iii ergebnisse

Aus der Klinischen Pharmakologie
der Universität Wien
Intratumorale Zytostatika-Konzentrationen und
zytostatischer Effekt
Experimentelle Untersuchung der in vivo-Pharmakokinetik und der
korrespondierenden in vitro-Pharmakodynamik von Methotrexat und
5-Fluorouracil bei Mammakarzinom-Patientinnen und -Patienten
INAUGURAL – DISSERTATION
zur
Erlangung des
Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i.Br.
Vorgelegt 2000
von Julia Bockenheimer
geboren in Worms
Dekan
1. Gutachter
2. Gutachter
Jahr der Promotion
Prof. Dr. rer. nat. M. Schumacher
PD Dr. med. U. Karck
Prof. Dr. med. M. Müller
2002
meinen Eltern
INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG
7
I.1
DIE ZYTOSTATISCHE THERAPIE DES MAMMAKARZINOMS
7
I.2
WIRKUNGSWEISE VON ZYTOSTATIKA IM ALLGEMEINEN
9
I.3
WIRKUNGSWEISE VON METHOTREXAT UND 5-FLUOROURACIL
11
I.4
HINTERGRUND DER VORLIEGENDEN ARBEIT
13
I.5
ZIEL DER VORLIEGENDEN ARBEIT
16
II MATERIAL UND METHODEN
17
TEIL I: IN VIVO-EXPERIMENTE
17
II.1
II.1.1
PATIENTINNEN UND MATERIAL
17
II.1.2
METHODIK DER MIKRODIALYSETECHNIK
18
II.1.3
CHEMISCHE ANALYSE, BERECHNUNGEN UND DATENANALYSEN
29
II.2
TEIL II: IN VITRO-EXPERIMENTE
32
II.2.1
MATERIAL
32
II.2.2
ZUGRUNDELIEGENDE IN VIVO-EXPERIMENTE
33
II.2.3
METHODIK DER ZELLKULTUR
34
II.2.4
METHODIK DES MTT-ASSAYS
36
II.2.5
BERECHNUNGEN UND DATENANALYSEN
37
III ERGEBNISSE
38
III.1
38
TEIL I: IN VIVO-EXPERIMENTE
III.1.1
BESTIMMUNG DER RECOVERY IN VITRO
38
III.1.2
MIKRODIALYSE IN VIVO
39
TEIL II: IN VITRO-EXPERIMENTE
42
III.2
III.2.1
ZYTOSTATISCHE WIRKUNG IN VITRO
42
III.2.2
PK/PD-SIMULATIONSMODELLE
43
III.2.3
ASSOZIATION ZWISCHEN AUCTUMOR UND ZYTOSTATISCHEM EFFEKT
46
III.2.4
PK/PD-SIMULATION UNTER SIMULTANER INKUBATION MIT
III.2.5
METHOTREXAT UND 5-FLUOROURACIL
47
ASSOZIATION ZWISCHEN ZELLZAHL UND ZYTOSTATISCHER WIRKUNG
48
Inhaltsverzeichnis
IV DISKUSSION
50
IV.1
TEIL I: IN VIVO-EXPERIMENTE
51
IV.2
TEIL II: IN VITRO-EXPERIMENTE
55
IV.3
SCHLUSSFOLGERUNG
58
V ZUSAMMENFASSUNG
59
VI LITERATURVERZEICHNIS
60
VII ANHANG
69
VII.1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
69
VII.2 LEBENSLAUF
71
VII.3 DANKSAGUNG
73
Inhaltsverzeichnis
7
I EINLEITUNG
Das Mammakarzinom spielt im klinischen Alltag aufgrund seiner hohen Inzidenz und
Prävalenz (10% aller europäischen Frauen werden im Laufe ihres Lebens an einem
Mammakarzinom
erkranken)
und
der
Lebensbedrohung
für
die
Patientin/
den Patienten eine große Rolle. Bei diesen soliden Tumoren bildet die chirurgische
Intervention die Grundlage für eine kurative Therapie. Chirurgische Maßnahmen
allein sind jedoch oft nicht ausreichend, so daß zusätzlich auch andere
Therapiemodalitäten, wie beispielsweise die Strahlentherapie, die Hormontherapie
oder die Chemotherapie genutzt werden.
I.1 D IE
ZYTOSTATISCHE
T HERAPIE
DES
M AMMAKARZINOMS
Je nach Stadium der Erkrankung und individuellem Zustand der Patientin oder des
Patienten werden beim Mammakarzinom verschiedene Therapieansätze verfolgt.
Eine Therapieform ist die Chemotherapie, die entweder als adjuvante, neoadjuvante
oder palliative Therapie durchgeführt wird.
Unter dem Begriff der adjuvanten Chemotherapie versteht man eine Therapie in
Kombination mit anderen Therapieformen, meist einer vorangehenden Operation.
Ziel der adjuvanten Chemotherapie ist die Zerstörung nach einer Operation noch
verbliebener, bzw. disseminierter Tumorzellen. Das Konzept der adjuvanten Therapie
basiert auf der Erkenntnis, daß sich viele Tumoren vor der Primärtherapie, d.h. der
Operation, bereits über den Blutweg ausgebreitet haben. Diese okkulte, das bedeutet
makroskopisch,
bzw.
radiologisch
nicht
nachweisbare
Streuung,
kann
zur
Manifestation von Fernmetastasen führen, welche lebenswichtige Organstrukturen
befallen und zerstören können und so das weitere Schicksal der Patienten
mitbestimmen. Die adjuvante Chemotherapie spielt im klinischen Alltag eine große
Rolle, da gezeigt werden konnte, daß eine lokale Behandlung des Tumors durch
chirurgische Maßnahmen und/oder Strahlentherapie mit zusätzlicher Chemotherapie
zu einer vergleichsweise größeren Lebensverlängerung führt als eine ausschließlich
lokale chirurgische Behandlung (Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group,
1995).
Einleitung
8
Für die postoperative Chemotherapie kommen besonders Patientinnen und
Patienten mit regionären Lymphknotenmetastasen oder prognostisch ungünstigen
Tumoren in Betracht. Es konnte gezeigt werden, daß durch diese Art der Therapie
besonders bei Frauen vor der Menopause sowohl eine Verlängerung des
rezidivfreien Intervalls (Zeitraum zwischen Primärbehandlung und Wiederauftreten
der Tumorerkrankung) als auch eine Verbesserung der Überlebenschancen zu
erreichen ist.
Sinn der neoadjuvanten Chemotherapie ist die präoperative Verkleinerung eines
primär inoperablen Tumors, der durch die medikamentöse Intervention einer
operativen Therapie zugänglich gemacht wird.
Die palliative Behandlung dient hauptsächlich der Linderung tumorbedingter
Schmerzen. Bei fortgeschrittenen und metastasierten Mammakarzinomen zielt die
Chemotherapie auf eine möglichst lang andauernde Remission (Rückbildung der
Tumormasse), bzw. auf einen Wachstumsstillstand des Tumors. Eine vollständige
Heilung kann durch eine palliative Therapie nicht mehr erreicht werden.
Zahlreiche Zytostatika haben einen nachgewiesenen zytostatischen Effekt beim
Mammakarzinom. Zu den am häufigsten eingesetzten, sogenannten ″first-lineZytostatika″
(Zytostatika
erster
Wahl),
gehören
Cyclophosphamid,
Adriamycin/Epirubicin, Methotrexat, 5-Fluorouracil und Taxol. Zu den seit vielen
Jahren angewandten Chemotherapieschemata beim Mammakarzinom gehört das
CMF-Schema (Cyclophoshamid, Methotrexat und Fluorouracil), (Bonadonna und
Valagussa, 1985; Bonadonna et al., 1995; Tannock et al., 1988; Engelsman et al.,
1991; Brandi et al., 1994; O’Byrne et al., 1998). Aufgrund der in der Literatur
verfügbaren Daten über die langzeitliche Wirksamkeit dieses Schemas wird es nach
wie vor als ″first-line-Therapie″ bei Patienten mit erstmals diagnostiziertem
Mammakarzinom durchgeführt (Hayes et al., 1995).
Einleitung
9
I.2 W IRKUNGSWEISE
VON
Z YTOSTATIKA
IM
A LLGEMEINEN
Der Wirkmechanismus von Zytostatika basiert auf einer Hemmung der Zellteilung.
Prinzipiell befindet sich nur eine gewisse Zellfraktion eines Gewebes im Stadium der
Zellteilung, die sogenannte Wachstumsfraktion. Nur die Zellen dieser Gruppe sind
einer zytostatischen Therapie zugänglich. Die Wachstumsphase des Zellzyklus
gliedert sich in eine G1-Phase (1.Wachstumsphase), eine S-Phase (DNS-SynthesePhase), eine G2-Phase (2.Wachstumsphase) und eine M-Phase (Mitose-Phase). Alle
anderen Zellen befinden sich in der nicht proliferierenden, sogenannten G0-Phase,
aus der sie nur unter besonderen Umständen wieder in den proliferierenden
Zellzyklus zurückkehren.
Viele Zytostatika wirken hauptsächlich in der S-Phase des Zellzyklus. Der Erfolg
einer Therapie ist unter anderem auch davon abhängig, wie groß der Anteil an Zellen
in der empfindlichen S-Phase ist. Je schneller ein Tumor wächst, desto mehr Zellen
befinden sich in dieser Phase. Die Empfindlichkeit eines Gewebes gegenüber
Zytostatika wird also entscheidend durch dessen Proliferationsrate mitbestimmt.
Einfluß auf die Sensibilität eines Gewebes gegenüber verschiedenen Zytostatika hat
darüber hinaus die Tatsache, daß auch ohne zuvorige Zytostatikatherapie
Resistenzen
durch
spontane
Mutationen
entstehen
können,
wodurch
die
zytostatische Wirksamkeit eingeschränkt werden kann. Zur Zeit werden vielfältige
Mechanismen diskutiert, durch die sich Tumorzellen vor zytostatischen Wirkungen
schützen können, wovon folgende experimentell unter der Einwirkung von Zytostatika
nachgewiesen wurden:
•
Überexpression
Transferase
inaktivierender
oder
Enzyme,
Glutathionperoxidase,
wie
beispielsweise
z.B.
bei
Glutathion-S-
alkylierenden
und
Platinverbindungen (Wang und Tew, 1985; Buller et al., 1987; Bellamy et al.,
1991).
•
Verminderte Expression der Topoisomerase II, wodurch die Empfindlichkeit der
Zellen
gegenüber
Anthrachinonen,
Anthrazyklinen
und
anderen
DNS-
interkalierenden Substanzen geschwächt wird (Friche et al., 1991; Chen und
Beck, 1995; Kusumoto et al., 1996).
Einleitung
10
•
Überexpression des ″Multi-Drug-Resistance″-Gens, MDR-I, dessen Produkt, ein
P-Glykoprotein
(Pgp),
als
energieabhängige
Membranpumpe
für
den
Auswärtstransport zahlreicher, vor allem relativ lipophiler, Stoffe sorgt. Die
intrazelluläre
Konzentration
einiger
Zytostatika
(Anthrazykline,
Epipodophyllotoxine, Vinca-Alkaloide u.a.) wird dadurch erniedrigt (Gerlach et al.,
1986; Beck, 1987; Endicott und Ling, 1989; van der Bliek und Borst, 1989;
Shustik et al., 1995).
Da die Anzahl unterschiedlicher Zellklone innerhalb eines Tumors, die Resistenzen
gegen verschiedene Zytostatika ausbilden können, mit zunehmender Zellzahl steigt
und die Heilungschance von Tumoren auch aus diesem Grund umgekehrt
proportional der Anzahl an Tumorzellen ist, sollte eine Therapie möglichst früh
angestrebt werden (Goldie und Coldman, 1979 und 1986).
Aufgrund der angesprochenen Zellmutationen und unterschiedlicher Angriffspunkte
verschiedener Zytostatika im Zellzyklus ist es außerdem sinnvoll, verschiedene
Zytostatika im Rahmen einer Kombinations-Chemotherapie zu applizieren (Goldie
und Coldman, 1979; Cadman et al., 1981; Benz et al., 1983). Durch diese Form der
Therapie kann eine größere Menge teilresistenter Zellklone wirksam bekämpft
werden. Einige Studien konnten zeigen, daß kombinierte Zytostatikatherapien auch
deshalb meist bessere Tumoransprechraten erzielen, da sich verschiedene
Zytostatika gegenseitig direkt in ihrer Wirkung verstärkend beeinflussen können
(Major et al., 1982; Benz et al., 1983; Damon et al., 1989; White, 1995).
Ferner wurde festgestellt, daß die Wirksamkeit von Zytostatika einer Kinetik erster
Ordnung folgt, d.h. es wird immer ein konstanter Prozentsatz von Zellen, die dem
Medikament ausgesetzt sind, getötet, nicht eine konstante Anzahl (Skipper et al.,
1964).
Auf
dieser
Erkenntnis
beruht
die
Therapie
mit
intermittierenden
Behandlungszyklen. Dieser Aufbau der Therapie ist sinnvoll, um pro Therapiezyklus
möglichst viele Zellen zu töten, gleichzeitig aber auch dem restlichen Körper,
insbesondere dem Knochenmark, die Möglichkeit zur Regeneration zu bieten.
Einleitung
11
I.3 W IRKUNGSWEISE
MTX
VON
UND
5-FU
Bei den Zytostatika MTX und 5-FU handelt es sich um sogenannte Antimetabolite. In
dieser Gruppe werden Abwandlungsprodukte natürlicher Stoffe zusammengefaßt, die
aufgrund ihrer Affinität zu Enzymen im Rahmen der Biosynthese von Nukleinsäuren
wirken. Sie entfalten ihre Wirkung hauptsächlich in der S-Phase des Zellzyklus, da zu
diesem Zeitpunkt ein besonders hoher Bedarf an Nukleinsäuren zur DNS-Synthese
besteht. In die Gruppe der Antimetabolite gehören die Folsäureantagonisten (z.B.
MTX, Aminopterin), die Pyrimidinantagonisten (z.B. 5-FU, Cytarabin) und die
Purinantagonisten (z.B. 6-Mercaptopurin, Azathioprin). Alle drei Gruppen stören,
bzw. verhindern die DNS-Synthese und führen infolge zum Tod der Zelle.
