Entwicklung und Charakterisierung von Tamoxifen

„Entwicklung und Charakterisierung von Tamoxifenregulierbaren onkolytischen adenoviralen Vektoren zur
Behandlung von Tumorerkrankungen
Vorgelegt von
Diplom-Ingenieur Isaac Sipo
Von der Fakultät III - Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Ingenieurwissenschaften
-Dr.-Ing.genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. rer. Nat. L.W. Kroh
Berichter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl
Berichter: Prof. Wolfgang Poller
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 12.12.06
Berlin 2007
D 83
Diese Dissertation wurde an der Charité Berlin / Campus Benjamin Franklin / Medizinische
Klinik II-Kardiologie & Pulmologie unter Anleitung von Dr. H. Fechner und Prof. W. Poller
angefertigt
Die Einreichung zur Erlangung der Doktorwürde erfolgte bei Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl am
Institut für Biotechnologie des Fachbereiches Prozesswissenschaften der Technischen
Universität Berlin
Abkürzungsverzeichnis.............................................................................................................I
1 Einleitung ............................................................................................................................... 1
1.1
Onkolytische Viren in der Tumortherapie ................................................................. 1
1.2
Biologie der Adenoviren ............................................................................................ 2
1.2.1
1.3
Replikationszyklus der Adenoviren ................................................................... 4
Onkolytische adenovirale Vektoren und Tumorselektivität....................................... 8
1.3.1
Verbesserung der Tumorselektivität der oAdV durch Ausnutzung des p53Signalweges ........................................................................................................ 8
1.3.2
Verbesserung der Tumorselektivität onkolytischer Viren durch Ausnutzung des
Retinoblastom-Signalweges ............................................................................. 10
1.3.3
Verbesserung der Tumorselektivität onkolytischer Adenoviren durch
Verwendung von tumor- und gewebespezifischen Promotoren....................... 10
1.3.4
Verbesserung der Tumorselektivität durch Steuerung der Vektorbindung an
tumorzellspezifischen Rezeptoren .................................................................... 13
2
1.4
Verbesserung der onkolytischen Effizienz der oAdV.............................................. 14
1.5
Genexpression und Regulationssysteme .................................................................. 15
1.5.1
Tetrazyklin-regulierbares Genexpressionsystem ............................................. 15
1.5.2
Dimerizer-induzierbares Expressionssystem ................................................... 18
1.5.3
Kontrolle der Genexpression in Abhängigkeit von Steroid-Hormon-Analoga 19
1.6
Das Fas/FasL-System und seine Bedeutung in der Tumoreliminierung.................. 23
1.7
Fragestellung ............................................................................................................ 26
Material und Methoden ................................................................................................. 28
2.1
Material .................................................................................................................... 28
2.1.1
Bakterienstämme .............................................................................................. 28
2.1.2
Bakterien-Medien............................................................................................. 28
2.1.3
Basis-Plasmide ................................................................................................. 28
2.1.4
Zelllinien .......................................................................................................... 28
2.1.5
Antikörper ........................................................................................................ 29
2.1.6
Enzyme............................................................................................................. 29
2.1.7
Oligonukleotide................................................................................................ 29
2.1.8
Geräte ............................................................................................................... 30
2.2
Arbeiten mit Bakterien ............................................................................................. 31
2.2.1
Herstellung chemokompetenter Bakterien ....................................................... 31
2.2.2
Herstellung elektrokompetenter Bakterien....................................................... 31
2.2.3
Transformation elektrokompetenter Bakterien ................................................ 32
2.2.4
Transformation chemokompetenter Bakterien................................................. 32
2.2.5
Konservierung von Bakterienzellen ................................................................. 33
2.3
DNA-und RNA-Techniken ...................................................................................... 33
2.3.1
DNA-Isolation aus Bakterien ........................................................................... 33
2.3.2
Isolierung eukaryontischer DNA ..................................................................... 33
2.3.3
DNA-Extraktion durch Phenol-Chloroform..................................................... 34
2.3.4
DNA-Extraktion aus Agarosegel ..................................................................... 34
2.3.5
DNA-Fällung.................................................................................................... 35
2.3.6
Trennung von DNA-Molekülen durch Ultrazentrifugation auf SucroseGradienten......................................................................................................... 35
2.3.7
Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren.................................. 35
2.3.8
Bestimmung der Nukleinsäurenkonzentration ................................................. 37
2.4
Klonierung von DNA ............................................................................................... 37
2.4.1
Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen......................................... 37
2.4.2
Dephosphorylierung von DNA-Molekülen...................................................... 38
2.4.3
Ligation von DNA-Fragmenten ....................................................................... 38
2.4.4
Herstellung von glatten Enden an DNA-Fragmenten ...................................... 38
2.5
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ........................................................................... 39
2.6
Sequenzierung von DNA ......................................................................................... 40
2.7
Quantitative kompetitive PCR ................................................................................. 40
2.7.1
Generierung des verkürzten Längenstandards ................................................. 40
2.7.2
Kompetitive PCR ............................................................................................. 41
2.7.3
Detektion und Quantifizierung der PCR-Produkte mittels Gene-Scan-Analyse
.......................................................................................................................... 42
2.8
Plasmid-Konstruktion............................................................................................... 43
2.9
Zellbiologische Methoden........................................................................................ 44
2.9.1
Ablösen adhärent wachsender Zellen............................................................... 44
2.9.2
Zell-Passagierung ............................................................................................. 45
2.9.3
Konservierung von Stammkulturen ................................................................. 45
2.9.4
Reaktivierung konservierter Kulturen.............................................................. 45
2.9.5
Zellzahl-Bestimmung ....................................................................................... 46
2.9.6
Transfektion von Säugetierzelllinien ............................................................... 46
2.10
Konstruktion und Produktion adenoviraler Vektoren .......................................... 46
2.10.1
Herstellung des RR5-Long-Arm ...................................................................... 47
2.10.2
Generierung und Propagation adenoviraler Vektoren...................................... 47
2.10.3
Quantifizierung rekombinanter Adenoviren: Titer-Bestimmung..................... 50
2.11
Expressionsnachweis-Methoden .......................................................................... 51
2.11.1
Nachweis der Proteinexpression durch Immunfluoreszenz-Färbung............... 51
2.11.2
Luciferase-Assay.............................................................................................. 51
2.12
Apoptose-Messung............................................................................................... 52
2.13
Zytotoxizitäts-Messung........................................................................................ 52
2.14
Transfer von Nukleinsäuren auf Nylonmembranen ............................................. 53
2.14.1
DNA-Transfer mittels Southern-Blot-Methode ............................................... 53
2.14.2
RNA-Transfer mittels Northern-Blot-Methode ............................................... 53
2.14.3
Kapillar-Blot..................................................................................................... 54
2.14.4
Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten.............................................. 54
2.14.5
Reinigung radioaktiv markierter Sonden ......................................................... 55
2.14.6
Hybridisierung von Nukleinsäuren mit markierten DNA-Fragmenten............ 55
2.14.7
Nachweis und Quantifizierung der Hybridisierungsprodukte.......................... 56
2.14.8
Waschen radioaktiv markierter DNA-Fragmente ............................................ 56
2.15
Tierversuche ......................................................................................................... 56
2.15.1
Generierung von Lungen-Tumorxenograftmodellen ....................................... 56
2.15.2
Zubereitung von Tamoxifen- und 4-Hydroxy-Tamoxifen-Lösungen .............. 57
2.16
3
Statistische Evaluierung ....................................................................................... 57
Ergebnisse ....................................................................................................................... 59
3.1
Arbeitshypothese...................................................................................................... 59
3.2
Entwurf und Konstruktion von Plasmiden zur Expression von E1A-MerFusionsproteinen ...................................................................................................... 60
3.3
Charakterisierung der E1A-Mer Fusionsproteine .................................................... 61
3.3.1
Untersuchung der Expression........................................................................... 61
3.3.2
Funktionelle Charakterisierung der E1A-Mer Fusionsproteine ....................... 62
3.4
Trans-Komplementierung der Adenovirusreplikation durch die E1A-Mer-Chimäre
.................................................................................................................................. 63
3.5
Untersuchung des Wirkmechanismus der Tam-abhängigen Regulation der Aktivität
von E1A-Mer-Chimären .......................................................................................... 64
3.6
3.6.1
Konstruktion von Tamoxifen-abhängigen adenoviralen Vektoren (Tam-oAdV).... 65
Überprüfung der viralen Konstrukte .................................................................... 66
3.7
Charakterisierung der Tam-oAdV............................................................................ 68
3.7.1
Expression der E1A-Mer-Chimären nach Infektion mit den Tam-oAdV........ 68
3.7.2
Untersuchung der Funktionalität der Tam-oAdV ............................................ 69
3.8
Tam -abhängige Regulation von Ad.MEM in vivo .................................................. 71
3.9
Optimierung der EM-Chimäre ................................................................................. 72
3.9.1
Deletion des Kernsignals im EM-Fusionsprotein und der daraus resultierende
Effekt auf dessen Aktivität ............................................................................... 72
3.9.2
Nachweis und subzelluläre Lokalisation der EΔNLSM- und MEΔNLSMFusionsproteine................................................................................................. 73
3.10
Charakterisierung des Deletionsmutanten Ad.EΔNLSM ........................................ 74
3.10.1
Untersuchung der EΔNLSM-Expression............................................................. 74
3.10.2
Kontrolle der adenoviralen DNA-Replikation durch die EΔNLSM-Chimäre .... 75
3.10.3
Replikation von Ad. EΔNLSM............................................................................ 76
3.11
Untersuchung der onkolytischen Eigenschaften der Tam-oAdV......................... 77
3.12
Untersuchung des Effekts der Überexpression von E1A-Mer-Chimären auf die
Regulierbarkeit der Tam-oAdV-verursachten Zytotoxizität ................................ 78
3.13
Untersuchung der Spezifizität der Tam-oAdV..................................................... 80
3.14
Reduktion der basalen Virusreplikation durch den tTS ........................................... 81
3.15
Untersuchung des Antitumorpotentials der Tam-oAdV im Maus-Modell .......... 82
3.16
Verbesserung der onkolytischen Eigenschaften der Tam-oAdV durch Expression
des Todesliganden (FasL) .................................................................................... 85
3.16.1
Evaluierung von Dox-abhängigen TRE-Promotoren für die Expression von
FasL .................................................................................................................. 85
3.16.2
Untersuchung der Leakiness der Dox-abhängigen TRE-Promotoren.............. 86
3.16.3
Effekt der FasL-Expression auf Lungenadenokarzinom-Zellen ...................... 87
3.16.4
Kombination der Virusreplikation mit der FasL-Expression in Abhängigkeit
von OHT ........................................................................................................... 89
4
Diskussion ....................................................................................................................... 91
4.1
Funktionelle Charakterisierung der E1A-Mer-Chimären ........................................ 92
4.2
Subzelluläre Lokalisation der E1A-Mer-Chimären und Einfluss auf die OHTabhängige Regulation............................................................................................... 93
4.3
Vergleich der Tam-oAdV......................................................................................... 94
4.4
Tam-oAdV verursachen eine OHT-abhängige Lyse der Tumorzellen .................... 97
4.5
Starke Expression der E1A-Mer-Chimären und Regulationskapazität der TamoAdV ........................................................................................................................ 98
4.6
Die Replikation der Tam-oAdV kann durch Expression von tTS inhibiert werden 99
4.7
Spezifizität der Tam-oAdV .................................................................................... 100
4.8
Regulation der Replikation und Anti-Tumorpotentiale der Tam-oAdV in vivo .... 102
4.9
Analyse der TRE-Promotoren und Auswahlkriterien für die Expression des FasL im
Kontext replikativer Adenoviren............................................................................ 105
4.10
Die FasL-Expression hat einen synergistischen Effekt auf die onkolytische
Effizienz der Tam- oAdV................................................................................... 107
5
Zusammenfassung........................................................................................................ 110
6
Ausblick......................................................................................................................... 111
7
Literatur........................................................................................................................ 112
8
Anhang .......................................................................................................................... 136
Abkürzungsverzeichnis
I
Abkürzungsverzeichnis
aa
Aminosäure
Abb.
Abbildung
A. bidest.
zweifach destilliertes Wasser
Ad
Adenovirus
ADP
„adenovirus death protein”
AdV
Adenoviraler Vektor
AFP
α-feto Protein
bGH
„bovine growth hormon”
bp
Basenpaare
CAR
Coxsackie Adenovirus Rezeptor
CBP
“cAMP-response-element-binding protein
(CREB)-binding protein“
cDNA
„complementary desoxyribonucleic acid”
CD
Cytosin-Deaminase
CEA
Carcinoembryonales Antigen
CMV
Cytomegalovirus
CMVmin
minimaler CMV-Promotor
CMV IE
„Cytomegalovirus immediate/early”
CPE
“cytopathic effect”
CR
Konservierte Region
CtBP
“C-terminal binding protein”
CTL
Zytotoxische T Lymphozyten
DBD
DNA-Bindungsdomäne
DEPC
Diethylpyrocarbonat
DMEM
„Dulbecco's Modified Eagle's Medium”
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
Dox
Doxyzyklin
dNTP
Desoxyribonukleotidtriphosphat
DrB
Dimerizer-Bindungsdomäne
EcR
„ecdyson rezeptor”
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA
„Enzyme-linked Immunosorbent Assay”
Abkürzungsverzeichnis
II
ER
Östrogenrezeptor/-en
FasL
Fas Ligand
FGF
„fibroblast growth factor”
FGFR
„fibroblast growth factor rezeptor”
FKS
Fetales Kälberserum
FRAP
FKBP-Rapamycin-assoziiertes Protein
FRB
FKBP-Rapamycin-bindende Domäne
GAPDH
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GR
Glucocorticoidrezeptor/-en
h
Stunde
HBD
Hormonbindungsdomäne/-n
HEK
„human epithelial kidney”
hGH
„human growth hormon”
HRE
„hormon response element”
HSP90
„heat shock protein 90”
HSV-tk
Herpes simplex Virus Thymidin Kinase
hTERT
„human telomerase reverse transciptase”
ITR
„inverted terminal repeat”
kb
Kilobasenpaare
kD
Kilo-Dalton
KRAB
„Kruppel-associated box”
LB
„Luria broth”
LDH
Lactatdehydrogenase
Luc
Luciferase
Mer
Mutierter Mausöstrogenrezeptor
MHC
„Major histocompatibility complex”
mA
Milli-Ampere
ME
Mer-E1A
MEM
Mer-E1A-Mer
EM
E1A-Mer
min
Minute
MOI
„multiplicity of infection”
mRNA
„messenger RNA”
MOPS
Morpholinopropansulfonsäure
Abkürzungsverzeichnis
III
NLS
Nukleares Lokalisationssignal
nt
Nukleotide
oAdV
Onkolytische(r) adenovirale(r) Vektor/-en
OC
Osteocalcin
OD
Optische Dichte
OHT
4-Hydroxy-Tamoxifen
ORF
„open reading frame”
P
Irrtumswahrscheinlichkeit
pRB
Retinoblastom Protein
PBS
„phosphate buffered saline”
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
PEG
Polyethylenglykol
PFU
„plaques forming units ”
Poly A
Polyadenylierungssignal
PR
Progesteron-Rezeptor
PR-HBD
Mutierte HBD des PR
PR-LBD
Ligandbindungsdomäne des PR
PSA
Prostata-spezifisches Antigen
RCA
„replication competent adenovirus”
RNA
Ribonukleinsäure
RNase
Ribonuklease
RLU
„relative light units”
RPM
„rotation per minute”
RPMI
„Rapid Prototyping and Manufacturing Institute”
RT
Raumtemperatur
rtTA
„reverse tetracyclin dependent transactivator”
RxR
Retinoid-x-Rezeptor
s
Sekunde
SDS
Natriumdodecylsulfat
SERM
Selektiver Östrogenrezeptor-Modulator
SP-B
„surfactant protein B”
SSC
„saline buffered sodium citrate”
SSP
„System Service Processor ”
STAT-1
“signal transducer and activator of transcription 1”
Abkürzungsverzeichnis
IV
TAF
“TBP-associated factor”
Tam
Tamoxifen
Tam-oAdV
Tamoxifen-regulierbare onkolytische adenovirale
Vektoren
TBP
„TATA-box-binding protein”
TERT
„telomerase reverse transciptase
Tet
Tetrazyklin
TetO
Tetrazyklin-Operator
TGsP
Tumor- und gewebespezifische(r) Promotor/-en
TREmod
„modified tetracyclin response element”
tTA
„tetracyclin dependent transactivator”
tTS
„tetracyclin dependent transcriptional silencer”
Tyr
Tyrosinase
U
„units”
USP
„Ultraspiracle”
V
Volt
vLS
Verkürzter Längenstandard
Vol
Volumenteil
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Onkolytische Viren in der Tumortherapie
Tumorerkrankungen sind trotz technischer Forschritte und Verbesserung der operativen
Therapien und Strahlentherapien sowie der Entwicklung zahlreicher neuer Chemotherapeutika
eine der Haupttodesursachen weltweit. Aufgrund der hohen Resistenz von Tumoren gegenüber
konventionellen Tumortherapieansätzen wird derzeit fortlaufend nach Alternativen gesucht.
Die Tumorgentherapie stellt seit einigen Jahren eine potentielle Methode zur Behandlung von
Tumorerkrankungen
Tumorerkrankungen
dar.
Das
durch
Therapiekonzept
Übertragung
„Tumorgentherapie“
fremden
besteht
genetischen
darin,
Materials
(Tumorsuppressorgene, toxische oder immunmodulatorische Gene) in Tumorzellen zu
behandeln. Als Genfähre wurden dabei bisher überwiegend replikationsdefiziente virale
Vektoren
eingesetzt
(McCormick,
2001;
Romano
et
al.,
1999).
Der
Nachteil
replikationsdefizienter Vektoren besteht allerdings darin, dass die Wirkung des Produktes der
übertragenen Nukleinsäuren in den primär betroffenen Tumorzellen begrenzt bleibt. In neuen
Ansätzen,
als
Tumor-Virotherapie
bezeichnet,
werden
zur
Bekämpfung
von
Tumorerkrankungen replikationskompetente virale Vektoren direkt als zytotoxisches Mittel
durch Ausnutzung ihrer zytolytischen Eigenschaften eingesetzt. Die dabei verwendeten
Vektoren replizieren entweder natürlicherweise oder aufgrund genetischer Veränderungen
selektiv in Tumorzellen und werden deshalb onkolytische Viren genannt (Abb. 1.1). Ein
wesentlicher Vorteil dabei besteht darin, dass die Vektoren sich vermehren und sich auf primär
nicht infizierten Tumorzellen ausbreiten (Vecil and Lang, 2003). Somit stellen onkolytische
Viren ein Alternative zur Überwindung des Distributionsproblems der replikationsdefizienten
Vektoren dar (Dobbelstein, 2004; McCormick, 2001; Romano et al., 1999). Zahlreiche
replikationsselektive virale Vektoren wurden bisher auf der Basis von Adenoviren, Herpes
simplex Viren, Influenza Virus, Newcastle disease Virus, Poliovirus, Reovirus und Vaccinia
Virus entwickelt, und ihr Potential wird derzeit in der Tumortherapie untersucht (Bitzer and
Lauer, 2002; McCormick, 2001; Ring, 2002; Young et al., 2006).
Adenoviren weisen aufgrund ihrer geringen Pathogenität, ihrer gut charakterisierten Biologie,
ihrer Fähigkeit, sowohl ruhende als auch proliferierende Zellen zu infizieren, ihrer großen
Insert-Kapazität und ihres episomalen Charakters sowie der Möglichkeit, sie in hohem Titer zu
produzieren, viele Vorteile gegenüber anderen Viren auf. Deshalb stehen sie im Mittelpunkt
der zurzeit entwickelten onkolytischen viralen Vektoren und sind auch Gegenstand der
vorliegenden Dissertation. Zahlreiche onkolytische adenovirale Vektoren (oAdV) wurden
bisher entwickelt, von denen sich einige in klinischen Studien befinden. Gegenwärtig wird
Einleitung
2
daran gearbeitet, die Effizienz und die Sicherheit durch die Regulation der Replikation und der
Onkolyse dieser Vektoren zu verbessern.
Im Folgenden wird zunächst ein Überblick über die Biologie der Adenoviren (Ad), über die
Strategien zur Generierung und zur Verbesserung der onkolytischen Effizienz von
tumorselektiven oAdV dargestellt. Da die Regulation der oAdV das zentrale Thema dieser
Arbeit ist, werden die zurzeit verfügbaren Genregulationssysteme vorgestellt.
Abortive Infektion
Infektion
Onkolytischer
Adenovirus
Normales Gewebe
Produktive Replikation
in infizierten Zellen
Tumorgewebe
Zelllyse und Infektion
benachbarter Tumorzellen
Abbildung 1.1. Onkolytische Viren und ihr Prinzip.
Nach Applikation infizieren die Viren sowohl die normalen als auch Tumorzellen. Jedoch replizieren sie nur in
Tumorzellen. Neue Viren werden nach Lyse der infizierten Tumorzellen freigesetzt und infizieren weitere Tumorzellen.
1.2 Biologie der Adenoviren
Adenoviren (Ad) sind hüllenlose DNA-Viren mit ikosahedrischen Strukturen von ca. 70 bis
100 nm Durchmesser (Nemerow and Stewart, 1991; Stewart et al., 1993) und gehören zur
Familie der Adenoviridae, die in die Gattungen Mastadenovirus (Adenoviren von Säugetieren)
und Aviadenovirus (Adenoviren von Vögeln) unterteilt ist. Die Mastadenoviren beeinhalten
wiederum zahlreiche Subgenera, zu denen die humanen Adenoviren gehören. Die humanen Ad
sind, basierend auf ihrer Fähigkeit zur Agglutination roter Blutkörperchen, in 6 Subgruppen (A
bis F) unterteilt, von denen 49 Serotypen nach ihrer genetischen Variabilität, ihrem onkogenen
Potential, dem G/C-Gehalt ihrer DNA und ihrer Resistenz gegen neutralisierende Antikörper
unterteilt werden (Eiz and Pring-Akerblom, 1997; Mei and Wadell, 1996).
Einleitung
3
Humane Ad der Subgruppe C, insbesondere Ad Serotyp 2 und Ad Serotyp 5, sind ubiquitäre
Viren. Sie verursachen milde Infektionen der Atemwege im Menschen. Ihr Genom besteht aus
einer linearen doppelsträngigen DNA von ca. 36 kb mit jeweils einem inverted terminal repeat
(ITR) am 5´- und am 3´-Ende sowie dem Verpackungssignal (Nukleotiden 194-358) als cisElement. Das Genom ist mit 4 Strukturproteinen (PV, PVI, µ, TP) verbunden, die das Core
bilden (Grable and Hearing, 1990; Rux and Burnett, 2004; Stewart et al., 1993). Die ITRs
fungieren als Replikationsursprung und während der Replikation des Virusgenoms dient das
terminale Protein (TP) als Initiationsprimer (Primase) . Sieben weitere Strukturproteine bilden
das Kapsid, das aus 252 Untereinheiten (Kapsomeren) zusammengesetzt ist (240 Hexone und
12 Pentone), wobei die Pentone die Ecken des Ikosaeders bilden (Abb.1.2). Gleichzeitig bilden
die Pentone die Basis für das Fiberprotein, das antennenartig in die Peripherie reicht und
dessen Länge zwischen den einzelnen Serotypen variiert (Norrby et al., 1969). Die C-terminale
Domäne des Fiberproteins, als Knob bezeichnet, agiert mit dem Rezeptor der Zielzelle. Die
Hexone ihrerseits liegen als Trimere vor, deren hervorstehende Schlaufen die Hauptepitope für
neutralisierende AK darstellen (Shenk, 1996).
Das Ad-Genom enthält überlappende transkriptionale Einheiten auf beiden DNA-Strängen
(Abb. 1.3), die über 50 Polypeptide kodieren (Shenk, 1996). Die Gene werden eingeteilt in die
fünf frühen Transkriptionseinheiten (E1A, E1B, E2, E3, E4), in vier verzögerte
Transkriptionseinheiten (IVa, IX, VAI, VAII) und in die späte Transkriptionseinheit (L), von der
5 mRNAs generiert werden (Majhen and Ambriovic-Ristov, 2006; Shenk, 1996).
Bei der Transkription werden beide DNA-Stränge abgelesen, wobei E1A, E1B, IX, E3 und die
Major Late Region rechtswärts, E4, E2 und IVa dagegen in links ausgerichteter Richtung
abgelesen werden (Russell, 2000).
Einleitung
4
Kapsid-Proteine
Andere Proteine
Core Proteine
VIII
Hexon
V
Fiber
VII
IX
IIIa
Penton
Mu
VI
Abbildung 1.2. Struktur der Adenoviren (W.C. Russel , 2000)
L5
MLP
L4
L3
L2
L1
E1B
E3
E1A
VA RNAs
0
20
40
60
80
E2A
IX
100
E4
IV2a
E2B
Abbildung 1.3. Schematische Darstellung des Adenovirusgenoms und seiner Transkriptionseinheiten
1.2.1
Replikationszyklus der Adenoviren
Der Infektionszyklus des Adenovirus dauert 24 bis 40 Stunden in permissiven Zellen und
besteht aus zwei Phasen: Der frühen Phase und der späten Phase.
1.2.1.1 Frühe Phase
Die frühe Infektionsphase des Ad beinhaltet die Adsorption und die Penetration des Virus in
die Wirtszelle sowie den Transport seines Genoms in den Zellkern, wo eine selektive
Transkribierung und Translation der frühen Gene (E1A, E1B, E2, E3 und E4) stattfindet.
Einleitung
5
Bis auf Ad der Gruppe B wird die Bindung der Ad an die Wirtszelle durch Interaktion der
Knob-Domäne des Fiberproteins mit dem zellulären Coxsackie Adenovirus Rezeptor (CAR)
auf der Zelloberfläche ermöglicht (Bergelson et al., 1997; Bergelson et al., 1998; Roelvink et
al., 1998). CAR ist ein 46 kD Transmembranprotein, das zur Immunglobulin-Superfamilie
gehört (Chretien et al., 1998; Wang and Bergelson, 1999) und an der Oberfläche verschiedener
Zelltypen exprimiert wird. Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass außer dem CAR der
MHC Ι und die Heparansulfat-Glycosaminoglycane auch als Bindungsrezeptoren von Ad
benutzt werden (Dechecchi et al., 2001; Hong et al., 1997). Nach seiner Bindung wird das
Viruspartikel
hauptsächlich
durch
Clathrin-abhängige
rezeptorvermittelte
Endozytose
internalisiert (Meier and Greber, 2004). Die virale Endozytose wird durch Co-Rezeptoren
getriggert, wozu die αVβ3- und αVβ5-Integrine gehören (Goldman and Wilson, 1995; Greber et
al., 1993; Huang et al., 1995). Die Interaktion mit der αV-Untereinheit des Integrins erfolgt via
RGD-Motiv des Fiber-Proteins des adenoviralen Pentons (Mathias et al., 1998;Meier et al.,
2002). Einmal im Zytoplasma gelandet, wird das virale Partikel über die Mikrotubuli in
Richtung Zellkern transportiert. Das virale Genom wird über einen bisher unklaren Prozess als
Nukleoproteinkomplex freigesetzt (uncoating) und durch Interaktion mit dem nuklearen
Porenkomplex in den Nukleus translokiert (Meier and Greber, 2004; Morgan et al., 1969).
Die E1-Region wird in die Regionen E1A und E1B unterteilt. Die E1A wird als erstes virales
Gen exprimiert, wobei fünf Proteine (13S, 12S, 11S, 10S und 9S) nach differentiellen
Splicevorgängen der Pre-mRNA entstehen. Bei Ad 2 und Ad 5 sind E1A-13S und E1A-12S
(auch 289R bzw. 243S, genannt) die Hauptprodukte der E1A-Expression. Beide Proteine haben
die gleichen Sequenzen am N- und am C-Terminus, sind unter anderem transkriptionale
Aktivatoren und hauptverantwortlich sowohl für die Transkription aller weiteren frühen
adenoviralen Gene als auch für die Modulation des Zellzyklus. Das E1A-13s Protein ist
essentiell für die Adenovirusreplikation und übernimmt die Hauptrolle für eine lytische
Propagation des Ad, indem es zu sämtlichen notwendigen Funktionen, die durch die E1ARegion kodiert werden, befähigt ist (Montell et al., 1982; Winberg and Shenk, 1984).
Das E1A-13s enthält aufgrund seiner komplexen Struktur zahlreiche Bindungsstellen, die
Interaktionen mit verschiedenen zellulären und viralen Faktoren ermöglichen (Abb.1.4).
Dadurch erfüllt dieses Protein multiple Funktionen während des adenoviralen Infektionszyklus,
so dass E1A-deletierte Ad replikationsunfähig sind. Jedoch kann die E1A-Funktion allein
durch die Expression von E1A-13s komplementiert werden (Moran et al., 1986).
Einleitung
6
Angesichts der zentralen Rolle der E1A-Genprodukte in der Adenovirusreplikation stellt dieses
Gen ein wichtiges Target für die Generierung replikationsunfähiger AdV sowie für die
Kontrolle replikativer AdV dar.
E1B wird als langes Transkript exprimiert und generiert vier Proteine, von denen das E1B19kD und E1B-55kD besser untersucht worden sind (Boulanger and Blair, 1991; Braithwaite et
al., 1991). Das E1B-19kD Protein ist ein viraler Homologe des zellulären antiapoptotischen
Faktors bcl-2 (Bernards et al., 1983). Das E1B-55kD ist an den Transport der späten mRNAs
vom Zellkern bis zu den Ribosomen beteiligt, spielt aber auch eine wesentliche Rolle bei der
Inhibierung der Apoptose (Martin and Berk, 1998; Yew and Berk, 1992). In der Summe
schützen beide E1B-Produkte die infizierten Zellen vor frühzeitigem Zelltod während der
Virusreplikation.
Die Produkte des E2-Gens sind ausschließlich in der Regulation der viralen DNA-Synthese
involviert und beinhalten das TP, die DNA-Polymerase und ein DNA-bindendes Protein, das
durch seine Helicase-Funktion die virale doppelsträngige DNA vorwärts der Replikationsgabel
denaturiert (de Jong et al., 2003; Hay et al., 1995).
Die E3-Transkriptionseinheit kodiert für neun Polypeptide, die die immunologische Umgebung
der Wirtszelle verändern und eine wichtige Rolle in der Zytolyse spielen, ist aber für die
Adenovirusreplikation nicht essentiell. Zwei gut untersuchte E3-Produkte sind das Adenovirus
Death Protein (ADP) und das Protein gp19K. Das ADP induziert die Lyse der infizierten
Zellen und ermöglicht dadurch eine effiziente Freisetzung der neuen Viruspartikel (Tollefson
et al., 1996). Das gp19K inhibiert den Transport der MHC Ι an die Zellmembran und
verhindert dadurch die Eliminierung der adenoviralen Partikeln durch die CTL (Bennett et al.,
1999).
Die Transkription des E4-Gens findet linkswärts statt und ergibt sieben Produkte, die als offene
Leserahmen 1 bis 6/7 bezeichnet werden (ORF 1-6, 6 /7). Es wurde nachgewiesen, dass die
E4-Genprodukte verschiedene Funktionen während der Virusinfektion erfüllen: beispielsweise
die Regulation der viralen DNA-Replikation und des subzellulären mRNA-Transports
(Goodrum and Ornelles, 1998;Weigel and Dobbelstein, 2000) sowie die Förderung der
selektiven Expression viraler Gene auf Kosten zellulärer Gene (Halbert et al., 1985). E4
verhindert die p53-vermittelte Apoptose, indem durch Interaktion des ORF 6 mit E1B-55K das
p53 zur Degradation freigesetzt wird (Boivin et al., 1999; Boyer and Ketner, 2000). Insgesamt
werden in der frühen Phase die Wirtszellen zur Replikation des Virusgenoms sowie zur
Produktion neuer Virionen vorbereitet.
Einleitung
7
pRB
Sug1
TBP
CtBP
C
N
CR1
p300
STAT-1
CR2
pCAF
CR3
UBC9
TAFs
Sur2
Abbildung 1.4. E1A-Genprodukt und seine zellulären Bindungspartner, modifiziert nach WC Russel, 2000
(siehe Tabelle 1.1)
Tabelle 1.1: Interaktionspartner der adenoviralen E1A-Proteine und Merkmale
Bindungspartner des E1A-Proteins
Merkmale der Interaktion
p21-Protein und verwandte CDK-
Stimulierung des Zellwachstums
Inhibitoren
Cyclin A und E
Induktion der DNA-Synthese
p300 und CBP-Proteinfamilie
Regulation des Zellzyklus, Inhibierung der Apoptose
Multiprotein-Komplex Sur-2
Stimulierung der Transkription viraler Gene
TATA-box-binding protein (TBP)
Regulation der Transkription
und TBP-associated factor (TAF)
Sug1
Apoptose durch Stabilität von p53
CtBP, E2F-Co-Repressor
Stimulierung der Zellen in der S-Phase
STAT-1, Transaktivator
Inhibierung der Interferonantwort und der p53-unabhängigen Apoptose
pCAF
Änderung der Nukleosomstruktur und dadurch der zellulären Transkription
Retinoblastom-Protein (pRB)
Synthese der S-Phase- Komponente
1.2.1.2 Späte Phase
Nach Eintritt der Zellen in die S-Phase des Zellzyklus und Akkumulation der frühen GenProdukte, insbesondere der E2-Proteine, beginnt am Replikationsursprung der ITR die
Replikation des adenoviralen Genoms. Dabei initiert die E2-kodierte DNA-Polymerase durch
Interaktion mit dem TP (als Primer) die Replikation des viralen Genoms. Die Elongation wird
von der Polymerase durch Interaktion mit dem Einzelstrang-DNA-bindenden Protein und
weiteren Faktoren vermittelt (de Jong et al., 2003).
Einleitung
8
Die späten Gene (L1-L5) werden erst mit Beginn der DNA-Replikation, ausgehend vom major
late promotor (MLP), als lange Transkriptionseinheit effizient exprimiert (Zhang and
Imperiale, 2003). Die entsprechenden späten mRNAs entstehen durch alternatives Splicing und
Polyadenylierung der langen Pre-mRNA. Nach ihrer Translation werden die resultierenden
Proteine als virale Strukturkomponenten (Kapsidbildung) in den Zellkern transportiert, wo die
Verpackung und Reifung neuer Viruspartikel stattfindet (Philipson, 1984; Russell, 2000). Die
Verpackung des Virusgenoms in das Kapsid im Nukleus beginnt ca. 8 Stunden nach der
Infektion und wird durch das Verpackungssignal initiiert (Grable and Hearing, 1990; Hearing
et al., 1987).
Die Ereignisse der späten Infektionsphase führen zur Umstellung der Zellkern-Maschinerie
und zur Permeabilisierung der nuklearen Membran (Rao et al., 1996; Tollefson et al., 1996b).
Dadurch gelangen die reifen Viruspartikel ins Cytoplasma und werden letztendlich nach
Schädigung der Zellmembran ca. 30-40 Stunden nach der Infektion freigesetzt (Majhen and
Ambriovic-Ristov, 2006).
1.3 Onkolytische adenovirale Vektoren und Tumorselektivität
Bei
der
ersten
klinischen
Anwendung
von
replikativen
Ad
als
Mittel
gegen
Krebserkrankungen, Anfang der fünfziger Jahre, als der Adenovirus-Wildtyp bei Patienten mit
Zervixkarzinom eingesetzt wurde (Huebner et al., 1956), bestand das Hauptproblem darin, dass
trotz des Antitumoreffekts des Virus die normalen Gewebe ebenfalls geschädigt wurden. Um
normales Gewebe beim Einsatz von replikationskompetenten Adenoviren zu schonen, werden
derzeit vier Strategien verfolgt, die eine tumorselektive Replikation der oAdV (auch bedingt
replikationskompetente AdV genannt) ermöglichen.
1.3.1
Verbesserung der Tumorselektivität der oAdV durch Ausnutzung des p53Signalweges
Das zelluläre Tumorsuppressor-Protein p53 fungiert als Transkriptionsfaktor für eine große
Anzahl von Genen, die für die Zellzyklusregulation und für die Apoptose unentbehrlich sind.
Dadurch wird die Progression des Zellzyklus blockiert und die Apoptose als Reaktion auf
zellulären Stress, DNA-Schädigung oder Synthese fremder DNAs induziert (Giaccia and
Kastan, 1998;Levine, 1997). Wildtyp-Adenoviren überwinden diese Blockade, indem sie das
p53 durch die von E1B-Gen kodierten E1B-55kD und E1B-19kD Proteine neutralisieren und
so die infizierten Zellen vor einem vorzeitigen Tod schützen (Yew et al., 1994). E1B-19kD ist
funktionell mit dem antiapoptotischen Protein Bcl-2 verwandt und kann die Zellen vor
Apoptose schützen. Das E1B-55kD Protein bindet und inaktiviert p53 (Kao et al., 1990). Mit
Einleitung
9
Hilfe des E4 ORF6-Proteins steuert es seinen Export ins Cytoplasma und seinen Abbau (Moore
et al., 1996). Der p53-Signalweg ist in vielen humanen Tumorarten aufgrund der Mutationen
im p53-Gen defekt (Lowe et al., 1993; Lowe et al., 1994) und wird deshalb genutzt, um die
Tumorselektivität der oAdV zu erhöhen. Diese Strategie wurde zum ersten Mal von Bischoff
und Mitarbeiter (1996) genutzt, indem sie einen oAdV, nämlich ONYX015, mit einer Deletion
im p53-bindenden Protein E1B-55K entwickelten. ONYX-015 enthält eine 827bp Deletion in
der E1B-Region des adenoviralen Genoms sowie eine Punktmutation, die zur Entstehung eines
Stopkodons führt und in einem nicht funktionellen E1B-55kD Protein resultiert (Barker and
Berk, 1987). So sollte nach Infektion normaler Zellen mit ONYX-015 eine p53-vermittelte
Signalkaskade ausgelöst werden, die zum Zellzyklusstillstand und zur Apoptose und als Folge
dessen zu einer unvollkommenen Virusreplikation führt, während p53-negative Tumorzellen
einer lytischen Virusreplikation unterliegen. ONYX-015 wurde bisher in zahlreichen
klinischen Studien (Phasen I und II) getestet (Galanis et al., 2005; Kirn, 2001; Nemunaitis et
al., 2001). Kontroverse bestehen jedoch darin, was den Wirkungsmechanismus und den
Zusammenhang zwischen der Replikation von E1B-55K-Mutanten und dem p53-Status der
Zellen anbelangt. Diese Kontroversen basieren auf der Beobachtung, dass auch Zellen mit
normalem p53-Status einer vollkommenen Replikation von ONYX-015 unterlagen (Goodrum
and Ornelles, 1999; Hall et al., 1998; Petit et al., 2002; Ries, 2005). Es wird angenommen, dass
die Funktion des p53-Proteins durch andere Mechanismen als die Mutation des p53-Gens
inhibiert werden kann. In diesem Zusammenhang reguliert das Tumorsupressor-Protein p14ARF
den zellulären Level sowie die Funktion des p53-Proteins, indem es das protoonkogene Protein
MDM2 (eine E3-Ubiquitin Ligase, die den Abbau von p53 steuert) negativ reguliert. Da ihre
Expression in humanen Tumoren oft dereguliert ist, kann dadurch ein alternativer Weg zur
Inhibierung von p53 und eine permissive Replikation von ONYX-015 in p53-positiven
Tumorzellen entstehen (McCormick, 2000; Ries et al., 2000). Zum anderen übt das E1B-55kD
Protein auch Funktionen beim Export und bei der Translation der späten viralen mRNA
während der Virusinfektion aus (Harada and Berk, 1999; Horridge and Leppard, 1998). Einige
Tumorzellen scheinen die Funktion des E1B-55K vollständig zu komplementieren (Bischoff et
al., 1996), während andere das nicht können (Rothmann et al., 1998). Wahrscheinlich hängt die
in p53-defizienten Tumoren beobachtete Diskrepanz in der Replikation von ONYX-015 davon
ab, wie weit andere Funktionen von E1B-55K komplementiert werden können.
