Wertigkeit der interventionellen endosonographischen
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Ruhr-Universität Bochum PD Dr. med. S. Hollerbach Dienstort: Allg. Krankenhaus Celle Abteilung Innere Medizin Wertigkeit der interventionellen endosonographischen Feinnadelpunktion bei Erkrankungen des oberen Gastrointestinaltraktes und Mediastinums Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Inga Wilhelms aus Düsseldorf 2003 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: PD Dr. med. S. Hollerbach Korreferent: Tag der mündlichen Prüfung: Inhaltsverzeichnis 3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis....................................................................................................3 Abbildungsverzeichnis ............................................................................................5 Tabellenverzeichnis ................................................................................................6 Einleitung und Fragestellung...................................................................................7 Endosonographie ................................................................................................8 Indikationen für eine endosonographische Untersuchung +/Feinnadelpunktion.......................................................................................... 11 Kontraindikationen ......................................................................................... 12 Diagnostik von Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts und der umliegenden Organe ........................................................................................................... 13 Ösophaguskarzinome................................................................................. 13 Veränderungen der Magenwände .............................................................. 13 Mediastinum ............................................................................................... 14 Erkrankungen des Pankreas ...................................................................... 15 Gallenblase ................................................................................................ 17 Extrahepatische Gallengänge .................................................................... 18 Leber .......................................................................................................... 18 Retroperitoneale Raumforderungen ...........................................................19 Lymphknoten.............................................................................................. 19 Daten zur Durchflusszytometrie......................................................................... 21 Non-Hodgkin-Lymphome ............................................................................... 24 Non-Hodgkin-Lymphome der B-Zell-Reihe................................................. 28 Non-Hodgkin-Lymphome der T-Zell-Reihe................................................. 29 Instrumentenbeschreibung.................................................................................... 33 Das Endosonographiegerät ............................................................................... 33 Endosonographie am Patienten ........................................................................ 34 Das Durchflusszytometer................................................................................... 36 Vorbereitung der Proben für die Doppelfärbung mit konjugierten Antikörpern39 Patientengut und Zeitraum der Studie ............................................................... 40 Datenauswertung .................................................................................................. 42 Auswertung des entnommenen Gewebepunktionsmaterials ............................. 43 Inhaltsverzeichnis 4 Mediastinum................................................................................................... 45 Magen und Umgebung .................................................................................. 47 Duodenum und Umgebung ............................................................................ 49 Einzelauswertung der Punktate aus der Duodenumumgebung ohne Pankreas.............................................................................................. 51 Gesamtauswertung Lymphknoten ................................................................. 53 Auswertung der Patientenbefragung über die endosonographische Untersuchung .................................................................................................... 55 Komplikationen bei der endosonographischen Feinnadelpunktion ................ 57 Auswertung der FACS-Ergebnisse ................................................................ 57 Leichtkettenrestriktion................................................................................. 59 Zytokeratinbestimmung .............................................................................. 59 Diskussion............................................................................................................. 61 Allgemeine Ergebnisse ...................................................................................... 61 Spezielle Ergebnisse ......................................................................................... 66 Ösophagus und Mediastinum ........................................................................ 66 Magen, Retroperitoneum und Leber .............................................................. 68 Pankreas und Duodenum .............................................................................. 69 Lymphknoten ................................................................................................. 71 Akzeptanz und Komplikationen .........................................................................73 Neue und zukünftige Ausblicke ......................................................................... 75 Zusammenfassung................................................................................................ 81 Literaturverzeichnis ............................................................................................... 82 Danksagung .......................................................................................................... 92 Lebenslauf ............................................................................................................ 93 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 5 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Stufenplan zur Diagnostik von Non-Hodgkin-Lymphomen ..............32 Abbildung 2: Endosonographischer linearer Schallkopf........................................34 Abbildung 3: Schema zur Darstellung mittels endosonographischer Feinnadelpunktion erreichbarer mediastinaler Prozesse .................45 Abbildung 4: Endosonographische Darstellung einer Lymphknotenmetastase bei Ösophaguskarzinom mit links oben sichtbarer Feinnadel ..........46 Abbildung 5: Lymphknotenmetastase am Truncus coeliacus bei einem Magenkarzinom (T2 N1) ...................................................................48 Abbildung 6: kleines, lokal begrenztes Pankreaskarzinom am Korpus-KopfÜbergang in endosonographischer transduodenaler Darstellung.....50 Abbildung 7: Diffus ausgeprägte, chronische Pankreatitis bei endosonographischer transduodenaler Darstellung des PankreaskopfKorpus-Übergangs............................................................................50 Abbildung 8: Zyto-histologische Darstellung von maligne entarteten Zellen aus einem Pankreaskarzinom ..........................................................50 Abbildung 9: Transgastrale Darstellung eines Nebennierenadenoms ...................52 Abbildung 10: Transösophageale Darstellung einer Lymphknotenmetastase bei Bronchialkarzinom ............................................................................53 Abbildung 11: Schmerzen, allgemeines Unwohlsein und Angst der Patienten im Überblick .....................................................................................56 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 6 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: WHO–Klassifikation der Lymphome .....................................................25 Tabelle 2: Zusammenfassung der für die Diagnostik relevanten B-Zell-Antigene .29 Tabelle 3: Zusammenfassung der für die Diagnostik relevanten T-Zell-Antigene .31 Tabelle 4: Vierfeldertafel zur Berrechnung von Sensitivität, Spezifität, positivem und negativem Vorhersagewert und Treffsicherheit .............................42 Tabelle 5: Übersicht der für die Studie entnommenen Punktate ...........................44 Tabelle 6: Aus dem Bereich des Mediastinums entnommene Punktate ...............45 Tabelle 7: Aus dem Bereich des Magens und seiner Umgebung entnommene Punktate................................................................................................48 Tabelle 8: Aus dem Bereich des Duodenums und seiner Umgebung entnommene Punktate................................................................................................50 Tabelle 9: Punktate der Duodenumumgebung ohne Pankreaspunktate ..............52 Tabelle 10: Gesamtübersicht der Lymphknotenpunktate ......................................53 Tabelle 11a-c: Auswertung der visuellen Analogskalen der Patienten bezüglich Schmerz, allgemeinem Unwohlsein und Angst ....................................55 Tabelle 12: Leichtkettenrestriktion in den durchflusszytometrisch untersuchten Präparaten ............................................................................................59 Tabelle 13: Zytokeratinhaltige Befunde in den durchflusszytometrisch untersuchten Präparaten ......................................................................60 Einleitung und Fragestellung 7 Einleitung und Fragestellung Die Endosonographie wurde erstmals 1980 vorgestellt [57]. Seitdem hat sie eine wichtige Stellung in der Diagnostik und als Hilfe bei klinischen Entscheidungen gewonnen, vor allem bei Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes und seiner umliegenden Organe wie Mediastinum, Leber, Gallenwege, Pankreas und umliegende Lymphknoten. Immer neue Indikationen [38-53] kommen zu den bisher etablierten [1-35] hinzu. Manche Einsatzgebiete sind noch im Stadium der experimentellen Studien und bislang nicht im klinischen Alltag einsetzbar. Das Interesse an der Endosonographie ist in den letzten Jahren ständig gewachsen, wie man anhand der steigenden Zahl von Publikationen leicht sehen kann. Vor allem ist die Endosonographie nicht länger allein ein diagnostisches bildgebendes Verfahren. Die Möglichkeit zur Entnahme von Gewebeproben und deren zytologische sowie histologische Untersuchung bietet die Chance, noch sicherer zwischen vielen Erkrankungen zu unterscheiden. Dies betrifft vor allem die Diagnostik von malignen Erkrankungen. Zudem hat die Endosonographie inzwischen auch ersten therapeutischen Nutzen erlangt und die Technik entwickelt sich ständig weiter. Um die Diagnose-Genauigkeit noch weiter zu verbessern werden genauere und höher spezialisierte Instrumente auf den Markt gebracht, die bald auch in der Klinik ihren Platz finden werden. In unserer prospektiven Studie ging es darum, Aussagekraft und klinischen Nutzen der endosonographischen Untersuchung und Feinnadel-Punktion unter Routine-Bedingungen zu prüfen, um so eine Bewertung der Endosonographie mit Punktion unter nicht experimentell geschaffenen Bedingungen vornehmen zu können. Ziele der Studie waren: a) Prospektive, longitudinale Erfassung Endosonographie-Untersuchungen mit aller Punktion interventionellen im oberen Gastrointestinaltrakt und im Mediastinum, b) die Erfassung der Treffsicherheit, Korrektheit, Sensitivität und Spezifität der Methode bei der Abklärung von benignen und malignen Befunden, Einleitung und Fragestellung c) 8 die Erfassung der Wertigkeit von FACS-Analysen zusätzlich zur Zytologie mit Untersuchung auf das Vorliegen einer Leichtketten-Restriktion oder Zytokeratin-positiver Zellen aus verdächtigen Läsionen. Dabei sollten alle Patienten, die aus diagnostischen Gründen eine endosonographische Untersuchung mit Feinnadelpunktion von Läsionen im Bereich von Ösophagus, posteriorem Mediastinum, Magen, Duodenum, Pankreas, hepatobiliärer Region und umliegenden Lymphknoten erhielten, eingeschlossen werden. Als Referenzuntersuchungen zur Erfassung der Korrektheit der gewonnenen Ergebnisse diente, - wo möglich -, als „Goldstandard“ die Operation mit Histologie, in allen anderen Fällen die Kombination aus folgenden Untersuchungsverfahren: abdomineller Ultraschall, ERCP mit Bürstenabstrich, Bronchoskopie mit Biopsie und Bürstenabstrich, Computertomographie von Abdomen und Thorax mit Kontrastmittel (in Spiraltechnik), Kernspintomographie (falls durchgeführt), SRSRezeptor-Szintigraphie (falls indiziert), Angiographie Laboruntersuchungen (wie Tumormarker), (falls klinischer indiziert), Verlauf und Abschlussdiagnose (aus dem abschließenden ärztlichen Bericht). Endosonographie Die Endosonographie kombiniert die beiden Modalitäten der endoskopischen Sicht und dem hochfrequenten Ultraschall miteinander. Durch diese Kombination ist es möglich geworden , die Wände des Gastrointestinaltraktes sowie seine Umgebung genauer zu beurteilen und gleichzeitig Gewebeproben aus pathologisch verändert erscheinenden Arealen mittels Feinnadel zu gewinnen [58]. Diese Neuerung ermöglicht die endoskopische Abgrenzung der Mukosaoberfläche und die sonographische Beurteilung der übrigen Wandschichten und deren Umgebung innerhalb eines Untersuchungsganges [58]. Durch den geringen Abstand des Transducers zu den zu untersuchenden Strukturen ist es möglich, Ultraschall mit hohen Frequenzen einzusetzen. Diese Einleitung und Fragestellung 9 liegen bei den heutigen Geräten zwischen 5 und 29 MHz mit einer axialen Auflösung von 0.2 mm. Bisher war nur der Einsatz niedriger Frequenzen möglich gewesen, da mit Erhöhung der Frequenzen gleichzeitig die Penetrationskraft der Wellen nachlässt und somit die Barriere der Haut nicht überwunden werden konnte. Durch das endoskopische Einbringen des Ultraschallkopfes ins Innere des Körpers ist die Hautbarriere kein Hindernis mehr. Der Einsatz höherer Frequenzen verbessert gleichzeitig die lokale Gewebestrukturauflösung, so dass es heute möglich ist, zwei in der gleichen Schallrichtung liegende Punkte zu unterscheiden. Dies nennt man die axiale Auflösung. Der Vorteil gegenüber anderen bildgebenden Verfahren liegt vor allem in der Genauigkeit der Darstellung der einzelnen Schichten des Gastrointestinaltrakts. Diese neue Technik erlaubt somit ein regionäres Staging von Malignomen des Gastrointestinaltraktes, Ursprungsbestimmung von Veränderungen der Submukosa und die genaue Differenzierung anderer gastrointestinaler Wandveränderungen. Eine sichere, rein endosonographische Unterscheidung zwischen benignen und malignen Veränderungen ohne Entnahme von Proben ist jedoch nicht möglich. Deshalb beruht die Malignomdiagnose vor allem auf der histologischen und zytologischen Beurteilung der Feinnadelbiopsien. Zur Zeit gibt es zwei Basistypen von Ultraschallendoskopen: ein radiales Schallkopfbildsystem und ein gebogenes lineares Schallkopfbildsystem. Das radiale System arbeitet mit 7,5 und 12 MHz. Das lineare Instrument benutzt 5 und 7,5 MHz und besitzt zusätzlich einen Farbdoppler. Die kurvenförmige Anordnung macht auch eine direkte Feinnadelbiopsie oder Feinnadelinjektion möglich, ein wichtiger Punkt bei der Diagnosefindung vieler Erkrankungen. Weitere Systeme sind hochfrequente (12-20 MHz) Ultraschall-Minisonden in Katheter-Form. Höhere Frequenzen erhöhen die Auflösung, allerdings zum Preis einer geringeren Eindringtiefe. Diese Katheter liefern radiale Bilder, ähnlich denen der Echoendoskope, werden aber durch einen zusätzlichen Kanal während der konventionellen Endoskopie eingeführt. Diese Technik ist vor allem nützlich, um Bilder aus dem Lumen des Pankreasganges und der Gallengänge abzubilden und um gastrointestinale Stenosen zu überwinden, die den Durchtritt normaler Einleitung und Fragestellung 10 Endoskope unmöglich machen. Außerdem ermöglichen sie eine verbesserte lokale Staging-Diagnostik von Früh-Karzinomen (Tis, T1). Die Endosonographie wird daher meist als weiterführende Untersuchungsmethode bei Patienten eingesetzt, bei denen zuvor Veränderungen des Gastrointestinaltraktes oder der umliegenden Organe bereits durch andere Verfahren festgestellt wurden. Die Möglichkeit der Feinnadelpunktion hat aber die diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten zusätzlich deutlich erweitert. Inzwischen haben verschiedene Studien gezeigt, dass die Endosonographie der Computertomographie beim Tumor- und Lymphknotenstaging von luminalen und pankreatikobiliären Malignomen überlegen ist. Allerdings besteht durch die geringe Eindringtiefe ein eingeschränktes Sichtfeld, so dass die Darstellung von Fernmetastasen nur in seltenen Fällen möglich ist. Die gewonnenen Staginginformationen können wichtige Informationen bei der Entscheidung zwischen operativer und nicht-operativer Behandlung, dem Management einer präoperativen neoadjuvanten Chemotherapie und der Auswahl zwischen weiträumiger Resektion, lokaler Exzision oder endoskopischer Behandlung liefern [3]. Die Gewinnung von Gewebeproben (EUS-FNP) aus Lymphknoten und anderen extraluminalen Läsionen ermöglicht eine zyto-histologische Diagnose und erhöht die therapeutische Entscheidungsfähigkeit bei niedriger Komplikationsrate [1],[59],[60]. Obwohl die Möglichkeit der Streuung von Tumorzellen entlang des Stichkanals beim Zurückziehen der Nadel diskutiert wurde, scheint in dieser Hinsicht kein Grund zur Besorgnis zu bestehen. Das theoretisch geringe Risiko ist bei der endosonographischen Feinnadelpunktion bisher nicht dokumentiert worden. Insgesamt liegt die Komplikationsrate der Feinnadelpunktion unter 1%. Die Kompetenzerlangung bei der endosonographischen Untersuchung erfordert aber viel Übung unter Anleitung eines Experten. Die noch geringe Zahl geeigneter Lehrzentren und der Zeitaufwand für das Erlernen bremsten bisher die Verbreitung der endosonographischen Untersuchungsmethoden. Es wird angenommen, dass zum Erlernen der luminalen Endosonographie 3-6 Monate benötigt werden und zur Kompetenzerlangung bei der pankreatikobiliärer Einleitung und Fragestellung 11 Untersuchung und Feinnadelbiopsie sogar bis zu einem Jahr intensives Training nötig ist. So sollte die endosonographische Feinnadelpunktion im Gegensatz zur CT- und anderen apparativen Untersuchungsmethoden in Kompetenz-Zentren praktiziert werden. Zur Zeit wird die Endosonographie als die größte technische Herausforderung der Endoskopie angesehen. Auch die Bilder sind schwieriger zu interpretieren als endoskopische Standardbilder [2]. Indikationen für eine endosonographische Untersuchung +/Feinnadelpunktion 1) Ösophagus a) Prätherapeutisches Tumorstaging (Ösophagus-, Mediastinal- und Bronchial-Karzinome): T-, N1-3, M1-Stadium b) Charakterisierung von Tumoren der Submukosa c) Artdiagnostik mediastinaler Tumore und Lymphknoten. 