die IL-10 Sekretion induziert (Cohen,
1997).
Dieser experimentell belegte Effekt, erklärt plausibel die in der vorliegenden Untersuchung wieder
abnehmende Apoptoserate zum Studienende hin (24. Woche), als auch die in der 12. Studienwoche
vermehrte Anzahl an IL-10 sezernierenden TH2-Zellen.
Die Bedeutung einer gesteigerten Apoptoserate von MBP-spezifischen TH1-Zellen für die
Remission des Entzündungsschubs im EAE-Modell, ist experimentell belegt (Sharief, 2000).
Untersuchte autoreaktive TH-Zellen von MS-Patienten zeigten in Remissionsphasen des Schubs
neben vermehrter IL-10 Produktion eine erhöhte bcl-2 Expression, die sie resistent gegenüber
apoptotischen Mechanismen machte (Zipp, 2000). Der Rückgang eines Entzündungsschubs bei
SRMS-Patienten durch hochdosierte Kortikoidtherapie, wird über die Apoptose von TH-Zellen
vermittelt (Gold, 2001).
Alle genannten Befunde zeigen die entzündungsbegrenzende Bedeutung der TH-Zellapoptose bei
der SRMS, so daß die von uns gefundene erhöhte Apoptoserate von TH-Zellen als günstiger,
krankheithemmender Effekt verstanden werden kann (Comi, 2000).
Wie kommt es dann allerdings zur weiteren Abnahme der TH-Gesamtanzahl bis zum Studienende?
Hinweise darauf geben verschiedene EAE-Modelle.
Eine Behandlung von Lewis-Ratten mit IL-10 vor Schubinduktion, verhindert das Auftreten der
Erkrankung über eine gehemmte Proliferation von TH1-Zellen (Xu, 2000). Aufgrund des
antiproliferativen Signals von IL-10 nehmen die Absolutzahlen der TH-Zellen im Blut des Tieres
ab (Xu, 2000). Die antiproliferative Wirkung von IL-10, könnte die kontinuierliche Abnahme der
TH-Zellen (bis zur 24. Studienwoche) in der vorliegenden Arbeit erklären.
Abschließend läßt sich somit folgender 2-phasiger immunmodulatorischer Mechanismus der FAETherapie bei der SRMS postulieren:
________________________________85______________________________
§
Nach einer initialen Induktion von TH-Zellapoptose, kommt es zum Überwiegen von TH2bzw. TH3-Zellen bei den untersuchten Patienten. Möglicher Induktor der Apoptosephänomene
bei den untersuchten TH-Zellen, ist die gesteigerte Anzahl von TGF-β produzierenden TH3Zellen.
§
Stabilisiert wird die neue Immunbalance (TH2-dominiert) durch den gesteigerten Anteil an IL10 sezernierenden TH-Zellen, die zu einer Proliferationshemmung von TH1-Zellen führt.
Langfristige Stabilisierung erfährt die antiinflammatorische, TH2/3 dominierte Immunbalance
dann, über die kontinuierlich gesteigerte Zunahme von IL-4 sezernierenden TH2-Zellen im
Therapieverlauf.
Kritisch anzumerken bleibt, daß möglicherweise die erhöhte Anzahl IL-10 produzierender THZellen nicht nur Folge der Apoptoseinduktion in den TH-Zellen ist, sondern dies auch ein direkter
zellulärer Effekt der FAE-Therapie sein kann (Asadullah, 1997). Möglicherweise spielt deshalb die
erhöhte Apoptoserate der TH-Zellen unter FAE-Therapie keine wesentliche Rolle in der
Entwicklung der „Bystander Suppression“. Die Bedeutung der Apoptoseinduktion von TH-Zellen
durch FAE ist deshalb nicht eindeutig, und sollte in Folgeuntersuchungen verifiziert werden.
Methodologisch ist anzumerken, daß aufgrund der raschen Verarbeitung (binnen 1h) der
Blutproben von Patienten und dem standardisierten Vorgehen, die Möglichkeit einer fehlerhaften,
artifiziell bedingten Apoptoserate minimiert wurde. Die Methode der Annexin-V markierten
Apoptosedetektion ist rasch durchzuführen und vergleichbar sensitiv mit immunhistochemischen
Apoptosedetektionsmethoden (Vermes, 1995). Durch die Nutzung der Durchflußzytometrie kann
jede einzelne Zelle auf ihren Vitalitätszustand hin geprüft werden, und erlaubt so eine sensitivere
Erfassung der Apoptoserate von TH-Zellen als alternative Methoden (Vermes, 1995).