Einleitung
1.3.2
10
Verbesserung der Tumorselektivität onkolytischer Viren durch Ausnutzung des
Retinoblastom-Signalweges
Das Retinoblastom-Protein (pRB) ist ein Tumorsuppressor, der eine wichtige Rolle in der
Kontrolle des Zellzyklus spielt. In normalen Zellen bindet das pRB an das E2F-Protein, einen
zellulären Transkriptionsfaktor, dessen Funktion darin besteht, die Expression der Gene zu
aktivieren, die an der Transition der Zellen von der G1- in die Synthese-Phase beteiligt sind
(Lavia and Jansen-Durr, 1999). Durch diese Interaktion wird der Checkpoint des Zellzyklus
reguliert und eine unkontrollierte Zellproliferation verhindert. Um diesen Checkpoint des
Zellzyklus zu durchbrechen, bindet und inaktiviert das adenovirale E1A-Produkt das pRB über
seine konservierte Region CR2 (Whyte et al., 1988). Es ist in zahlreichen unabhängigen
Untersuchungen nachgewiesen worden, dass eine Mutation in der E1A-CR2, die die
Bindungsstelle für pRB deletiert, zu keinem Verlust der Transaktivierungsfunktion führt
(Jelsma et al., 1989; Moran et al., 1986; Whyte et al., 1988; Whyte et al., 1989). Der pRBkontrollierte G1-S-Phase-Checkpoint ist in der überwiegenden Anzahl von Tumorzellen
infolge einer Mutation oder Deletion in dem pRB nicht mehr vorhanden (Sherr, 1996), so dass
dieser Defekt in den Retinoblastom-Signalwegen in Tumorzellen gezielt ausgenutzt wird, um
die Tumorselektivität von oAd zu erzielen. Erste oAdV dieser Art sind durch den AdenovirusMutanten dl922-947 (Heise et al., 2000) und den Mutanten Δ24 (Fueyo et al., 2000) vertreten.
Beide Mutanten enthalten eine Deletion in der Retinoblastom-bindenden Region des
adenoviralen E1A-Gens. Ihre Selektivität und Effizienz wurden in einer Vielzahl von
Tumortypen nachgewiesen (Bauerschmitz et al., 2004; Sonabend et al., 2006; Vecil and Lang,
2003).
1.3.3
Verbesserung der Tumorselektivität onkolytischer Adenoviren durch
Verwendung von tumor- und gewebespezifischen Promotoren
Eine weitere Strategie zur Erhöhung der Tumorselektivität von oAdV besteht darin, tumor- und
gewebespezifische Promotoren (TGsP) einzusetzen und damit die Expression essentieller
adenoviraler Gene zu kontrollieren. Zahlreiche TGsP wurden bisher identifiziert, die eine
spezifische Transgenexpression und Replikation der oAdV in Tumoren ermöglichen, in denen
die verwendeten TGsP aktiv sind (Tabelle 1.2).
Meistens wurden zur Kontrolle der oAdV-Replikation die TGsP zur Expression des E1A- oder
E4-Gens verwendet. Das Adenovirus CN706 wurde von Rodriguez und Mitarbeiter (1997)
entwickelt, bei dem das E1A durch den prostata-spezifischen Antigen-Promotor (PSAPromotor) kontrolliert wurde. Dieses Virus wies eine selektive Zytotoxizität in PSA-positiven
Prostata-Karzinom-Zellen auf. In CV764 wurden, um eine prostataspezifische Replikation zu
Einleitung
11
erzielen, die Enhancer und Promotorelemente aus prostataspezifischem Kallikrein-Gen zur
Regulierung
des
adenoviralen
E1B-Gens
eingesetzt
(Yu
et
al.,
2001).
Weitere
prostataspezifische oAdV wurden entwickelt, die sowohl in vitro als auch in vivo eine selektive
Replikation und Onkolyse in PSA-positiven Prostatakarzinomzellen aufwiesen (Cheng et al.,
2006; Small et al., 2006).
Hallenbeck und Mitarbeiter (1999) nutzten den α-Fetoprotein (AFP) Promotor, um die
Transkription des E1A-Gens im Adenovirus AvE1a04i zu steuern und damit hepatozelluläre
Karzinome zu bekämpfen. Das AFP-Gen wird in fast 80 % der Patienten mit hepatozellulären
Karzinomen hoch exprimiert und konnte dagegen in gesunden Individuen nicht nachgewiesen
werden (Camper and Tilghman, 1991). Das AvE1a04i war in einem ex-vivo-Experiment in der
Lage, das Wachstum der AFP-positiven Leberkarzinomzellen zu hemmen, in AFP-negativen
Karzinomzellen hingegen nicht. Allerdings war in vitro auch in AFP-negativen humanen
Zelllinien, primären Lungenepithel- und Endothelialzellen eine leichte Virusreplikation
nachweisbar (Hallenbeck et al., 1999).
Weitere oAdV wurden entwickelt, in denen das E1A bzw. das E1B unter Kontrolle des AFPEnhancer
Promotors
stehen.
Sowohl
die
Replikationsspezifität
als
auch
die
Replikationseffizienz in AFP-positiven Zellen konnte dadurch deutlich verbessert werden
(Takahashi et al., 2002).
Um die Replikation der oAdV in Lungentumoren zu steuern, entwickelten Doronin und
Mitarbeiter (2000) den KD1-SPB, einen oAdV, in dem der Surfactant-Protein B-Promotor
(SP-B Promotor) die Expression des viralen E4-Gens kontrolliert. Der SP-B Promotor ist nur in
Alveolar- und Bronchialepithelzellen aktiv. Der KD1-SPB zeigte nicht nur Tumorselektivität,
sondern auch Gewebespezifizität, bezogen auf die Lungen. Des Weiteren konnten Nettelbeck
und Mitarbeiter (2002) einen oAdV entwickeln, bei dem durch Verwendung des TyrosinasePromotors zur Kontrolle der E1A-Expression eine spezifische Virusreplikation in
Melanomzellen erreicht wurde.
Obwohl alle diese entwickelten oAdV gewebespezifische Replikationen und AntitumorWirkungen in zahlreichen präklinischen Studien gezeigt haben, besteht ihre Limitierung darin,
dass ihre Replikation und zytolytischen Effekte nur auf bestimmte Tumortypen gesteuert
wurden, die in den meisten Fällen aufgrund der Heterogenität nur eine kleine Subpopulation
innerhalb eines bestimmten Tumortyps ausmachen. Weitere Möglichkeiten wurden daher
erprobt, um diese Limitierung zu überwinden. Es wurden Promotoren untersucht, die in den
meisten Tumoren aktiv sind. E2F-1 ist ein Transkriptionsfaktor, der sowohl seinen eigenen
Promotor als auch Gene aktiviert, die beim Übergang von der G1- zur S-Phase des Zellzyklus
Einleitung
12
beteiligt sind. Da Tumorzellen durch unkontrolliertes Wachstum gekennzeichnet sind und
darüber hinaus E2F-1 aufgrund des Defektes im pRb/p16INK4a/CyclinD Signalweg in
proliferierenden Tumorzellen konstitutiv aktiv ist, stellt der E2F-1 Promotor ein universelles
Regulationselement dar, um die Virusreplikation in einer großen Anzahl von Tumortypen zu
steuern. AdE2F-1 ist ein oAdV, in dem die Expression des E1A-Gens durch die humanen E2F1 Promotorelemente reguliert wird. Es wurde gezeigt, dass dieses Virus zytolytische Wirkung
in einer großen Anzahl von Tumorzellen, aber nicht in normalen ruhenden Zellen aufweist
(Tsukuda et al., 2002).
Tabelle 1.2: Tumor- und gewebespezifische Promotoren für die selektive Kontrolle der oAdV
Promotor
Ziel-Gewebe/Tumor
Literatur
α-feto protein (AFP)
Leberkarzinom
Hallenbeck et al., 1999
Carcinoembryonic antigen (CEA)
Lungen-, Pankreas-,
Li et al., 2003
Kolon-, Leberkarzinom
Tyrosinase (Tyr)
Melanozyten
Banerjee et al., 2004
Prostate-specific antigen (PSA)
Prostata
DeWeese et al., 2001
Surfactant protein B (SP-B)
Lunge
Doronin et al., 2000
Human telomerase reverse transcriptase (hTERT)
viele Tumore
Huang et al., 2003
Human kallikrein 2 (hKLK2)
Prostata
Yu et al., 2001
E2F-1
viele Tumore
Tsukuda et al., 2002
Osteocalcin (OC)
Osteoblasten
Matsubara et al., 2001
Probasin
Prostata-Karzinom
Yu et al., 2001
MUC1
Mammakarzinom
Kurihara et al., 2000
Hypoxia-inducible factor responsive element (HRE)
viele Tumore
Post and Van Meir, 2003
Ein weiterer Versuch, die Replikation onkolytischer Adenoviren generell in allen Tumortypen
zu steuern, wurde durch Einsatz des Telomerase-Promotors unternommen. Die Telomerase ist
eine RNA-abhängige DNA Polymerase, die durch Synthese von Telomeren die ChromosomenEnden auffüllt. Da dieses Enzym nur in fetaler Entwicklung aktiv ist und nicht in
postmitotischen Zellen (Shah et al., 2003), führt eine unkontrollierte Zellteilung zu einer
Verkürzung des Telomers, was zur Apoptose führt. Zahlreiche Tumorzellen sind durch hohe
Telomerase-Aktivität gekennzeichnet (Hara et al., 2001; Rathi et al., 1999; Shay and Wright,
2001; Takakura et al., 1999), so dass der Telomerase-Promotor einen universellen
tumorspezifischen Promotor darstellt. Die Arbeitsgruppe um Huang (2003) nutzte den
telomerase reverse transcriptase (TERT) Promotor, um das adenovirale E1A-Gen im AdvTERTp-E1A zu kontrollieren. Adv-TERTp-E1A zeigte die gleiche Effizienz wie das Wildtyp-
Einleitung
13
Adenovirus in TERT-positiven Tumoren in vitro und in vivo, während seine Replikation in
TERT-negativen Tumorzellen stark reduziert war. oAdV mit dem E2F-1 und dem human
telomerase reverse transcriptase (hTERT) Promotor zur Kontrolle der E1A- bzw. der E1BExpression führten zur spezifischen Replikation und Zytotoxizität in einer großen Anzahl von
Tumoren in vitro und in vivo (Li et al., 2005; Uchino et al., 2005).
1.3.4
Verbesserung der Tumorselektivität durch Steuerung der Vektorbindung an
tumorzellspezifischen Rezeptoren
Eine Limitierung im Einsatz von AdV in der Antitumor-Therapie besteht darin, dass
Adenoviren ein breites Spektrum von Zelltypen infizieren können. Dies stellt einen
wesentlichen Nachteil dar, weil bei einer systemischen Applikation die Vektoren mit
verschiedenen Zellarten in der Blutbahn interagieren und anschließend in der Leber
abgefangen werden können, so dass sie ihre Zielzellen und Organe nicht effizient erreichen
können (Alemany et al., 2000). Eine Möglichkeit, dieses Problem zu minimieren oder zu
verhindern besteht darin, den nativen Tropismus von AdV zu verändern. Die Strategie beruht
darauf, die Interaktion des Ad Fiberproteins mit CAR durch gentechnische Modifikationen zu
unterbinden. So wurden spezifische Liganden mit adenoviralen Kapsid-Proteinen fusioniert
oder Tumoroberflächen-Rezeptoren als neue Rezeptoren für AdV erprobt. Gu und Mitarbeiter
(1999) zeigten, dass ein bifunktionelles Protein durch Fusion des Fibroblast Growth Factor 2
(FGF2) mit dem neutralisierenden Antikörper gegen Fiber-Protein (Fab) die Bindung des
Adenovirus FGF2-Ad an FGF2 Rezeptor (FGFR)-positiven Zellen 50- bis 100-fach erhöht.
Gleichzeitig zeigte das FGF2-Ad aufgrund des neutralisierenden Effektes des Fab einen
Affinitätsverlust für CAR. Der FGFR ist in zahlreichen Tumoren überexprimiert (Chandler et
al., 1999; Dib et al., 1995; Jaakkola et al., 1993; Kobrin et al., 1993) und wurde deshalb zur
Steuerung des Adenovirus-Tropismus in Zellen und Tumortypen eingesetzt, bei denen CAR
downreguliert ist (Dmitriev et al., 1998; Miller et al., 1998; Okegawa et al., 2000; Rauen et al.,
2002). Wickham und Mitarbeiter (1997) haben ein Adenovirus mit modifiziertem Fiber-Protein
durch Insertion eines RGD Motivs in das Fiberprotein entwickelt. Dadurch konnte die
Transduktion von αv-Integrin-exprimierenden Zellen erreicht werden. In vitro konnte gezeigt
werden, dass die onkolytischen Eigenschaften des Adenovirus-Mutanten Ad5-Δ24 durch
Insertion eines RGD-Motivs in Fiberprotein in vielen humanen Tumorzelllinien gesteigert
werden (Bauerschmitz et al., 2002). Auch wurde durch sieben zusätzliche Lysin-Reste im
Fiberprotein die Infektion der CAR-defizienten Zellen beträchtlich gesteigert. Durch
Pseudotypisierung des Fiber-Proteins wurde die adenovirale Infektion in bestimmten Zelltypen
erreicht. Rivera und Mitarbeiter (2004) erreichten durch Entwicklung des replikationsfähigen
Einleitung
14
Pseudotyps Ad5/Ad3 eine 10-fache Steigerung der Infektion, der Replikation und der Lyse in
Melanomzellen. Diese Zellen sind zwar durch niedrigen Expressionslevel von CAR
gekennzeichnet, exprimieren aber reichlich die Rezeptoren für Adenovirus Serotyp 3. Ad5/Ad3
enthält ein chimärisches Fiberprotein durch Fusion des Ad5- Schwanzes mit der Ad3- KnobDomäne. Weitere oAdV mit chimärischem Ad5/Ad3 Fiber-Protein wurden erfolgreich in
zahlreichen Tumorarten untersucht (Bauerschmitz et al., 2006; Borovjagin et al., 2005; Rein et
al., 2005).
1.4
Verbesserung der onkolytischen Effizienz der oAdV
Präklinische und klinische Studien haben deutlich gezeigt, dass die oAdV ein Antitumorpotential aufweisen. Allerdings ist auch deutlich zu erkennen, dass in ihrer bisherigen
Form die Effizienz der oAdV als Monotherapie nicht ausreicht. Deshalb wird gegenwärtig
intensiv
an
der
Verbesserung
der
Vektoren,
der
Therapieschemata
und
der
Kombinationsmöglichkeit mit anderen Therapieformen gearbeitet. Zwei Strategien wurden
bisher dabei verfolgt. Zum einen wurde eine multimodale Therapie angestrebt, indem oAdV
mit Immuno-, Chemo- oder Bestrahlungs-Therapien kombiniert wurden. So wurde gezeigt,
dass diese multimodale Therapie zu einer Verstärkung der tumordestruktiven Wirkung der
oAdV führt (Chen et al., 2001; Geoerger et al., 2004; Li et al., 2001; Li et al., 2005; Motoi et
al., 2000). Zum anderen wurde in jüngster Zeit eine Kombination der Virotherapie mit der
Gentherapie erprobt. Als therapeutische Gene werden dabei tumorsuppressive oder toxische
Gene, insbesondere Suizidgene, verwendet. Suizidgene kodieren für Enzyme, die harmlose
chemische Verbindungen (Prodrug) in eine toxische Form umwandeln. Die am häufigsten
untersuchten Suizidgene sind die Gene für die bakterielle Cytosin-Deaminase (cd) und für die
Thymidin-Kinase des Herpes Simplex Virus (HSV-tk) (Mullen et al., 1992). Die CD wandelt 5Fluorocytosin in die Anti-Krebsverbindung 5-Fluorouracil um, die in Zellen zu 5-FdUMP
metabolisiert wird und zum Zelltod führt (Boucher et al., 2006). Die HSV-tk- exprimierenden
Zellen wandeln Ganciclovir in seine phosphorylierte Form um, die in die DNA inkorporiert
wird und zur Apoptose führt (Boucher et al., 2006). Lee und Mitarbeiter (2006) haben gezeigt,
dass
durch
Insertion
von
hitze-induzierbaren
cd-
und
HSV-tk-Genen
in
einem
replikationskompetenten Ad-Genom ihr zytopathogener Effekt und die Zytotoxizität gesteigert
wurden. Es gibt dagegen Berichte darüber, dass sich die Expression der Suizidgene nachteilig
auf die Replikationseffizienz der oAdV auswirkt (Lambright et al., 2001; Wildner et al., 2003).
In jüngster Zeit wurde zur Verbesserung der Antitumoreffizienz der oAdV auch auf die
adenoviralen Gene zurückgegriffen. Es wurde z.B. nachgewiesen, dass die Reinsertion des
55 kD Proteins des adenoviralen E1B und des ADP in das Adenovirusgenom ebenfalls zur
Einleitung
15
Verstärkung der tumortoxischen Wirkung führte (Barton et al., 2006a;Toth et al., 2004;Yun et
al., 2005). Geoerger und Mitarbeiter (2005) haben vor kurzem gezeigt, dass es möglich wäre,
oAdV und shRNA gegen bestimmte Targets in Tumorzellen zu kombinieren.
1.5
Genexpression und Regulationssysteme
Die Regulation der Transgenexpression ist sowohl in der Gen- als auch in der Virotherapie
hinsichtlich der klinischen Wirksamkeit und der Sicherheit von großer Bedeutung.
Insbesondere bietet die Regulation der Transgenexpression die Möglichkeit, nicht nur die
Konzentration
der
Transgen-Produkte
innerhalb
des
therapeutischen
Fensters
aufrechtzuerhalten und dadurch die damit verbundene Toxizität zu vermeiden, sondern auch im
Fall eines Auftretens unerwarteter Nebenwirkungen oder Komplikationen, die Expression
auszuschalten und somit die Therapie abzusetzen. Ursprünglich wurden zur Regulation der
Genexpression induzierbare Systeme verwendet, die auf endogenen Elementen basierten.
Solche Elemente reagierten auf exogene Signale und Stresssituationen wie Hitzeschock
(Evgen'ev et al., 1979; Schweinfest et al., 1988), Hormone (Lee et al., 1981; Yarranton, 1992),
Metall-Ionen (Brinster et al., 1982; Searle et al., 1985) und Strahlen (Manome et al., 1998),
litten aber im Allgemeinen unter niedriger Spezifizität, einer zu hohen Basalexpression und
einer schwachen Induzierbarkeit der Transgenexpression. Außerdem reagierten die
verwendeten Promotoren auf Wirkstoffe, die häufig pleiotropische Effekte auf eukaryontische
Zellen ausübten (Agha-Mohammadi and Lotze, 2000).
Um diese Limitierungen der ersten regulierbaren Systeme zu überwinden, wurden
verschiedene induzierbare Systeme entwickelt, die auf Nicht-Säugetieren oder auf mutierten
endogenen Kontrollelementen basieren (Agha-Mohammadi and Lotze, 2000).
Den zurzeit entwickelten regulierbaren Systemen liegt fast ausschließlich eine Ligandabhängige Regulation der Genexpression zugrunde. Die Systeme bestehen meistens zum einen
aus einem künstlichen Promotor und zum anderen aus chimärischen Transkriptionsfaktoren,
die durch Fusion der Sequenz einer DNA-bildenden Domäne und einer transkriptionalen
Aktivator-Domäne mit einer Sequenz, die mit einem bestimmten Wirkstoff (Induktor)
interagiert, entstehen. Der künstliche Promotor besteht aus einer monomerischen oder
multimerischen Bindungsstelle für den chimärischen Transkriptionsfaktor und einem
Promotor mit niedriger Basalaktivität (Toniatti et al., 2004).
1.5.1
Tetrazyklin-regulierbares Genexpressionsystem
Das Tetrazyklin-regulierbare System (Tet-System) ist das am häufigsten untersuchte und
verwendete Genregulations-System. Dieses System wurde ursprünglich von Gossen und
Einleitung
16
Bujard (1992) entwickelt und basiert auf dem Tetrazyklin-Resistenzoperon von Escherichia
coli. Das System nutzt die Spezifität des Tet-Repressors (TetR), ein prokaryontisches DNAbindendes Protein, für die Tet-Operator (TetO)-Sequenz , sowie die Sensitivität des TetR
gegenüber Tetrazyklin und die ubiquitäre Aktivität des potenten Herpes-Simplex-VirusTransaktivators VP16 in eukaryontischen Zellen (Agha-Mohammadi and Lotze, 2000). Das
Tet-System ist von dem chimären Tetrazyklin-abhängigen Transaktivator (tTA) abhängig, der
durch die Fusion der VP16-Aktivations-Domäne mit dem tetR-Protein generiert wurde. In
Abwesenheit von Tetrazyklin bindet die TetR-Domäne des tTA mit hoher Affinität und
Spezifität an den Tetrazyklin-responsiven Promotor, der aus einer Regulatorregion mit sieben
Wiederholungen der TetO-Sequenz upstream eines minimalen CMV-Promotors (CMVmin)
besteht. Infolge der Bindung des tTA an TetO-Sequenzen transaktiviert die VP16Aktivationsdomäne den Tetrazyklin-responsiven Promotor und dadurch die Expression des
downstream liegenden Zielgens (Abb. 1.5A). Die Bindung von Tetrazyklin oder seinem
Analogon Doxyzyklin an TetR bewirkt eine allosterische Änderung an dem Repressor, die die
TetR-Affinität zu TetO aufhebt (Baron and Bujard, 2000) und so die Transgenexpression
herabreguliert (Agha-Mohammadi and Lotze, 2000). Dieses System (als Tet-OFF bezeichnet)
wurde in zahlreichen in vitro und in vivo Studien angewandt, hat jedoch für eine therapeutische
Anwendung den Nachteil, dass eine kontinuierliche Zugabe von Tetrazyklin oder Doxyzyklin
für die Inaktivierung der Transgenexpression erforderlich ist. Eine Verbesserung des Tet-OFF
erzielte man durch Mutagenese des tTA zu einem reversen tTA (rtTA). Der rtTA aktiviert, im
Gegensatz zu tTA, die Transkription des Zielgens in Gegenwart von Doxyzyklin (Abb. 1.5B)
(Gossen et al., 1995). Diese Version (Tet-ON) zeigte ihrerseits neben ihrer hohen Instabilität in
vivo (Mizuguchi and Hayakawa, 2001) zwei wesentliche Nachteile: zum einen war die
Affinität des rtTA zu Doxyzyklin gering, so dass eine hohe Dosis vom Induktor für eine
effiziente Aktivierung erforderlich war; zum anderen war das System mit einer relativ hohen
basalen Aktivität aufgrund der residualen Bindung des rtTA an tetO in Abwesenheit des
Induktors verbunden.
Deuschle und Mitarbeiter (1995) leisteten einen großen Beitrag zur weiteren Optimierung des
Tet-Systems, indem sie den Dox-abhängigen transkriptionalen Silencer (tTS) entwickelten. Der
tTS wurde durch Fusion der KRAB (Kruppel-associated Box)-Repressionsdomäne des
humanen Kid-Proteins mit dem TetR generiert. Der tTS bindet an tetO in Abwesenheit von
Dox und reprimiert die Promotoren, während durch Dox-Applikation der tTS vom TetO
dissoziiert und die transkriptionelle Suppression aufgehoben wird (Freundlieb et al., 1999). Die
Verwendung unterschiedlicher Dimerisierungsdomänen in rtTA und tTS ermöglichte eine
Einleitung
17
Kombination beider Systeme und somit eine strengere Regulation der Transgenexpression
(Freundlieb et al., 1999). Eine weitere Optimierung des Tet-Systems wurde durch Mutagenese
am rtTA und Screeningexperimente in Hefe (Saccharomyces cerevisiae) erzielt. Dies führte
zur Isolierung von fünf rtTA-Mutanten, von denen zwei (rtTA2S-M2 und rtTA2S-S2)
verbesserte Eigenschaften gegenüber dem ursprünglichen rtTA zeigten (Urlinger et al., 2000).
A
Tet-OFF
B
Tet-ON
tTA
Keine Gen-Aktivierung
Gen-Aktivierung
rtTA
Gen-Aktivierung
Keine Gen-Aktivierung
Abbildung 1.5. Tetrazyklin-regulierbare Systeme (modifiziert nach Goverdhana et al., 2005)
(A) Tet-OFF-System. Nach Expression des Transaktivators (tTA) bindet Doxyzyklin an tTA und verhindert
seine Bindung an tetO-Elemente. Dadurch kann tTA den TRE-Promotor und damit die Transgenexpression
nicht aktivieren. In Abwesenheit von Dox induziert die Bindung des tTA an tetO die Genexpression durch
Aktivierung des TRE-Promotors.
(B) Tet-ON-System. In Abwesenheit von Dox ist der rtTA nicht in der Lage, an tetO zu binden. In Anwesenheit
von Dox bindet rtTA an tetO und aktiviert die Genexpression.
Der rtTA2S-S2 zeichnete sich durch eine strenge Regulierbarkeit, eine nicht-detektierbare
Aktivität in Abwesenheit vom Induktor, jedoch mit vergleichbarem Aktivierungspotential wie
rtTA, aus. Der rtTA2S-M2 erwies sich dabei hinsichtlich seiner Induzierbarkeit und Spezifität
den anderen Mutanten gegenüber deutlich überlegen (mit einer kaum detektierbaren
Background-Aktivität und gleichzeitig mit einer höheren Affinität zu Dox). Eine maximale
Aktivierung mit rtTA2S-M2 konnte bei 10-fach niedrigerer Doxyzyklin-Dosis im Vergleich zu
rtTA und rtTA2S-S2 erreicht werden (Urlinger et al., 2000). Es konnte in einer Studie sowohl
der rtTA2S-M2 als auch rtTA2S-S2 benutzt werden, um die Expression des Erythropoetins
nach DNA-Mikroinjektion in adulte Mäuse zu regulieren. Beide Varianten zeigten in vivo über
10 Monate eine deutlich niedrigere basale Aktivität und eine sehr hohe Induzierbarkeit
(Lamartina et al., 2002).
In weiteren Untersuchungen konnten das Tet-System auf adeno-
und retroviraler Basis
S
eingesetzt werden. Durch Kombination der tTS mit rtTA2 -M2 oder rtTA2S-S2 wurde
nachgewiesen, dass die Replikation von adenoviralen Vektoren Dox-abhängig gemacht werden
Einleitung
18
kann. Fechner und Mitarbeiter (2003) generierten einen regulierbaren oAdV durch
Kombination von rtTA2S-M2 und tTS zur Regulierung der E1A-Expression in einem E1B-,
E3-deletierten bedingt replikationskompetenten adenoviralen Vektor und zeigten seine
Wirkung in vivo.
1.5.2
Dimerizer-induzierbares Expressionssystem
Das Dimerizer-induzierbare Expressionssystem (Abb. 1.6) basiert auf der Verwendung von
kleinen Molekülen (Dimerizer) mit unterschiedlichen Bindungsstellen, die die Dimerisierung
von zwei verschiedenen Polypeptiden vermitteln. Das am häufigsten verwendete Dimerizerinduzierbare Expressionssystem ist das Rapamycin-induzierbare System (Pollock and
Clackson, 2002). In diesem System induziert Rapamycin die Bildung eines Heterodimers
zwischen dem Immunophilin FKBP12 (einem Protein, das die immunsuppressive Verbindung
FK506 bindet) und der FKBP-Rapamycin-bindenden Domäne (FRB) der Phosphoinositid 3Kinase FRAP (FKBP-Rapamycin-assoziiertes Protein).
Durch Fusion des FKBP mit der DNA-Bindungsdomäne ZFHD1 (ein Hybrid aus Zink-FingerPaar und einer Homeodomäne) und Fusion des FRB mit der aus 190 Aminosäuren bestehenden
Aktivatorregion des p65 (Untereinheit vom humanen NF-κB) dimerisieren beide Proteine in
Abhängigkeit von Rapamycin zu einem Komplex und striggern die Aktivierung des ZFDH1abhängigen Promotors (Pollock and Clackson, 2002).
Es wurde in unabhängigen Studien in vitro gezeigt, dass das Rapamycin-induzierbare System
verglichen mit den anderen regulierbaren Systemen eine sehr geringe basale Aktivität und eine
hohe Induzierbarkeit aufweist (Pollock and Clackson, 2002; Go and Ho, 2002; Senner et al.,
2001; Xu et al., 2003). Diesem scheint zugrunde zu liegen, dass die DNA-Bindungsdomäne
und die Aktivatorregion räumlich getrennt sind (Toniatti et al., 2004). Durch unterschiedliche
Optimierungen wurde das System verbessert und für in vitro und in vivo Untersuchungen
angewandt. Ein Beispiel dafür lieferten Chong und Mitarbeiter (2002), indem sie das
Rapamycin-System verwendeten, um die pharmakologische Kontrolle der Replikation eines
adenoviralen Vektors sowohl in vitro als auch im Maus-Modell mit humanen
Tumorxenograften zu gewährleisten.
Einleitung
19
A
DBD
B
DrB
AD
Poly A
DrB
Poly A
C
Dimerizer
XX
Pmin
Transgen
PolyA
Pmin
Transgen
PolyA
Abbildung 1.6. Dimerizer-regulierbares System. Das System benötigt gleichzeitig drei Expressionskassetten
(A, B, C) in der Zielzelle. Die DNA-bindende Komponente besteht aus der DNA-Bindungsdomäne (DBD) und
der Dimerizer-Bindungsdomäne (DrB). Die Transaktivatorkomponente besteht aus einer Aktivatordomäne
(AD) und einer DrB. Der Dimerizer vermittelt die Heterodimerisierung zwischen beiden Komponenten. Es
entsteht ein Transaktivator-Komplex, der den responsiven Promotor und damit die Transkription aktiviert.
Die Replikation eines adenoviralen Vektors, dessen E1A unter transkriptionaler Kontrolle des
Z12-induzierbaren Promotors stand, konnte um mehrere Zehnerpotenzen in Reaktion auf den
C7-veränderten Rapalog nach Co-Infektion dieses Vektors mit einem anderen Vektor (der den
Rapamycin-abhängigen Transkriptionsfaktor exprimiert) gesteigert werden (Chong et al.,
2002). In einer weiteren Arbeit wurde auf der Basis von AdV das Rapamycin-System
eingesetzt, um die Insulin-Expression in der Mausleber zu regulieren (Auricchio et al., 2002).
Obwohl strenge Regulierbarkeit und hohe Induzierbarkeit des Rapamycin-Systems in vitro und
in vivo bewiesen werden konnten, hat das System einige nicht zu vernachlässigende Nachteile:
Es ist trotz der kurzen Halbwertszeit der Rapamycin-Verbindung von 4,5 h eine Senkung der
Transgen-Expression nur nach mehreren Tagen nach Absetzen des Pharmakons zu erreichen
(Pollock and Clackson, 2002). Außerdem ruft Rapamycin aufgrund seiner Bindung an FRAP
immunsuppressive Eigenschaften hervor (Abraham, 1998; Kahan and Camardo, 2001). Diese
immunsuppressiven Eigenschaften von Rapamycin stellen eine ernstzunehmende Limitierung
dieses Systems für eine klinische Anwendung beim Menschen dar. Eine Weiterentwicklung
dieses Systems ist aus diesem Grund erforderlich.
1.5.3
Kontrolle der Genexpression in Abhängigkeit von Steroid-Hormon-Analoga
Eine weitere Möglichkeit, die Gen-Expression und -Funktionen zu kontrollieren besteht darin,
die Aktivität eines Effektorproteins durch Fusion mit der Hormon-bindenden Domäne (HBD)
von Steroidrezeptoren zu regulieren (Picard et al., 1988; Picard et al., 1990).
Einleitung
20
Die Steroidrezeptoren sind nukleare Hormonrezeptoren, die als Ligand-induzierbare
Transkriptionsfaktoren durch Interaktion mit cis-Enhancer-Elementen (Hormon-response
Elemente genannt) fungieren (Green and Chambon, 1988; Ham and Parker, 1989). Die
Steroidbindung bewirkt eine funktionelle Aktivierung des Steroidrezeptors, Dimerizierung und
spezifische Bindung des Rezeptors an Hormon-Response Elemente (HRE) (Catelli et al., 1985;
Denis et al., 1988). Die Steroidrezeptoren weisen eine konservierte und modular aufgebaute
Organisation auf, die aus einem oder mehreren Kernsignalen (NLS), AD, DBD und HBD
besteht (Evans and Hollenberg, 1988; Godowski and Picard, 1989). Steroidrezeptoren kommen
in den Zellen als große Heterokomplexe vor, die zahlreiche Hitzeschock-Proteine
(insbesondere HSP90 und HSP70) enthalten (Pratt and Toft, 1997). Die Hitzeschock-Proteine
im Heterokomplex bewirken die Faltung der HBD des Rezeptors in eine Konformation, die mit
hoher Affinität die Hormonbindung ermöglicht. Durch Bindung des HSP90 an die HBD wird
die Funktion des Rezeptors reprimiert. Die Bindung der Hormone bzw. des Liganden bewirkt
die Dissoziation mit dem HSP90 und hebt die funktionelle Repression des Rezeptors auf (Pratt
and Toft, 1997). Zahlreiche Genregulationssysteme werden von natürlichen Steroid-basierten
Regulationen abgeleitet. Dabei werden heterologe Proteine durch Fusion mit HBD von
Steroidrezeptoren
hormonabhängig
gemacht.
Die
bessere
molekularbiologische
Charakterisierung und Isolierung verschiedener HBD-Mutanten, die nicht mit ihren natürlichen
Steroiden, sondern mit synthetischen Steroidhormon-Analoga interagieren, machte diese
Strategie vielversprechend für potentielle Ansätze zahlreicher in vitro- und in vivoApplikationen.
1.5.3.1
Progesteronrezeptor-basiertes Regulationssystem
Das am besten charakterisierte System dieser Art wird durch RU486, einen synthetischen
Progesteron (PR)-Antagonisten, der auch als Mifepriston bekannt ist, induziert (Leonhardt and
Edwards, 2002). In diesem System wurde eine RU486-abhängige Chimäre entwickelt, die
ursprünglich aus der DNA-bindenden Domäne des Hefe-Transkriptionsfaktors GAL4 (GAL4DBD),
aus
einer
heterologen
Aktivatordomäne
und
einer
mutierten
HBD
des
Progesteronrezeptors (PR-HBD) besteht (Nordstrom, 2002).
Dieser PR-Mutant wurde durch Deletion der 42 Carboxy-terminalen Aminosäuren von PR
generiert und hat seine Affinität für Progesteron verloren, während die Interaktion mit dem
Progesteron-Antagonisten RU486 erhalten bleibt (Vegeto et al., 1992). RU486 bindet an die
PR-HBD, wodurch der Transkriptionsfaktor an das GAL4-Response Element upstream des
Ziel-Promotors bindet und die Transgenexpression induziert (Abb. 1.7).
Einleitung
21
VP16
GALA
Poly A
PR-LBD
Transaktivator
RU486
Transgen
Poly A
4 GALA
Abbildung 1.7. Progesteron-regulierbares System. Der Transaktivator ist ein Fusionsprotein aus der VP16Transaktivierungsdomäne, der DNA-Bindungsdomäne des Hefe-GAL4-Proteins und aus der LigandBindungsdomäne des Progesteronrezeptors (PR-LBD).
In Anwesenheit von RU486 bindet der Transaktivator nach seiner Expression in der Zielzelle an das 4-GALAElement und aktiviert die Transgenexpression ausgehend vom responsiven Promotor.
Mittlerweile wurde das System hinsichtlich der basalen Expression, der Expressionseffizienz
und der Ligandempfindlichkeit durch weitere Mutationen in der PR-HBD und GAL-DBD und
durch Verwendung der AD aus p65 weiterentwickelt (Abruzzese et al., 2000; Burcin et al.,
1999).
Ye und Mitarbeiter (2002) konnten durch Optimierung des RU486-induzierbaren Systems auf
der Basis eines Helfer-abhängigen adenoviralen Vektors, eine Langzeit-Regulation der
Expression von humanem Wachstumshormon (hGH) in der Maus-Leber erzielen.
Transgene Mäuse mit integrierter Transaktivator-Expressionskassette sowie mit dem humanen
Wachstumshormon unter Kontrolle einer tetramerischen GAL4-DNA-Bindungssequenz
upstream einer TATA-Box zeigten 12 Stunden nach RU486-Applikation eine schnelle
Induktion der hGH-Expression (Wang et al., 1997).
Eine Limitierung dieses Systems besteht in der Natur seines Induktors. Zum einen weist
RU486 eine relativ lange Halbwertzeit von bis zu vier Tagen und eine geringe
Gewebediffusion auf (Serguera et al., 1999; Wang et al., 1997). Zum anderen beeinflusst
RU846, ein Antagonist für Progesteron- und Glucocorticoiderezeptoren, schon bei geringer
Dosierung den Eierstockzyklus (Sarkar, 2002).
1.5.3.2
Östrogenrezeptor-basierte Regulationssysteme
Der Östrogenrezeptor hat sich als interessanter Steroidrezeptor bei der Generierung
chimärischer Proteine mit Ligand-abhängigen Aktivitäten erwiesen. Durch Isolierung
Einleitung
22
zahlreicher muriner und humaner Mutanten, die keine Affinität zum natürlichen Liganden 17β-Östradiol, sondern Interaktionen mit zahlreichen selektiven Östrogenrezeptor-Modulatoren
(SERMs) aufweisen, ergaben sich neue Perspektiven zur Entwicklung regulierbarer Chimären
durch Fusion der mutierten ER-HBD mit Effektor-Proteinen oder Transkriptionsfaktoren
(Danielian et al., 1993;Feil et al., 1986). Tamoxifen (Tam) ist ein sehr gut untersuchter SERM,
eine relativ gut verträgliche synthetische Nicht-Steroidverbindung mit partiellen ERantagonistischen Eigenschaften, die zur Behandlung des ER-positiven Brustkrebses eingesetzt
wird (Jordan, 1997; Goldstein et al., 2000). Tam wird im Körper zu 4-OH-Tam (OHT)
verstoffwechselt, das eine höhere Affinität für die ER-HBD aufweist (Laios et al., 2003).
Littlewood und Mitarbeiter (1995) konnten ein OHT-induzierbares System in vitro entwickeln.
In diesem System wurde ein muriner ER-Mutant (G525R) mit dem c-Myc Protein fusioniert.
Die resultierende Chimäre (Myc-ER) zeigte in Fibroblasten eine stringente OHT-abhängige
Aktivität, während 17-β-Östradiol keinen Einfluss auf die Aktivität der Chimären aufwies.
Viele Arbeitsgruppen haben über eine OHT-abhängige Induktion der Genexpression in vitro
und in Transgenmäusen durch Verwendung der Mer-Cre-Rekombinase berichtet. Die Mer-CreRekombinase ist ein Fusionsprotein aus der mutierten murinen ER-HBD und dem Enzym
CRE-Rekombinase von der Bakteriophage P1 (Feil et al., 1986; Danielian et al., 1998; Indra et
al., 1999; Lam and Rajewsky, 1998; Verrou et al., 1999). Die CRE-Rekombinase initiiert die
Sequenz-spezifische Deletion oder Inversion von DNA-Sequenzen, die durch zwei CREspezifische Erkennungssequenzen (lox) flankiert sind.
1.5.3.3
Ekdyson-basiertes Regulationssystem
Dieses Regulationssystem basiert auf dem Insektensteroidhormon Ekdyson und seinem
Rezeptor, dem Ekdyson-Rezeptor (EcR). Der EcR weist neben seiner transkriptionalen
Aktivationsfunktion einen transkriptionalen Silencer in seiner HBD auf (Ghbeish and
McKeown, 2002). Die Bindung des Liganden bewirkt eine Konformationsänderung des EcR,
die zur Dissoziation des Co-Repressors und Anwerbung von Aktivatoren mit anschließender
Transaktivierung der Gene unter Kontrolle der EcR führt (Ghbeish and McKeown, 2002;
Riddiford et al., 2000).
In seiner natürlichen funktionellen Form liegt der EcR mit dem Insektenprotein Ultraspiracle
(USP) als Heterodimer vor. Es wurden EcR-Mutanten generiert, die in Abhängigkeit von
Muristeron A and Ponasteron A den Retinoid-x-Rezeptor (RxR) statt USP als
Dimerisierungspartner für EcR anwerben (Graham, 2002; Rastinejad, 2001). So konnte in
Zellkultur eine 100.000-fache Induktion der Genexpression bei relativ geringer basaler
Expression erzielt werden (Karns et al., 2001; Karzenowski et al., 2005). In dieser Form basiert
Einleitung
23
das System auf einem Zwei-Hybridsystem, bestehend aus dem RxR und einem Fusionsprotein
aus der GR-DBD, dem EcR und aus der VP16-Aktivatordomäne (Abb. 1.8).
VP16
EcR
Poly A
RXR
Poly A
Ekdyson oder Analogon
Transgen
Poly A
4xECRE
Abbildung 1.8. Ekdyson-regulierbares System. Der Transaktivator besteht aus zwei Komponenten: einem
modifizierten Ekdysonrezeptor (durch Fusion von VP16, einem Ekdysonrezeptor-Mutanten und einer DNABindungsdomäne des Glucocorticoidrezeptors) und einem Retinoid x Rezeptor (RxR).