2) Magen a) Prätherapeutisches Tumorstaging (Magenkarzinome, Lymphome, mesenchymale Tumore): T-, N1-3, M1-Stadium b) Charakterisierung von Tumoren der Submukosa c) Artdiagnostik perigastrischer und retroperitonealer Lymphknoten und Tumoren d) Lymphom-Staging (NHL) + Artdiagnose e) Bewertung suspekter großer Magenfalten (M. Ménétiere) f) Postoperative Malignomrezidivüberwachung (m.E.) 3) Pankreas und Gallenwege a) Prätherapeutisches Tumorstaging (Pankreas– und Papillenmalignome): T-, N1-3, M-Stadium b) Verdacht auf chronische Pankreatitis c) Differentialdiagnose zystischer Veränderungen des Pankreas und Retroperitoneums d) Lokalisation + Artdiagnose neuroendokriner Tumoren Einleitung und Fragestellung e) Verdacht auf Choledocholithiasis f) Artdiagnose retroperitonealer Lymphknoten und Tumoren (GisT) g) Pankreasbiopsie bei Verdacht auf maligne Veränderungen 4) Kolon und Rektum a) Prätherapeutisches Tumorstaging b) Charakterisierung von Tumoren der Submukosa c) Lymphknotenbiopsien d) Bewertung pelviner und perianaler Erkrankungen 5) Nicht-gastrointestinale-Erkrankungen a) Bronchial-Karzinom-Staging b) Lymphadenopathien unklarer Genese c) Bewertung mediastinaler Tumoren 6) Therapeutische Endosonographie a) Plexus-zöliakus-Neurolyse b) Drainage von Pankreas-Pseudo-Zysten c) Endosonographische Feinnadel-Injektions-Therapie (EUS-FNI) Kontraindikationen 1) Absolute Kontraindikationen: a) Bekannte oder vermutete Perforation b) Akute Divertikulitis c) Fulminante Kolitis d) Patient nicht kooperativ/ fehlende Einwilligung 2) Relative Kontraindikationen: a) Hochgradige Ösophagusstenose b) Unsichere kardiale oder pulmonale Situation c) Unerfahrener Untersucher 12 Einleitung und Fragestellung 13 Diagnostik von Erkrankungen des Gastrointestinaltrakts und der umliegenden Organe Ösophaguskarzinome Die Endosonographie darf heute als die treffsicherste bildgebende Technik beim lokalen Staging von Ösophaguskarzinomen angesehen werden. In mehreren prospektiven Studien wurde die Überlegenheit der Endosonographie gegenüber der Computertomographie bezüglich des Stagings von Ösophaguskarzinomen herausgestellt. Die dabei beschriebene Sensitivität des T-Stagings liegt zwischen 85-95%, die des N-Stagings zwischen 70-80% . Die Sensitivität des CT-Scannings beträgt insgesamt ca. 50% sowohl für das T- wie auch für das N-Stadium [4], [5]. Wie mehrere Studien zeigen, besteht eine hohe Korrelation zwischen TNMStaging und mittlerer Überlebenszeit [6]. Allerdings können höhergradige Stenosen, wie sie bei ca. 25% der Patienten gefunden werden, die nötige Ausweitung der Untersuchung bis in den Magen verhindern. Insbesondere für das Auffinden und die Artdiagnose von M1A-Lymphknoten-Metastasen (am Truncus coeliacus und der kleinen Kurvatur) ist die Endosonographie mit Feinnadelbiopsie sehr nützlich, da hierbei in vielen Fällen eine neo-adjuvante Therapieoption diskutiert werden sollte. Veränderungen der Magenwände Indikationen für die Endosonographie des Magens beinhalten vorwiegend das lokale Staging von Magen-Karzinomen, die Beurteilung der Wirksamkeit einer Chemotherapie bei inoperablen Karzinomen oder malignen Lymphomen, die Artdiagnostik submuköser Tumoren des Magens, die Überwachung der Abheilung gastrischer Ulcera und die Diagnostik des M. Ménétriere. Ähnlich wie bei Ösophaguskarzinomen besteht auch bei Malignomen des Magens eine relativ hohe Sensitivität beim präoperativen Staging, welches aufgrund der neuen stadienadaptierten Behandlungsmethoden möglicherweise immer wichtiger Einleitung und Fragestellung 14 wird. Mehrere Studien haben die Überlegenheit der Endosonographie gegenüber der Computertomographie mit einer Sensitivität von 80-92% beim T-Staging und 77-90% beim N-Staging dokumentiert, womit für das N-Staging sogar bessere Werte als bei der chirurgischen Intervention erreicht werden [7], [8]. Bedingt durch eine verminderte Darstellbarkeit der Trennlinie zwischen Subserosa und Serosa, durch welche T2- schlecht von T3-Tumoren unterschieden werden können, erreicht die Endosonographie des Magens jedoch nicht ganz die Genauigkeit wie im Ösophagus. Eine weitere Einsatzmöglichkeit ist die Erkennung und Therapieüberwachung von gastrointestinalen MALT-Lymphomen [9]. Bei Patienten mit einer Helicobacterpylori-Infektion und Gastritis können mit Hilfe der Endosonographie diffuse Verdickungen der inneren drei Schichten der Magenwand ohne Verdickungen der vierten und fünften Schicht festgestellt werden. Nach antibiotischer Therapie und Verschwinden der Gastritis verschwinden gleichzeitig die Verdickungen und es kann eine Normalisierung der ersten drei Schichten demonstriert werden. Diese Normalisierung ist mit Hilfe der Endosonographie überwachbar. Bei submukosalen Tumoren der Wände des Gastrointestinaltraktes gelingt es mit der Endosonographie häufig, zwischen soliden intramuralen Tumoren und extramuraler Kompression durch solide, zystische oder vaskuläre Gebilde zu unterscheiden, während deren Diagnose durch andere Verfahren oft schwierig ist. Dennoch ist es auch mit Hilfe der Endosonographie und der mit ihr verbundenen Feinnadelbiopsie nicht immer möglich, die richtige Tumorzuordnung zu treffen, auch wenn sich die Treffsicherheit der Methode stark verbessert hat [10]. Mediastinum Eine relativ neue Form der Nutzung der Endosonographie liegt in der präoperativen Beurteilung Diagnosestellung bisher von Bronchialkarzinomen, vorwiegend durch eine deren Staging nach computertomographische Untersuchung und Mediastinoskopie des Thorax erfolgte. Inzwischen ist es Einleitung und Fragestellung 15 möglich geworden, Gewebe aus vergrößerten Lymphknoten im hinteren Mediastinum und subcarinalen Bereich mit Hilfe der endosonographisch gesteuerten Feinnadel zu aspirieren und dann zytologisch und histologisch auf Malignität zu überprüfen. Dabei kann eine positive Zytologie einen großen Einfluss auf die Behandlung von Patienten, vor allem mit kleinzelligen Karzinomen, haben. Initiale Studien über endosonographisch gesteuerte Feinnadelpunktionen zu diesem Zwecke zeigen eine Genauigkeit von mehr als 90% [11]. In diesem Zusammenhang spielt auch das Staging mediastinaler Lymphknoten eine große Rolle, da durch die genaue Kenntnis der bereits befallenen Lymphknoten eine Entscheidung über therapeutische Maßnahmen getroffen werden kann. An diesem Punkt ist die Endosonographie anderen Methoden, wie Mediastinoskopie, Mediastinotomie und Thorakoskopie insofern überlegen, als dass sie weit weniger invasiv und somit für den Patienten weniger belastend und auch weniger kostspielig ist. Zudem kann auch Material aus Lymphknoten des hinteren Mediastinums gewonnen werden, welche mit anderen Verfahren nicht erreicht werden können [12]. Allerdings kann das vordere Mediastinum nicht gut dargestellt werden. Somit könnte die Endosonographie in der Lage sein, traditionelle Methoden der Gewebegewinnung aus mediastinalen Lymphknoten zu verbessern oder teilweise zu ersetzen [13]. Eine der Einschränkungen der Endosonographie im Mediastinum ist die Bewertung von isolierten prätrachealen Lymphknoten, da es nicht möglich ist, sie durch die dazwischenliegende Trachea richtig zu erkennen. Erkrankungen des Pankreas Pankreaskarzinome Da die Prognose von Pankreaskarzinomen sehr schlecht ist, ist es dringend wünschenswert, sensitive Früherkennungsmaßnahmen zu etablieren, die aber noch nicht existieren. Die höchste lokale Auflösung von Parenchym- Veränderungen erreicht aber die Endosonographie. Das Pankreas ist durch seine Lage in unmittelbarer Nähe zu Magen und Duodenum der Endosonographie gut Einleitung und Fragestellung 16 zugänglich. Kopf, Körper und Schwanz sind im Detail gut beurteilbar, so wie auch der Pankreasgang, dessen Durchmesser während der Untersuchung ausgemessen werden kann. So können mit Hilfe der Endosonographie auch kleine Veränderungen weiter abgeklärt werden, die zuvor durch CT oder MRT aufgedeckt wurden, oder durch diese Untersuchungsverfahren nicht detektierbar waren (=bis zu 30% !). Daher wird die Endosonographie vorwiegend zum Auffinden auch sehr kleiner vorvermuteter Zysten, Adenokarzinome und Inselzelltumoren eingesetzt. Dabei können Veränderungen bis zu einer Größe von 4-5 mm diagnostiziert werden [14]. Ein genaues Karzinom-Staging ist wichtig, um sinnvoll stadienadaptiert zwischen den verschiedenen Therapiemöglichkeiten (operativer Behandlung oder palliativen Maßnahmen) entscheiden zu können, wobei die Sensitivität der Endosonographie für das T- und N-Staging über 90% liegt und somit anderen Methoden klar überlegen ist [15], [16], [17]. Auch die Tumorinfiltration in Gefäße ist besser darstellbar und ein TNM-Staging ist möglich [18]. In der Klinik kommt die Feinnadelpunktion beim Staging der Pankreaskarzinome, der Auswahl der Patienten für eine kurative Therapiezielsetzung und zur präoperativen Identifizierung von Patienten mit Lymphknotenbefall zum Einsatz. Von den Karzinomen lassen sich neuroendokrine Tumoren und zystische Veränderungen des Pankreas abgrenzen. Die Unterscheidung ist häufig schon allein durch das sonographische Erscheinungsbild möglich. Zur Diagnosesicherung kann dann in begründeten Fällen die Entnahme von Gewebe mittels Feinnadel eingesetzt werden [19], [20], [21]. Chronische Pankreatitis Auch für die Diagnose der chronischen Pankreatitis hat sich die Endosonographie als nützlich erwiesen. So zeigen sich bei der Ultraschalluntersuchung des Pankreas fokale oder diffuse Veränderungen des Pankreas-Parenchyms wie zum Beispiel echogene Foci, prominente interlobuläre Septen, kleine zystische Höhlenbildungen, läppchenartige extraglanduläre Ränder und ein heterogenes Einleitung und Fragestellung 17 Parenchym. Die Untersuchung des pankreatischen Gangsystems ergibt Befunde wie zum Beispiel Dilatation, Irregularitäten, echogene Wände, Seitenastektasien und echogene Foci [22], [23]. Derzeit gelingt die Darstellung früher ParenchymVeränderungen einer chronischen Pankreatitis mit Hilfe der Endosonographie und Feinnadelbiopsie bereits sehr genau. Ihre Sensitivität (97%) ist vergleichbar mit der endoskopisch-retrograden Cholangiopankreatikographie (ERCP), welche bisher als Goldstandard gegolten hat. Allerdings liegt die Spezifität nur bei 67% so dass noch weitere Verbesserungen bei der Probenentnahme und Analyse erreicht werden müssen [61]. Bei fortgeschrittener chronischer Pankreatitis kann es schwierig sein, zwischen inflammatorischen und neoplastischen Prozessen zu entscheiden. Ob sehr frühe pankreatische Strukturveränderungen mit Hilfe der Endosonographie auch in solchen Fällen sicher aufgedeckt werden können, in denen andere Tests und bildgebende Verfahren regelrechte Befunde liefern, bleibt noch unbeantwortet. Dennoch wurde die Endosonographie bereits erfolgreich zur Aufdeckung von leichtgradigen Parenchym-Veränderungen eingesetzt, die bis dahin durch andere Verfahren nicht aufgeklärte Schmerzsyndrome verursacht hatten [22], [23]. Gallenblase Die Endosonographie Gallenblasenveränderungen wird nach als Untersuchung dem abdominellen von unklaren Routine-Ultraschall empfohlen. Durch diese Untersuchung können vor allem Mikro-Steine und kleine polypoide Veränderungen diagnostiziert sowie abnorme Gangverläufe des Pankreasgangs in Papillennähe, wie zum Beispiel beim Pankreas divisum, erkannt werden. Auch beim Staging von Gallenblasenkarzinomen spielt die endosonographische Untersuchung eine Rolle [24]. Gestielte Tumoren können in beinahe 100% der Fälle durch eine endosonographische Untersuchung richtig diagnostiziert werden, breitbasig oder eben wachsende Tumoren jedoch nur in 70-85% [25]. Die Unterscheidung zwischen den verschiedenen Karzinomen und das lokale Staging sind wichtig zur Planung der späteren chirurgischen Intervention. Einleitung und Fragestellung 18 Extrahepatische Gallengänge Bei den Erkrankungen der extrahepatischen Gallengänge wird die Endosonographie vor allem zur ergänzenden Diagnostik der Choledocholithiasis und zur Aufdeckung und zum Staging von Gallengangskarzinomen eingesetzt. In einigen prospektiven Studien ist die Endosonographie als das am sensitivsten zur Erkennung einer Choledocholithiasis geeignete Instrument beschrieben worden [26], [27]. In den bisher erschienenen Studien zeigt die Endosonographie eine Sensitivität von über 95% für die Diagnose der Choledocholithiasis. Damit sind die Ergebnisse mit denen der ERCP vergleichbar und denen der anderen bildgebenden Verfahren deutlich überlegen. Außerdem sind sie zusätzlich mit fehlendem Risiko für postinterventionelle Pankreatitis belastet. Allerdings besitzt die Endosonographie bisher nicht die therapeutischen Möglichkeiten der ERCP und eignet sich somit nicht zur Steinentfernung. Zusätzlich sind die Feinnadelpunktion und die Möglichkeit der Gefäßdarstellung mittels Doppler für die Beurteilung extrahepatischer Gallengangskarzinome von großem klinischen Nutzen. Leber Die endosonographische Untersuchung der Leber wird bisher nicht routinemässig durchgeführt, da in den meisten Fällen auch mit Hilfe des abdominellen Ultraschalls oder dem Spiral-CT eine gute Übersicht geschaffen werden kann und die Entnahme von Gewebeproben bisher zumeist durch transkutanes Einführen der Nadel erfolgte [28]. Die Leber ist durch die Endosonographie nur zu ca. 2/3 darstellbar, da sich vor allem der rechte Leberlappen außerhalb der Reichweite des hochfrequenten Ultraschalls befindet. In mehreren Studien wurden inzwischen endosonographische Feinnadelpunktionen zur Untersuchung fokaler Leberveränderungen eingesetzt, wobei Läsionen bis zu einer Größe von <1 cm Durchmesser biopsiert wurden. Dabei handelte es sich vor allem um die Erkennung von primären Leberkarzinomen und Metastasen aus Neoplasien anderer Organe. Auch gutartige Tumoren wie Hämangiome, fokale noduläre Einleitung und Fragestellung 19 Hyperplasie und Zysten konnten bereits diagnostiziert werden. Dabei wurde eine Sensitivität von 94% und eine Spezifität von 100% erreicht [56]. Durch die Erkennung von Metastasen aus Primärtumoren in Kolorektum, Lunge, Pankreas und Mammae scheint auch ein begrenztes endosonographisches M-Staging möglich geworden zu sein [55]. Zudem ist die endosonographische Feinnadelpunktion eine verträgliche und sichere Methode zur Probenentnahme vor allem bei Patienten mit erhöhtem Blutungsrisiko, z.B. bei Leberzirrhose, Koagulopathie, Aszites oder Aspirineinnahme [56]. Retroperitoneale Raumforderungen Retroperitoneale Tumoren wie zum Beispiel Sarkome, Lymphknoten-NHLs und Neoplasien von Nieren und Nebennieren sind verglichen mit dem Befall anderer Organe eher selten. Differentialdiagnosen Dennoch ist unterscheiden es zu wichtig, sicher können. zwischen Dabei ihren kann die endosonographische Feinnadelpunktion erfolgreich zur Unterscheidung zwischen Primärtumoren, Metastasen und nicht-malignen Veränderungen beitragen [29]. Lymphknoten Die Erkennung von Lymphknoten, die durch Metastasen eines Tumors befallen sind, ist ein kritischer Punkt beim Staging von Tumoren. Endosonographische Merkmale für verdächtige Lymphknoten sind: Größe mehr als ein Zentimeter, schallgeminderte Echostruktur, runde Form, scharfe Begrenzung zur Umgebung, wobei mehrere dieser Merkmale gleichzeitig vorhanden sein müssen. Die Feinnadelpunktion bietet die Möglichkeit, Benignität und Malignität zu unterscheiden [18]. Die Entnahme von Lymphknotenmaterial mit der Feinnadel hat eine besonders große klinische Bedeutung gewonnen, da sie das Lymphknotenstaging einer Vielzahl von Neoplasmen, wie zum Beispiel maligner Tumoren des Ösophagus, des Magens, des Pankreas, der Ampulle und der Lunge sowie mediastinaler Einleitung und Fragestellung 20 Lymphadenopathie unbekannter Ursache ermöglicht hat. Dabei wird in Studien von einer Sensitivität bis zu 96% bei der Unterscheidung von benignen und malignen mediastinalen Lymphknoten berichtet [30]. Somit wird wohl auch in Zukunft der Endosonographie und der Feinnadelbiopsie suspekter Lymphknoten eine wichtige Rolle bei der Beurteilung ihrer Malignität