Weiterer Grund der hohen Sensitivität dieser Methode ist die frühzeitige Erfassung der
irreversiblen Apoptosevorgänge, durch die Detektion der Störung der Membranintegrität. In solch
frühen Stadien der Apoptose lassen sich immunhistochemisch häufig noch keine Veränderungen
nachweisen.
Als nachteilig anzumerken ist allerdings, daß die detektierten TH-Zellen im Rahmen der
Apoptosemarkierung nur mittels Oberflächenmarkierung subklassifiziert werden können. Eine
gleichzeitige intrazelluläre Zytokinmarkierung über den Einsatz von Zellpermeabilisatoren, würde
zu einer geringen Sensitivität der Annexin-V Färbung führen (Vermes, 1995). Aufgrund der
fehlenden Differenzierung der apoptotischen TH-Zellen in den TH1 bzw. TH2/3-Subtyp, lassen
sich somit in der vorliegenden Arbeit nur indirekte Annahmen über die Bedeutung der THZellapoptose bei FAE-Therapie machen.
________________________________86______________________________
4.6
Fazit
Ziel der vorliegenden Dissertation war die Untersuchung verschiedener Aspekte der FAE-Therapie
bei SRMS.
1. Medikamentensicherheit und Verträglichkeit
Die gängige Standarddosierung der FAE-Therapie mit 6 Tabletten Fumaderm forte, d.h. einer
Dosierung von 1308 mg Fumarsäureestern, inklusive der 720mg Dimethylfumarat als
Hauptwirkkomponente (Ockenfels, 1998), wurde durch alle Patienten gut vertragen. Es traten keine
schweren Nebenwirkungen während der Therapie auf, und kein Patient mußte die Studie aufgrund
von Medikamentennebenwirkungen verlassen.
Die hohe Rate an Nebenwirkungen, von im Mittel ca. 46%, erscheint über die Gesamtstudienzeit
von 4 Monaten relativ hoch. Zu berücksichtigen ist aber, daß die Nebenwirkungen hauptsächlich
auf die Flush-Symptomatik und gastrointestinale Beschwerden zurückzuführen waren. Insgesamt
zeigte sich auch in dieser Studie die Tendenz, daß nach einer Eingewöhnungsperiode mit höheren
Nebenwirkungsfrequenzen, eine Adaptation des Organismus an das Therapieregime zu beobachten
ist. Dies entsprach den Feststellungen von Altmeyer und Mitarbeitern bei Psoriatikern (Altmeyer,
1996). Somit handelt es sich nach unserer Meinung um eine sichere und gut verträgliche Therapie.
Die
klinischen
Kontrolluntersuchungen
zeigten,
unter
Berücksichtigung
der
limitierten
Aussagekraft von Phase II-Studien, keinen Progreß der Krankheit bei allen Patienten. Daher kann
die
FAE-Therapie
mit
hoher
Sicherheit
bei
SRMS
durchgeführt
werden,
und
ein
entzündungshemmender, krankheitslimitierender Effekt ist aus den klinischen Untersuchungen zu
vermuten.
2. Immunmodulatorische Wirkungen
Die Gabe von FAE bei SRMS reduziert signifikant die sICAM-1 Serumspiegel von Patienten. Da
die Serumspiegel von sICAM-1 als biologischer Marker der Krankheitsaktivität und Marker der
Krankheitsprogression gelten (Khoury, 1999), führt die FAE-Therapie bei SRMS zu einer
Suppression der Krankheitsaktivität und wahrscheinlich auch der Krankheitsprogression. Dies
geschieht über differente Mechanismen, wobei die Reduktion der ICAM-1 Expression auf
Endothelzellen (Vandermeeren, 1997) des ZNS, und die damit reduzierte Migration von
autoreaktiven Zellen über die Blut/Hirnschranke (Lee, 1999), ein detektierter Mechanismus dieser
Arbeit ist.