Im
Rahmen
der
DNS-Synthese
in
der
S-Phase
des
Zellzyklus
spielt
Desoxythymidylat (dTMP) eine wichtige Rolle. Bei dTMP handelt es sich um eines
der vier Nukleoside, die als Bausteine der DNS fungieren. Der letzte Schritt in der
Bildung von dTMP erfolgt durch die Methylierung von Desoxyuridylat (dUMP), einer
Vorstufe von dTMP, zu Desoxythymidylat. Diese Reaktion wird durch das Enzym
Thymidylat-Synthase katalysiert:
dUMP
dTMP
Thymidylat-Synthase
Die Übertragung der Methylgruppe erfolgt durch das Co-Enzym Tetrahydrofolat
(FH4=Tetrahydrofolsäure), bzw. sein aktives Derivat N5,N10-Methylentetrahydrofolat.
FH4 wird in dieser Reaktion zu Dihydrofolat (FH2=Dihydrofolsäure) oxidiert:
dUMP + FH4
→
dTMP + FH2
Um FH4 zu regenerieren, muß FH2 wieder reduziert werden. Dieser Schritt wird durch
die Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) katalysiert, die NADPH als Reduktionsmittel
verwendet:
FH2 + NADPH + H+
FH4 + NADP+
Dihydrofolat-Reduktase
Einleitung
12
Zellen in der S-Phase des Zellzyklus benötigen aufgrund der hohen Zellteilungsrate
besonders viel dTMP zur DNS-Synthese. Die Empfindlichkeit solcher Zellen
gegenüber der Hemmung der dTMP-Synthese wird bei der Chemotherapie
ausgenutzt, wobei sowohl die Thymidylat-Synthase als auch die DihydrofolatReduktase als Angriffspunkte dienen.
Die Synthese von dTMP kann durch Beeinflussung der DHFR moduliert werden.
FH2-Analoga wie MTX oder Aminopterin sind kompetitive Inhibitoren der DHFR
(Sotos et al., 1994). Sie besitzen im Vergleich zum natürlichen Substrat FH2 eine
höhere Affinität zu dem Enzym DHFR und verdrängen FH2 somit von diesem. Die
Überführung von FH2 in FH4
wird blockiert, wodurch die FH4-abhängigen
Übertragungen von C1-Resten (Methylgruppen) verhindert werden, die im Rahmen
der Synthese von Purinnukleotiden und dTMP, und damit der DNS, stattfinden
(Dollery, 1991a; Fleisher, 1993; Sotos et al., 1994). Wie die physiologischen Folate,
so wird auch MTX intrazellulär in Hepatozyten zu Polyglutamat-Derivaten
metabolisiert.
Diese
akkumulieren
im
Gegensatz
zum
Ausgangsstoff
im
intrazellulären Raum (Jolivet et al., 1982; Jolivet und Chabner, 1983). Die längere
intrazelluläre Verweildauer ist mit einer länger anhaltenden Hemmung der DHFR
auch nach Abfluten der extrazellulären Substanzkonzentration und somit mit einer
ausgedehnteren zytostatischen Wirkung verbunden. Darüber hinaus inhibieren die
Polyglutamate auch andere Folsäure-abhängige Enzyme, die nicht direkt durch MTX
gehemmt werden, wodurch die Toxizität zusätzlich verstärkt wird (Allegra et al.,
1985a/b; Sotos et al., 1994).
5-FU wird in vivo in seine aktive Form, das Fluordesoxyuridylat (F-dUMP)
umgewandelt. Dieses dUMP-Analogon hemmt die Thymidylat-Synthase irreversibel,
so daß die Desoxythymidylat-Synthese und sekundär auch die DNS-Sythese und
-Reparatur gehemmt werden (Heidelberger et al., 1958; Dollery, 1991b, Sotos et al.,
1994). Darüber hinaus wird 5-FU in Form von F-dUTP in die Zell-RNS eingebaut
(Wilkinson et al., 1975; Tseng et al., 1978; Glazer und Hartman, 1980), was durch
Störung der RNS-Funktion erheblich zur Zytotoxizität der Substanz beiträgt (Kufe und
Major, 1981; Major et al., 1982).
Einleitung
13
I.4 H INTERGRUND
DER VORLIEGENDEN
A RBEIT
In der Vergangenheit wurden verschiedene in vitro-Modelle entwickelt, um
Vorhersagen über die Wirksamkeit von Zytostatika gegen solide Tumoren in vivo
treffen zu können (von Hoff und Weisenthal, 1980; Wilson et al., 1990; Köpf-Maier,
1992; Huschtscha et al., 1996). Durch in vitro-Modelle konnte beispielsweise gezeigt
werden, daß Unterschiede in der Dosis pro Zeiteinheit, der sogenannten ″dose
intensity″, die zytostatische Wirkung in der Zellkultur entscheidend mitbeeinflussen
(Evans und Relling, 1989). Für viele Zytostatika, die im Rahmen von in vitro-Modellen
eine vielversprechende Wirksamkeit zeigten, konnte eine korrespondierende
Wirksamkeit in vivo allerdings nicht in gleichem Ausmaß bestätigt werden. Diese
Beobachtung führte zu der Hypothese, daß in vivo oft nur eine subinhibitorische dose
intensity in der Tumorzelle erreicht werden kann.
Die Mehrzahl aller Studien zur Resistenz solider Tumoren fokussierte bislang auf die
Erforschung der Biochemie und Molekularbiologie von Tumorzellen. Weniger
Beachtung wurde der Tatsache geschenkt, daß die verabreichten Zytostatika in vivo
erst zur Tumorzelle gelangen müssen, da Zytostatika meist systemisch über das
Blutgefäßsystem und nicht lokal verabreicht werden. Aus dem Blut müssen sie
jedoch zunächst in den Zwischenzellraum (Interstitium oder Extrazellulärraum)
gelangen, um auf die direkt benachbarten Tumorzellen wirken zu können. Sobald ein
Molekül eines Zytostatikums in die Blutbahn injiziert wird, muß es also folgende
″Hindernisse″ überwinden, bevor es an eine Tumorzelle gelangt (Jain, 1987):
•
Distribution durch das Gefäßsystem
•
Transport über das Kapillarendothel
•
Transport durch das Interstitium
In allen genannten Subkompartimenten besteht die Möglichkeit, daß das Molekül
metabolisiert und in seiner Wirkung abgeschwächt wird oder sich an Proteine oder
andere Strukturen bindet und dadurch seine Wirkung am Zielort nicht entfalten kann
(Jain, 1987; Gerlowski und Jain, 1983).
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß Tumorgewebe im Vergleich zu
normalem Gewebe signifikante Unterschiede in Struktur und Funktion aufweist, die
Einleitung
14
zu einem eingeschränkten Transport von Molekülen aus der Blutbahn in das
Tumorinterstitium führen können (Jain et al., 1979; Jain 1987; Twentyman, 1985). In
jüngster Vergangenheit konnte von einigen Arbeitsgruppen gezeigt werden, daß die
verminderte Penetration eines Zytostatikums aus dem Blut in das Tumorgewebe zu
einer
Einschränkung
der
klinischen
Wirksamkeit
beitragen
kann,
da
die
Tumoransprechrate unter anderem von der Zytostatika-Dosis im Tumorinterstitium
abhängig ist (Presant et al., 1994; Müller et al.,1997b). Um bessere Aussagen über
die in vivo-Wirksamkeit von Zytostatika treffen zu können, wäre es daher
wünschenswert, intratumorale Konzentrationen quantifizieren zu können.
In diesem Zusammenhang ist zunächst von Interesse, ob ein bestimmtes
Zytostatikum das Tumorinterstitium in vivo überhaupt in ausreichender Konzentration
erreicht. Zur Klärung dieser Frage muß daher eine Methodik angewandt werden, die
es erlaubt, die freie, d.h. pharmakologisch aktive, Zytostatika-Konzentration im
Zielgewebe zu messen. Derzeit sind mehrere Möglichkeiten verfügbar, um klinisch
relevante Medikamentenkonzentrationen im Zielgewebe zu messen:
•
Biopsie: Durch die chemische Analyse einer Biopsie (Hecquet et al., 1986; Roos
und
Brorson,
1990;
Vaden
et
al.,
1993)
ist
es
zwar
möglich,
die
Medikamentenkonzentration im entnommenen Gewebsstück zu bestimmen,
jedoch handelt es sich dabei um ein Homogenisat aus zellulären, extrazellulären
und vaskulären Anteilen. Pharmakokinetische Verläufe lassen sich nicht
verfolgen, da serielle Probeentnahmen aufgrund der Invasivität der Methodik
meist nicht möglich sind.
•
MRS
(Magnetresonanzspektroskopie):
Diese
Technik
wurde
bereits
für
gewebspharmakokinetische Studien angewandt (Wolf et al., 1987; Evelhoch,
1989; Schlemmer et al., 1994; Findlay et al., 1993; Presant et al., 1994). Sie
bietet
als
bildgebendes
Verfahren
den
Vorteil
einer
Darstellung
der
Zytostatikaanreicherung im gesamten Tumorbereich, wobei es nicht möglich ist,
zwischen freien und proteingebundenen Molekülen zu unterscheiden. Auch läßt
sich nicht sagen, ob sich eine Substanz innerhalb eines Tumors in Gefäßen oder
dem Tumorinterstitium befindet. Letztendlich ist es auch schwierig, zwischen
Metaboliten mit ähnlichen magnetischen Eigenschaften zu unterscheiden
(Evelhoch, 1989).
Einleitung
15
•
PET (Positronenemissionstomographie): Auch dieses Verfahren ist bereits zu
Studienzwecken im Bereich der Gewebspharmakokinetik zur Anwendung
gekommen (Daghighian et al., 1993) und bietet wie die MRS die Möglichkeit,
Zytostatikaanreicherungen innerhalb eines gesamten Tumors darzustellen.
Die Methodik ist jedoch mit einer Strahlenbelastung für den Patienten verbunden.
Die beiden letztgenannten Verfahren haben unter anderem die Nachteile eines
hohen technischen Aufwands und hoher Kosten.
Durch die Entwicklung der Mikrodialysetechnik (Ungerstedt et al. 1982; Ungerstedt
1984; Zetterström et al. 1983; Tossman und Ungerstedt, 1986) ist es möglich
geworden, Zytostatika-Konzentrationen in vivo direkt in der interstitiellen Flüssigkeit,
welche die Tumorzellen unmittelbar umgibt, zu messen. Durch simultanes Messen
der Zyostatikakonzentration in Plasma und Tumor kann der transendotheliale
Transport eines Zytostatikums bestimmt werden. Dadurch wird es möglich zu
untersuchen, inwieweit die Plasmakonzentration eines Medikaments mit dessen
Tumorkonzentration und die Medikamentenkonzentration im Tumorgewebe mit dem
Therapieerfolg korrelieren. Die interstitiellen Konzentrations-Zeit-Verläufe, die man
durch Messungen über einen bestimmten Zeitraum erhält, können als die effektive in
vivo-dose intensity, vergleichbar der in vitro-dose intensity in einem ZellkulturExperiment, betrachtet werden.
Der neuartige Forschungsansatz einer anschließenden pharmakodynamischen
Simulation der interstitiellen Pharmakokinetik in einem in vitro-Modell bietet die
Möglichkeit,
die
in
vivo
ermittelte
intratumorale
Pharmakokinetik
in
vitro
nachzuvollziehen und dadurch indirekte Vorhersagen über die klinische Wirksamkeit
eines Zytostatikums in vivo treffen zu können.
Einleitung
16
I.5 Z IEL
DER VORLIEGENDEN
A RBEIT
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluß des transendothelialen Transports
von Zytostatika aus der Blutbahn in das Tumorinterstitium und der ZytostatikaKonzentration im Tumorinterstitium auf die Tumoransprechrate bei Patientinnen und
Patienten mit primärem Mammakarzinom zu untersuchen.
Zu diesem Zweck wurde zunächst mittels Mikrodialyse der Konzentrations-ZeitVerlauf von freiem, nicht an Proteine gebundenem MTX in Plasma und
Tumorinterstitium jeder Patientin in vivo gemessen und die jeweilige Fläche unter der
Konzentrations-Zeit-Kurve (″Area Under the Curve″, AUC) berechnet.
In einem zweiten Schritt wurde der in vivo für jede Patientin bestimmte intratumorale
MTX-Konzentrations-Zeit-Verlauf
an
Mammakarzinomzellen
in
vitro
simuliert
(in vivo-pharmakokinetisch / in vitro-pharmakodynamisches Simulationsmodell;
PK/PD-Simulationsmodell). Neben MTX wurde auch für 5-FU der in einer früheren
Studie (Müller et al., 1997b) ebenfalls bei Mammakarzinom-Patientinnen und
-Patienten in vivo ermittelte Konzentrations-Zeit-Verlauf in vitro simuliert. In einer
dritten Versuchsanordnung wurden Mammakarzinomzellen simultan mit MTX und
5-FU inkubiert. An mehreren Tagen nach der Zytostatika-Exposition wurde die
Anzahl vitaler Zellen ermittelt.
Durch die genannten Experimente sollten folgende Fragen beantwortet werden:
•
Gibt es individuelle Unterschiede in der Plasma-Tumor-Transferrate eines
bestimmten Zytostatikums bei verschiedenen Patientinnen?
•
Ist die Reaktion eines soliden Tumors auf eine Chemotherapie abhängig von der
direkt auf die Tumorzellen einwirkenden Konzentration des Zytostatikums pro
Zeit?
•
Korreliert die in vitro-Überlebensrate der Karzinomzellen mit der in vivo-AUCTumor?
•
Wie wirkt sich die kombinierte Gabe von MTX und 5-FU (wie sie im Rahmen des
CMF-Schemas durchgeführt wird) auf die Überlebensrate der Karzinomzellen
in vitro aus?
Einleitung
17
II MATERIAL UND METHODEN
II.1 T EIL I: I N
VIVO -E XPERIMENTE
II.1.1 Patientinnen und Material
II.1.1.1 Patientinnen:
In die klinische Studie wurden 9 Patientinnen mit histologisch gesicherter Diagnose
eines primären Mammakarzinoms im Stadium T3/4, NX, M0 nach der TNMStadieneinteilung und im Stadium 0, 1 oder 2 der ECOG-scale (WHO performance
status) mit einer Lebenserwartung von mindestens drei Monaten eingeschlossen.