In Abwesenheit von seinen Liganden ist der Transaktivator inaktiv. In Anwesenheit von Ekdyson bzw. seinem
Analogon (Muristerin) bindet der Transaktivator an vier Wiederholungen des Glucocorticoid receptor response
element (ECRE) im Ziel-Promotor.
Der wesentliche Nachteil dieses Systems besteht darin, dass eine effiziente Aktivierung nur
durch Überexpression des RxR in den Zielzellen möglich ist, was ein Sicherheitsproblem
darstellt (Rastinejad, 2001; Subbarayan et al., 2000). Eine weitere Optimierung des EkdysonSystems wurde durch Verwendung eines chimärischen Drosophila/Bombyx-Ekdysonrezeptors
(DB-EcR) entwickelt, der für die Induktion der Genexpression nicht mehr das RxR, sondern
den Nicht-Steroid-Agonisten benötigt (Hoppe et al., 2000). Auf adenoviraler Basis konnte mit
diesem System eine mehr als 40-fache Induktion der Luciferase-Expression in adulten Ratten
in Abhängigkeit von GS-E, einem synthetischen Bisacylhydrazin, erreicht werden (Hoppe et
al., 2000).
Trotz der höheren Effizienz des Ekdyson-basierten Regulationssystems und obwohl für die
Ekdysteroide noch keine Nebenwirkungen beim Menschen bekannt sind, fand dieses System
bislang aufgrund mangelnder toxikologischer Informationen eine sehr geringe Beachtung für
die Anwendung in der humanen Gentherapie.
1.6
Das Fas/FasL-System und seine Bedeutung in der Tumoreliminierung
Der programmierte Zelltod (Apoptose) ist sowohl für die immunologische Abwehr von
Tumorzellen als auch für die Wirkungen von Chemotherapie und Strahlentherapie von
zentraler Bedeutung. Die Entwicklung und Progression eines Tumors setzen seine weitgehende
Einleitung
24
Apoptose-Defizienz voraus, und viele neue therapeutische Konzepte suchen nach Wegen zur
Überwindung dieser Defizienz. Proapoptotische Gene gewinnen so zunehmend an Bedeutung
in der aktuellen Krebsforschung.
Während Chemotherapeutika und Strahlentherapie den p53-abhängigen intrinsischen
Signalweg aktivieren, der in Krebszellen vielfach blockiert ist, verläuft die durch Immunzellen
induzierte Apoptose über extrinsische Signalwege. Hierbei spielt das Fas/FasL-System eine
wesentliche Rolle. Fas (CD95) ist ein 45 kD Typ Ι-Membranprotein und wird in fast allen
Zelltypen exprimiert. Sein Ligand FasL (CD95L) ist ein 37-40 kD Typ ΙΙ-Membranprotein und
wird in Immunzellen und immun-privilegierten Organen exprimiert (Janssen et al., 2003). Die
Bindung des Todesliganden FasL an seinen Rezeptor Fas induziert eine RezeptorOligomerisierung und führt zur Aktivierung der Initiatorcaspasen 8 und 10, die ihrerseits
entweder direkt die Effektorcaspase-3 aktivieren oder das Signal über den mitochondrialen
Signalweg weiterleiten (Abb. 1.9).
Abbildung 1.9: Fas/FasL-Pathway und Induktion der Apoptose
Hierfür spaltet und aktiviert die Caspase-8 das Bcl-2-Protein Bid, welches in die
mitochondriale Membran transferiert wird und mit Hilfe weiterer Bcl-2-Proteine wie Bax oder
Bak die Freisetzung proapoptotischer mitochondrialer Moleküle wie Cytochrom C bewirkt.
Zytosolisches Cytochrom C initiiert die Bildung eines zytoplasmatischen Proteinkomplexes
(Apoptosom), in dem die Initiatorcaspase-9 aktiviert wird. Durch Caspase-9 wiederum werden
Effektorcaspasen prozessiert und dadurch aktiviert. Effektorcaspasen spalten und inaktivieren
schließlich eine große Zahl von Proteinen (Todessubstrate). Schließlich führen die
Einleitung
25
gemeinsamen Aktivitäten von Caspasen und aktivierten Todessubstraten zur Apoptose (Daniel
et al., 2001; Krammer, 2000; Rieux-Laucat et al., 2003).
Eine interessante Alternative bei der Suche nach synergistischen Therapien stellt die
Expression von proapoptotischen Genen dar. Erste Ergebnisse zeigen, dass sie die Effizienz
der oAdV im Rahmen einer Krebstherapie entscheidend verbessern können (Guo et al., 2006;
Sova et al., 2004). In Lungenkarzinomen z.B. ist der Fas/FasL-Pathway offensichtlich gestört,
wobei als wesentliche Ursachen für die Apoptose-Resistenz von Lungenkarzinomzellen eine
niedrige Fas- bzw. FasL-Expression bzw. Mutationen in diesen Genen angesehen werden
(Boldrini et al., 2002; Uramoto et al., 1999; Viard-Leveugle et al., 2003).
Mit Hilfe von FasL-exprimierenden replikationsdefizienten Adenovektoren konnte in einer
Reihe von Tumorzelllinien die Apoptose induziert und dadurch das Tumorwachstum inhibiert
werden (Hyer et al., 2004; Rubinchik et al., 2001; Sipo et al., 2006; Sudarshan et al., 2005;
Boldrini et al., 2001; Boldrini et al., 2002; Hyer et al., 2000; Rubinchik et al., 2001; Sudarshan
et al., 2005) Der allgemeine therapeutische Erfolg war allerdings oft erst bei einer
vergleichsweise hohen Vektordosis nachweisbar (Hedlund et al., 1999;Hyer et al., 2004;
Kawaguchi et al., 2000; Hedlund et al., 1999; Hyer et al., 2000; Kawaguchi et al., 2000).
Vermutet wird deshalb, dass eher primäre Probleme des Vektortargetings, der in vivoTransduktionseffizienz und schließlich der Transgen-Expression im Tumor für die variable
Effizienz eine Rolle spielen als in vivo-Apoptose-Resistenzen (Rubinchik et al., 2003).
Onkolytische Adenoviren könnten hier durch die Fähigkeit zur Ausbreitung unter primär nicht
infizierten Tumorzellen (Alemany et al., 2000) und der infolge der Virusamplifikation
erzielbaren drastisch erhöhten Transgenexpression (Fechner et al., 2000) Abhilfe schaffen.
Zu beachten bleibt allerdings, dass eine konstitutive adenoviral vermittelte FasL-Expression in
der Leber, ähnlich wie bei der Verwendung von agonistischen Fas-Antikörpern, binnen 24h
zum Tod von Mäusen führt (Okuyama et al., 1998). Deshalb wurden komplexe Vektoren
entwickelt, die mit Hilfe gewebespezifischer und/oder pharmakologisch regulierbarer
Promotoren eine hohe Spezifität und Sicherheit der FasL-Expression gewährleisten (Rubinchik
et al., 2001; Rubinchik et al., 2005). Es gibt allerdings Berichte, wonach einige Tumorarten das
Fas/FasL-System ausnutzen um dem Immunsystem zu entkommen, indem sie die FasExpression herunterregulieren (Houston et al., 2003; Okada et al., 2000) oder den FasL
überexprimieren (Perabo et al., 2001; Zhu et al., 2005) bzw. einen löslichen FasL produzieren
(Strand et al., 2004).
Einleitung
1.7
26
Fragestellung
Onkolytische adenovirale Vektoren (oAdV) haben sich in den letzten Jahrzehnten als
potentielle und vielversprechende Alternative oder Ergänzung zu konventionellen Therapien
gegen Tumorerkrankungen erwiesen. Obwohl sich diese Vektoren durch gentechnische
Manipulationen als stark abgeschwächt in primären Zellen erwiesen haben und in klinischen
Studien von vielen Probanden gut vertragen wurden, kann eine starke Virusreplikation in der
Tumormasse aufgrund der Onkolyse zur Tumor-Nekrose und Ausbreitung der Viruspartikel in
der Blutbahn führen. Die darauffolgende systemische Immunantwort kann zu Komplikationen
führen. Zum anderen führt die Replikation von oAdV zur Vervielfachung der Virusmenge und
zur verlängerten Exposition der Patienten gegenüber dem Virus. Dies würde ein erhöhtes
Risiko einer Virus-induzierten Toxizität zur Folge haben. In Phase II der klinischen Studie mit
replikationsselektiven oAdV traten bei Patienten ungewöhnliche immunologische Reaktionen
und Gefäßschäden auf (Reid et al., 2002). Daher wäre für eine effektive und sichere
Anwendung im Rahmen der Tumor-Virotherapie eine Fortentwicklung der zurzeit verfügbaren
oAdV hilfreich. Die Sicherheit der onkolytischen Viren sollte nicht nur auf ihrer
Tumorselektivität beruhen, sondern es sollten die Vektoren so gebaut werden, dass durch eine
strenge Regulierung eine externe Angriffsmöglichkeit besteht, um die Replikation und die
Vektorenausbreitung in unerwünschten oder unvorhersehbaren Fällen zu mindern oder zu
stoppen. Die bislang erprobten Regulationssysteme zur Kontrolle von oAdV sind sehr komplex
und erfordern neben den zu regulierenden viralen Genen die Co-Expression einer oder
mehrerer Komponenten in der Zielzelle, die meistens nur schwer in einem singulären Vektor
zu inserieren sind.
Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung neuer Tamoxifen-regulierbarer onkolytischer
Adenovirusvektoren (Tam-oAdV) für die Tumorgentherapie. Durch Fusion des adenoviralen
E1A-Proteins mit einer mutierten Hormon-Bindungsdomäne des murinen Östrogenrezeptors
sollte die Aktivität und damit die Replikation eines E1/E3-deletierten Adenovirus, der das
chimärische Protein exprimiert, vom Therapeutikum Tamoxifen (Tam) bzw. 4-HydroxyTamoxifen (OHT) abhängig gemacht werden. Nach Charakterisierung der entwickelten
Vektoren in vitro hinsichtlich ihrer Replikation, ihrer onkolytischen Eigenschaften und ihrer
Regulierbarkeit sollten sie im Rahmen der Tumor-Virotherapie in vivo im Mausmodell mit
humanen Lungentumor-Xenograften angewandt werden. Dabei sollte untersucht werden, ob
das entwickelte Regulationssystem in vivo funktionell ist. Die Vektoren sollten in ihren
Eigenschaften untersucht werden, sich in Abhängigkeit vom Tam bzw. OHT in Tumormassen
produktiv zu vermehren, sich auszubreiten bzw. das Tumorwachstum negativ zu beeinflussen.
Einleitung
27
Weiterhin sollte nach Evaluierung unterschiedlicher CMV-Promotorvarianten hinsichtlich ihrer
basalen Aktivitäten der Promotor mit der niedrigsten Basalaktivität verwendet werden, um den
Todesliganden FasL (CD95-Ligand) zu exprimieren. Darum sollte untersucht werden, ob durch
Komplementierung
mit
OHT-abhängigen
Eigenschaften erhöht werden können.
replikativen
Vektoren
ihre
onkolytischen
Material und Methoden
2
28
Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1
Bakterienstämme
E. coli Sure (Stratagene, USA): (McrA–) D(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 supE44 thi-1
gyrA96 relA1 lac recB recJ sbcC umuC Tn5 (Kanr) uvrC [F' proAB lacIqZDM15 Tn10
(Tetr)]
E. coli DH5α (Vieira und Messing, 1982): F- end A1, hsdR17, (rK-,mK+), supE44, thi-1,
gyrA96, relA1, Δ (argF-laczya) U169, f80dlacZΔM15, λE.coli XL-10 Gold (Stratagene, USA): TetR ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1
supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte [F´ proAB
lacIqZ∆M15 Tn10 (TetR) Amy CamR]
E.coli Top 10 (Invitrogen, USA): F {lacIq Tn10 (TetR)} mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC)
F80lacZM15 lacX74 recA1 deoR araD139 (araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1
nupG
2.1.2
Bakterien-Medien
Medium
Hersteller
LB-Medium
Invitrogen, CA
LB-Agar
Invitrogen, CA
2.1.3
Basis-Plasmide
Name
Selektionsmarker
Hersteller
PCR2.1-TOPO
Ampr, Kanr
Invitrogen, CA
r
r
PCR 4Blunt-TOPO
Amp , Kan
Invitrogen, CA
pTRE2
Ampr
Clontech
pTRE-tight
Ampr
Clontech
pZS2
Ampr
Zeg Sheng, Dallas
2.1.4
Zelllinien
Bezeichnung
Beschreibung
Kultivierungsmedium
HEK 293
humane embryonale Nierenzellen
DMEM (Gibco BRL) *
HeLa
humanes Zervix-Karzinom
DMEM (Gibco BRL) *
H441
humanes Lungen–Adenokarzinom
RPMI + 2µM Glutamin*
Material und Methoden
EA.hy926
29
Hybrid - Zelllinie aus HUVEC und A549
DMEM (Gibco BRL) *
* Wenn nicht anders erwähnt, wurden alle Zellkulturmedien mit 10% FKS (CCPro, Neustadt,
Deutschland) und 1% Penicillin/Streptomycin (Biochrom AG, D) versetzt.
2.1.5
Antikörper
Bezeichnung
Hersteller
Rabbit Ad2 E1A (13s) polyklonaler Antikörper
Santa Cruz
Donkey anti Rabbit IgG F(ab)2-Biotin
Dianova
2.1.6
Enzyme
Bezeichnung
Hersteller
Restriktionsenzyme
New England Biolab (NEB)
DNA-Ligasen
NEB
T4- DNA-Polymerasen
NEB
Proteinase K
Boehringer Mannheim
Pwo-Polymerase
PE Applied Biosystem, USA
Taq-Polymerase
PE Applied Biosystem, USA
Alle Enzyme wurden mit den mitgelieferten Puffern entsprechend den Herstellerangaben
eingesetzt.
2.1.7
Oligonukleotide
Bezeichnung
Sequenz
Ad5 4600 A
5´- gaa tgc atg gaa aat ctt gg
GAPDH 682T
TAM-5´- caa gcc tgt ggg caa ggt - 3´
E1A-119-F
FAM-5´- ggt tca aaa tgg cta gga g - 3´
E1A-120A
5´- tgg ttc aaa atg gct agg aga tca gcc agt acc tct tca a - 3´
Mer-SalI-NheI-2100a
5´- cta gct agc tta gtc gac gat cgt gtt ggg gaa gcc - 3´
E1A NheI 2958as
5´- acc gct agc tgg cct ggg gcg ttt aca gct c - 3´
Mer-HindIII-3941as
5´- cag aag ctt tca gat cgt gtt ggg gaa gcc - 3´
Mer-NheI 2958s
5´- cca gct agc ggt tct gga gat cca cga aat gaa atg ggt gc - 3´
Mer-BamHI-1112s
5´- tac gga tcc tgc ctg cac acc atg gga gat - 3´
Ad5-324sBglII
5´- tct aga tct ttt gtg tta ctc ata gcg cg - 3´
Ad5-3315s
5´.- tga cat gac cat gaa gat ct - 3´
E1A 1s
5´- atg aga cat att atc tgc ca - 3´
Material und Methoden
E1A as
5´- cgc gct agc tta tgg cct ggg gcg tt - 3´
E1AdelNLS
5´- cta gct agc gca ttc tct gga cac agg tg - 3´
bGH-SpeI-Bgl IIas
5´- ata aga tct act agt ccc cag ctg gtt ctt tcc - 3´
E1a 2108 SalIs
5´- gat cgt cga cct gca gac cat gag aca ata tta tct gcc acg g - 3´
Luc-426F
FAM-5´.- agc aat tgt tcc agg aac ca - 3´
pZS2-3´UTRa
5´- tgg ctg gca act aga agg c - 3´
GAPDH-826A
5.- cac cac ctt ctt gat gtc atc a - 3´
Ad5 324s BglII
5´- cct cta gat ttt tgt gtt act cat agc gcg - 3´
BA-1371s
5´- aag gat tcc tat gtg ggc g - 3´
BA-2307as
5´- ctc ctt aat gtc acg cac ga - 3´
E1A-Seq
5´.- cgg cca ttt ctt cgg taa ta - 3´
bGH s-HindIII
5´- cgg gga tcc aat gag aca tat tat ct - 3´
bGH-SpeI-BglII as
5´ - ata aga tct act ccc cag ctg gtt ctt tcc - 3´
E1-1-XhoI
5´- gag ctc gag cat cat caa taa tat acc - 3´
CMV-BamHI A
5´- tct gga tcc gcg acc gga tct gac ggt tca cta aa - 3´
CMV-tata BamHI A
5´- ata tgg atc cag ctt ata tag gcg acc cgg gta ccg agc tcg a - 3´
TRE3596s
5´- ggt tat tgt ctc atg agc gga tac a - 3´
Ad-5-end-SalI A
5´- gcg tgt cga cgttta aac tat tac gcg cta tga gta - 3´
Tight-KpnI A
5´- tcc cac cgt aca cgg gta cc - 3´
2.1.8
Geräte
ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer, Wellesley, USA)
Agarosegel-Kammer Hoefer® HE 33 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden)
Axiovert 25 Mikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland)
Brutschrank Modell 5420 (Labotect Labortechnik, Göttingen, Deutschland)
Centrifuge 5415D und Centrifuge 5415R (Eppendorf, Hamburg, Deutschland)
DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, Wellesley, USA)
Elektrophoreseeinheit PP3000 (Biometra GmbH, Göttingen, Deutschland)
Feinwaage BL 310 (Sartorius, Göttingen, Deutschland)
Gene Amp® PCR System 9700 (PE Applied Biosystems, Foster City, USA)
Heizplatte IKAMAG® RH (Janke & Kunkel IKA-Labortechnik, Staufen, Deutschland)
Hybridisierungsofen Compact Line OV 4 (Biometra GmbH, Göttingen, Deutschland)
Immunfluoreszenzmikroskop Olympus IX 50 (Olympus, Tokyo, Japan)
Kamera Coolpix 990 (Nikon, Tokyo, Japan)
Lumat LB 9501 (Berthold Technologies GmbH, Bad Wildbad, Deutschland)
NanoDrop® ND-1000 Spectrophotometer (Peqlab, Erlangen, Deutschland)
pH-Meter HI 8314 membrane pHmeter (HANNA intruments, Woonsocket, USA)
Pipetten (Eppendorf, Hamburg, Deutschland, und Gilson, Middleton, USA)
QC 2000 (Bioscan, Washington, USA)
30
Material und Methoden
31
Thermomixer 5436 (Eppendorf, Hamburg, Deutschland)
Transilluminator BioDoc Analyze (Biometra GmbH, Göttingen, Deutschland)
TRIO-Thermoblock (Biometra GmbH, Göttingen, Deutschland)
UV Stratalinker®1800 (Stratagene, LaJolla, USA)
Vortex-Genie 2 (Scientific Industries Inc., Bohemia, USA)
Wasserbad (Memmert GmbH, Schwabach, Deutschland)
Zentrifuge Avanti™J-25 (Beckman Coulter, Fullerton, USA)
Zentrifuge Varifuge RF (Heraeus Sepatech, Osterode, Deutschland)
2.2 Arbeiten mit Bakterien
2.2.1
Herstellung chemokompetenter Bakterien
Chemokompetente Zellen wurden für die Transformation von Bakterien hergestellt. Dazu
wurden die tiefgefrorenen Zellen aus - 80°C entnommen und mit einer Impföse abgekratzt
und auf Agar-Platten ausgestrichen. Die Platten wurden dann bei 37 °C über Nacht inkubiert.
Danach wurden 5 ml LB-Medium im 15 ml-Falcon-Röhrchen mit einer einzigen Kolonie von
einer Agar-Platte beimpft und über Nacht bei 37°C schüttelnd inkubiert. Mit 500 µl dieser
Kultur wurden 50 ml LB-Medium im Kulturkolben beimpft und bei 37°C schüttelnd bis zu
einer OD600 von 0,5 vermehrt (frühe log-Wachstumsphase). Die Bakterienkultur wurde
anschließend in ein 50 ml-Zentrifugen-Röhrchen überführt, für 10 Minuten auf Eis inkubiert,
bei 4°C zentrifugiert (4000 RPM, 5 min) und das Zellpellet in 50mM CaCl2-Lösung
resuspendiert. Nach erneuter Inkubation (15 min auf Eis) wurden die Zellen 5 Minuten
zentrifugiert (4°C, 5000 RPM) und das Pellet in 2 ml kalter 50 mM CaCl2-Lösung
resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen für 2 Stunden auf Eis gestellt, mit 20%
Glycerin versetzt, in vorgekühlten 1,5 ml-Röhrchen aliquotiert (50 - 200 µl Volumen) und
bei –80 °C gelagert. Alle Zentrifugationsschritte erfolgten in der Zentrifuge Avanti™J-25
(Beckman).
2.2.2
Herstellung elektrokompetenter Bakterien
Elektrokompetente Zellen eignen sich zur Transformation durch Elektroporation.
Zur Herstellung elektrokompetenter Zellen wurden 50 ml LB-Medium im 200 mlKulturkolben mit 500 µl einer Bakterien-Übernachtkultur beimpft (wie oben beschrieben)
und bis zu einer OD600 von 0,5 schüttelnd inkubiert. Die Kultur wurde dann in 50 mlZentrifugen-Röhrchen überführt und 10 Minuten auf Eis belassen. Es folgten
Zentrifugationsschritte von jeweils 10 Minuten bei 5000 RPM und bei 4°C in der Zentrifuge
Avanti™J-25. Zuerst wurde die auf Eis abgekühlte Kultur zentrifugiert, das
Material und Methoden
32
Zellpellet in 50 ml einer 5%igen Glycerin-Lösung resuspendiert und noch einmal
zentrifugiert, Anschließend wurde das Zellpellet in 20 ml Glycerin-Lösung (5%)
resuspendiert, erneut zentrifugiert, und in 2 ml Glycerin-Lösung (5%) resuspendiert und
zentrifugiert. Darauf wurde das Zellpellet in 2 ml einer 10%igen Glycerin-Lösung wiederum
resuspendiert und die Zellsuspension in 50 µl-Aliquots in vorgekühlte Eppendorf-Röhrchen
verbracht und bei - 80°C gelagert. Die Zellen wurden abschließend auf ihre
Transformationskompetenz überprüft, indem ein Aliquot mit 50 ng einer reinen PlasmidDNA transformiert wurde.
2.2.3
Transformation elektrokompetenter Bakterien
Zum Einschleusen fremder DNA-Moleküle in Bakterien-Zellen durch Elektroporation
wurden 50 µl elektrokompetenter Zellen schnell aufgetaut, mit 3 µl DNA-Lösung aus dem
Ligationsansatz (Kap. 2.4.3) versetzt und auf Eis gestellt. Der Ansatz wurde auf 100 µl mit
sterilem
entionisiertem
Elektroporationsküvette
Wasser
überführt.
aufgefüllt
Die
und
luftblasenfrei
Küvette
wurde
in
dann
eine
in
sterile
die
Elektroporationsapparatur gestellt und der elektrische Impuls bei 2,5 kV (für die 0,2 mm
Küvette) bzw. 1,8 kV (für die 0,1 mm Küvette) und bei 200 Ω ausgelöst. Die Zellen
wurden danach in 1 ml LB-Medium aufgenommen und für 60 min bei 37°C schüttelnd
(200 RPM) vorinkubiert. Die Zellsuspension wurde anschließend unverdünnt oder in
geeigneter Verdünnung auf Agar-Platten mit entsprechendem Antibiotikum (Ampicillin
oder Kanamycin) ausplattiert. Die Platten wurden dann für 18 bis 24 Stunden bei 37°C im
Brutschrank inkubiert.
2.2.4
Transformation chemokompetenter Bakterien
Zur Transformation chemokompetenter Zellen wurden 50 bis 100 µl Zell-Aliquot schnell
aufgetaut, mit 10 bis 25 µl DNA-Lösung aus dem Ligationsprodukt versetzt und das
Gemisch wurde für 10 bis 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock für 30 bis 60 s
(je nach Bakterienstamm) bei 42°C im Wasserbad wurde der Ansatz für eine weitere Minute
auf Eis inkubiert. Dann wurde die Zellsuspension in 250 µl (E. coli Top 10) bzw. 900 µl
(andere Stämme) LB-Medium aufgenommen und in Falcon-Röhrchen 30 min bis 60 min bei
37°C Schüttelnd vorinkubiert. Die Zellsuspension wurde unverdünnt oder in geeigneter
Verdünnung auf Agar-Platten mit Selektionsmedium ausplattiert und anschließend für 18 bis
24 Stunden bei 37°C im Brutschrank inkubiert.
Material und Methoden
2.2.5
33
Konservierung von Bakterienzellen
Zur Konservierung von Bakterienzellen wurden 5 ml LB-Medium mit einer einzigen
isolierten Kolonie beimpft, die dann über Nacht bei 37 °C kultiviert wurde. Abschließend
wurde 1 ml aus der Übernacht-Kultur in ein steriles Eppendorf-Cryo-Röhrchen (Eppendorf,
Deutschland) überführt, mit Glycerin versetzt (Endkonzentration 20 %) und bei – 80 °C
eingefroren.
2.3 DNA-und RNA-Techniken
2.3.1
DNA-Isolation aus Bakterien
2.3.1.1 Plasmid-Präparation in kleinem Maßstab (Minipräparation)
Diese Methode diente der schnellen Isolierung von Plasmid-DNA aus den Bakterienzellen.
Dazu wurden 2 bis 5 ml LB-Medium in ein 15 ml-Röhrchen überführt, mit Antibiotikum
versetzt (Ampicillin 100 µg/ml bzw. Kanamycin 50 µg/ ml) und anschließend mit einer
Bakterienkolonie angeimpft. Der Ansatz wurde über Nacht bei 37°C schüttelnd (225 RPM)
inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde aus 1,5 ml Zellsuspension mittels Plasmid
Minipräparation Kit (Peqlab Biotechnologie GmbH, Deutschland) entsprechend den
Angaben des Herstellers isoliert.
2.3.1.2 Plasmid-Präparation in großem Maßstab (Maxipräparation)
Die Maxipräparation von Plasmid-DNA erfolgte nach dem Qiagen-Protokoll-Kit (Qiagen,
Deutschland). Diese Methode diente der Isolierung nicht nur von größeren DNA-Mengen,
sondern auch von hochreiner DNA, die für die Klonierung sowie für die Transfektion von
Säugetierzellen verwendet wurden. Dabei wurden 150 ml LB-Medium im Erlenmeyerkolben
(mit Ampicillin 100 µg/ml bzw. Kanamycin 50 µg/ml versetzt) mit einer einzigen
Bakterienkolonie beimpft und über Nacht bei 37°C schüttelnd (250 RPM) inkubiert. Die
Zellsuspension wurde in 50 ml Falcon-Rörchen überführt und 10 min bei 5000 RPM
zentrifugiert. Die Plasmid-Isolierung wurde entsprechend den Angaben des Herstellers
(Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Alle Zentrifugationsschritte erfolgten in der
Zentrifuge Avanti™J-25 (Beckman).
2.3.2
Isolierung eukaryontischer DNA
Die Isolierung genomischer DNA aus Zellen erfolgte mittels E.Z.N.A. Tissue DNA Kit II
(peQLab Biotechnologie GmbH, Deutschland). Dazu wurde das Kulturmedium abgesaugt
und die Zellen auf Zellkulturplatten mit dem vom Hersteller mitgelieferten
Material und Methoden
34
Lyse-Puffer lysiert. Danach wurde die DNA nach Angaben des Herstellers weiter präpariert.
2.3.2.1 Isolierung viraler DNA
Zur Lyse der adenoviralen Partikel wurden zu der Adenovirus-Suspension 50 µl 10xTEPuffer*1, 50 µl Proteinase K*2 (5mg/ ml) und 50 µl einer 10%igen DNase-freien SDSLösung (Sigma) gegeben. Der Ansatz wurde 2-3 Stunden bei 56 °C inkubiert, die virale
DNA durch Phenol-Chloroform extrahiert (Kap. 2.3.3) und in 30 µl TE-Puffer gelöst.
*1TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0, autoklaviert
*2Proteinase K (Sigma): 5 mg/ ml in sterilem Wasser, Lagerung bei -20 °C
2.3.2.2 Isolierung gesamter RNA aus eukaryotischen Zellen
Zur Isolierung von Gesamt-RNA wurde aus der Kulturplatte das Medium abgesaugt. Die
Trizol-Lösung (Invitrogen life technologies, UK) wurde auf die Zellen gegeben, durch Aufund Abpipettieren durchmischt und das Zelllysat in 2 ml Eppendorf-Röhrchen überführt. Die
RNA wurde nach Angaben des Herstellers isoliert, in 30 µl RNase-freiem Wasser (DEPCWasser, USB Corporation Cleverland, USA) gelöst, 10 min bei 60 °C inkubiert und
anschließend weiterverwendet oder bei – 80 °C gelagert.
2.3.3
DNA-Extraktion durch Phenol-Chloroform
Die DNA-haltigen Zell- bzw. Viruslysate wurden mit einem Volumenteil (Vol) einer
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung (24:25:1) versetzt, eine Minute geschüttelt und
zentrifugiert. Die obere wässrige DNA-haltige Phase wurde in ein frisches steriles Röhrchen
überführt und mit einem Vol Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) versetzt. Der Ansatz wurde 1
min geschüttelt und erneut zentrifugiert. Die obere wässrige DNA-haltige Phase wurde in ein
frisches Röhrchen überführt und mit Ethanol gefällt (Kapitel 3. 2.7).
Alle Zentrifugationsschritte erfolgten in der Tischzentrifuge (Eppendorf, Deutschland) für 5
min bei 12000 x g.
2.3.4
DNA-Extraktion aus Agarosegel
Die Reinigung von DNA-Fragmenten (z.B. PCR-Produkte oder Restriktionsfragmente)
erfolgte mit dem Gel extraction Kit (Qiagen, Hilden). Die DNA-Proben wurden
elektrophoretisch auf Agarosegel getrennt. Das gewünschte Fragment wurde mittels eines
Skalpells ausgeschnitten und entsprechend den Angaben des Herstellers gereinigt.
Material und Methoden
2.3.5
35
DNA-Fällung
Die Fällung diente zur Aufkonzentrierung von DNA-Proben. Dazu wurde die DNA-Lösung
mit 0,1 Vol einer 1 M NaCl- oder 3 M Natriumacetat- Lösung und mit 2 Vol absolutem
Ethanol versetzt. Der Ansatz wurde durchmischt und mindestens 15 min oder über Nacht bei
– 20 °C gelagert. Es folgte die Zentrifugation für 15 min bei 12000 RPM. Das Pellet wurde
mit 400 µl 70%igem Ethanol gewaschen und 5 min bei 12000 RPM erneut zentrifugiert.
Nach Lufttrocknung 10 min bei Raumtemperatur (RT) wurde das DNA-Pellet in sterilem
destilliertem Wasser oder in TE-Puffer gelöst.
2.3.6
Trennung von DNA-Molekülen durch Ultrazentrifugation auf SucroseGradienten
Diese Methode wurde eingesetzt, um Adenovirus-long- arm (nt 3333-36000) vom short-arm
(nt 1-570) nach Restriktion von RR5-DNA mit XbaI voneinander zu trennen. Dazu wurden
10, 15, 20, 25, 30, 35 und 40%ige Sucrose-Lösungen in TE-NaCl-Puffer* hergestellt. Es
wurden 1,5 ml der 10%igen Lösung in ein 11 ml Polyallomar centrifuge tube (Beckman)
pipettiert und nacheinander mit 15, 20, 25, 30, 35 und 40%iger Sucrose-Lösung
unterschichtet. In der Regel wurden 0,5 bis 1 ml DNA-Lösung vorsichtig auf die 10%ige
Schicht pipettiert und die Proben in einer Beckman-Ultrazentrifuge (Coulter-Optima LE80K
mit einem SW41 Ti Rotor) bei 22000 RPM für 20 h bei 20°C zentrifugiert. Anschließend
wurde das Röhrchen von Boden her ausgepumpt und 25 Fraktionen á 500 µl genommen. Ein
10 µl-Aliquot jeder Fraktion wurde elektrophoretisch auf 0,8 %igem Agarosegel analysiert.
Die Fraktionen mit den gewünschten DNA-Banden wurden gesammelt und mit 3 Vol
destilliertem Wasser verdünnt und gefällt (Kap. 2.3.5).
*
TE-NaCl Puffer: 10mM Tris, 10mM EDTA, 10mM NaCl
2.3.7
Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren
2.3.7.1 Auftrennung von DNA
In einer Gelmatrix wandern die Nukleinsäuren nach Anlegen einer gleichen Spannung (in
einem elektrischen Feld) auf die Anode zu, wobei die kleineren Fragmente schneller als
größere Fragmente wandern. Dies bildet das Prinzip der Gelelektrophorese.
DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese auf Agarosegel getrennt. Die Gelkonzentration
wurde abhängig von den zu trennenden Fragmentgrößen gewählt (Tab. 2.1). Als Längenmarker
wurden je nach der Größe der zu trennenden DNA verschiedene DNA-Leiter (1kb-DNA-Leiter
Material und Methoden
36
für Fragmente größer als 1 kb und DNA-Leiter Mix für Fragmente kleiner als 500 bp)
verwendet.
Zur Herstellung des Gels wurde die entsprechende Menge an Agarose in 1xTAE-Puffer* gelöst
und bis zum Schmelzen in einer Mikrowelle (Bosch, Deutschland) erhitzt. Diese Lösung wurde
auf
ca.
60°C
temperiert
und
eine
Ethidiumbromid-Lösung
(Sigma)
zugegeben
(Endkonzentration von 0,005%) und in die Gelkammer (Pharmacia Biosciences, Uppsala,
Schweden) gegossen. Nach vollständiger Verfestigung wurden die Kämme entnommen und
das Gel in die Elektrophorese-Apparatur (Pharmacia Biosciences, Uppsala, Schweden) gestellt,
die DNA-Proben mit DNA-Loading-Puffer (PeqLab Biotechnologie GmbH, Germany)
vermischt (10:1), aufgetragen und die Trennung bei 140 Volt, 200 mA in 1xTAE-Puffer
durchgeführt. Anschließend wurden die DNA im Transilluminator (Biometra) visualisiert.
*
50x TAE-Puffer: 2 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 8,0
Tabelle 2.1. Agarosegel-Konzentration in Abhängigkeit von Fragmentgrößen
DNA-Fragmentsgröße Agarose-Konzentration
≤ 0,5 kb
0,5 bis 10 kb
≥ 10 kb
1,2 %
1%
0,8 %
2.3.7.2 Auftrennung von RNA
RNA-Moleküle wurden durch Elektrophorese auf Formaldehyd-Agarosegelen voneinander
getrennt. Dazu wurden 10 bis 20 µg gesamte RNA in 5 µl des mit 0,001 µl EthydiumbromidStammlösung (10 mg/ ml) versetztem RNA-Ladepuffers*1 gemischt, 5 min bei 65°C erhitzt
und schnell auf Eis verbracht. Die Proben wurden dann auf das Gel aufgetragen und die RNATrennung erfolgte mit 1x MOPS-Puffer*2 für etwa 1 h bei 140 V. Die RNA wurde
anschließend im Transilluminator auf ihre Qualität und Integrität hin begutachtet.
Zur Herstellung des Formamid-Agarosegels wurden 1,2 % Agarose in 5/6 Vol 1x MOPSPuffer aufgekocht und auf 60 °C abgekühlt, bevor 1/6 Vol 38 % Formaldehyd (2,2 M
Endkonzentration) zugegeben wurden. Das Gel wurde dann in die Gelkammer gegossen und
bis zur Verfestigung bei RT belassen.
*110x RNA-Ladepuffer: 720 µl Formamid, 80 µl gesättigte Bromphenolblau-Lösung, 180 µl 38 %-ige
Formaldehyd-Lösung (Sigma),160 µl 10x MOPS-Puffer, ad 1500 µl A. bidest.
*210x MOPS-Puffer: 50 mM Natriumacetat, 10 mM EDTA, 200 mM MOPS, pH 7,0
Material und Methoden
2.3.8
37
Bestimmung der Nukleinsäurenkonzentration
2.3.8.1 Photometrische Konzentrationsbestimmung
Die DNA- und RNA-Konzentrationen wurden im Genesis 6-UV-Photometer (Thermo electron
corporation, USA) nach entsprechender Verdünnung gemessen.
Nukleinsäuren zeigen aufgrund der Purin- und Pyrimidinbasen in ihren Sequenzen eine starke
Absorption mit einem Maximum bei 260nm im UV-Bereich. Die Messung der Absorption
wässriger DNA- oder RNA-Lösungen bei 260nm in einer Quarzküvette gegen Wasser als
Referenz lässt näherungsweise folgende Beziehung zur Nukleinsäurekonzentration zu:
Nukleinsäurekonzentration (µg/ml) = Faktor x A260, wobei der Faktor bei DoppelstrangDNA 50, bei Einzelstrang-RNA oder -DNA 40 und bei Oligonukleotiden 20 ist. Diese
Angaben beziehen sich auf RNA-freie DNA bzw. auf DNA-freie RNA. Als Verunreinigungen
treten häufig auch Phenolreste oder Proteine auf, die stark bei 280 nm absorbieren. Die
Reinheit der Präparation lässt sich aus dem Quotienten von A260/A280 abschätzen.
Für eine hinreichende Reinheit der isolierten Nukleinsäuren gelten dabei folgende Richtwerte:
E260/E280 ≥1,8
E260/E230 ≥2,2
2.3.8.2 Konzentrationsbestimmung mittels Agarose-Gelelektrophorese
Zur Bestimmung der DNA-Konzentration durch diese Methode wurde ein Aliquot der
DNA-Probe auf ein Agarosegel aufgetragen. Zum Vergleich wurde eine DNA-ReferenzProbe mit bekannter Konzentration aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde die
Konzentration der DNA-Probe durch Vergleich mit der DNA-Referenz-Probe abgeschätzt.
2.4 Klonierung von DNA
2.4.1
Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonukleasen vom Typ II erkennen spezifisch palindromische Tetra- bis
Oktanukleotidsequenzen und hydrolysieren die doppelsträngigen DNA innerhalb dieser
Erkennungssequenzen.
Dabei entstehen entweder glatte („blunt-ends“) oder 5´- bzw. 3´-überhängende („stickyends“) Enden.
Die Restriktionen wurden für alle Experimente nach den Angaben des Herstellers (NEB,
Frankfurt, Deutschland) in den jeweils mitgelieferten Puffersystemen durchgeführt. Für einen
Restriktionsansatz wurde ein gesamtes Volumen von 20 µl für 0,5 – 1 µg DNA, 50 -100 µl
Material und Methoden
38
für 3 – 10 µg DNA und 500 - 1000 µl für DNA-Mengen höher als 10 µg verwendet. Die
Restriktionsansätze wurden zwischen 2 und 24 h bei entsprechender Temperatur inkubiert.
2.4.2
Dephosphorylierung von DNA-Molekülen
Um eine Religation von Plasmiden bzw. Virusgenomabschnitten bei der Ligation zu
verhindern, wurden DNA-Restriktionsprodukte an ihren 5´-Enden dephosphoryliert.
Dazu wurde zur Inaktivierung des Restriktionsenzyms der Restriktionsansatz 20 min bei 70
°C inkubiert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur (10 min) wurden 0,1 U Calf Intestinal
alkalinische Phosphatase (Roche, Mannheim) pro µg Plasmid-DNA zugegeben und die Probe
für weitere 60 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA-Lösung
(Endkonzentration: 5 mM) und 20-minütiges Erhitzen bei 75 °C gestoppt. Zur Entfernung der
alkalischen Phosphatase wurden die Dephosphorylierungsprodukte elektrophoretisch auf
Agarosegel aufgetrennt und das entsprechende Fragment wurde aus dem Gel extrahiert (für
Klonierungszwecke) bzw. auf Sucrose-Gradient gereinigt (long arm des Adenovirus).
2.4.3
Ligation von DNA-Fragmenten
Die Ligationsreaktionen wurden mit dem zur DNA-Ligase mitgelieferten Puffersystem nach
Angaben des Herstellers durchgeführt. Dazu wurden für Klonierungszwecke 50 bis 100 ng
linearisierten Plasmids mit 50 ng DNA-Fragment zusammenpipettiert (1:1- bzw.2:1Verhältnis) und in einem Gesamtansatz von 20 µl mit 0,5 - 1 U T4-DNA-Ligase (NEB,
Frankfurt, Deutschland) und mit 2 µl des entsprechenden 10x Puffers für 4 h bei RT oder über
Nacht bei 16 °C inkubiert. Für in vitro Ligation der Adenovirus-DNA wurden in einem 40 µl
Reaktionsansatz 1 µg des adenoviralen XbaI-long arm, 500 ng des linearisierten ShuttlePlasmids, 1U DNA-Ligase (Stratagene, Kanada) und 4 µl des mitgelieferten Puffersystems
zusammenpipettiert. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4 °C.
