Einfluss aktivierter Mikroglia auf die funktionelle Kopplung und das

Aus der
Abteilung für Neuroanatomie
des Institutes für Anatomie
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. Rolf Dermietzel
Einfluss aktivierter Mikroglia auf die funktionelle Kopplung und
das Membranpotential einer Astrozyten-Zelllinie
Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
Vorgelegt von
Caroline Möller
aus Köln
2005
Dekan:
Referent:
Korreferent:
Prof. Dr. med. G. Muhr
PD Dr. med. P.M. Faustmann
PD Dr. med. Claus G. Haase
Tag der Mündlichen Prüfung: 22.11.2005
2
Seite
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
4
Einleitung
Bedeutung und Funktion von Astrozyten
im Zentralen Nervensystem
Funktionelle Kopplung von Astrozyten über
Gap-Junctions
Bedeutung und Funktion von Mikroglia
Proinflammatorische Wirkung von
Lipopolysaccharid (LPS)
Veränderung der Eigenschaften von Astrozyten unter
inflammatorischen Bedingungen
Fragestellungen der Arbeit
5
5
7
11
15
16
17
Material und Methoden
Überblick
Technische Vorraussetzungen
Zellkulturen
Passage der RGCs
Anzucht der Mikroglia
Immuninkubation
Patch Clamp-Technik
Beschreibende und analytische Statistik
20
20
20
21
23
24
26
27
32
Ergebnisse
Funktionelle Kopplung
Cx43-Expression
Membranpotentialmessung
Mikroglianachweis in der Immunfluoreszenz
Morphologische Veränderungen
Kontrollexperiment: Primäre Astrozytenkulturen
34
34
40
44
47
52
55
Diskussion
Funktionelle Kopplung der RGCs
Beeinflussung des Membranruhepotentials
Wirkung von LPS
Pathophysiologische Bedeutung der Ergebnisse
Ausblick
Zusammenfassung
57
57
59
66
69
76
78
Literaturverzeichnis
79
Danksagung
87
Lebenslauf
88
3
Abkürzungsverzeichnis
ATP:
Cx43:
EEG:
ELISA:
FGF:
GABA:
GFAP:
HIV:
IL:
ICAM:
INF:
Kir:
LFA:
LPS:
2h LPS pur:
24h LPS pur:
LT:
MAPK:
MEM:
MHC:
M pur:
M+2h LPS:
M+24h LPS:
MRP:
MS:
NO:
PBS:
PCW:
PKC:
RGCs:
rHuTNF-α:
RRT :
RPT:
TNF:
Adenosintriphosphat
Connexin 43
Elektroenzephalografie
enzyme-linked immunosorbent assay
fibroblast growth factor
Gamma-Aminobuttersäure
glial fibrillary acidic protein
human immunedeficiency virus
Interleukin
intercellular adhesion molecule
Interferon
inwardly rectifying K+ channel
leucocyte function antigen
Lipopolysaccharid
für 2 Std. mit LPS inkubierte Zellen ohne Mikroglia
für 24 Std. mit LPS inkubierte Zellen ohne Mikroglia
Leukotrien
mitogen activated protein kinase
minimum essential medium
major histocompatibility complex
über 30 Std. mit Mikroglia ko-kultivierte Zellen
über 30 Std. mit Mikroglia ko-kultivierte und für 2 Std.
mit LPS inkubierte Zellen
über 30 Std. mit Mikroglia ko-kultivierte und für 24 Std.
mit LPS inkubierte Zellen
Membranruhepotential
Multiple-Sklerose
Stickstoffmonoxid
phosphate buffered salt solution
pneumococcal cell wall components
Protein-Kinase-C
rat glial cells
rekombinantes TNF-α
resting ramified type
roundet phagozytic type
Tumor-Nekrose-Faktor
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Einleitung
Bedeutung und Funktion von Astrozyten im Zentralen Nervensystem
Gliazellen bilden die zahlenmäßig größte Zellpopulation des Zentralen
Nervensystems (ZNS) und nehmen mehr als die Hälfte seines Volumens ein.
Es ist daher nicht verwunderlich, dass sie nicht nur wie früher angenommen
als Stützgerüst und „Kittsubstanz“ für die Neuronen dienen, sondern wichtige
Funktionen im reibungslosen Ablauf der neuronalen Informationsübertragung
wahrnehmen.