Das Durchschnittsalter betrug 52 Jahre (± 4), die durchschnittliche Körperoberfläche
1.77 m2 (± 0,03); (Mittelwerte ± SD). Alle Patientinnen nahmen an der Studie im
Rahmen des ersten Behandlungszyklus einer neoadjuvanten Chemotherapie nach
dem CMF-Schema (600 mg/m2 Cyclophosphamid, 40 mg/m2 MTX, 600 mg/m2 5-FU)
teil. An vier Patientinnen wurden während ihres zweiten Therapiezyklus erneut
Mikrodialysemessungen durchgeführt. Die so gewonnenen Daten wurden separat
analysiert.
Die Studie wurde von der Ethikkommission der medizinischen Fakultät der
Universität Wien bewilligt und in Übereinstimmung mit der Helsinki-Deklaration und
den ″Good Clinical Practice Guidelines″ der Europäischen Kommission (EC-GCPRichtlinien) durchgeführt. Alle Patientinnen wurden sowohl schriftlich als auch
mündlich detailliert über Zweck und Ablauf der Studien aufgeklärt und gaben ihr
schriftliches Einverständnis zur Teilnahme.
Material und Methoden
18
II.1.1.2 Material:
•
Mikrodialyse-Sonden mit einem äußeren Durchmesser von 500 µm, einer
Schaftlänge von 7 cm, einer Membranlänge von 16 mm und einem ″molecular
cutoff″ (oberer Grenzwert für die Durchlässigkeit von Molekülen) von 20 kD
(CMA-10®, CMA, Stockholm, Schweden); (siehe Abb.2)
•
Physiologische Kochsalzlösung (Fresenius, Pharma Austria GmbH, Graz)
•
Venenkatheter (Venflon2®, Helsingborg, Schweden)
•
Mikroinfusionspumpe (Predicor®, Infors, Basel, Schweiz)
•
Microfraction-collector (CMA 120®, CMA, Stockholm, Schweden)
•
Methotrexat (MTX®, Roche, Basel, Schweiz)
•
FPI-Assay (Fluorescence polarization immuno assay; Abbott, Abbott Park, III)
•
COBAS Fara II-Analyser (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz)
•
Computerprogramm (Topfit 2,0, Gustav Fischer, Stuttgart, Jena, New York;
1993)
II.1.2 Methodik der Mikrodialysetechnik
Die Mikrodialysetechnik, erstmals 1972 von Delgado et al. beschrieben, wurde
ursprünglich auf dem Gebiet der präklinischen Hirnforschung angewandt, um im
Hirngewebe extrazelluläre Konzentrationen von Neurotransmittern zu messen.
1987 wurde erstmals eine Studie über die Anwendung der Technik am Menschen
veröffentlicht (Lönnroth et al., 1987). In den letzten Jahren wurde die Mikrodialyse
vermehrt im Bereich der klinischen Pharmakokinetik angewandt, insbesondere, um
die Verteilung und Metabolisierung von Pharmaka zu untersuchen (Müller et al.,
1995, 1996, 1997 a/b; Blöchl-Daum, 1996; Ekstrøm et al., 1997).
Material und Methoden
19
II.1.2.1 Prinzip der Mikrodialyse
Das Grundprinzip der Mikrodialyse beruht auf der Konzentrationsmessung
endogener Analyte (z.B. Metabolite, Hormone, Neurotransmitter) oder exogen
zugeführter Substanzen (Pharmaka und ihre Metabolite) im Extrazellulärraum mit
Hilfe einer Mikrodialysesonde.
An der Spitze der Mikrodialysesonde befindet sich eine semipermeable Membran,
die so im Gewebe plaziert wird, daß sie in direktem Kontakt mit dem
Extrazellulärraum des Gewebes steht, in dem Messungen vorgenommen werden
sollen (siehe Abb.1 und 2). Nach der Implantation im Gewebe wird die Sonde mit
einer
physiologischen
Flüssigkeit,
dem
Perfusat,
mit
einer
konstanten
Geschwindigkeit von 1-2 µl/min gespült. Zwischen dem Perfusat und dem
Extrazellulärraum findet nun ein Konzentrationsausgleich statt. Ungebundene
Substanzen diffundieren aus dem Interstitium entlang des Konzentrationsgradienten
durch die Membran in das Perfusat. Das mit dem Analyten teiläquilibrierte Perfusat,
das Dialysat, wird gesammelt und die Konzentration der zu messenden Substanz
chemisch bestimmt (s.a. II.1.2.3. Kalibrierung der Sonde).
Basierend auf der Annahme, daß die Membran in beide Richtungen durchgängig ist,
können dem Perfusat zugesetzte gelöste Stoffe in das umgebende Gewebe
diffundieren. Durch diese Technik können daher auch Pharmaka gezielt in eine
Gewebsregion appliziert werden.
II.1.2.2 Aufbau der Sonde
Derzeit kommen verschiedene Sondentypen zur Anwendung. Bei der am häufigsten
verwendeten Mikrodialysesonde handelt es sich um eine nadelförmig konzentrische
Sonde (Tossman und Ungerstedt, 1986). Sie besteht aus einem längeren inneren
und einem kürzeren äußeren Schaft. Die semipermeable Membran überdeckt den
inneren Schaft, ist am äußeren Schaft befestigt und bildet die vorne geschlossene
Spitze der Sonde.
Die Perfusionsflüssigkeit gelangt über den inneren Schaft zur Spitze der Sonde, wo
an der semipermeablen Membran die Diffusion zwischen Gewebe und Perfusat
stattfindet. Das so entstandene Dialysat verläßt über den äußeren Schaft die Sonde
(siehe Abb.1 und 2).
Material und Methoden
20
Perfusat
Dialysat
Hautoberfläche
Blutkapillare
Membran
Diffusion
Interstitium
Analyt
Zellen
Abb.1: Prinzip der Mikrodialysetechnik: An der Spitze einer ins Gewebe implantierten
Mikrodialysesonde befindet sich eine semipermeable Membran, die in direktem Kontakt mit dem
Interstitium des Gewebes steht, in dem Messungen vorgenommen werden sollen.
Nach der Implantation im Gewebe (siehe II.1.2.5 Studienprotokoll) wird die Sonde mit einer
physiologischen Flüssigkeit, dem Perfusat, mit einer konstanten Geschwindigkeit von 1-2 µl/min
gespült. Zwischen dem Perfusat und dem Extrazellulärraum findet nun ein Konzentrationsausgleich
statt. Ungebundene Substanzen diffundieren aus dem Interstitium durch die Membran in das Perfusat.
Das mit dem Analyten äquilibrierte Perfusat, das Dialysat, wird gesammelt und die Konzentration der
zu messenden Substanz chemisch bestimmt.
Material und Methoden
21
Abb.2: Mikrodialyse-Sonde mit einem äußeren Durchmesser von 500 µm, einer Schaftlänge von
7 cm, einer Membranlänge von 16 mm und einem ″molecular cutoff″ von 20 kD (CMA-10®, CMA,
Stockholm, Schweden).
Zur Veranschaulichung der Größenverhältnisse wurde ein Streichholz gewöhnlicher Größe neben die
Sonde gelegt.
II.1.2.3 Kalibrierung der Sonde
Die im Dialysat gemessene Substratkonzentration entspricht nie gänzlich der
absoluten Konzentration im Interstitium, da es während der Mikrodialyse nur zu einer
unvollständigen Äquilibrierung zwischen Gewebsflüssigkeit und Perfusat kommt. Die
Dialysatkonzentration
ist
daher
niedriger
als
die
tatsächliche
absolute
Substratkonzentration im Interstitium. Durch Kalibrierung der Mikrodialysesonden ist
es möglich, einen Umrechnungsfaktor zu berechnen, die sogenannte ″Recovery″.
Erst mit Hilfe dieser Recovery lassen sich quantitative Konzentrationsbestimmungen
im Gewebe durchführen. Die Recovery ist definiert als das Verhältnis zwischen der
Konzentration einer bestimmten Substanz im Dialysat und der Konzentration der
gleichen Substanz im Medium, das die Sonde umgibt (Ungerstedt et al.; 1982).
Die Recovery wird in Prozent angegeben.
Material und Methoden
22
In vitro-Kalibrierung:
Um sicherzustellen, daß eine bestimmte Substanz konzentrationsunabhängig
dialysabel ist, sollte für jeden Analyten zunächst eine in vitro-Kalibrierung
durchgeführt werden.
Die Recovery wird in vitro bestimmt, indem die Sonde in einer Stammlösung,
bestehend aus Medium mit dem zu messenden Analyten, kontinuierlich bei
gleichbleibender Geschwindigkeit mit physiologischer Kochsalzlösung perfundiert
wird. Die Konzentration des Analyten im Dialysat wird in bestimmten Zeitintervallen
gemessen und als Prozent der Konzentration in der Stammlösung angegeben:
Recovery in vitro (%) = CDialysat / CMedium · 100
wobei
CDialysat die Konzentration im Dialysat
und
CMedium die Konzentration im Medium angibt.
Die
Bestimmung
der
Recovery
wird
mit
unterschiedlich
hohen
Substratkonzentrationen in der Stammlösung durchgeführt, wobei die Höhe der
Recovery dabei idealerweise über einen weiten Konzentrationsbereich konstant
bleiben sollte. Das heißt, daß sie unabhängig von der Außenkonzentration der
Substanz ist, was als wichtige Voraussetzung für quantitative kinetische Studien
anzusehen ist.
Material und Methoden
23
In vivo-Kalibrierung:
Um in vivo-Experimente so durchführen zu können, daß quantitative Aussagen über
die Substratkonzentration im Gewebe getroffen werden können, muß die Sonde in
vivo kalibriert werden. Dies ist deshalb wichtig, da die Kalibrierung in vitro meist zu
höheren Recoverywerten führt als in vivo (Lönnroth et al.; 1987), so daß eine
Berechnung der Recovery basierend auf der in vitro-Recovery in einem falsch
niedrigen Ergebnis resultieren würde. Der Grund für die Messung unterschiedlich
hoher Recoverywerte sind verschiedene Diffusionskoeffizienten für Wasser und
Gewebe (Lönnroth et al., 1987; Amberg und Lindefors, 1989; Hsiao et al., 1990;
Bungay et al., 1990).
Auch die unterschiedlich hohe Durchlässigkeit verschiedener Membranen führt in
vitro zu unterschiedlichen Recovery-Werten. In vivo spielt dies jedoch eine eher
untergeordnete Rolle, da in vivo nicht der Membranwiderstand, sondern der im
Vergleich sehr viel höhere Gewebswiderstand den limitierenden Faktor für die
Diffusion darstellt (Hsiao et al., 1990).
Für die Bestimmung der in vivo-Recovery wurden verschiedene Techniken
entwickelt. Von diesen hat sich die sogenannte ″Retrodialysetechnik″ als am
einfachsten und schnellsten durchzuführen herausgestellt. Außerdem ist sie
unabhängig vom Fließgleichgewicht der Analytkonzentration im Gewebe (Ståhle,
1991). Die Retrodialysetechnik basiert auf der Annahme, daß die Diffusionsrate über
die Membran in beide Richtungen gleich hoch ist. Bei dieser Methode wird die
Substanz, die später gemessen werden soll, der Perfusionsflüssigkeit zugefügt. Der
Verlust über die Membran entspricht der Recovery:
Recovery in vivo (%) = 100 - (100 · CDialysat · CPerfusat-1)
Daraus läßt sich anschließend auch die Gewebskonzentration der Substanz als
Quotient aus der Substanzkonzentation im Dialysat und der Recovery berechnen:
CGewebe = (CDialysat · Recoveryin vivo -1) · 100
Material und Methoden
24
II.1.2.4 Einflußgrößen der Recovery
Im Laufe der Jahre wurden in mehreren Studien Faktoren untersucht, welche die
Recovery in vitro und in vivo beeinflussen, wovon hier einige aufgeführt und erläutert
werden sollen.
Beschaffenheit der Membran: Prinzipiell entsprechen die Mikrodialyse-Membranen
jenen Membranen, die in Hämodialysesäulen zur Anwendung kommen. Zu den am
häufigsten
verwendeten
Membranmaterialien
gehören
Polyacrylonitril,
Polyethersulfon, Polycarbonatether und Celluloseacetat (Kendrick, 1989; Elmquist
und Sawchuk, 1997).
Das Membranmaterial sollte möglichst inert und biokompatibel sein, um Interaktionen
zwischen zu messenden Substanzen und der Membran zu verhindern (Lindefors et
al., 1989). Abgesehen vom Membranmaterial sollten auch die zu- und ableitenden
Plastikschläuche des Systems inert sein, um eine Adsorption von Molekülen, die zu
einer Verfälschung der Ergebnisse führen kann, zu verhindern (Ungerstedt, 1991).
Um bei pharmakokinetischen Studien interstitiell freie, d.h. pharmakologisch
wirksame Analytkonzentrationen messen zu können, sollte die durchschnittliche
Porengröße groß genug sein, um eine freie Diffusion der gelösten Moleküle zu
ermöglichen, jedoch klein genug, um die Passage von Proteinen und anderen
Makromolekülen zu verhindern.
Membranlänge: Je länger die Membran der Sonde ist, desto größer ist die
Diffusionsaustauschfläche und somit auch die Recovery (Hamberger et al., 1983;
Ungerstedt, 1984). Dies geht aus dem 1.Fick'schen Diffusionsgesetz hervor:
dQ / dt = D · F · ∆c/l
Nach diesem Gesetz ist die pro Zeiteinheit (t) über die Membran diffundierende
Stoffmenge (Q) proportional dem Diffusionskoeffizienten des Mediums (D), der
Fläche (F), über die eine Diffusion stattfinden kann, und der Stoffkonzentration (c)
und antiproportional der Länge der Diffusionsstrecke (l).
Material und Methoden
25
Interaktionen zwischen Substanz und Membran: Abhängig von Membran- und
Substanzeigenschaften können zwischen Membran und Substanz Interaktionen
auftreten, die sich auf die Recovery auswirken. So ist beispielsweise beschrieben
worden, daß die Recovery für saure Metabolite sehr viel größer ist als für basische,
auch
wenn
die
Substanzen
den
gleichen
Diffusionskoeffizienten
besitzen
(Ungerstedt, 1984).
Diffusionskoeffizient: Die Variabilität der Recovery verschiedener Substanzen wird
auf Unterschiede im Molekulargewicht, der Konfiguration und der Ladung der
Substanzmoleküle,
und
damit
auf
unterschiedliche
Diffusionskoeffizienten
zurückgeführt (Benveniste und Hüttemeier, 1990).