Die Therapie mit FAE bei SRMS führt zu einer Zunahme der TH2 und TH3-Zellen und gleicht
damit die pathologische, TH1 dominierte Immunbalance bei SRMS aus (van Boxel-Dezaire, 1999).
Dies geschieht ni itial vermutlich über die Auslösung von TH1-Zellapoptose, über eine erhöhte
Produktion von TGF-β durch induzierte TH3-Zellen. Die entstehende TH2/TH3 Dominanz wird
langfristig über eine durch FAE gesteigerte IL-4 Sekretion von TH2-Zellen stabilisiert.
________________________________87______________________________
Eine TH2-Induktion korreliert nach vorliegenden Daten mit einer stabilen Krankheitsphase der
SRMS, ohne weitere inflammatorische Aktivität (Clerici, 2001). Eine TH2 induzierende
medikamentöse Therapie wie die hier vorliegende, stellt nach Auffassung von Hohlfeld und
Wekerle (Hohlfeld, 2001) eine effektive, therapeutische Substanz zur Hemmung der
Behinderungsprogression bei SRMS dar.
Die Induktion von TH3-Zellen, korreliert mit einem benignen Verlauf und mit geringer
Krankheitsprogression bei Multipler Sklerose (Link, 1998). Somit stellt die immunmodulierende
Induktion von TH3-Zellen durch medikamentöse Substanzen wie sie durch diese Arbeit gezeigt
werden konnte, nach der Überzeugung von Link (Link, 1998), eine attraktive Therapiealternative
zu den bisherigen Standardtherapien der SRMS dar (Link, 1998).
Die derzeitigen Standardtherapeutika in der Intervallbehandlung der SRMS sind Interferon-β und
Copolymer-I. Hauptwirkmechanismus von Interferon-β und Copolymer-I ist die Induktion von
TH2 und teilweise auch TH3-Zellen (Kozovska, 1999). Beide Substanzen senkten in Phase-III
Studien signifikant die Schubrate und die MRT-kontrollierte Entzündungsaktivität, wobei
Copolymer-I auch einen progressionshemmenden Effekt auf die Erkrankung nach neueren Daten
zeigte (Johnsson, 2000). Eine Therapie mit Interferon-β, führte in einer aktuell publizierten Studie
sogar zu einem verringerten Risiko an SRMS zu erkranken (Jacobs, 2000). Diese Fakten zeigen die
therapeutische Potenz von immunmodulierenden, TH2 induzierenden Therapien.
Somit betrachten wir die FAE-Therapie bei SRMS als eine effektive, immunmodulierende
Therapie zur Hemmung der Inflammation, und möglicherweise auch der Progression bei SRMS.
Aufgrund der vorliegenden Daten sollte sich nun eine placebokontrollierte Phase-III Studie
anschließen, zur Verifizierung der beschriebenen Wirkungen.
Die immunologischen Wirkmechanismen sind in der folgenden Abbildung 16 zusammengefaßt.
FAE
Hemmende
FAE-Einflüsse
FAE
Stimulierende
FAE-Einflüsse
IL12
,
FAE
MA
Y
B
B l u/H
t irnschranke
Periphere
Aktivierung
BP
+
IFN γ
IL 10
+
IL 10
IL 4
TNF α
O H •, NO•
Myelinphagozytose
MYELIN
v.a. M B P
TH3
TGF β TH3
_
2
TH
TGF β
_
TH1
_
Migration
APC
_
APC
M
+
IFN γ
TH 1
A
F
f
B
FAE
+
Axon
TH3
f
BLUT
IL2
TNF α
Endothel
TH1
ZNS
TH1
Apoptose
YY
Y
f
FAE
f
,
+
FAE
IgG1,
IgG4-AK
Opsonierung
A k t i v i e r u n g z y t o t o x i s c h e r TZellen und Axonzerstörung
Abbildung 16: Immunmodulatorische Wirkungen der FAE: Induktion einer TH2/TH3 dominierten
„Bystander Suppression“.