zukommen [31]. Bei der Suche nach einer weiteren Verbesserung der Genauigkeit der Beurteilung suspekter Lymphknoten bei schwer zu diagnostizierenden Prozessen wie Sarkoidose, Non-Hodgkin-Lymphomen etc. stellt sich vor allem die Frage nach dem Nutzen einer zusätzlichen Untersuchung des Punktats mittels FACS-Analyse. Die Durchflusszytometrie bietet eine spezielle Methode zur Untersuchung und Isolierung der Lymphozytensubpopulationen durch die Bestimmung ihrer immunophänotypischen Charakteristika. FACS-Phänotypisierung von ImmunglobulinLeichtketten-Restriktion oder der Nachweis einer abnormen LymphozytenAntigen-Expression sind eine hilfreiche Technik in der zytologischen Diagnose von Lymphomen, in der Mehrzahl B-Zell-Lymphome. Ein weiterer Vorteil dieser Methode liegt in der schnellen und quantitativen Zellanalyse und der Möglichkeit der Zellisolation und Untersuchung von Subpopulationen, unterscheidbar auf der Basis von Größe, Ploidie und immunphänotypischen Merkmalen. Die Durchflusszytometrie ergänzt das traditionelle morphologische Vorgehen der Standard-Zytologie. B-Zell-Tumoren, die die Mehrzahl der Non-Hodgkin- Lymphome bilden, werden durch die Herausstellung der Leichtkettenrestriktion oder abnormer Lymphome Lymphozyten-Antigenexpressionsmuster können durch eine Aberration der erkannt. T-Zell- T-Zell-Antigenexpression diagnostiziert werden. In einer Studie von Ribeiro et al. wurde beim gleichzeitigen Einsatz von Zytologie und FACS eine Sensitivität von 74%, eine Spezifität von 93% und eine Genauigkeit von 81% in der Diagnostik und dem Staging von Lymphomen erreicht [32]. Eine weitere Studie von Wiersema et al. zeigte, dass es mit Hilfe der Durchflusszytometrie möglich ist, Lymphknotenbeteiligung zu bestätigen, die durch endosonographische Befunde und Zytologie nicht diagnostiziert werden konnten. Die Kombination von Endosonographie mit Feinnadelpunktion und FACS Einleitung und Fragestellung 21 scheint eine Verbesserung des Stagings von Non-Hodgkin-Lymphomen des Magens zu ermöglichen [33]. Im Gegensatz zu B-Zell-NHL-Lymphomen entbehren Hodgkin-Lymphome einer nachweisbaren Monoklonalität. Allerdings können Sternberg-Reed-Zellen, wenn sie im entnommenen Lymphknotengewebe vorhanden sind, zur Diagnosefindung beitragen. Bei der Diagnostik perigastrischer Lymphknoten kann es schwierig sein, reaktiv und metastatisch vergrößerte Lymphknoten zu unterscheiden. Zudem kann auch die zytologische Interpretation von Gewebebiopsiematerial aus perigastrischen Lymphknoten bei Patienten mit bekanntem gastrischen NHL problematisch sein. Zum einen bestehen Schwierigkeiten bei der Unterscheidung zwischen reaktiver und metastatischer Vermehrung einer Population von Lymphozyten im untersuchten Lymphknoten, zum anderen können großzellige Non-HodgkinLymphome morphologisch zwar diagnostiziert werden, aber zytologische Kriterien erlauben keine sichere Diagnose von Lymphknoteneinbeziehung durch kleinzellige und einige gemischt klein- und großzellige Lymphome. Bei Patienten mit diesen Typen von NHL’s könnte die Durchflusszytometrie eine monotypische Expression im Aspirationsmaterial darstellen, und somit einen malignen Lymphknotentumor beweisen. Daten zur Durchflusszytometrie Im Jahr 1956 beschrieb Wallace H. Coulter das erste Gerät, das das elektronische Zählen und die Größenmessung von in Flüssigkeit suspensierten Zellen ermöglichte. Allerdings konnte zu dieser Zeit nur ein Parameter, nämlich der der Zellgröße, bestimmt werden. Im Jahr 1965 beschrieben dann Kamentsky, Melamed und Derman das erste mit zwei Parametern (Zellgröße und Kern-DNAGehalt-Bestimmung) arbeitende Gerät. Einleitung und Fragestellung 22 Mit den heutigen kleinen und kompakten Durchflusszytometern ist eine simultane Akquisitation von bis zu 11 unterschiedlichen Parametern bei jeder einzelnen Zelle möglich. Hierbei handelt es sich um die Bestimmung von: 1) Oberflächenantigenen zur Immunphänotypisierung, Leukämie- und Lymphomdiagnostik, Transplantatüberwachung, Zellaktivierung und zum HLA-B27-Screening 2) Intrazellulären Parametern zur Bestimmung von zellulärem DNA/RNAGehalt, Zellproliferation, Chromosomenanalyse, Retikulozytenzählung, Proteingehalt und PH-Wert 3) Funktionellen Parametern wie Phagozytose von Bakterien und Hefen und Enzymaktivitäten 4) Zellmembranständigen Parametern wie Medikamentenaufnahme und Kalziumeinstrom Dabei können jedoch nicht alle diese Parameter mit Routinezytometern gemessen werden, da nicht alle erforderlichen Farbstoffe mit Laserlicht von 488 nm anregbar sind. Zwei dieser Parameter beruhen auch bei den modernen Systemen noch auf rein physikalischen Gegebenheiten der Zellen: die Größe der Zellen und ihre innere Struktur. Zur Bestimmung Fluoreszenzfarbstoffen der anderen gekoppelte Zellparameter Antikörper gegen werden mit spezifische Oberflächenantigene der zu bestimmenden Zellpopulation eingesetzt, wie zum Beispiel Antikörper gegen die CD-Moleküle der Blutzellen oder MHC-Klasse I oder –Klasse II Moleküle. Diese Fluoreszenzfarbstoffe müssen durch die im Durchflusszytometer vorhandene Lichtquelle anregbar und ihr Fluoreszenzlicht im Gerät detektierbar sein. So liefert die Durchflusszytometrie eher ein quantitatives als ein qualitatives Maß, welches auf zellassozierter Fluoreszenz basiert und unabhängig von Färbemodellen ist [34]. Die heute möglich gewordene Herstellung monoklonaler Antikörper ist als großer Fortschritt zu werten, Untersuchungsergebnisse da durch vergleichbar ihren Einsatz geworden sind Studien[34]. und Diese Einleitung und Fragestellung 23 multiparametrische Analyse lässt sich grundsätzlich an allen biologischen Zellen durchführen, deren entsprechende Oberflächenantigene fluoreszingekoppelte bekannt Antikörper sind und vorhanden sind. gegen die Allerdings müssen die Zellen zunächst in Flüssigkeit suspensiert werden. Zellen aus Gewebeverbänden müssen hierzu somit erst mechanisch und/oder enzymatisch aus dem Verband isoliert werden. Die Analyserate liegt hierbei bei etwa 4000 Zellen pro Minute. Inzwischen ist es möglich geworden, Antikörper mit verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen zu koppeln und so mehrere Oberflächenantigene einer Zelle in einem Untersuchungsgang gleichzeitig darzustellen. So können Zellen noch genauer zugeordnet und unterschieden werden. Durch dieses System der Multi-Color-FACS-Analyse ist das Verfahren noch universeller einsetzbar geworden. Ein weiterer Fortschritt zur Darstellung mehrere Oberflächenmerkmale einer Zelle war die Entwicklung eines dualen Lasersystems, welches den Einsatz einer großen Menge von Markern, die gleichzeitig auf einzelnen Zellen detektiert werden können, möglich gemacht hat [34]. Heutzutage werden Ein-Laser-FACS-Geräte gewöhnlich beim gleichzeitigen Darstellen von 3 verschiedenen antikörpergebundenen Fluoreszenzfarbstoffen eingesetzt. Dual-Laser-FACS-Geräte werden in wenigen Laboratorien eingesetzt, um bis zu 5 Fluoreszenzfarben gleichzeitig darzustellen. Die richtige Fluoreszenz-Darstellung in diesen modernen FACS-Systemen bleibt aber vorerst noch problematisch. Obwohl moderne optische Systeme und Filter Überlappungen seltener gemacht haben, ist es immer noch wichtig, Antikörper und Fluoreszenzfarben vorsichtig zu kombinieren, um Marker mit geringer Expression auf den Zellen nicht durch solche mit hoher Expression zu überlagern. Inzwischen sind effektive Reagentien und Farbkombinationen entwickelt worden, so dass das System gewinnbringend eingesetzt werden kann [35], [36], [37]. Einleitung und Fragestellung 24 Insgesamt lässt sich sagen, dass die Mehrdeutigkeit bei der Bestimmung von Zellsubpopulationen eines bestimmten Phänotyps geringer ist, je mehr Reagentien zusammen in einer einzelnen Probe genutzt werden können. Subpopulationen, die beim Gebrauch von zwei Reagentien überlappen, können oft durch den Einsatz von vier Reagentien hinreichend voneinander getrennt werden. Non-Hodgkin-Lymphome Unter dem Begriff Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) wird eine Reihe maligner Erkrankungen der B- und T-Lymphozyten zusammengefasst. Für ihre Entstehung sind die maligne Transformation eines Lymphozyten, der damit verbundene Reifungsarrest der Zelle und ihre überschießende Proliferation von großer Bedeutung. Aus letzterem ergibt sich die Entstehung aus einer einzigen Stammzelle, welche als Monoklonalität bezeichnet wird und mit immunologischen und molekularbiologischen Methoden nachweisbar ist. Diese Monoklonalität unterscheidet das Lymphom von einer benignen polyklonalen Lymphozytenproliferation z.B. durch akute Virusinfektionen (EBV, CMV oder Pertussis etc.) oder chronische Infektionen (Tbc oder Brucellose etc.). Obwohl inzwischen verschiedene Einteilungen für NHLs bestehen (z.B. die Revised European American Lymphoma (R.E.A.L.)- Klassifikation und die WHOKlassifikation von 1999), wird in Deutschland weiterhin vor allem die KielKlassifikation verwendet, da sie dem Kliniker am ehesten eine Aussage über die Prognose des Patienten ermöglicht. Dabei muss jedoch beachtet werden, dass verschiedene Formen der Non-Hodgkin-Lymphome auch ineinander übergehen können. Die typische Trias der Non-Hodgkin-Lymphome besteht in: 1) Lymphom-Zell-Proliferation 2) Monoklonalität 3) Koexpression von Antigenen unreifer Zellen und Aktivierungsantigenen Einleitung und Fragestellung 25 Tabelle 1: WHO–Klassifikation der Lymphome B-Zell Non-Hodgkin-Lymphome Vorläufer B-Zell Neoplasien Akute lymphoblastische Vorläufer-B-Zell-Leukämie / lymphoblastisches Lymphom (B-ALL, LBL) Periphere B-Zell Neoplasien Chronische lymphozytische B-Zell-Leukämie / kleinzelliges lymphozytisches Lymphom Prolymphozytische B-Zell-Leukämie Lymphoplasmozytisches Lymphom / Immunozytom Mantelzelllymphom Follikuläres Lymphom Extranodales Marginalzonen-B-Zell-Lymphom vom MALT-Typ Nodales Marginalzonen-B-Zell-Lymphom (+/- monozytoide B-Zellen) Splenisches Marginalzonen-B-Zell-Lymphom (+/- Zottige Lymphozyten) Haarzell-Leukämie Plasmozytom / Plasma-Zell-Myelom Diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom Burkitt-Lymphom T-Zell- und putative NK-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome Vorläufer-T-Zell-Neoplasien Akute lymphoblastische Vorläufer-T-Zell-Leukämie / lymphoblastisches Lymphom (T-ALL, LBL) Periphere T-Zell- und NK-Zell-Neoplasie Chronische lymphozytische T-Zell-Leukämiie / Prolymphozytische Leukämie Granuläre lymphozytische T-Zell-Leukämie Mykoses funguides / Sezary-Syndrom Periperes T-Zell-Lymphom, nicht anderweitig klassifizierbar Hepato-splenisches Gamma- / Delta-T-Zell-Lymphom Einleitung und Fragestellung 26 Subkutanes pannikulitis-artiges T-Zell-Lymphom Angioimmunoblastisches T-Zell-Lymphom Extranodales T- / NK-Zell-Lymphom, nasaler Typ Intestinales T-Zell-Lymphom vom enteropathischen Typ Adultes T-Zell-Lymphom / Leukämie (HTLV 1+) Anaplastisches großzelliges Lymphom, hauptsächlich systemischer Typ Anaplastisches großzelliges Lymphom, hauptsächlich kutaner Typ Agressive NK-Zell-Leukämie Hodgkin-Lymphome (Morbus Hodgkin) Noduläres lymphozyten-prädominantes Hodgkin-Lymphom Klassische Hodgkin-Lymphome Nodulär-sklerosierendes Hodgkin-Lymphom Lymphozytenreiches, klassisches Hodgkin-Lymphom Gemischtes Hodgkin-Lymphom Lymphozytenarmes Hodgkin-Lymphom Bei der Entstehung von Lymphomen kommen verschiedene Mechanismen in Betracht, zu denen in einigen Fällen Infektionen mit Viren (z.B. beim endemischen Typ des Burkitt-Lymphoms in Afrika das EBV oder beim HIV-assoziierten KaposiSarkom das HHV-8) bzw. Bakterien (z.B. das niedrig-maligne MALT-Lymphom nach jahrelanger Infektion der Magenschleimhaut mit Helicobacter pylori) gehören. In einer Großzahl der Fälle jedoch sind tumorspezifische Mutationen im Genom der jeweiligen Lymphom-Stammzelle für deren überschiessende Proliferation verantwortlich. Es wird davon ausgegangen, dass ein unreifer antigen-reaktiver Lymphozyt während seines Reifungsprozesses transformiert, dadurch in dem bis zu diesem Zeitpunkt erreichten Reifungsstadium arretiert und proliferiert, wobei der genaue Pathomechanismus nicht bekannt ist, aber außer einer chromosomalen Veränderung auch Zell-Zell-Interaktionsstörungen angenommen werden. So findet sich z. B. eine inverse T4/T8-Ratio im Blut von Patienten mit BZell-Lymphomen. Einleitung und Fragestellung 27 Desweiteren findet sich durch die Translokation des Protoonkogens bcl-2 von Chromosom 18 auf Chromosom 14 bei Keimzentrumslymphomen eine Überexpression des Apoptoseschutzgens, was zu einem verspäteten Absterben dieser Zellen führt. Modelle der Lymphomentstehung gehen davon aus, dass durch die Translokationen Onkogene in Form von „Second-Hit-Ereignissen“ aktiviert werden, die maligne Transformation und Proliferation auslösen. Zum weiteren Verständnis ist wichtig, dass die naive B-Zelle während ihrer Reifung Veränderungen ihrer Morphologie und ihres Oberflächenantigenmusters erfährt, wobei jedes Reifungsstadium durch ein bestimmtes Antigenmuster ihrer Oberflächenstrukturen charakterisiert ist, welches man mit Hilfe monoklonaler Antikörper nachweisen kann Bei erstmaliger Auseinandersetzung des Immunsystems mit einem Antigen entstehen durch die primäre Immunantwort in der Rindenzone des Lymphknotens bzw. der Tonsillen aus Primärfollikeln Sekundärfollikel. Von diesem Zeitpunkt an sind im entsprechenden Lymphknoten alle Reifungsstufen der B-Lymphozyten und zudem T-Helfer-Zellen nachweisbar, wobei sich die Zentroblasten und Zentrozyten hauptsächlich neben dendritischen Zellen im Keimzentrum befinden, während die Gedächtniszellen und Prä-Plasmazellen im Follikelmantel vorkommen. Aus diesen verschiedenen Reifungsstufen können dann bei entspechender Mutation im Keimzentrum die Keimzentrumslymphome (z.B. CB-CC) und im Follikelmantel zum Beispiel zentrozytische Lymphome entstehen. Mit Hilfe immunologischer Methoden können die charakteristischen Oberflächenantigenmuster nachgewiesen und zur Klassifikation der NHL herangezogen werden. Zudem tragen reife B-Zellen Immungobuline und T-Zellen einen T-Zell-Rezeptor, wobei beide für die spezifische Erkennung von Fremdantigenen bei der Immunantwort verantwortlich sind. Diese Antigenrezeptoren werden während der Reifung des lymphatischen Systems gebildet, wobei jede Zelle nur ein einziges pathogenes Antigen erkennen kann, so dass viele verschiedene Zellen mit verschiedenen Antigenrezeptoren vorkommen (Diversität). Diese Diversität wird durch die Umlagerung von Genen ermöglicht, welche die Immunglobuline bzw. T-ZellRezeptoren codieren. Einleitung und Fragestellung 28 Bei einer malignen Zellpopulation tragen so alle Zellen nicht nur die gleichen Oberflächenstrukturmuster, sondern auch das gleiche Rearrangement des Antigenrezeptors. Der Nachweis der Monoklonalität und damit der Malignität der NHL-Zellen ist über den Nachweis der spezifischen Gen-Umlagerungen ihrer Antigenrezeptoren möglich. Non-Hodgkin-Lymphome der B-Zell-Reihe Im normalen gesunden Blut finden sich 5-15%, im Knochenmark bis zu 30%, polyklonale reife B-Zellen. Diese exprimieren die Pan-B-Zell-Marker CD20 und CD19, jedoch keine Antigene unreifer B-Zellen (CD10, CD15) und keine Aktivierungsmarker (CD23, CD38, CD11c, CD25). Membranständige Immunglobuline (Schwer- und Leichtketten) sind nachweisbar, wobei die Hälfte der B-Zellpopulation κ-Leichtketten, die andere λ-Leichtketten exprimiert (κ = λ = Polyklonalität). Da B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome durch die maligne Transformation einer einzigen Antigen-reaktiven Vorläuferzelle entstehen, ist die pathologische Zellpopulation somit monoklonal und imponiert durch eine charakteristische Morphologie und ein typisches Oberflächenantigen-Expressionsmuster. Zudem trägt sie ein spezifisches Immunglobulin-Gen-Rearrangement. Die Monoklonalität ist immunologisch einfach über die Untersuchung der Leichtkettenexpression nachweisbar, da die pathologischen Zellen alle den gleichen Antigenrezeptor und damit nur einen Typ von Leichtketten exprimieren, wodurch sich in der B-ZellPopulation die Ratio der Leichtketten zugunsten eines Typs verschiebt. Diese ausschließliche Expression eines Leichtkettentyps auf der malignen B- Zellpopulation wird als Leichtkettenrestriktion bezeichnet. Neben Antigenen, die nur auf unreifen B-Zellen zu finden sind, werden Aktivierungsantigene koexprimiert. Die Antigene, die auf anderen hämatopoetischen Zellen exprimiert werden können, sollten nur in Koexpression mit CD19 beurteilt werden. Auch der Nachweis der Leichtketten sollte in Doppelfärbung mit Anti-CD19-Antikörpern Einleitung und Fragestellung 29 erfolgen, da sich Anti-κ- und Anti-λ-Antikörper an die löslichen Immunglobuline im Serum des Patienten binden. Tabelle 2: Zusammenfassung der für die Diagnostik relevanten B-Zell-Antigene Antigen Expression auf B-Zellen Lymphom hämatopoetischen Gammopathie Zellen CD19 unreife/reife alle keine CD20 reife alle keine CD5 unreife cc, CLL T-Zellen CD10 Prä-B-Zellen, cb-cc, Highgrade Granulozyten HZL, CLL aktivierte Keimzentrum CD25 aktivierte T-Zellen, Monozyten CD11c aktivierte HZL Ganulozyten B-ly7 unreife HZL keine CD23 aktivierte CLL, ic keine CD38 aktivierte ic, Myelom T-Zellen, Monozyten, Plasmazellen FCM7 Subpopulation etc. HZL, PLL, cc, cb-cc Non-Hodgkin-Lymphome der T-Zell-Reihe Im Blut finden sich 60 bis 80% reife T-Zellen, die CD2, CD3, CD5 und CD7 membranständig exprimieren. Alle T-Zellen tragen einen T-Zell-Rezeptor. Bei den T-Zell-Subpopulationen überwiegt der T-Helfer-Zellanteil (CD4-positiv) mit 35 bis 60 % der Lymphozytenpopulation gegenüber dem T-Suppressor-Zellanteil (CD8positiv) mit 15 bis 25 %. So ergibt sich die typische Ratio des