2.4.4
Herstellung von glatten Enden an DNA-Fragmenten
Für die Klonierung von DNA-Fragmenten, deren Enden nicht kompatibel waren, wurden zur
Generierung glatter Enden die 3´-überhängenden Enden abgebaut und die 5´-überhängenden
Enden aufgefüllt. T4-DNA- Polymerase (NEB, Frankfurt, Deutschland), ein Enzym mit
ausgeprägter 3´→ 5´-Exonuklease- und mit 5´→ 3´-Polymeraseaktivität, wurde zu diesem
Zweck eingesetzt. Zum Restriktionsansatz wurden Desoxyribonukleotide (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP) zu einer Endkonzentration von 100 µM gegeben und die Reaktion mit 1 U T4DNA-Polymerase bei 12 °C für 20 min
Material und Methoden
39
gestartet. Anschließend wurde der Ansatz für 20 min bei 65 °C zur Inaktivierung des Enzyms
inkubiert.
2.5 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde zur Amplifizierung und zum Nachweis
spezifischer
DNA-Fragmente
eingesetzt.
In
Abhängigkeit
von
Primer-Längen,
Basenzusammensetzung und von der Länge und Struktur der zu amplifizierenden DNAMatrix wurde die PCR-Reaktion mit unterschiedlichen DNA-Polymerasen und unter
verschiedenen PCR-Bedingungen durchgeführt. Für Klonierungszwecke wurden DNAMatrizen mit wiederholten Sequenzen mit pwo-Polymerase (PE Applied Biosystems, CA,
USA), eine DNA-Polymerase mit Proof Reading Eigenschaften, amplifiziert. Übliche PCRReaktionen erfolgten mit Taq Polymerase (PE Applied Biosystems, CA, USA). Die
Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes sowie die Reaktionsbedingungen sind in den
Tabellen 2.2 und 2.3 angegeben. Die PCR erfolgte im Gene Amp Thermocycler 9700 (PE
Applied Biosystems, CA, USA).
Tabelle 2.2: Zusammensetzung eines PCR-Reaktionsansatzes
Reagenzien
10x Polymerasepuffer
dNTPs (10mM)
Forward-Primer (100µM)
Reverse-Primer (100µM)
DNA-Template (a)
DNA-Polymerase (5U/ µl)
A. bidest.
25 µl -Reaktionsvolumen
2,5 µl
0,5 µl
0,25 µl
0,25 µl
x µl
0,25 µl
Ad 25 µl
50 µl -Reaktionsvolumen
5 µl
1 µl
0,5 µl
0,5 µl
x µl
0,5 µl
Ad 50 µl
(a) Üblicherweise wurden entsprechend der Konzentration der DNA-Lösung 0,2- 0,5 µg
zugegeben.
Tabelle 2.3:Reaktionsbedingungen der PCR
Reaktionsschritt für 18 bis 40 Zyklen
Initiale Denaturierungstemperatur
Denaturierungstemperatur
Annealingstemperatur
Synthese
Finale Extension
Kühlung
Temperatur
94 °C
94 °C
55 °C - 60 °C
72 °C
72 °C
4 °C
Zeit
4 min
45 s
30 s
30 s bis 2 min
5 min
∞
Material und Methoden
40
2.6 Sequenzierung von DNA
Alle im Rahmen dieser Arbeit klonierten und untersuchten Plasmid-Konstrukte wurden durch
Sequenzierung der jeweiligen Expressionskassetten auf Mutationen überprüft. Für die
Sequenzierung der Plasmide und Vektor-DNA wurden 0,4 µg bis 1 µg DNA verwendet, 1 µl
Verdünnungspuffer (Applied Biosystems, CA, USA) und 1 µl Sequenzierungsprimer (10 µM)
zugefügt und mit A. bidest. auf 8 µl aufgefüllt. Nachdem der Reaktionsansatz 4 min bei 98°C
im Gene-Amp-Thermocycler 9700 erhitzt worden war, wurden 2 µl Big Dye Prämix (PE
Applied Biosystems, CA, USA) zugegeben und die PCR-Reaktion über 25 Zyklen unter
folgenden Bedingungen durchgeführt:
Reaktionsschritt
Denaturierung
Annealing
Extension
Kühlung
Temperatur
96°C
50°C
60°C
4°C
Zeit
10 s
5s
4 min
∞
Im Anschluss an die PCR-Reaktion wurde die DNA für die Sequenzierung aufgearbeitet.
Dazu wurden 90 µl A. bidest, 10 µl 3M Natriumazetat-Lösung (pH 4,8; Merck) und 250 µl
absoluter Ethanol (Mallinckrodt Baker) zum PCR-Ansatz gegeben und 15 min bei 14000
RPM in der Tischzentrifuge (Eppendorf, Deutschland) zentrifugiert. Der Überstand wurde mit
Hilfe einer Wasserstrahlpumpe abgenommen, das DNA-Pellet mit 400 µl 70%igem Ethanol
gewaschen. Das DNA-Pellet wurde 5 min bei 56°C getrocknet und in 30 µl A. bidest. gelöst.
Die Detektion und Auswertung erfolgten mit Hilfe des Gene Analyzer ABI 310 KapillarSequenzerautomaten (PE Applied Biosystems, CA, USA) unter Verwendung der ABI DNA
Sequencing Analysis Software.
2.7 Quantitative kompetitive PCR
Die semi-quantitative kompetitive PCR (QKPCR) wurde eingesetzt, um die Menge
adenoviraler DNA in infizierten Zellen zu bestimmen. Dazu wurde zunächst jeweils ein
verkürzter Längenstandard (vLS) für die zu messende Adenovirus-DNA und für die zelluläre
GAPDH- DNA generiert.
2.7.1
Generierung des verkürzten Längenstandards
Der verkürzte E1A-Längenstandard (E1A-vLS) für QKPCR wurde mittels PCR hergestellt.
Zunächst wurde eine 120bp-große Region auf der E1A-cDNA (nt 1 - 120) gewählt und dafür
zwei Primer entworfen. Der Forward-Primer (E1A 1s) überspannte die Nukleotide 1 - 20 der
adenoviralen E1A-cDNA. Der Reverse-Primer (E1A 120as) überspannte die Nukleotide 70 -
Material und Methoden
41
120, wobei er für die Nukleotide 90-100 eine Deletion aufwies. Dies führte dazu, dass das
Amplifikat nach der PCR um 10 nt kleiner war als die originale E1A-Region. Dadurch
konnte nach der PCR das E1A-vLS vom spezifisch nachzuweisenden nativen DNAFragment unterschieden werden (Abb. 2.1). Die PCR-Produkte wurden auf 2%igem
Agarose-Gel getrennt, das 110 bp-große Fragment (E1A-vLs) extrahiert und durch
Sequenzierung überprüft. Anschließend wurde das E1A-vLs in DEPC-Wasser zu einer
Endkonzentration von 1ng/ µl gelöst, dekadisch bis 10-9 verdünnt und bei – 20°C gelagert.
Die verkürzten Längenstandards für die zelluläre GAPDH-kodierende DNA sowie für
Luciferase-DNA (Luc-vLs) waren bereits im Labor vorhanden (Fechner et al. 1999, Fechner
et al., 2003).
Nukleotideposition :
1
90
E1A 1s
E1A 119as
PCR
1
119
100
Deletion
90-100
119
E1A-vLS (109 bp)
Abbildung 2.1: Generierung von E1A-verkürztem Längenstandard mittels PCR. Die zu deletierende
Sequenz (Nukleotide 90-100) ist blau und die zu amplifizierende Region orange angezeigt. ForwardPrimer (E1A 1s), Reverse- Primer (E1A 119as).
2.7.2
Kompetitive PCR
Die kompetitive PCR wurde mit Taq-Polymerase durchgeführt. Sie erfolgte für GAPDH und
E1A in separaten 25 µl Reaktionsansätzen (Tab. 2.4), wobei unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Primer verwendet wurden, die eine spätere Analyse der Amplifikate im Genetic
Analyzer ABI 310 ermöglichten (Primerpaare GAPDH-682s-T/GAPDH-826a, E1A-119F/E1A-1s). Der fluoreszierende Farbstoff (FAM [F] bzw. TAMRA [T]) war an das 5´-Ende
des Primers gekoppelt.
Material und Methoden
42
Tabelle 2.4.: Reaktionsansatz für die kompetitive PCR
Reagenzien
10x Taq-Reaktionspuffer
dNTP-Set (10 mM)
Sense Primer (10 µM)
Reverse Primer (10µM)
DNA-Template (30 ng/ µl)
Längenstandard (vLs)
Taq-DNA-Polymerase
Aq. bidest.
2.7.3
Volumen
2,5 µl
0,5 µl
1 µl
1 µl
1 µl
0,2 -5 µl
0,25 µl
ad 25 µl
Detektion und Quantifizierung der PCR-Produkte mittels Gene-Scan-Analyse
Die fluoreszenz-markierten PCR-Produkte wurden, nachdem je 2 µl E1A- bzw. GAPDHPCR-Produkt mit 15 µl Formamid und mit 0,2 µl GS 500 ROX Längenstandard (PE Applied
Biosystems, USA) versetzt wurden, im Trio-Thermoblock (Biometra) für 2 min auf 95°C
erhitzt und anschließend auf 4°C abgekühlt. Die Proben wurden durch Kapillarelektrophorese
mit Pop4-Polymer (PE Applied Biosystems, USA) im Genetic Analyzer ABI 310 (PE
Applied Biosystems, USA) entsprechend der Größe der Fragmente aufgetrennt und
nachgewiesen. Zusätzlich ermöglicht die Auswertungssoftware (ABI 310 Collection
Software, PE Applied Biosystems, USA) die Quantifizierung der Fragmente anhand der
Peakhöhe bzw. der Fläche unter dem Peak. Die Fläche und die Höhe jedes Peaks sind
abhängig von der Intensität des Signals und wurden durch die Gene scan Software (ABI)
errechnet, wobei nur die Peakfläche zur Auswertung genutzt wurde.
Das Verhältnis zwischen Peakfläche des nativen E1A- bzw. Luc-PCR-Produktes und
Peakfläche des E1A-vLS- bzw.Luc-vLS-PCR-Produktes wurde zur Berechnung der VirusDNA-Menge in den infizierten Zellen genutzt.
Unterschiede bei den in der PCR eingesetzten DNA-Mengen wurden durch Verhältnisse
zwischen Menge des nativen E1A-PCR-Produktes und Menge des GAPDH-PCR-Produktes
normalisiert. Die Berechnung erfolgte mittels folgender Formel:
DNA-Menge =
(F1 / F2) x vLS1-Menge
(F3 / F4] ) x GAPDH-vLS -Menge
F1: Luc- bzw. E1A-Peakfläche
F2: Peakfläche des Luc- bzw. E1A-vLS
F3: GAPDH-Peakfläche
F4: Peakfläche des GAPDH-vLS
vLS1: E1A-vLS bzw. Luc-vLS
Material und Methoden
43
2.8 Plasmid-Konstruktion
Zur Konstruktion des Plasmids pAd5TRE.MEM wurden über zwei getrennte PCRReaktionen mit den Primerpaaren Mer-BamHI-1112s / Mer-SalI-NheI-2100 bzw. Mer-NheI
2958s / Mer-HindIII-3941as aus dem Plasmid pANMerCreMer (Verroux et al., 1999) zwei
Mer-Fragmente (Mer1 und Mer2) amplifiziert, die sich nur an ihren Linker-Sequenzen
unterscheiden. Das PCR-Produkt Mer1 wurde über BamHI und NheI in den Vektor pAd5TREluc (Fechner et al., 2003) kloniert, woraus pAd5TRE.Mer1 resultierte. Das zweite PCRProdukt Mer2 wurde über NheI und HindIII in das Zwischenplasmid pAd5TRE.Mer1 zur
Generierung von Plasmid pAd5TRE.Mer1-Mer2 kloniert. Abschließend wurde das E1AΔpRBFragment über die PCR aus dem Plasmid pAd5TetO7SPB-E1AΔpRB (Hurtado Picó et al., 2005)
mit dem Primerpaar (E1A-SalIs /E1A-NheI 2958as) amplifiziert. Das PCR-Fragment wurde
dann über SalI und NheI in pAd5TRE.Mer1-Mer2 in Leserahmen kloniert.
Das Plasmid pAd5TRE.ME wurde konstruiert, indem ein E1AΔpRB-Fragment mittels PCR mit
dem Primerpaar E1s-SalI / E1Aas amplifiziert und über SalI und NheI in das mit SalI und NheI
verdaute Plasmid pAd5TRE.Mer 1 kloniert wurde. Für das Plasmid pAd5TRE.EM wurde das
Mer1-Fragment aus dem Vektor pAd5TRE.MEM über BamHI und Sal I weggeschnitten. Die
überhängenden Enden des restlichen Plasmids wurden mit T4 DNA-Polymerase aufgefüllt und
religiert.
Für die in vitro-Ligation zur Produktion adenoviraler Vektoren wurde eine singuläre SpeISchnittstelle stromaufwärts der Transgen-Kassette in das Plasmid pAd5TetO7SPB-luc
(Hurtado Picó et al., 2005) eingefügt. Dazu wurde über PCR ein Fragment aus dem Plasmid
pAd5TRE-E1A (Fechner et al., 2003) mit dem Primerpaar bGHs-HindIII / bGH-SpeI-BglIIas
amplifiziert und über HindIII / BglII in das Plasmid pAd5TetO7SPB-luc eingebaut. Das MEMund ME-Fragment wurde über BamHI / HindIII aus dem Plasmid pAd5TRE.MEM bzw.
pAd5TRE.ME herausgeschnitten und jeweils im Plasmid pAd5TetO7SPB-luc umkloniert,
wobei die Plasmide pAd.MEM bzw. pAd.ME entstanden sind. Zur Konstruktion des Plasmids
pAd.EM wurde das Mer1-Fragment aus dem Plasmid pAd5TRE.MEM über BamHI und SalI
geschnitten. Die überhängenden Enden des restlichen Plasmids wurden mit T4-DNAPolymerase aufgefüllt und religiert.
Zur Deletion des E1A-Kernsignals in der MEM-Chimäre wurde über PCR ein 670 bp
Fragment aus pAd.MEM mit Primerpaar E1s / E1AdelNLSas amplifiziert und in pAd.MEM
über SalI / NheI ligiert. Das resultierende Plasmid pAd.MEΔNLSM wurde mit BamHI und SalI
verdaut. Die überhängenden Enden des Plasmids wurden mit T4 DNA-Polymerase aufgefüllt
und religiert, wobei das Plasmid pAd.EΔNLSM entstanden ist.
Material und Methoden
44
Für Plasmidkarten siehe Anhang.
pAd5TRE1-Luc: Das CMVmin-Fragment (nt –53 bis +7) wurde mittels PCR mit dem
Primerpaar E1A-1-XhoI / CMV-BamHIa aus dem Plasmid pAd5TRE-Luc amplifiziert. Das
resultierte PCR-Fragment wurde nach Restriktion mit XhoI / BamHI in das mit XhoI / BamHIgeschnittene pAd5TRE-Luc ligiert.
pAd5TRE2-Luc: Das TATA-Box-enthaltende Fragment wurde mittels PCR mit dem
Primerpaar E1A-1-XhoI / CMV-tata-BamHIa aus pAd5TRE-Luc amplifiziert. Nach Restriktion
des resultierenden PCR-Fragments mit XhoI / BamHI wurde es in das mit XhoI / BamHI
geschnittene pAd5TRE-Luc ligiert. Daraus resultierte der Ersatz des CMVmin durch die TATABox des CMV IE Promotors (nt –31 bis –21).
pAd5Tight2-Luc: Ein erstes Fragment, das das adenovirale 5´-Ende (nt 1-342) enthält, wurde
mittels PCR mit dem Primerpaar TRE3595s / Ad5-end-SalI aus pAd5TRE-Luc amplifiziert.
Ein zweites Fragment, das einen modifizierten tetO7 (tetO7mod) enthält, wurde ebenfalls mit
dem Primerpaar TRE-XhoIs / Tight-KpnIa aus dem Plasmid pTRE-Tight (Clontech)
synthetisiert. Das erste PCR-Fragment wurde danach mit AatII/SalI geschnitten und in das
AatII/SalI-geschnittene pAd5TRE-Luc ligiert. Anschließend wurde das resultierte Plasmid
XhoI/KpnI geschnitten und mit dem XhoI/KpnI-restringierten zweiten PCR-Fragment
zusammenligiert.
pAd5Tight1-Luc: Das modifizierte TRE-Fragment (TREmod) wurde aus pTRE-Tight
(Clontech) mit SspI/BamHI herausgeschnitten und in das SspI/BamHI-verdaute pAd5Tight2Luc ligiert.
pAd5TRE-FasL: Die murine FasL-cDNA wurde aus dem Plasmid pBKCMV-mmFasL
(freundlicherweise von Dr. J. Eberle zur Verfügung gestellt) mit BamHI / NheI
herausgeschnitten und in das mit BamHI / NheI geschnittene pAd5TRE-Luc ligiert, wobei die
Luciferase-cDNA durch FasL-cDNA ersetzt wurde.
pAd5Tight1-FasL: Die Luciferase-cDNA wurde in pAd5Tight1-Luc durch die FasL-cDNA
ersetzt.
2.9 Zellbiologische Methoden
2.9.1
Ablösen adhärent wachsender Zellen
Die adhärent wachsenden Zellen wurden durch Trypsinierung vom Kulturboden abgelöst.
Dazu wurden die Zellen mit PBS (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) gewaschen (5 ml pro
25cm3- bzw.10 ml pro 75cm3-Kulturflasche), 2 ml Trypsin-Lösung (Sigma) in die
Zellkulturflasche bzw. in das Loch der Zellkulturplatte gegeben und 2 bis 3 min bei 37°C
Material und Methoden
45
belassen. Die Trypsinierung wurde dann mit 10 Vol FKS-haltigem geeignetem
Kulturmedium gestoppt, die abgelösten Zellen in entsprechendem Kulturmedium
resuspendiert und in eine neue Kulturflasche entsprechend der gewünschten Konfluenz
ausgesät. Optional wurde die Zellsuspension in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen überführt und
in der Zentrifuge 5810R für 5 min bei 1200 RPM und 4°C zentrifugiert (Eppendorf,
Hamburg, Deutschland). Das Zellpellet wurde je nach
Versuchsziel entsprechend
verarbeitet.
2.9.2
Zell-Passagierung
Aus den Kulturflaschen mit den konfluenten Zellen wurde das Nährmedium angesaugt. Die
Zellen wurden mit PBS gewaschen und trypsiniert (Kap. 2.9.1), durch Auf- und
Abpipettierung vereinzelt und je nach gewünschter Konfluenz im Verhältnis 1:3 bis 1:10 auf
neue Zellkulturflaschen oder Kultur-Schalen verteilt. Anschließend erfolgte die Inkubation
bei 37 °C und 5 % CO2. Eine Umsetzung der Zellen fand alle 2 bis 3 Tage statt.
2.9.3
Konservierung von Stammkulturen
Die Zellen wurden in einer 75cm2-Kulturflasche bis zu einer Konfluenz von 70- 80%
kultiviert, trypsiniert (Kap. 3.9.1) und in 10 ml Medium resuspendiert. Die Zellsuspension
wurde in ein 15 ml-Zentrifugen-Röhrchen überführt und für 5 min bei 1200 RPM und 4°C
zentrifugiert. Das Zellpellet wurde im Einfriermedium* (5 x 106 bis 1 x 107 Zellen/ml)
resuspendiert. Anschließend wurde 1 ml Aliquot in Cryo-Röhrchen (Nunc, Dänemark)
gefüllt und sofort in einer Einfrierbox bei einer kontrollierten Abkühlung (1°C /min) für
mindestens 16 h bei – 80 °C gelagert und danach in -196 °C kaltem flüssigem Stickstoff
aufbewahrt.
*Einfriermedium: entsprechendes Kulturmedium mit 20 % FKS und 10 % DMSO
versetzt.
2.9.4
Reaktivierung konservierter Kulturen
In ein 15 ml-Röhrchen wurden 10 ml eines entsprechenden kalten Kulturmediums gegeben
und die tiefgefrorenen, dann schnell aufgetauten Zellen direkt dazu pipettiert und vorsichtig
durchmischt. Die Zellsuspension wurde 5 min bei 1200 RPM bei 4°C in der 5810R
Zentrifuge
(Eppendorf,
Deutschland)
zentrifugiert.
Anschließend
wurde
Zellpellet in 5 ml auf 37 °C vorgewärmtes Kulturmedium resuspendiert, in eine 25 cm2-
das
Material und Methoden
46
Zellkulturflasche überführt und bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach 24 Stunden erfolgte
ein Wechseln des Kulturmediums, und die Zellen wurden bis zum Erreichen der
gewünschten Konfluenz weiter inkubiert.
2.9.5
Zellzahl-Bestimmung
Die Zellzahl und der Anteil lebensfähiger Zellen wurden durch Anfärbung der Zellen mit
einer Trypanblau-Lösung (Biochrom AG, Deutschland) in einer Neubauer-Zählkammer
(Neubauer, Deutschland) unter dem Mikroskop bestimmt. Trypanblau färbt lediglich tote
Zellen aufgrund ihrer defekten Membranstruktur. Die Berechnung erfolgte nach folgender
Formel:
Zellzahl (Zellen / ml) = [(Q1+Q2+Q3+Q4)/4] x VF x 104
Q : Zellzahl in einem großen Quadrat
VF: Verdünnungsfaktor
2.9.6
Transfektion von Säugetierzelllinien
Das Einschleusen nackter DNA in adhärent wachsende Zellen erfolgte durch die
Calciumphosphat-Methode. Am Vortag wurden die Zellen auf eine Zellkulturschale oder
Zellkulturplatten mit dem entsprechenden Medium so ausgesät, dass sie zum Zeitpunkt der
Transfektion eine Monoschicht bildeten, die eine Konfluenz von 40% bis 60% aufwiesen. Die
Transfektion erfolgte mit dem Transfektion Kit (Stratagene, CA) nach Angaben des
Herstellers.
2.10 Konstruktion und Produktion adenoviraler Vektoren
Die adenoviralen Vektoren wurden durch in vitro Ligation eines Shuttle-Plasmids mit dem
langem XbaI-Fragment (RR5-long arm) der RR5-DNA,ein Ad5 Mutant mit einer singulären
XbaI-Schnittstelle und einer Deletion der E1-Region (Nukleotiden 445 bis 3333), und der E3Region im Wildtyp vom Ad5-Genom generiert und in HEK 293 Zellen propagiert (Abb. 2.2).
Es folgte die Reinigung durch Ultrazentrifugation auf Cäsium-Chlorid-Gradient mit
anschließender Entfernung des Salzrückstandes. Der Titer der produzierten Viren wurde dann
bestimmt.
Material und Methoden
47
Ad (1-342)
Promotor
pShuttle
Transgen
XbaI (nt 560)
XbaI -Verdau
5´- ITR
3´- ITR
long arm
short arm
bGH p(A)
Reinigung über
Sucrose-Gradient
SpeI / XbaI
Restriktion mit
SpeI bzw. XbaI
Long arm
Linearisiertes pShuttle
Ligation und Transfektion
in HEK293
Abbildung 2.2: Rekombinantes adenovirales Produktionsschema
2.10.1 Herstellung des RR5-Long-Arm
Aus 5 x 1012 RR5-Viruspartikeln wurde die DNA isoliert (Kap. 2.3.2). RR5-DNA (80 –
100 µg) wurde in einem 1 ml Restriktionsansatz (Kap. 2.4.1) mit 400 Units XbaI (NEB,
Frankfurt, Deutschland) über Nacht bei 37 °C inkubiert. Danach wurden weitere 80 U XbaI
zugegeben, und nach einer Inkubation von 4h bei 37°C wurde zur Inaktivierung des Enzyms
der Ansatz 5 min bei 60°C erhitzt. Nach elektrophoretischer Überprüfung eines Aliquots auf
vollständigen Verdau (Long arm 33,33kb und Short arm 0,57 kb) erfolgte die
Dephosphorylierung (Kap. 2.4.2). Die Auftrennung beider Fragmente erfolgte durch
Ultrazentrifugation auf Sucrose-Gradienten (Kap. 2.6). Danach wurden die Fraktionen mit der
33,33 kb RR5-Bande gesammelt, gefällt, in TE-Puffer gelöst und die Aliquots á 1 µg wurden
bei - 20°C gelagert.
2.10.2 Generierung und Propagation adenoviraler Vektoren
2.10.2.1
Ligation und Vorkultur
Das adenovirale Shuttle-Plasmid wurde mit SpeI verdaut. Davon wurden 500 ng in einem
40 µl-Reaktionsansatz mit 1 µg RR5-Long-Arm ligiert (Kap. 2.4.3). Der Ligationsansatz
wurde auf die am Vortag auf einer 60mm-Kulturschale ausgesäten HEK 293-Zellen (106
Zellen) mit dem Kalzium-Phosphat Transfektion-Kit (Stratagene, Germany) nach Protokoll
des Herstellers gegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C und 5% CO2 wurde das
Material und Methoden
48
Kulturmedium abgenommen, mit PBS gewaschen und die transfizierten Zellen mit Lowmelting-Agarose (Kap. 2.10.3) überschichtet. Nach weiterer Inkubation von 7 bis 14 Tagen
wurden unter dem Mikroskop 5 bis 10 gut isolierte virale Plaques auf der unteren Seite der
Kulturschale markiert, unter der Werkbank mit einer 1000 µl Pipette gepickt und in 500 µl
des mit 2% FKS versetzten DMEM Low Medium aufgenommen (Plaque-Lösung). Zur
Amplifikation der isolierten Plaques wurde aus den am Vortag auf 60 mm-Kulturschalen
ausgesäten HEK 293-Zellen das Medium abgenommen und die Zellen mit jeweils 500 µl
viralen Plaques für 2 h inkubiert. Es folgte die Zugabe von 4 ml DMEM (High Medium) mit
10% FKS und eine weitere Inkubation. In der Regel wurde zwischen 5 und 7 Tagen ein
kompletter zytopathogener Effekt (CPE) erreicht. Das Zelllysat wurde dann geerntet, in 15
ml-Falcon-Röhrchen überführt und drei Zyklen Einfrieren in flüssigem Stickstoff und
Auftauen bei 37°C im Wasserbad unterworfen. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 3000
RPM (Centrifuge 5810, Eppendorf) wurden vom virushaltigen Überstand (Primär-Lysat)
jeweils 500 µl zur weiteren Amplifikation, wie oben beschrieben, verwendet. Nach 5 Tagen
wurden erneut Zellen und Kulturmedium geerntet (Sekundär-Lysat). Vom Sekundär-Lysat
wurden 1,5 ml in 2 ml Eppendorf-Röhrchen überführt und 10 min bei 3000 RPM in der
Tischzentrifuge (Eppendorf, Deutschland) zentrifugiert. Die gesamte DNA wurde aus dem
Zellpellet mit Hilfe des DNA-Extraktion-Kit (peQLab, Germany) isoliert und mit Ethanol
gefällt. Die Plaques wurden auf Insert, auf RR5-Hintergrund mit dem Primer-Paar Ad5 324s /
Ad5 4600 as und auf Rekombination (RCA) mit dem Primer-Paar Ad5 3315s / Ad5 4600as
mittels PCR überprüft. Zur Überprüfung der Inserts wurden, abhängig vom Insert, spezifische
Primer verwendet. Das RCA-freie und auf Transgen positiv getestete Sekundär-Lysat wurde
weiter propagiert und zur Produktion von Adenoviren in größerer Menge verwendet (Kap.
2.10.2).
2.10.2.2
Adenovirus-Präparation
Das RCA-freie Sekundär-Lysat (500 µl) wurde konfluent auf die auf einer 60mmKulturplatte ausgesäten HEK293-Zellen gegeben. Nach 30 min Inkubationszeit wurden 4,5
ml Low-Medium* zugegeben und die Zellen weiter inkubiert. Nach 4 Tagen war der
Zellrasen komplett lysiert (3. Lysat). Die Zelllysate von drei Schalen wurden gesammelt und
in einer sterilen 250 ml- Flasche mit 180 ml Low-Medium gemischt. Zehn 14,5 cm GewebeKultur-Schalen mit konfluenten HEK293-Zellen wurden mit 10 ml PBS gewaschen und 9
Platten mit jeweils 20 ml der Virus-Lösung/Low-Medium-Mischung infiziert. Eine Schale
diente als Zell-Kontrolle. Nach weiterer Inkubation bei 37°C für 4 Tage wurde das
Material und Methoden
49
entstandene Virus-Lysat der 9 Schalen in 250 ml Erlenmeyerkolben überführt und mit
Nonidet-P40 (Endkonzentration: 0,5%) zum Zellaufschluss versetzt, durchmischt und 10
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Suspension wurde dann für 10 min bei 13.000
RPM (20000 ×g) bei 4°C (J-25 Zentrifuge und JA-25 Rotor, Beckman) zentrifugiert und der
virushaltige Überstand in einen sterilen 250 ml-Erlenmeyerkolben überführt. Es wurden 0,5
Vol PEG/NaCl-Puffer (20% PEG, 2.5 mM NaCl) hinzugefügt.Die Viruspartikel wurden durch
Inkubation der Lösung über Nacht bei 4°C präzipitiert. Danach erfolgte eine Zentrifugation
bei 13000 RPM für 15 min bei 4°C. Das Virus-Pellet wurde in 4 ml TBS in einem
Polypropylen-Röhrchen gelöst und bei 3.000 RPM für 5 min bei Raumtemperatur
zentrifugiert und über Ultrazentrifugation auf Cäsium-Chlorid gereinigt (Kap. 2.10.2).
*Low-Medium: DMEM + 2% FKS + 1% Penicillin/Streptomycin
2.10.2.3
Adenovirus-Reinigung durch Ultrazentrifugation
Zu 4 ml virushaltigem Überstand (Kap.3.10.3) wurden 2 g CsCl (Sigma) gegeben (Dichte von
1,34 g/ml). Der Ansatz wurde 1 h bei 4°C inkubiert und die Zellbruchstücke bei 3000 RPM
für 10 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Mittels einer Pasteur-Pipette wurde der
Überstand in zwei Beckman-Ultrazentrifugen-Röhrchen (2 ml/Tube) überführt. Beide
Röhrchen wurden durch Zugabe einer 1.34 g/ml CsCl-TBS-Lösung austariert und die
Röhrchen mittels eines Tube-Topper-Heaters (Beckman, USA) versiegelt. Nach der
Zentrifugation bei 90.000 RPM für 3 h bei 20°C (Beckman Ultrazentrifuge, TLA-120 Rotor)
wurden die viralen Partikel als weißer, opaleszierender Ring sichtbar. Der Virus-Ring wurde
mit einer sterilen Insulin-Spritze abgezogen und in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß überführt und
von CsCl-Kontamination befreit (Kap. 2.10.2).
2.10.2.4
Entfernung des CsCl-Salzes von der aufgereinigten Virus-Suspension
Die Entfernung des CsCl-Salzes aus der gereinigten Adenoviren-Suspension erfolgte über
Gelfiltrations-Chromatographie auf NAPTM-Säulen (Amersham Biosciences, USA). Nachdem
die Säule mit 25 ml TBS äquilibriert wurde, erfolgte die Zugabe von 1 ml Virus-Probe direkt
auf die Säule, die nach Durchlauf mit 2,5 ml TBS aufgefüllt wurde. Die Säule wurde mit
weiteren 6 ml TBS gewaschen und das Eluat in 1,5 ml Eppendorf-Gefäßen in 14 Fraktionen á
0,5 ml aufgefangen. 10 µl jeder Fraktion wurden mit 90 µl TBS gemischt und die Absorbtion
bei 260 nm im Genesys 6 UV-Spektrometer (Thermo Electron Corporation, USA) gemessen.
Die Fraktionen mit den hohen Konzentrationen wurden gesammelt und die Konzentration
erneut bestimmt. Die Virus-Lösung wurde mit Bovines Serum Albumin (Endkonzentration
Material und Methoden
50
von 1,0 mg/ ml) zum Stabilisieren des Virus gegenüber dem Gefriervorgang versetzt und in
50 µl bis 200 µl Aliquots bei – 80°C gelagert. Aus 200 Virus-Aliquots wurde die DNA
isoliert und mittels PCR auf Vorhandensein des Transgens und auf RCA Kontamination
überprüft. Zusätzlich wurde die Integrität des Virus-Genoms durch Hind III-Verdau
analysiert.
2.10.3 Quantifizierung rekombinanter Adenoviren: Titer-Bestimmung
2.10.3.1
Bestimmung der adenoviralen Partikelkonzentration
Dazu wurden 10 µl der gereinigten Virus-Lösung in 90 µl TBS verdünnt und die optische
Dichte (OD) bei 260 nm im UV-Spektrometer gemessen.
Die Partikelzahl wurde nach folgender Formel berechnet:
Konzentration (in Partikel/µl) = OD x 10 x 109
2.10.3.2
Bestimmung der biologisch aktiven adenoviralen Partikelkonzentration
mittels Plaque-Assay
Diese Methode diente zur Bestimmung biologisch aktiver (infektiöser) Viruspartikel. Dazu
wurden 10 µl Virus-Probe in 990 µl DMEM Medium (mit 2% FKS) aufgenommen (10-2
Verdünnung). Die 10-2 -Verdünnungs-Lösung wurde weiter bis 10-9 dekadisch verdünnt.
900 µl der jeweiligen Verdünnungen wurden anschließend auf die am Vortag mit
konfluenten
HEK293-Zellen
vorbereiteten
6-Loch-Platten
gegeben,
nachdem
das
Kulturmedium abgesaugt worden war. Die Platten wurden 1 h bei 37°C inkubiert.
Währenddessen wurde eine autoklavierte 5%ige Low-Melting- Agarose-Lösung 5 min in der
Mikrowelle (Bosch, Germany) bei 200 W zum Schmelzen gebracht und auf 42°C im
Wasserbad temperiert. Daraus wurde durch vierfache Verdünnung mit einem auf 37°C
temperierten Medium ein 1,25%iges Agarose-Medium vorbereitet und bei 42°C ins
Wasserbad gestellt. Von den Infektionsplatten wurde das Medium abgesaugt und die Zellen
mit jeweils 3 ml des 1,25%igen Agarose-Mediums pro Loch überschichtet. Nach
Verfestigung des Gels bei Raumtemperatur wurden die Platten bei 37°C weiter inkubiert.
Innerhalb von 10 Tagen bildeten sich virale Plaques. Die Plaques wurden am 14. Tag gezählt
und der Titer wie folgt berechnet:
Virus-Titer (PFU/ml) = (N x F) / V
V: Volumen der zur Infektion verwendeten Virus-Suspension
N: Anzahl der gebildeten Plaques
F: Verdünnungsfaktor (entspricht der Verdünnungsstufe)
Material und Methoden
51
2.11 Expressionsnachweis-Methoden
2.11.1 Nachweis der Proteinexpression durch Immunfluoreszenz-Färbung
Die indirekte Immunfluoreszenz-Färbung diente zum Nachweis des E1A-Proteins in
Adenovirus-infizierten oder mit E1A transfizierten Zellen. Dazu wurden die Zellen auf
40 mm-Zellkulturflaschen ausgesät (2 x 105 Zellen pro Schale) und 24 h bei 37°C inkubiert.
Die Zellen wurden dann entsprechend infiziert bzw. transfiziert. Nach der gewünschten
Inkubationszeit wurde das Kulturmedium abgenommen und die Zellen zweimal mit 2 ml PBS
gewaschen.
Zur
Fixierung
und
Permeabilisierung
der
Zellen
wurden
10
ml
Fixierungslösung*1 zugegeben und die Schale 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es
folgten drei Waschvorgänge mit jeweils 3 ml TBS*2. Nach Ausgießen des TBS-Puffers wurde
mit einem Ohrstäbchen ein Kreis von ca. 20 mm Durchmesser eingelegt und mit einem
Fettstift (Dako Cytomation, Dänemark) abgedichtet. In dem abgedichteten Kreis wurden die
Zellen mit 100 µl Blockierungslösung*3 20 min bei Raumtemperatur in einer feuchten
Kammer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit 100 µl TBS wurden 100 µl des 200-fach
in Blockierungslösung verdünnten anti-Ad2 E1A rabbit polyclonal antibody (Santa Cruz
Biotechnology, CA) für 1h in einer mit Zellstoff angefeuchteten Kammer inkubiert. Die
Zellen wurden erneut dreimal gewaschen und mit 100 µl des 400-fach in Blockierungslösung
verdünnten sekundären Antikörpers (Biotin-konjugierten Donkey anti-rabit-Antikörper,
Dianova) für 45 min in einer dunklen Kammer inkubiert. Die Zellen wurden anschließend
dreimal gewaschen und mit 100 µl einer 1:500 verdünnten Cy3-konjugierten StreptavidinLösung (Dianova, Deutschland) für 30 min im Dunkeln belassen. Nach drei weiteren
Waschgängen erfolgte zum Anfärben des Zellkerns eine 10minütige Inkubation mit 100 µl
0,5 mg/ml DAPI-Lösung (Sigma). Abschließend wurden die Zellen gewaschen und mit einem
Tropfen Fluoromount G (Southern Biotechnology Assiates, Inc.) eingebettet und mit einem
Deckglas bedeckt. Die fluoreszenzmikroskopische Auswertung erfolgte mit Hilfe des
Olympus BX60 Immunofluorescence Mikroskops (Olympus) unter Verwendung der Software
AnalySIS (Olympus).
*1Fixierungslösung: PBS mit 4% Formaldehyd, 1 mM MgCl2, 0,5% Triton X 100
*2TBS: Tris pH 8.0, 2 mM CaCl2 , 2 mM MgCl2, 150 mM NaCl
*3Blockierungslösung : TBS mit 5% Donkey Serum, 0,1% Triton X 100
2.11.2 Luciferase-Assay
Das Enzym Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin unter Abgabe eines Photons in
Form einer erfassbaren Lumineszenz und wurde so als Reporter für verschiedene
Expressionsanalysen verwendet.
Material und Methoden
52
Der Nachweis der Luciferase-Expression erfolgte mit dem Luciferase detection Kit
(Boehringer, Mannheim) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Nach Abnehmen
des Mediums und Waschen der Zellen mit 1 x PBS wurden die Zellen direkt mit 250 µl
Lysispuffer lysiert. Danach erfolgte eine Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur und
anschließend eine 15-sekündige Zentrifugation bei 14000 RPM in der Tischzentrifuge
(Eppendorf). 10 µl des Überstandes wurden mit 50 µl Luciferase-Substrat gemischt und die
Luciferase-Aktivität durch Messung der Lumineszenz innerhalb von 20 s im Lumat LB 9501
Luminometer (Berthold GmbH, D) bestimmt.
2.12 Apoptose-Messung
Die DNA-Fragmentation zu Oligonukleosomen ist ein irreversibler Schritt im apoptotischen
Programm. Die am Ende der Apoptosesignalkaskade aktivierte Endonuklease schneidet die
DNA an den für das Enzym zugänglichen Linkerregionen der Nukleosomen, so dass DNAHiston-Komplexe entstehen. Die Apoptose-Messung erfolgte mittels Cell Death Detection
ELISA (Roche, Mannheim, Deutschland). Zunächst wurden die infizierten Zellen durch eine
Trypsinbehandlung abgelöst und in Eppendorf-Gefäße überführt. Durch Zentrifugation
(12000 x g, 40 sec, 20°C) wurden die Zellen vom Überstand abgetrennt und mit je 500 µl
Inkubationspuffer lysiert. Die kleinen, löslichen DNA-Histon-Komplexe wurden von
hochmolekularen Bestandteilen durch Zentrifugation (12000 x g, 15 min, 20 °C) getrennt. Die
Probenverarbeitung erfolgte entsprechend den Angaben des Herstellers und die Detektion im
ELISA-Reader (MRX 2, Dynex Technologies, Denkendorf, D) bei 405 nm, wobei die
Absorption der Farbstofflösung proportional zur Konzentration der Oligonukleosomen ist.