Gliazellen lassen sich in Makroglia ektodermalen Ursprungs, hierzu zählen
Oligodendrozyten und Astrozyten, und Mikroglia, die sich aus mesodermalen
Makrophagen entwickeln, unterteilen.
Astrozyten sind untereinander über Gap Junctions gekoppelt. Diese
interzellulären Verbindungen ermöglichen eine direkte Kommunikation des
Zytoplasmas von benachbarten Zellen. Die Astroglia formt so ein
funktionelles Synzytium, das die Neuronen dicht umgibt. Mit ihren
Zellausläufern reicht sie bis in unmittelbare Nähe an die Synapsen und somit
an die zentralen Schaltstellen neuronaler Aktivität heran. Diese anatomischen
Eigenschaften prädestinieren sie für ein enges funktionelles Zusammenspiel
mit den Neuronen.
Astrozyten können selbst keine Aktionspotentiale auslösen, tragen aber in
starkem Maße zur neuronalen Funktion bei, indem sie ein für die Neuronen
optimales extrazelluläres Milieu aufrechterhalten. So tauschen sie z.B. mit
den Neuronen wichtige Stoffwechselsubstrate wie Glucose, Lactat und
Aminosäuren aus. Dies hat einerseits große Bedeutung für den
Energiestoffwechsel des ZNS, zum anderen werden den Neuronen so auch die
Substrate für die Synthese der Aminosäurentransmitter Glutamat und
Gamma-Aminobuttersäure (GABA) bereitgestellt. Nach Freisetzung der
5
genannten Neurotransmitter aus den Synapsen bei neuronaler Aktivität sorgen
die Astrozyten für deren Entfernung aus dem Extrazellulärraum. Von
besonderer Wichtigkeit ist hier der schnelle Abtransport des Glutamats, da
dieses potentiell neurotoxisch wirkt. Astrozyten können Glutamat über einen
aktiven Transportmechanismus in sich aufnehmen und so eine gefährliche
Anstauung zu toxischen Konzentrationen verhindern.
Besondere Bedeutung haben Astrozyten auch in der Regulation der
extrazellulären Kalium-Konzentration (Übersicht: Aschner et al., 2002). Bei
jeder neuronalen Aktivität wird verstärkt Kalium in den Extrazellulärraum
freigesetzt. Die Aktivität der in allen Zellen vorhandenen Na+/Ka+-Pumpe
reicht hier nicht aus, um das Kalium schnell wieder in die Zellen
hineinzubefördern. Bereits 1966 stellten Orkand et al. erstmals die Theorie
des „spatial buffering“ auf, die besagt, dass Astrozyten in der Lage sind, das
im Extrazellulärraum anfallende Kalium abzupuffern, indem sie es in ihr
Zytoplasma aufnehmen und in Regionen mit niedriger Kaliumkonzentration
abtransportieren. Seitdem ist diese Theorie Gegenstand vielfacher Arbeiten
gewesen. Man fand heraus, dass die Kalium-Aufnahme über drei
verschiedene Wege erfolgen kann. Neben der Na+/Ka+-Pumpe und dem
Na+/Ka+/2Cl-Kotransporter scheint vor allem eine Klasse von aktiv, das
heißt unter ATP-Verbrauch betriebenen Kalium-Kanälen, für die schnelle
Aufnahme von Kalium in die Astrozyten von Bedeutung zu sein. So konnte
z.B. an Müller-Zellen der Retina, die Kalium-Regulation durch solche,
„inwardly rectifying K+ channels“ (Kir) genannten Kanäle, bewiesen werden
(Newman et al., 1993). Diese Hinweise auf die astrozytäre Fähigkeit, Kalium
abzupuffern, erscheinen besonders bedeutend, wenn man bedenkt, dass eine
pathologisch erhöhte extrazelluläre Kaliumkonzentration als wichtiger
Auslöser epileptischer Anfälle gilt (Übersicht: Bordey und Sontheimer, 2001).
Weitere Aufgaben von Astrozyten sind die Produktion von
Wachstumsfaktoren, Entfernung von Toxinen und metabolischen
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Abbauprodukten aus dem Extrazellulärraum sowie die Regulation des pHWertes und des extrazellulären Volumens.