Helfer-Zellanteils zum Suppressor-Zellanteil von 2:1, auch T4/T8-Ratio genannt. Eine Verschiebung kann viele Ursachen haben und ist nicht unbedingt hinweisend auf ein T-ZellLymphom. Einige dieser Ursachen sind z.B. akute Virusinfektionen (EBV, CMV, Pertussis), chronische Virusinfektionen (HIV; EBV), hämatologische Einleitung und Fragestellung 30 Systemerkrankungen (akute Leukämie, Non-Hodgkin-Lymphom, M. Hodgkin, monoklonale Gammopathie), primäre Immundefizienzen, Autoimmunerkrankungen (rheumatoide Arthritis, Kollagenosen, Sarkoidose) und solide Tumorerkrankungen. Die T-Zell-Lymphome entstehen wie die B-Zell-NHL während der T-ZellEntwicklung im Thymus und können bestimmten Reifungsstadien der T-Zelle zugeordnet werden, wobei T-Zell-Lymphome, die primär aus Thymus-assoziierten Reifungsstadien entstehen, von post- und thymitischen Lymphomen (sogenannte „periphere T-NHL“) abgegrenzt werden können. Neben dem Reifungsstop findet sich eine Proliferation der monoklonalen T-Zellen; somit ist die klassische Trias des Non-Hodgkin-Lymphoms erfüllt. Allerdings ist die Monoklonalität mit immunologischen Methoden nicht erfassbar, sondern nur mit dem molekularbiologischen Nachweis des spezifischen T-Zell-Rezeptor- Rearrangements des malignen Klons. Nicht alle Antigene, die zur Diagnostik von T-Zell-Lymphomen herangezogen werden, sind linienspezifisch. Deshalb werden in der Diagnostik Doppelfärbungen mit einem linienspezifischen Antigen (CD3) durchgeführt. Bei der immunologischen Diagnostik eines Non-Hodgkin-Lymphoms steht, neben der Zuordnung des Lymphoms zur B- bzw. T-Zell-Linie, der Nachweis der Monoklonalität der B-Zell Lymphome im Vordergrund. Bei T-Zell-Lymphomen ist ein solcher Klonalitätsnachweis durch immunologische Methoden nicht möglich. Grundsätzlich sollte vor Beginn der Immundiagnostik ein Differentialblutbild vorliegen, um im Einzelfall beurteilen zu können, ob eine immunologische Untersuchung indiziert ist. Ratsam sind zudem klinische Angaben zur Erkrankung, um Probenmaterial und Antikörper sinnvoll auswerten zu können. Zur Diagnostik eines Lymphoms kann Material aus Blut, Knochenmark und Lymphknoten sowie eventuell aus Pleuraerguss- bzw. Aszitespunktat verwendet werden. Einleitung und Fragestellung 31 Tabelle 3: Zusammenfassung der für die Diagnostik relevanten T-Zell-Antigene Antigen Expression auf T-Zellen Lymphom hämatopoetischen Zellen CD1 Thymozyten ib keine CD2 reife/unreife alle Granulozyten, NK- Zellen CD3 reife variabel keine CD4 Helfer T-CLL Monozyten CD5 unreife/reife variabel, B-NHL unreife B-Zellen CD7c unreife/reife variabel myeloische Zellen CD8 Supressor T-PLL keine CD10 keine high-grade Granulozyten, Prä-BZellen CD16 NK-Zellen T-γ-Lymphocytosen, LGL-Zellen, LGL-Leukämien Granulozyten CD25 aktivierte variabel B-NHL CD29 Helfer-Inducer Sézary-Syndrom B-Zellen, Monozyten CD38 CTL variabel Monozyten, akt. BZellen CD56 NK-Zellen T-γ-Lymphocytosen LGL-Zellen CD57 NK-Zellen T-γ-Lymphocytosen LGL-Zellen In der Routinediagnostik von Non-Hodgkin-Lymphomen hat sich die Doppelfärbung mit Hilfe der direkten Immunfluoreszenz durchgesetzt, wobei in der Regel monoklonale Antikörper verwendet werden. Antikörper gegen Differenzierungs- und Aktivierungsantigene werden bei diesen Doppelfärbungen mit linienspezifischen Antikörpern kombiniert. Dabei wird erst über die Koexpression eine eindeutige Zuordnung zum Zelltyp möglich. Für B-Zell-NHL eignet sich hierzu das CD19-Antigen, für T-Zell-NHLs das Pan-T-Zell-Antigen Einleitung und Fragestellung 32 CD3. Neben isotypischen Kontrollen sollte im Panel stets eine Positivkontrolle mitgeführt werden (z.B. eine Färbung gegen das Pan-Leukozyten-Antigen CD45). In der klinischen Routine hat sich ein Stufenplan zur Abklärung der Verdachtsdiagnose „Non-Hodgkin-Lymphom“ bewährt. Dabei wird die Probe zunächst mit Hilfe der entsprechenden Marker auf das Vorhandensein pathologischer Zellen untersucht und diese einer B-Zell-Linie zugeordnet. Werden pathologische B- oder T-Zellen gefunden, können dann zur genaueren Differenzierung in einem weiteren Schritt weitere koexprimierende Antigene bestimmt werden und so zu einer Subklassifikation beitragen. I. pathologische Zellen? CD20/CD19 CD8/CD4 CD7/CD3 κ/CD19 λ/CD19 IIa. IIb. monoklonale B-Zellen maligne T-Zellen CD23/CD19 CD2/CD3 CD5/CD19 CD5/CD3 CD38/CD19 MHC II/CD3 CD10/CD19 CD25/CD3 CD11c/CD19 CD16/CD3 B-ly7/CD19 CD56/CD3 CD38/CD3 CD57/CD3 lgM/CD19 CD29/CD3 lgD/CD19 CD10/CD3 CD1/CD3 Abbildung 1: Stufenplan zur Diagnostik von Non-Hodgkin-Lymphomen Instrumentenbeschreibung 33 Instrumentenbeschreibung Das Endosonographiegerät Bei dem in unserer Studie verwendeten Endosonographiegerät handelt es sich um ein Faseroptik-Gastroskop mit im 60° Grad Winkel schräg-vorwärts ausgerichteter Sicht und linear angeordnetem Schallkopf. Es wird von der Firma Pentax/ Hitachi unter der Bezeichnung FG-34 UX vertrieben. Der Schallkopf ist 36 mm lang und 12 mm breit, mit in der Longitudinalebene des Endoskops gelegener Schallebene. Sein Kurvenradius beträgt 20mm und sein Schallwinkel 100°. Die Schallfrequenz kann auf 5 MHz oder 7,5 MHz eingestellt werden. Dabei beträgt die laterale und axiale Auflösung etwa 0,8 mm und die Eindringtiefe etwa 6 cm bei 5 MHz. Die Fokustiefe beträgt 2-2,5 cm. Die Blickrichtung der Faseroptik stimmt mit der Schallebene überein. Nahe der optischen Linse endet der Biopsiekanal (Durchmesser: 2 cm), welcher die Benutzung konventioneller endoskopischer Instrumente ermöglicht. Am distalen Ende ist er leicht gebogen, so dass sich der Katheter beim Einführen in einem Winkel von 30° biegen muss. Durch die sektorförmige Schallebene und die Ausrichtung der Schallebene kann man eine durch den Biopsiekanal eingebrachte Nadel im Ultraschallbild erkennen und unter sonographischer Sicht in die richtige Position für eine Probenentnahme bringen. Der distale Teil der Nadel kann auch durch die optische Linse gesehen werden. Das Endoskop ist 160 cm lang und hat einen Durchmesser von 10 mm. Außerdem beinhaltet es einen Spül- und Absaugkanal, verbunden mit einem Wasserzufuhrgerät. Diese Spülvorrichtung ist mit einem Fußschalter verbunden, der bei Aktivierung über einen mit dem Biopsieeinlass des Endoskops verbundenen Kanal Wasser in den Magen einbringt. Das Tankvolumen dieser Maschine beträgt 2 Liter. Ein weiterer Kanal des Endoskops dient der Wasserinstillation in einen Ballon, welcher damit um den Schallkopf herum aufgepumpt werden kann. Als Lichtquelle dient ein Pentax LX-75 F-Gerät. Außerdem wird eine HitachiKamera-Kontroll-Einheit mit einer an die Optik des Endoskops angeschlossenen Videokamera benutzt. Das optische Bild kann sowohl auf einen Fernseh- wie auch Instrumentenbeschreibung 34 auf einen Videomonitor übertragen werden. So können sowohl das endoskopische wie auch das sonographische Bild auch auf Video aufgenommen werden. Der Schallkopf ist mit einem sektorförmigen Schallfeld in der Longitudinalachse des Endoskops eingebaut. Für die endosonographische Untersuchung wird in unserem Falle ein linear gebogener Schallkopf verwendet, welcher aus mehreren Kristallen besteht, die in einer Reihe angeordnet sind. Dabei wird jeder Kristall oder kleine Gruppen von Kristallen gleichzeitig aktiviert, wobei die Aktivierung entweder sequentiell über den linearen Schallkopf verläuft oder gleichzeitig aber mit variierenden Verzögerungen der erregenden Impulse. Mit Abbildung 2: Endosonographischer linearer dieser Art Schallkopf zu arbeiten Schallkopf bedeutet allerdings, dass während der Untersuchung der Schallkopf um die Longitudinalachse des Endoskops gedreht werden muss, um die Wände des Gastrointestinaltraktes überall richtig beurteilen zu können. Solange das Endoskop nur in grader Position gehalten wird, kann nur ein Teil der Wand in der Longitudinalebene gesehen werden. Endosonographie am Patienten Vor Beginn der Untersuchung wurde sichergestellt, dass der Patient seit mindestens 8 Stunden nüchtern war, um eine Aspiration von Speiseresten und ihre Komplikationen zu vermeiden. Als Lokalanästhetikum wurde Lidocain-Spray verwendet, welches dem Patienten einige Minuten vor Untersuchungsbeginn in den Rachen gesprüht wurde, um ihm das Schlucken des Endoskops zu erleichtern. Weiterhin ist es wichtig, den Patienten zu sedieren. Bei den diese Studie betreffenden Endosonographien wurde hierzu Midazolam in einer Eingangsdosis von 3 bis 5 mg i.v. sowie Disoprivan i.v. (30-180 mg) verwendet, die im Untersuchungsverlauf nach Bedarf erhöht wurde. Während der Zeit der Instrumentenbeschreibung 35 Sedierung wurden die Vitalparameter des Patienten auf dem Monitor mittels Pulsoxymetrie überwacht. Als Endosonographieraum diente ein moderner Arbeitsraum mit Monoitorhalterungen und Endoskopie-„Turm“. Der Patient wurde in seinem Bett in die Mitte dieses Raumes gefahren und für die Untersuchung seitlich gelagert (Linksseitenlage). Rechts von der Liege standen die Endosonographiegeräte. Von dieser Seite aus arbeitete auch der untersuchende Arzt. Auf der linken Seite stand die Endoskopieschwester. Während der Untersuchung wurde der Raum abgedunkelt, um eine bessere Beurteilbarkeit der Ultraschallbilder auf dem Monitor zu erreichen. Um eventuelle Zusatzbefunde nicht zu übersehen, wurden bei jeder Untersuchung alle endosonographisch untersuchbaren Organe im oberen GI-Trakt und ihre Umgebung betrachtet, unabhängig davon in welchem Organ der pathologische Prozess vermutet wurde. Die Untersuchung begann mit dem Einführen des Endoskops in den Ösophagus. Dieses wurde unter Sicht bis zum oberen Ösophagussphinkter vorgeschoben. Dann wurde der Patient aufgefordert zu schlucken, um so leichter mit dem Endoskop in das Magenlumen vordringen zu können. Von dort aus schob der Untersucher das Endoskop über den Pylorus ins Duodenum vor. Hier begann die Untersuchung mit der Beurteilung der Duodenalwände und Umgebung. Danach wurde die sonographische Komponente des Geräts eingesetzt, um das Pankreas und die Umgebung zu beurteilen. War hier kein Befund zu erheben, wurde mit dem Rückzug des Endoskops unter gastroskopischer Sicht begonnen. Im Magen wurde der Ultraschall nach vorheriger gastroskopischer Untersuchung erneut eingeschaltet, dieses Mal zur Beurteilung der Magenwände, der Leber, der Nebennieren und der Nieren und der Magenumgebung. Dazu war es nötig, die im Magen befindliche Luft abzusaugen und das Lumen stattdessen mit Flüssigkeit anzufüllen. Während des Schallens wurde dann das Endoskop in beide Richtungen um 180° um seine Longitudinalachse gedreht, so dass die gesamte Magenumgebung betrachtet werden konnte. Instrumentenbeschreibung 36 Die sonographische Beurteilung des Ösophagus und seiner Umgebung begann im Bereich der Kardia. Von hier aus wurde das Instrument unter 360° Drehung langsam nach kranial gezogen und damit die Untersuchung beendet. Wurden bei der Untersuchung suspekte Organveränderungen gesehen, wurden diese mit der Feinnadel punktiert, um so Material für eine histologische Untersuchung des suspekten Bezirks zu gewinnen. Dazu wurde die Nadel in den Biopsiekanal des Endoskops eingeführt und in diesem vorgeschoben, bis der Untersucher im Ultraschallbild ihr distales Ende erkennen konnte. Dann wurde die Nadel unter sonographischer Sicht bis in den suspekten Prozess vorgeschoben und durch Aspiration Material aus diesem entnommen. Nach entsprechender Aufarbeitung wurde dieses Material dann an den Pathologen versand. Zu Dokumentationszwecken ist es wie beim herkömmlichen Ultraschallgerät möglich, die Bilder der untersuchten Strukturen zu speichern und bei Bedarf auch auszudrucken. Das Durchflusszytometer Bei dem von uns verwendeten Gerät handelt es sich um ein COULTER EPICS XL-Gerät, ein optokinetisches Messgerät, welches optische Signale unterschiedlicher Qualität (Lichtstreuung und Fluoreszenzsignale) detektiert. Der hierzu benötigte Messaufbau ist in allen Durchflusszytometern ähnlich. Folgende Elemente sind enthalten: 1) Die Lichtquelle, ein kleiner, luftgekühlter Laser 2) Die Durchflusszelle, welche die Analyseküvette des Durchflusszytometers ist. Hier werden die suspensierten Zellen einzeln perlschnurartig hintereinander aufgereiht und nacheinander durch den Laserstrahl geführt. Der Hüllstrom aus der die Zellen umspülenden Flüssigkeit sorgt durch seine hohe Flussgeschwindigkeit dafür, dass sich die Zellen im Zentrum der Messzelle befinden und jede Zelle im Fokus des Laserstrahls gemessen wird. So stabilisiert die Durchflusszelle das zu untersuchende Objekt im Fokus des Lichtstrahls. 3) Das opto-elektronische Detektionssystem quantifiziert die Fluoreszenzund Streulichtwerte jeder einzelnen Zelle, die die Durchflusszelle passiert. Instrumentenbeschreibung Es besteht aus 37 einer Reihe von optischen Filtern, die Licht unterschiedlicher Wellenlänge voneinander trennen und den Detektoren (Photomultiplier Tubes (PMTs), Lichtverstärkerröhren) zuleiten. Außerdem gibt es noch zwei weitere Detektoren zum Messen der Zellgröße (Vorwärtsstreulicht) und die Zellgranularität (Seitwärtsstreulicht). Hiermit ist (Lymphozyten, es möglich, Monozyten die und drei Hauptleukozytenpopulationen neutrophile Granulozyten) zu unterscheiden. Das von den optischen Filtern getrennte Licht wird zur Detektion auf die PMTs geleitet. Diese wandeln Licht in elektrische Impulse um, wobei die Höhe des erzeugten Impulses mit der Stärke des Lichtsignals korreliert. Gleichzeitig verstärken die PMTs das optische Primärsignal über eine Photokaskade. Diese am Ausgang der PMT erhaltenen elektrischen Impulse werden noch einmal elektronisch nachverstärkt, anschließend digitalisiert und an den Rechner weitergeleitet. Diese an den Rechner übermittelten elektrischen Impulse können wahlweise in ein- oder zweiparametrischen Histogrammen dargestellt werden. Dabei werden die Impulse entsprechend ihrer Voltzahl in 1024 unterschiedlichen Klassen zugeordnet (die kleinsten Ereignisse in Kanal 0, die größten in Kanal 1023) .In jedem dieser Kanäle werden nun alle Ereignisse identischer Größe addiert. Wenn die Zellen nach mehr als einem Parameter untersucht werden, ist es möglich, je zwei dieser Parameter verknüpft in einem Zwei-Parameter-Histogramm darzustellen. Ein solches Histogramm wird in 64 mal 64 Felder (Kanäle, Klassen) aufgeteilt. Diese repräsentieren die Impulsstärke für zwei Parameter. Die Anzahl der Ereignisse in jeder Klasse wird über eine Helligkeitsskala oder eine Farbskala dargestellt. Durch diese Verknüpfung von zwei unabhängigen Parametern einer Zelle lassen sich einzelne Zellpopulationen wesentlich besser unterscheiden. In einem solchen Zwei-Parameter-Streulichthistogramm ist es möglich, eine beliebige Zellpopulation zur weiteren fluoreszenzspezifischen Analyse auszuwählen. Dieser Vorgang heißt Gating. Hierzu wird ein „Gate“ oder „Bismap“ um die interessierende Zellpopulation gelegt. In den folgenden Histogrammen Instrumentenbeschreibung 38 werden dann nur die Zellen dieser Region auf ihr Fluoreszenzverhalten hin untersucht. Um doppelpositve Zellpopulationen zu erkennen, sollte man bei Doppelfärbung eine Zwei-Parameter-Darstellung wählen. Um kleine unerwünschte Partikel von der Untersuchung auszuschließen, ist es möglich, einen Schwellenwert (Diskriminator) zu setzen. So werden automatisch alle Partikel, die Impulse unterhalb des Schwellenwertes erzeugen von der Analyse ausgeschlossen, so dass sie die Messung der „Zielzellen“ nicht mehr negativ beeinflussen können. Diese in Ein- oder Zwei-Parameter-Histogrammen dargestellten Meßdaten können durch Setzen von „Statistikregionen“ ausgewertet werden. In Ein-Parameter-Histogrammen sind dies „lineare Statistikregionen“. In Zwei-Parameter-Histogrammen gibt es zwei unterschiedliche Möglichkeiten, Statistikregionen zu definieren, nämlich entweder mehrere rechteckige sogenannte Statistikboxen frei zu setzen oder das Histogramm mit einem „Quadrat“ in 4 Quadranten unterteilen. Für jeden dieser Quadranten oder Statistikboxen wird der prozentuale Anteil der Zellen am Gesamthistogramm errechnet und zusammen mit den Histogrammen ausgedruckt. Bei unseren Untersuchungen ging es vor allem um die Darstellung von Zytokeratingehalt und Leichtkettenexpression (κ oder λ) der zu untersuchenden Zellen. Als Material für unsere durchflusszytometrischen Untersuchungen verwendeten wir Lymphknotenpunktate, die zuvor durch endosonographische Feinnadelpunktate gewonnen und zusätzlich histologisch untersucht wurden. Dabei richtete sich unser besonderes Interesse auf die Aussagekraft der Leichtkettenrestriktion im klinischen Gebrauch bei der Suche nach B-ZellLymphomen. In einer weiteren Untersuchungsreihe verwendeten wir einen Marker zur Feststellung von Zytokeratin, welches nur in epithelialen Zellen vorkommt. Wird es also in einem Lymphknotenpunktat festgestellt, kann es als Hinweis auf eine Karzinommetastase gewertet werden. Instrumentenbeschreibung 39 Vorbereitung der Proben für die Doppelfärbung mit konjugierten Antikörpern Probe: Ficollierte Zellen Material: PBS+1% BSA+0,01% Natriumazid direktkonjugierte Antikörperkombination direktkonjugierte isotypische Negativkontrollen 5-ml-Proberöhrchen, 12*75mm DANN-Check-Beads zur Gerätekalibrierung Geräte: Zentrifuge Absaugepumpe Vortex-Mischer Durchflußzytometer COULTER EPICS XL Vorgehen: 1) Pro Probenröhrchen 100 µl Zellsuspension mit 0,5-1,5*106 Zellen und 10 µl der entsprechenden Antigenkombination bzw. isotypischen Negativkontrolle pipettieren und gut vortexen. 2) Für 15 min bei 4°C inkubieren und anschließend 1 ml PBS-BSA zugeben 3) 5 min bei 1200 U/min (800 g) mit Bremse zentrifugieren und Überstand dekantieren oder absaugen. 