________________________________88______________________________
5.0
Zusammenfassung
Die vorliegende, experimentelle Arbeit, befaßt sich im Rahmen einer prospektiven Phase II-Studie,
mit dem Einsatz einer oralen Fumarsäureester-Therapie (FAE-Therapie) bei schubförmigremittierender Multipler Sklerose (SRMS). Die SRMS wird durch T-Helferzellen des Subtyps-I
mediiert, die Botenstoffe wie Tumor-Nekrose-Faktor-α, Interferon-γ bzw. Interleukin-2 sezernieren
(TNF-α, IFN-γ, IL-2). Phasen der reduzierten Krankheitsaktivität, gehen mit TH-Zellen des
Subtyps-II einher, die Botenstoffe wie Interleukin-4, Transforming-Growth-Factor-β und
Interleukin-10 sezernieren (IL-4, TGF-β, IL-10). Die FAE-Therapie führt bei der Psoriasis zu einer
Induktion von TH2-Zellen, und somit zur Terminierung dieser ebenfalls TH1 mediierten
Erkrankung. Zie l der vorliegenden Untersuchung war, die FAE-Therapie bei SRMS bezüglich
Verträglichkeit, Arzneimittelsicherheit und immunmodulatorischer Potenz der eingesetzten
Präparate zu untersuchen.
Zu diesem Zweck wurden periphere Blutlymphozyten von 7 SRMS-Patienten über 28
Studienwochen immunologisch untersucht, wobei mittels der Durchflußzytometrie die Produktion
von TH1 versus TH2 Zytokinen, die Apoptoserate als auch die Serumkonzentrationen des
Adhäsionsmoleküls sICAM-1 gemessen wurden. Parallel erfolgten bei allen Patienten klinischneurologische (EDSS, AI, 9-HPT), laborchemische und nebenwirkungsspezifische
Kontrolluntersuchungen.
Der zeitliche Rahmen umfaßte zwei Basisuntersuchungen ohne Therapie im Abstand von 6
Wochen, sowie anschließend 3 Kontrolluntersuchungen unter FAE-Therapie. Abschluß fand die
Studie mit einer Kontrolluntersuchung 4 Wochen nach Beendigung der FAE-Therapie. Eingesetzte
Präparate waren Fumaderm mite und Fumaderm forte.
Die FAE-Therapie bei SRMS zeigte sich als sichere, gut verträgliche Therapie, ohne schwere
Nebenwirkungen. Die durchgeführten klinisch-neurologischen Kontrolluntersuchungen zeigten
keine Krankheitsprogredienz im Sinne einer stabilen Phase der Erkrankung, ein Befund der mittels
der immunologischen Meßparameter verifiziert werden konnte.
Die FAE-Therapie senkte signifikant die sICAM-1 Spiegel im Verlauf der Therapie, als Hinweis
für eine reduzierte Krankheitsaktivität und verlangsamte Krankheitsprogression der SRMS.
Bedingt wurde dieser Effekt über eine reduzierte ICAM-1 Expression des ZNS-Gefäßendothels,
der zu einer reduzierten Migration autoreaktiver Entzündungszellen über die Blut/Hirnschranke
führte. Andererseits kam es unter der FAE-Therapie zu einer Induktion einer TH2/TH3Immunantwort bei SRMS-Patienten, initial bedingt durch einen Anstieg der TH1-Apoptoserate.
Langfristig erfolgte eine Stabilisierung der TH2/TH3-Dominanz durch eine selektive Induktion von
TH2/TH3-Zytokinen durch die FAE-Therapie . Da die Prädominanz von TH2/TH3-Zellen im
Immunsystem von SRMS-Patienten als aktivitäts- und progressionshemmender Wirkmechanismus
angesehen wird, propagiert diese Untersuchung die FAE-Therapie erstmals als kausal begründete,
sichere Therapie bei SRMS.