Des weiteren wird die Diffusion in einem inhomogenen Medium wie dem Gewebe
duch Zellen behindert, wodurch der Diffusionsweg verlängert wird. Dieser Umstand
erklärt den erschwerten Übertritt von Molekülen über die Membran in vivo im
Vergleich zur Situation in vitro (Benveniste, 1989).
Temperatur:
Bei
einem
Temperaturanstieg
des
Mediums
steigt
auch
der
Diffusionskoeffizient um 1-2 % pro °C (Bard und Faulkner, 1980). Die Recovery steigt
demnach mit steigender Temperatur (Wages et al., 1986).
Zusammensetzung des Perfusats: Die Perfusionsflüssigkeit sollte der interstitiellen
Flüssigkeit in bezug auf Osmolarität, Zusammensetzung und pH-Wert möglichst
ähnlich sein, um die physiologischen Gegebenheiten des umliegenden Gewebes
nicht zu verändern (Benveniste und Hüttemeier, 1990). Zu hohe Gradienten, sowie
eine zu hohe Perfusionsgeschwindigkeit können zum Phänomen der ″Drainage″
führen (Benveniste, 1989), wobei dem Gewebe in direkter Umgebung der Sonde die
zu messende Substanz durch die Sonde selbst entzogen wird, die Diffusionsmenge
abnimmt und dadurch mit der Zeit falsch niedrige interstitielle Werte gemessen
werden. Um dies zu vermeiden, kann dem Perfusat eine bestimmte Konzentration
der zu messenden Substanz zugefügt werden, um den Gradienten über die
Membran und damit auch den Substratabtransport aus dem Gewebe zu senken.
Zusätzlich sollte die Perfusionsgeschwindigkeit möglichst niedrig gehalten werden.
Material und Methoden
26
Perfusionsrate:
Wie
in
Perfusionsgeschwindigkeit
Abbildung
und
der
3
dargestellt,
Recovery
ein
besteht
umgekehrt
zwischen
der
proportionales
Verhältnis. Je höher die Perfusionsgeschwindigkeit, desto geringer ist die Recovery
(Kehr et al., 1993).
Recovery (% )
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Perfusionsgeschwindigkeit (µl/min)
Abb.3:
Einfluß
der
Perfusionsgeschwindigkeit
auf
die
Recovery.
Mit
zunehmender
Fließgeschwindigkeit (µl/min) nimmt die Recovery (%) in nichtlinearer Weise ab.
II.1.2.5 Studienprotokoll
Am Morgen des Studientages wurden die Patientinnen an der Abteilung für klinische
Pharmakologie aufgenommen. Während der Studie befanden sie sich in liegender
Position. Um die MTX-Konzentration im Plasma messen zu können, wurde jeder
Patientin ein Venenkatheter in die Kubitalvene gelegt. Die Haut wurde im Bereich
des Tumors gereinigt und desinfiziert. Hierauf wurde je ein Venenkatheter in den
Tumor und in das periumbilikale subkutane Fettgewebe eingestochen, der Mandrin
entfernt und über den Venenkatheterschaft jeweils eine Mikrodialysesonde in das
Gewebe vorgeschoben. Der Katheterschaft wurde so weit zurückgezogen, daß
davon ausgegangen werden konnte, daß die Sondenmembran frei im Interstitium zu
liegen kam.
Material und Methoden
27
Die Position der Sonden wurde mittels Ultraschall kontrolliert (siehe Abb.4). Die
Sonden wurden für 30 Minuten mit Ringerlösung mit einer Rate von 1,5 µl/min über
eine Mikroinfusionspumpe gespült und danach über 30 Minuten wie oben
beschrieben für MTX kalibriert. Anschließend wurde das System wiederum für 30
Minuten mit Ringerlösung gespült, dann wurde das MTX verabreicht. Dialysatproben
wurden mit Hilfe eines ″Microfraction-collectors″ (CMA 120®, CMA, Stockholm,
Schweden) über 30-Minuten-Intervalle gesammelt und bis zur Analyse bei -20°C
gelagert.
Den Patientinnen wurde MTX in Form einer einmaligen i.v.-Dosis von 40 mg/m² über
5 Minuten verabreicht, was einer durchschnittlichen Dosis von 60 mg entsprach.
Zuvor wurden 8 mg Ondansetron, 4 mg Dexamethason und 50 mg Ranitidin i.v.
verabreicht. Nach der dreistündigen experimentellen Beobachtungsperiode nach
MTX-Applikation
erhielten
die
Patientinnen
5-FU
und
Cyclophosphamid
entsprechend dem CMF-Schema.
Abb.4: Lage einer Mikrodialysesonde im Tumorgewebe, dargestellt mittels Ultraschall.
Material und Methoden
28
II.1.2.6 Beurteilung der Tumoransprechrate
Die Reaktion der Tumoren auf die Chemotherapie wurde nach Abschluß mindestens
zweier Chemotherapiezyklen radiologisch anhand der WHO-Standardkriterien
bestimmt:
Eine
komplette
Remission
wurde
als
Verschwinden
aller
nachweisbaren
Tumorparameter, dokumentiert durch zwei Kontrolluntersuchungen, die mindestens
vier Wochen auseinanderlagen, definiert.
Eine partielle Remission lag vor, wenn es zu einem Rückgang der Tumorausdehnung
um mindestens 50% oder mehr über eine Dauer von mindestens vier Wochen kam.
Dies mußte durch Mammographie, Ultraschall oder direkte klinische Messung des
Tumordurchmessers festgestellt werden.
Führte die Therapie zu keiner signifikanten Änderung der Tumorausdehnung über
mindestens vier Wochen (Abnahme um < 50% oder Zunahme um < 25%), wurde
dies als unverändertes Krankheitsbild bezeichnet.
Im Falle einer Zunahme der Tumorausdehnung um mehr als 25% oder unter der
Therapie neu auftretender Tumorläsionen handelte es sich um ein Fortschreiten der
Krankheit.
Material und Methoden
29
II.1.3 Chemische Analyse, Berechnungen und Datenanalysen
II.1.3.1 Chemische Analyse
Die MTX-Konzentrationen in Plasma und Dialysaten wurden mit Hilfe eines FPI
(Fluorescence
polarization
immuno)-Assays
gemessen.
Um
geringe
MTX-
Konzentrationen messen zu können, wurde der Assay für den Gebrauch eines
″COBAS Fara II-Analysers″ (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) adaptiert.
Die Inter- und Intraassay-Variationskoeffizienten betrugen weniger als 5%. Die
Nachweisgrenze lag bei 0.01µM.
II.1.3.2 Pharmakokinetische Berechnungen und Datenanalysen
Alle Daten wurden als Mittelwerte ± Standardfehler (standard error, SE) angegeben.
Die absoluten Gewebskonzentrationen von MTX wurden als Quotient aus der
Substratkonzentration im Dialysat und der Recovery berechnet:
CGewebe = (CDialysat · Recoveryin vivo-1) · 100
Alle in vivo gemessenen Daten wurden mit einem kommerziell erhältlichen
Computerprogramm (Topfit 2,0) nach der ″least squares method″ in ein Ein- bzw.
Zwei-Kompartimentmodell eingepaßt.
Die im Plasma gemessenen Zytostatika-Konzentrationswerte wurden in das
Programm
eingegeben,
so
daß
nach
folgender
Gleichung
für
ein
Zwei-
Kompartimentmodell die Zytostatika-Konzentration im Plasma zu jedem beliebigen
Zeitpunkt t berechnet werden konnte:
C(t) = A e-k1 t + B e-k2 t
Dabei gilt:
C(t)
Zytostatika-Konzentration im Plasma zu jedem beliebigen Zeitpunkt t
k1
Eliminationskonstante für das Plasmakompartiment
k2
Eliminationskonstante für das Gewebskompartiment
Material und Methoden
30
A
rückextrapolierter Schnittpunkt mit der Ordinate für die α-Phase der
Elimination
B
rückextrapolierter Schnittpunkt mit der Ordinate für die β-Phase der
Elimination
A e-k1 t
Zytostatika-Konzentration zu jedem beliebigen Zeitpunkt t während
der α-Phase der Elimination
B e-k2 t
Zytostatika-Konzentration zu jedem beliebigen Zeitpunkt t nach
Erreichen der Eliminationsphase
Durch die im Gewebe gemessenen Zytostatika-Konzentrationswerte konnte nach
folgender Gleichung für ein Ein-Kompartimentmodell die Zytostatika-Konzentration im
Gewebe zu jedem beliebigen Zeitpunkt t berechnet werden:
C(t) = B e-k2 t - C e-ka t
Dabei gilt:
C(t)
Zytostatika-Konzentration
im
Gewebe
zu
jedem
beliebigen
Zeitpunkt t
ka
Absorptionskonstante für das Gewebskompartiment
B e-k2 t
Zytostatika-Konzentration zu jedem beliebigen Zeitpunkt t nach
Erreichen der Eliminationsphase
C e-ka t
noch nicht absorbierte Zytostatika-Konzentration zu jedem beliebigen
Zeitpunkt t während der Absorptionsphase
Anschließend
wurde
die
Plasma-Gewebe-Transferrate
(k12)
nach
folgender
Gleichung ermittelt:
k1 + k2 = k12 + k21 + k13
,
wobei k1, k2 und k13 durch das Topfit- Programm berechnet wurden;
k21 ergibt sich aus:
k21 = k1 · k2 : k13
Material und Methoden
31
Dabei gilt:
k12
Transferrate vom Plasma ins Gewebe
k21
Transferrate vom Gewebe ins Plasma
k13
Eliminationskonstante aus dem Plasma
Das Penetrationsverhältnis für das Tumorgewebe wurde ausgedrückt durch den
Quotienten AUCTumor / AUCPlasma
Folgende pharmakokinetischen Parameter wurden ermittelt:
AUC
Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (in µg·min·ml-1)
Die AUC-Werte wurden nach der Trapezregel berechnet.
cmax
maximale Konzentration
tmax
Zeitpunkt bis zum Erreichen der maximalen Konzentation
Statistik:
Für Korrelationen und Vergleiche zwischen pharmakokinetischen Parametern
verschiedener Kompartimente wurden Spearman rank (rs)-, bzw. Mann-Whitney Utests angewandt, da die pharmakokinetischen Parameter nicht normalverteilt waren.
Ein p-Wert < 0.05 wurde als signifikant gewertet.
Material und Methoden
32
II.2 T EIL II: I N
VITRO -E XPERIMENTE
II.2.1 Material
II.2.1.1 Zellkultur:
•
MCF-7-Zellstamm (ATCC, Rockville, MD, USA)
•
Kulturflaschen (75 cm2 Vented Culture Flask, 0.2µm Vented Tissue Filter Cap,
Culture Treated; Costar®3276, Cambridge, MA, USA)
•
Medium, zusammengesetzt aus:
• RPMI mit Glutamax I® (GIBCO 61870-010, Gaithersburg, MD, USA)
• 10%igem
hitzeinaktiviertem
fötalen
Kälberserum
(GIBCO
10106-066,
Gaithersburg, MD, USA)
• 50µl Gentamicin/ml Medium (GIBCO 15750-037, Gaithersburg, MD, USA)
•
Trypsin; 2.5%ige Lösung (210234, Boehringer Mannheim, Deutschland)
•
Trypanblau; 0.5%ige Lösung (S11-004, PAA Laboratories GmbH, A-4020)
•
Bürker-Türk-Zählkammer (7192 06, Brand GmbH + Co KG, D-97861)
•
96-well-Mikrotiterplatten; flat bottom (Costar® 3596, Cambridge, MA, USA)
•
Methotrexat (Serva, Heidelberg, Deutschland)
•
5-FU (Serva, Heidelberg, Deutschland)
II.2.1.2 MTT-Assay:
•
CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Mannheim,
Deutschland); beinhaltet:
• 100 ml Solubilization/Stop Solution
• 15 ml Dye Solution
•
ELISA-Meßgerät (Easy reader EAR 400 AT, SLT-Labinstruments, Austria)
Material und Methoden
33
II.2.2 Zugrundeliegende in vivo-Experimente
Grundlage der in vitro-Studie bildeten die pharmakokinetischen Konzentrations-ZeitVerläufe, die in zwei in vivo-Studien an Patientinnen und Patienten mit primärem
Mammakarzinom gemessen wurden.
Die mit MTX durchgeführte in vivo-Studie wurde bereits in TEIL I vorgestellt. Die
Daten der in vivo-Experimente mit 5-FU basieren auf der Studie von Müller et al.
(1997b). In diese klinische Studie wurden 8 Patientinnen und 2 Patienten mit
histologisch gesicherter Diagnose eines primären Mammakarzinoms im Stadium
T3/4, NX, M0 nach der TNM-Stadieneinteilung und im Stadium 0, 1 oder 2 der
ECOG-scale (WHO performance status) mit einer Lebenserwartung von mindestens
drei
Monaten
eingeschlossen.
Das
Durchschnittsalter
betrug
53
Jahre
(± 9), die durchschnittliche Körperoberfläche 1.9 m2 (± 0,4); (Mittelwerte ±
Standardabweichung der Stichprobe, SD). Zwei Patientinnen nahmen an der Studie
im Rahmen des ersten Behandlungszyklus einer neoadjuvanten Chemotherapie
nach dem CMF-Schema (600 mg/m2 Cyclophosphamid, 40 mg/m2 MTX, 600 mg/m2
5-FU), acht nach dem FEC-Schema (600 mg/m2 5-FU, 60 mg/m2 Epirubicin, 600
mg/m2 Cyclophosphamid) teil. An drei Patientinnen wurden während ihres zweiten
Therapiezyklus erneut Mikrodialysemessungen durchgeführt. Die so gewonnenen
Daten wurden separat analysiert und ebenfalls in die in vitro-Studie integriert.
Basierend auf den durch die in vivo-Experimente ermittelten pharmakokinetischen
Daten wurden die Konzentrations-Zeit-Profile von 5-FU und MTX in vitro an
Mammakarzinomzellen der Zellinie MCF-7 simuliert.