Funktionelle Kopplung von Astrozyten über Gap Junctions
Bereits 1859 wurden Astrozyten von Rudolph Virchow erstmals in der
Literatur beschrieben. Er nahm an, dass sie als Stütz- und Haltegewebe
dienten und bezeichnete sie daher als „Nervenkitt“. In den sechziger Jahren
des letzten Jahrhunderts wurde dann erstmals die elektrische Kopplung
zwischen Gliazellen demonstriert (Kuffler et al., 1966). Wenig später konnten
Brightman und Reese (1969) Strukturen identifizieren, über die ein direkter
Austausch von Ionen und Metaboliten zwischen den Zellen stattfand, und die
von den Autoren als „Junctions“ bezeichnet wurden. Eine große Anzahl
ultrastruktureller, „dye-transfer-“ und elektrophysiologischer Studien haben
seitdem die allgemein akzeptierte Ansicht gestützt, dass Astrozyten über Gap
Junctions miteinander gekoppelt sind und somit im engen metabolischen
Austausch miteinander stehen. In diesem Zusammenhang wurde auch der
Begriff des funktionellen Synzytiums geprägt, der das heutige Wissen um die
vielfältigen Funktionen dieser engen Zellkommunikation widerspiegelt. So
dient das Netzwerk als direkter Transportweg von Ionen, Metaboliten und
Neurotransmittern zwischen unterschiedlichen Regionen.
Hier ist wieder die bereits oben genannte Theorie der Kalium-Pufferung
hervorzuheben: Das Netzwerk erlaubt einen schnellen Abtransport des
Kaliums vom Ort der Ansammlung, also der Synapse, in die perivaskulären
Kompartimente, wo es in den Blutstrom abgegeben werden kann. Diese
Annahme wird durch die Beobachtung unterstützt, dass Gap Junctions sowohl
an Synapsen, als auch an der Blut-Hirn-Schranke besonders zahlreich
vorhanden sind.
Eine weitere wichtige Beobachtung war, dass erhöhte Konzentrationen von
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Calcium-Ionen, in der Literatur als „Calcium Waves“ bezeichnet, über relativ
weite Distanzen durch die Gap Junctions von einem Astrozyten zum nächsten
weitergeleitet werden (Cornell-Bell et al., 1990). Diese können durch
Applikation eines Agonisten, wie beispielsweise Gutamat oder durch
mechanische Stimulation ausgelöst werden. Die Mechanismen und
Funktionen der Calcium Waves sind noch nicht vollständig verstanden, man
nimmt aber an, dass sie der Signalübertragung innerhalb des astrozytären
Synzytiums dienen und auf diese Weise sogar aktiv an der Neuromodulation
teilhaben: Eine durch das Netzwerk fortgeleitete Calcium-Welle könnte z.B.
in weiter entfernten Zellen die durch Ca2+-induzierte Ca2+-Freisetzung aus
intrazellulären Speichern auslösen, welche regenerative Wirkung hat. Auch
die Ausschüttung des ebenfalls regenerativ wirkenden Inositol 1,4,5Triphosphat (IP3) wird möglicherweise auf diese Weise vermittelt. Weiterhin
wird angenommen, dass die Ca2+-Signale möglicherweise zu Änderungen
der lokalen Pufferkapazität von Ka+-Ionen oder sogar zur Ka+-Freisetzung
aus der Gliazelle führen und somit die neuronale Erregbarkeit verändern
können. Dies alles weist darauf hin, dass die aktive Signalübertragung im
ZNS nicht ausschließlich die Eigenschaft von Neuronen ist. Auch Astrozyten
besitzen diese Fähigkeit, wenn auch über einen anderen Mechanismus als die
Auslösung von Aktionspotentialen (Übersicht: Dermietzel und Spray, 1993).
In Ko-Kultur-Experimenten konnte inzwischen sogar der Signaltransfer
zwischen Neuronen und Gliazellen direkt nachgewiesen werden (Nedergaard,
1994; Froes-Ferrao und Campos de Carvalho, 1998). Durch diese Arbeiten
wurde die Ansicht bekräftigt, dass Astrozyten durch ihr funktionelles
Netzwerk aktiv an der Neuromodulation beteiligt sind.