________________________________89______________________________
6.0
Anhang
0.0 = normale neurologische Untersuchung (Grad 0 in allen FS)
1.0 = keine Behinderung, minimale Abnormität in einem FS (d.h. Grad 1)
1.5 = keine Behinderung, minimale Abnormität in mehr als einem FS, (mehr als einmal Grad 1)
2.0 = leichte Behinderung in einem FS (ein FS Grad 2, andere 0 oder 1)
2.5 = leichte Behinderung in zwei FS (ein FS Grad 2, andere 0 oder 1)
3.0 = mäßiggradige Behinderung in einem FS (ein FS Grad 3, andere 0 oder 1) oder leichte Behinderung in drei
oder vier FS (drei oder vier FS Grad 2, andere 0 oder 1), aber voll gehfähig
3.5 = voll gehfähig, aber mit mäßiger Behinderung in einem FS (Grad 3) und ein oder zwei FS Grad 2; oder zwei
FS Grad 3; oder fünf FS Grad 2 (andere 0 oder 1)
4.0 = gehfähig ohne Hilfe und Rast für mindestens 500 m; aktiv während ca. 12 Stunden pro Tag trotz relativ
schwerer Behinderung (ein FS Grad 4, übrige 0 oder 1)
4.5 = gehfähig ohne Hilfe und Rast für mindestens 300 m; ganztägig arbeitsfähig; gewisse Einschränkung der
Aktivität, benötigt minimale Hilfe, relativ schwere Behinderung (1 FS Grad 4, übrige 0 oder 1)
5.0 = gehfähig ohne Hilfe und Rast für etwa 200 m; Behinderung schwer genug, um tägliche Aktivität zu
beeinträchtigen (z.B. ganztägig zu arbeiten ohne besondere Vorkehrungen); (ein FS Grad 5, übrige 0 oder
1; oder Kombination niedrigerer Grade, die aber über die Stufe 4.0 geltenden Angaben hinaus gehen)
5.5 = gehfähig ohne Hilfe und Rast für etwa 100 m; Behinderung schwer genug, um normale tägliche Aktivität
zu verunmöglichen (FS-Äquivalente wie Stufe 5.0)
6.0 = bedarf intermittierend, oder auf einer Seite konstant, der Unterstützung (Krücke, Stock, Schiene), um etwa
100 m ohne Rast zu gehen; (FS-Äquivalente: Kombinationen von mehr als zwei FS Grad 3)
6.5 = benötigt konstant beidseits Hilfsmittel (Krücke, Stock, Schiene), um etwa 20 m ohne Rast zu gehen (FSÄquivalente wie 6.0)
7.0 = unfähig, selbst mit Hilfe, mehr als 5 m zu gehen; weitgehend an den Rollstuhl gebunden; etwa 12 h pro
Tag im Rollstuhl; bewegt den Rollstuhl selbst und transferiert ohne Hilfe (FS-Äquivalente: Kombinationen
von mehr als zwei FS Grad 4 , selten Pyramidenbahn Grad 5 allein)
7.5 = unfähig, mehr als ein paar Schritte zu tun; an den Rollstuhl gebunden; benötigt Hilfe für Transfer; bewegt
Rollstuhl selbst, aber vermag nicht den ganzen Tag im Rollstuhl zu verbringen; benötigt evtl. motorisierten
Rollstuhl (FS-Äquivalente wie 7.0)
8.0 = weitgehend an Bett oder Rollstuhl gebunden; pflegt sich weitgehend selbständig; meist guter Gebrauch der
Arme (FS-Äquivalente: Kombinationen meist von Grad 4 in mehreren FS)
8.5 = weitgehend ans Bett gebunden, auch während des Tages; eigennützlicher Gebrauch der Arme, Selbstpflege
möglich (FS-Äquivalente wie 8.0)
9.0 = hilfloser Patient im Bett; kann essen und kommunizieren (FS-Äquivalente sind Kombinationen, meist Grad
4)
9.5 = gänzlich hilfloser Patient; unfähig zu essen, zu schlucken oder zu kommunizieren (FS-Äquivalente sind
Kombinationen von fast lauter Grad 4 )
10 = Tod infolge MS
Übersicht 1: Kurzform des EDSS nach Kurtzke (Kurtzke1983)
________________________________90______________________________
0=
1=
2=
3=
4=
5=
6=
7=
8=
9=
asymptomatisch, voll aktiv
geht normal, aber berichtet Erschöpfung, die während sportlicher oder anderer beanspruchender Aktivität
auftritt
abnormer Gang oder episodische Gleichgewichtsstörungen; Gangstörung wird von Familie und Freunden
bemerkt; fähig, 7,5 m in 10 oder weniger Sekunden zu gehen
geht ohne Hilfe; fähig, 7,5 m in 20 oder weniger Sekunden zu gehen
benötigt einseitige Unterstützung (Krücke, Stock, Schiene) zum Gehen; benutzt die Unterstützung in mehr
als 80% der Zeit; geht 7,5m in 20 Sekunden oder weniger
benötigt beidseitige Unterstützung (Krücke, Stock, Schiene) und geht 7,5m in 20 Sekunden oder weniger;
oder benötigt einseitige Unterstützung, aber geht 7,5m in mehr als 20 Sekunden
benötigt beidseitige Unterstützung (Krücke, Stock, Schiene) und geht 7,5m in mehr als 20 Sekunden;
möglicherweise gelegentliche Benutzung eines Rollstuhls*
Gehen beschränkt sich auf wenige Schritte mit beidseitiger Unterstützung; unfähig, 7,5m zu gehen;
möglicherweise Benutzung eines Rollstuhls für die meisten Aktivitäten
an Rollstuhl gebunden; fähig zum selbständigen Transfer
an Rollstuhl gebunden; unfähig zum selbständigen Transfer
*Die Benutzung des Rollstuhls wird möglicherweise durch Lebensweise und Motivation des Patienten bestimmt.
