Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat

Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
1. Einleitung
Escherichia coli ist in der Lage Glukose und Acetat als Substrat zu verwerten. In
diesem Versuch wird das Wachstum unter aeroben Bedingungen auf Glucose und
Acetat untersucht.
Ziel ist die Aufstellung zweier Wachstumskurven, durch die die exponentielle
Wachstumsrate (µ) und die Verdopplungszeit (td)bestimmt werden können. Die
exponentielle Wachstumsrate ist ein Maß für die Geschwindigkeit des Zellwachstums
während der exponentiellen Wachstumsphase. Sie errechnet sich aus den zu den
Zeiten t0 und t gemessenen Bakteriendichten x0 und xt. Die Verdopplungszeit gibt die
Zeit für die Verdopplung der Zellmasse an und kann über µ berechnet werden.
Für das Aufstellen der Wachstumskurven wird die Zellzahl über die optische Dichte
(OD) bestimmt. Die optische Dichte nimmt bis zu einem bestimmten Wert
proportional zur Zellzahl zu. Ab einem Wert von 0,5 beginnen sich die
Bakterienzellen wegen ihrer Größe gegenseitig zu beschatten und eine genaue
Bestimmung der Zellzahl ist nicht mehr möglich. Durch geeignete Verdünnung der
Proben kann die Zellzahl jedoch wieder bestimmt werden.
Die optische Dichte wird alle 30 Minuten (Zellen, die mit Glucose wachsen) bzw. alle
60 Minuten (Zellen, die mit Acetat wachsen) ermittelt, bis sie einen konstanten Wert
annimmt (stationäre Phase).
Bei der Verwertung von Glucose und Acetat werden teilweise unterschiedliche
Stoffwechselwege genutzt, die maßgeblich für die Teilungsrate der Bakterien sind.
Die Glukose wird über die Glykolyse zu Pyruvat abgebaut, das durch die Bildung von
AcetylCoA in den Citratzyklus überführt wird und dort vollständig zu Kohlenstoffdioxid
oxidiert wird. Die Reduktionsäquivalente werden in die Atmungskette eingeschleust
und ein Protonengradient aufgebaut. Durch Abbau des Protonengradienten kann
ATP
gebildet
werden
(Energiestoffwechsel).
Intermediärprodukte
für
den
Baustoffwechsel können direkt aus der Glykolyse und dem Citratzyklus entnommen
werden. Die Synthese von Oxalacetat (OA) aus Phosphoenolpyruvat (PEP) wird von
der PEP-Carboxylase katalysiert und dient als anaplerotische Reaktion zum Auffüllen
des Citratzykluses.
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
Acetat wird dagegen durch den Glyoxylatzyklus und den Citratzyklus abgebaut. Die
Reduktionsäquivalente werden in der Atmungskette zur Bildung von ATP verwendet.
Im Glyoxylatzyklus werden zwei Acetat verbraucht, die über Acetyl-Coenzym A
(AcetylCoA) eingeschleust werden. Die Bildung von Acetyl-Coenzym A aus Acetat
kann direkt durch die Fettsäure-CoA-Synthetase unter Verbrauch von ATP oder
durch die Bildung des Zwischenprodukte Acetylphosphat, wobei ein ATP verbraucht
wird, erfolgen.
Das AcetylCoA reagiert mit Oxalacetat (OA) zu Citrat und weiter zu Isocitrat. Dieses
wird durch die Isocitratlyase in Succinat und Glyoxylat gespalten:
Isocitratlyase
Succinat + Glyoxylat + NADH+H+
Isocitat + NAD
Unter Verwendung eines weiteren AcetylCoA reagiert das Glyoxylat zu Malat:
Malatsynthase
Malat
Glyoxylat + AcetylCoA
Der Glyoxylatzyklus sorgt dafür, dass die notwendigen Verbindungen für den
Citratzyklus und für die Gluconeogenese zur Verfügung stehen. Die Bildung von
Reduktionsäquivalenten im Citratzyklus ist somit gewährleistet.
Diese werden in die Atmungskette eingeschleust und sind für die Bildung eines
Protonengradienten
verantwortlich.
Durch
den
Abbau
des
entstandenen
Protonengradienten wird ATP gebildet (ATP-Synthase).