2.13 Zytotoxizitäts-Messung
Eine produktive Virusreplikation bewirkt aufgrund massiver Produktion viraler Proteine und
Partikel eine Schädigung der Zelle sowie einen Verlust der Integrität der Zellmembran. Dies
führt zur Freisetzung des Enzyms Lactatdehydrogenase (LDH), das im Zellüberstand
nachgewiesen werden kann. Die Freisetzung von LDH wurde unter Verwendung des
Cytotoxicity Detection Kit (Roche, Mannheim, D) entsprechend der Herstellerangaben
bestimmt. Die minimale LDH-Freisetzung (Amin) wurde im Überstand unbehandelter
Kontrollzellen gemessen. Die maximale LDH-Freisetzung (Amax) wurde durch Zusatz von
100 µl Triton x 100 (Endkonzentration von 2%) zu unbehandelten Zellen erhalten. Die
Absorption der Proben wurde bei 490 nm im ELISA-Reader (MRX-2, Dynex Technologies,
Denkendorf, Deutschland) gemessen. Die Zytotoxizität wurde wie folgt berechnet:
Zytotoxizität (in %) = [(A - Amin) / Amax] x 100
Material und Methoden
53
A: Absorption der Probe
Amin: Minimalabsorption
Amax: Maximale Absorption
2.14 Transfer von Nukleinsäuren auf Nylonmembranen
2.14.1 DNA-Transfer mittels Southern-Blot-Methode
Für Detektion von DNA mittels Southern Blot wurden 10 bis 20 µg der HindIII-verdauten
DNA elektrophoretisch auf einem Agarosegel (Kap. 2.3.7) 1 h lang getrennt. Das DNAAgarosegel wurde anschließend zweimal 30 min in Denaturierungslösung*1 geschwenkt,
wobei die Doppelstrang-DNA in Einzelstrang-DNA überführt wurde. Anschließend wurde
das DNA-Agarosegel weitere 60 min in Neutralisierungslösung*2 geschwenkt und die DNA
auf Nylonmembran mittels Kapillar-Blot (Kap. 2.14.3) transferiert und anschließend
hybridisiert (Kap. 2.14.6).
*1Denaturierungslösung: 0,5 M NaCl, 0,5 M NaOH
*2Neutralisierungslösung: 105 M NaCl, 1 M Tris-Hcl , pH 8.0
Abbildung 2.3: Schematische Darstellung einer Kapillar-Bloteinrichtung
2.14.2 RNA-Transfer mittels Northern-Blot-Methode
RNA-Agarosegele (Kap. 2.3.7) wurden mittels Kapillar-Blot-Methode über Nacht auf
Nylonmembranen transferiert. Die Hybridisierung wurde wie in Kap. 2.14.6. beschrieben
durchgeführt.
Material und Methoden
54
2.14.3 Kapillar-Blot
Der Transfer von Nukleinsäuren auf Nylonmembranen erfolgte durch Kapillar-Blot. Bei
dieser Methode wird der Nukleinsäurentransfer durch eine gerichtete Ionenwanderung
vollzogen. Dazu wurde ein in 10 x SSC* getränktes Whatman-Papier (Whatman International
Ltd, England) auf einen ebenen Untergrund gelegt, wobei dessen Enden in 10x SSC-Puffer
eintauchten. Luftblasenfrei wurde anschließend das DNA-Agarosegel bzw. das RNAAgarosegel (mit den Taschenöffnungen nach unten) aufgelegt, auf dessen vier Seiten jeweils
Streifen einer Plastikfolie gelegt wurden, um einen Flüssigkeitsstrom jenseits der Membran zu
verhindern. Auf das Gel wurden nun nacheinander ebenfalls luftblasenfrei eine feuchte
Nylonmembran (HybondTM N-Hybridisation Membran; Amersham), ein feuchtes und ein
trockenes Whatman-Papier sowie ein Stapel trockener Papiertücher geschichtet (Abb. 2.3).
Schließlich wurde der Blot mit einem Gewicht von etwa 500g beschwert und über Nacht
stehen gelassen. Dann wurde der vollständige Transfer der RNA durch eine Überprüfung des
Gels unter dem Transilluminator (Biometra, Deutschland) kontrolliert. Die Position der 18Sund 28S-rRNA-Bande (für RNA) oder DNA-Marker (für DNA) wurde auf dem Filter
markiert, der Filter beschriftet und 30 min an der Luft getrocknet. Anschließend wurde die
RNA durch zweimaliges Cross-linken unter UV-Licht (150 mJoule/cm2) im Strata Linker
1200 (Stratagene, Germany) an den Filter kovalent gebunden und die Filter in einer
Klarsichttüte bei 4°C gelagert.
*20x SSC-Puffer: 3 M NaCl, 0,3 M Na-citrat
2.14.4 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mittels PCR durchgeführt
(Tab.2.5). Das Prinzip der DNA-Markierung beruht auf der Synthese eines komplementären
DNA-Matrizenstranges mit Hilfe der Taq-Polymerase und unter Verwendung radioaktiv
markierter Nukleotide. Als Sonde diente mit
32
P-dCTP radioaktiv markierte Einzelstrang-
DNA, die unter Verwendung des entsprechenden antisense-Primers (Northern Blot) oder des
entsprechenden sense- bzw. antisense-Primers (Southern Blot) mit Hilfe einer PCR hergestellt
wurden. Dazu diente folgendes Protokoll:
Material und Methoden
55
Tabelle 2.5: Reaktionsansatz für die Herstellung von Einzelstrang-DNA-Sonden
Reagenzien
10x Taq PolymerasePuffer
dNTP ohne dCTP (1 mM)
Primer (100 µM)
DNA-Matrize (100 ng) (a)
Taq-Polymerase (5 Units/ µl
A. bidest.
Mineralöl zur Überschichtung
32
P dCTP (10 µCi/ µl) (b)
Volumen
2,5 µl
0,5 µl
0,25 µl
-- µl
0,25 µl
ad 25 µl
15 µl
3 – 5 µl
(a)
(b)
Abhängig von der Konzentration der DNA-Lösung
Abhängig von der Aktivität und von der Stärke des zu erwartenden Signals
2.14.5 Reinigung radioaktiv markierter Sonden
Die radioaktiv markierten PCR-Produkte wurden auf Sephadex-Säulen gereinigt. Dazu wurde
in A.bidest. gelöstes Sephadex G-50 (Sigma) in eine Pasteurpipette geschichtet, die Sonde
zugegeben und durch weitere Zugabe von bidest. H2O über die Polymer-Säule gespült. Unter
Plexiglas-Schutz wurde die Sonde auf die Säule pipettiert und anschließend ca. 1 ml
destilliertes H2O zugegeben. Eine erste Fraktion von ca. 500 µl Eluat wurde aufgefangen und
verworfen. Danach wurden bis zu 8 Fraktionen á 50 µl aufgefangen und die Radioaktivität in
jeder Fraktion mit Bioscan QC 2000 (Bioscan, USA) gemessen. Die Fraktionen, die den
höchsten Peak hatten, wurden anschließend gepoolt und als Sonde verwendet.
2.14.6 Hybridisierung von Nukleinsäuren mit markierten DNA-Fragmenten
Die Membran wurde in den zuvor mit 1%igem SDS und A. bidest. gereinigten
Hybridisierungsröhren (Biometra, Deutschland) mit 5-10 ml (pro 100 cm2 Filter) der auf 68°C
(Northern Blot) bzw. auf 60°C (Southern Blot) erwärmten ExpressHyb Hybridization Solution
(Clontech) für 30 min bei 68°C bzw. 60°C im Hybridisierungsofen (Biometra, Deutschland)
prähybridisiert. Die Filter wurden unter Zugabe von ca. 0,4 ml der entsprechenden
Einzelstrang-Antisense-Sonde (Kap.2.14.4) für 1 h bei 68°C (Northern Blot) bzw. unter
Zugabe von Einzelstrang-Antisense– und Einzelstrang-Sense-Sonde bei 60°C (Southern Blot)
hybridisiert. Nach Verwerfen der Hybridisierungslösung wurden die Filter zweimal für 15
min mit jeweils 20 ml Waschlösung I bei Raumtemperatur gewaschen. Die Waschlösung I*1
wurde verworfen und zweimal für 20 min mit je 20 ml der Waschlösung II*2 bei 50°C
gewaschen. Die Filter wurden entnommen und noch feucht in Klarsichtfolie eingeschlagen.
*1Waschlösung I: 2 x SSC, 0,05 % SDS
*2Waschlösung II: 0,1 x SSC, 0,1% SDS
Material und Methoden
56
2.14.7 Nachweis und Quantifizierung der Hybridisierungsprodukte
Für die Detektion radioaktiv markierter DNA-Fragmente wurden die in Klarsichtfolie
eingeschlagenen hybridisierten Filter in eine Filmkassette gelegt und entweder nach Auflegen
eines Röntgenfilms (FujiFilm-BAS-1500-Film-Kassette) bei - 80°C oder nach Auflegen einer
Phosphoimager-Belichtungsplatte (Fuji Film-Platte BAS-1500) bei Raumtemperatur oder bei
4°C für mehrere Stunden bis hin zu mehreren Tagen inkubiert. Der Röntgenfilm war
anschließend entwickelt und die Phosphoimager-Belichtungsplatte mit dem „Fuji Bas 2000
Phospho-Imager“ (Fuji) und der Software BAS Reader 2.21 digitalisiert worden. Die
Intensität des Hybridisierungssignals wurde densitometrisch mittels Phosphoimaging unter
Verwendung der Software Tina (Version 2.09g ©raytest Isotopenmessgeräte GmbH)
bestimmt.
2.14.8 Waschen radioaktiv markierter DNA-Fragmente
Nach Auswertung der Filter wurde die Sonde in einem Wasserbad bei 95 - 98°C durch 5minütiges Schwenken in 0,5%igem SDS (Sigma) vom Filter gelöst (Strippen). Dieser
Vorgang wurde so oft wiederholt, bis kein radioaktives Signal mehr gemessen wurde. Danach
wurde der Blot in Klarsichtfolie bis zur weiteren Verwendung eingeschlagen und bei – 20°C
gelagert.
2.15 Tierversuche
Die Mäuse wurden unter Beachtung der deutschen Tierschutzverordnung gehalten und
gepflegt.
2.15.1 Generierung von Lungen-Tumorxenograftmodellen
Zur Generierung von Tumorxenograften wurden die Lungenadenokarzinom-Zellen (H441Zellen) in 20 x 75cm3–Kulturflaschen bis zum Erreichen der Konfluenz kultiviert. Die Zellen
wurden dann trypsiniert und in 10 ml Medium (RPMI mit 10 % FKS, 1 %
Penicillin/Streptomycin) pro Flasche resuspendiert. Anschließend erfolgte deren Pelettierung
durch Zentrifugation (5 min bei 1200 RPM und 4°C). Das erhaltene Zell-Pellet wurde
zweimal mit PBS (10 ml) gewaschen, in RPMI-Medium ohne FKS bei einer Konzentration
von 5x107 Zellen/ml resuspendiert und in ein Volumen von 200 µl aliquotiert. 107 Zellen
wurden dann in die Flanken von 5 bis 6 Wochen alten weiblichen athymischen BaLB/C
Mäusen (nu/nu) mittels 18G Nadeln appliziert und bis zum Erreichen eines Volumens
zwischen 40 - 150 mm3 wachsen gelassen.
Die Bestimmung der Tumorgröße erfolgte mit der Formel:
Material und Methoden
57
Tumorvolumen (mm3)= (D x d2) / 2
D: größerer Durchmesser
d: kleinerer Durchmesser
Zur Untersuchung der Virusreplikation in vivo wurden die Tiere 5 Tage nach intratumoraler
Infektion mit adenoviralen Vektoren und intraperitonealer Applikation von 50 µl OHTLösung (5mg/ml) bzw. mit 100 µl Tam-Lösung (30 mg/ ml) pro Maus durch Genickbruch
getötet. Die subkutanen Tumoren wurden entnommen und in flüssigem Stickstoff
eingefroren. Jeder der Tumoren wurde in 1 ml RPMI-Medium aufgenommen und mit einem
Ultra Turrex T25 Gerät (IKA Labortechnik, Deutschland) bei 2000 U/min homogenisiert.
Nach Zentrifugation (10000 RPM, 4°C) wurde aus den virushaltigen Überständen der
Virustiter mittels Plaques-Assay bestimmt (Kap. 2.10.3).
2.15.2 Zubereitung von Tamoxifen- und 4-Hydroxy-Tamoxifen-Lösungen
Für in vitro-Experimente wurde eine 48 mM 4-OH-Tamoxifen-Stock-Lösung hergestellt: 6mg
4-Hydroxy-Tamoxifen (OHT) (Sigma) wurden in 323 µl absolutem Ethanol aufgenommen.
Der Einsatz wurde so lange gevortext, bis das OHT-Pulver vollständig gelöst war. Daraus
wurden 4 mM bzw. 8 mM Lösungen durch Verdünnen der 48 mM Stock-Lösung in
absolutem Ethanol bereitet. Um unter der Ethanol-Verträglichkeitsgrenze der Zellen zu
bleiben, wurden zur Behandlung der Zellen in der Regel 0,5 µl OHT (4 mM) pro ml
Kulturmedium eingesetzt (Endkonzentrationen: 2 µM OHT, 0,05% Ethanol).
Für
in
vivo
Experimente
wurden
Tamoxifen-Lösung
(Sigma)
und
OHT-Lösung
folgendermaße hergestellt:
50 mg OHT wurden in 100 µl absolutem Ethanol gelöst und anschließend in 9,9 ml
sterilfiltriertem Erdnussöl resuspendiert (Endkonzentration 5mg/ml).
210 mg Tamoxifen (Tam) wurden in 600 µl absolutem Ethanol gelöst und in 6,4 ml Erdnussöl
aufgenommen (30 mg/ml). Die hergestellten Suspensionen wurden gleich verwendet oder bei
- 20°C gelagert.
Kurz vor der Behandlung wurden die OHT- und Tam-Lösungen 15 min mit Ultraschall
behandelt.
2.16 Statistische Evaluierung
Die Versuchsansätze wurden mit dem ungepaarten, zweiseitigen Mann-Whitney- U-Test
verglichen. Die Berechnung statistischer Parameter für in vitro Versuche erfolgte unter
Verwendung des MS-DOS-Programms Instat (Version 2.05a; GraphPad Software Inc., San
Diego, CA).
Material und Methoden
58
Für in vivo Versuche wurde die statistische Auswertung durch das SSP-Programm (SPSS Inc.,
Chicago, USA) durchgeführt.
Die Unterschiede zwischen zwei Versuchsansätzen wurden als signifikant betrachtet, wenn die
P-Werte kleiner als 0,05 waren.
Ergebnisse________________________________________________________ 59
3
Ergebnisse
3.1 Arbeitshypothese
Picard und Mitarbeiter (1988) konnten durch Fusion des adenoviralen E1A-Proteins mit der
Hormonbindungsdomäne (HBD) des Rattenglucocorticoidrezeptors (GR) die Aktivität der
E1A-GR-Chimäre hormonabhängig machen. Einige Zeit später zeigten Spitkovsky und
Mitarbeiter (1994), dass durch Fusion des E1A Proteins mit der HBD des humanen
Östrogenrezeptors (ER) eine Östrogen-abhängige Regulation der Aktivität der E1A-ERChimäre erzielt werden konnte. Die Isolierung von HBD-Mutanten des ER ermöglichte es,
durch Fusion von Effektorproteinen mit der mutierten HBD des Maus-ER (Mer) oder mit dem
humanen Analogon eine Östrogen-unabhängige, aber Tamoxifen (Tam)- bzw. 4-HydroxyTamoxifen (OHT)-abhängige Regulation der Aktivitäten der resultierenden Fusionsproteine
zu erzielen (Feil et al., 1986; Indra et al., 1999; Sohal et al., 2001; Verrou et al., 1999). Diese
Vorarbeiten führten in der vorliegenden Dissertation zur Hypothese, dass E1A-Mer-Chimären
die Replikation der oAdV Tam- bzw. OHT-regulierbar machen würde. Der hypothetische
Mechanismus der Tam- bzw. OHT-abhängigen Regulation der oAdV wird in Abb. 3.1
dargestellt.
A
In Abwesenheit von OHT
B
In Anwesenheit von OHT
Trans-Aktivierung viraler Promotoren
durch aktivierte EM
Keine Aktivierung viraler Promotoren
Keine Expression
anderer viraler Gene
E1A
Ad.ITR
Expression
anderer viraler Gene
E1A
Mer
pA
Promotor
Ad.ITR
Ad.ITR
Mer
Promotor
pA
Ad.ITR
Expression der EM
hsp90
hsp90
EM
(inaktiv)
Keine Virusreplikation
EM
(aktiv)
Virusreplikation
OHT
Keine neuen adenoviralen
Partikel
Entstehung neuer adenoviraler
Partikel
Abbildung 3.1: Hypothetische Darstellung der Tam- bzw. OHT-abhängigen Regulation der
Adenovirusreplikation durch Kontrolle eines E1A-Mer-Fusionsproteins (EM). A: in Abwesenheit von OHT wird
das exprimierte EM-Fusionsprotein durch zelluläre Faktoren in einen Komplex verwickelt und bleibt inaktiv. Es
findet daher keine Virusreplikation statt. B: In Anwesenheit von Tam bzw. OHT dissoziert das EMFusionsprotein vom Multiproteinkomplex und wird aktiv. Das aktive EM-Fusionsprotein transaktiviert seinen
eigenen Promotor sowie die viralen Promotoren. Dies führt zur Expression viraler Gene, die für die
Virusreplikation erforderlich sind.
Ergebnisse________________________________________________________ 60
3.2 Entwurf und Konstruktion von Plasmiden zur Expression von E1AMer-Fusionsproteinen
Zur Untersuchung der pharmakologischen Regulation der Aktivität des adenoviralen E1AProteins wurden zunächst drei Plasmid-Konstrukte (pTRE.ME, pTRE.MEM, pTRE.EM) zur
Expression von verschiedenen Protein-Chimären angefertigt, wobei die jeweiligen
Expressionskassetten
unter
Kontrolle
eines
tetrazyklin-responsiven
minimalen
Cytomegalovirus-Promotors (CMVmin) standen. Die Chimären wurden durch Fusion des
adenoviralen E1A-Proteins mit der mutierten HBD (Aminosäuren 281-599) des Maus-ER
(Mer) generiert. Im Mer wurde die Affinität für seinen natürlichen Liganden (17β-Östradiol)
durch Substitution von Arginin (Aminosäuren-Position 525) durch Glycin (G525R)
aufgehoben (Danielian et al., 1993). Das angewendete Adenovirus E1A (E1AΔpRB) ist eine
mutierte E1A-Variante von Adenovirus Serotyp 5. Die Mutation besteht in der Deletion der
Retinoblastomprotein-Bindungsdomäne
(Aminosäuren
122
bis
129)
innerhalb
der
konservierten Region CR2 (Heise et al., 2000).
Das Plasmid pTRE.MEM kodiert für das Fusionsprotein MEM (Abb. 3.2), in dem das E1AProtein am N- und am C-Terminus mit jeweils einem Mer fusioniert wurde. Das Plasmid
pTRE.ME kodiert für das Fusionsprotein ME (Fusion des Mer am N-Terminus von E1A) und
pTRE.EM für das Fusionsprotein EM (Fusion des Mer am C-Terminus von E1A).
ΔpRB
G 525 R
EM
E1A
Mer
H2N
281
599
1
281
599
ΔpRB
ME
1
1
COOH
Mer
289
281
599
G 525 R
E1A
H2N
G 525 R
E1A
Mer
H2N
289
ΔpRB
G 525 R
MEM
COOH
Mer
289
281
COOH
599
Abbildung 3.2: Schematische Darstellung der chimärischen E1A-Mer-Proteine. Die Pfeile zeigen die mutierten
Regionen an. Die Zahlen geben die Aminosäuren-Positionen innerhalb der jeweiligen Teile der Chimären an.
G525R bedeutet Substitution von Arginin an der Position 525 durch Glycin. ΔpRB bedeutet eine Deletion der
RB-Bindungsdomäne (Aminosäuren 122 bis 129) innerhalb des E1A-Proteins.
Ergebnisse________________________________________________________ 61
3.3 Charakterisierung der E1A-Mer Fusionsproteine
3.3.1
Untersuchung der Expression
Zur Untersuchung der Expression der jeweiligen Chimären wurden die Plasmid-Konstrukte
pTRE.ME, pTRE.MEM und pTRE.EM auf HeLa Zellen analysiert. Dazu wurden die Zellen
mit den jeweiligen Expressionsplasmiden transfiziert. Um die Genexpression ausgehend vom
TRE-Promotor zu aktivieren, wurden die Zellen 24 h nach der Transfektion mit dem
adenoviralen
Vektor
Ad5-CMVrtTA-M2,
der
den
reverse
tetracycline-dependent
transactivator (rtTA-M2) exprimiert, transduziert (MOI 10). Um die Transaktivierung des
TRE-Promotors zu induzieren, wurde das Zellkulturmedium mit 1µg/ml Doxyzyklin versetzt.
Gleichzeitig wurden die Zellen in Anwesenheit bzw. in Abwesenheit von OHT zur
Aktivierung der exprimierten ME-, MEM- und EM-Chimären für 24 h inkubiert. Um die
Expression der E1A-Mer-Chimären zu untersuchen, wurde die gesamte RNA aus den Zellen
isoliert und mittels Northern Blots mit E1A-Sonden bestimmt, wobei die Normalisierung der
quantifizierten
Chimären-mRNA
auf
die
Expression
des
ubiquitär
exprimierten
(‚housekeeping‘)-Gens β-Aktin erfolgte (Abb. 3.3). Für alle drei Konstrukte wurden die
mRNA für die drei Fusionsproteine stark exprimiert, und es konnte kein Einfluss von OHT
auf die Expression der drei Fusions-Proteine auf transkriptioneller Ebene beobachtet werden.
Quantitativ betrachtet war der Expressionslevel des MEM-Konstrukts geringer als der von
ME und EM, was möglicherweise auf eine geringere Stabilität der MEM-mRNA, verglichen
mit der ME- bzw. EM-mRNA, zurückzuführen ist.
pAd.
TRE.ME
-
+
pAd.
TRE.MEM
-
+
pAd.
TRE.EM
-
+
OHT
MEM
ME
EM
β-actin
Abbildung 3.3: Transkriptionelle Expression der ME-, MEM- und EM-mRNA nach Transfektion mit ME-,
MEM- und EM-exprimierenden Plasmiden. HeLa-Zellen wurden mit pAd.TRE.ME, pAd.TRE.MEM und
pAd.TRE.EM transfiziert und 18h später mit Ad5CMVrtTA-M2 (MOI 10) transduziert. 24h nach Inkubation mit
Doxyzyklin (1µg/ml) und ohne bzw. mit OHT (2µM) wurde die gesamte RNA isoliert und 10µg davon mittels
Northern Blots mit einer einzelsträngigen E1A-Antisense Hybridisierungssonde analysiert. Die Pfeile geben die
entsprechenden Transkripte an. Zur Kontrolle der gleichen RNA-Ladung wurde der Blot mit einer 32Pmarkierten β-Aktin-Sonde rehybridisiert.
Ergebnisse________________________________________________________ 62
3.3.2
Funktionelle Charakterisierung der E1A-Mer Fusionsproteine
Das adenovirale E1A-Protein spielt eine essentielle Rolle im adenoviralen Replikationszyklus
(Russell, 2000). Eine seiner wichtigsten Funktionen besteht darin, verschiedene zelluläre und
virale Promotoren zu transaktivieren (Svensson and Akusjarvi, 1984; Lillie and Green, 1989;
Sanchez et al., 2000) und dadurch Gene zu aktivieren, die für die Virusreplikation erforderlich
sind. Um zu prüfen, ob die drei E1A-Mer Fusionsproteine diese funktionellen Eigenschaften
beibehalten, wurde ein Co-Transfektionsexperiment durchgeführt. Dabei wurden HeLa-Zellen
mit dem Reporter-Plasmid pAd5TRE-luc (Fechner et al., 2003) und mit den jeweiligen
Plasmiden pTRE.ME, pTRE.MEM bzw. pTRE.EM kotransfiziert, wobei das Plasmid
pAd5TRE-luc das Luciferase-Gen unter Kontrolle des minimalen CMV Promotors (CMVmin)
kodierte. Der TRE-Promotor hat eine Basalaktivität, die eine minimale Expression der
jeweiligen E1A-Mer Fusionsproteine sowie des Luciferase-Reporters ermöglicht. Nach 48stündiger Behandlung der Zellen ohne und mit zwei unterschiedlichen OHT- Konzentrationen
konnte die Transaktivierung des CMVmin durch Messung der Luciferase-Aktivität für alle drei
Fusionsproteine nachgewiesen werden (Abb. 3.4).
2.3x
200 0
Luciferase-Aktivität in RLU/Zellen
180 0
1.9x
5.4x
4.3x
6.6x
5.5x
160 0
140 0
1
2
120 0
Ohne OHT
3
4
5
100 0
200 nM OHT
6
7
8
80 0
2 µM OHT
9
10
11
60 0
40 0
20 0
0
mock
pAd.ME
pAd.MEM
pAd.EM
Abbildung 3.4: OHT-abhängige Transaktivierung des CMVmin durch die E1A-Mer-Chimären. HeLa-Zellen
wurden mit pTRE.ME, pTRE.MEM und pTRE.EM transfiziert und mit dem Luciferase-exprimierenden Plasmid
pAd5TREluc kotransfiziert. Nach der täglichen Zugabe von 0,02 bzw. 2µM OHT war eine dosisabhängige
Steigerung der Luciferase-Aktivität zu erkennen. Als Mock-Kontrolle wurden die Zellen mit pAd5TREluc und
pAd5TRE-iGFP (ein Plasmid ohne E1A-Sequenz) kotransfiziert.
Allerdings zeigten die Konstrukte unterschiedliche Transaktivierungsstärken, die zusätzlich
von der OHT-Konzentration abhängig waren. Zellen, die mit den Konstrukten pTRE.ME und
pTRE.MEM kotransfiziert wurden, zeigten eine ähnliche Luciferase-Aktivität im induzierten
Status. Jedoch war die Basalaktivität beim ME-Protein 3-fach höher als bei MEM. Die
Ergebnisse________________________________________________________ 63
Induzierbarkeit betrug das 2,3-fache für ME bzw. das 5,4-fache für MEM. Das Konstrukt
pTRE.EM zeichnete sich durch die höchste Regulierbarkeit (6,6-fach) und die geringste
basale Aktivierung des CMVmin Promotors aus. In der Luciferase-Aktivität war kein
Unterschied erkennbar, wenn die mit den Plasmiden pAd5TRE-luc und pAd5TRE-iGFP
kotransfizierten Zellen mit denen verglichen wurden, die nur mit pAd5TRE-luc transfiziert
worden
waren.
Dies
belegte,
dass
alle
E1A-Mer-Konstrukte
die
originäre
Transaktivierungsfunktion des E1A-Proteins nur in Anwesenheit von OHT beibehalten.
3.4 Trans-Komplementierung der Adenovirusreplikation durch die E1AMer-Chimäre
Die Vermehrung des adenoviralen Genoms
ist die Vorstufe einer produktiven
Virusreplikation, in der das E1A-Protein eine essentielle Rolle spielt. Um zu überprüfen, ob
trotz der Fusion mit Mer die resultierenden Chimären die Replikation des adenoviralen
Genoms steuern können, wurde ein Trans-Komplementierungsexperiment durchgeführt.
HeLa-Zellen wurden mit dem Plasmid pTRE.EM transfiziert und einen Tag später mit dem
E1-deletierten Adenovirusvektor (AdV) Ad5CMV-luc als Indikator und mit dem AdV
Ad5CMVrtTA-M2 kotransduziert. Nach 48-stündiger Behandlung mit und ohne Doxyzyklin
zur Induktion der EM-Expression und mit OHT zur Aktivierung der EM-Chimäre wurde die
virale DNA-Menge des Indikator-Virus mittels kompetitiver semi-quantitativer PCR
bestimmt. In Anwesenheit von OHT nahm die Ad5CMV-luc-DNA um das 38-fache im
Vergleich zur viralen DNA-Menge in Abwesenheit von OHT zu (Abb. 3.5). Im nicht
induzierten Status war die virale DNA-Menge vergleichbar mit der Kontrolle, bei der eine
Transfektion mit dem Kontroll-Plasmid pAd5TRE-iGFP und nachfolgender Koinfektion mit
Ad5CMV-rtTA-M2 und Ad5CMV-luc stattfand. Die Daten zeigen, dass die EM-Chimäre
nach Aktivierung mit OHT die Replikation des Adenovirusgenoms trans-komplementieren
kann.
Ergebnisse________________________________________________________ 64
- OHT
20
Adenovirale DNA-Menge in aU
38.3 x
2.1 x
+ OHT
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
1
Mock
2
3
pAd.TRE.EM
Abbildung 3.5: OHT-abhängige Trans-Komplementierung der adenoviralen DNA-Replikation. HeLa-Zellen
wurden mit pTRE.EM transfiziert und 24h später mit Ad5CMVrtTA-M2 und Ad5CMVluc infiziert. Die Zellen
wurden mit täglicher Zugabe von OHT (2µM) und Dox (1µg/ml) 48h inkubiert und die DNA isoliert. Die virale
DNA-Replikation wurde durch Messung der Luciferase-DNA mittels semiquantitativer PCR analysiert und in
zufälligen Einheiten angegeben. Als Mock-Kontrolle wurden die Zellen mit pAd5TRE-iGFP statt mit
pAd.TRE.EM transfiziert.
3.5 Untersuchung des Wirkmechanismus der Tam-abhängigen Regulation
der Aktivität von E1A-Mer-Chimären
Als transkriptioneller Aktivator (Rhoades et al., 1996; Sassone-Corsi and Borrelli, 1987)
wandert das E1A-13S nach seiner Expression sehr schnell aufgrund eines starken Kernsignals
an seinem Carboxyl-Terminus in den Zellkern (Krippl et al., 1985; Moran et al., 1987). Da die
HBD der Steroidrezeptoren ihrerseits in Abwesenheit ihrer Liganden mit verschiedenen
zytoplasmatischen Proteinen, darunter das „heat shock protein 90“ (HSP90) komplexieren
(Chambraud et al., 1933; Picard et al., 1990), könnte die Sequestrierung der E1A-MerChimären im Zytoplasma in Abwesenheit von Liganden ein möglicher Mechanismus sein,
über den die funktionelle Inaktivierung der HBD-haltigen Proteine stattfindet. Um diese
Hypothese zu überprüfen, wurde die subzelluläre Lokalisation der E1A-Mer-Fusionsproteine
untersucht. Die transiente Expression der ME-, MEM- bzw. EM-Chimären in HeLa-Zellen
zeigte nach Anfärbung mit dem gegen E1A gerichteten Antikörper unterschiedliches
Verhalten der exprimierten Fusionsproteine (Abb. 3.6). Nach 48-stündiger Behandlung mit
OHT wiesen ME und EM wie das native E1A eine exklusive nukleare Lokalisation sowohl in
Abwesenheit als auch in Anwesenheit von OHT auf. Das Fusionsprotein MEM wurde in
Anwesenheit von OHT ausschließlich im Nukleus detektiert, während es in nicht induziertem
Status zwar überwiegend im Nukleus, aber auch im Zytoplasma lokalisiert war. Diese
Ergebnisse________________________________________________________ 65
Ergebnisse zeigten, dass das ME und das EM-Fusionsprotein nicht im Zytoplasma
zurückgehalten werden, obwohl ihre Aktivität von OHT abhängt. Daher schien die OHTabhängige Regulation der E1A-Mer-Aktivität nicht hauptsächlich auf der zytoplasmatischen
Sequestrierung des Proteins zu beruhen.
Abbildung 3.6: Subzelluläre Lokalisation der E1A-Mer-Chimären. Nach Kotransfektion von HeLa-Zellen mit
pAd5CMVrtTA-M2 und mit jeweils pTRE.ME, pTRE.MEM und pTRE.EM bzw. pTRE-E1A wurden 48h nach
Inkubation ohne oder mit Dox (1,5µg/ml) und OHT (2µM) die exprimierten Chimären mittels indirekter
Immunfluoreszenz mit dem Anti-E1A-Antikörper als primärer und mit dem Biotin-konjugierten Esel-AntiKaninchen-Antikörper als sekundärer Antikörper detektiert. Als fluoreszierender Stoff diente das mit
Streptavidin gekoppelte Cy3 (Rot). Der Zellkern wurde mit Dapi blau angefärbt. Die Überlagerung beider
Fluoreszenzbilder zeigt bei ME, EM und E1A ausschließlich eine nukleare Lokalisation (Magenta), während
MEM sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma ist.
3.6 Konstruktion von Tamoxifen-abhängigen adenoviralen Vektoren
(Tam-oAdV)
Auf der Grundlage der aus den obigen Experimenten gewonnenen Daten wurden drei
adenovirale Vektoren Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM konstruiert (Abb. 3.7). Um die Replikation
der
Vektoren
gewebespezifisch
zu
steuern,
wurde
der
ubiquitär-aktive
minimale
Cytomegalovirus-Promotor durch den lungenspezifischen humanen surfactant protein B (SPB) Promotor ersetzt. Dazu wurden zunächst die Shuttle-Plasmide pAd.ME, pAd.MEM,
pAd.EM und pAd.E konstruiert. Zur Konstruktion der viralen Vektoren wurden die Shuttle-
Ergebnisse________________________________________________________ 66
Plasmide mit SpeI linearisiert und mit dem RR5-Long Arm zusammenligiert, so dass die
jeweiligen
ME-,
MEM,
EM-Expressionskassetten
jeweils
in
die
E1-Region
des
Adenovirusmutanten RR5 inseriert wurden. Die Ligationsprodukte wurden dann in HEK 293
Zellen transfiziert und die entstandenen adenoviralen Plaques propagiert und gereinigt (siehe
Kap. 3.10). Die Virustiter wurden durch den Standard Plaque Assay und anschließend durch
quantitative PCR bestimmt.
A
Ad5-Wildtyp
E1A
RR5-Mutant
B
Ad.ME
E1A/E1B-Deletion
E3-Deletion
445 - 3333
Substitution
30005 - 30750
ψ
E1A
ψ
Mer
TetO7 SP-B
Ad.EM
27360-30960 3‘ITR
1714-4026
TetO7 SP-B
Ad.MEM
E3
E1B
460-1543
5‘ITR
ψ
TetO7 SP-B
Mer
ME
pA
E1A
Mer
pA
MEM
E1A
Mer
EM
pA
ψ
Ad.E
E1A
TetO7 SP-B E1AΔpRB pA
Abbildung 3.7: Schematische Darstellung der adenoviralen Vektoren. (A) Adenovirus-Wildtyp und RR5Mutant. (B) In Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM wurden die entsprechenden Expressionskassetten in die E1-Region
von RR5 inseriert. Sieben Wiederholungen des Tetrazyklin-Operators (TetO7), Adenovirus-Verpackungssignal
(ψ), surfactant Protein B Promotor (SP-B), Polyadenylierungsignal (pA), inverted terminan repeat (ITR). Ad.E
ist das Kontroll-Virus mit E1AΔpRB (E1A mit Deletion der pRB-Bindungssequenz).
3.6.1
Überprüfung der viralen Konstrukte
Bei der Propagation von AdV nach der in vitro Ligationsmethode besteht die Möglichkeit
einer Kontamination durch das Ausgangsgenom (RR5). Um die RR5-Kontamination und die
Integrität der Vektorgenome zu überprüfen, wurden die Virus-Präparationen einem HindIIIVerdau unterworfen. Die Abb. 3.8 zeigt die Restriktionsmuster der Vektoren Ad.ME,
Ad.MEM und Ad.EM mit den jeweiligen Fragmenten, die die spezifischen Sequenzen der
jeweiligen E1A-Mer-Konstrukte enthalten. Neben den spezifischen HindIII-Fragmenten für
RR5-Long Arm waren transgenspezifische Fragmente mit 3073, 4032 und 3047 bp bei
Ad.ME, Ad.MEM bzw. Ad.EM nachweisbar, während die RR5-spezifische Bande bei 3353
bp lag. Diese Bandenmuster belegten das Vorhandensein der jeweiligen TransgenExpressionskassetten und dass die drei Vektoren frei von RR5-Hintergrund waren. Zum
anderen wurde durch PCR-screening das Vorhandensein des Transgens in den jeweiligen
Vektoren bestätigt (Daten nicht gezeigt).
Ergebnisse________________________________________________________ 67
RR5
Ad.MEM
Ad.ME
Ad.EM
4032 bp
3353 bp
3073 bp
3047 bp
Abbildung 3.8: Überprüfung der gereinigtenTam-oAdV. HindIII-Verdau von Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM und
RR5. Die Pfeile zeigen für Ad.MEM, Ad.ME und Ad.EM die Fragmente, die die MEM-, ME- bzw. EMExpressionskassetten enthalten. Der Vergleich mit dem RR5-Restriktionsmuster zeigt eindeutig, dass die drei
Vektoren frei von Backbone-Kontaminationen sind.
Aufgrund des Vorhandenseins homologer Sequenzen der Ad5-DNA (12,5% des 5’-Ende und
8,7% des 3’-Ende) in den Verpackungszellen HEK293 (Aiello et al., 1979) können bei der
Vermehrung
der
AdV
replikationskompetente
Adenoviren
(RCA)
infolge
der
Rekombinationen (Abb. 3.9A) von Ad5-DNA und Vektorgenom entstehen (Fallaux et al.,
1998; Schiedner et al., 2000).
B
A
Ψ
E1A
Trangen
3´- ITR
5´- ITR
M
Rekombination in 293-Zellen
PCR
RCA
Ad-Vektor
1285 bp
Ad 3315s Ad 4600as3´- ITR
5´- ITR
Ψ
Trangen
R
C
A
Ad-Vektor
Ψ
Ad
.M
E
Ad
.M
E
Ad M
.E
M
K-
Ad5 DNA
in 293
1285 bp
PCR
Kein Fragment
Ad 4600as 3´- ITR
5´- ITR
Ad 3315s
Abbildung 3.9: Überprüfung der Vektoren auf Kontamination durch RCA. (A) Entstehung der RCA bei der
Propagation der AdV in HEK293. (B) PCR wurde mit dem Primerpaar Ad5-3315s und Ad5-4600A durchgeführt.
Das RCA-spezifische PCR-Produkt bei 1285bp fehlt bei Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM und das deutet daraufhin,
dass sie RCA-frei sind.
Daher ist eine Überprüfung der adenoviralen Vektoren vor und nach jeder Viruspräparation
erforderlich. Hier wurden die produzierten Vektoren mittels PCR-screening mit den
spezifischen Primern Ad5-324s und Ad5-4600as analysiert. Abb. 3.9B zeigt die PCRProdukte nach gelelektrophoretischer Auftrennung. Im Vergleich zu einem RCAkontaminierten Kontrollvirusstock bestätigte die Abwesenheit der 1285 bp-Bande bei Ad.ME,
Ad.MEM und Ad.EM die RCA-Freiheit der drei Vektoren.
Ergebnisse________________________________________________________ 68
3.7 Charakterisierung der Tam-oAdV
3.7.1
Expression der E1A-Mer-Chimären nach Infektion mit den Tam-oAdV
Zur Charakterisierung der adenoviralen Vektoren wurde zunächst die Expression der
Fusionsproteine untersucht. Die Lungenadenokarzinom-Zelllinie H441 wurde mit den
Vektoren Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM und mit dem Kontroll-AdV Ad.E bei einer MOI 4
infiziert. Die Northern-Blot-Analyse nach 24-stündiger Inkubation der infizierten Zellen mit
2µM OHT zeigte, dass die Expression der Fusionsproteine ME, MEM und EM von OHT
abhängig war, während die der E1A-Kontrolle unabhängig von OHT verlief (Abb. 3.10A).
B
M
E
.M d.ME d.EM Ad.E
d
A
A
A
OHT
MEM
ME
β-actin
- + - + - +
4x
4,7x
Ad.ME
Ad.MEM
10,2x
1,2x
Ad.EM
Ad.E
0,9
0,8
- +
EM
E1AΔpRB
relative RNA-Menge
A
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
- OHT
+ OHT
Abbildung 3.10: Expression der E1A-Mer-Chimäre nach Infektion mit Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM und dem
Kontroll-Vektor Ad.E. (A) mRNA-Expression der E1A-Mer-Chimären nach Infektion von H441-Zellen mit
Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM sowie mit dem Kontroll-Vektor Ad.E. Die Zellen wurden nach Infektion mit den
jeweiligen Vektoren (MOI 4) mit 2µM OHT für 24h inkubiert und die mRNA-Expression mittels Northern-BlotAnalyse unter Verwendung einer einzelsträngigen 32P-markierten E1A-Hybridisierungssonde durchgeführt. Zur
Kontrolle der gleichen RNA-Ladung wurde eine Rehybridisierung des Blots mit einer 32P-markierten β-ActinSonde vorgenommen. (B) Densitometrische Quantifizierung der relativen mRNAs. Die OHT-abhängige
Erhöhung der Expression wurde als Verhältnis zwischen mRNA-Mengen in Anwesenheit und in Abwesenheit
von OHT berechnet.
Bei den Vektoren Ad.ME und Ad.MEM wurde in Abwesenheit von OHT keine Expression
der Chimären detektiert. Allerdings lag die Expressionsstärke bei beiden Konstrukten deutlich
unter dem Niveau von Ad.EM und Kontrollvektor Ad.E. In Anwesenheit des Induktors OHT
war der Expressionslevel vom EM-Protein sogar höher als der von E1A aus dem
Kontrollvektor, wobei jedoch auch in nicht induziertem Status EM-mRNA detektierbar war.