1977 entwickelten Makowski et al. ein Modell für die molekulare Struktur des
Gap-Junction-Kanals, das heute immer noch Gültigkeit besitzt: Jeder Kanal
besteht aus zwei Hälften, die Connexon genannt werden und in die
Zellmembran eingefügt sind. Die benachbarten Zellen schließen sich mit
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ihren gegenüberliegenden Connexons zu einem Gap Junction-Kanal
zusammen. Der so gebildete durchgängige Tunnel erlaubt die direkte
Kommunikation zwischen ihren Zytoplasmen. Die strukturelle Untereinheit
der Connexons sind Proteine, die Connexine genannt werden. Jedes
Connexon ist aus sechs dieser Connexine aufgebaut. In weiteren Arbeiten
fand man heraus, dass das Molekulargewicht und die Struktur der Connexine
in unterschiedlichen Geweben variierten. Es existieren also verschiedene
Subtypen der Connexine, die von verschiedenen Zellarten exprimiert werden
und nach ihrem Molekulargewicht unterschieden und benannt werden.
Oftmals finden sich hierbei Überschneidungen, so dass ein Connexin meist in
verschiedenen Geweben präsent ist, oder auch eine Zellart mehrere
Connexine gleichzeitig exprimiert.
Zu Beginn der neunziger Jahre gelang es, das Connexin 43 (Cx43) als
zellspezifisches Gap Junction-Protein der Astrozyten zu identifizieren
(Dermietzel et al., 1989, 1991; Yamamoto et al., 1990). Seitdem ist es
möglich, die funktionelle Kopplung des astrozytären Netzwerkes auch mit
Methoden der Immunhistochemie oder Western Blot-Analyse nachzuweisen
und zu quantifizieren.
Diverse Studien haben gezeigt, dass die Stärke der astrozytären Kopplung
kein feststehender Zustand ist, sondern durch Einflüsse verschiedenster Art
gestört werden kann. Zu diesen Einflussfaktoren gehören von Neuronen
freigesetzte Stoffe wie das Arachidonsäurederivat Anandamide (Venance et
al., 1995) oder das schlafinduzierende Lipid Oleamide (Guan et al., 1997).
Durch beide Stoffe konnte die interzelluläre Kommunikation über Gap
Junctions potent und selektiv gehemmt werden. Desgleichen konnte auch für
die Wachstumsfaktoren „Fibroblast-Growth-Factor“(FGF) 2, 9 und 5 eine
Beeinflussung der Kopplungsfähigkeit von Astrozyten gezeigt werden, wobei
hier interessanterweise die Wirkungen in Abhängigkeit von der Hirnregion
variierten. So bewirkte FGF-2 eine Reduktion von Cx43 und der
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funktionellen Kopplung in Zellen des Kortex und Striatums, nicht aber des
Mesenzephalons (Reuss et al., 1998, 2000).
Eine weitere in diesem Zusammenhang wichtige Substanzklasse sind die
Zytokine (Brosnan et al.,2001). Auch für diese vor allem unter entzündlichen
Bedingungen freigesetzten Stoffe wurde in den letzten Jahren eine Wirkung
auf die astrozytäre Kopplungsfähigkeit festgestellt: So resultierte die
Inkubation mit dem Zytokin IL-1β in einer verminderten Expression von
Connexin 43 und in einer Downregulation von Cx43 mRNA in kultivierten
Astrozyten aus humanen Feten (John et al., 1999). In primären Astrozytenkulturen der Ratte bewirkte die Inkubation von Astrozyten mit IL-1β oder
Lipopolysaccharid (LPS), einem Membranbestandteil gramnegativer
Bakterien, eine Verminderung der Cx43-Expression sowie eine verminderte
Anzahl von funktionell gekoppelten Zellen.(Hinkerohe et al., 2002; Smikalla
et al., 2002).