Um die Intermediärprodukte für den Baustoffwechsel bilden zu können, die bei
Wachstum mit Glucose durch die Glykolyse entstehen, muss OA durch die PEPCarboxykinase
zuerst
zu
PEP
umgewandelt
werden,
um
dann
in
die
Gluconeogenese eingehen zu können.
PEP-Carboxykinase
Oxalacetat + ATP
Phosphoenolpyruvat + CO2 + ADP
Des Weiteren wird nach dem Aufstellen einer Eichgerade die Konzentration von
Glucose im Medium photometrisch bestimmt. Der Nachweis erfolgt indirekt über
oxidiertes 2,2´-Azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonat (ABTS), dessen Extinktion bei
436nm gemessen wird. Die bestimmte Menge an ABTS ist der Menge an Glucose
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
gleich zu setzten. Dem Versuch liegen zwei Reaktionen zugrunde, die durch die
Enzyme Glucoseoxidase (GOD) und Peroxidase (POD) katalysiert werden.
GOD
Glukonat + H2O2
Glucose + O2 + H2O
POD
ABTSox + 2 H2O
H2O2 + ABTSred
Durch die Bestimmung der Glucosekonzentration kann der Extinktionskoeffizient (ε)
von dem oxidierten ABTS über das Lambert-Beersche-Gesetz ermittelt werden.
Zusätzlich kann die von 1 Mol Glucose gebildete Zellmasse und damit der molare
Ertragskoeffizient (YGly) berechnet werden.
2. Material und Methoden
Vorkulturen des E. coli-Stamms AN387 wurden auf Glucose bzw. Acetat gezüchtet.
In zwei Erlenmeyerkolben werden je 15ml M9-Medium + Substrat (Acetat bzw.
Glucose; Endkonzentration 3mM) pipettiert und die Medien mit dem entsprechenden
Zellen beimpft.
Zur Messung der optischen Dichte (OD) wird in regelmäßigen Abständen je 1ml
Zellsuspension abgenommen und bei 578nm gegen Luft gemessen. Davon wird der
Blindwert (Medium ohne Zellen) abgezogen. Anhand dieser Werte wird eine
Wachstumskurve aufgestellt, aus der die Generationszeit, die Verdopplungszeit und
die Wachstumsrate berechnet werden.
Material:
M9-Medium: 50 ml M9-Medium :
- 100 ml/l M9 (10 x)-Salzlösung:
Na2HPO4 60 g/l
KH2PO4 30 g/l
NH4Cl 10 g/l
NaCl 5 g/l
- 10 ml/l CaCl2 (10 mM)
- 1 ml/l MgSO4 (1 M)
- 10 ml/l Säurehydrolysiertes Casein (10 %), mit H2O auffüllen.
Nach Zusatz aller Lösungen mischen (schwenken)!
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C-Quelle:
- D-Glucose (0.1 M)
- Na-Acetat, pH 7 (0.1 M)
Zuchtansätze (für jeweils 1 Gruppe):
In 2 vorbereitete sterile Erlenmeyerkolben folgende Lösungen pipettieren:
A) 15 ml Medium + Glucose (Endkonz. 3 mM)
B) 15 ml Medium + Na-Acetat (Endkonz. 3 mM)
Die Glucosebestimmung einer unbekannten Probe sowie der Anfangs- und
Endkonzentration der Zucht erfolgt durch den direkten Vergleich mit der
Standardlösung (500µM). Zusätzlich wird eine Eichgerade (0µM (Blindwert) bis
500µM Glucose) erstellt, mit der die Funktion des Testsystems überprüft wird. Für
alle Proben werden Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Ermittlung der
Glucosekonzentration erfolgt indirekt nach den in der Einleitung beschriebenen
Reaktionen. Die Proben werden wie unten beschrieben zusammen pipettiert und bei
37°C für 30 Minuten im Wasserbad inkubiert (b) Durchführung)
Aus den Ergebnissen der Messungen kann der molare Extinktionskoeffizient von
ABTS
berechnet
werden
(Lambert.Beersche-Gesetz).
Mit
dem
ermittelten
Glucoseverbrauch kann zusätzlich der molare Ertragskoffizient für Glucose bestimmt
werden (YGly = g Trockenzellen / mol verbrauchter Glucose).