Material und Methoden
34
II.2.3 Methodik der Zellkultur
Humane Mammakarzinomzellen der Zellinie MCF-7 wachsen als Monolayerkulturen
in Kulturflaschen in RPMI-Medium in einem Inkubator bei 37°C, 5% CO2 und 95%
relativer Luftfeuchtigkeit. Um für die Zellen optimale Bedingungen, d.h. ausreichend
Platz zum Wachsen und genügend Nährstoffe im Medium, aufrecht zu erhalten,
werden in regelmäßigen Abständen Subkulturen angelegt. Hierfür werden die Zellen
durch Trypsin vom Boden der Kulturflaschen gelöst und mit frischem Medium in einer
1:3-1:10-fachen Verdünnung wieder in Flaschen ausgesät. Auf gleiche Weise
wurden auch die Zellen für die in vitro-Studie durch Trypsinieren in ihrer
logarithmischen Wachstumsphase gewonnen.
Um die Konzentration vitaler Zellen der aus einer Kulturflasche gewonnenen
Zellsuspension zu bestimmen, wurden 50µl der Suspension mit 50µl Trypanblau
angefärbt. Anschließend wurden die Zellen zweier Quadranten einer Bürker-TürkZählkammer unter dem Mikroskop gezählt.
Für die in vitro-Experimente wurden auf 96-well-Mikrotiterplatten (Costar® 3596,
Cambridge,
MA,
USA;
Platten
mit
96
schalenförmigen
Vertiefungen,
den
sogenannten ″wells″) je sechs wells mit 5.000, 15.000 und 25.000 Zellen in 100µl
Medium ausgesät. Je drei wells pro Zellzahl dienten der Kontrolle, wurden also
keinem Zytostatikum ausgesetzt, die anderen drei der PK/PD-Simulation, d.h. der
Inkubation mit MTX, 5-FU oder einer Kombination der beiden Zytostatika (siehe
Abb.5). Für die Experimente wurden jeweils drei wells pro Zellzahl untersucht, um
nach Durchführung des MTT-Assays (siehe II.2.4) einen möglichst reproduzierbaren
Mittelwert für die Extinktion errechnen zu können.
Nach dem Aussäen der Zellen wurden die Mikrotiterplatten vier Stunden lang bei
37°C inkubiert, um den Zellen die Möglichkeit zu geben, am Boden der wells
anzuwachsen, bevor mit den Experimenten begonnen wurde. Nach der vierstündigen
Ruhephase wurden die Zellen nach den in vivo für jede Patientin und jeden Patienten
gemessenen Konzentrations-Zeit-Verläufen mit dem entsprechenden Zytostatikum
inkubiert. Für die kombinierte Inkubation mit MTX und 5-FU wurde der
Konzentrations-Zeit-Verlauf aus den Mittelwerten aller MTX-, bzw. aller 5-FUKinetiken errechnet. In den durch die in vivo-Experimente vorgegebenen
Zeitabständen (15 min für 5-FU, 30 min für MTX) wurden die Zellen mit der jeweils
in vivo gemessenen MTX-, bzw. 5-FU-Konzentration in 150 µl Medium bei 37°C
inkubiert.
Material und Methoden
35
Nach den angegebenen Zeitintervallen wurde die Konzentrationslösung mit einer
Pasteurpipette abgesaugt und die Zellen mit der Konzentrationslösung für den
nächsten Zeitabstand inkubiert. Abschließend wurde die letzte Konzentrationslösung
abgesaugt und die Zellen nach Zugabe 150µl reinen Mediums bis zur Durchführung
des MTT-Assays (siehe II.2.4) inkubiert.
5.000 Zellen
pro well
Kontrolle
PK/PD-Simulation
15.000 Zellen
pro well
Kontrolle
PK/PD-Simulation
25.000 Zellen
pro well
Kontrolle
PK/PD-Simulation
Abb.5: 96-well-Mikrotiterplatte unter der Versuchsanordnung: Ausgesät wurden je sechs wells mit
5.000, 15.000, bzw. 25.000 Zellen. Davon dienten jeweils drei als Kontrolle (
) und drei der PK/PD-
Simulation ( ). Alle restlichen wells der Mikrotiterplatte blieben leer (○).
Material und Methoden
36
II.2.4 Methodik des MTT-Assays
II.2.4.1 Durchführung des MTT-Assays
Um den zeitlichen Verlauf der Tumorreaktion in vitro nachzuvollziehen, wurde die
Zahl der überlebenden Zellen jedes Simulationsmodells an den Tagen 1, 2, 4 und 7
nach der Inkubation mit dem Zytostatikum gemessen. Für jeden Meßtag wurde daher
eine Mikrotiterplatte vorbereitet. Die Zahl der nach der Zytostatikaexposition noch
vitalen Zellen wurde mit Hilfe eines MTT-Proliferationsassays (CellTiter 96)
ermittelt.
Für die Durchführung eines solchen Assays werden am Meßtag pro well 15 µl einer
vorgefertigten Farblösung (″Dye solution″) zugefügt. In der darauffolgenden
Inkubationszeit von 4 Stunden bei 37°C findet in allen noch vitalen Zellen eine
Umwandlung des in der Farblösung enthaltenen Tetrazolium-Salzes MTT zu einem
Formazan-Produkt statt (siehe Abb.6), was deutlich an einem Farbumschlag der
Flüssigkeit von gelb nach blau zu erkennen ist. Diese Produktumwandlung ist auf die
mitochondriale Dehydrogenase-Aktivität der vitalen Zellen zurückzuführen. Nach der
Inkubationszeit werden 100µl einer vorgefertigten Lösung (″Solubilization/Stop
Solution″) hinzugefügt, um das gebildete Formazan-Produkt in Lösung zu bringen.
Nach weiteren 24 Stunden kann die Absorption bei 570 nm und einer
Referenzwellenlänge von 690 nm mit einem ELISA-Meßgerät gemessen werden. Die
so ermittelte Absorption ist der Zahl an lebenden Zellen direkt proportional.
N
N
N
N
H
+
N
S
Br
N
N
N
S
N
CH3
N
CH3
CH3
CH3
MTT
Formazan
Abb.6: Umwandlung des Tetrazolium-Salzes MTT in ein Formazan-Produkt: Die nach der
Inkubation mit einem Zytostatikum noch vitalen Zellen metabolisieren MTT zu einem FormazanProdukt.
Material und Methoden
37
II.2.4.2 Anwendungsbereiche des MTT-Assays
Tetrazolium-Salze finden in der Forschung im Rahmen von Zellproliferations- und
Zytotoxizitäts-Assays (Campling et al., 1988 und 1991; Wilson et al., 1990), EnzymAssays,
histochemischen
Untersuchungen
und
bakteriologischen
Screening-
Untersuchungen (Berridge et al., 1996), Assays zur Bestimmung der Zellhaftung
(Prieto et al., 1993; Klemke et al., 1994) und der Apoptose-Mechanismen von Zellen
(Wong und Goeddel, 1994), sowie bei der Bestimmung von Hefe- (Levitz und
Diamond, 1985; Smail et al., 1992; Mikami et al., 1994) und Bakterienzellzahlen
(Stevens und Olsen, 1993) breite Anwendung. Die Methodik des mit TetrazoliumSalzen entwickelten MTT-Assays basiert auf der quantitativen kolorimetrischen
Bestimmung lebender Zellen mit Hilfe eines ELISA-Meßgeräts (Mosman, 1983). Die
ursprünglich
von
Mosman
1983
beschriebene
Methodik
wurde
in
den
darauffolgenden Jahren durch mehrere Arbeitsgruppen (Tada et al., 1986; Hansen
et al., 1989; Denizot und Lang, 1986; Carmichael et al., 1987) abgeändert.
Dadurch
konnten
technische
Probleme
der
Methodik,
insbesondere
die
Serumprotein-Präzipitation durch Zugabe organischer Lösungsmittel, die inkomplette
Lösung
der
Formazan-Kristalle
(verminderte
Sensitivität
des
Assays),
die
Beeinträchtigung der kolorimetrischen Bestimmung durch Zugabe von Phenolrot und
die Stabilität des Farbproduktes, deutlich verbessert werden.
Nicht zuletzt aufgrund seiner einfachen und schnellen Durchführbarkeit wird dieser
Assay in der Forschung häufig angewandt.
II.2.5 Berechnungen und Datenanalysen
Alle pharmakokinetischen Daten wurden mit einem kommerziell erhältlichen
Computerprogramm (Topfit 2,0) nach der ″least squares method″ für ein ZweiKompartimentmodell berechnet.
Statistik
Korrelationen
zwischen
pharmakokinetischen
Parametern
und
der
relativen
Zellwachstumshemmung wurde eine lineare Regressionsanalyse zugrundegelegt.
Ein p-Wert < 0.05 wurde als signifikant gewertet.
Material und Methoden
38
III ERGEBNISSE
III.1 T EIL I: I N
VIVO -E XPERIMENTE
III.1.1 Bestimmung der Recovery in vitro
Vor Beginn der in vivo-Experimente wurden die Mikrodialysesonden in vitro kalibriert,
um sicherzustellen, daß der Diffusionsprozeß von MTX über die Sondenmembran
über einen weiten Konzentrationsbereich unabhängig von der MTX-Konzentration in
der Umgebung der Sonde ist. Die Sonden wurden in Stammlösungen verschiedener
MTX-Konzentrationen getaucht und mit physiologischer Kochsalzlösung perfundiert.
Die jeweilige MTX-Konzentration im Dialysat wurde anschließend gemessen.
Abbildung 7 zeigt die Assoziation zwischen der MTX-Konzentration in der
Stammlösung und der MTX-Konzentration im korrespondierenden Dialysat. Das
lineare Verhältnis der beiden Parameter (Regressionskoeffizient r=0.99) zeigt die
Konzentrationsunabhängigkeit der Recovery, die für MTX 35% betrug.
Konzentration im Dialysat (µM)
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
Konzentration in der Stammlösung (µM)
70
Abb.7: In vitro-Kalibrierung der Mikrodialysesonde für MTX: Assoziation zwischen der MTXKonzentration im Dialysat (µM) und der MTX-Konzentration in verschiedenen Stammlösungen (µM;
r= 0.99). Die in vitro-Recovery für MTX beträgt 35% bei einer Fließgeschwindigkeit von 1.5 µl/min.
Ergebnisse
39
III.1.2 Mikrodialyse in vivo
Die in vivo gemessenen MTX-Konzentrations-Zeit-Verläufe für Plasma, Subkutis und
Tumor aller neun Patientinnen sind in Abbildung 8 dargestellt. Die berechneten
pharmakokinetischen Parameter sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
14
13
12
M TX-Konzentration (µM )
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
30
60
90
120
150
180
Zeit (m in)
Abb.8: MTX-Konzentrations-Zeit-Verlauf für die drei Kompartimente Plasma, Subkutis und
Tumor über 180 Minuten nach einmaliger Gabe einer i.v.-Dosis von 40 mg/m2 MTX über 5
Minuten im Rahmen des ersten CMF-Therapiezyklus einer neoadjuvanten Chemotherapie bei 9
Patientinnen mit primärem Mammakarzinom. Die Abweichung vom Mittelwert der gemessenen
Werte, die sich durch die verschiedenen pharmakokinetischen in vivo-Experimente für jede Patientin
ergibt, ist durch vertikale Balken gekennzeichnet.
(Plasma (○), Subkutis (△); Tumor (▼); Mittelwerte ± SE).
Ergebnisse
40
cmax
tmax
AUC0-180 min
(µM)
(min)
(µM ·min)
Plasma
11.7 ± 2.30

550.4 ± 46.4
Subkutis
1.75 ± 0.53
43 ± 10
210.3 ± 91.1
Tumor
1.79 ± 0.76
43 ± 7
223.7 ± 76.8
Tab.1: Pharmakokinetische Parameter für Plasma, Subkutis und Tumorinterstitium nach
einmaliger Gabe einer i.v.-Dosis von 40 mg/m2 MTX über 5 Minuten im Rahmen des ersten
CMF-Therapiezyklus einer neoadjuvanten Chemotherapie bei 9 Patientinnen mit primärem
Mammakarzinom.
(cmax maximal erreichte MTX-Konzentration, tmax Zeitpunkt der erreichten cmax , AUC Fläche unter der
Konzentrations-Zeit-Kurve von 0-180 min; Mittelwerte ± SE).
Das Verhältnis AUCTumor / AUCPlasma betrug 0.60 ± 0.20, das Verhältnis AUCSubkutis /
AUCPlasma betrug 0.49 ± 0.19 (Mittelwerte ± SE). Die fehlende Korrelation zwischen
AUCPlasma und AUCTumor wird in Abbildung 9 deutlich (rs=-0.03 und p=0.93).
Die Transferrate vom Plasmakompartiment in die peripheren Kompartimente (k12)
betrug für das Tumorkompartiment 0.74 ± 0.24 und für das subkutane Kompartiment
0.70 ± 0.23 (Mittelwerte ± SE).
Bei vier Patientinnen wurden die Experimente während des ersten und zweiten
Chemotherapie-Zyklus durchgeführt. Bei ihnen betrug das Verhältnis AUCZyklus
AUCZyklus
2
1
/
0.87 ± 0.07 (Variationskoeffizient = 16%) für das Plasmakompartiment
und 0.98 ± 0.17 (Variationskoeffizient = 35%) für das Tumorkompartiment.
Bei fünf von neun Patientinnen kam es zu einer partiellen Remission, vier zeigten ein
unverändertes Krankheitsbild nach der Chemotherapie. Die mittlere AUCTumor betrug
107.2 ± 46.7 µmol·min·l-1 bei den Patientinnen mit partieller Remission und 34.9 ±
5.5 µmol·min·l-1 bei den anderen vier Patientinnen, die mittlere AUCPlasma betrug
609.6 ± 67.7 µmol·min·l-1 bei den Patientinnen mit partieller Remission und 476.5 ±
44.2 µmol·min·l-1 bei den vier anderen, wobei die Konzentrationsunterschiede
keinen signifikanten Unterschied darstellten.
Ergebnisse
41
AUC Tumor (µmol min l-1)
800
600
400
200
0
0
200
400
600
800
1000
AUC Plasma (µmol min l-1)
Abb.9: Assoziation zwischen AUCTumor und AUCPlasma (r= -0.03; p= 0.93) nach einmaliger Gabe
einer i.v.-Dosis von 40 mg/m2 MTX über 5 Minuten im Rahmen des ersten CMF-Therapiezyklus
einer neoadjuvanten Chemotherapie bei 9 Patientinnen mit primärem Mammakarzinom.