Im Vergleich zur Abwesenheit von OHT ergab die quantitative Evaluierung der mRNAExpression eine 4-, 4,7- und eine 10,2-fache Erhöhung der mRNA-Expression für Ad.ME,
Ad.MEM bzw. Ad.EM in Anwesenheit von OHT (Abb. 3.10B). Dieses Ergebnis belegte, dass
auf viraler Ebene die mRNA-Expression der E1A-Mer-Chimären nach Infektion mit den
Tam-oAdV von OHT abhängig war, während das für den Kontroll-oAdV nicht der Fall war.
Ergebnisse________________________________________________________ 69
3.7.2
Untersuchung der Funktionalität der Tam-oAdV
3.7.2.1 Die Replikation der adenoviralen Genome wird von E1A-Mer Chimären und in
Abhängigkeit von OHT kontrolliert
Um die Vervielfachung des viralen Genoms nach der Infektion zu untersuchen, wurden die
drei Vektoren Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM bezüglich der DNA-Replikation analysiert. H441Zellen wurden mit den jeweiligen Vektoren und mit dem Kontroll-Vektor Ad.E infiziert und
anschließend in Anwesenheit bzw. in Abwesenheit von OHT inkubiert. 24 h nach Infektion
wurde die gesamte DNA isoliert und die Virus-DNA mittels Southern Blots analysiert
(Abb. 3.11). In Korrelation mit der mRNA-Expression (Abb. 3.10) nahm die Menge der
Virus-DNA in Anwesenheit von OHT deutlich zu, was auf eine OHT-abhängige
Virusreplikation deutete. Beim Kontroll-Vektor Ad.E hingegen war die Replikation des
viralen Genoms unabhängig von OHT. Darüber hinaus zeigte der Ad.EM eine stärkere
Genomreplikation als das Kontroll-Virus Ad.E, wies aber auch eine hohe BackgroundReplikation auf. Die beiden Konstrukte Ad.ME und Ad.MEM zeichneten sich durch eine im
Vergleich zu Ad.EM geringere Genomreplikation aus. Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Chimären ME, MEM und EM in Abhängigkeit von OHT die Replikation des viralen Genoms
steuern, allerdings mit unterschiedlicher Effizienz.
Ad.ME Ad.MEM Ad.EM
OHT
-
+
-
+
-
+
Ad.E
-
+
Abbildung 3.11: Untersuchung der OHT-abhängigen
Replikation der viralen Genome. H441-Zellen wurden mit
Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM und Ad.E infiziert (MOI 5).
Nach Inkubation der Zellen in Anwesenheit und
Abwesenheit von 2µM OHT wurde die DNA isoliert und
die virale DNA-Replikation nach Restriktion mit HindIII
mittels Southern-Blot-Hybridisierung unter Verwendung
von 32P-markierten sense und antisense E1A-Sonden
untersucht.
3.7.2.2 OHT-abhängige Regulation der Replikation der Tam-oAdV
Im Folgenden wurden die Vektoren hinsichtlich der vollständigen Virusreplikation, d.h. auf
die Produktion infektionsfähiger Viruspartikel untersucht. Die H441-Zellen wurden mit
jeweils Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM bzw. mit dem Kontroll-Virus Ad.E bei MOI 4 infiziert.
Nach 3-stündiger Inkubation wurden die Zellen gewaschen und ohne bzw. mit 2µM OHT
weiter inkubiert. Die Bestimmung der produzierten Virus-Nachkommen erfolgte 24, 48 und
72h nach Infektion mittels Plaques-Assay. Die jeweiligen Vektoren zeigten verschiedene
Regulierbarkeit und Replikationsstärke (Abb. 3.12). Einen Tag nach der Infektion war die
Virusreplikation bei allen drei Vektoren relativ gering, allerdings hatte Ad.EM den höchsten
Titer. In Anwesenheit von OHT nimmt 24h nach Infektion die Virus-Produktion um jeweils
Ergebnisse________________________________________________________ 70
den Faktor 1,3, 11,8 und 30,8 bei Ad.ME, Ad.MEM bzw. Ad.EM zu. Danach nimmt die
Virusproduktion rasch zu und erreicht für Ad.MEM das 50-fache nach 48h und über das 90fache nach 72h. Das Konstrukt Ad.ME zeichnete sich durch eine 11,3-fache Zunahme der
Virusproduktion nach 48h aus, aber die Regulierbarkeit sank nach 72h auf das 5,4-fache, was
hauptsächlich auf die Zunahme der Replikation in Abwesenheit von OHT zurückzuführen
war. Ad.EM zeigte eine 40,7- fache Zunahme der Virusproduktion nach 48h und eine 24fache nach 72h in induziertem Status.
x 105
1,3x
11,3x
x 106
6
5,4x
4
50x
92,5x
-OHT
-OHT
+OHT
5
+OHT
PFU/ml
3
PFU/ml
11,8x
2
1
4
3
2
1
0
0
24h
48h
24h
72h
48h
72h
Ad.MEM
Ad.ME
PFU/ml
x 107
30,6x
40,7x
24x
6
-OHT
5
+OHT
4
3
2
1
0
24h
48h
72h
Ad.EM
Abbildung 3.12: Replikation von Ad.ME, Ad.MEM und Ad.EM in Abhängigkeit von OHT in H441-Zellen. Die
Zellen wurden mit den jeweiligen Vektoren mit MOI 4 für 3h infiziert. Nach dreimaligem Waschen wurden die
Zellen mit frischem Medium versorgt und in Abwesenheit bzw. in Anwesenheit von 2µM OHT täglich inkubiert.
Die Bestimmung des Virus-Titers erfolgte nach den angegebenen Zeiten und ist als plaques forming units (PFU)
pro ml Zelllysat dargestellt. Die Faktoren der Induktion wurden als Verhältnis zwischen dem Titer in
Anwesenheit und dem Titer in Abwesenheit von OHT berechnet.
3.7.2.3 Untersuchung der Replikation der Tam-oAdV in Abhängigkeit von der OHTKonzentration
Um den Einfluss der Konzentration von OHT auf die Aktivität der E1A-Mer-Chimären zu
untersuchen, wurde ein Dosisabhängigkeits-Experiment durchgeführt. H441-Zellen wurden
mit Ad.MEM (MOI 2) infiziert und in Abwesenheit bzw. in Anwesenheit von steigender
Ergebnisse________________________________________________________ 71
Konzentration von OHT (0 – 10 µM) inkubiert. Die neu produzierten Virus-Partikel wurden
48h nach der Infektion mittels Standard-Plaques-Assay ermittelt. Die Virusreplikation nahm
mit steigender Konzentration von OHT zu (Abb. 3.13A-B). Durch Erhöhung der OHTKonzentration auf 10µM konnte die Replikation von Ad.MEM bis um das 950-Fache
gesteigert werden. Allerdings wäre eine solche Konzentration in vivo aufgrund der Toxizität
nicht applizierbar. Für weitere in vitro Experimente mit den Tam-oAdV wurden daher 2µM
OHT eingesetzt.
A
B
Steigerung der Virusreplikation
40
35
PFU / Zelle
30
25
20
15
10
5
0
1
0
2-3
10
3-2
10
4-1
10
5
1
6
2
OHT-Konzentration (µM)
7
4
8
10
1200
1000
800
600
400
200
0
1 -3
10
2 -2
10
3 -1
10
4
1
5
2
6
4
7
10
OHT-Konzentration (µM)
Abbildung 3.13: OHT-Dosisabhängigkeit der Ad.MEM-Replikation in H441-Zellen. Die Zellen wurden mit
Ad.MEM infiziert (MOI 2) und in Anwesenheit steigender OHT-Konzentration inkubiert. Der Virus-Titer wurde
48h nach Infektion bestimmt (A) und die OHT-abhängige Steigerung der Virus-Produktion als Verhältnis
zwischen Titer in Anwesenheit und dem Titer in Abwesenheit von OHT berechnet (B).
3.8 Tam -abhängige Regulation von Ad.MEM in vivo
Um die Regulierbarkeit der Tam-oAdV in vivo zu untersuchen, wurde Ad.MEM aufgrund der
besten Regulation seiner Replikation in vitro gewählt. Zunächst wurde ein subkutanes
Lungentumormodell etabliert. Dazu wurden H441-Zellen in die rechten Flanken von 2
Wochen alten Nacktmäusen (nu/nu) appliziert und bis zum Erreichen eines Volumens von
100 mm3 wachsen gelassen. Die Tiere wurden in drei Gruppen eingeteilt, von denen die erste
Gruppe (7 Mäuse) und die zweite Gruppe (7 Mäuse) mit dem Ad.MEM und die dritte Gruppe
(5 Mäuse) mit dem replikationsdefizienten Kontroll-Vektor Ad5TREluc mit jeweils
5x107 PFU intratumoral infiziert wurde. Die Tiere der zweiten Gruppe wurden mit OHT
täglich intraperitoneal behandelt, um die Virusreplikation zu induzieren. Fünf Tage nach der
Infektion wurden die Tumoren entnommen und die Virus-Titer bestimmt. In der mit OHT
behandelten Tiergruppe zeigte Ad.MEM eine 31-fache Erhöhung der Virusproduktion in den
Ergebnisse________________________________________________________ 72
Tumoren im Vergleich zu den nicht behandelten Tieren (P = 0,058) (Abb. 3.14). Im Vergleich
zur Kontroll-Gruppe war die Replikation von Ad.MEM signifikant höher (P < 0,005).
Zwischen der mit Ad.MEM-infizierten Gruppe und der Kontroll-Gruppe ergab sich kein
signifikanter Unterschied, wenn die Tiere nicht behandelt wurden. Diese Daten deuteten in
Übereinstimmung mit den in vitro Experimenten auf eine klare Tendenz hin, dass die
Ad.MEM- Replikation auch in vivo OHT-abhängig ist.
108
107
Pfu/ml
106
105
104
103
102
101
1
-
+
Ad.MEM
+
OHT
Ad5TRE-Luc
Abbildung 3.14: Regulation von Ad.MEM in vivo im Mausmodell mit subkutanem H441-Xenograften. Die
erste (n = 7) und die zweite (n = 7) Tiergruppe wurden mit Ad.MEM intratumoral infiziert?, während die
Kontroll-Gruppe (n = 5) mit Ad5TREluc infiziert wurde. Die Tiere der Gruppe 2 erhielten intraperitoneal 0,5 mg
OHT am ersten Tag und anschließend Tamoxifen (5mg am Tag 2 und 3 und 2,5 mg am Tag 4). Tiere der Gruppe
1 und der Kontroll-Gruppe wurden mit 50 µl Erdnussöl-Ethanol-Suspension entsprechend behandelt. Der VirusTiter wurde aus isolierten Tumoren 5 Tage nach Infektion bestimmt. Die statistischen Vergleiche zwischen den
Gruppen sind durch den P-Wert angegeben. Die geometrischen Mittelwerte des Virus-Titers sind durch
horizontale Striche dargestellt.
3.9 Optimierung der EM-Chimäre
3.9.1
Deletion des Kernsignals im EM-Fusionsprotein und der daraus resultierende
Effekt auf dessen Aktivität
Untersuchungen von Krippl und Mitarbeiter (1985) zeigten, dass das Kernsignal-deletierte
E1A-Protein funktionell für die Virusreplikation erhalten bleibt, aber nur langsam in den
Zellkern transportiert wird. Ausgehend davon wurde der Einfluss der Kernsignal-Deletion auf
die basale Replikation von Ad.EM untersucht. Ein neues Vektor-Konstrukt, Ad.EΔNLSM,
wurde generiert, indem die letzten 77 Aminosäuren am C-Terminus des E1A-Teils innerhalb
des EM-Fusionsproteins deletiert wurden (Abb. 3.15).
Ergebnisse________________________________________________________ 73
A
289
222
RECNSSTDSCDSGPSNTPPEIHPVVPLCPIKPVAVRVGGRRQAVDCIEDLLNESGQPLDLSCKRPRP
E1A 13s
NLS
CR2 CR3
289
CR1
1
Mer
EM
Mer
EΔNLSM
1
MEΔNLSM
222
Mer
Mer
B
Ad. EΔNLSM
ψ
E1A
TetO7 SP-B
Mer
EΔNLSM
pA
Abbildung 3.15: Deletion des Kernsignals in EM. (A) Deletion des Kernsignals (Aminosäurensequenz 222289 des E1A-Teils) in Ad.EM und Ad.MEM. Nuclear lokalisation signal (NLS), Konservierte Region (CR),
die Ziffern geben die Aminosäuren-Position an. (B) Schematische Darstellung von Ad.EΔNLSM und
Ad.MEΔNLSM.
3.9.2
Nachweis und subzelluläre Lokalisation der EΔNLSM- und MEΔNLSMFusionsproteine
Um die Auswirkung der NLS-Deletion auf das Zytoplasma-Zellkern-Trafficking der EΔNLSMund MEΔNLSM-Proteine zu analysieren, wurde die subzelluläre Lokalisation untersucht. HeLaZellen wurden mit den Plasmiden pAd.EΔNLSM bzw. pAd.MEΔNLSM transfiziert. Die
Zellspezifizität des SP-B Promotors wurde durch Kotransfektion mit pAd5.rtTA-M2
aufgehoben und die Transaktivierung des Tetrazyklin-responsiven SP-B Promotors durch den
Transaktivator rtTA-M2 wurde durch Zugabe von Doxyzyklin induziert. Nach 48-stündiger
Inkubation der Zellen mit bzw. ohne OHT wurden die EΔNLSM- und MEΔNLSM-Proteine durch
indirekte Immunfluoreszenz analysiert. Wie aus Abb. 3.16 ersichtlich, war das EΔNLSMProtein in Abwesenheit von OHT im Zytoplasma und im Zellkern gleichmäßig verteilt. In
Gegenwart von OHT lag das Protein überwiegend im Nukleus. Das MEΔNLSM-Protein zeigte
hingegen ausschließlich eine zytoplasmatische Lokalisation in Abwesenheit von OHT,
während in Gegenwart von OHT das Protein überwiegend im Zellkern detektiert wurde. Diese
Ergebnisse zeigen, dass durch die Deletion des Kernsignals am C-Terminus des E1A-Proteins
das subzelluläre Trafficking des Fusionsproteins stärker von OHT abhängig gemacht wurde.
Ergebnisse________________________________________________________ 74
Abbildung 3.16: Subzelluläre Lokalisation von MEΔNLSM- und EΔNLSM-Fusionsprotein. HeLa-Zellen wurden
mit pAd5CMVrtTA-M2 und jeweils mit pAd.EΔNLSM, pAd.MEΔNLSM kotransfiziert. Nach 48-stündiger
Inkubation mit Dox (1,5µg/ml) und in Abwesenheit bzw. in Gegenwart von OHT (2µM) wurden die
exprimierten Chimären mittels indirekter Immunfluoreszenz angefärbt (siehe Abb. 3.5). Die Pfeile zeigen die
zytoplasmatische Färbung.
3.10 Charakterisierung des Deletionsmutanten Ad.EΔNLSM
3.10.1 Untersuchung der EΔNLSM-Expression
Angesichts der Verbesserung der OHT-Abhängigkeit des nuklearen Transports wurde der
Vektor Ad.EΔNLSM weiter charakterisiert. Zunächst wurde die Expression von EΔNLSM auf
transkriptionaler Ebene untersucht. H441-Zellen wurden mit Ad.EM, Ad.EΔNLSM bzw. mit
dem Kontroll-Vektor Ad.E mit MOI 4 infiziert und in Anwesenheit bzw. in Abwesenheit des
Induktors OHT inkubiert. Die Expression der jeweiligen Transkripte wurde mittels NorthernBlot analysiert. Im Vergleich mit EM und mit der E1A-Kontrolle wurde das EΔNLSMTranskript nur in Gegenwart von OHT detektiert (Abb. 3.17). Allerdings war der EΔNLSMExpressionslevel nach der Induktion geringer als der von EM und von E1A.
Ergebnisse________________________________________________________ 75
Ad.EM
Ad.EMΔNLS
Ad.E
EM
EMΔNLS
E1A-13s
β-actin
Abbildung 3.17: OHT-abhängige Expression der EΔNLSM-mRNA nach Infektion von H441-Zellen mit
Ad.EΔNLSM. Als Vergleich wurden Ad.EM und Ad.E einbezogen. Die H441-Zellen wurden mit den jeweiligen
Vektoren infiziert (MOI 4). Die gesamte RNA wurde 24 h nach Infektion isoliert und die mRNA-Expression
mittels Northern-Blot-Hybridisierung mit einer E1A-Sonde (siehe 4.9A) analysiert. Die Pfeile zeigen die
jeweiligen Transkripte.
3.10.2 Kontrolle der adenoviralen DNA-Replikation durch die EΔNLSM-Chimäre
Im Folgenden wurde die Replikation des Ad.EΔNLSM-Genoms untersucht und mit der von
Ad.MEM und Ad.EM verglichen. Dazu wurden H441-Zellen mit den jeweiligen Vektoren
(MOI 4) infiziert und in Anwesenheit bzw. in Abwesenheit von OHT inkubiert. 24 h später
wurde die gesamte DNA aus den Zellen präpariert und eine Southern-Blot-Analyse zur
Quantifizierung des viralen DNA-Gehalts durchgeführt. Während das Ad.EM-Genom in
Abwesenheit von OHT detektiert werden konnte, waren das Ad.EΔNLSM- und das Ad.MEMGenom ausschließlich in Anwesenheit von OHT nachweisbar (Abb. 3.18). Die Signalstärke in
induziertem Zustand bei Ad.EΔNLSM war zwar geringer als bei Ad.EM, aber deutlich stärker
als die von Ad.MEM. Dieses Ergebnis deutete daraufhin, dass das EΔNLSM-Protein effizient
die Replikation des adenoviralen Genoms steuern kann. Außerdem zeigt das neue Konstrukt
eine strikte Regulierbarkeit im Vergleich zum Ausgangskonstrukt Ad.EM.
Ad.MEM
OHT
-
+
Ad.EM
-
+
Ad.EΔNLSM
-
+
Abbildung 3. 18: Effekt der Kernsignaldeletion im EΔNLSM-Protein auf die OHT-abhängige Regulation der
viralen DNA-Replikation. H441-Zellen wurden mit Ad.EΔNLSM, Ad.EM bzw. Ad.MEM infiziert (MOI 4). Die
virale DNA wurde mittels Southern-Blot-Hybridisierung unter Verwendung von 32P-markierten sense und
antisense E1A-Sonden nach 48-stündiger Inkubation der Zellen in Abwesenheit bzw. in Anwesenheit von 2µM
OHT analysiert.
Ergebnisse________________________________________________________ 76
3.10.3 Replikation von Ad. EΔNLSM
Die Fähigkeit von Ad.EΔNLSM, neue infektiöse virale Partikel zu bilden, wurde über den
Virusreplikations-Assay bestimmt. H441-Zellen wurden mit Ad. EΔNLSM bzw. Ad.EM und
mit dem Kontroll-Vektor Ad.E (jeweils MOI 5) infiziert und in Abwesenheit bzw. in
Anwesenheit von OHT inkubiert. Die Titration der gebildeten Viruspartikel in Zelllysaten
zeigte 48 h nach Infektion eine 14-fache Reduktion der Ad.EΔNLSM-Replikation in nicht
induziertem Status im Vergleich zum ursprünglichen Vektor Ad.EM (Abb. 3.19). Dieses
ergab eine 2-fache Verbesserung der OHT-abhängigen Regulierbarkeit der gesamten
Virusreplikation im Vergleich mit Ad.EM. Obwohl die Reduktion der Basalreplikation bei
Ad.EΔNLSM auf Kosten der absoluten Virusreplikation (Reduktion um den Faktor 8 im
Vergleich mit Ad.EM in Gegenwart von OHT) ging, war unter induzierten Bedingungen die
Replikation von Ad.EΔNLSM nur etwa zweimal niedriger als die von Ad.E. Der Vektor Ad.E
zeigte in Anwesenheit und in Abwesenheit von OHT keinen signifikanten Unterschied in der
Replikation. Diese Ergebnisse zeigen, dass durch Deletion des Kernsignals im E1A-Teil der
EM-Chimäre eine deutliche Reduktion der Basalreplikation sowie eine stringente Regulation
der oAdV erreicht werden kann. Allerdings muss dabei eine Reduktion der Virusreplikation in
Kauf genommen werden.
x106
53.7x
90.5x
1,9x
16
16000000
- OHT
14
14000000
+ OHT
12
Pfu/ml
12000000
10
10000000
8
8000000
6
6000000
4
4000000
2
2000000
00
Ad.EM
Ad.EΔNLSM
Ad.E
Abbildung 3.19: Effekt der Kernsignaldeletion im EΔNLSM-Protein auf die OHT-abhängige Regulation der
Virusreplikation. H441-Zellen wurden mit Ad.EM, Ad.EΔNLSM bzw. Ad.E infiziert (MOI 5). Der Virus-Titer im
Zelllysat erfolgte mittels Plaque-Assay nach 48-stündiger Inkubation der Zellen in Abwesenheit bzw. in
Anwesenheit von 2µM OHT.
Ergebnisse________________________________________________________ 77
3.11 Untersuchung der onkolytischen Eigenschaften der Tam-oAdV
Die Relevanz der oAdV für eine klinische Anwendung hängt von ihrer zytolytischen
Effizienz in Tumorzellen (Onkolyse) ab. Daher wurden die entwickelten oAdV hinsichtlich
ihrer onkolytischen Potentiale getestet. H441-Zellen wurden mit Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM,
Ad. EΔNLSM oder dem Kontroll-Vektor Ad.E mit MOI 10 infiziert und in Anwesenheit bzw in
Abwesenheit von OHT inkubiert. Die zytolytische Aktivität der jeweiligen Vektoren wurde 3
und 5 Tage nach der Infektion mittels Kristallviolettfärbung untersucht. Nach 72-stündiger
Inkubationszeit zeigte Ad.EM die stärkste Zytotoxizität in Anwesenheit von OHT. Zu diesem
Zeitpunkt war die Zytotoxizität bei Ad.ME und Ad.MEM sehr gering, während der Vektor
Ad.EΔNLSM fast die gleiche Wirkung wie der Kontroll-Vektor Ad.E zeigte. Fünf Tage nach
Infektion bewirkten Ad.ME und Ad.EM eine relativ hohe Basalaktivität, welche in der Lyse
der Zellen in Abwesenheit von OHT resultierte. Ad.MEM und Ad.EΔNLSM zeichneten sich
durch zeitliche Zunahme der zytotoxischen Aktivität in Abhängigkeit von OHT aus
(Abb. 3.20). Die Regulation der Zelllyse war mit Ad.MEM und Ad.EΔNLSM stringenter als mit
Ad.EM. Jedoch zeigten beide Vektoren eine geringere onkolytische Effizienz. Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Zytotoxizität mit der Replikation der Tam-oAdV korreliert.
Abbildung 3.20: Untersuchung des OHT-abhängigen onkolytischen Potentials von Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM
und Ad.EΔNLSM. H441-Zellen wurden mit den angegebenen Vektoren (MOI 10) infiziert und in Abwesenheit
bzw. in Anwesenheit von 2µM OHT inkubiert. Nach 3 und 5 Tagen wurden die Zellen fixiert und mit
Kristallviolett angefärbt.
Ergebnisse________________________________________________________ 78
3.12 Untersuchung des Effekts der Überexpression von E1A-MerChimären auf die Regulierbarkeit der Tam-oAdV-verursachten
Zytotoxizität
Im Folgenden wurde untersucht, welchen Einfluss die Stärke des Promotors bzw. eine starke
Expression der E1A-Chimären auf die Regulierbarkeit der Virus-vermittelten Zytotoxizität
haben kann. Um eine Überexpression der Chimären zu erzielen, wurde der SP-B Promotor
durch Koexpression von rtTA-M2 verstärkt. Diese Verstärkung des SP-B Promotors durch
den rtTA-M2 ist dadurch möglich, dass die Bindungselemente (tetO7) des Transaktivators
upstream dieses Promotors in allen E1A-Mer-Chimären-Expressionskassetten positioniert
wurden. Dadurch kann durch Expression des rtTA-M2 in den mit oAdV-infizierten Zellen der
SP-B Promotor in Anwesenheit von Doxyzyklin (Dox) transaktiviert werden (Fechner et al.,
2006 im Druck). H441 Zellen wurden mit Ad.MEM, Ad.EM, Ad. EΔNLSM, Ad.E bzw. mit
dem replikationsdefizienten adenoviralen Vektor Ad.TRE-iGFP und jeweils mit dem rtTAM2- exprimierenden Vektor Ad5CMVrtTA-M2 koinfiziert (je MOI 5). Nach 48-stündiger
Inkubation der Zellen in Anwesenheit von OHT und von Doxycyclin zeigte die
Kristallviolett-Färbung der Zellen eine Erhöhung der virusverursachten Zytotoxizität bei allen
Vektoren im Vergleich zu den Zellen ohne Dox-Behandlung (Abb. 3.21).
Abbildung 3.21: Einfluss der Promotoraktivität auf die Regulierbarkeit und auf die oAdV-vermittelte
Zytotoxizität . H441-Zellen wurden mit Ad.MEM, Ad.EM, Ad.EΔNLSM, dem Kontroll-Vektor Ad.E und mit dem
replikationsdefizienten Vektor Ad5TRE-iGFP infiziert und mit Ad5CMVrtTA-M2 koinfiziert (jeweils MOI 5).
Nach 72-stündiger Inkubation ohne oder mit 2µM OHT und mit täglicher Zugabe von Dox (1µg/ml) erfolgte die
Kristallviolett-Färbung der Zellen.
Aus der Überexpression von EM durch Ad.EM resultierte eine Erhöhung des zytotoxischen
Effekts, wobei allerdings eine Zunahme der Aktivität in nicht induziertem Zustand auftrat.
Die MEM- und EΔNLSM-Überxpression hatte hingegen nur eine geringfügige Auswirkung auf
die basale Zytotoxizität der entsprechenden Vektoren.
Ergebnisse________________________________________________________ 79
Des Weiteren wurden die zytolytischen Effekte der Vektoren durch Messung der freigesetzten
Lactat-Dehydrogenase als Folge der Zellschädigung durch Virusreplikation in infizierten
Zellen untersucht. Wie in Abb. 3.22A-D dargestellt, erhöhte sich nach OHT-Induktion die
Zytolyse um das 2,2-, 1,2- und 1,6-fache für Ad.MEM, Ad.EM bzw. für Ad.EΔNLSM sowie
um das 1,7-fache für den Kontroll-Vektor durch Verstärkung des schwachen SP-B Promotors.
Gleichzeitig
bewirkte
die
Transaktivierung
des
Promotors
eine
Erhöhung
der
virusvermittelten Zytotoxizität in nicht induziertem Zustand um jeweils das 1,5-, 4-, 2-fache
für Ad.MEM, Ad.EM bzw. für Ad. EΔNLSM. Diese Daten zeigten zum einen, dass die starke
Expression der E1A-Mer-Chimäre keinen großen Einfluss auf die Regulation der
zytotoxischen Aktivität der Tam-oAdV hat und zum anderen, dass die Tam-abhängige
Regulation der Tam-oAdV mit dem Tet-ON-Regulationssystem kombiniert werden kann.
x 10,3
x 7,5
45
x3
x 9,5
80
40
70
35
Zytotoxizität (in %)
90
30
60
25
50
20
40
15
30
10
20
5
10
0
1
+ OHT
0
2
- Dox
- OHT
+ Dox
1
- Dox
Ad.MEM
45
x 13
Ad.EM
x 9,8
45
40
40
35
35
30
30
25
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
1
- Dox
Ad.EΔNLSM
+2 Dox
2
+ Dox
0
x 0,95
x1
1
2
+ Dox
- Dox
Ad.E
Abbildung 3.22: Quantitative Analyse der Zytotoxizität nach Überexpression von E1A-Mer-Chimären. Die
H441-Zellen wurden mit den angegebenen Vektoren infiziert und behandelt (wie in Abb. 3.20). Die Zytotoxizität
wurde durch Messung der LDH-Aktivität im Kulturmedium bestimmt.
Ergebnisse________________________________________________________ 80
3.13 Untersuchung der Spezifizität der Tam-oAdV
Um die Gewebespezifität der Vektoren zu überprüfen, wurde die Replikation von Ad.MEM,
Ad.EM, Ad. EΔNLSM und Ad.E in EA.hy.926-Zellen untersucht, einer Zelllinie, in der der
endogene SP-B Promotor inaktiv ist. Parallel zu H441-Zellen wurden die EA.hy926-Zellen
mit den jeweiligen Vektoren mit einer MOI von 5 infiziert und die virale DNA-Replikation
24h nach Infektion mittels Southern-Blot analysiert.
A
Ad.ME Ad.MEM Ad.EM Ad.EΔNLSM Ad.E
-
+
-
+
-
+
-
+
-
OHT
+
H441
Ad.ME Ad.MEM
-
+
-
+
Ad.EM Ad.EΔNLSM Ad.E
-
+
-
+
-
+
OHT
EA.hy926
Abbildung 3.23: Zelltyp-Spezifizität der Tam-oAdV. (A) Zelltyp-spezifische Replikation: 24 h nach Infektion
von Lungenkarzinom-Zellen (H441) und EA.hy926-Zellen mit den angegebenen Vektoren (MOI 5) wurde die
DNA isoliert und nach Verdau mit HindIII mittels Southern Blot mit 32P-markierten E1A-Sonden analysiert. (B)
Zelltyp-spezifische Induktion der Zytotoxizität.
Generell zeigten alle vier Vektoren in Anwesenheit von OHT eine abgeschwächte Replikation
in EA.hy926-Zellen (Abb. 3.23A). Die gleiche Attenuierung wurde ebenfalls mit dem
Kontroll-Vektor Ad.E unabhängig von OHT beobachtet. Bemerkenswert war, dass die
Replikation von Ad-MEM 14-fach und die Replikation von Ad. EΔNLSM in EA.hy926-Zellen,
obwohl vergleichbar mit der von Ad.E in H441-Zellen, 6-fach abgeschwächt war. In
induziertem Status zeigte Ad.EM seinerseits eine 2- bis 3-fache Attenuierung in Non-Target-
Ergebnisse________________________________________________________ 81
Zellen, wobei in Abwesenheit von OHT keiner der Vektoren außer dem Kontroll-Vektor
Ad.E eine detektierbare Replikation aufwies.
Um die virusverursachte Zytotoxizität zu untersuchen, wurden beide Zelllinien unter den
gleichen Bedingungen wie oben infiziert und 5 Tage in Anwesenheit bzw. in Abwesenheit
von OHT inkubiert. Die Kristallviolett-Färbung der Zellen zeigte in Korrelation mit der
Virusreplikation eine geringere virusverursachte Zelllyse in EA.hy926 im Vergleich zu H441Zellen (Abb. 3.23B).
3.14 Reduktion der basalen Virusreplikation durch den tTS
Im folgenden Abschnitt wurde untersucht, ob der Tetrazyklin-abhängige transkriptionale
Silencer (tTS) durch Silencing des SP-B Promotors und der daraus resultierenden Inhibition
der E1A-Mer-Expression die Replikation der Tam-oAdV inhibieren kann (siehe Abb. 3.24AB für den Mechanismus).
A
In Abwesenheit von Dox
Ad5CMV-tTS
CMV
tTS
CMV
In Anwesenheit von Dox
B
tTS
tTS
tTS
Dox
tTS bindet an tetO
und inhibiert die
Promotoraktivität
Keine Expression
von EΔNLSM
SP-B
Ad.EΔNLSM
tTS löst sich vom tetO,
Promotor ist aktiv
Expression
von EΔNLSM
EΔNLSM
tetO7
SP-B
EΔNLSM
tetO7
Keine Virusreplikation
Virusreplikation
Abbildung 3.24: Inhibierung der Aktivität des SP-B Promotors durch Expression von tTS. Nach Koinfektion der
Zellen mit Tam-oAdV und dem tTS-exprimierenden AdV Ad5CMV-tTS wird tTS konstitutiv exprimiert. In
Abwesenheit von Dox bindet der tTS an den tetO upstream des SP-B Promotors und reprimiert seine Aktivität.
Es findet deshalb keine Expression der E1A-Mer Chimäre und als Folge keine Virusreplikation statt (A). In
Anwesenheit von Dox bindet Dox an tTS. Durch Konformationsänderung löst sich der tTS von tetO ab. Der
Promotor wird aktiv und die Expression der E1A-Mer Chimäre führt zur Virusreplikation (B).
Eine 72-stündige Inkubation von H441-Zellen nach Infektion mit jeweils Ad.MEM, Ad.EM,
Ad.EΔNLSM und Koinfektion mit dem tTS-exprimierenden AdV Ad5CMV-tTS (Fechner et al.,
2003) mit jeweils MOI 2 zeigte nach Plaques-Assay zur Bestimmung der neu gebildeten
Ergebnisse________________________________________________________ 82
Viruspartikel, dass die Basalreplikation des Ad.EM-Vektors durch den Transrepressor (tTS)
um den Faktor 12 reduziert und damit auf das Niveau von Ad.MEM und Ad.EΔNLSM gebracht
werden konnte, wenn die Zellen ohne Dox und ohne OHT inkubiert wurden (Abb. 3.25A).
Auf die basale Replikation von Ad.MEM und Ad.EΔNLSM, die schon relativ gering war, hatte
die Koexpression des tTS keinen signifikanten Einfluss (0,8- und 1,3-fache Reduktion). Wenn
die H441-Zellen mit OHT inkubiert wurden, konnte die Replikation von Ad.MEM, Ad.EM
bzw. Ad.EΔNLSM in Abwesenheit von Dox um das 2,3-, 2,4- bzw. 3-fache reduziert werden
(Abb. 3.25B). Die Ergebnisse zeigen, dass das Tamoxifen-abhängige Regulationssystem mit
dem tTS kombiniert werden kann und dass generell die Replikation aller Vektor-Varianten
durch den tTS in Abwesenheit von Dox reprimiert werden kann.
A
B
x
106
20
x 0,76
x 11,8
x 106
80
x 1,34
20
70
10
5
60
15
PFU / ml
PFU / ml (x 106 )
15
10
50
40
30
20
5
10
0
0
0
Ad.MEM
Ad.EM
Ad.EΔNLSM
x 2,26
8
0
7
0
6
0
5
0
4
0
3
0
2
0
1
0
x 2,42
x3
0
Ad.MEM
Ad.EM
- Dox
- Dox & +OHT
+ Dox
+ Dox & +OHT
Ad.EΔNLSM
Abbildung 3.25: Einfluss der tTS-Co-Expression auf die Replikation der Tam-oAdV. Untersucht wurde die
Kompatibilität der OHT-abhängigen Regulation der Virusreplikation mit dem tTS-basierten Dox-abhängigen
Silencing. H441-Zellen wurden mit Ad.MEM, Ad.EM, Ad.EΔNLSM infiziert und mit Ad5CMVtTS koinfiziert
(jeweils MOI 2). (A) Die Zellen wurden in Kulturmedium ohne OHT in Abwesenheit bzw. mit täglicher Zugabe
von 1 µg/ml Dox für 72 h inkubiert. (B) Die Zellen wurden in Medium mit 2 µM OHT in Abwesenheit bzw. mit
täglicher Zugabe von 1µg/ml Dox für 72 h inkubiert.
3.15 Untersuchung des Antitumorpotentials der Tam-oAdV im MausModell
Um die onkolytischen Eigenschaften der Tam-oAdV in vivo zu untersuchen, wurden die
Vektoren Ad.EΔNLSM und Ad.EM aufgrund ihrer besseren Replikation und onkolytischen
Effizienz unter induzierten Bedingungen im Vergleich zu Ad.MEM und Ad.ME ausgewählt.
Ergebnisse________________________________________________________ 83
Zur Etablierung von Mäusen mit Adenokarzinom-Tumor-Xenograften als Modell wurden
H441-Zellen in die Flanken von drei Wochen alten Nacktmäusen appliziert (jeweils 107
Zellen in rechte und linke Flanke). 14 Tage nach Applikation wurden die Mäuse mit Tumoren
von durchschnittlich 50 mm3–Volumen zweimal im Abstand von 3 Tagen intratumoral mit
Ad.EΔNLSM, Ad.EM, Ad.E bzw. dem replikationsdefizienten AdV Ad5TREluc (3,4 x 107 PFU
pro Applikation je Maus) infiziert. Die Mäuse wurden täglich ohne oder mit 3 mg Tamoxifen
intraperitoneal behandelt. Nach 38-tägiger Behandlung ergab sich kein Unterschied in der
Tumorgröße zwischen Tieren ohne und mit Tamoxifen-Behandlung, die mit dem
replikationsdefizienten Ad5TREluc infiziert worden waren (Abb. 3.26A). Dies zeigte, dass
Tamoxifen allein keinen Einfluss auf das Tumorwachstum hatte. Bei der Maus-Gruppe, die
mit Ad.EΔNLSM infiziert wurde, bewirkte die Behandlung mit Tamoxifen eine Inhibierung des
Tumorwachstums, so dass die Tumorgröße nach 38 Tagen 2,3-fach kleiner war als bei der mit
Ad5TREluc infizierten Kontrollgruppe. Dies bedeutet, dass die Tumorprogression signifikant
um 60 % inhibiert werden konnte (P < 0,002).
In Abwesenheit von Tamoxifen war durch Ad.EΔNLSM keine signifikante Inhibierung des
Tumorwachstums nachweisbar. Ad.EM konnte in vivo zwar eine stärkere Inhibierung des
Tumorwachstums bewirken, zeigte aber keine Abhängigkeit von Tamoxifen (Abb. 3.26B). In
der Ad.E-Kontrollgruppe war ebenfalls das Tumorwachstum signifikant inhibiert im
Vergleich zur Ad5TREluc-Kontrollgruppe. Jedoch war das Ausmaß der Inhibierung geringer
als in der Ad.EM-Gruppe und überraschenderweise auch geringer als in der Ad.EΔNLSMGruppe, die mit Tam behandelt wurde.
Ergebnisse________________________________________________________ 84
A
25
EM2-Tam
Ad.EΔNLSM - Tam
EM2+Tam
Ad.EΔNLSM + Tam
Zunahme des Tumorvolumens
20
Luc-Tam
Ad5TREluc - Tam
Luc+Tam
Ad5TREluc + Tam
15
dpRB+Tam
Ad.E + Tam
10
5
0
0
7
14
21
25
27
31
34
38
Tage nach Infektion
B
25
EM-Tam- Tam
Ad.EM
Zunahme des Tumorvolumens
Ad.EM
EM+Tam+ Tam
Ad5TREluc
- Tam
Luc-Tam
20
Ad5TREluc
Luc+Tam + Tam
Ad.E
+ Tam
dpRB+Tam
15
10
5
0
0
7
14
21
25
27
31
34
38
Tage nach der Infektion
Abbildung 3.26: Untersuchung des Antitumor-Effektes von Ad.EM und Ad.EΔNLSM und der Regulation in
Mäusen mit humanen Lungen-Tumormodellen. (A) Antitumor-Effekt von Ad.EΔNLSM im Vergleich zu
Kontrollen Ad.E und Ad5TREluc. (B) Antitumor-Effekt von Ad.EM im Vergleich zu Kontrollen Ad.E und
Ad5TREluc. Mäuse, die subkutane H441-Tumoren mit einem Volumen zwischen 40 und 90 mm3 hatten, wurden
in 4 Gruppen unterteilt. Die Gruppe 1 wurde mit Ad.EΔNLSM (6 Tiere), die Gruppe 2 mit Ad.EM (6 Tiere), die
Gruppe 3 mit Ad.E (3 Tiere) und die Gruppe 4 mit dem replikationsdefizienten Kontroll-Vektor Ad5TREluc (4
Tiere) zweimal im Abstand von 3 Tagen intratumoral injiziert (3,4 x 107 PFU pro Injektion). Jeweils 3 Tiere der
Gruppen 1 und 2 und 2 Tiere der Gruppe 4 wurden mit Erdnußöl-Ethanol-Suspension ohne Tam behandelt,
während die restlichen Tiere mit 3 mg in Erdnussöl resuspendiertem Tamoxifen dreimal wöchenlich
intraperitoneal behandelt wurden. Die Behandlung dauerte 38 Tage und die Tumorgröße wurde zu den
angegebenen Zeitpunkten gemessen.
Ergebnisse________________________________________________________ 85
3.16 Verbesserung der onkolytischen Eigenschaften der Tam-oAdV durch
Expression des Todesliganden (FasL)
3.16.1 Evaluierung von Dox-abhängigen TRE-Promotoren für die Expression von FasL
Im Rahmen dieser Untersuchung ging es darum, verschiedene Modifikationen des TREPromotors und dessen Einfluss auf die Basalaktivität zu evaluieren. Zu diesem Zweck wurden
zunächst vier Reporter-Plasmide konstruiert, die Modifikationen entweder innerhalb des
tetO7-Operatorelements oder innerhalb des CMVmin Promotors beinhalteten (Abb. 3.27).