Material:
a) Lösungen
NaPi-Puffer:
700 mg Na2HPO4 x 2 H2O
360 mg NaH2PO4 x H2O
auf 50 ml mit H2O auffüllen (davon 500 µl für GOD abzweigen)
Glucoseoxidase (für 50 Tests, haltbar bei 4 °C)
400 U GOD (aus Schimmelpilz, Grad II) in 500 µl NatriumPhosphat-Puffer lösen.
Lösung ist für 2-3 Tage bei 4 °C stabil.
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
Glucosereagenz (für 50 Proben, haltbar bei 4°C)
50 ml NaPi -Puffer
200 U POD (aus Meerrettich, Grad II)
25 mg ABTS, Diammoniumsalz, zugeben.
5 Tr. Chloroform zusetzen.
Glucosestandard
100 mg Glucose x H2O in 1 l H2O lösen, bei -20 °C
aufbewahren.
b) Durchführung: (in Eppendorf-Cups)
1 ml Glucosereagenz
50 µl Probe (max. 30 nmol Glucose)
10 µl GOD, mischen
Die ausführliche Versuchsbeschreibung ist im Skript zu finden!
3. Ergebnisse
3.1. Wachstum mit Glucose
Tab. 1: Ermittlung der optischen Dichte bei Wachstum mit Glucose
Blindwert (BW; nur Medium): OD
(578nm) = 0,041
Minuten
OD578 (unverdünnt - BW)
0
30
60
0,159 0,216 0,38
OD578 (verdünnt - BW)
Verdünnungsfaktor
OD578 (Endwert)
0,041
0,2
90
120
150
180
210
240
0,576
0,759
0,885
0,919
1,003
1,092
0,309
0,199
0,219
0,223
0,245
0,268
2
5
5
5
5
5
0,995
1,095
1,115
1,225
1,34
0,257 0,421 0,618
Bei der Berechnung der OD-Endwerte sind nur die rot markierten Messwerte
eingegangen. Die unverdünnten Messwerte ab 90 Minuten können für die Ermittlung
der OD nicht berücksichtig werden, da sich ab einer OD von 0,5 die Bakterien
gegenseitig beschatten.
Die OD-Werte zeigen, dass die Zellmasse stetig zugenommen hat und das
Wachstum zwischen 30 und 120 Minuten am stärksten ist. Die verdünnten und
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
unverdünnten OD-Werte werden gegen die Zeit in Minuten aufgetragen (siehe Abb.
1). Somit erhält man eine typische Wachstumskurve, die anfangs (0 bis 30 Minuten)
eine lag-Phase besitzt, dann von 30-120 Minuten ein exponentielles Wachstum
aufweist und schließlich ab 120 Minuten in eine statische Phase übergeht. Eine
Absterbe-Phase ist hier allerdings nicht zu erkennen. Dagegen nimmt die Zellzahl ab
180 Minuten nochmals zu.
Zudem ist ein großer Unterschied zwischen der verdünnten und unverdünnten
Wachstumskurve zu erkennen. Die Werte bei 0, 30 und 60 Minuten sind jedoch
identisch, da dort die Proben noch nicht verdünnt wurden.
Wachstum mit Glucose
1,6
1,4
OD578
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
50
100
150
200
250
300
Zeit in min
Wachstumskurve unverdünnt
Wachtumskurve verdünnt
Abb. 1: Wachstumskurve mit Glucose (linear)
Die exponentielle Phase lässt sich besser aufzeigen, wenn die Darstellung der
Wachstumskurven halb-logarithmisch erfolgt (siehe Abb. 2). Jedoch zeigt sich auch
hier, dass die exponentielle Phase zwischen 30 und 120 Minuten liegt. Aus dem nun
theoretisch linearen Bereich können die Wachstumskonstante (µ) und die
Verdopplungszeit (td) berechnet werden. Auch hier zeigt sich, ähnlich wie bei der
linearen Auftragung, dass sich die Wachstumskurven unterscheiden.