Es ist davon auszugehen, daß Patienten von Grad 7 einen Rollstuhl häufiger benutzen als Patienten von Grad 5
oder 6. Die Zuweisung der Grade 5 bis 7 wird in jedem Fall durch die Gehfähigkeit bestimmt und nicht durch
das Ausmaß der Rollstuhlbenutzung.
Übersicht 2: Ambulation Index nach Hauser et al. (Paty, 1992)
Laborparameter
Referenzintervall
Glucose
3.05-5.6 mmol/l
NA+
135-144 mmol/l
K+
3.6-4.8 mmol/l
2+
Ca
2.2-2.5 mmol/l
Harnstoff
2-8 mmol/l
Kreatinin
42-97 µmol/l
Bilirubin
< 17.1 µmol/l
GOT
< 18U/l
GPT
<23 U/l
4-28 U/l
γ-GT
Gesamtprotein
66-83 g/l
Albumin
36.2-50 g/l
Gesamtcholesterin
< 5.17 mmol/l
Alkalische Phosphatase
60-180U/l
Phosphat
0.84-1.45 mmol/l
Eisen
4-30 µmol/l
Erythrozyten
4.1-5.9/pl
Leukozyten
4.4-10/nl
Neutrophile Granulozyten
1.8-7.7/nl
Eosinophile Granulozyten
<0.45/nl
Basophile Granulozyten
<0.2/nl
Monozyten
<0.8/nl
Lymphozyten
1.5-4.0/nl
Hämoglobin
12.3-14.5 g/dl
Hämatokrit
36-46%
MCV
80-96 fl
Thrombozyten
136-423/nl
C-reaktives-Protein
<5 mg/l
Glukose im Urin
Negativ
Protein im Urin
Negativ
pH im Urin
5.5-7.5
Erythrozyten im Urin
<5/µl
Übersicht 3: Klinisch-Chemisches Sicherheitslabor
________________________________91______________________________
7.0
1.
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166. Wingerchuk, D.M. et al.
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________________________________104______________________________
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Inhibition of dendritic cell differentiation by fumaric acid esters.
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Genetic control of Multiple sclerosis: Increased production of lymphotoxin and tumor necrosis factor
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Apoptosis in multiple sclerosis.
Cell Tissue Res., 301: 163-171 (2000)
________________________________105______________________________
Gewidmet sei diese Arbeit insbesondere meinen Eltern und meiner Lebenspartnerin Frau
Beermann, ohne deren Hilfe die Erstellung der vorliegenden Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
Danksagung:
Herrn Dr. med. Sebastian Schimrigk bin ich sehr zu Dank verpflichtet für seine Anregung und
Unterstützung zu dieser Arbeit. Die umfassende Durchführung der Arbeit wäre ohne ihn und den
wissenschaftlichen Leiter, Herrn Prof. Dr. med. Horst Przuntek, nicht möglich gewesen.
Darüberhinaus bin ich Frau Dipl. Biol. Maike Rieks für ihre Unterstützung und Anregung bei der
praktischen Durchführung der immunologischen Untersuchungstechniken zu Dank verpflichtet.