(Patientinnen mit unverändertem Krankheitsbild (■); Patientinnen mit partieller Tumorremission (□)).
Ergebnisse
42
III.2 T EIL II: I N
VITRO -E XPERIMENTE
III.2.1 Zytostatische Wirkung in vitro
Als repräsentatives Beispiel der Hemmung des Zellwachstums nach Inkubation der
MCF-7-Zellen mit einem Zytostatikum dient für alle durchgeführten PK/PDSimulationsmodelle Abbildung 10. Hier ist das Zellwachstum der zytostatisch mit
5-FU
behandelten
Zellen
der
Gruppe
mit
5.000
Zellen/well
für
jedes
zugrundeliegende in vivo-Experiment im Vergleich zum Zellwachstum der Kontrolle
zusammengefaßt dargestellt.
2,5
Absolute Extinktion
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Zeit (Tage)
Abb.10: Beispiel eines PK/PD-Simulationsmodells: Dargestellt ist die Anzahl vitaler Zellen,
ausgedrückt durch die Extinktion, an den Tagen 1, 2, 4 und 7 nach Inkubation mit 5-FU. Die
Abweichung der gemessenen Werte vom Mittelwert ist durch vertikale Balken gekennzeichnet.
(Kontrolle (○); 5.000 Zellen/well nach Inkubation mit 5-FU (●)).
Ergebnisse
43
III.2.2 PK/PD-Simulationsmodelle
Die Abbildungen 11a und b zeigen die Gegenüberstellung der interstitiellen
Konzentrations-Zeit-Verläufe für MTX, respektive 5-FU aller individuellen in vivoMikrodialyse-Experimente und des relativen Wachstums der mit den Zytostatika
inkubierten Mammakarzinomzellen mit der Ausgangszellzahl von 25.000 Zellen/well
in vitro. Der obere Teil jeder Abbildung repräsentiert den Konzentrations-Zeit-Verlauf
in vivo, der untere Teil das relative Zellwachstum in vitro. Korrespondierende in vivound in vitro-Kurven sind durch gleiche Symbole gekennzeichnet.
Die Zytostatika-Exposition der MCF-7-Zellen führte für MTX zu einer maximalen
Wachstumshemmung, ausgedrückt als Prozent vitaler Zellen von der Kontrolle, von
71%, d.h. einer Reduktion auf 29 ± 3% der ursprünglichen Zellzahl, an Tag 7 und für
5-FU zu einer maximalen Wachstumshemmung von 69%, d.h. einer Reduktion auf
31 ± 4% der ursprünglichen Zellzahl, an Tag 4.
Ergebnisse
44
10
Interstitille MTX-Konzentration (µM)
9
8
7
6
5
4
3
2
1
Relatives Zellwachstum (% der Kontrolle)
0
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
4000
8000
12000
Zeit (min)
Abb.11a: Interstitieller Konzentrations-Zeit-Verlauf für MTX in vivo nach einmaliger Gabe einer
i.v.-Dosis von 40 mg/m2 MTX über 5 Minuten im Rahmen des ersten CMF-Therapiezyklus einer
neoadjuvanten Chemotherapie bei 9 Patientinnen mit primärem Mammakarzinom (oben) und
relatives Zellwachstum in Abhängigkeit der Zeit in vitro, ausgedrückt als Prozent der Kontrolle,
für eine Ausgangszellzahl von 25.000 Zellen/well (unten).
Ergebnisse
45
Interstitielle 5-FU-Konzentration (µM)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Relatives Zellwachstum (% der Kontrolle)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
60
120
180
4000
8000
12000
Zeit (min)
Abb.11b: Interstitieller Konzentrations-Zeit-Verlauf für 5-FU in vivo nach einmaliger Gabe einer
i.v.-Dosis von 600 mg/m2 5-FU über 15 Minuten im Rahmen des ersten CMF-Therapiezyklus
einer neoadjuvanten Chemotherapie bei 8 Patientinnen und 2 Patienten mit primärem
Mammakarzinom (oben) und relatives Zellwachstum in Abhängigkeit der Zeit in vitro,
ausgedrückt als Prozent der Kontrolle, für eine Ausgangszellzahl von 25.000 Zellen/well
(unten).
An drei Patientinnen wurden auch während des 2. Therapiezyklus Mikrodialyse-Messungen
vorgenommen, daher sind 13 Kurven dargestellt.
Ergebnisse
46
III.2.3 Assoziation zwischen AUCTumor und zytostatischem Effekt
Die Abbildungen 12a und b zeigen für jede in vivo gemessene interstitielle Kinetik die
korrespondierende AUCTumor von MTX, respektive 5-FU und die Überlebensrate der
Mammakarzinomzellen in vitro, ausgedrückt als Prozent der Kontrolle, für eine
Ausgangszellzahl von 25.000 Zellen/well.
Relatives Zellwachstum (% der Kontrolle)
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
200
400
600
800
AUC (µM min)
Abb.12a: Assoziation zwischen AUCTumor (µM · min) und relativem Zellwachstum (% der
Kontrolle) nach Inkubation von 25.000 Zellen/well mit MTX (r= 0.05; p= 0.88).
Relatives Zellwachstum (% der Kontrolle)
(Patientinnen mit unverändertem Krankheitsbild (■), Patientinnen mit partieller Remission (□)).
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
250
500
750
AUC (µM min)
Abb.12b: Assoziation zwischen AUCTumor (µM · min) und relativem Zellwachstum (% der
Kontrolle) nach Inkubation von 25.000 Zellen/well mit 5-FU (r= -0.82; p= 0.0005).
(Patientinnen mit unverändertem Krankheitsbild (■), Patientinnen mit partieller Remission (□)).
Ergebnisse
47
III.2.4 PK/PD-Simulation
unter
simultaner
Inkubation
mit
Methotrexat und 5-Fluorouracil
Die Abbildungen 13a, b und c zeigen das für alle in vitro-Versuche ermittelte
durchschnittliche relative Wachstum der Zellen nach der Inkubation mit MTX, 5-FU,
bzw. einer Kombination von MTX und 5-FU als Prozent der Kontrolle für eine
Ausgangszellzahl von 5.000 (Abb.13a), 15.000 (Abb.13b) und 25.000 Zellen
(Abb.13c) pro well. Das Zellwachstum ist über einen Zeitraum von sieben Tagen
dargestellt.
Für die simultane Applikation von MTX und 5-FU wurden die Mittelwerte aller durch
Mikrodialyse in vivo gemessenen Konzentrationswerte im Tumorinterstitium von
MTX, bzw. 5-FU berechnet und die Zellen mit diesen Konzentrationen inkubiert.
Relatives Zellwachstum (% der Kontrolle)
1,5
1,0
0,5
0,0
0
2
4
6
8
Zeit (Tage)
0
2
4
6
8
Zeit (Tage)
13a
0
2
4
6
8
Zeit (Tage)
13b
13c
Abb.13: Relatives Zellwachstum, ausgedrückt als Prozent der Kontrolle, nach Inkubation von
5.000 Zellen/well (Abb.13a), 15.000 Zellen/well (Abb.13b) und 25.000 Zellen/well (Abb.13c) mit
MTX, 5-FU und einer Kombination von MTX und 5-FU über einen Zeitraum von sieben Tagen.
(5-FU (□), MTX (∆), Kombination von 5-FU und MTX (●)).
Ergebnisse
48
III.2.5 Assoziation zwischen Zellzahl und zytostatischer Wirkung
Die Abbildungen 14a und b zeigen das für alle in vitro-Versuche durchschnittliche
relative Zellwachstum nach der Zytostatika-Exposition der Zellen als Prozent der
Kontrolle für eine Ausgangszellzahl von 5.000, 15.000, bzw. 25.000 Zellen pro well:
Relatives Zellwachstum (% der Kontrolle)
1,50
1,25
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Zeit (Tage)
Abb.14a: Durchschnittliches relatives Zellwachstum, ausgedrückt als Prozent der Kontrolle,
für eine Ausgangszahl von 5.000, 15.000 und 25.000 Zellen pro well an den Tagen 1, 2, 4 und 7
nach Inkubation der Zellen mit MTX. Die Abweichung der gemessenen Werte vom Mittelwert, die
sich durch die individuellen pharmakokinetischen in vivo-Experimente für jede Patientin ergibt, ist
durch vertikale Balken gekennzeichnet.
(5.000 Zellen/well (■); 15.000 Zellen/well (○); 25.000 Zellen/well (▲)).
Ergebnisse
49
Relatives Zellwachstum (% der Kontrolle)
1,50
1,25
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Zeit (Tage)
Abb.14b: Durchschnittliches relatives Zellwachstum, ausgedrückt als Prozent der Kontrolle,
für eine Ausgangszahl von 5.000, 15.000 und 25.000 Zellen pro well an den Tagen 1, 2, 4 und 7
nach Inkubation der Zellen mit 5-FU. Die Abweichung der gemessenen Werte vom Mittelwert, die
sich durch die individuellen pharmakokinetischen in vivo-Experimente für jede Patientin/jeden
Patienten ergibt, ist durch vertikale Balken gekennzeichnet.
(5.000 Zellen/well (■); 15.000 Zellen/well (○); 25.000 Zellen/well (▲)).
Sowohl für MTX als auch für 5-FU zeigte sich ein deutlicher Einfluß der
ursprünglichen Zellzahl auf den zytostatischen Effekt. Eine höhere initiale Zellzahl
war mit einer niedrigeren Wachstumshemmung verbunden.
Ergebnisse
50
IV DISKUSSION
Die in der Chemotherapie solider Tumoren etablierten Dosierungsrichtlinien für
verschiedene Zytostatika stützen sich auf Messungen der in vivo-dose intensity im
Plasma, welche mit der effektiv wirksamen dose intensity am Zielort gleichgesetzt
wird. Einige Studien konnten jedoch zeigen, daß die im Plasma erreichte
Konzentration eines Zytostatikums aufgrund der sehr variablen Penetration aus dem
Blut in solide Tumoren meist nicht mit der am Wirkort erreichten Konzentration
übereinstimmt (Front et al., 1987; Pujol et al., 1990; Presant et al., 1994; Müller et al.,
1997b). Dies könnte ein Grund dafür sein, daß viele in vitro hochaktive Zytostatika in
vivo nicht in gleichem Maße wirksam sind. Obwohl das Konzept der Tumor-dose
intensity generell anerkannt ist (Evans und Relling, 1989), ist der experimentellen
Untersuchung der Penetration von Zytostatika in solide Tumoren bislang nur wenig
Beachtung geschenkt worden (Bateman et al., 1979; Front et al., 1987; Pujol et al.,
1990; Presant et al., 1994; Müller et al., 1997b).
Verschiedene Studien konnten jedoch bereits zeigen, daß ein eingeschränkter
Transfer von Medikamenten aus dem Blut über das Tumorendothel in das
Tumorinterstitium einen kritischen Punkt in bezug auf die Tumoransprechrate unter
einer Chemotherapie darstellt (Jain, 1987, 1989, 1994 und 1998; Ekstrøm et al.,
1995; Müller et al.,1997b). Folge eines eingeschränkten Transports ist eine im
Vergleich mit der Plasmakonzentration geringere Zielgewebskonzentration des
Zytostatikums, denen die Zellen während einer bestimmten Zeit ausgesetzt sind, was
zu einer Einschränkung der klinischen Wirksamkeit beitragen kann (Presant et al.,
1994; Ekstrøm et al., 1995; Müller et al.,1997b).
Interstitielle Zytostatika-Konzentrationen in soliden Tumoren des Menschen wurden
bislang nur in wenigen Studien gemessen. Die relativ neue klinische Technik der
Mikrodialyse bietet die Möglichkeit, in vivo am Menschen pharmakokinetische
Messungen im Tumorinterstitium durchzuführen (Blöchl-Daum et al., 1996; Müller et
al., 1997b; Ekstrøm, 1997).
Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die Pharmakokinetik von freiem, d.h.
pharmakologisch wirksamem MTX im Tumorinterstitium von MammakarzinomPatientinnen mit Hilfe der Mikrodialyse-Methodik im Rahmen einer Chemotherapie zu
messen. Dabei sollten die Zusammenhänge zwischen dem transendothelialen
Diskussion
51
Transport von MTX in das Tumorgewebe, welcher die Voraussetzung für eine
entsprechend
hohe
interstitielle
Zytostatika-Konzentration
ist,
und
der
Tumoransprechrate untersucht werden.
Ferner sollte mit den in vivo ermittelten pharmakokinetischen Konzentrations-ZeitProfilen von MTX und 5-FU (letztere aus der Studie Müller et al., 1997b) die
Pharmakodynamik
Simulationsmodell
der
beiden
Zytostatika
nachvollzogen
am
werden,
Zielort
um
in
die
einem
in
vitro-
Reaktion
von
Mammakarzinomzellen auf die direkte Zytostatika-Exposition zu untersuchen. Dabei
wurde den Fragen nachgegangen, inwieweit sich die verschiedenen ZytostatikaKonzentrationen auf die Wachstumshemmung der Zellen auswirken und ob die
Tumorzellzahl die zytostatische Wirkung beeinflußt.
Da MTX und 5-FU in Kombination im Rahmen der Chemotherapie nach dem CMFSchema verabreicht werden, wurde in der vorliegenden Arbeit auch untersucht, wie
sich eine simultane Inkubation von Tumorzellen mit beiden Zytostatika auf den
zytostatischen Effekt auswirkt. Zu diesem Zweck wurde ein weiteres Experiment
durchgeführt, bei dem Mammakarzinomzellen entsprechend der Mittelwerte der
in vivo gemessenen MTX- und 5-FU-Konzentrations-Zeit-Verläufe inkubiert wurden.
IV.1 T EIL I: I N
VIVO -E XPERIMENTE
Für die klinische Studie schien ein neoadjuvantes Therapieschema am geeignetsten,
da die Zahl resistenter Zellklone in den noch unbehandelten Tumoren als relativ
gering angenommen werden kann (Goldie und Coldman; 1979; Fisher, 1995).
Dementsprechend kann auch davon ausgegangen werden, daß ein fehlender
Zusammenhang zwischen der Konzentration des Zytostatikums im Tumorinterstitium
und der klinischen Reaktion des Tumors eher eine pharmakokinetisch bedingte
Resistenz als eine Resistenz auf zellulärer Ebene widerspiegelt. Im Gegensatz dazu
hätte bei einem palliativen Therapieschema berücksichtigt werden müssen, daß eine
eventuelle Vorbehandlung des Tumors zur Induktion resistenter Zellklone führen
kann.