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
Wachstum mit Glucose (halb-logarithmisch)
0,5
ln OD578
0
-0,5
0
50
100
150
200
250
300
-1
-1,5
-2
-2,5
Zeit in Minuten
Wachstumskurve unverdünnt (halb-logarithmisch)
Wachstumskurve verdünnt (halb-logarithmisch)
Exponentieller Bereich
Abb. 2: Wachstumskurve mit Glucose (halb-logarithmisch)
Berechnung der Wachstumskonstanten (µ) und der Verdopplungszeit (td) beim
Wachstum auf Glucose:
µ = (ln xt – ln x0) / (t – t0)
µ = (ln 0,995 – ln 0,257) / (90min) = 0,015min-1
td = ln 2 / µ = 0,693 / 0,015min-1 = 46,2min
3.2. Wachstum mit Acetat
Tab. 2: Ermittlung der optischen Dichte bei Wachstum mit Acetat
Blindwert (BW; nur Medium): OD (578nm) = 0,041
Minuten
OD578 (unverdünnt - BW)
0
60
120
180
240
0,261
0,358
0,47
0,658
0,841
0,243
0,171
0,207
2
5
5
0,486
0,855
1,035
OD578 (verdünnt - BW)
Verdünnungsfaktor
OD578 (Endwert)
0,261
0,358
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
Bei der Berechnung der OD-Endwerte sind nur die rot markierten Messwerte
eingegangen. Die unverdünnten Messwerte ab 120 Minuten können für die
Ermittlung der OD nicht berücksichtigt werden, da sich ab einer OD von 0,5 die
Bakterien gegenseitig beschatten und die Messwerte ungenau werden. Beim
Wachstum auf Acetat nimmt die Zellmasse bei jeder Messung zu. Die OD steigt
zwischen den Messungen bei 60 bis 180 Minuten an.
Die Auftragung der OD-Werte gegen die Zeit in Minuten zeigt, dass die Kurve keine
eindeutige lag-Phase aufweist (siehe Abb. 3). Wiederum unterscheiden sich die
Kurven bei den letzten 3 Messungen außerordentlich.
Wachstum mit Acetat
1,2
1
OD578
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
50
100
150
200
250
300
Zeit in Minuten
Wachstumskurve verdünnt
Wachstumskurve unverdünnt
Abb. 3: Wachstumskurve mit Acetat (linear)
Auch eine halb-logarithmische Auftragung zeigt keine eindeutige lag-Phase. Die
exponentielle Phase liegt zwischen 60 und 180 Minuten. Das Wachstum nimmt ab
180 Minuten wieder ab (stationäre Phase).
Anhand des – theoretisch - linearen Bereichs können die Wachstumskonstante (µ)
und die Verdopplungszeit (td) berechnet werden.
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
Wachstum mit Acetat (halb-logarithmisch)
0,5
ln OD578
0
-0,5 0
50
100
150
200
250
300
-1
-1,5
-2
Zeit in Minuten
Wachstumskurve unverdünnt (halb-logarithmisch)
Wachstumskurve verdünnt (halb-logarithmisch)
Exponentieller Bereich
Abb. 4: Wachstumskurve mit Acetat (halb-logarithmisch)
Berechnung der Wachstumskonstanten (µ) und der Verdopplungszeit beim
Wachstum mit Acetat:
µ = (ln xt – ln x0) / (t – t0)
µ = (ln 0,855 – ln 0,358) / (120min) = 0,00725 min-1
td = ln 2 / µ = 0,693 / 0,00725min-1 = 95,6 min
3.3. Bestimmung der Glucosekonzentration
Tab. 3: Wertetabelle der Glucose-Eichgerade
[µM Glucose]
0 (=BW)
100
200
300
400
500
E436 (1)
0,11
0,214
0,454
0,605
0,764
0,958
E436 (2)
0,111
0,21
0,455
0,611
0,788
0,947
Mittelwert (MW)
0,1105
0,212
0,4545
0,608
0,776
0,9525
0
0,101
0,344
0,4975
0,6655
0,842
MW - BW
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
y = 0,0017x
2
R = 0,9915
Glucose-Eichgerade
0,9
Extinktion bei 436nm
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
100
200
300
400
500
600
Glucosekonzentration in µM
Messwerte
Linear (Messwerte)
Abb. 5: Glucose-Eichgerade
Die Eichgerade der Glucosekonzentration wurde mit Glucosekonzentrationen von 0
bis 500µM aufgestellt. Die Eichgerade dient hier nicht zur Ermittlung der
Glucosekonzentration des Versuchsansatzes, sondern erstens zum Nachweis, dass
das
Testverfahren
funktioniert
und
zweitens
der
Ermittlung
des
Extinktionskoeffizienten von 2,2´-Azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonat (ABTS) über
das Lambert-Beersche-Gesetz.
Die dazu notwendigen Werte sind in Tabelle 4 angegeben.