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Lebenslauf
§
Name:
Brune
§
Vorname:
Nils
§
Geburtsdatum:
28.06.1972
§
Geburtsort:
Essen
§
Familienstand:
ledig
§
Staatsangehörigkeit:
deutsch
§
Konfession:
römisch-katholisch
§
Eltern:
Eberhard Brune, Steuerberater
Ingeborg Brune, Künstlerin
§
Anschrift:
§
1.
2.
3.
Bisherige Ausbildung:
Besuch der Grundschule, Am Neggenborn, Bochum: 1978-1982
Besuch des Gymnasiums, Goethe-Schule, Bochum: 1982-1991
Ableistung des Zivildienstes, Notfallaufnahme der Berufsgenossenschaftlichen
Krankenanstalten Bergmannsheil Bochum, Universitätsklinik: Juli 1991-Oktober 1992
Studium der Humanmedizin, Ruhr-Universität-Bochum, 1993-2000
Ärztliche Vorprüfung: Oktober 1995
Erstes Staatsexamen: Oktober 1996
Zweites Staatsexamen: April 1999
Ausbildung im Rahmen des dritten, klinischen Studienabschnitts in der Universitätsklinik
St. Josef-Hospital Bochum: 19.04.99-01.05.2000, Chirurgie, Innere Medizin und Neurologie
Drittes Staatsexamen: Mai 2000
Tätigkeit als Arzt im Praktikum: 01.06.00-30.11.01, Neurologische Universitätsklinik St. Josef
Hospital, Bochum
Vollaprobation als Arzt: 6.12.01
Assistenzarzt für Neurologie, Neurologische Universitätsklinik St. Josef-Hospital, Bochum:
Seit 01.02.02
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Wittenerstraße 69, 44789 Bochum
§ Weiterführende berufliche Aktivitäten:
13. Studentische Hilfskraft, Notfallaufnahme der Universitätsklinik St. Josef-Hospital Bochum,
Februar 1993-Januar 1994
14. Studentische Hilfskraft, Neurologisch-Internistische Intensivstation der Universitätsklinik St.
Josef-Hospital Bochum, Januar 1994-Juni 1997
15. Famulatur, Klinik für Anästhesiologie und operative Intensivmedizin des Marienhospitals
Herne, Universitätsklinik, September 1996-Oktober 1996
16. Famulatur, Klinik für Neurologie der Universitätsklinik St. Josef-Hospital Bochum,
März 1997-April 1997
17. Famulatur, Klinik für Traumatologie und allgemeine Chirurgie des Marienhospitals Herne,
________________________________107______________________________
Universitätsklinik, September 1997-Oktober 1997
18. Famulatur in der Klinik für Neurologie , Rheuma- und Rehabilitationszentrum Valens
(Schweiz), Lehrkrankenhaus der Universität Zürich, Oktober 1998-September 1998
§
Bisherige Wissenschaftliche Aktivitäten:
19. Teilnahme am 14. Kongreß des Europäischen Komitees für Behandlung und Erforschung der
Multiplen Sklerose (ECTRIMS 1998), 9-12 September Stockholm (Schweden)
2 Posterpräsentationen:
20. Teilnahme am 9. Treffen der Europäischen Neurologischen Gesellschaft (ENS 1999), 5-9 Juni
in Mailand (Italien)
1 Vortrag, 1 Posterpräsentation:
21. Weitere Veröffentlichungen:
1. Beer S, Brune N, Kesselring J. Detection of anterior horn lesions by MRI in central European
tick-borne encephalomyelitis.
J Neurol., 246:1169-71 (1999)
2. Rieks M, Ferdosi A, Hellwig K, Hoffmann V, Brune N, Krane M, Schimrigk S, Przuntek H,
Pöhlau D. Flowcytometric analysis of cytokine producing cerebrospinal fluid (CSF)
lymphocytes after intracellular staining. Cytometry, in press.
§ Sonstige Aktivitäten:
22. Aktiver Leistungssport im Olympiastützpunkt für Leichtathletik Bochum-Wattenscheid:
1984-1992
23. Hospitant in der Dramaturgie des Residenztheaters Bayrisches Staatsschauspiel München,
November 1992-Februar 1993