A
pAd5TRE-Luc
5‘ITR
tetO7
CMVmin+75
Luc
pA
pAd5TRE1-Luc
5‘ITR
tetO7
CMVmin+7
Luc
pA
pAd5TRE2-Luc
5‘ITR
tetO7
TATA
Luc
pA
pAd5Tight1-Luc
5‘ITR tetO7mod
CMVmin+16
Luc
pA
pAd5Tight2-Luc
5‘ITR tetO7mod
TATA
Luc
pA
B
Ad5TRE-Luc
5‘ITR
tetO7
CMVmin+75
Luc
pA
3‘ITR
Ad5TRE-FasL
5‘ITR
tetO7
CMVmin+75
FasL
pA
3‘ITR
Ad5Tight1-FasL
5‘ITR
tetO7mod
CMVmin+16
FasL
pA
3‘ITR
Abbildung 3.27: Schematische Darstellung der Luciferase-Plasmide (A) und der FasL-exprimierenden
adenoviralen Vektoren (B)
Im Ausgangsplasmid pAd5TRE-Luc (Fechner et al., 2003; Hurtado Picó et al., 2005) besteht
die Expressionskassette aus firefly luciferase cDNA unter Kontrolle des originalen TREPromotors (Gossen and Bujard, 1992). Dabei setzt sich der TRE-Promotor aus dem tetOHeptamer und dem CMVmin-Promotor (CMVmin+75:Nukleotideposition –53 bis +75 im CMV
Promotor) zusammen. Die Plasmide pAd5TRE1-Luc und pAd5TRE2-Luc wurden von
pAd5TRE-Luc abgeleitet, indem der CMVmin+75 durch CMVmin+7 (Nukleotide –53 bis +7)
bzw. durch die isolierte TATA-Box des CMV-Promotors (Nukleotide –31 bis –21) ersetzt
wurde. Im Plasmid pAd5Tight1-Luc, welches sich aus einem modifizierten tetO Heptamer
(tetO7mod; Clontech) und einem verkürzten CMV zusammensetzt, wurde das Luciferase-Gen
downstream des verkürzten CMVmin+16 (Nukleotide –53 bis +16, Clontech) kloniert, während
im pAd5Tight2-Luc der CMVmin+16 durch die TATA-Box ersetzt wurde.
Ergebnisse________________________________________________________ 86
3.16.2 Untersuchung der Leakiness der Dox-abhängigen TRE-Promotoren
Die Luciferase-Reporter-Konstrukte wurden in Transfektionsexperimenten evaluiert. HeLaZellen wurden mit den jeweiligen Plasmiden transfiziert und 24 h später mit dem
Ad5CMVrtTA-M2 (MOI 4) transduziert. Die Messung der Luciferase-Aktivität in Zelllysaten
nach 48-stündiger Inkubation zeigte, dass die basale Aktivität des TRE1- bzw. TRE2Promotors 2,1- bzw. 49-fach niedriger war als für den originären TRE Promotor (Abb. 3.28).
Dies deutete darauf hin, dass die Sequenzen innerhalb des CMVmin, die downstream der
TATA-Box liegen, die basale Aktivität des TRE-Promotors beeinflussen.
Der Ersatz des ursprünglichen tetO7 durch tetO7mod bewirkte eine Reduzierung der
Promotoraktivität um das 5-fache in pAd5Tight2-Luc gegenüber pAd5TRE2-Luc im nicht
induzierten Status. Zusammengenommen hatte dies eine gesamte Reduzierung der basalen
Aktivität zur Folge (um das 11-fache im Plasmid pAd5Tight1-Luc und um das 183-fache im
Plasmid pAd5Tight2-Luc im Vergleich zum Plasmid pAd5TRE-Luc).
Zum anderen wurde untersucht, welche Auswirkung die jeweiligen Modifikationen auf die
Transaktivierbarkeit bzw. das absolute Expressionslevel der Promotoren haben. Zusätzlich
zeigt die Abb. 3.28 die Aktivität der jeweiligen Reporter-Plasmide nach Induktion der
Expression durch Inkubation der Zellen in Anwesenheit von Dox. Daraus ist ersichtlich, dass
die Konstrukte pAd5Tight1-Luc und pAd5Tight2-Luc eine 7-fache bzw. eine 58-fache
Steigerung der Luciferase-Expression im Vergleich mit pAd5TRE1-Luc bzw. pAd5TRE2Luc zeigten. Diese Daten deuteten darauf hin, dass das tetO7mod eine stärkere Transaktivierung
des responsiven Promotors ermöglicht als das ursprüngliche tetO7.
Im induzierten Zustand zeigten die Konstrukte unterschiedliche Expressionsstärken, die in
eine 950-fache Regulierbarkeit für pAd5Tight2-Luc, eine 375-fache Regulierbarkeit für
pAd5Tight1-Luc gegenüber einer 23-, 10- bzw. 4-fachen Regulierbarkeit für pAd5TRE-Luc,
pAd5TRE1-Luc bzw. für pAd5TRE2-Luc ergaben. Zusätzlich wurde untersucht, inwieweit
die Basalaktivität der Promotorvarianten Tight1, Tight2 und TRE durch Koexpression des tTS
reduziert werden kann. Dafür wurden die HeLa-Zellen mit den Plasmiden pAd5Tight1-Luc,
pAd5Tight2-Luc und pAd5TRE-Luc transfiziert. 24h später wurden die Zellen mit dem
Ad5CMV-tTS infiziert. Nach weiterer 24-stündiger Inkubationszeit in Anwesenheit bzw. in
Abwesenheit von Dox wurde die Promotoraktivität durch Messung der Luciferase-Aktivität
bestimmt. Dabei reduzierte sich in Abwesenheit von Dox die Aktivität der Promotoren
Tight1, Tight2 bzw. TRE um das 2,5-, 3- bzw. 2-fache im Vergleich zu den mit Dox
behandelten Zellen (Abb. 3.29). Allerdings blieb die Aktivität des TRE-Promotors 5-fach
höher als die basale Aktivität des Tight1-Promotors bzw. 10-fach höher als die von Tight2.
Ergebnisse________________________________________________________ 87
Aus diesen Daten ergebend zeigte sich der Tight1 aufgrund einer geringen Basalaktivität und
seiner starken Transaktivierbarkeit den anderen Promotoren weit überlegen und eignete sich
dadurch für die Regulation der Expression des Todesliganden FasL.
- Dox
Luciferase
activity
in RLU/Zelle
luciferase
activity
in RLU/cell
100
23x
10x
4.4x
375x
956x
pAd5TRELuc
pAd5TRE1Luc
pAd5TRE2Luc
pAd5Tight1Luc
pAd5Tight2Luc
73.2
34.8
1.5
6.6
0.4
343.3
6.6
2476.7
382.4
10000
+ Dox
1000
100
10
1
0
1660.2
Luciferase-Aktivität (RLU/Zelle)
Abbildung 3.28: Vergleich der Aktivität unterschiedlicher TRE-Promotoren. HeLa-Zellen wurden mit 2 µg der
angegebenen Reporter-Plasmide transfiziert und 18h später mit Ad5CMVrtTA-M2 transduziert (MOI 10). Die
Messung der Luciferase-Aktivität erfolgte 48h nach weiterer Inkubation in Anwesenheit und in Abwesenheit von
Dox und wird logarithmisch dargestellt.
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
- Dox
+ Dox
pAd5Tight2Luc
pAd5Tight1Luc
pAd5TRELuc
Abbildung 3.29: Vergleich der Reduktion der basalen Promotorenaktivität durch den Dox-abhängigen
transkriptionalen Silencer (tTS). HeLa-Zellen wurden mit 2 µg der angegebenen Reporter-Plasmide transfiziert
und 18h später mit Ad5CMV-tTS transduziert (MOI 5). Die Messung der Luciferase-Aktivität erfolgte 48h nach
weiterer Inkubation in Anwesenheit und in Abwesenheit von Dox.
3.16.3 Effekt der FasL-Expression auf Lungenadenokarzinom-Zellen
Aufgrund seiner niedrigeren Basalaktivität und seiner gleichzeitig höheren Regulierbarkeit im
Kontext des Tet-On-Systems wurde der Promotor Tight1 ausgewählt, um die Regulierung des
pro-apoptotischen Gens Fas-Ligand (FasL) auf der Basis von AdV zu untersuchen. Zwei
Ergebnisse________________________________________________________ 88
FasL-exprimierende AdV, Ad5tight1-FasL Ad5TRE-FasL (als Vergleich) wurden generiert
(Abb. 3.27B). In Ad5tight1-FasL steht die FasL-cDNA unter Kontrolle des Tight1-Promotors,
während im Ad5TRE-FasL die FasL-cDNA unter Kontrolle des originären TRE-Promotors
steht. Die Expression von FasL konnte mittels Northern-Blot-Analyse 24 h nach
Kotransduktion von H441-Zellen mit Ad5CMVrtTA-M2 und Ad5TRE-FasL bzw. Ad5TightFasL bestätigt werden.
Dox
-
+
Ad5TREiGFP
Ad5TREFasL
Ad5Tight1FasL
-
+
-
+
FasL
rtTA-M2
β-actin
Abbildung 3.30: Northern Blot-Analyse der FasL-Expression nach Transduktion mit FasL-Vektoren. H441Zellen wurden mit Ad5TRE-FasL, Ad5Tight1-FasL und mit dem Kontroll-Vektor Ad5TRE-iGFP transduziert
(MOI 4) und mit Ad5CMVrtTA-M2 (MOI 4) kotransduziert. Nach 24-stündiger Inkubation mit und ohne Dox
wurde aus isolierter RNA eine Northern Blot-Hybridisierung mit 32P-markierter FasL-Sonde durchgeführt.
Residuale Levels der endogenen FasL-mRNA sind erkennbar. Die rekombinante FasL-mRNA wurde nur nach
Induktion mit Dox detektiert.
Wie aus Abb. 3.30 ersichtlich, zeigten beide Vektoren eine starke Expression von FasLmRNA in Anwesenheit von Dox. In Abwesenheit von Dox war eine residuale Menge der
FasL-mRNA nachweisbar. Da diese residuale FasL-mRNA auch in dem AdV ohne FasLExpressionskassette (Ad5TRE-iGFP) detektiert wurde, konnte es sich dabei um die endogene
FasL-mRNA handeln. Um den Effekt der FasL-Expression auf H441-Zellen zu untersuchen,
wurde die Apoptose nach Kotransduktion der Zellen mit Ad5CMVrtTA-M2 und Ad5TREFasL bzw. Ad5Tight-FasL bestimmt. Daraus ergab sich, dass die Induktion der FasLExpression zur Apoptose der Zellen führte (Abb. 3.31). Obwohl das Ausmaß der durch beide
Vektoren induzierten Apoptose in Anwesenheit von Dox ähnlich war, zeigte Ad5TRE-FasL
eine Apoptose-Induktion bereits unter nicht induzierten Bedingungen, die im Vergleich zu
Ad5Tight-FasL und der Kontrolle signifikant um das 1,5-fache höher war. Diese Ergebnisse
stimmen mit den Plasmid-Daten überein und belegen, dass der Tight1 Promotor hinsichtlich
der niedrigeren Basalaktivität und strengeren Regulierbarkeit dem TRE-Promotor deutlich
überlegen ist.
Ergebnisse________________________________________________________ 89
∗
Ohne Dox
1,5x
Mit Dox
1,2
relative Apoptose
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Ad5Tight1-FasL
Ad5TRE-FasL
Ad5TRE-IGFP
Abbildung 3.31. Induktion der Apoptose in H441-Zellen nach Expression von FasL. H441-Zellen wurden mit
Ad5TRE-FasL, Ad5Tight1-FasL, Ad5TRE-iGFP und anschließend mit Ad5CMVrtTA-M2 kotransduziert
(jeweils MOI 1). Die Apoptose wurde 16 h nach Inkubation der Zellen mit und ohne Dox als DNAFragmentierung mittels cell death detection assay (Roche) bestimmt. ∗ zeigt die statistische Signifikanz P < 0,05.
3.16.4 Kombination der Virusreplikation mit der FasL-Expression in Abhängigkeit von
OHT
Da der guten Regulierbarkeit von Ad.MEM und Ad.EΔNLSM eine geringere onkolytische
Effizienz gegenüber stand, wurde durch Anwendung des Todesliganden FasL der Versuch
unternommen, die Zytotoxizität beider Vektoren zu verbessern. Dazu wurden die H441Zellen mit Ad.MEM, Ad.EΔNLSM und dem Kontroll-Vektor Ad.E infiziert und mit jeweils
Ad5TRE-FasL, Ad5Tight1-FasL und Ad5TRE-iGFP koinfiziert (je MOI 10). Die Inkubation
der Zellen über 72h in Anwesenheit von OHT zeigte eine eindeutige Steigerung der
Zytotoxizität im Vergleich zu den mit AdTRE-iGFP-infizierten Zellen (Abb. 3.32). Damit
erhöhte sich die Zytotoxizität von Ad.MEM um das 2,4- und 1,9-fache bzw. die von
Ad.EΔNLSM um das 2,8- und 2,5-fache durch Koinfektion mit Ad5TRE-FasL bzw. mit
Ad5Tight1-FasL. Der gleiche Effekt wurde auch für den Kontroll-Vektor Ad.E mit einer 1,6bzw. 1,8-fachen Steigerung der Zytotoxizität beobachtet. In Korrelation mit der Untersuchung
der Luciferase-Expression wies Ad5TRE-FasL eine höhere Toxizität im Vergleich zu
Ad5Tight1-FasL (6-fach in Ad.MEM-infizierten und 5,4-fach höher in Ad.EΔNLSM-infizierten
Zellen) in nicht induziertem Status auf. Diese Daten belegten, dass der zytotoxische Effekt der
Tam-oAdV durch Koexpression von FasL im Lungenkarzinom in Abhängigkeit von OHT
gesteigert werden kann.
Ergebnisse________________________________________________________ 90
Zytotoxizität (in %)
Ad.MEM
Ad.E
Ad.EΔNLSM
35
35
35
30
30
30
25
25
25
20
20
20
15
15
15
10
10
10
5
5
5
0
0
Ad5.TRE Ad5.TRE
-FasL
-iGFP
Ad5.Tight
-FasL
0
A
d
5
T
.
R
E
-iG
F
P
A
d
5
.T
R
E
-F
a
sL
Ad5.TRE Ad5.TRE
-iGFP
-FasL
- OHT
A
d
5
T
.
ig
h
t-F
a
sL
Ad5.Tight
-FasL
Ad5.TRE Ad5.TRE Ad5.Tight
-iGFP
-FasL
-FasL
+ OHT
Abbildung 3.32: Transaktivierung der FasL-Expression durch MEM- und EΔNLSM-Chimären bewirkt einen
OHT-abhängigen additiven zytotoxischen Effekt. Die H441-Zellen wurden mit Ad.MEM, Ad.EΔNLSM, Ad.E
infiziert (MOI 10) und mit jeweils Ad5TRE-FasL, Ad5Tight1-FasL oder Ad5TRE-iGFP koinfiziert (MOI 10).
Die Zytotoxizität wurde nach 72stündiger Inkubation der Zellen ohne oder mit 2µM OHT durch Messung der
LDH-Aktivität im Kulturmedium bestimmt und als prozentualer Anteil der toten Zellen dargestellt.
Diskussion_______________________________________________________91_
4
Diskussion
Onkolytische Adenoviren (oAdV) finden ein wachsendes Interesse als potentielle
Therapieoption bei Tumorerkrankungen. Bisher wurden zahlreiche oAdV entwickelt, von
denen einige sich in klinischen Studien befinden (Shah et al., 2003; Shimoyama and Nakao,
2006; Xu et al., 2003). Obwohl die Ergebnisse der bisherigen klinischen Studien vermuten
lassen, dass oAdV relativ sicher sind, ist nicht auszuschließen, dass Fälle auftreten, bei denen
die Therapie unterbrochen werden muss. In solchen Fällen wäre eine pharmakologische
Kontrolle der oAdV wünschenswert, weil dies eine zeitlich begrenzte und auf den Patienten
bezogene Anpassung der Virusreplikation und damit der Therapie ermöglicht. Mittlerweile
wurden unterschiedliche Regulationssysteme zur Kontrolle der Replikation von oAdV
getestet. Die bisher getesteten Systeme basieren ausschließlich auf der Regulation der
Expression des E1A-Gens oder anderer essentieller viraler Gene. Die Regulation beruht dabei
entweder auf Verwendung von verschiedenen Ligand-abhängigen Transaktivatoren in
Kombination mit ihren dazugehörigen Promotoren (Chong et al., 2002; Fechner et al., 2003;
Hurtado Picó et al., 2005) oder auf Verwendung von Promotoren, die in ihrer Aktivität von
bestimmten Liganden abhängen (Avvakumov and Mymryk, 2002). In ihrer bisherigen Form
benötigen die Tet-regulierbaren (Fechner et al., 2003) und die Dimerizer-regulierbaren oAdV
(Chong et al., 2002) neben dem zu regulierenden viralen Gen die konstitutive Expression
einer bzw. mehrerer Komponenten des Transaktivators. Zum Erhalt einer regulierten
Expression müssen daraus resultierend mehrere Komponenten in die Zielzellen transferiert
werden. Obwohl es möglich wäre, diese in ein singuläres Vektorgenom zu inserieren, bleibt
unter anderem das Problem, dass die Insertionskapazität des Vektorgenoms dadurch reduziert
wird. Zum anderen können adenovirale Enhancer-Elemente mit induzierbaren Promotoren
interferieren und die Regulation negativ beeinflussen (Hurtado Picó et al., 2005). Darüber
hinaus kann die konstitutive Expression von Transaktivatoren zu „Squelchings“ führen.
Darunter versteht man das Abfangen von endogenen Transkriptionsfaktoren (Baron et al.,
1997; Sadowski et al., 1988; Strathdee et al., 1999), was sich auf die Effizienz der
Virusreplikation negativ auswirken kann.
In der vorliegenden Arbeit wurden zum ersten Mal pharmakologisch regulierbare oAdV
entwickelt und charakterisiert, deren Kontrolle im Gegensatz zu den bisherigen regulierbaren
oAdV auf der Regulation der Aktivität des essentiellen adenoviralen E1A Proteins statt auf
der Regulation seiner Expression basiert. Hierbei wurden zur Steuerung der oAdVReplikation E1A-Mer-Chimären durch Fusion des E1A-Proteins mit der mutierten
Hormonbindungsdomäne (HBD) des Mausöstrogenrezeptors (Mer) (Danielian et al., 1993)
Diskussion_______________________________________________________92_
generiert. Die E1A-Mer-Chimären wurden auf diese Weise von Tamoxifen (Tam) und seinem
Metaboliten 4-Hydroxy-Tamoxifen (OHT) abhängig gemacht. Daraus resultierend wurden die
Replikation und die dadurch vermittelte Zytolyse der kontrollierten oAdV von Tam bzw.
OHT induziert.
4.1 Funktionelle Charakterisierung der E1A-Mer-Chimären
In der Vergangenheit wurden verschiedene Studien durchgeführt, in denen das E1A mit der
HBD des Rattenglucocorticoidrezeptors (Picard et al., 1988) oder des humanen
Östrogenrezeptors fusioniert wurde (Spitkovsky et al., 1994). In beiden Fällen wurde gezeigt,
dass die resultierenden E1A-Chimären in ihren Aktivitäten hormonabhängig waren. In der
vorliegenden Arbeit wurden initial drei E1A-Mer-Chimärenkonstrukte, ME, MEM und EM,
charakterisiert. Dies wurde zunächst auf Plasmidebene durchgeführt, indem HeLa Zellen mit
den ME-, MEM- bzw. EM-exprimierenden Plasmiden transfiziert wurden. Daraus ergab sich
kein Einfluss von OHT auf die Transkription der Chimären. Auffällig war, dass MEM im
Vergleich zu ME und EM eine geringere Transkript-Menge aufwies. Dies könnte auf eine
gewisse Instabilität des Transkriptes hindeuten. In weiteren Experimenten wurde der Frage
nachgegangen,
ob
die
entwickelten
E1A-Mer-Chimären
in
der
Lage
sind,
die
Transaktivierungsfunktion des originären adenoviralen E1A Proteins zu erfüllen. Dazu wurde
die Regulation der Aktivität der E1A-Mer-Chimären ME, MEM, EM und EΔNLSM zunächst
durch Analyse der Transaktivierung des CMVmin untersucht. Es konnte eine mehr als 5-fache
Transaktivierung des CMVmin im induzierten Zustand durch MEM, EM (Abb.4.4) und
EΔNLSM (Daten nicht gezeigt), aber nur eine 2-fache Transaktivierung für ME festgestellt
werden. Bekannt ist, dass das E1A Protein durch positive Rückkopplung seinen eigenen
Promotor aktiviert (Hurtado Picó et al., 2005). Überraschenderweise war bei der initialen
Testung der E1A-Mer-Chimären auf Plasmidebene keine Transaktivierung des CMVmin
beobachtet worden. Anscheinend wurde hier der transaktivierende Effekt der E1A-MerChimären aufgrund der Ko-Expression des im Rahmen dieses Experiments verwendeten
starken Transaktivators (rtTA-M2) maskiert.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen aus den Plasmidexperimenten konnte bei Verwendung von
E1A-Mer-Adenovektoren eine erhöhte Expression der Chimären in Anwesenheit von OHT
beobacht werden, während in Abwesenheit von OHT nur der Ad.EM eine detektierbare EMmRNA zeigte. Die erhöhte Expression der Mer-E1A-Chimären in Gegenwart von OHT ist
offensichtlich auf eine Regulation zurückzuführen, die sich auf zwei Ebenen abspielt. Zum
einen können die E1A-Mer-Chimären nach Induktion mit OHT den SP-B-Promotor
Diskussion_______________________________________________________93_
autoaktivieren, unter dessen Kontrolle sie stehen. Dies würde zu einer Erhöhung der
Transkriptionseffizienz führen. Zum anderen bewirkt die Aktivierung der E1A-Chimären die
Induktion der Virusreplikation, wodurch die Anzahl der transkribierbaren viralen
Genomkopien aufgrund der Vervielfachung des viralen Genoms zunimmt. Daraus
resultierend erhöht sich die Transkriptionsrate.
4.2 Subzelluläre Lokalisation der E1A-Mer-Chimären und Einfluss auf die
OHT-abhängige Regulation
Angesichts der eindeutigen OHT-Abhängigkeit der generierten E1A-Mer-Chimären ME,
MEM, EM und EΔNLSM, aber auch ihres unterschiedlichen Verhaltens war es von großem
Interesse zu wissen, welcher Mechanismus ihrer OHT-abhängigen Regulation zugrunde lag.
Mehrere Modelle der Steroidhormon-abhängigen Regulation von Steroidhormonrezeptoren
bzw. von Fusionsproteinen, die aus der HBD und Effektorproteinen bestehen, wurden
beschrieben (Pratt and Toft, 1997). Eines dieser Modelle, das Sequestrierungsmodell, geht
davon aus, dass Steroidrezeptoren bzw. HBD-Fusionsproteine mit dem heat shock protein 90
(HSP90) interagieren und in einen Proteinkomplex übergehen, der im Zytoplasma
zurückgehalten wird. Die Ligandenbindung bewirkt die Dissoziation des Proteinkomplexes,
wobei die Steroidrezeptoren bzw. die HBD-Fusionsproteine in den Zellkern wandern (Pratt
and Toft, 1997). Laut diesem Modell wäre die Inaktivierung der Steroidhormonrezeptoren auf
ihre zytoplasmatische Sequestrierung zurückzuführen. Um zu prüfen, ob diese Hypothese für
die konstruierten Chimären ME, MEM, EM und EΔNLSM zutrifft, wurde ihre subzelluläre
Lokalisation mittels Immunfluoreszenz untersucht. Die ME- und EM-Chimären zeigten,
unabhängig von OHT, eine exklusive nukleare Lokalisation. Dagegen konnte man bei MEM
und EΔNLSM in Abwesenheit des Liganden beobachten, dass beide Proteine sowohl im
Zellkern als auch im Zytoplasma lokalisiert waren, wobei nach OHT-Zugabe die Proteine
überwiegend im Zellkern zu finden waren. Zusammengefasst wurde hier gezeigt, dass auf
einer Seite die E1A-Mer-Chimären ME und EM trotz ihrer OHT-abhängigen Aktivierung eine
konstitutiv strikte nukleare Lokalisation haben. Auf der anderen Seite zeigten die Chimären
mit der besseren Regulierbarkeit, nämlich MEM und EΔNLSM, eine OHT-abhängige Zunahme
der Proteinmenge im Zellkern.
Für einige Steroidrezeptoren (z.B. den Glucocorticoidrezeptor bzw. die Fusionsproteine, die
die Glucocorticoidrezeptor-HBD enthalten) ist es gut dokumentiert, dass ihre Ligandabhängige Regulation darauf basiert, dass in Ligand-freiem Status aufgrund der
Sequestrierung durch zytoplasmatische Chaperone die Steroidrezeptoren bzw. die HBD-
Diskussion_______________________________________________________94_
Fusionsproteine nicht in den Zellkern wandern können (Htun et al., 1996; Martinez et al.,
2005; Picard et al., 1990). Bei CRE-Mer, einem aus der P1-Bakteriophagen-Rekombinase und
dem Mer bestehenden Fusionsprotein, wurde angenommen, dass die Induktion der
Rekombinase-Aktivität nur darauf basierte, dass das im Zytoplasma in Abwesenheit vom
Liganden sequestrierte Fusionsprotein in den Zellkern wandert (Verrou et al., 1999; Zhang et
al., 1996). Allerdings sind keine detaillierten Daten darüber veröffentlicht worden. Ohne
dieser Annahme zu widersprechen wurde hier gezeigt, dass allein die zytoplasmatische
Sequestrierung der E1A-Mer-Chimären ihre Inaktivierung im OHT-freien Zustand nicht
erklären kann. Die Regulation der E1A-Chimären scheint ein sehr komplexer Prozess zu sein,
in dem je nach Design der Chimären unterschiedliche Faktoren eine Rolle spielen können.
Mögliche Einflüsse des Chimärendesigns auf die Regulation ihrer Aktivitäten werden in
Abschnitt 5.3 diskutiert.
4.3 Vergleich der Tam-oAdV
Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier Tam-oAdV entwickelt, die unterschiedliche
Regulierbarkeiten und Replikationseffizienzen sowie unterschiedlich starke onkolytische
Eigenschaften aufwiesen. Während Ad.ME eine schlechte Regulation und ineffiziente
Replikation aufwies, zeichnete sich Ad.EM in induziertem Status durch die höchste
Replikationsrate aus. Sie war hier zweifach höher als beim Kontroll-Vektor Ad.E. Obwohl der
Mechanismus nicht untersucht wurde, scheint dies eine Möglichkeit zu sein, mit der durch
gentechnische Modifikation des adenoviralen E1A-Proteins die Replikationseffizienz des
Virus gesteigert werden kann. Die höhere Replikationsrate von Ad.EM in Anwesenheit von
OHT stand einer basalen Replikation (in Abwesenheit von OHT) entgegen. Das E1A-Protein
ist ein multifunktionelles Protein, das nicht nur als Transaktivator viraler und zellulärer
Promotoren, sondern auch als transkriptionaler Repressor (Loewenstein et al., 2006) und als
Modulator des Zellzyklus und der Apoptose fungiert. Alle diese Funktionen können eine
wichtige Rolle in der Replikationseffizienz des Adenovirus spielen. Es ist möglich, dass die
Fusion des E1A-Proteins mit der HBD einige dieser Funktionen stärker beeinflusst als andere.
Die Untersuchung der Transaktivierung des CMVmin-Promotors hatte auf Plasmidebene
gezeigt, dass die EM-Chimäre nicht nur die stringenteste OHT-abhängige Transaktivierung
des CVMmin ermöglichte, sondern dass sie im nicht induzierten Zustand mit einer geringen
Transaktivierung verbunden war. Daher ist nicht auszuschließen, dass die höhere Ad.EMReplikation im OHT-freien Zustand damit zusammenhängt, dass in nicht induziertem Status
andere für die Replikation relevante Funktionen des E1A-Proteins teilweise oder vollständig
erfüllt werden können.
Diskussion_______________________________________________________95_
Im docking model der Inaktivierung der Steroidhormonrezeptoren wird angenommen, dass die
Steroidrezeptoren bzw. HBD-haltigen Fusionsproteine an einen Heterokomlex mit HSP90
angedockt werden und so lange biologisch inaktiv bleiben, bis sie durch Ligand-Bindung
freigesetzt werden (Pratt, 1990; Pratt, 1992). Wenn man dieses docking model hier geltend
macht, könnte aufgrund ihres starken NLS eine schnelle Wanderung der EM-Chimäre in den
Zellkern (Lyons et al., 1987) eine wesentliche Rolle in der Aktivität der Chimäre in nicht
induziertem Status spielen. Ein Argument dafür ist, dass die schnelle Wanderung der EMChimäre in den Zellkern die Interaktion mit den hauptsächlich im Zytoplasma lokalisierten
HSP90-Molekülen (Gasc et al., 1984) negativ beeinflussen kann. Im Rahmen der
Untersuchungen zur Reduktion der Basalreplikation des Ad.EM zeigte sich, dass aus der
Deletion des NLS am C-Terminus des E1A-Teils der EM-Chimäre eine verringerte
Basalreplikation des Ad.EΔNLSM-Vektors und infolgedessen eine zweifache Steigerung der
Regulation im Vergleich mit dem Ausgangsvektor Ad.EM resultierten. Trotz der Stringenz
seiner Replikation zeigte Ad.EΔNLSM im Vergleich zu Ad.EM allerdings eine niedrigere
Replikationseffizienz in induziertem Status. Es ist möglich, dass dies auf einer Verzögerung
der Replikation aufgrund eines langsameren Transports der EΔNLSM-Chimäre in den Zellkern
beruht. Durch den verlängerten Aufenthalt des Proteins im Zytoplasma könnte sich in
Abwesenheit von OHT die Wahrscheinlichkeit der Interaktion der Chimäre mit HSP90
erhöhen. Allerdings könnte die verringerte Replikationseffizienz des Ad.EΔNLSM auch auf der
Deletion der 67 carboxy-terminalen Aminosäuren im E1A beruhen. Krippl und Mitarbeiter
(1985) hatten gezeigt, dass diese Deletion keinen großen Einfluss auf die Funktion des E1AProteins hat. Allerdings wurde dabei nur die Aktivierung der Expression, jedoch nicht der
direkte Einfluss auf die Virusreplikation untersucht.
Ad.MEM wies im Vergleich zu Ad.EM auch eine stringentere Regulation auf, die
vergleichbar mit der von Ad.EΔNLSM war. Zu vermerken ist die Tatsache, dass Ad.MEM und
Ad.EΔNLSM eine Gemeinsamkeit haben: die von ihnen kodierten Chimären MEM bzw.
EΔNLSM sind in Abwesenheit des Induktors teilweise im Zytoplasma lokalisiert. Dies deutet
darauf hin, dass die Lokalisation der Chimären im Zytoplasma in Abwesenheit von OHT eine
generelle Möglichkeit zur Verbesserung der Ligand-abhängigen Regulation darstellt.
Die Größe und die Struktur der Chimären können eine Rolle in ihrer Regulation spielen. So
wurde in der sogenannten „space-dependant repression“-Hypothese angenommen, dass die
HBD einen reprimierenden Effekt auf Effektorproteine ausübt. Picard und Mitarbeiter (1988)
konnten zeigen, dass nach Fusion von Effektorproteinen mit der HBD die Repression des
Effektorproteins in Abwesenheit von Liganden abnimmt, je größer das Fusionsprotein war.
Diskussion_______________________________________________________96_
Das E1A-Protein hat drei wichtige funktionelle Domänen, die als konservierte Regionen (CR)
bezeichnet werden (Moran et al., 1987; Russell, 2000). Die konservierte Region 1 (CR1)
enthält unter anderem die Funktion zur Induktion der DNA-Synthese. Die konservierte
Region 2 (CR2) ist an der Induktion der Mitose beteiligt, wobei beide Regionen am NTerminus liegen. Die CR3 liegt in der Mitte des Proteins und enthält die Motive, die für die
Promotor-Transaktivierung erforderlich sind (Moran et al., 1987). Möglicherweise werden
nach Positionierung von Mer an dem N- bzw. C-Terminus des E1A alle seine funktionellen
Domänen nicht vollständig reprimiert, was zu einer Basalaktivität führt. Picard und
Mitarbeiter (1988) belegten am Beispiel einer aus adenoviralem E1A und GlucocorticoidHBD (GC-HBD) bestehenden Chimäre, dass die Effizienz der Repression der E1A-Aktivität
von der Größe oder der intramolekularen Distanz beider Teile der Chimäre abhängt. Dabei
inserierten sie Aminosäurensequenzen mit zunehmender Größe (0, 100 oder 500
Aminosäuren) zwischen dem am N-Terminus liegenden E1A und der am C-Terminus
positionierten
GC-HBD.
Dabei
stellten
sie
fest,
dass
ohne
Ligandbindung
die
Repressionseffizienz der E1A-Aktivität mit wachsender Molekülgröße geringer wurde. In
diesem Zusammenhang konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass durch die
Flankierung des Proteins am N- und am C-Terminus mit einem Mer (wie in der MEMChimäre) eine stringentere Repression der E1A-Aktivität in ligandfreiem Zustand erreicht
wird.
Die relative Positionierung von Mer in den Fusionsproteinen scheint eine wesentliche Rolle in
der gesamten OHT-abhängigen Regulation der oAdV zu spielen. Diese Rolle wurde durch
den Vergleich von Ad.ME und Ad.EM deutlich. Ad.EM war hinsichtlich des absoluten
Replikationslevels und der pharmakologischen Regulation Ad.ME deutlich überlegen. Das
zeigt, dass die Fusion der HBD am C-Terminus eine bessere Regulation der E1A-Aktivität
ermöglicht als die Fusion am N-Terminus. Obwohl die pharmakologische Regulation der
oAdV durch Fusion einer zweiten HBD am N-Terminus im MEM stark verbessert wurde,
ging dies auf Kosten der absoluten Aktivität des Fusionsproteins. Diese Beobachtung kann
allerdings nicht verallgemeinert werden, da die Struktur des fusionierten Proteins auch eine
Rolle spielen kann. So wurde vor einigen Jahren gezeigt, dass bei der Fusion der CreRekombinase mit dem Mer die Chimäre mit einem Mer am N- und am C-Terminus
(MerCreMer), sowohl eine stringentere OHT-abhängigen Regulation als auch eine erhöhte
absolute Aktivität im Vergleich zu CreMer hat, in
der Mer am C-Terminus der Cre-
Rekombinase lokalisiert ist (Verrou et al., 1999). Eine Erklärung für diesen Unterschied
Diskussion_______________________________________________________97_
könnte darin liegen, dass möglicherweise einige Funktionen des E1A-Proteins durch Fusion
mit der HBD am N-Terminus gestört sind.
4.4 Tam-oAdV verursachen eine OHT-abhängige Lyse der Tumorzellen
Die in der vorliegenden Arbeit entwickelten Tam-oAdV haben unterschiedliche onkolytische
Potentiale in vitro gezeigt, die die Unterschiede in der OHT-abhängigen Regulation der
Replikation von den jeweiligen Vektoren widerspiegelten. Nach Induktion verursachte
Ad.EM eine schnelle und starke Lyse der Tumorzellen in vitro. Bis zu 3 Tagen nach Infektion
zeigte dieser Vektor eine stringente OHT-abhängige Viro-Onkolyse. Bei längerer
Inkubationszeit ließ die Stringenz seiner Regulation aufgrund zunehmender Zytolyse in nicht
induziertem Status nach. Die Vektorvarianten Ad.MEM und Ad.EΔNLSM wiesen im Gegensatz
zu Ad.EM eine langsamere und weniger effiziente aber deutlich stringentere OHT-abhängige
Onkolyse auf, wobei Ad.EΔNLSM dem Vektor Ad.MEM leicht überlegen war. Der
Adenovirus-Wildtyp verfügt über zahlreiche Mechanismen, mit denen er zur Lyse der
infizierten Zellen führt. Die E3-Produkte, insbesondere das „adenovirus death protein“
(ADP) spielen dabei eine Rolle, indem sie in der späten Infektionsphase zur direkten Zelllyse
führen; im Gegensatz zu anderen viralen Proteinen, wie beispielsweise dem E1A, die zum
apoptotischen Zelltod führen (Braithwaite and Russell, 2001). Darüber hinaus bewirkt die
Virusreplikation eine massive Produktion der viralen Proteine sowie die Entstehung von
neuen Virionen, was zur Destabilisierung der zellulären Maschinerie, der Desintegration der
Zellstruktur und letztendlich zur Lyse der Zellen führt (Tollefson et al., 1996; Tollefson et al.,
1996). Letzteres könnte den Hauptmechanismus darstellen, über den die von OHTabhängigen Vektoren verursachte Onkolyse der Tumorzellen verläuft. Darüber hinaus
fungiert das E1A als pro-apoptotisches Protein und trägt zum Tod der infizierten Zellen bei
(Abou El Hassan et al., 2004; Boulakia et al., 2003). Außer dem Ad.ME-Vektor waren die
anderen Vektoren hinsichtlich ihrer onkolytischen Eigenschaften regulierbar. Die mit
Ad.MEM und Ad.EΔNLSM infizierten Tumorzellen waren ohne OHT-Behandlung gut
geschützt, während sie nach Behandlung lysiert wurden. Auch zu vermerken war die
Tatsache, dass Ad.EM, wie schon bei seiner Replikation, einen stärkeren onkolytischen Effekt
zeigte als der Kontroll-Vektor Ad.E. Es ist zu vermuten, dass das EM-Fusionsprotein
zusätzliche Funktionen erfüllt, die die Virusreplikation bzw. die Zytolyse verstärken oder
begünstigen können. Eine Schwankung in der Virusdosis wäre hier nicht auszuschließen.
Jedoch wurden die Virustiter bei allen Vektoren über einen Aufnahme-Assay überprüft, so
Diskussion_______________________________________________________98_
dass es unwahrscheinlich ist, dass die Vektorkonzentrationen eine große Rolle in den
beobachteten Effizienzunterschieden gespielt haben.
4.5 Starke Expression der E1A-Mer-Chimären und Regulationskapazität
der Tam-oAdV
Der zur Kontrolle der Expression der E1A-Mer-Chimären verwendete SP-B Promotor ist im
Vergleich zu vielen anderen Promotoren wie beispielsweise dem ubiquitäraktiven CMVmin
schwach (Hurtado Picó et al., 2005). Es stellte sich die Frage, ob eine hohe Expression der
E1A-Mer-Chimären durch stärkere Promotoren die Regulation der Tam-oAdV beeinflussen
kann. Um diese Frage anzugehen, wurde die Expression der E1A-Mer-Chimären erhöht,
indem der SP-B Promotor durch Ko-Expression von rtTA-M2 verstärkt wurde. Dabei wirkte
sich die Überexpression der E1A-Mer-Chimären nur geringfügig auf die Regulation der von
Tam-oAdV verursachten Zytolyse aus. Insbesondere blieb nach Überexpression von MEM
bzw. EΔNLSM ihre Aktivität im nicht induzierten Status kaum verändert. Im induzierten Status
hingegen bewirkte dies eine erhöhte onkolytische Effizienz. Im Gegensatz dazu war ein
oAdV, in dem das E1A-13s unter Kontrolle des TRE-Pomotors (bestehend aus tetO7 und
CMVmin) gesetzt wurde, bei konstitutiver Ko-Expression des rtTA-M2 schlecht regulierbar
(Fechner et al., 2003). Die Daten dieser Arbeit belegen, dass die Regulation der Tam-oAdV
auch bei der Verwendung starker Promotoren zur Expression der E1A-Mer-Chimären
gewährleistet ist.
Im Tet-System sowie im Dimerizer-System setzt eine stringente Regulierung der
Transgenexpression einen Promotor mit relativ geringer oder keiner Basalaktivität voraus.
Diese Voraussetzung wird annäherungsweise durch Anwendung des minimalen IL-2
Promotors (Rivera et al., 1996) für das Dimerizer-System oder durch die Anwendung von
optimierten Tetrazyklin-responsiven CMVmin Promotoren (Gossen and Bujard, 1992; Sipo et
al.,
2006;
Agha-Mohammadi
et
al.,
2004)
für
das
Tet-System
erfüllt.