Tab. 4: Wertetabelle zur Aufstellung der Eichgeraden und Ermittlung von ε von ABTSox
[µM Glucose]
0
100
200
300
400
500
E436 (1)
0,11
0,214
0,454
0,605
0,764
0,958
E436 (2)
0,111
0,21
0,455
0,611
0,788
0,947
Mittelwert (MW)
0,1105 0,212 0,4545 0,608
0,776
0,9525
0,344 0,4975 0,6655
0,842
MW - BW
Verdünnungsfaktor
Produkt aus (MW-BW)*VF
Extinktionskoeffizient von
ABTS in l / µmol x cm
0
0,101
21,2
MW
21,2
21,2
21,2
21,2
21,2
0 2,1412 7,2928 10,547 14,1086 17,8504
0
0,021
0,036
0,035
0,035
0,036 0,033
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
Beispielrechnung bei einer Konzentration von 200µM Glucose:
E = Extinktion
d = Schichtdicke der Küvette = 1 cm
c = Konzentration [µmol / l]
Lambert-Beersche-Gesetz: E = ε * d * c Æ ε = E / c * d
Verdünnungsfaktor = 1060/50 = 21,2
Unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors:
ε = (0,344 * 21,2) / (200µmol/l * 1cm) = 0,036 l/(µmol*cm) = 36 l/(mmol *cm)
Tab. 5: Wertetabelle mit E436nm-Messwerten und berechneter Glucosekonzentration in mM
unverdünnt
0,049
Ende der
Zucht
unverdünnt
E436 (1)
x
0,448
0,095
1,516
0,934
0,193 0,896
E436 (2)
MW
MW - BW
Glucosegehalt der
Probelösung (mit
Berücksichtigung
der Verdünnung)
[mM]
x
x
x
0,505
0,477
0,318
0,082
0,0885
-0,0705
1,589
1,553
1,394
0,884
0,909
0,750
0,125 0,891
0,159 0,894
0,000 0,735
x
2,161
0
9,486
10,211
0,000 0,500
Anfang der Zucht
Verdünnung
Unbekante Probe
1:10
1:20
BW
500µM
Die in Tabelle 5 errechneten Glucosekonzentrationen wurden nicht anhand der
Eichgeraden berechnet. Die Exktinktion des Glucosestandards wurde bei der
Messung bei436nm bestimmt und die restlichen Werte über den Dreisatz berechnet.
Es
fällt
auf,
dass
sich
die
Konzentrationen
der
unbekannten
Lösungen
unterscheiden, obwohl die verschiedenen Verdünnungsfaktoren eingerechnet
wurden.
Die Glucosekonzentration am Anfang des Versuchs ist zusätzlich ermittelt worden
(2,161mM). Sie unterscheidet sich von der Konzentration, die eigentlich eingesetzt
wurde (3mM).
Aus den in Tabelle 5 angegebenen und berechneten Werte kann außerdem die
Zellmasse berechnet werden, die von einem Mol Glucose und theoretisch von einem
Mol Acetat gebildet wird (YGlucose, YAcetat).
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
Man geht davon aus, dass bei einem OD-Wert von 1 300mg Trockengewicht pro
einem Liter Kulturvolumen vorhanden ist und kann somit das Trockengewicht des im
Versuch
vorhandenen
Kulturmediums
berechnen,
um
dann
anhand
des
Trockengewichts den molaren Ertragskoeffizienten (Y) zu berechnen.
Glucose:
300mg Trockenmasse / 1 Liter Kulturmedium bei einem OD-Wert von 1.
ODEnde – ODAnfang = ∆OD Æ 1,34 – 0,2 = 1,14
1 OD = 300mg/l
1,14 OD = x
Æ Trockenmasse = 300 * 1,14 = 342 mg / l
YGlucose = Trockenzelle in g / mol Glucose
YGlucose = 0,342 g / 0,002161 mol = 158,26 g / mol
Acetat:
300mg Trockenmasse / 1 Liter Kulturmedium bei einem OD-Wert von 1.