4) Zellen in 1 ml PBS-BSA resuspendieren. Die Proben sind anschließend messbereit und können ohne Fixativ bis zu 24 h bei 4°C aufbewahrt werden. Als monoklonale Antikörper zur Identifizierung der aus dem Lymphknotenmaterial gewonnenen Zellen und der Bestimmung ihrer Auswertbarkeit dienten neben Antikörpern gegen die κ, λ Leichtketten oder Zytokeratin auch Antikörper gegen: 1) CD 19 2) IgG 1 3) CD 3 4) CD 45 Instrumentenbeschreibung 40 Patientengut und Zeitraum der Studie Im Zeitraum zwischen Januar 1999 und Mai 2000 wurden 101 Patienten im Alter zwischen 29 und 83 Jahren in die Studie aufgenommen. Bei diesen Patienten wurden zusammen 106 Feinnadelpunktionen durchgeführt. Es handelte sich um Patienten aus umliegenden dem Knappschaftskrankenhaus Krankenhäusern, die aus Bochum-Langendreer diagnostischen Gründen und eine endosonographische Untersuchung bekommen sollten. Dazu zählen: Abklärung von Beschwerdebildern und weitere Abklärung von Befunden aus anderen Untersuchungen, Tumorsuche und Tumornachsorgeuntersuchung bei Rezidivverdacht. Ausgeschlossen wurden Patienten, 1) die bei der endosonographischen Untersuchung keinen pathologischen Befund aufwiesen, und nicht punktiert wurden 2) deren Entlassungsbriefe nicht zugänglich waren, und bei denen keine endgültige Diagnose gesichert werden konnte, 3) bei denen bis zum Ende der Datenerfassungszeit keine endgültige Diagnose gestellt werden konnte. Bei den zu untersuchenden Prozessen handelte es sich um Befunde in den Ösophagus, Magen und das Duodenum umgebenden Strukturen. Hierbei handelt es sich z.B. um: 1) Prozesse des Ösophagus, oberen Magen und Gastrointestinaltraktes Duodenum, M. wie Karzinome Ménétrier, Magen- von und Duodenalulzera und gastrointestinale Sarkome, 2) Erkrankungen des Pankreas wie akute und chronische (evtl. mit Pseudozystenbildung) Pankreaskarzinom, Pankreatitis, Pankreasabszess oder Instrumentenbeschreibung 3) Erkrankungen von 41 Leber und Gallenwegen wie Leber- und Gallenblasenkarzinom und Leberfiliae, 4) Bronchialkarzinome, 5) Nebennierenprozesse wie Metastasen und granulomatöse Entzündungen, 6) Mediastinalprozesse, 7) Verschiedenste Lymphknotenveränderungen wie Hyperplasie und Anthrakose, Tbc und Sarkoidose, Karzinommetastasen, CUP-Syndrom, M. Hodgkin und Non-Hodgkin-Lymphome. Zusätzlich wurden 46 der endosonographierten Patienten zu ihren Erfahrungen mit dieser Art von Untersuchung befragt und zwar in Form einer visuellen Analogskala. In dieser konnten sie die bei der Untersuchung empfundenen Schmerzen, das nach dem Aufwachen folgende allgemeine Unwohlsein und die vorher empfundene Angst auf einer Skala von 1 bis 6 beurteilen und angeben. Datenauswertung 42 Datenauswertung Für die weitere Bewertung der Daten sind die statistischen Begriffe Sensitivität, Spezifität, positiver und negativer Vorhersagewert von Bedeutung, welche man aus der folgenden Tabelle errechnen kann: Tabelle 4: Vierfeldertafel zur Berechnung von Sensitivität, Spezifität, positivem und negativem Vorhersagewert und Treffsicherheit Zytologie Diagnose + - + a b - c d a = Zytologie und Diagnose sind beide positiv und stimmen somit überein, dass der Patient an einer bestimmten Krankheit erkrankt ist (die Zytologie ist richtig positiv) b = Die Zytologie ist negativ, während die Diagnose positiv ist, d.h. der Patient ist erkrankt, was aber durch die Zytologie nicht erkannt wurde (die Zytologie ist falsch negativ) c = Die Zytologie ist positiv, während die Diagnose negativ ist, d.h. der Patient ist an der entsprechenden Erkrankung nicht erkrankt, obwohl seine Zytologie positiv ist (die Zytologie ist falsch positiv) d = Zytologie und Diagnose sind negativ und stimmen somit überein, dass der Patient nicht an der entsprechende Erkrankung erkrankt ist (die Zytologie ist richtig negativ) Die Sensitivität gibt die Eignung einer Methode an, Kranke richtig als krank zu erkennen. Sie wird errechnet, indem der Anteil der richtig positiven Ergebnisse durch die Gesamtzahl der Erkrankten geteilt wird. Das bedeutet: Sensitivität = a / (a + b). Die Spezifität gibt die Eignung einer Methode an, Gesunde auch als solche zu erkennen. Sie wird errechnet, indem der Anteil der richtig negativen Ergebnisse Datenauswertung 43 durch die Gesamtzahl der gesunden Probanden geteilt wird. Das bedeutet: Spezifität = d / (c + d). Der positive Vorhersagewert gibt an, wie sicher bei einem positiven Testergebnis auch die entsprechende Erkrankung zu erwarten ist. Er wird errechnet, indem man die Anzahl der Patienten mit einem richtig positiven Testergebnis durch die Anzahl der insgesamt positiven Testergebnisse dividiert. Das bedeutet: Positiver Vorhersagewert = a / (a + c). Der negative Vorhersagewert gibt an, wie sicher ein Patient mit einem negativen Testergebnis auch tatsächlich nicht an der entsprechenden Erkrankung erkrankt ist. Er wird errechnet, indem die Anzahl der nicht Erkrankten mit negativem Testergebnis durch die Anzahl der negativen Testergebnisse dividiert wird. Negativer Vorhersagewert =d / (b + d). Die Genauigkeit gibt an, wie groß die Sicherheit ist, dass das Ergebnis der Untersuchung sich als richtig erweist. Sie wird errechnet, indem die Anzahl der Patienten mit einem richtigen Testergebnis (richtig positiv und richtig negativ) durch die Gesamtzahl der Patienten dividiert wird. Genauigkeit =(a + d) / (a + b + c + d). Auswertung des entnommenen Gewebepunktionsmaterials Insgesamt wurden von uns im Zeitraum zwischen Januar 1999 und Mai 2000 insgesamt 101 Patienten in die Studie eingeschlossen. Bei diesen wurden 106 Feinnadelpunktate entnommen. Bei 6 Punktaten konnte nur nicht verwertbares Material entnommen werden. 4 dieser Punktate stammten aus Lymphknoten, eine aus einem Tumor des Magens und eine aus dem Pankreas. Die übrigen 100 verwertbaren Punktate wurden im Rahmen der Studie ausgewertet. Die punktierten Strukturen lassen sich zunächst in drei Hauptgebiete einteilen: 1) Das Gebiet des Mediastinums, dazu gehören: a) Ösophagus b) Hilusnahe Lungenbezirke c) Mediastinale posteriore Lymphknoten d) Andere mediastinale Raumforderungen/Prozesse Datenauswertung 44 2) Das Gebiet des Magens und seiner umliegenden Strukturen, dazu gehören: a) Magen b) Nebennieren c) Leber mit Gallenblase und intrahepatischen Gallengängen d) Umliegende Lymphknoten 3) Das Gebiet des Duodenums und seiner umliegenden Strukturen, dazu gehören: a) Duodenum b) Pankreas c) Distaler Gallengang mit Papilla Vateri d) Umliegende Lymphknoten Tabelle 5: Übersicht der für die Studie entnommenen Punktate richtig richtig falsch falsch insgesamt positiv negativ negativ positiv Auswertbare Punktionen 100 41 48 11 0 Mediastinum 33 17 13 3 0 Magen und Umgebung 23 12 9 2 0 Duodenum und Umgebung 44 12 26 6 0 Von den 100 auswertbaren Feinnadelpunktaten waren 41 richtig positiv, 48 richtig negativ und 11 falsch negativ. Falsch positive Ergebnisse kamen nicht vor. Daraus ergibt sich als Gesamt-Ergebnis für die endosonographische Feinnadelpunktion (EUS-FNP): Sensitivität: 78% Spezifität: 100% Positiver Vorhersagewert: 100% Negativer Vorhersagewert: 81% Genauigkeit: 89% Datenauswertung 45 Mediastinum Insgesamt wurden Mediastinums 33 im Bereich Punktate mit des der Feinnadel entnommen, davon 26 aus regionären Lymphknoten, 4 aus der Ösophaguswand, 2 aus der Lunge und eine aus einer mediastinalen Zyste. Die Patienten litten an folgenden Erkrankungen: 1) Ösophagus: a) Ösophaguskarzinom Abbildung 3: Schema zur Darstellung mittels endosonographischer Feinnadelpunktion erreichbarer 2) Lunge a) Plattenepithelkarzinom b) Adenokarzinom 3) Mediastinale Lymphknoten a) Reaktive lymphatische Hyperplasie/ Anthrakose b) Non-Hodgkin-Lymphome c) Metastasen aus Bronchialkarzinomen d) Metastasen aus Kolonkarzinomen e) Metastasen aus Ösophaguskarzinomen f) CUP-Syndrom g) Tuberkulose 4) Mediastinale Raumforderung a) Mediastinale Zyste mediastinaler Prozesse Datenauswertung 46 Tabelle 6: Aus dem Bereich des Mediastinums entnommene Punktate richtig richtig falsch falsch insgesamt positiv negativ negativ positiv insgesamt 33 17 13 3 0 Ösophagus 4 3 1 0 0 Lunge 2 2 0 0 0 26 12 11 3 0 1 0 1 0 0 Mediastinum regionäre Lymphknoten Andere Raumforderungen Von den insgesamt 33 Punktaten des Mediastinums stimmten 17 mit der Enddiagnose des Patienten und der vorher vermuteten Erkrankung überein, waren also richtig stimmten positiv. mit 13 der Enddiagnose überein, wobei der Patient allerdings nicht an der vorher vermuteten Krankheit erkrankt war, waren also richtig negativ. Bei 3 Punktaten konnte die Abbildung 4: Endosonographische Darstellung einer Lymphknotenmetastase bei Ösophaguskarzinom mit links oben sichtbarer Feinnadel vorhandene Erkrankung im Feinnadelpunktat nicht festgestellt werden, also falsch negativ. Punktate, die als krankhaft eingestuft wurden ohne das Vorliegen der entsprechenden Erkrankung, also falsch positiv gewesen wären, kamen nicht vor. Datenauswertung 47 Daraus ergibt sich für die Punktate des Mediastinums und seiner Umgebung: Sensitivität: 85% Spezifität: 100% Positiver Vorhersagewert: 100% Negativer Vorhersagewert: 81% Genauigkeit: 90% Magen und Umgebung Insgesamt wurden im Bereich des Magens und seiner Umgebung 23 Punktate entnommen, davon 9 aus den umliegenden Lymphknoten, 6 aus der Leber mit intrahepatischen Gallengängen und Gallenblase, 4 aus der Magenwand und 4 aus den Nebennieren. Die punktierten Patienten litten an folgenden Erkrankungen: 1) Magen a) Magenkarzinom b) Gastritis mit Ulzera 2) Nebennieren a) Granulozytäre Entzündungen b) Metastasen aus Bronchialkarzinomen c) Metastasen aus Magenkarzinomen 3) Leber mit intrahepatischen Gallengängen und Gallenblase a) Hepatozelluläres Karzinom b) Metastasen aus Bronchialkarzinomen c) Metastasen aus kolorektalen Karzinomen d) Tuberkulose Datenauswertung 48 4) Regionäre Lymphknoten a) Lymphatische Hyperplasie/ Anthrakose b) Non-Hodgkin-Lymphome c) CUP-Syndrom d) Metastasen aus cholangiozellulären Karzinomen e) Metastasen aus Gallenblasenkarzinomen Tabelle 7: Aus dem Bereich des Magens und seiner Umgebung entnommene Punktate richtig richtig falsch falsch insgesamt positiv negativ negativ positiv Magen und Umgebung 23 12 9 2 0 Magen 4 2 2 0 0 Leber 6 4 1 1 0 Nebennieren 4 3 1 0 0 Regionäre Lymphknoten 9 3 5 1 0 Von den 23 Punktaten aus dem Magen und seiner Umgebung stimmten bei insgesamt 12 die beim Patienten vermutete Erkrankung, der histologische Befund und die Enddiagnose überein, sie waren also richtig positiv. Bei 9 Punktaten stimmten die Histologie und die Enddiagnose überein, wobei sie allerdings besagten, dass der Patient die vermutete Krankheit nicht hatte, also richtig negativ. Bei 2 Punktaten wurde Abbildung 5: Lymphknotenmetastase am Truncus coeliacus bei einem Magenkarzinom (T2 N1) die vermutete und auch tatsächlich bestehende Erkrankung im Punktat nicht erkannt, also falsch negativ. Punktate in denen Erkrankungen festgestellt wurden, ohne dass der Patient an ihnen erkrankt war, also falsch positiv, gab es keine. Datenauswertung 49 Daraus ergibt sich für die Punktate des Magens und seiner Umgebung: Sensitivität: 85% Spezifität: 100% Positiver Vorhersagewert: 100% Negativer Vorhersagewert: 81% Genauigkeit: 91% Duodenum und Umgebung Insgesamt wurden aus dem Bereich des Duodenums 44 Feinnadelpunktate entnommen, und zwar 36 aus dem Pankreas, 5 aus regionären Lymphknoten und 3 aus dem distalen Gallengang. Die punktierten Patienten litten an folgenden Erkrankungen: 1) Pankreas a) akute Pankreatitis b) chronische Pankreatitis c) Pankreaskarzinom d) Pankreasabszess 2) Distale Gallenwege a) Papillenkarzinome 3) Regionäre Lymphknoten a) Lymphatische Hyperplasie/ Anthrakose b) Non-Hodgkin-Lymphome c) CUP-Syndrom Datenauswertung 50 Tabelle 8: Aus dem Bereich des Duodenums und seiner Umgebung entnommene Punktate richtig richtig falsch falsch insgesamt positiv negativ negativ positiv Duodenum und Umgebung 44 12 26 6 0 Pankreas 36 10 21 5 0 Distaler Gallengang 3 1 2 0 0 Regionäre Lymphknoten 5 1 3 1 0 Abbildung 6: Kleines, lokal begrenztes Abbildung 7: Diffus ausgeprägte, chronische Pankreaskarzinom am Korpus-Kopf- Pankreatitis bei endosonographischer Übergang in endosonographischer transduodenaler Darstellung des transduodenaler Darstellung Pankreaskopf-Korpus-Übergangs Abbildung 8: Zyto-histologische Darstellung von maligne entarteten Zellen aus einem Pankreaskarzinom Datenauswertung 51 Von den 44 Punktaten aus der Umgebung des Duodenums stimmten bei insgesamt 12 Punktaten vermutete Erkrankung, histologischer Punktatbefund und Enddiagnose des Patienten überein, also richtig positiv. Bei 26 der Punktate stimmten der histologische Befund und die Enddiagnose des Patienten überein, die allerdings zeigten, dass der Patient nicht an der vermutete Erkrankung litt, also richtig negativ. Bei 6 Punktaten stimmte der zytologische Befund nicht mit der Enddiagnose des Patienten überein, also falsch negativ. Keiner der zytologischen Befunde war positiv für eine Erkrankung, wenn diese nicht vorhanden war, also falsch positiv. Daraus ergibt sich für die Punktate der Umgebung des Duodenums: Sensitivität: 66% Spezifität: 100% Positiver Vorhersagewert: 100% Negativer Vorhersagewert: 83% Genauigkeit: 86% Einzelauswertung der Punktate aus der Duodenumumgebung ohne Pankreas Am häufigsten wurden aus der Umgebung des Duodenums Gewebeproben aus dem Pankreas entnommen, so dass ihre Bewertung die der anderen Punktate massgeblich mitbestimmt. Da es jedoch, wie weiter unten erläutert wird, bei der Beurteilung von Pankreaspunktaten einige Schwierigkeiten gibt, sind hier die anderen Punktionsorte noch einmal gesondert dargestellt, um eine Einzelauswertung zu ermöglichen. Das Punktionsmaterial wurde bei insgesamt acht Patienten aus dem distalen Gallengang und regionären Lymphknoten entnommen. Datenauswertung 52 Tabelle 9: Punktate der Duodenumumgebung ohne Pankreaspunktate richtig richtig falsch falsch insgesamt positiv negativ negativ positiv Distaler Gallengang 3 1 2 0 0 Regionäre Lymphknoten 5 1 3 1 0 Von diesen stimmten bei 8 Punktaten insgesamt vermutete 2 Erkrankung, histologischer Befund und Enddiagnose überein, also richtig positiv, bei 5 stimmten Enddiagnose und histologischer Befund überein, nicht jedoch die vermutete Erkrankung, also richtig Abbildung 9: Transgastrale Darstellung eines negativ. Bei einem konnte die Nebennierenadenoms vermutete und in der Enddiagnose bestätigte Erkrankung histologisch nicht nachgewiesen werden, also falsch negativ. Falsch positive Ergebnisse kamen nicht vor. Daraus ergibt sich für Feinnadelpunktate der Duodenumumgebung: Sensitivität: 66% Spezifität: 100% Positiver Vorhersagewert: 100% Negativer Vorhersagewert: 80% Genauigkeit: 87% Datenauswertung 53 Gesamtauswertung Lymphknoten Da zur Bestimmung der Genauigkeit der Befunde aus der Feinnadelbiopsie von uns noch ein zusätzliches Verfahren, nämlich die Durchflusszytometrie, verwendet wurde, sind hier alle aus den Lymphknoten stammenden Befunde noch einmal zusammen dargestellt. Insgesamt wurde aus 40 Lymphknoten Punktionsmaterial entnommen. Tabelle 10: Gesamtübersicht der Lymphknotenpunktate richtig richtig falsch falsch insgesamt positiv negativ negativ positiv Lymphknoten insgesamt 40 16 19 5 0 Mediastinale Lymphknoten 26 12 11 3 0 Gastrische Lymphknoten 9 3 5 1 0 Duodenale Lymphknoten 5 1 3 1 0 Von diesen 40 Lymphknotenpunktaten wurden in histologisch 16 Punktaten Erkrankungen festgestellt, die der zuvor vermuteten Erkrankung entsprachen und sich durch die Enddiagnose des Patienten bestätigten, also richtig positiv. In 19 Punktaten wurde die vorher vermutete histologisch Erkrankung Abbildung 10: Transösophageale Darstellung einer Lymphknotenmetastase bei Bronchialkarzinom nicht nachgewiesen, was aber mit der Enddiagnose übereinstimmte, also richtig negativ. Datenauswertung 54 In 5 Punktaten ließ sich histologisch die Erkrankung nicht bestimmen, obwohl der Patient an ihr litt, also falsch negativ. Fälschlicherweise in den Punktaten diagnostizierte Erkrankungen kamen nicht vor, also keine falsch positiven Befunde. Daraus ergibt sich für die endosonographische Punktion von Lymphknoten: Sensitivität: 76% Spezifität: 100% Positiver Vorhersagewert: 100% Negativer Vorhersagewert: 79% Genauigkeit: 87% Datenauswertung Auswertung 55 der Patientenbefragung über die endosonographische Untersuchung Insgesamt wurden 46 Studienteilnehmer, davon 18 weibliche und 28 männliche Patienten, über ihre während und nach der endosonographischen Untersuchung empfundenen Schmerzen, ihr allgemeines Unwohlsein während und nach der Untersuchung und ihre Angst vor der Untersuchung befragt. Die Ergebnisse wurden anhand einer visuellen Analogskala ausgewertet. Die Tabelle zeigt die von den Patienten erfragten Ergebnisse getrennt nach weiblichen und männlichen Patienten. 