Die
Auswahlmöglichkeiten für solche Promotoren bleiben jedoch begrenzt. Darüber hinaus ergibt
sich keine Möglichkeit, diese Promotoren gewebe- oder tumorspezifisch direkt zu
kontrollieren, denn die Spezifizität der Promotoren wird durch die konstitutiv und ubiquitär
exprimierten Transaktivatoren aufgehoben. Das Tam-regulierbare System bietet im Gegensatz
zu diesen Systemen die Möglichkeit, beliebige Promotoren für die zusätzliche transkriptionale
Kontrolle der pharmakologisch zu regulierenden Gene zu verwenden. Dies ist von besonderer
Bedeutung, denn es bieten sich zurzeit zahlreiche gewebe- und tumorspezifische Promotoren
an (Haviv and Curiel, 2001; Lo et al., 2005; Sadeghi and Hitt, 2005), die eine spezifische
Diskussion_______________________________________________________99_
Kontrolle der AdV-essentiellen Gene ermöglichen und dadurch für zusätzliche Sicherheit in
ihrer klinischen Anwendung von oAdV sorgen können.
4.6 Die Replikation der Tam-oAdV kann durch Expression von tTS
inhibiert werden
Aufgrund der nachweisbaren Virusreplikation unter nicht induzierten Bedingungen, die die
entwickelten Tam-oAdV, insbesondere der Ad.EM, gezeigt haben, war es von großem
Interesse, Möglichkeiten zu untersuchen, um die Basalreplikation zu reduzieren. Hierzu
wurde untersucht, ob die Verwendung des tTS zur transkriptionalen Repression der E1A-MerChimäre dies ermöglichen kann. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, dass das tTS
(Freundlieb et al., 1999; Fechner et al., 2003; Hurtado Picó et al., 2005) eine Reduktion der
Transgenexpression im Vergleich zu einem mit nicht-transduzierten Zellen vergleichbaren
Expressionslevel in Abwesenheit von Dox ermöglicht (Rossi and Blau, 1998). In der
vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass die hohe Basalaktivität des Vektors
Ad.EM durch Koexpression von tTS in Abwesenheit von Dox um das 12-fache reduziert
werden kann. Allerdings hatte der tTS nur einen geringfügigen Einfluss auf die
Basalreplikation von Ad.MEM und Ad.EΔNLSM. Diese Daten korrelieren mit der
vorangegangenen Veröffentlichung von Fechner und Mitarbeiter (2003), in der gezeigt wurde,
dass bei der Verwendung des Tetrazyklin-abhängigen rtTA/tTS-Systems zur Kontrolle der
oAdV, die Virusreplikation in Abwesenheit von Dox deutlich reduziert wurde. Allerdings hat
die Kombination Tam-regulierbares-/tTS-System im Vergleich zum Tetrazyklin-abhängigen
rtTA/tTS-System den Vorteil, dass im nicht induzierten Zustand ein Doppeleffekt erzielt wird.
Dieser Doppeleffekt wird zum einen durch die Inaktivierung der E1A-Mer-Chimäre im OHTfreien Status und zum anderen durch die tTS-verursachte Downregulation der E1AExpression erreicht. Auf diese Weise kann die Kompetition zwischen dem tTS-vermittelten
Silencing und der E1A-getriebenen Transaktivierung minimiert werden.
Für eine sichere klinische Anwendung sollte ein ideales regulierbares System schnell wieder
abschaltbar sein. Dabei kommt es darauf an, wie schnell die Wirkung des Therapeutikums
oder wie hier, die Virusreplikation nachlässt. Für ein pharmakologisch regulierbares System
wie im Falle der Tam-oAdV hängt das Abschalten der induzierten Virusreplikation unter
anderem von der Halbwertszeit des Induktors ab. Die OHT-Verbindung hat eine relativ lange
Halbwertszeit von 7 bis 14 Tagen. Diese lange Halbwertszeit kann sich limitierend auswirken,
wenn die Virusreplikation gestoppt werden soll. Es wurde beispielsweise in dieser Arbeit
beobachtet, dass drei Tage nach einer dreistündigen Vorinkubation der infizierten Zellen mit
Diskussion_______________________________________________________100_
OHT die gleiche Virusreplikationseffizienz erreicht wurde wie nach einer täglichen Zugabe
des Induktors (Daten nicht gezeigt). Durch Expression des tTS konnte im OHT-induzierten
Zustand die Virusreplikation je nach Vektoren bis um das 3-fache reduziert werden. Die
Möglichkeit, die Virusreplikation durch transkriptionelles Silencing der E1A-Chimären zu
inhibieren, kann dazu beitragen, die Halbwertszeitproblematik zum Teil zu lösen. Rittner und
Mitarbeiter (1997) hatten in ihrer Arbeit herausgefunden, dass der tTS in Abhängigkeit von
Dox die Transaktivierung der viralen Promotoren durch E1A-13s supprimieren kann. Die
vorliegenden Ergebnisse stehen daher in Korrelation mit denen von Ritter und Mitarbeiter.
Die E1A-mRNA ist instabil und hat eine Halbwertszeit von 40 min (Slavicek JM et al., 1998;
Boyle et al., 1985; Curran et al., 1984; Hann and Eisenman, 1984). Der inhibierende Effekt
von tTS auf die Replikation der oAdV in OHT-induziertem Status kann möglicherweise
dadurch erklärt werden, dass aufgrund des transkriptionalen Silencings durch tTS eine de
novo Synthese des E1A verhindert wird.
Des Weiteren wäre es nützlich, andere Östrogenmodulatoren mit kürzerer Halbwertszeit zur
Induktion der oAdV zu erproben.
Fulvestrant, auch ICI genannt, ist eine neue Art von Östrogenrezeptor-Antagonist, der an die
HBD des Östrogenrezeptors bindet und dessen Abbau verursacht (Robertson, 2004). Diese
Eigenschaft von Fulvestrant hat zur Hypothese geführt, dass es als Alternative für ein
schnelleres Abschalten der Virusreplikation nach Absetzen von Tam oder OHT beitragen
könnte. In dieser Arbeit wurde der Effekt von Fulvestrant auf die Replikation der Tam-oAdV
untersucht. Überraschenderweise wurde hier beobachtet, dass Fulvestrant die Virusreplikation
induzierte (Daten nicht gezeigt). Andere selektive Östrogenrezeptor-Modulatoren wie
beispielsweise Droloxifen haben eine kurze Halbwertszeit von nur 27h (Grill and Pollow,
1991b) und besitzen eine noch höhere Affinität für die HBD vom Östrogenrezeptor
(Eppenberger et al., 1991). Daher könnten diese Verbindungen eine gute Alternative zu Tam
und OHT sein.
4.7 Spezifizität der Tam-oAdV
Für eine onkolytische Virotherapie ist neben einer hohen Replikationsrate ein hohes Maß an
Tumorselektivität von großer Bedeutung. Die Tumorselektivität der entwickelten Tam-oAdV
beruht auf zwei Kriterien: zum einen auf der Deletion der Bindungsdomäne für das
Retinoblastom-Protein (Heise et al., 2000) innerhalb des Adenovirus-E1A-Proteins, was dazu
führt, dass in Retinoblastom-positiven Zellen die wichtige für die Replikation erforderliche
Überbrückung des Zellzyklus-Checkpunkts verhindert wird; zum anderen sind die Vektoren
E1B-deletiert, was aufgrund des fehlenden E1B-55kD-Proteins zu einer vorzeitigen Apoptose
Diskussion_______________________________________________________101_
in normalen Zellen führen sollte und damit zur Eliminierung der infizierten normalen Zellen
(Duque et al., 1998). Die Tumorselektivität der oAdV mit Mutation in der Bindungsdomäne
für das Retinoblastom-Protein oder Mutation in der E1B-Region wurde schon mehrfach
bewiesen.
Um die Replikation der Tam-oAdV auf Lungentumoren zu beschränken, wurde der
lungenspezifische SP-B Promotor zur Expression der E1A-Chimären eingesetzt. Der SP-B
Promotor ist fast ausschließlich in Typ II alveolarer und bronchialer Epithelzellen der Lunge
aktiv (Bohinski et al., 1994; Yan et al., 1995). In EA.hy926-Zellen, wo der SP-B Promotor
nicht aktiv ist, replizierten sich der Kontroll-oAdV Ad.E sowie Ad.EM nach OHT-Induktion.
Trotzdem waren diese oAdV in diesen Zelltypen im Vergleich zu H441-Zellen stark
abgeschwächt. Die unspezifische Replikation in EA.hy926-Zellen kann möglicherweise drei
Gründe haben: Als erstes können die cis-agierenden adenoviralen regulatorischen Elemente
die Spezifität der heterologen Promotoren beeinflussen. Hurtado Picó und Mitarbeiteret al.,
2005 evaluierten den Einfluss der adenoviralen 5´-terminalen Elemente (nt 1-342) auf die
Aktivität der in die E1-Region inserierten tumor- und gewebespezifischen Promotoren
(TGsP). Dabei zeigten sie, dass beispielsweise der SP-BPromotor eine um über 14-fach
erhöhte Aktivität in Non-Target-Zellen aufweist, wenn er downstream der adenoviralen 5´terminalen Elemente positioniert ist. Diese Verstärkung des SP-BPromotors könnte die
unspezifische Replikation der oAdV in EA.hy926-Zellen erklären.
Des Weiteren untersuchten Hurtado Picó et al. 2005 den Effekt des adenoviralen E1A-13S auf
die Aktivitäten der TGsP und stellten fest, dass die untersuchten TGsP von E1A-13S
unterschiedlich stark durch eine positive Rückkopplungsschleife (feed-back loop)
transaktiviert werden. So wurde der SP-BPromotor von E1A-13S um das 92-fache
transaktiviert. Diese positive Rückkopplungsschleife kann zum Spezifizitätsverlust und zur
Replikation der oAdV in Non-Target-Zellen führen.
Als drittes kann genannt werden, dass schon geringe Mengen an E1A-Genprodukten
ausreichend sind, um die adenovirale Replikation zu initiieren (Hitt MM, and Graham FL,
1990).
Im Gegensatz zu Ad.EM zeigten Ad.MEM und Ad.EΔNLSM eine sehr geringe Replikation und
Zytotoxizität in EA.hy926-Zellen nach OHT-Behandlung. Interessanterweise waren in
EA.hy926-Zellen die Vektoren Ad.MEM und Ad.EΔNLSM 13- bzw. 6-fach schwächer als
Ad.E. Möglicherweise lagen ihre Replikationslevel unterhalb des Grenzwerts, der zur
Auslösung der autoaktivierenden feed-back loop erforderlich ist. Doronin und Mitarbeiter
(2000) zeigten, dass ein onkolytisches Adenovirus mit dem SP-B Promotor zur Kontrolle des
Diskussion_______________________________________________________102_
E4-Gens effizient in Lungentumorzellen repliziert, in anderen Zelltypen aber stark
abgeschwächt war. Allerdings scheinen die TGsP in der E4-Region weniger von adenoviralen
Elementen beeinflusst zu werden als in der E1A-Region.
Der Einbau einer Insulatorsequenz zwischen dem SP-B Promotor und dem Enhancer-Element
könnte den Einfluss der Enhancer-Elemente auf den SP-B Promotor minimieren und die
unpezifische Replikation der Vektoren in Non-Target-Zellen reduzieren. Insulatorsequenzen
definieren die Grenze zwischen unterschiedlich regulierten Genloci und schützen Promotoren
vor dem Einfluss benachbarter regulatorischer Elemente (Prioleau et al., 1999). Werden sie
zwischen Promotoren und Enhancer-Elementen inseriert, so blockieren sie die PromotorEnhancer-Interaktion. Darüber hinaus konnte durch Insertion einer Expressionskassette in
umgekehrter Orientierung zwischen dem SP-BPromotor und dem adenoviralen E1A-Enhancer
die unspezifische Replikation der oAdV in HeLa-Zellen reduziert werden (Hurtado Picó et al.,
2005; Fechner et al., 2006, im Druck). Das ist ein weiterer Beweis, dass die Verhinderung der
Interaktion zwischen TGsP und E1A-Enhancer zur erhöhten Spezifizität der oAdV führt.
4.8 Regulation der Replikation und Anti-Tumorpotentiale der Tam-oAdV
in vivo
Für die Untersuchung der therapeutischen Potentiale der entwickelten Tam-oAdV in vivo
wurde das humane Lungenadenokarzinom als Tumormodell getestet. Lungenkarzinome
gehören zu den häufigsten bösartigen Erkrankungen des Menschen, wobei nur die kurative
chirurgische Therapie eine Heilungschance mit einer Fünfjahresüberlebensrate von unter
zehn Prozent bietet. Aus diesem Grund wären neue Therapienansätze wünschenswert. In
Mäusen mit H441-Tumorxenograften wurde am Beispiel von Ad.MEM die OHT-abhängige
Regulation der Virusreplikation analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass in Tumorextrakten
der mit Tam behandelten Mäuse der adenovirale Titer 38-fach höher war als bei den nicht
behandelten. Obwohl dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war (P = 0,058), war eine
klare Tendenz der Tam- bzw. OHT-abhängigen Regulation der Replikation des oAdV
Ad.MEM in diesen Tumoren zu erkennen. Die Funktionalität des Systems in vivo wurde
durch den Vergleich der Ad.MEM-infizierten mit den mit replikationsdefizienten AdV
infizierten Kontroll-Mäusen bestätigt. Ohne Tam-Behandlung gab es keinen signifikanten
Unterschied zwischen beiden Gruppen, während nach Tam-Behandlung der Virustiter in den
Ad.MEM-infizierten signifikant höher war als in den Kontroll-Mäusen. Allerdings wurde
dabei keine Reduktion des Tumorwachstums beobachtet. Der Grund dafür könnte neben der
geringen Virusreplikation auch an der kurzen Untersuchungszeit von 5 Tagen liegen. Um das
Diskussion_______________________________________________________103_
therapeutische Potential der Tam-oAdV in vivo über einen längeren Zeitraum zu untersuchen,
wurden die Vektoren Ad.EM und Ad.EΔNLSM aufgrund der besseren Replikations- und
onkolytischen Effizienz in vitro bevorzugt. Beide Vektoren verursachten nach TamBehandlung der infizierten Mäuse eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums im
Gegensatz zu dem replikationsdefizienten Vektor Ad5TRE-luc (P<0,005). Hinsichtlich der
pharmakologischen Kontrolle zeigte Ad.EM in vivo vergleichbare Anti-Tumoreffekte in Tambehandelten und nicht behandelten Mäusen. Die in vitro beobachtete Basalreplikation schien
in vivo ausreichend zu sein, um die gleiche Wirkung zu erzielen wie nach Behandlung mit
Tamoxifen. Obwohl das Tumorwachstum in den mit Ad.EΔNLSM infizierten Mäusen nach der
Tamoxifenbehandlung langsamer war als bei den nicht behandelten Mäusen, war dieser
Unterschied nicht signifikant. Ein Grund für die fehlende Signifikanz könnte die
Heterogenität zwischen den Tumoren sein. Zum anderen könnte die geringe Anzahl der
untersuchten Tiere die statistische Bedeutung der Untersuchung beeinflusst haben. Im Prinzip
war der Basaleffekt der entwickelten Tam-oAdV in vivo noch ausgeprägter als in der
Zellkultur.
Die
Basalreplikationen
bei
pharmakologisch
induzierbaren
replikationskompetenten AdV ist ein allgemeines Problem, das sowohl bei den Tetrazyklinregulierbaren (Fechner et al., 2003) als auch bei den Rapamycin-abhängigen oAdV (Chong et
al., 2002) beobachtet wurde. Für die transkriptionale Regulation der oAdV-Replikation
spielen die benachbarten regulatorischen Elemente auf dem viralen Genom eine wesentliche
Rolle für die beobachteten Basalreplikationen (Hurtado Picó et al., 2005; Steinwaerder and
Lieber, 2000; Vassaux et al., 1999). Es ist aber unwahrscheinlich, dass dieser Effekt der
viralen regulatorischen Elemente einen schwerwiegenden Einfluss auf die Basalreplikationen
der Tam-oAdV gehabt hat. Der Grund dafür liegt darin, dass ihre Regulation, wie schon
angedeutet, auf der Aktivitätsebene stattfindet. Es wurde darüber berichtet, dass Tumorzellen
Proteine mit E1-ähnlichen Funktionen exprimieren (Steinwaerder et al., 2000; Steinwaerder et
al., 2001). Möglicherweise können diese Proteine durch Trans-Komplementierung der
Virusreplikation eine Rolle in der Basalreplikation und der Reduktion des Tumorwachstums
in nicht behandelten Mäusen gespielt haben.
Was die onkolytische Effizienz der oAdV betrifft, konnten beide oAdV, Ad.EM und
Ad.EΔNLSM, mindestens genauso effizient wie der originäre Tam-unabhängige Ad.E das
Tumorwachstum in Tam-behandelten Mäusen hemmen. Trotzdem war ihre Effizienz nicht
ausreichend, um die Tumoren gänzlich zu zerstören. Mehrere Gründe können die
unzureichende Antitumorwirkung der oAdV erklären: Als erstes kann die Schwäche des
verwendeten SP-BPromotors genannt werden, denn in einem systematischen Vergleich
Diskussion_______________________________________________________104_
unterschiedlicher TGsP wurde gezeigt, dass der SP-BPromotor beispielsweise eine 7- bzw.
40-fach niedrigere Aktivität hat als der CEA- bzw. Tyr-Promotor (Hurtado Picó et al., 2005).
Andere Studien haben gezeigt, dass durch Anwendung stärkerer TGsP effizientere
Antitumoreffekte erzielt werden können. So berichteten Li und Mitarbeiter (2003) über die
Reduktion des kolorektalen Tumorxenograft-Wachstums durch den oAdV, dessen E1-Gen
unter Kontrolle des CEA-Promotors stand. Ähnliche Effekte wurden von Jakubczak und
Mitarbeiter (2003) erzielt, indem sie den E2F-Promotor einsetzten, um die Replikation des
oAdV in hepathozellulären Tumorxenograften zu kontrollieren.
Es ist möglich, dass die Vektordosis, aber auch die Anzahl der Applikationen zu gering war.
Eine höhere Dosierung und mehr als zwei Vektorapplikationen im Laufe der
Untersuchungszeit hätten vielleicht den onkolytischen Effekt verbessern können. Jakubczak
und Mitarbeiter (2003) konnten durch fünf aufeinanderfolgende intratumorale Applikationen
höhere oAdV-Dosen und eine komplette Regression des Tumorwachstums in Mäusen
erreichen. Des Weiteren zeigten Huang und Mitarbeiter (2003), dass in der Tumormasse die
Onkolyse zu nekrotischen Arealen führt. Diese Areale sind meistens durch Bindegewebe
getrennt, die die weitere Ausbreitung der Viren verhindern können.
Es ist nicht auszuschließen, dass die Resorption von Tamoxifen eine nicht zu
vernachlässigende Rolle in dem Ausmaß der intratumoralen Replikation der Tam-oAdV
gespielt hat. Die in vitro-Experimente
haben gezeigt, dass durch Erhöhung der
Induktorkonzentration die Effizienz der Replikation gesteigert werden konnte. Tamoxifen ist
ein Typ-IV-Östrogenrezeptor-Antagonist, der lediglich seine Aktivatorfunktion 2 blockiert.
Tamoxifen wirkt jedoch als Östrogenrezeptor-Agonist überall dort, wo die Aktivatorfunktion
1 ausreicht, um bestimmte Gene zu beeinflussen, wie es am Endometrium der Fall ist
(McDonnell et al., 1995; Tsai and O'Malley, 1994). Diese Verbindung als Salz (z.B.
Tamoxifendihydrogencitrat) ist ein klinisch validiertes Pharmakon und wird zur Behandlung
von Hormon-abhängigem Brustkrebs eingesetzt. Im Gegensatz zu vielen anderen
Chemotherapeutika kann Tamoxifen über einem langen Zeitraum eingenommen werden und
ist mit keiner schwerwiegenden Toxizität beim Menschen verbunden (Jordan, 2004;
Mandlekar and Kong, 2002). Der Nachteil dieser Verbindung liegt allerdings in ihrer geringen
Wasserlöslichkeit im Gegensatz zu Doxyzyklin und Rapamycin (Pollock and Clackson,
2002), die eine orale Applikation bei in vivo Experimenten erschwert hatte (Toniatti et al.,
2004). Tamoxifen wird in vivo zu OHT metabolisiert (White, 2003), ein Metabolit mit 10- bis
100-fach besserer Affinität für die HBD des Östrogenrezeptors im Vergleich zu Tamoxifen
(Charlier et al., 1995; Williams et al., 1994). Jedoch weist OHT eine noch geringere
Diskussion_______________________________________________________105_
Löslichkeit als Tamoxifen auf und wurde deshalb nur für in vitro Experimente bevorzugt.
Zum anderen gibt es Berichte, wonach die Langzeitbehandlung mit einer höheren Tam-Dosis
mit Nebenwirkungen wie Thromboembolien oder einem erhöhten Risiko an endometrischen
Tumoren verbunden ist (Fabian and Kimler, 2001). Es bleibt daher zu untersuchen, ob andere
selektive Östrogenrezeptor-Modulatoren wie beispielsweise Droloxifen (Eppenberger et al.,
1991; Grill and Pollow, 1991; John et al., 2002) aufgrund ihrer höheren Bindungsaffinität zur
ER-HBD, ihrer geringeren Nebenwirkungen sowie aufgrund ihrer besseren Bioverfügbarkeit
die in vivo-Induktion der Replikation der in dieser Arbeit entwickelten oAdV verbessern
würden.
4.9 Analyse
der
TRE-Promotoren
und
Auswahlkriterien
für
die
Expression des FasL im Kontext replikativer Adenoviren
Adenoviren verfügen über Mechanismen, mit denen sie zum passenden Zeitpunkt die Lyse
der Wirtszellen verursachen. Insbesondere für Ad5-Wildtyp spielt das ADP in der späten
Phase des Replikationzyklus eine wesentliche Rolle in der Induktion der effizienten Lyse der
infizierten Zellen (Scaria et al., 1992; Tollefson et al., 1996). Um einen vorzeitigen Zelltod zu
vermeiden, scheint der Virus die ADP-Expression zeitlich an seinen Replikationsverlauf
anzupassen. Daher wird ADP in der frühen Phase ausgehend vom E3-Promotor nur in sehr
kleinen Mengen exprimiert, und wird aber in der späten Infektionsphase ausgehend vom
major late promotor in großer Menge exprimiert (Tollefson et al., 1992). Um toxische Gene
im Kontext von replikationskompetenten AdV zu exprimieren, erscheint es deshalb hilfreich,
die Kinetik der Genexpression der Virusreplikation anzupassen. In der vorliegenden Arbeit
wurde bei der Auswahl des geeigneten Promotors zur Expression des Todesliganden FasL auf
eine sehr geringe Basalaktivität fokussiert. Damit sollte erreicht werden, dass die
Genexpression in der frühen Infektionsphase minimiert wird. Vier TRE-Promotorvarianten
wurden deshalb analysiert, wobei die Unterschiede in der Promotorlänge und den
Regulationselementen upstream der Promotoren bestanden. Der TRE-Promotor besteht aus
zwei Komponenten, nämlich dem tetO7 und einem CMVmin (Gossen and Bujard, 1992). Die
vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Verkürzung des CMVmin durch Deletion der
Sequenzen downstream des Transkriptionstarts sowie die Substitution des CMVmin durch eine
isolierte TATA-Box zu erheblicher Reduktion der Basalaktivität des TRE-Promotors führten.
Dies steht in Übereinstimmung mit der Untersuchung von Agha-Mohammadi und Mitarbeiter
(2004), die gezeigt hatten, dass bis auf vier Basenpaare die Deletion aller CMVmin Sequenzen
zwischen dem ersten tetO und der TATA-Box in einer starken Reduktion der Basalaktivität
Diskussion_______________________________________________________106_
resultiert. Eine weitere Möglichkeit, den TRE-Promotor zu optimieren, besteht darin, den
tetO7 zu verändern (Agha-Mohammadi et al., 2004). In diesem Zusammenhang bewirkte der
Austausch des tetO7 durch tetO7mod im TRE-Promotor eine 5- bis 10-fache Reduktion der
Basalaktivität, ohne dabei die Transaktivierbarkeit zu beinträchtigen. tetO7mod ist ein
heptamerischer tetO, in dem die Linker-Sequenzen zwischen den tet-Operatoren im Vergleich
zu tetO7 modifiziert wurden. Möglicherweise ist die dabei beobachtete Reduktion der
Basalaktivität auf die Deletion der IFN-α-stimulierten-response-element-ähnlichen Sequenzen
in den Linker-Sequenzen zwischen den tetO-Einheiten zurückzuführen. Es wurde in jüngster
Zeit gezeigt, dass diese Elemente die Aktivierung des TRE-Promotors durch IFN-stimulierte
Transkriptionsfaktoren vermitteln (Rang and Will, 2000).
In der vorliegenden Arbeit wurde deutlich gezeigt, dass zwei optimierte TRE-Promotoren,
Tight1-
und
Tight2-Promotor,
niedrigere
Basalaktivitäten
und
eine
stringentere
Regulierbarkeit im Vergleich zum originären TRE-Promotor aufweisen. Auch durch
Koexpression des tTS konnte die Basalaktivität des TRE Promotors nicht auf das Niveau von
Tight1 oder Tight2 reduziert werden. Die Repression des TRE durch tTS führte zu einer 2fachen Reduktion der Promotoraktivität. Jedoch blieb die Basalaktivität 4-fach höher als im
nicht reprimierten Tight1-Promotor. Obwohl der Tight2-Promotor eine niedrigere
Basalaktivität und höhere Regulationskapazität hatte, war der Tight1-Promotor angesichts
seiner hohen absoluten Expressionstärke dem Tight2-Promotor weit überlegen und für die
Kontrolle der FasL-Expression besser geeignet.
Der Effekt der Basalaktivität des TRE-Promotors wurde anhand der FasL-Expression in
H441-Zellen gezeigt. Der FasL-exprimierende replikationsunfähige Ad5TRE-FasL führte im
nicht induzierten Status zur erhöhten Apoptose der transduzierten Zellen im Vergleich zu
Ad5tight1-FasL. Darüber hinaus war bei der Produktion der Vektoren in HEK293 der Titer
des Ad5TRE-FasL 6-fach niedriger als der von Ad5Tight1-FasL und der durchschnittlichen
Ausbeute der Adenoviruspräparationen. Dieser niedrige Virustiter deutete darauf hin, dass die
residuale FasL-Expression einen negativen Einfluss auf die Virusreplikation als Folge der
Zytotoxizität hat.
Aus den Promotoranalyse-Experimenten kann gefolgert werden, dass der Tight1-Promotor
angesichts seiner niedrigen Basalaktivität, seiner guten Regulierbarkeit und seiner effizienten
Trans-Aktivierbarkeit die Kriterien zur regulierten Expression des FasL erfüllt.
Diskussion_______________________________________________________107_
4.10 Die FasL-Expression hat einen synergistischen Effekt auf die
onkolytische Effizienz der Tam- oAdV
Die Tam-oAdV haben deutliche onkolytische Potentiale in OHT- bzw. Tam-induziertem
Zustand gezeigt. Jedoch war zu erkennen, dass die Konstrukte mit der besseren
Regulierbarkeit Ad.MEM und Ad.EΔNLSM weniger effizient im Vergleich zu Ad.EM waren.
Auch in den vorliegenden in vivo-Experimenten konnte festgestellt werden, dass trotz ihres
Antitumoreffekts die onkolytische Effizienz eher gering war. Die unzureichende
Antitumoreffizienz ist nicht nur bei den Tam-oAdV zu beobachten, sondern stellt eine
allgemeine Limiterung der bisher entwickelten oAdV dar. Beispiele dafür liefern Daten aus
den klinischen Studien mit ONYX015. In einer zweiten Phase der klinischen Studie mit
ONYX015 bei Patienten mit Hepatobiliary Tumoren wurde nur eine mäßige Reduktion der
Tumoren bei der Hälfte der Probanden festgestellt (Makower et al., 2003). Untersuchungen
und zahlreichen Studien zufolge sind die bisherigen oAdV als Single-Therapieagenzien nicht
effizient genug für eine klinische Anwendung (Lichtenstein and Wold, 2004). Um die
Effizienz der oAdV zu verbessern, versucht man in jüngster Zeit unter anderem, die ViroTherapie mit der Gentherapie zu kombinieren. Zu diesem Zweck wurden beispielsweise
verschiedene oAdV entwickelt, in denen Suizidgene (Selbstmordgene), inseriert wurden. Als
Suizidgene wurden zumeist
entweder das Herpes-simplex-Virus-Thymidin Kinase -Gen
(HSV-tk) oder das bakterielle Cytosin Deaminase Gen (cd) bzw. eine Kombination der beiden
verwendet (Barton et al., 2006; Boucher et al., 2006), wodurch eine verbesserte Onkolyse
erzielt wurde.
In weiteren Arbeiten wurde auf adenovirale zytotoxische Gene zurückgegriffen, um die
Effizienz der oAdV zu verbessern. So haben Kuppuswamy und Mitarbeiter (2005) neulich
gezeigt, dass ein oAdV, der ADP überexprimiert, eine erhöhte Zell-Zell-Ausbreitung sowie
eine verbesserte Antitumoreffizienz aufweist. Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass die
Expression des TRAIL (ein Todesligand) durch oAdV zu erhöhten Antitumoreffekten in vitro
und in vivo führte (Ye et al., 2005; Zhao et al., 2006).
In der vorliegenden Dissertation wurde mit dem Ziel der Verbesserung der Antitumoreffekte
der oAdV die Expression des Todesliganden FasL mit der der OHT-abhängigen oAdV
kombiniert. Das Immunsystem nutzt das Fas/FasL System, um Tumorzellen im Körper zu
eliminieren. Dabei exprimieren aktive zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) FasL und
induzieren die Apoptose der Fas-exprimierenden Tumorzellen (Reichmann, 2002; Sapi et al.,
2002). Daher stellt das Fas/FasL System ein attraktives Mittel zur Bekämpfung von Tumoren
dar. Bisher wurde das Fas/FasL nur auf der Basis von FasL-exprimierenden
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replikationsdefizienten Adenoviren untersucht. Es konnte sowohl in vitro als auch in vivo
gezeigt werden, dass die FasL-Expression ein zytotoxisches Potential gegenüber einigen
Tumorarten aufweist (Hedlund et al., 1999; Zheng et al., 2005). Allerdings wurden dazu
meistens das Tet-System (Rubinchik et al., 2003; Rubinchik et al., 2005) oder starke
Promotoren (Zheng et al., 2005) zur Kontrolle der FasL-Expression eingesetzt. Für eine
ausreichende Sicherheit erfordert diese Strategie das Targeting des Tropismus verwendeter
Vektoren zu den Tumoren. Der Grund dafür ist, dass der Todesrezeptor Fas in fast allen
normalen Zellen exprimiert wird (Leithauser et al., 2004). Konstitutiv aktive oder regulierbare
Promotoren mit hoher Basalaktivität könnten nach Expression von FasL in normalen Zellen
zur Apoptose führen. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein neues Konzept erprobt, dass
die tumorselektive Replikation der oAdV ausnutzt, um einen additiven Effekt auf ihr
Antitumorpotential durch replikationsbedingte Expression von FasL in diesen Tumoren zu
erzielen. Die Koinfektion von Tumorzellen mit OHT-regulierten und FasL-exprimierenden
Vektoren zeigte einen synergetischen Effekt auf die onkolytische Effizienz der oAdV.
Auffällig war, dass durch Verwendung des Tight1-Promotors zur Expression des FasL eine
strikte OHT-abhängige Steigerung der Zytotoxizität der Tam-oAdV erreicht wurde.
Offensichtlich führt diese Kombination dazu, dass in OHT-induziertem Zustand die
aktivierten E1A-Mer-Chimären zum einen den Tight1-Promotor transaktivieren und zum
anderen die Replikation des Ad5tight1-FasL bzw. Ad5TRE-FasL trans-komplementieren.
Daraus resultiert eine kontinuierliche Erhöhung der FasL-Expression. In der späten
Replikationsphase könnte dadurch ein FasL-Expressionslevel erreicht werden, welcher sich
synergistisch auf die Viro-Onkolyse auswirkt. Bemerkenswert war die Tatsache, dass unter
Kontrolle des Tight1-Promotors im Gegensatz zum TRE-Promotor keine Erhöhung der
Zytolyse beobachtet wurde, wenn die Virusreplikation nicht induziert war. Dies belegt, dass
der Tight-Promotor für eine stringentere replikationsabhängige Kontrolle der FasLvermittelten Zytolyse gut geeignet ist.
Dies ist das erste Mal, dass der Todesligand FasL im Kontext von induzierbaren und
selektiven onkolytischen Adenoviren eingesetzt wurde. Diese Strategie weist wesentliche
Vorteile auf: Erstens wird durch die zunehmende, aber replikationsbedingte Expression des
FasL sein toxischer Effekt erst in der späten Phase der Virusreplikation effektiv. Somit wird
ein vorzeitiger Tod der Tumorzellen verhindert. Zweitens wird eine ausreichende FasLExpression aufgrund der Tumorselektivität der Virusreplikation auf Tumoren begrenzt. Des
Weiteren setzen die mit FasL-exprimierenden Ad-Vektoren infizierten Tumorzellen
apoptotische Körperchen (bodies) und Zellbruchstücke in der lokalen Umgebung frei, die
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durch den Bystander-Effekt benachbarte Zellen abtöten können (Hyer et al., 2003; Norris et
al., 2006). Dies unterstützt die Annahme, dass die Kombination von FasL als
Gentherapieagent mit oAdV eine vielversprechende Methode darstellt, die in der Zukunft für
die Anti-Tumortherapie weiter evaluiert werden kann.
Die Kombination der Tam-oAdV mit FasL wurde auf der Basis eines Zwei-Vektorsystems
durchgeführt, indem die E1A-Mer Chimären und die FasL-Expressionskassette auf separaten
Ad-Vektoren inseriert wurden. Das hat den Nachteil, dass eine Trans-Komplementierung der
Replikation nur möglich ist, wenn beide Vektoren die gleiche Zielzelle infizieren. Da dies
nicht immer der Fall ist, könnte die Insertion beider Kassetten in einen singulären Vektor das
Ausmaß des durch die FasL-Expression verursachten additiven Effektes steigern.
Zusammenfassung
5
110
Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurden vier Fusionsproteine ME, MEM, EM und EΔNLSM durch
Fusion des adenoviralen pRB-Bindungsdomäne-deletierten E1A-Mutanten (E1AΔpRB) mit der
mutierten HBD des Maus-ER (Mer) konstruiert, mit dem Ziel, ihre Aktivität in Abhängigkeit
von Tam- bzw. OHT zu kontrollieren. Die systematische Charakterisierung der
Fusionsproteine ergab, dass alle Konstrukte in Abhängigkeit von Tam bzw. OHT die
Funktionen des nativen adenoviralen E1A-Proteins beibehalten, nämlich die Transaktivierung
von TATA-Box-haltigen Promotoren und die Komplementierung der Adenovirusreplikation.
Auf dieser Grundlage wurden vier lungenspezifische Tam-regulierbare oAdV (Tam-oAdV)
entwickelt (Ad.ME, Ad.MEM, Ad.EM bzw. Ad.EΔNLSM), in denen die Fusionsproteine ME,
MEM, EM bzw. EΔNLSM unter Kontrolle des SP-B Promotors in die E1-Region des E1/E3deletierten AdV-Genoms inseriert wurden. Die Analyse der Tam-oAdV zeigte eine eindeutige
Tam- bzw. OHT-Abhängigkeit sowohl ihrer Replikation als auch ihrer onkolytischen
Potentiale in vitro. Die vier Tam-oAdV wiesen unterschiedliches Verhalten auf, wobei
Ad.MEM und Ad.EΔNLSM die bessere Regulationskapazität aufwiesen. Ad.EM hatte eine
niedrigere Regulationskapazität im Vergleich zu Ad.MEM und Ad.EΔNLSM, zeigte aber eine
effizientere Replikation und Onkolyse auch im Vergleich zu einem Kontroll-oAdV, dessen
Replikation durch das native E1AΔpRB gesteuert wird. Das Konstrukt Ad.ME war durch eine
ineffiziente Regulation und onkolytisches Potential gekennzeichnet. In vivo wurden die TamoAdV in Mäusen mit subkutanen humanen Lungen-Adenokarzinomxenograften untersucht
mit dem Ergebnis, dass beide Tam-oAdV, Ad.EM und Ad.EΔNLSM, einen klaren
Antitumoreffekt in Tam-behandelten Mäusen, aber keine signifikante Tam-abhängige
Regulation aufwiesen. Hinsichtlich der Spezifizität wurde die Replikation der Vektoren in
Nicht-Zielzellen stark geschwächt. Des Weiteren wurde bei der Untersuchung des Einflusses
der Überexpression der Fusionsproteine auf die Regulation und Aktivität der Tam-oAdVs
festgestellt, dass die Regulationskapazität der Vektoren beibehalten und ihr onkolytisches
Potential gesteigert werden. Interessanterweise wurde durch Kombination der Tam-oAdV mit
dem tTS festgestellt, dass sowohl die Basalaktivität als auch die OHT-induzierte Replikation
der Tam-oAdV inhibiert werden kann. Um eine Verbesserung der OHT-abhängigen, aber
tumorselektiven onkolytischen Effizienz der Tam-oAdV zu erreichen, wurde ein neues
Konzept getestet, indem nach Analyse von verschiedenen Promotorvarianten der Tight1Promotor ausgesucht und zu einer replikationsbedingten Expression des Todesliganden FasL
im Ad5Tight1-FasL verwendet wurde. Die Trans-Komplementierung der Replikation von
Zusammenfassung
111
Ad5Tight1-FasL durch Ad.MEM bzw. Ad.EΔNLSM in H441-Zellen ermöglichte einen OHTabhängigen synergistischen Effekt auf die onkolytische Effizienz beider Vektoren. In der
Summe wurde in dieser Arbeit eine neue Generation von pharmakologisch regulierbaren
oAdV entwickelt, deren Regulationsprinzip im Gegensatz zu den bisherigen regulierbaren
oAdV auf der Kontrolle der Aktivität statt der Expression des essentiellen Genproduktes
basiert.
6
Ausblick
Die in der vorliegenden Dissertation erzielten Ergebnisse belegen die Funktionalität der Tamregulierbaren Fusionsproteine zur pharmakologischen Kontrolle der Adenovirusreplikation.
Es gibt jedoch einen Verbesserungsbedarf, was die Reduktion der Basalreplikation sowie den
Antitumoreffekt der Tam-oAdV in vivo betrifft. Beide Fragen wurden in vitro mit binären
Systemen angegangen, indem eine Koinfektion der Tumorzellen mit den Tam-oAdV und dem
tTS-exprimierenden AdV zur Reduktion der Basalreplikation bzw. eine Koinfektion mit den
Tam-oAdV und dem FasL-exprimierenden AdV zur Erhöhung der viralen Zytotoxizität
durchgeführt wurde. Durch den Einbau der tTS- bzw. FasL-Expressionskassette in das TamoAdV-Genom als singuläres System könnte das Ausmaß der in vitro erzielten Ergebnisse
stark verbessert werden. Des Weiteren könnte die durch FasL verursachte Steigerung der
onkolytischen Effizienz der Tam-oAdV in Tumorxenograften in vivo getestet werden.
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Anhang----------------------------------------------------------------------------------------------------
8
Anhang
Plasmidkarten
Anhang----------------------------------------------------------------------------------------------------
Anhang----------------------------------------------------------------------------------------------------
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Wolfgang Poller möchte ich für die Möglichkeit danken, diese Arbeit an
der Charite Berlin/CBF – Klinik für Kardiologie und Pulmunolgie anzufertigen.
Dr. Henry Fechner danke ich für die hervorragende Betreuung, fachliche und
organisatorische Hilfe, unzählige Anregungen, interessante Diskussionen und ganz besonders
für seine große Motivationsfähigkeit.
Ich danke Prof. Dr. Ulf Stahl für die Betreuung meiner Arbeit von der universitären Seite
und die Übernahme des Berichts.
.
Xiomin Wang möchte ich für die hervorragende technische Unterstützung besonders danken.
Vielen Dank an alle Mitarbeiter unserer Arbeitsgruppe insbesondere Lennart Suckau, A.
Hurtado Picó, Sandra Pinkert für die gute Zusammenarbeit, konstruktiven Diskussionen
sowie die lockere und angenehme Arbeitsatmosphäre.
Ich danke meiner Frau Grit und meinem Sohn Erik Leonel, die für mich jederzeit die größte
Motivation waren und sind.
Mein großer Dank geht an Tante Margot und meine Schwiegermutter Marlis für die
sprachlichen und unzähligen Unterstützungen aller Arten.
Vielen Dank an meine Eltern in 6000 km Entfernung.
Ich möchte mich auch bei allen bedanken, die mich direkt oder indirekt bei meinen
Untersuchungen unterstützt haben.