ODEnde – ODAnfang = ∆OD Æ 1,035 – 0,261 = 0,774
1 OD = 300mg/l
0,774 OD = x
Æ Trockenmasse = 300 * 0,774 = 232,2 mg / l
YAcetat = Trockenmasse in g / mol Acetat
YAcetat = 0, 2322/ 0,003 mol = 77,4 g/mol
4. Diskussion
Betrachtet man die OD-Werte, die daraus resultierenden Werte der
Wachstumskonstanten (µ) und der Verdopplungszeit (td), sowie den molaren
Ertragskoeffizienten (Y) von E.coli-Zellen, die mit Glucose bzw. Acetat als Substrat
gewachsen sind, so kommt man zu der Schlussfolgerung, dass Glucose für E.coli
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
das Substrat ist, das für das schnelle Wachstum günstiger zu sein scheint. Die
Verdopplungszeit beim Wachstum mit Glucose liegt bei 46,2 Minuten, während die
Verdopplungszeit bei Acetat bei 95,6 Minuten liegt und somit über doppelt so groß
ist. Daraus resultiert auch die größere Wachstumskonstante von 0,015min-1 der mit
Glucose gewachsenen Zellen gegenüber 0,0075min-1 der mit Acetat gewachsenen
Zellen.
Für die Berechnung der aus den Wachstumskurven resultierenden Werte wurden die
verdünnten Messwerte der OD-Messung benutzt, um den Fehler der gegenseitigen
Beschattung der Zellen ausschließen zu können.
Die Wachstumskurve der E. coli-Zellen, die mit Acetat gewachsen sind, weist im
Gegensatz zu der Wachstumskurve der E. coli-Zellen, die mit Glucose gewachsen
sind, eine eindeutigere Einteilung in die typischen Phasen des Bakteriumwachstums
einer statischen Kultur auf. Eine häufigere Messung wäre zumindest angemessen
gewesen, um die lag-Phase von der exponentiellen Phase bei den auf Acetat
wachsenden E. coli-Zellen unterscheiden zu können. Zusätzlich wäre eine längere
Betrachtung des Wachstums sinnvoll gewesen, um das Erreichen der stationären
Phase genauer dokumentieren zu können. Bei der Wachstumskurve mit Glucose fällt
ab 180min eine weitere Zunahme der Zellmasse auf, obwohl die Kultur eigentlich
schon in der stationären Phasen zu sein schien. Dieses doppelte Wachstum, dass
man auch als Diauxie bezeichnet, wird durch die Verwendung von zwei
unterschiedlichen Substraten bedingt. Zuerst wird die Glucose komplett
verstoffwechselt. Danach bilden die Zellen neue Enzyme um ein zweites Substrat
verwenden zu können. In vorliegenden Fall wurden wahrscheinlich Aminosäuren in
den Stoffwechsel einbezogen. Dadurch kommt das zweite Wachstum zustande.
Auch der molare Ertragskoeffizient der Glucose (158,26g/l) ist mehr als doppelt so
groß wie der molare Ertragskoeffizient des Acetats (77,4g/l).
Die Ergebnisse unterscheiden sich nicht von der theoretischen Annahme, dass
Acetat für E. coli das „schlechtere“ Substrat darstellt.
Bei der Verwertung von Acetat ist das Wachstum nicht durch die geringere Ausbeute
an ATP begrenzt, da das Substrat hier in Überschuss vorliegt. Grund für das
langsamere Wachstum sind die Auffüllreaktionen (anaplerotische Reaktionen) der
Gluconeogenese und des Glyoxylatzykluses.
Bei der Ermittlung der Glucosekonzentration der unbekannten Probe unterscheiden
sich die Konzentrationen der 1:10 und 1:20 Verdünnungen trotz Einberechnung der
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Versuch 5: Wachstum von E. coli mit Glucose oder Acetat
Verdünnungsfaktoren. Man kann davon ausgehen, dass die ermittelte Konzentration
der 1:20 Verdünnung genauer ist als die der 1:10 Verdünnung, da die gemessenen
Extinktionswerte näher im Bereich der Eichgerade liegen bzw. näher an der
gemessenen Extinktion der 500µM Standardglucoselösung.
Die ermittelte Anfangskonzentration der Glucoselösung von 2,161µM unterscheidet
sich von der theoretisch eingesetzten Konzentration von 3mM. Der Fehler kann
durch Pipettierfehler oder durch die Verwendung von Glaspipetten erklärt werden.
5. Literatur
Schlegel „Allgemeine Mikrobiologie“, 7. überarbeitete Auflage, Thieme Verlag, 1992
Skript „Übungen in Mikrobiologie F1-Teil2a“
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