1 entspricht dem Minimalwert, was Schmerzen, allgemeines Unwohlsein und Angst betrifft, während 6 dem Maximalwert mit starken Schmerzen, starkem Unwohlsein bzw. starker Angst entspricht. Tabelle 11a-c: Auswertung der visuellen Analogskalen der Patienten bezüglich Schmerz, allgemeinem Unwohlsein und Angst weiblich 1 2 3 4 5 6 Durchschnitt Schmerzen 13 5 0 0 0 0 1,27 Allgemeines Unwohlsein 10 4 3 1 0 0 1,72 Angst 3 2 1 8 2 2 3,55 1 2 3 4 5 6 Durchschnitt Schmerzen 24 3 1 0 0 0 1,17 Allgemeines Unwohlsein 14 5 6 1 0 2 2,07 Angst 16 5 1 5 0 1 1,96 1 2 3 4 5 6 Durchschnitt Schmerzen 37 8 1 0 0 0 1,21 Allgemeines Unwohlsein 24 9 9 2 0 2 1,93 Angst 19 7 2 13 2 3 2,58 männlich insgesamt Datenauswertung 56 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Schmerzen weiblich Durchschnitt Allgemeines Unwohlsein männlich Durchschnitt Angst insgesamt Durchschnitt Abbildung 11: Schmerzen, allgemeines Unwohlsein und Angst der Patienten im Überblick Aus der Tabelle geht hervor, dass die Patienten während der Untersuchung kaum Schmerzen hatten. Dies ist wohl vor allem dem vor der Untersuchung zur Sedierung und Schmerzbefreiung gegebenen Midazolam zu verdanken. Auch das allgemeine Unwohlsein nach der Untersuchung wurde eher im niedrigen Skalenbereich angegeben. Der Bereich von 4 bis 6 wurde nur von 4 Patienten angegeben, die nach der Untersuchung unter stärkeren Kreislaufstörungen litten. Die Angst war gerade bei den weiblichen Patienten zum Teil stark ausgeprägt, wobei allerdings gesagt werden muss, dass die Patienten nach der Untersuchung angaben, es sei gar nicht so schlimm gewesen. Die Angaben von Patienten, die ihre zweite endosonographische Skalenbereich von 1 bis 2. Untersuchung bekamen lagen alle im Datenauswertung 57 Komplikationen bei der endosonographischen Feinnadelpunktion Als einzige mittelschwere Komplikation wurde bei der Feinnadelpunktion des Pankreas einer Patientin eine relevante extraluminale Blutung ausgelöst, die allerdings konservativ zum Stillstand gebracht werden konnte. Es wurden keine Blutkonserven für die Patientin benötigt. Zu einem Rezidiv kam es nicht. Weitere Blutungen in größerem Umfang bei anderen Patienten traten nicht auf. Als weitere Komplikation beklagten 12% der Patienten nach dem Aufwachen Schwindelgefühl, Kreislaufprobleme und zum Teil leichte Kopfschmerzen, die wohl am ehesten auf eine Kreislaufschwäche nach der Gabe von Midazolam zurückzuführen sein dürften. Diese Symptome bildeten sich bei allen Betroffenen rasch ohne weitere Maßnahmen im Laufe des Untersuchungstages zurück. Auswertung der FACS-Ergebnisse Bei der Durchflusszytometrie wurden folgende zwei Parameter auf ihre Aussagekraft in Bezug auf die im Lymphknoten erwarteten Befunde getestet: die Leichtkettenrestriktion und der Zytokeratingehalt im entsprechenden Lymphknotenpunktat. Wie bereits oben erwähnt, ist bei gesunden B-Lymphozyten in einem Lymphknoten der Antigengehalt an λ und κ ausgeglichen (λ = κ). Bei der malignen Proliferation einer monoklonalen B-Lymphomzelle kommt es jedoch zum Überwiegen einer der beiden Leichtketten und somit zur Leichtkettenrestriktion, welche mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen werden kann. Dabei ist es wichtig, den Leichtkettennachweis in Doppelfärbung mit Anti-CD19-Antikörpern zu führen. So lässt sich ein Lymphknotenbefall durch B-NHL, welche ja immerhin 85% der NHL ausmachen, diagnostizieren. Zytokeratinfilamente bilden eine zytologische Gruppe der intermediären Filamente (10 nm-Filamente) als Bestandteile des Zellskeletts epithelialer Zellen. Sie inserieren oft an den Desmosomen und sind somit an der Verbindung der Zellen Datenauswertung 58 beteiligt. Zudem finden sie sich in den Z-Scheiben der quergestreiften Muskulatur. Da man sie nur in epithelialen Zellen (z.B. Gewebe aus Pankreas, Leber, Magen) findet, lassen sie sich gut zur Diagnose von Karzinommetastasen in Lymphknoten heranziehen, da diese mesenchymalen Ursprungs sind, also selbst kein Zytokeratin enthalten. Um die Richtigkeit der aus der Durchflusszytometrie stammenden Ergebnisse bewerten zu können, wurden diese mit der Histologie des entsprechenden Lymphknotenpunktats und der Entlassungsdiagnose des entsprechenden Patienten verglichen und so ausgewertet. Im Zeitraum Februar 1998 bis November 2001 konnte von insgesamt 47 Patienten im Alter von 32 bis 84 Jahren Material in 49 Lymphknotenpunktionen gewonnen und ausgewertet werden. Da einige Patienten, deren Lymphknotenmaterial durchflusszytometrisch untersucht worden war, nur ambulant aus anderen Häusern kamen und sich von ihnen daher häufig keine weiteren Daten erheben ließen, konnten ihre FACS-Ergebnisse nicht im Zusammenhang mit anderen Untersuchungsergebnissen bewertet werden. Diese Patienten mussten deshalb ausgeschlossen werden. Bei 9 der 47 Lymphknotenpunktate war entweder zu wenig Material vorhanden oder das Material in der histologischen Untersuchung nicht repräsentativ, so dass das FACS nicht bewertet werden konnte. Die restlichen Punktate wurden auf Leichtkettenrestriktion und Zytokeratingehalt durchflusszytometrisch untersucht und danach ausgewertet. In den untersuchten Lymphknoten fanden sich außer den B-Zell-Non-HodgkinLymphomen auch ein T-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom, Metastasen von nichtkleinzelligen und kleinzelligen Bronchialkarzinomen und von Karzinomen des Magens, des Pankreas und der Niere, sowie Keimzelltumoren, ein Leiomyosarkom und nicht-tumoröse Erkrankungen wie Sarkoidose, Tuberkulose, Mastozytose und Lymphknoten mit PAP-Kl. II (z.B. Lymphatische Hyperplasie oder Anthrakose). Datenauswertung 59 Leichtkettenrestriktion Wie bereits oben beschrieben kommt eine Leichtkettenrestriktion nur in Lymphknoten vor, die Zellen eines B-NHLs enthalten. Sie ist somit für diese spezifisch und sollte nur bei Patienten mit einem B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom entweder für κ oder für λ positiv sein. Insgesamt 8 Punktate enthielten B-NHL-Zellen. 29 Punktate stammten von Patienten mit Erkrankungen ohne Leichtkettenrestriktion, bei einem der Punktate wurde nur eine Zytokeratin- nicht aber eine Leichtkettenbestimmung durchgeführt. Tabelle 12: Leichtkettenrestriktion in den durchflusszytometrisch untersuchten Präparaten Leichtkettenrestriktion λ κ keine insgesamt B-NHL-Punktate 2 6 0 8 andere Punktate 0 0 30 30 Bei den 8 Lymphknotenpunktaten, in denen histologisch ein B-NHL diagnostiziert wurde, wurde auch durchflusszytometrisch eine Leichtkettenrestriktion gefunden und zwar in 6 der Fälle für κ und in zweien für λ, welche histochemisch bestätigt wurde. Hingegen wurde in keinem der anderen 29 Punktate eine Leichtkettenrestriktion im FACS gefunden. Daraus ergäbe sich für die FACS-Analyse der Leichtkettenrestriktion bei allerdings niedriger Fallzahl von NHL eine Sensitivität von 100%, was aber weiter untersucht werden muss. Zytokeratinbestimmung Wie bereits oben erwähnt, findet sich Zytokeratin nur in Zellen epithelialen Ursprungs, kann also in Lymphknoten nur gefunden werden, wenn diese Karzinomzellen enthalten. In unseren Lymphknotenpunktaten handelte es sich dabei um Metastasen aus Pankreas- und nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen. Datenauswertung 60 Bei dieser Gruppe sollte also die Zytokeratinuntersuchung positiv ausfallen, bei allen anderen negativ. Insgesamt gab es 6 Punktate aus mit Karzinommetastasen befallenen Lymphknoten und 26 Punktate mit anderen Befunden, an denen eine Zytokeratinmessung durchgeführt wurde. Tabelle 13: Zytokeratinhaltige Befunde in den durchflusszytometrisch untersuchten Präparaten CK-Befund Punktate mit epithelialem pos. neg. fragl. insgesamt 3 1 0 4 4 22 2 28 Karzinom andere Punktate Nur bei 3 der 4 Karzinommetastasenpunktate wurde der Zytokeratingehalt richtig erkannt, bei einem wurde er nicht erkannt. 22 der übrigen 28 Punktate wurden richtig als Zytokeratin-negativ erkannt, 2 waren fraglich positiv und die restlichen 4 zeigten einen falsch positiven Zytokeratinbefund. Daraus ergäbe sich für die Zytokeratinmessung bei niedriger Fallzahl eine Sensitivität von 75% bei einer Spezifität von 84%, was ebenfalls näher untersucht werden muss. Diskussion 61 Diskussion Zum ersten Mal wurde die Endosonographie 1980 vorgestellt. Seitdem hat sie sich als bildgebendes Verfahren auf immer neuen Gebieten bewährt. Die Kombination von hochfrequentem Ultraschall und endoskopischer Sicht ermöglicht eine viel genauere Untersuchung von Organstrukturen, als sie vor der Einführung endosonographischer Geräte erreicht werden konnte. Durch das Hinzukommen der Feinnadel und der damit verbundenen Möglichkeit zur Aspiration von suspekt erscheinendem Gewebe und dessen histologischer Untersuchung wurde ein weiterer Schritt zur Diagnosesicherung erreicht. Zudem ist die Feinnadelpunktion eine sehr wenig invasive und damit patientenfreundliche Methode zur Gewinnung von Gewebe aus Mediastinum, Retroperitoneum, Pankreas, Leberpforte und den Wänden der Hohlorgane. Ziel unserer Studie war die Beurteilung endosonographischer Untersuchungen mit Feinnadelpunktion bei Erkrankungen des oberen Gastrointestinaltraktes und des Mediastinums unter klinischen Bedingungen. Studienort war das Knappschaftskrankenhaus in Bochum-Langendreer. Es sollten beurteilt werden: • die prospektive, longitudinale Erfassung aller interventionellen Endosonographie-Untersuchungen im Gastrointestinaltrakt und im Mediastinum mit Punktion, • die Erfassung der Treffsicherheit, Korrektheit, Sensitivität und Spezifität der Methode bei der Abklärung von benignen und malignen Befunden, • die Wertigkeit der Zytologie mit Immunhistochemie sowie von FACS-Analysen zur Leichtkettenrestriktion aus tumorverdächtigen Läsionen. Allgemeine Ergebnisse Die Untersuchungsergebnisse der endosonographischen Feinnadelbiopsie insgesamt zeigten gute bzw. zufriedenstellende Ergebnisse in Bezug auf Sensitivität, Spezifität, positiven und negativen Vorhersagewert sowie Genauigkeit in den von uns durchgeführten Punktionen. Auffallend war, dass im Bereich von Diskussion 62 Mediastinum und Magen bessere Ergebnisse erzielt wurden als im Bereich des Duodenums und Pankreas. Die Ergebnisse von Spezifität und positivem Vorhersagewert lagen dabei in allen Auswertungsbereichen bei 100%, erklärbar durch die den Untersuchungen zu Grunde liegenden diagnostischen Fragestellungen. In den meisten Fällen handelte es sich um die Diagnostik von Malignomen. Das entnommene Gewebematerial wurde daraufhin vom Zyto-Pathologen auf neoplastische Zellen untersucht, welche bei einem Teil der Präparate aufgrund verschiedener Ursachen, z.B. die Aspiration von nekrotischem Tumorgewebe, nicht dargestellt werden können, so dass es zu vereinzelten falsch negativen Befunden kommen kann. Hingegen kommt es extrem selten zur Diagnose von malignen Zellen, ohne dass diese vorhanden sind. Derartige falsch positive Befunde kamen erfreulicherweise in dieser Serie nicht vor. In ähnlich aufgebauten Studien sind diese Ergebnisse demnach reproduzierbar. Insgesamt sind unsere Ergebnisse mit denen aus bereits publizierten Studien gut vergleichbar. Sie schneiden jedoch vor allem in Bezug auf die Sensitivität etwas schlechter ab. Grund für diese Diskrepanzen sind am ehesten unterschiedliche Rahmenbedingungen. So herrschten als Hintergrundbedingungen die Routinebedingungen eines großen Krankenhauses. Die Patienten wurden daher nicht nach vorher genau umrissenen Kriterien für ein bestimmtes Krankheitsbild selektiv ausgewählt, wie dies in der experimentellen Forschung möglich ist. Zudem handelte es sich um Untersuchungen im klinischen Alltag eines Krankenhauses mit den entsprechenden Engpässen, wie zum Beispiel Zeitmangel und störenden Einflüssen durch zusätzliche Aufgaben im täglichen Klinikablauf. Zu dieser Klinikroutine gehört zudem auch das Zusammenspiel wechselnder Mitarbeiter, so dass die Zusammenarbeit während der endosonographischen Untersuchung durch gelegentlich wechselnde Faktoren bestimmt wurde. Bei dem Studien-Auswerter handelte es sich um eine geblindete Person, die sich bei der Auswertung der Ergebnisse vor allem auf schriftliche Untersuchungsbefunde sowie Arztbriefe beziehen konnte. Bei der Auswertung der Untersuchungsergebnisse zeigte sich eine deutliche Zunahme der bei den Punktionen erzielten richtigen Ergebnissen. Dies führen wir vor allem auf den mit der Zahl der durchgeführten Feinnadelpunktionen Diskussion 63 zunehmenden Lernerfolg beim Untersucher zurück. Je mehr Erfahrung der Untersucher hat, desto eher gelingt es ihm, aus Malignomgewebe, welches zusätzlich zu den entarteten Zellen meist auch nekrotisches und entzündliches Gewebe aufweist [2], die neoplastischen Zellen zu aspirieren. Da sich die Endosonographie insgesamt gut zum T- und N-Staging sowie zur Erkennung mancher Fernmetastasen eignet, kann bei einem neoplastischen Befund häufig im gleichen Untersuchungsgang ein Therapiekonzept entworfen werden. Allerdings machen die Ergebnisse der Sensitivität zwischen 66% und 85% und des negativen Vorhersagewertes von 81% eine Kontrolle der negativen Befunde durch kurzfristige Verlaufskontrollen oder zusätzliche Untersuchungen (z.B. abdomineller US, CT, MRT) zur Bestätigung des negativen Ergebnisses nötig, um bei einigen Patienten nicht eine zum Untersuchungszeitpunkt noch kurable Erkrankung zu übersehen. Dennoch ist die Endosonographie kleiner und/oder schwer zugänglicher mediastinaler oder retroperitonealer Prozesse in ihrer Aussagekraft bezüglich Malignität und Benignität den meisten anderen Untersuchungsmethoden überlegen. Das mit Hilfe der endosonographischen Feinnadelpunktion aus Lymphknoten gewonnene Gewebe wurde zum Teil von uns zusätzlich durchflusszytometrisch (FACS) untersucht, da wir eine Verbesserung der diagnostischen Aussagekraft durch diese zusätzliche Zelluntersuchungsmethode erhofften. Untersucht wurden zwei Parameter - die Leichtkettenrestriktion, die wie oben beschrieben ein Zeichen für einen Lymphombefall vom B-Zell-Typ des Lymphknotens ist und das Zytokeratin, welches auf die Lymphknotenmetastase eines epithelialen Malignoms hindeuten kann. Die histologische Untersuchung von Lymphknotengewebe mit Verdachtsdiagnose Lymphom ist oft problematisch, da die Unterscheidung von reaktiven und maligne entarteten Lymphozyten schwierig ist. Obwohl großzellige NHL-Lymphome auf einer morphologischen Basis diagnostiziert werden können, erlauben zytologische Kriterien keine sichere Diagnose von kleinzelligen und einigen gemischtzelligen Lymphomen. Besonders in diesen Fällen ist der Einsatz einer weiteren Untersuchung wie der FACS sinnvoll. Diskussion 64 Insgesamt wurde Material aus 38 auswertbaren Lymphknotenpunktaten auf eine Leichtkettenrestriktion untersucht, wobei nur 8 durch ein B-Zell-Non-HodgkinLymphom befallen waren. Von diesen 8 Präparaten zeigten 2 eine Leichtkettenrestriktion für λ, 6 für κ, was sich anhand immunologischer Färbungen als richtig erwies. In den nicht von B-Zell-Lymphomen befallenen Lymphknoten zeigte sich hingegen keine Leichtkettenrestriktion. Somit erreichten wir bei Sensitivität, Spezifität, positivem und negativem Vorhersagewert das vorläufige Ergebnis von 100%. Da es sich jedoch nur um eine sehr niedrige Fallzahl handelt, müssen diese Ergebnisse in einer größer angelegten Studie sicher reproduziert werden. In einer von Ribeiro et al. an einer größeren Anzahl Patienten durchgeführten Studie wurde eine Sensitivität von 86%, eine Spezifität von 100% und eine Genauigkeit von 89% erreicht. In dieser Studie konnte eine deutliche Verbesserung der Ergebnisse durch den Einsatz der Durchflusszytometrie gegenüber der rein zytologischen und histologischen Untersuchung gezeigt werden [32]. Einer unserer Patienten mit einem κ-exprimierenden B-Zell-Lymphom war ca. 2 Monate vor der histologischen Lymphomdiagnose schon einmal endosonographisch punktiert worden. In dem gewonnenen Lymphknotenmaterial hatte sich durchflusszytometrisch bereits eine Leichtkettenrestriktion gezeigt, während der Lymphknoten jedoch zyto-histologisch mit PAP Kl II und als „reaktiv“ bewertet wurde. Bei der zweiten Punktion im Verlauf ließ sich durch FACS die vordiagnostizierte Leichtkettenrestriktion bestätigen und diesmal ergab auch die Histologie den Nachweis eines niedrig malignen Non-Hodgkin-Lymphoms. In dieser Untersuchung war die Durchflusszytometrie zuerst in der Lage gewesen, den Lymphknotenbefall zu erkennen So geben die Ergebnisse unserer Studie einen Hinweis darauf, dass die Durchflusszytometrie als Zusatzuntersuchung aus der endosonographischen Feinnadelpunktion die Diagnosesicherheit von B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen erhöhen kann. Zeigt sich bei der FACS-Analyse eine Leichtkettenrestriktion, liegt mit großer Sicherheit im entsprechenden Lymphknoten die Invasion durch ein BZell-Lymphom vor. Da die B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome etwa 90% der gesamten Non-Hodgkin-Lymphome ausmachen, könnte somit durch eine routinemäßige Untersuchung auf Leichtkettenrestriktion mittels Diskussion 65 Durchflusszytometrie ein großer Anteil diagnostiziert werden. Eine Einschränkung ergibt sich jedoch in Bezug auf T-Zell- und Hodgkin-Lymphome. Ihre durchflusszytometrische Erkennung ist weit schwieriger. Die Diagnose von T-ZellLymphomen ist bisher nur anhand der Darstellung aberranter Kombinationen von T-Zell-Rezeptoren möglich. Die Hodgkin-Lymphome lassen sich aber histologisch durch die Darstellung von Steinberg-Reed-Zellen besser diagnostizieren. Für die Untersuchungen tumorsuspekten des Lymphknoten Zytokeratingehalts in Gewebematerial aus wurde aus insgesamt 32 pathologischen Lymphknoten auswertbares Material gewonnen und auf seinen Zytokeratingehalt untersucht. Leider fanden sich nur in 4 Punktaten letztendlich epitheliale Metastasen, so dass auch hier nur eine kleine Stichprobe mit eingeschränkter Aussagekraft vorhanden ist. Für die Bestimmung des Zytokeratins ergibt sich eine Sensitivität von 75% und eine Spezifität von 84%. Somit scheint die Zytokeratinmessung möglicherweise eine Hilfestellung bei der Diagnose von Metastasen aus epithelialen Tumoren in den Lymphknoten bieten zu können, was näher zu untersuchen bleibt. Vergleicht man diese Werte mit denen der Leichtkettenrestriktion, zeigt sich, dass die Messmethode des Zytokeratins noch weiter optimiert werden muss. Ein Problem bei der Auswertung des Zytokeratingehaltes könnte dabei die externe Kontamination des Lymphknotengewebes durch Zellmaterial aus dem