Da aktivierte Mikroglia die Hauptproduzenten proinflammatorischer Zytokine
darstellen, wurde auch deren direkter Einfluss auf das astrogliale Netzwerk
mittels einer Astrozyten-Mikroglia-Ko-Kultur untersucht. Ein pathologisch
erhöhter Mikrogliaanteil resultierte in einem erhöhten Prozentsatz des
aktivierten Phänotyps. In diesen Kulturen wurde ebenfalls eine signifikante
Verminderung der Cx43-Expression sowie der funktionellen Kopplung
festgestellt, was den starken Einfluss aktivierter Mikroglia auf Astrozyten
unter inflammatorischen Bedingungen deutlich macht (Faustmann et al.,
2003). Umgekehrt konnte der entkoppelnde Effekt eines hohen
Mikrogliaanteils in primären Astrozytenkulturen durch die Inkubation mit
dem Antikonvulsivum Levetiracetam wieder abgeschwächt werden (Heupel
et al., 2003). Hiermit ergibt sich ein wichtiger Hinweis für den Zusammenhang zwischen Störungen des astroglialen Synzytiums und der Entstehung
von Epilepsie.
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Als zugrunde liegender Wirkmechanismus für die Inhibition der astroglialen
Kopplung werden dynamische Phosphorilierungsvorgänge von Cx43
angenommen. Diese Vermutung wird durch die Beobachtung gestützt, dass
Cx43 sensitiv gegenüber phosphorilierenden Kinasen und Phosphatasen ist.
Unter pathologischen Bedingungen können diese Enzyme aktiviert werden
und ihre phosphorilierende bzw. dephosphorilierende Wirkung entfalten. So
konnte zum Beispiel in Gehirnslices, die zuvor ischämischen Bedingungen
ausgesetzt worden waren, die Dephosphorilierung von Cx43 und gleichzeitig
die Verminderung der funktionellen Kopplung nachgewiesen werden (Li und
Nagy, 2000). Durch Inhibition der Protein-Phosphatase PP-2B ließ sich dieser
Effekt abschwächen, was darauf hinweist, dass die Wirkung durch
Aktivierung dieses Enzyms vermittelt wurde. Da unter ischämischen
Bedingungen verstärkt Zytokine freigesetzt werden, kann man vermuten, dass
hier auch Zytokine über die Aktivierung von Phosphatasen an der Wirkung
auf Cx43 beteiligt waren.
Bedeutung und Funktion der Mikroglia
Mikroglia gehören der Mononukleären-Makrophagen-Linie an und bilden die
residente, unspezifische Immunabwehr des ZNS. Sie sind überall im Gehirn
anzutreffen, jedoch ist eine starke Variation ihrer Dichte in den
unterschiedlichen Regionen zu beobachten. Im gesunden Hirngewebe beträgt
sie zwischen 5 und 20%.
Der Ursprung der Mikrogliazellen war lange Zeit ungeklärt. Sowohl die
mesodermale als auch neuroektodermale Herkunft wurde von verschiedenen
Wissenschaftlern postuliert. 1980 konnte dann die mesodermale Hypothese
durch Ling et al. bewiesen werden: Monozyten, die mit Carbon-Partikeln
markiert worden waren, wurden in die Blutbahn neugeborener Ratten
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injiziert. Später konnten die Carbon-Partikel dann in reifen Mikrogliazellen
des Corpus Callosum wiedergefunden werden. Dieses ist ein starkes Indiz für
eine Entwicklung von Mikroglia aus Monozyten, also mesodermalen Zellen,
während der perinatalen Periode. Diese Hypothese wurde bestätigt durch die
Darstellung verschiedener makrophagen-spezifischer Antigene auf Mikrogliazellen mittels Immunhistochemie. So exprimieren ramifizierte Mikroglia Fcund Complementrezeptoren sowie ein makrophagen-spezifisches
Glykoprotein unbekannter Funktion (Perry et al., 1985). Des weiteren lassen
sich Mikroglia durch Lectin, einem histochemischen Marker, der spezifisch
an Monozyten bindet, markieren (Streit und Kreutzberg, 1987). Allerdings
lassen sich nicht alle bekannten Monozyten-Marker auch auf Mikroglia
wiederfinden. Dieses lässt sich dadurch erklären, dass einige der Antigene
während der Entwicklung der Monozyten in Mikroglia verloren gehen. Die
Differenzierung von Monozyten zu Mikrogliazellen scheint aber auf die
embryonale bzw. peripartale Periode beschränkt zu sein, da dieser Vorgang
bei erwachsenen Versuchstieren nicht mehr nachgewiesen werden konnte.