Diskussion
52
Die interstitielle AUC des freien, nicht an Proteine gebundenen intratumoralen MTX
wurde als Hauptvariable der Experimente bestimmt, da die interstitielle Dosis an
freiem MTX im Tumor ein direktes Maß für die pharmakologisch wirksame
Medikamentenkonzentration am Wirkort darstellt.
Die Zeitkurven für die mittlere Konzentration in Subkutis und Tumor zeigten keine
signifikanten Unterschiede (siehe Abb.8 und Tab.1). Dabei muß allerdings auch für
zukünftige Studien bedacht werden, daß für individuelle Patienten zu den einzelnen
Meßzeitpunkten ein deutlicher Unterschied in der MTX-Konzentration in Subkutis und
Tumor meßbar sein kann. Die Konzentrationen in Subkutis und Tumor der einzelnen
Patienten dürfen dementsprechend nicht a priori gleichgesetzt werden. Interessant
wären in diesem Zusammenhang Mikrodialyse-Messungen an einer größeren Menge
von Patienten. Dadurch könnte überprüft werden, ob die mittleren Konzentrationen in
Subkutis und Tumor auch bei einer größeren Patientenmenge statistisch keinen
signifikanten Unterschied zeigen und dadurch in Zukunft eventuell auch einfacher
durchzuführende Messungen in der Subkutis als repräsentativ für den Tumor gelten
könnten.
Die mittlere Transferrate (k12) vom zentralen Kompartiment (Plasma) in die
peripheren Kompartimente (Subkutis und Tumorgewebe) beweist eine rasche
Equilibrierung zwischen der MTX-Konzentration im Plasma und den freien MTXKonzentrationen in Subkutis und Tumor. Die interstitiellen Konzentrationen in beiden
peripheren
Kompartimenten
betrugen
etwa
50%
der
korrespondierenden
Plasmawerte (siehe Abb. 8). Diese Ergebnisse stimmen mit der in der Literatur
beschriebenen Plasmaproteinbindung von MTX von ca. 50% (Paxton, 1982; Dollery,
1991a) überein.
Die intraindividuelle Variabilität der Tumorexposition für MTX, ausgedrückt als
Quotient AUCZyklus 1 / AUCZyklus 2, betrug 16% für das Plasmakompartiment und 30%
für das Tumorkompartiment. Im Gegensatz dazu war die interindividuelle Variabilität
der AUC-Werte während des ersten Therapiezyklus relativ hoch, obwohl die
verabreichte MTX-Dosis basierend auf der Körperoberfläche jeder Patientin
errechnet wurde. Der Variationskoeffizient betrug 41% für das Plasma- und 103% für
das Tumorkompartiment. Der Plasma-Tumor-Transfer, ausgedrückt als AUCPlasma /
AUCTumor, zeigte ebenfalls eine hohe interindividuelle Variabilität. Für die meisten
pharmakokinetischen Parameter zeigte sich eine höhere Variabilität für die
Tumorwerte als für die korrespondierenden Plasmawerte. Diese Beobachtungen
Diskussion
53
zeigen, daß der Transfer vom Plasmakompartiment in das Interstitium keine
konstante, sondern vielmehr eine individuell variable Größe für jeden einzelnen
Patienten darstellt.
Dieses Ergebnis bekräftigt frühere Studien, die zeigten, daß die Penetration solider
Tumoren durch Zytostatika sehr variabel ist (Jain, 1987, 1989, 1994 und 1998;
Ekstrøm et al., 1995; Müller et al.,1997b). Zu den Gründen für diese Beobachtung
zählen ein meist heterogener Aufbau des Kapillarnetzes innerhalb eines Tumors, das
außerdem vermehrt arterio-venöse Shunts aufweist. Zwar ist in verschiedenen
Studien eine erhöhte Permeabilität von Tumorgefäßen festgestellt worden (Jain,
1987), jedoch finden sich innerhalb eines Tumors Regionen mit hohem interstitiellem
Druck, der dem Übertritt von Flüssigkeit und Makromolekülen aus der Blutbahn ins
Interstitium entgegenwirkt (Baxter und Jain, 1989; Young et al., 1950). Der erhöhte
Druck innerhalb des Tumors kann in manchen Regionen zu einem völligen Stillstand
des Transports von Molekülen über die Gefäßwand führen. Da der interstitielle Raum
im Tumorgewebe zusätzlich vergrößert ist (Jain, 1989), ist die Diffusion von
Molekülen aus der Tumorperipherie ins Zentrum des Tumors stark verlangsamt und
teilweise gänzlich inhibiert (Jain und Baxter, 1988). Der Transport innerhalb des
Tumorinterstitiums ist dementsprechend von der Konvektion abhängig. Aufgrund des
hohen interstitiellen Drucks im Tumorzentrum tritt den Molekülen jedoch bereits in
der Tumorperipherie eine nach außen gerichtete Konvektion entgegen, die ein
Vordringen in das Tumorzentrum behindert (Jain und Baxter, 1988). Je größer ein
Tumor
ist,
desto
geringer
ist
darüber
hinaus
die
durchschnittliche
Kapillarwandoberfläche, so daß bei größeren Tumoren der transkapilläre Austausch
im Verhältnis noch geringer ist.
Es ist also vorstellbar, daß die hohe interindividuelle Variabilität der MTXKonzentration im Tumorinterstitium in der vorliegenden Studie trotz der relativen
Homogenität der Patientengruppe auf individuelle Unterschiede in Tumoraufbau,
-größe und -durchblutung zurückzuführen sein könnte.
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie bekräftigen experimentell am Menschen und
im Tierversuch durchgeführte Studien, bei denen kein Zusammenhang zwischen der
ungebundenen Zytostatika-Konzentration im Plasma und im Tumor gefunden wurde
(Blöchl-Daum et al., 1996, Müller et al., 1997b; Dukic et al., 1998). Die Annahme
einer linearen Relation zwischen MTX-Plasmaspiegeln und intratumoralen Spiegeln,
und damit höchstwahrscheinlich auch eines erhofften therapeutischen Effekts,
Diskussion
54
konnte durch die vorliegende Studie nicht unterstützt werden. Zwar sind Messungen
der Plasma-MTX-Konzentration zur Therapieüberwachung anerkannt (Stroller et al.,
1977; Kerr et al., 1983), jedoch scheinen die gemessenen Werte keinen zusätzlichen
prädiktiven Wert für intratumorale MTX-Konzentrationen und einen daraus folgenden
therapeutischen Effekt zu haben.
Zwar läßt die geringe Patientenzahl keine detaillierte statistische Auswertung zu,
jedoch waren weder die Zytostatika-Konzentration im Plasma, noch diejenige im
Tumor mit einem positiven Ansprechen des Tumors assoziiert. Darüber hinaus gab
es auch keinen klaren Zusammenhang zwischen der Plasma-Tumor-Transferrate
(k12) und der Tumoransprechrate. Wie sind diese unterschiedlichen Beobachtungen
zu erklären?
Erstens erhielten die in der vorliegenden Studie eingeschlossenen Patientinnen eine
Therapie nach dem CMF-Schema, also eine Kombinationstherapie mit drei
verschiedenen Zytostatika. Nachdem ein positiver Zusammenhang zwischen der
intratumoralen 5-FU-Kinetik und der klinischen Tumoransprechrate nachgewiesen
werden konnte (Presant et al., 1994; Müller et al., 1997b), bleibt offen, ob der Erfolg
einer kombinierten Chemotherapie von einem die Tumoransprechrate bestimmenden
Medikament abhängig ist, und ob sich die in der Kombinationstherapie enthaltenen
Medikamente gegenseitig beeinflussen. In diesem Zusammenhang wäre auch eine
PK/PD-Simulation mit der Kombination aller drei im CMF-Schema enthaltenen
Zytostatika von Interesse. Experimentelle Untersuchungen mit Cyclophosphamid
sind jedoch limitiert, da es sich bei Cyclophosphamid um ein sogenanntes ″pro-drug″
handelt, das im menschlichen Körper erst in seine aktive Form umgewandelt wird
und somit in vitro keinen zytostatischen Effekt wie in vivo aufweist (Colvin et al.,
1973).
Zweitens könnte eine Resistenzentwicklung des Tumors eine Rolle spielen. Im
Verlauf der Behandlung mit MTX kann es aus verschiedenen Gründen zur
Entwicklung von Resistenzen kommen, welche durch folgende Phänomene erklärt
werden können:
•
Verminderte Aufnahme von MTX in die Zellen durch eine verminderte Affinität der
carrier für MTX (Curt et al., 1983 und 1985).
•
Verminderte Affinität der DHFR für MTX: Resistente Zellen können eine in bezug
auf ihr Molekulargewicht oder ihre Bindungsaffinität für MTX veränderte DHFR
aufweisen.
Auch
kann
die
veränderte
DHFR
nur
noch
für
andere
Diskussion
55
Folsäureantagonisten eine Affinität besitzen (Melera et al., 1988; Dicker et al.,
1990).
•
Vermehrte Bildung von DHFR aufgrund einer erhöhten Anzahl von für dieses
Enzym kodierenden Genen (″Gen-Amplifikation″; Haber und Schimke, 1981).
•
Verminderte Polyglutaminierung (Curt et al., 1983 und 1985).
Alle diese Überlegungen sprechen dafür, daß es höchstwahrscheinlich nicht möglich
ist, ein einfaches Konzept für eine wirksame MTX-Konzentration anzugeben, wie es
für verschiedene Antibiotika durch die ″minimale Hemmkonzentration″ möglich ist.
IV.2 T EIL II: I N
VITRO -E XPERIMENTE
Die Inkubation von MCF-7-Mammakarzinomzellen mit MTX, 5-FU und der
Kombination beider Zytostatika führte in allen PK/PD-Simulationsmodellen und in
allen drei Versuchsansätzen mit 5.000, 15.000 und 25.000 Zellen pro well zu einer
Wachstumshemmung der Zellen im Vergleich zur Kontrolle (siehe Abb.10).
Die Abbildungen 11a und 11b zeigen die individuelle intratumorale in vivoPharmakokinetik aller Patientinnen und Patienten, ausgedrückt als ZytostatikaKonzentration
pro
Zeit,
und
die
korrespondierende
in
vitro
ermittelte
Pharmakodynamik, ausgedrückt als Wachstumshemmung im Vergleich zur Kontrolle
pro
Zeit.
Die
Diagramme
zeigen
deutliche
Unterschiede
sowohl
im
pharmakokinetischen Verlauf als auch im pharmakodynamischen Effekt von MTX
und 5-FU. Für MTX zeigt sich ein durchschnittlich flacherer Konzentrationsanstieg im
Tumorinterstitium als für 5-FU. Gleichzeitig fällt die interstitielle 5-FU-Konzentration
schneller wieder ab als die MTX-Konzentration. Dies läßt sich durch die
unterschiedliche Plasma-Halbwertszeit der beiden Pharmaka erklären, die für MTX
8-10 Stunden, für 5-FU jedoch lediglich 20-30 Minuten beträgt (Dollery, 1991a/b).
Zusätzlich wird die Wirkung von MTX durch die im Körper stattfindende Bildung von
Polyglutamaten prolongiert.
Auch die Pharmakodynamik der beiden Zytostatika unterscheidet sich deutlich.
Während MTX erst an Tag 4 zu einer deutlichen Inhibition des Zellwachstums führt,
setzt der zytostatische Effekt von 5-FU bereits an Tag 1 ein. Die Wirkung von MTX
hält im Vergleich zu der von 5-FU sehr viel länger an. Im beobachteten Zeitraum von
Diskussion
56
7 Tagen kam es bei den MTX-exponierten Zellen nicht wieder zu einem Anstieg des
Zellwachstums im Vergleich zur Kontrolle. Im Gegensatz dazu kam es bei den 5-FUexponierten Zellen spätestens nach Tag 4 zu einem erneuten Anstieg der Zellzahl.
Die Abbildungen 12a und 12b zeigen den Zusammenhang zwischen der AUCTumor
der Zytostatika und dem zytostatischen Effekt, also der Wachstumshemmung der
Zellen, in vitro. Wieder lassen sich einige Unterschiede hinsichtlich der Wirkung der
beiden Zytostatika feststellen. Während die AUCTumor für 5-FU deutlich mit dem
erwünschten Effekt korreliert, zeigt sich für MTX kein Zusammenhang zwischen der
AUCTumor und dem zytostatischen Effekt. Diese durch die PK/PD-Simulation
gewonnenen Ergebnisse bekräftigen die Ergebnisse früherer Studien (Jain 1987,
1989, 1996 und 1998; Müller et al., 1997b) und der in dieser Arbeit vorgestellten
in vivo-Studie, daß für einzelne Zytostatika die sehr variable Verteilungskinetik
Einfluß auf die Pharmakodynamik hat. Es konnte gezeigt werden, daß für 5-FU im
Gegensatz zu MTX der transendotheliale Transport in das Tumorinterstitium ein
limitierender Faktor für die Tumoransprechrate ist. Für MTX könnte, wie im
vorangehenden Kapitel bereits erörtert, der die Ansprechrate limitierende Faktor auf
zellulärer Ebene liegen.