Stichkanal sein. In diesem Fall müsste eine Verbesserung der Gewebeentnahme beziehungsweise –gewinnung erfolgen, wie zum Beispiel eine gezielte äußerliche Säuberung der Feinnadel vor Entnahme des Probenmaterials. Darüber hinaus sollte der erste Milliliter des punktierten Materials verworfen werden. Durch die zusätzliche Bestimmung weiterer durchflusszytometrisch messbarer Zelloberflächenmerkmale metastatischen könnte epithelialen eine Zellen und bessere Unterscheidung akzidentiell im zwischen Punktionsmaterial befindlichen Zellen erreicht werden. So könnte im Zusammenspiel mit der histologischen Gewebeuntersuchung eine Verbesserung der diagnostischen Genauigkeit bei der Unterscheidung zwischen benigner und maligner Diskussion Lymphknotenvergrößerung 66 möglich werden. Natürlich ist auch die durchflusszytometrische Untersuchung, da sie ja von der Güte des gewonnenen Gewebematerials abhängig ist, ähnlich wie die Histologie der Feinnadelbiopsie stark von den Fähigkeit des die Gewebeproben entnehmenden Arztes abhängig. Spezielle Ergebnisse Ösophagus und Mediastinum Da ein großer Teil der im Bereich von Ösophagus und Mediastinum durchgeführten Feinnadelpunktate aus Lymphknoten stammt, bestimmt dieses Material sehr maßgeblich die Ergebnisse. Materialgewinnung aus suspekten Arealen des Ösophagus erfolgt weiterhin durch die Gastroskopie, die Punktion von mediastinalen Prozessen (Lymphknoten, Tumoren, Zysten, Abszessen) gehört aber zu den neuen Errungenschaften der Endosonographie. Die meisten Lungenabschnitte selbst sind jedoch der EUS-FNP nicht zugänglich, da sie zu weit vom Lumen des Gastrointestinaltraktes entfernt liegen. Um so wichtiger ist die zyto-/histologische Bewertung von mediastinalen Prozessen, da sie sehr gut zur Diagnose und zum Staging von Tumoren in diesem Bereich genutzt werden kann. Vereinzelte Schwierigkeiten bei der Auswertung und Erkennung von Lymphknoten sind im Teil „Lymphknoten“ beschrieben. Besonders der Nutzen bei Diagnostik und Staging von Ösophaguskarzinomen und ihrer Infiltrationstiefe, sowie die äußerst sensitive Erkennung von Metastasen in den umgebenden Lymphknoten haben der Endosonographie in der letzten Zeit zu immer häufigerem diagnostischem Einsatz verholfen [4]. Diese Vorzüge kommen auch in unseren Untersuchungen zum Ausdruck. So wurden die aus dem Ösophagus entnommenen Proben allesamt richtig beurteilt. Die Ergebnisse unserer Untersuchungen liegen etwas niedriger als die in bereits publizierten Studien. In der Literatur werden die Sensitivität der EUS-FNP und die Diagnosegenauigkeit in diesem Bereich mit bis zu 96% angegeben [12]. Diskussion 67 Dennoch zeigt sich die EUS-FNP Methoden wie der Computertomographie in ihrer Aussagekraft bezüglich der Diagnostik und dem lokalen Staging von mediastinalen malignen Prozessen überlegen. Operative Untersuchungsmethoden wie Mediastinotomie, Thorakoskopie und Thorakotomie erzielen zwar ähnlich gute Ergebnisse bei der Diagnose neoplastischer Erkrankungen, da auch Gewebeproben gewonnen werden können und sie einen guten Überblick bieten, sind jedoch wesentlich invasiver, erfordern eine Narkose, sind für den Patienten stärker belastend und mit einem wesentlich höheren Risiko (Mortalität !) behaftet. Allerdings kann mittels der endosonographischen Feinnadel kein Gewebe aus para- und praetrachealen Arealen entnommen werden. Die Mediastinoskopie als weniger invasives Verfahren kann dagegen als gute Ergänzung zur EUS-FNP bei prätrachealen und subzervikalen Prozessen gelten. Weitere Vorteile der Endosonographie beim mediastinalen Lymphknoten-Staging gegenüber anderen Methoden sind zudem: 1) Endoluminale Tumoren führen nicht zu falsch-positiven Ergebnissen wie bei der Bronchoskopie 2) Der Einsatz ultradünner Feinnadeln (22 G, 25 G) vermindert das Risiko einer Tumoraussaat 3) Die Möglichkeit, posteriore und aortopulmonale Lymphknoten zu erreichen, welche sonst chirurgisch angegangen werden müssten Diskussion 68 Magen, Retroperitoneum und Leber Aus dem Bereich des Magens und seiner Umgebung wurden insgesamt 23 Feinnadelpunktate entnommen. Dabei wurde eine Sensitivität von 85%, eine Spezifität von 100%, ein positiver Vorhersagewert von 100% und ein negativer Vorhersagewert von 81% erreicht. Auch diese Werte sind mit denen der Literatur gut vergleichbar [7]. Ähnlich wie im Ösophagus werden weiterhin viele Magentumoren endoskopisch mit Standardmethoden primär aufgedeckt. Die Endosonographie ist hierbei eine ergänzende Methode zur Aufdeckung intramuraler und submuköser Prozesse sowie zum Staging von Magentumoren, da sie den Vorteil der genauen Bestimmung der Infiltrationstiefe hat. Falsch negative Ergebnisse kamen in unserer Studie bei Tumoren des Magens nicht vor. Aus der Leber wurden alternativ zu anderen (perkutanen) diagnostischen Untersuchungsmöglichkeiten insgesamt 6 Gewebeproben von uns entnommen. Eine Schwierigkeit bei der Punktion der Leber mittels EUS-FNP ist, dass nicht alle Segmente erreicht werden können. Unsere Studien-Ergebnisse gleichen denen aus einer bereits publizierten Studie zu diesem Thema [28]. Dort wurde eine Sensitivität von 94%, eine Spezifität von 100%, ein positiver Vorhersagewert von 100% und ein negativer Vorhersagewert von 74% erreicht. Aufgrund unserer Untersuchungsergebnisse halten wir den Einsatz der EUS-FNP zur Abklärung von Leberherden bei unklarem Befund, kleinen Tumoren (<2,5 cm) und erhöhtem Blutungsrisiko anstelle der Punktion mit einer größeren perkutanen Nadel für individuell sehr vorteilhaft. Zum einen kann im Rahmen der endosonographischen Ultraschalluntersuchung der Herd genauer eingesehen werden, zum anderen ist die Punktion mit der feinen Nadel auch für den Patienten ungefährlicher, da es wesentlich seltener zu Blutungen kommt und das Risiko einer Tumorzellaussaat entlang des Stichkanals wesentlich geringer ist. Unsere Ergebnisse zeigen eine hohe Genauigkeit bei der histologischen Auswertung der Leberpunktate, so dass die EUS-FNP der Leber inzwischen routinemäßig in die UntersuchungsAlgorithmen unserer Patienten miteinbezogen wird. Diskussion 69 Im Bereich des oberen linksseitigen Retroperitoneums wurde in unseren Untersuchungen lediglich Material aus den Nebennieren entnommen. Deren Untersuchung zeigt eine große Genauigkeit, wobei es sich jedoch um eine geringe Anzahl Punktate handelte. Diese Genauigkeit ist wichtig, um zwischen Metastasen, Primärtumoren und benignen Prozessen unterscheiden und so die richtigen therapeutischen Entscheidungen treffen zu können [29]. So kann die Endosonographie auch in diesem, bei anderen Untersuchungsmethoden schlecht einsehbaren Bereich eingesetzt werden. Pankreas und Duodenum Über 80% unserer Punktate aus der Duodenalregion stammen aus dem Pankreas. Daher sind diese Gewebeproben maßgeblich an dem Ergebnis der Auswertung beteiligt. Bei den untersuchten Läsionen handelte es sich vor allem um Pankreaskarzinome und chronische Pankreatitiden. Die übrigen Gewebeproben stammen aus den regionären Lymphknoten und der Gallengangsregion. Die Ergebnisse der Sensitivität in diesem Bereich sind weniger gut als die im Bereich des Mediastinums und Magens. Sie bleiben stärker hinter den bisher in der Literatur beschriebenen Ergebnissen für diesen Bereich zurück. So ist in der Literatur bei der Erkennung von chronischen Pankreatitiden in einer in unserem Haus durchgeführten Studie eine Sensitivität von 97%, eine Spezifität von 67 %, ein positiver Vorhersagewert von 94% und ein negativer Vorhersagewert von 100% erreicht worden [61]. Auch die Ergebnisse bei der Erkennung von Karzinomen liegen in der Literatur höher [16], [17]. Die gegenüber Ösophagus und Magen niedriger liegende Sensitivität der EUSFNP-Untersuchung von Pankreasläsionen hat mehrere Ursachen. Zum einen ist es bei den leichteren Formen der chronischen Pankreatitis schwierig, diese mittels Ultraschall differentialdiagnostisch sicher zu erkennen, da es sich dabei zumeist nur um minimale Veränderungen der Organstruktur handelt. Bei schwererer chronischer Pankreatitis ist es für den Endoskopeur schwierig, zwischen entzündlichem und paraneoplastischem Geschehen zu unterscheiden. Da die chronische Pankreatitis den präkanzerösen Reiz für die Entstehung eines Diskussion 70 Pankreasneoplasmas bilden kann und Karzinome häufig peritumoral ausgeprägte Entzündungsreaktionen aufweisen, kommen Entzündung, Fibrose und Neoplasma häufig nebeneinander vor. In diesen Fällen ist es oft schwierig, die „passende Stelle“ für eine Gewebeentnahme zu finden bzw. aus dem desmoplastischen „harten“ Gewebe die eindeutig neoplastischen Zellen mittels Feinnadel zu aspirieren. Somit ist es zyto-histologisch schwierig, zwischen chronischer Pankreatitis und einem pankreatischen Neoplasma zu unterscheiden. Vielfach liegt stark entzündliches Material vor, in dem sich nur wenige neoplastisch entartete Zellen befinden. So sind häufig zusätzliche Färbemethoden zur genaueren Differenzierung notwendig, die nicht in jeder Pathologie routinemäßig durchgeführt werden. Demnach ist die Auswertung durch einen im Umgang mit Pankreaspunktaten erfahrenen Pathologen für die Diagnosesicherheit wichtig. Dennoch ist die Endosonographie bei der Abklärung chronisch-pankreatitischer und neoplastischer Pankreaserkrankungen ein wichtiges Instrument, inzwischen etwa gleichbedeutend mit der ERCP, welche bisher als der Goldstandard angesehen wurde. Die EUS ermöglicht eine gute Beurteilung aller Teile der Bauchspeicheldrüse, vom Kopf über den Corpus bis zum Schwanz, wobei sowohl Parenchym wie auch das Gangsystem detailliert dargestellt werden können. Da auch kleinere Läsionen sichtbar werden, ist eine frühe Karzinomerkennung möglich. Zudem können Lymphknotenvergrößerungen, die Infiltrationstiefe in die umliegenden Organe so wie Gefäßeinbrüche beurteilt werden. Somit können die für die Therapieplanung wichtigsten Fragen beantwortet werden. Da die Endosonographie zudem auch eine wenig invasive und komplikationsarme Untersuchung darstellt, vor allem gemessen am Risiko einer postinterventionellen Pankreatitis, sollte sie zur weiteren Abklärung unklarer Schmerzustände im Bereich des Oberbauchs und Überwachung chronischer Pankreatitiden großzügig eingesetzt werden. Zur Optimierung der Untersuchungsergebnisse ist die Untersuchung des Gewebematerials durch einen erfahrenen Pathologen notwendig. Im Bereich der Gallengänge wird die Endosonographie von uns hauptsächlich zum Auffinden tumoröser Veränderungen eingesetzt. Zwar ist es möglich, auch Gallensteine an verschiedenen Lokalisationen zu diagnostizieren, da jedoch keine Diskussion 71 Möglichkeit zu ihrer Therapie besteht, bleibt die Choledocholithiasis zunächst die Domäne des abdominellen Ultraschalls und der ERCP. Die tumorösen Veränderungen in diesem Bereich hingegen lassen sich vor allem in ihren Anfangsstadien häufig am ehesten mit Hilfe der Endosonographie erkennen. Durch den intraluminalen Ultraschall ist eine exakte Darstellung auch kleiner Wandveränderungen und zusätzlich noch die Möglichkeit einer Beurteilung über das Maß der Ausbreitung durch die Neoplasie gegeben. Diese bietet eine Hilfestellung bei Entscheidungen über die anschließende Therapie. In unseren Untersuchungen handelte es sich bei den Gallengangstumoren um 3 Raumforderungen im Bereich der Papille, die allesamt richtig erkannt wurden. Allerdings nimmt die Beurteilbarkeit des Gallenganges von distal nach proximal ab, so dass kleinere proximale Läsionen weniger gut erkennbar sind. Lymphknoten Insgesamt wurde Feinnadelpunktion bei 40 Gewebe Patienten aus suspekt mittels endosonographischer erscheinenden Lymphknoten entnommen. Diese Lymphknoten befanden sich im Bereich des Mediastinums sowie um den Magen und das Duodenum. Mittels zyto-histologischer Untersuchung erreichten wir eine Sensitivität von 76%, eine Spezifität von 100% und eine Genauigkeit von 87%. Die Genauigkeit der EUS beim lokalen Lymphknotenstaging wird in der Literatur mit zwischen 60 bis 80% angegeben [18]. Eine neuere Studie von Wiersema [12] zeigt eine Sensitivität von 96%, eine Spezifität von 100%, eine Genauigkeit von 98%, einen negativen Vorhersagewert von 94% und einen positiven Vorhersagewert von 100%. Unsere Studien erzielen somit Ergebnisse, die denen der Literatur vergleichbar sind. Die Ergebnisse der Literatur zeigen, dass die Genauigkeit bezüglich des N-Stagings etwas unter der des T-Stagings der meisten Tumoren liegt. Die Patienten in besser abschneidenden Studien waren oft mehr selektioniert und wiesen häufig etwas einfacher zu erreichende oberflächliche oder große retroperitoneale, hepatische oder mediastinale befallene Lymphknoten auf. Die Erkennung von Lymphknoten unter 20 mm und an abgelegener Stellen ist hingegen schwieriger. Diskussion 72 Die Schwierigkeit des N-Stagings liegt vor allem darin, den von neoplastischen Zellen befallenen Lymphknoten mit Hilfe des endoskopischen Ultraschalls zu identifizieren und gezielt zu punktieren. Insgesamt gibt es dabei vier Hauptmerkmale: verminderte Echointensität, scharf abgehobene Ränder, eine runde Kontur und eine Größe von >1 cm. Sind alle vier Merkmale erfüllt, ist in circa 80% von einem metastatischen Befall auszugehen. Allerdings zeigen nur ungefähr 25% aller metastatisch infiltrierten Lymphknoten alle Merkmale. Zudem zeigt eine Studie von Bhutani, dass die genannten Echostrukturen eher auf Lymphknoten im gastrointestinalen Bereich, jedoch weniger auf solche, die durch Lungenkarzinommetastasen befallen sind, zutreffen [18]. So kommt es vor, dass ein reaktiv vergrößerter Lymphknoten punktiert wird und ein negatives Ergebnis erzielt, während andere Lymphknoten der gleichen Region bereits befallen sind, dem Untersucher aber unauffällig erscheinen. Daher ist es von großer Relevanz, möglichst bei jeder Untersuchung Material aus mehreren Lymphknoten zu entnehmen, um das Risiko, einen metastatisch veränderten Lymphknoten zu übersehen, zu senken, so dass eine höhere Sicherheit erzielt werden kann. Zudem bleibt zu bedenken, dass gerade Lymphome häufig heilbar sind und oft junge Menschen betreffen. Dementsprechend sind frühes Erkennen und genaues Staging ausgesprochen wichtig. So sollte die Endosonographie routinemäßig bei Verdacht auf ein Lymphom in Zusammenschau mit den weiteren Untersuchungen wie Computertomographie und Ultraschall eingesetzt werden. Basierend auf den Ergebnissen unserer Studie, kann die Indikation für die endosonographische Untersuchung von Lymphknoten wie folgt gestellt werden: 1) Diagnostische Untersuchung von tief liegenden suspekten Lymphknoten, welche durch perkutane Punktion nicht erreichbar sind 2) Zum Staging perigastrointestinaler Lymphknoten, deren Aspiration ein Upstaging des Malignoms mit therapeutischen Konsequenzen bedingen könnte (v.a. beim Ösophagus- und Pankreas-Karzinom) 3) Therapiebewertung 4) Auswahl von Arealen für die chirurgische Intervention Diskussion 73 Akzeptanz und Komplikationen Die Auswertung der Patientenbefragung über Angst vor der Untersuchung, dabei empfundene Schmerzen und später aufgetretene Beschwerden anhand einer visuellen Analogskala zeigten zwar vor allem bei den weiblichen Patienten ein etwas erhöhtes Maß an Angst vor der Untersuchung, allgemeines Unwohlsein und während der Untersuchung empfundene Schmerzen wurden jedoch eher gering bewertet. Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass zwar viele Patienten vor Beginn der Untersuchung Angst vor dem unbekannten körperlichen Eingriff hatten, die Endosonographie aber von den Patienten gut toleriert wird und als wenig belastende Untersuchung zu werten ist. Hinzu kommt, dass Patienten bei denen bereits zu einem früheren Zeitpunkt schon einmal Gewebematerial mit Hilfe einer endosonographisch geleiteten Feinnadel entnommen worden war, ihre Angaben bezüglich der Angst vor dieser Untersuchung im Bereich zwischen 1 und 2 ansiedelten. Die Gabe von Midazolam, einem kurzwirksamen Benzodiazepin, zur Sedierung und Analgesierung der Patienten hat sicherlich einen großen Beitrag zur Toleranz der Patienten in Bezug auf die endosonographische Untersuchung geleistet. So wird sowohl das Schlucken des Endoskopie-Schlauches, wie auch die Probenentnahme nicht mehr als so unangenehm empfunden. Inzwischen werden in unserer Klinik alle endosonographischen Eingriffe routinemäßig unter Midazolam-Sedierung durchgeführt, soweit keine Kontraindikationen vorhanden sind. Dieses Vorgehen bietet zusätzlich für den Untersucher den Vorteil, dass er in Ruhe die richtige Stelle für die Gewebeentnahme auswählen kann und nicht durch Bewegungen des Patienten bei der Entnahme behindert wird. Ein weiteres Zeichen für die insgesamt gute Verträglichkeit der endosonographischen Feinnadelpunktion ist die sehr niedrige Komplikationsrate, die auch in der zu diesem Thema verfassten Literatur beschrieben wird [1]. In einer Studie von Wiersema et al., durchgeführt an insgesamt 457 Patienten wurden 5 relevante bzw. schwerwiegende Komplikationen (1,1%) beschrieben. Diese beinhalteten retroperitoneale sowie im Bereich von Duodenum und perigastral [1] aufgetretene Blutungen. Diskussion 74 Die einzige schwerwiegende Komplikation bei den insgesamt 106 von uns durchgeführten Feinnadelpunktionen war eine lokale Nachblutung aus dem Stichkanal. Diese trat bei einer Patientin während der Gewebeentnahme aus einer Raumforderung im Bereich des Pankreas auf. Die Blutung sistierte ohne endoskopische oder chirurgische Intervention spontan. Die Gabe von Fremdblut wurde zur Versorgung der Patientin nicht benötigt. Auch eine Rezidivblutung trat nicht auf, so dass man zusammenfassend sagen kann, dass es sich nicht um eine bedrohliche Komplikation handelte. Weitere größere Blutungen mit einem Umfang von mehr als ca. 50 ml traten bei keinem der übrigen Patienten auf, so dass die Blutungskomplikationsrate mit denen aus anderen Studien zu vergleichen ist. Bei insgesamt 12 Punktionen klagten die Patienten nach dem Aufwachen über leichte Schwindelgefühle, Kreislaufprobleme und zum Teil leichtgradige Kopfschmerzen, die sich aber im Laufe des Tages besserten. Diese Symptomatik führen wir auf die während der Untersuchung verabreichte Midazolam-Medikation zurück. Häufig ist es schwierig, individuell die kleinstmögliche Dosierung zu finden, bei der der Patient optimal sediert und analgesiert ist, um so optimale Verhältnisse für die Untersuchung zu schaffen. Ein gewisser Medikamentenüberhang bleibt daher nicht aus. Da sich diese Symptome jedoch ohne therapeutische Maßnahmen bis zum nächsten Tag vollständig zurückbildeten, kann hier von eher leichtgradigen Komplikationen gesprochen werden. Die Gabe von Midazolam (und noch mehr von Disoprivan) hat, wie bereits oben beschrieben, einen sehr positiven Effekt auf die Untersuchung. Wir halten daher den Einsatz dieser Medikamente bei der EUS-FNP für absolut indiziert, da die positiven Effekte die negativen klar überwiegen. Zusammenfassend soll hier noch einmal festgehalten werden, dass sich bei unseren Untersuchungen eine sehr niedrige Komplikationsrate ergab. Im Vergleich hierzu wäre eine chirurgische Intervention zur Erlangung von Gewebeproben aus den inneren Organen mit wesentlich größerem Aufwand, höherer Invasivität und Mortalität, höherer Patientenbelastung und größerer Komplikationsrate einhergegangen. Dies gilt besonders im Thoraxbereich, wo die Alternativen insbesondere aus Thorakoskopie und Mediastinoskopie bestehen, welche mit einem hohen Risiko für den Patienten behaftet sind. Diskussion 75 Neue und zukünftige Ausblicke Zur weiteren Verbesserung der endosonographischen Untersuchungsmethoden sind in den letzten Jahren sowohl Instrumente weiterentwickelt wie auch neue konstruiert worden. Mit ihrer Hilfe soll es möglich werden, einzelne - bereits durch die Endosonographie untersuchbare - Organsysteme noch besser beurteilen zu können. Zudem wird versucht, die Bildqualität weiter zu verbessern und die durch den Ultraschall gewonnenen Bilder für den Untersucher noch leichter interpretierbar zu machen. Auch im therapeutischen Bereich ist die Endosonographie inzwischen einsetzbar. So können zum Beispiel maligne Tumoren experimentell im Rahmen multimodaler Therapiekonzepte auch lokal chemotherapeutisch mit palliativer Intention behandelt werden. Eine weitere Neuentwicklungen besteht im Einsatz von mit Ultraschallkopf versehenen Sonden. Besteht eine hochgradige Stenose des Ösophagus, zum Beispiel durch ein Karzinom, ist es in vielen Fällen schwierig, das Endoskop über diese hinweg in den Magen vorzuschieben. Zur vollständigen Beurteilung der Infiltration in das umliegende Gewebe ist ein Staging u.U. jedoch dennoch klinisch wichtig. Deshalb wurde eine neue dünne Ultraschall-Sonde entwickelt, welche einfacher durch die ösophageale Stenose vorgeschoben werden kann, und somit in vielen Fällen die vollständige Untersuchung doch noch ermöglicht. Dieses neue Ultraschallsondensystem ist einfacher zu benutzen und genauer in der Beurteilung der Invasionstiefe oberflächlicher Karzinome [38]. Hochfrequente Ultraschallsonden erreichen dabei eine ausreichende Genauigkeit bei der Erkennung der Invasionstiefe früher Karzinome [39], so dass sie als zuverlässige Instrumente für die endoskopische Resektion mukosaler Tumoren unter Sicht gelten können. Zudem sind neue Techniken für dreidimensionale UltraschallBildsysteme in Entwicklung. Auch bei der Diagnostik von Gallengangskarzinomen sollen mit Hilfe einer intraduktalen Minisonde noch treffsicherere Ergebnisse zu erzielen sein. Vor allem weiter proximal gelegene kleine Läsionen sind durch die bisher eingesetzten Diskussion 76 endosonographischen Methoden nur schwer diagnostizierbar. Eine frühe Diagnosestellung ist jedoch für das Überleben des Patienten obligat. Zur Sensitivitätsverbesserung sind hochfrequente Ultraschallsonden entwickelt worden. Allerdings ist es bisher für den Endoskopeur schwierig, diese durch die Papilla Vateri und den Ductus choledochus bis zur Gallenblase vorzuschieben. Diese Technik soll eine Hilfestellung bei der Diagnostik von Gallenblasenveränderungen, vor allem kleiner polypoider Läsionen, bieten [40]. Eine weitere Verbesserung der endosonographischen Technik erhofft man sich von IDUS, einer neuen hochfrequenten Ultraschallsonde, die allerdings noch in der Entwicklung befindlich ist. Sie kann zur genauen Demonstration einer möglichen Tumorinfiltration in das Pankreas oder die Portalvene eingesetzt werden, ohne die bei der ERCP notwendige Papillotomie [41]. Dennoch bleibt die Diagnose der histologischen Infiltration eines T1-Tumors in die fibröse Schicht des perimuskulären locker-verbundenen Gewebes schwierig [42]. Somit sind weitere technische Verbesserungen der Sonde und Studien mit Vergleichen von histologischen Befunden und endosonographischen Ultraschallbildern nötig. Als Erweiterung dieses Systems sind das System des dreidimensionalen intraduktalen Ultraschalls (IDUS) [43] und das des dreidimensionalen intraportalen endovaskulären Ultraschalls in Entwicklung [44]. Theoretisch haben diese neuen Systeme bei der Diagnose von Erkrankungen des Gallengangsystems Vorteile gegenüber dem zweidimensionalen IDUS und dem intravaskulären Ultraschall. Allerdings ist zunächst eine Weiterentwicklung der Ultraschallsonden und bildgebenden Software vonnöten. Zur weiteren Verbesserung der pankreatischen Untersuchung von endosonographischer Seite wurde eine Hochfrequenz-Ultraschallsonde entwickelt. Diese ist dünn genug, um sie bis in den Pankreasgang vorzuschieben [45]. Intraduktaler Ultraschall ist nützlich bei der Differenzierung zwischen kleinen pankreatischen Veränderungen, Strikturen des Pankreasganges und intraduktalen papillären Tumoren. Der klinische Wert der IDUS auf dem Gebiet der pankreatischen Untersuchung wird sich in der nahen Zukunft herausstellen. Zudem werden in naher Zukunft neue Kontrastmittel zur intravenösen Applikation während der endosonographischen Untersuchung erhältlich sein. Diese werden Diskussion 77 möglicherweise die Genauigkeit des Farbdopplers erhöhen [46] und damit einen besseren Einblick in den neoplastischen Einbruch in Gefäße und die Blutversorgung der Tumoren erlauben. Im letzten Jahr wurde erstmals auch der therapeutische Nutzen der Endosonographie in Studien publiziert. Eine relativ neue Methode liegt in der Nutzung interventioneller Endosonographie in Form einer endosonographisch gesteuerten abdominellen Plexus-zoeliacus-Neurolyse Schmerzen, zum bei Beispiel Patienten infolge eines mit refraktären fortgeschrittenen Pankreaskarzinoms [47], [48]. Dabei wird der Plexus coeliakus gezielt durch die lokal injizierte 98%-absolute Alkohol-Lösung derart zerstört, dass deutlich weniger Schmerzsignale weitergeleitet werden können. Zur Behandlung einer Achalasie des Ösophagus ist es möglich, mit Hilfe der Feinnadel unter endosonographischer Sicht Botulinum-Toxin noch gezielter in den unteren Ösophagusspinkter zu injizieren und somit eine Minderung des Spasmus zu erreichen [49]. Diese führt bei dem Patienten zu einer Abnahme der Dysphagie. Auch bei der Steroidinjektion zur Behandlung refraktorischer ösophagealer Strikturen spielt die Endosonographie möglicherweise eine relevante Rolle [50], wobei sowohl die Botulinum-Toxin-Injektion, wie auch die Steroid-Injektion in regelmäßigen Abständen wiederholt werden müssen. Eine genaue klinische Bewertung dieser Verfahren steht aber noch aus. Des weiteren wird seit kurzer Zeit eine direkte zytoreduktive Lokal-Behandlung fortgeschrittener Pankreaskarzinome mit Hilfe von Feinnadelinjektionen von chemotherapeutischen, gentechnischen oder immunotherapeutischen Substanzen bzw. die Radiofrequenz-Ablation in die Karzinomherde und umgebenden Lymphknotenmetastasen in ersten experimentellen klinischen Studien getestet. Eine neue Generation linearer Schallkopf Endoskope (Pentax FG-3830) macht die endosonographisch gesteuerte Drainage von Pseudozysten in einem einzigen Untersuchungsschritt möglich. In mehreren Studien hat sich diese Methode als sicher, nebenwirkungsarm und erfolgreich erwiesen [51], [52], [53]. Besonders günstig ist, dass vor der Drainage alle wichtigen Informationen gesammelt werden Diskussion 78 können, wie zum Beispiel das Vorhandensein von blutungsgefährdeten Varizen und der genaue Abstand zwischen Zyste und Gastrointestinaltraktwand. Welche Rolle in der Therapie die Endosonographie (EUS-FNP) in der Zukunft einnehmen wird, wird sich in den nächsten Jahren herausstellen, wenn die zur Zeit noch in Erprobung befindlichen Techniken auf klinische Tauglichkeit getestet sind. Die Applikation von Substanzen über die endosonographisch gesteuerte Feinnadel scheint jedenfalls zur Zeit vor allem auf dem Gebiet der lokalen Chemotherapie von Tumoren bzw. der Botulinum-Toxin-Injektion zur Muskelentspannung durchaus vielversprechend. Eine weitere diagnostische Hilfestellung bringt die Durchflusszytometrie. Die bisher übliche Untersuchung des mit der Feinnadel gewonnenen Gewebes ist in ihrer Treffsicherheit noch zu stark subjektiv. Nun bestehen aber Möglichkeiten, das zelluläre und humorale Material zusätzlich auf eine andere Art zu beurteilen. So können Zellen anhand ihrer verschiedenen Oberflächenmarker mit Hilfe von gegen diese gerichteten Antikörpern genau auf ihre Zugehörigkeit zu bestimmten Populationen und Subpopulationen untersucht und diagnostiziert werden. Somit wird vor allem die Suche nach malignen Lymphdrüsen-Tumoren sensitiver. Bei Verdacht auf Lymphknotenbefall durch Lymphome wird diese Methode bereits eingesetzt, ist allerdings bisher hauptsächlich bei der Suche nach B-Zell-NonHodgkin-Lymphomen hilfreich. Auch die Anwendung der Durchflusszytometrie in Kliniken und Laboratorien hat in der letzten Zeit immer weitere Verbreitung gefunden. Nach den zunächst eher mühsamen Anfängen ist mit der Entwicklung von verkäuflichen monoklonalen Flurochrom-Antikörpern, die zu vergleichbaren Ergebnissen der verschiedenen Laboratorien geführt haben, ein bahnbrechender Fortschritt erzielt worden, der auch die klinische Nutzung dieser Methode ermöglicht hat. Antikörper zur Bestimmung immer neuer Zellmerkmale kommen auf den Markt, so dass eine immer feinere Differenzierung zwischen Subpopulationen einzelner Zellreihen ermöglicht wird. Damit kann eine immer genauere Unterscheidung zwischen regelrechten und veränderten Zellen erfolgen. Noch verstärkt wird diese Entwicklung durch den Bau von Durchflusszytometern mit einem dualen Laser- Diskussion System, 79 welche die gleichzeitige Beurteilung von immer mehr Oberflächenmerkmalen ermöglichen. Im klinischen Bereich wird die FACS-Analyse bisher als Basis für RoutineUntersuchungen zur Differenzierung von Oberflächenmarkern auf gesunden und neoplastischen Zellen eingesetzt, die zur Zeit von Leukämie-Klassifikationen bis zur Überwachung von CD4-T-Zell-Verlust bei HIV-Patienten reichen [34]. Ein weiterer Fortschritt ist die neu entwickelte Technik der Zellseparation durch das FACS-Gerät. So können durch entsprechend ausgestattete Geräte nicht nur Zellen qualitativ und quantitativ beurteilt werden, sondern auch im gleichen Untersuchungsgang separiert und weiteren Untersuchungen zugeführt werden. Insgesamt lässt sich sagen, dass durch die Zellseparation mit Hilfe des FACS die größte Reinheit und Reproduzierbarkeit gegenüber anderen Verfahren erreicht werden kann. Allerdings bestehen drei große Nachteile gegenüber den bisher eingesetzten Massensortiergeräten: 1) die relativ langsame Geschwindigkeit des Sortierens, 2) die Notwendigkeit des Gebrauchs von Fluorochromen und Antikörpern, welche die Zellvitalität und –funktion verändern können, 3) die Tatsache, dass die FACS-Geräte nicht idealerweise dafür entworfen wurden, Zellen unter sterilen Bedingungen auf einer routinemässigen Basis zu isolieren. Zudem sind die notwendigen Geräte weiterhin ziemlich teuer [54]. Die meisten der in den Laboratorien eingesetzten Durchflusszytometer sind nur zur Analyse von Zellen geeignet. Dennoch lassen sie sich auch zum Sortieren von Zellen einsetzen, nachdem diese nach bestimmten Kriterien analysiert wurden. Bis heute sind dazu zwei verschiedene Methoden entwickelt worden, die mechanische und die häufiger eingesetzte elektrische Methode. Die neueren mechanisch arbeitende Geräte, in denen die Zellisolation durch Flussturbulenzen, die eine Flussveränderung induzieren, erreicht wird, sind Diskussion 80 allerdings mit einer maximalen Sortiergeschwindigkeit von 500 Zellen pro Minute sehr langsam. Ihre Vorteile gegenüber den elektrisch arbeitenden Geräten sind jedoch: 1) es handelt sich um ein geschlossenes System, so dass es weder zu Verschmutzung noch zu Verdunstung kommen kann, 2) das Sortieren mit diesen Instrumenten ist einfacher, 3) sie sind leicht an andere Geräte zu adaptieren, so dass die Charakterisierung der isolierten Zellen sofort nach dem Sortieren durch ein zweites Feld von Detektoren erfolgen kann. Zusammenfassung 81 Zusammenfassung Hintergrund: Die endosonographische Feinnadelpunktion (EUS-FNP) findet seit einigen Jahren international und in Deutschland immer weitere Verbreitung zur Diagnostik maligner und benigner Erkrankungen von im Bereich des Gastrointestinaltraktes gelegenen pathologischen Läsionen. Wir untersuchten prospektiv die Treffsicherheit und Sicherheit dieser Methodik im klinischen Alltag. Methoden: An 100 Patienten wurden insgesamt 106 Gewebeproben mit Hilfe einer endosonographisch Studienteilnehmern gesteuerten handelte es sich Feinnadel um entnommen. Patienten des Bei den Knappschafts- Krankenhauses Bochum und umliegender Krankenhäuser, die aus diagnostischen Gründen einer endosonographischen Untersuchung unterzogen wurden. Besonders wichtig war die sichere Unterscheidung zwischen malignen und benignen Prozessen zur weiteren Therapieplanung. Als Untersuchungsgerät wurde ein longitudinales Endoskop HITACHI FG-34UX mit 22G-Aspirationsnadeln genutzt. Als Referenzverfahren dienten bildgebende Verfahren (MRT, CT), Ultraschall, sowie - wenn durchgeführt - die chirurgische Materialgewinnung (OP). Ergebnisse: In 6 Fällen der insgesamt 106 entnommenen Punktate (5,6%) konnte kein suffizientes Material gewonnen werden. Insgesamt wurde eine Sensitivität von 78%, Spezifität von 100%, eine Genauigkeit von 84% und ein positiver und negativer Vorhersagewert von 100% und 81% erreicht. Die höchste Treffsicherheit fand sich bei mediastinalen und retroperitonealen Läsionen, während Pankreasläsionen und intramurale Veränderungen schlechter abschnitten. Zudem wurden Einzelauswertungen im Bereich von Mediastinum, Magen, Duodenum und der Lymphknoten vorgenommen, deren zusätzliche Untersuchung mittels Durchflusszytometrie (FACS) eine weitere Auswertungsverbesserung ergab. Schlussfolgerung: Die endosonographische Feinnadelpunktion verbessert im klinischen Alltag die Diagnostik auch kleiner bzw. sonst unerreichbarer benigner und maligner Erkrankungen. Es handelt sich um eine treffsichere und sichere Methode. Bei der Untersuchung von malignen Lymphomen bringt der Einsatz der Durchflusszytometrie (FACS) verbesserte Ergebnisse. Literaturverzeichnis 82 Literaturverzeichnis 1) Wiersema, M.J., Vilman, P., Giovannini, M., et al. Endosonographic-guided fine-needle aspiration biopsy: Diagnostic accuracy and complication assessment. Gastroenterology 112(4), 1087-95 (1997) 2) American Society for Gastrointestinal Endoscopy Training Committee. Guidelines for Training in Endoscopic Ultrasound. Gastrointest. Endosc. 49, 829-33 (1999) 3) Yanai, H., Matsumoto, Y., Harada, T., et al. Endoscopic ultrasonography and endoscopy for staging depth of invasion in early gastric cancer: a pilot study. Gastrointest. Endosc. 46, 212-6 (1997) 4) Botet, J.F., Lightdale, C.J., Zauber, A.G., Gerdes, H., Urmacher, C., Brennan, M.F. Preoperative staging of esophageal cancer: Comparism of endoscopic US and dynamic CT. 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Hollerbach für die Aufgabenstellung, die Unterstützung bei der Durchführung der Untersuchungen und die Anregungen zur Auswertung und Darstellung der Untersuchungsergebnisse. Bedanken möchte ich mich auch bei Herrn PD Dr. U. Graeven für die Anregungen, das Material zum durchflusszytometrischen Teil und die kritische Durchsicht meiner Arbeit. Außerdem danke ich allen Mitarbeitern des Knappschaftskrankenhauses in Bochum, die durch ihren Einsatz zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Lebenslauf 93 Lebenslauf Name: Wilhelms Vorname: Inga Geburtsdatum: 27.12.1975 Geburtsort: Düsseldorf Eltern: Karin Wilhelms, geb. Terhorst; Manfred Wilhelms Familienstand: ledig Staatsangehörigkeit: deutsch Wohnort: Querenburger Str. 9, 44789 Bochum Schulausbildung: 1982 - 1986 Grundschule unter den Eichen, Düsseldorf 1986 - 1990 Marie- Curie- Gymnasium, Düsseldorf 1990 - 1995 Städt. Gymnasium Gevelsberg, Gevelsberg Mai 1995 Allgemeine Hochschulreife Studium: 1995-2001 Studium der Medizin an der Ruhr-Universität in Bochum August 1997 Physikum August 1998 Erstes Staatsexamen August 2000 Zweites Staatsexamen Oktober 2000 – Praktisches Jahr an der Universitätsklinik Oktober 2001 St. Josef Hospital in Bochum Oktober 2001 Drittes Staatsexamen Dezember 2001 vorl. Approbation Tätigkeiten: seit 01.12.2001 Ärztin im Praktikum an der Universitätsklinik St. Josef Hospital in Bochum