Das
vorliegende
PK/PD-Simulationsmodell
verdeutlicht
ebenfalls
das
Zusammenspiel der Pharmakodynamik verschiedener Zytostatika. Dies ist in
Abbildung 13 zu sehen, in der die Wirkung von MTX und 5-FU nach simultaner
Applikation im Vergleich zu den einzelnen pharmakodynamischen Verläufen der
beiden Zytostatika dargestellt ist. Deutlich zu erkennen ist der sofortige Abfall der
Zellzahl an Tag 1 für die kombinierte in vitro-Pharmakodynamik. Da MTX zunächst
kaum Wirkung zeigt, muß der initiale Effekt für die kombinierte Dynamik in der
Wirkung von 5-FU begründet liegen, wie sich auch aus dem Verlauf für die isolierte
5-FU-Dynamik ableiten läßt. Während die Zellzahl der 5-FU-Dynamik ab Tag 2
wieder kontinuierlich sinkt, wirkt nun MTX, was sich auch in der kombinierten
Dynamik durch einen weiteren Abfall der Zellzahl bemerkbar macht. Nach vier Tagen
wird der zytostatische Effekt allein durch die Wirkung von MTX bestimmt. Durch die
Überlagerung der 5-FU- und MTX-Dynamik kommt es somit zu einem summativen
Effekt. Die zytostatische Wirkung ist, zumindest für die Experimente mit 15.000 und
25.000 Zellen, bei der Inkubation mit beiden Zytostatika stärker.
Dieses Ergebnis unterstreicht den Sinn einer kombinierten Chemotherapie mit MTX
und 5-FU. Es zeigt, daß die zytostatische Wirkung jedes der beiden Medikamente
Diskussion
57
zwar einzeln vorhanden ist, jedoch besonders in Kombination zu einer länger
andauernden Wachstumshemmung der Zellen führt. Dieses Ergebnis bekräftigt
frühere Studien, in denen gezeigt wurde, daß sich unterschiedliche Zytostatika in
Kombination gegenseitig in ihrer Wirkung beeinflussen und die Gesamtwirkung auf
den Tumor auch dadurch, und nicht nur durch die additive Wirkung der einzelnen
Medikamente, verändert wird (Cadman et al., 1981; Herrick et al., 1982). Abgesehen
vom zeitlichen Aspekt der Wirksamkeit der beiden Zytostatika (siehe Abb.13a/b/c)
könnte der Kombinationseffekt von MTX und 5-FU einigen Studien zufolge damit
zusammenhängen, daß MTX den Einbau von 5-FU in die RNS durch Anheben des
Phosphoribosyl-1-pyrophosphatase-Spiegels fördert (Cadman et al, 1979 und 1981;
Damon et al., 1989; Sotos et al., 1994).
Eine Abhängigkeit der zytostatischen Wirkung konnte auch in bezug auf die
Zytostatika-exponierte
Ausgangszellzahl
pro
well
festgestellt
werden
(siehe
Abb.14a/b). Besonders deutlich zeigt sich dieses Resultat für die 5-FUSimulationsmodelle. Dieses Ergebnis läßt sich unter Umständen durch das
Phänomen
der
″multicellular
drug
resistance″
erklären,
wobei
eine
Zytostatikaresistenz aufgrund interzellulärer Kontakte hervorgerufen wird (St.Croix et
al., 1998). Die vorliegende Studie bekräftigt frühere Studien, indem sie erneut zeigt,
daß Resistenzen nicht nur aufgrund eines eingeschränkten transendothelialen
Transports von Zytostatika (Jain, 1987, 1994 und 1998) und aufgrund intrazellulärer
Mechanismen (Volm, 1998), sondern auch aufgrund interzellulärer Adhäsion
(St.Croix et al., 1998) ausgebildet werden können. Sowohl Resistenzen aufgrund
einer limitierten Zytostatika-Penetration als auch aufgrund interzellulärer Adhäsion
sind vom Tumorinterstitium abhängig und könnten eine Erklärung dafür bieten,
warum besonders große Tumoren oft schlecht auf eine zytostatische Chemotherapie
ansprechen.
Diskussion
58
IV.3 S CHLUSSFOLGERUNG
Die vorliegenden in vivo-Experimente führten zu dem Ergebnis, daß die AUCPlasma
von MTX keinen prädiktiven Wert für die erreichte AUCTumor darstellt und daß weder
die AUCPlasma, noch die AUCTumor von MTX mit der Tumoransprechrate korreliert. Der
Transport von MTX aus der Blutbahn in das Tumorinterstitium stellt nach diesen
Ergebnissen keinen limitierenden Faktor für die Tumoransprechrate dar.
Durch die vorliegenden in vitro-Experimente konnten diese Ergebnisse bestätigt und
daraus geschlossen werden, daß der zytostatische Effekt von MTX von
Einflußfaktoren distal des transendothelialen Transports abhängig sein muß. Für
5-FU hingegen zeigte sich eine Abhängigkeit des zytostatischen Effekts von der
Penetration des Zytostatikums in das Tumorinterstitium, ein Ergebnis, welches
frühere klinische Beobachtungen bekräftigt (Müller et al., 1997b).
Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, daß durch PK/PD-Simulationsmodelle nach
Erhebung pharmakokinetischer Daten durch interstitielle Mikrodialysemessungen die
Pharmakodynamik verschiedener Zytostatika im Tumorinterstitium beschrieben und
prädiktive Aussagen über den zytostatischen Effekt in vivo getroffen werden können.
Diskussion
59
V ZUSAMMENFASSUNG
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zum einen den Einfluß des transendothelialen
Transports von Zytostatika aus der Blutbahn in das Tumorinterstitium auf die
Tumoransprechrate, und zum anderen den Einfluß der Zytostatika-Konzentration im
Tumorinterstitium auf die Tumoransprechrate zu untersuchen.
Hierfür wurden klinische in vivo-Experimente bei Patientinnen mit primärem
Mammakarzinom mittels Mikrodialyse und in vitro-Experimente an Mammakarzinomzellen der Zellinie MCF-7 durchgeführt. Durch in vitro-Inkubation von Zellen
auf Basis der in vivo emittelten Pharmakokinetik verschiedener Zytostatika konnte die
Pharmakodynamik dieser Zytostatika am Wirkort simuliert werden.
Die Mikrodialyse-Experimente wurden im Rahmen des ersten Behandlungszyklus
einer neoadjuvanten CMF-Chemotherapie bei 9 Patientinnen mit primärem
Mammakarzinom durchgeführt. Nach einmaliger Gabe einer i.v.-Dosis von 40 mg/m2
MTX
wurde
der
Konzentrations-Zeit-Verlauf
von
MTX
in
Plasma
und
Tumorinterstitium über 180 Minuten gemessen. Vier Patientinnen nahmen ein
zweites Mal an Mikrodialysemessungen während des zweiten Therapiezyklus teil.
Für die in vitro-Experimente wurden MCF-7-Mammakarzinomzellen nach den in vivo
ermittelten Konzentrations-Zeit-Verläufen mit MTX, respektive 5-FU inkubiert (in vivoKonzentrations-Zeit-Verläufe der Mikrodialyse-Studie von Müller et al., 1997b). Des
weiteren wurden Zellen einer Kombination von MTX und 5-FU ausgesetzt.
Die in vivo-Experimente zeigten eine hohe interindividuelle Variabilität für den
Plasma-Tumor-Transfer von MTX, ausgedrückt als AUCPlasma / AUCTumor und eine
geringe intraindividuelle Variabilität der Tumorexposition für MTX, ausgedrückt als
AUCZyklus 1 / AUCZyklus 2 . Weder die MTX-Konzentration im Plasma, noch diejenige im
Tumorinterstitium war mit der Tumoransprechrate assoziiert.
Auch in vitro zeigte sich für MTX kein Zusammenhang zwischen der AUCTumor und
dem zytostatischen Effekt. Für 5-FU hingegen konnte eine deutliche Assoziation
zwischen AUCTumor und der zytostatischen Wirkung nachgewiesen werden. Durch
Inkubation der Zellen mit der Kombination von MTX und 5-FU konnte eine stärkere
zytostatische Wirkung erzielt werden als durch Inkubation mit nur einem der beiden
Zytostatika. Des weiteren zeigten die in vitro-Experimente eine Abhängigkeit der
zytostatischen Wirkung von der Ausgangszellzahl.
Zusammenfassung
60
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VII ANHANG
VII.1 A BKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Abb.
Abbildung
AUC
Area Under the Curve
°C
Temperatur in Grad Celsius
cmax
maximal erreichte Konzentration
CMF
Cyclophosphamid/Methotrexat/5-Fluorouracil
DHFR
Dihydrofolat-Reduktase
DNS
Desoxyribonukleinsäure
dTMP
Desoxythymidylat
dUMP
Desoxyuridylat
EC-GCP-Richtlinien
Good Clinical Practice Guidelines
der Europäischen Kommission
ECOG-scale
Eastern Cooperative Oncology Group-scale
ELISA
Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
F-dUMP
5-Fluorodesoxyuridylat
FEC
5-FU/Epirubicin/Cyclophosphamid
5-FU
5-Fluorouracil
FH4
Tetrahydrofolsäure
FH2
Dihydrofolsäure
FPI-Assay
Fluorescence Polarization Immuno-Assay
G0/G1/G2
von Gap = Lücke
H+
Wasserstoffatom (Proton)
IE
Internationale Einheit
kD
Kilo Dalton
MDR-I
Multi-Drug-Resistance-Gen
mg
Milligramm
min
Minute
Anhang
70
MRS
Magnetresonanzspektroskopie
MTT
3,(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid
MTX
Methotrexat
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
µm
Mikrometer
µM
Mikromol/l
NADP+
Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
nm
Nanometer
PET
Positronenemissionstomographie
PK/PD
Pharmakokinetik/Pharmakodynamik
RNS
Ribonukleinsäure
RPMI
Rose Park Memorial Institute
SD
Standardabweichung der Stichprobe
SE
Standardfehler
tmax
Zeitpunkt bis zum Erreichen der maximalen Konzentration
TNM-Klassifikation
T = Tumor (Ausdehnung des Primärtumors)
N = Nodulus (regionäre Lymphknotenmetastasen)
M = Metastasen (Fernmetastasen)
WHO
World Health Organization
Anhang
71
VII.2 L EBENSLAUF
Persönliche Daten
Name
Geburtsdatum
Geburtsort
Staatsangehörigkeit
Eltern
Julia Maria Theresia Bockenheimer
12. Februar 1974
Worms
deutsch
Dr. med. Gisela Bockenheimer-Lucius
Prof. Dr. med. Stephan Bockenheimer
Schul- und Universitätsausbildung
1980-1984
1984-1993
1990/91
06/1993
04-07/1994
Seit WS 1994/95
09/1996
08/1997
1997-1999
03/2000
Besuch der Grundschule Merzhausen
Besuch des Gymnasiums ″Kaiserin-Friedrich-Schule″, Bad
Homburg
Schuljahr im Rahmen eines Schüleraustausch-Programms an
der ″Central Bucks Highschool West″, Doylestown, Pennsylvania,
USA
Abitur an der ″Kaiserin-Friedrich-Schule″, Bad Homburg
Aufenthalt in Paris; Besuch der Sprachschule ″Alliance
Française″
Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i.Br.
Physikum
Erstes Staatsexamen
Dreisemestriger Studienaufenthalt an der Universität Wien;
Wissenschaftliche Mitarbeit und Fertigstellung der Doktorarbeit
an der Abteilung für Klinische Pharmakologie des Allgemeinen
Krankenhauses der Universität Wien
Zweites Staatsexamen
Famulaturen
03/1997
01/1998
08-09/1998
07/1999
08/1999
Abteilung für Abdominal-Chirurgie am Kreiskrankenhaus Bad
Homburg
Abteilung für Innere Medizin am Allgemeinen Krankenhaus der
Universität Wien
Abteilung für Anästhesie am ″Tampa General Hospital″ und ″H.
Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute″ der University
of South Florida, Florida, USA
Abteilung für Gynäkologie und Geburtshilfe der Universitätsklinik
Freiburg
Radiologische Praxis ″Urania-Zentrum″, Wien
Anhang
72
Medizinische Praktika / Nebentätigkeiten
09-11/1993
01-03/1994
03/1996
WS 1998/99
Seit 05/1999
Krankenpflegepraktikum am Kreiskrankenhaus Bad Homburg
Krankenpflegepraktikum an der Neurologischen Klinik Bad
Homburg; im Verlauf des Studiums Aushilfstätigkeit während der
Semesterferien
Praktikum
an
der
Abteilung
für
Geburtshilfe
am
Missionskrankenhaus Uwemba, Tanzania
Ultraschallkurs an der Universität Wien
Stelle als Labormitarbeiterin in der Abteilung für Mikrobiologie im
″Labor Clotten″, Freiburg
Publikationen / Auszeichnungen
♦ Müller M, Brunner M, Schmid R, Mader RM, Bockenheimer J, Steger GG,
Steiner B, Eichler HG, Blöchl-Daum B (1998): Interstitial Methotrexate Kinetics
in Primary Breast Cancer Lesions. Cancer Res 58, 2982-2985.
♦ Müller M, Bockenheimer J, Zellenberg U, Klein N, Steger GG, Eichler HG,
Mader RM (2000): Relationship between in vivo drug exposure of the tumor
interstitium and inhibition of tumor cell growth in vitro: a study in breast cancer
patients. Breast Cancer Res Treat 1678: 1-7.
Für die Arbeit ″Interstitial Methotrexate Kinetics in Primary Breast Cancer Lesions″
(1998; Cancer Res 58, 2982-2985) wurde durch die ″Österreichische Gesellschaft für
Hämatologie und Onkologie″ der Wolfgang Denk Preis 1998 verliehen.
Anhang
73
VII.3 D ANKSAGUNG
Mein Dank gilt ganz besonders Herrn Prof. Dr. Markus Müller, der mich mit der
Methodik der Mikrodialyse vertraut machte und bei der Themenfindung für diese
Dissertation eine große Hilfe war. Für Fragen im theoretischen wie auch im
praktischen Bereich nahm er sich stets Zeit und stand mir immer unterstützend zur
Seite.
Prof. Dr. Robert Mader und seinem Laborteam bin ich sehr dankbar für die Geduld
und Zeit, die sie aufbrachten, um mir die Methodik der Zellkultur nahezubringen.
Bei auftretenden Problemen waren sie jederzeit mit Rat und Tat für mich da.
Herrn PD Dr. Ulrich Karck danke ich für seine spontane Bereitschaft, diese Arbeit als
Vertreter der Freiburger Medizinischen Fakultät zu begutachten. Auch er opferte viel
Zeit für Diskussion und konstruktive Kritik.
Des weiteren möchte ich der gesamten Abteilung für Klinische Pharmakologie des
Allgemeinen Krankenhauses Wien und Herrn Prof. Dr. Hans-Georg Eichler für die
freundliche Aufnahme danken. Die Hilfsbereitschaft und Aufmunterung bei kleineren
und größeren Problemen sorgte für eine sehr angenehme Arbeitsatmosphäre.
Besonderen Dank schulde ich Herrn Dr. Martin Brunner und Edith Lackner, die nicht
nur zur unentbehrlichen Hilfe, sondern zu echten Freunden wurden.
Last but not least möchte ich an dieser Stelle auch meiner Familie und meinen
Freunden von ganzem Herzen für ihre Anteilnahme und Unterstützung danken.
Was wäre ich ohne Euch?!
Anhang