Wie es ihrer Herkunft aus der mononukleären Makrophagen-Linie entspricht,
gehören Mikroglia zu den immunkompetenten Zellen. Sie dienen als
Mediatoren immunologischer Prozesse und haben als solche verschiedene
Funktionen, so z.B. als phagozytierende Makrophagen, Antigenpräsentierende Zellen oder Immuneffektorzellen. Letzteres meint die
Fähigkeit der Mikroglia durch Sekretion proinflammatorischer Substanzen
eine Immunantwort zu vermitteln: Auf pathologische Veränderungen des
Gehirns reagieren Mikroglia mit der raschen Umwandlung in einen
aktivierten Phänotyp, der durch die Produktion verschiedener
proinflammatorischer Zytokine einen Entzündungsprozess in Gang setzt und
potentiell zytotoxisch wirkt (Banati et al., 1993). Der Aktivierungsprozess
geht mit Proliferation der Mikroglia am Ort der Entzündung und vor allem
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auch ihrer morphologischen Umwandlung einher, die mit einer Veränderung
ihres immunologischen Status assoziiert ist:
Unter physiologischen Bedingungen befinden sich Mikroglia meistens in der
ruhenden, ramifizierten Form (resting ramified type=RRT). Diese exprimiert
zwar in niedriger Konzentration Komplement- und Immunglobulinrezeptoren,
nicht aber weitere entzündungsassoziierte Antigene wie „leukocyte function
antigen“ (LFA)-1, intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 und MajorHistokompatibilitätskomplexe (MHC)-class 2. Es wird vermutet, dass von
Astrozyten produzierte Faktoren im gesunden Hirngewebe die Expression
dieser Moleküle verhindern (Hailer et al., 1998). Bei Aktivierung wandelt
sich die Mikrogliazelle nun in einen abgerundeten, phagozytierenden Typ
(roundet phagozytic type=RPT) um. Gleichzeitig werden die oben genannten
entzündungsassoziierten Antigene LFA-1, ICAM-1 und MHC-2 verstärkt auf
der Zelloberfläche exprimiert. Der aktivierte Phänotyp wird durch den
Entzündungsreiz zur Produktion verschiedenster proinflammatorischer
Substanzen angeregt. Hierzu gehören vor allem Zytokine, wie TNF-α oder
IL-1β aber auch Arachidonsäuremetaboliten und Prostanoide, sowie reaktive
Sauerstoff- und Stickstoffmetabolite (Banati et al., 1993; Lee et al., 1993;
Stoll et al., 1998).
Die Aktivierungsreaktion kann durch verschiedenste Erkrankungen, wie
Infektionen, Trauma, Ischämie, Hirntumore oder Neurodegeneration
ausgelöst werden. Als Bestandteil der immunologischen Reaktionen des
Organismus dient sie der Abwehr schädigender Einflüsse auf das
Hirngewebe. So haben aktivierte Mikroglia die Fähigkeit zu phagozytieren,
Mikroorganismen zu zerstören und Zellschutt zu beseitigen. Weiterhin tragen
sie durch die Sekretion von Wachstumsfaktoren zur Gewebereparation bei
(Kreutzberg, 1996).
Auf der anderen Seite kann die Aktivierungsreaktion der Mikroglia und die
damit einhergehende Freisetzung von Zytokinen und anderen proinflamma13
torischen Substanzen aber auch schädigende Wirkung haben. Schon lange
bekannt ist die große Bedeutung von Zytokinen im Krankheitsverlauf der
bakteriellen Meningitis. Waage et al. (1987) stellten in einer klinischen Studie
fest, dass bei Patienten mit Meningokokkenmeningitis, in deren Serum
TNF-α gefunden wurde, die Krankheit wesentlich häufiger einen fulminanten
tödlichen Verlauf hatte als bei den Patienten, bei denen kein TNF-α im Serum
gefunden wurde. Diese Erkenntnisse wurden in weiteren Studien, in denen die
Konzentration von TNF-α im Liquor von Meningitispatienten gemessen
wurde, bestätigt und ergänzt. Die Autoren zeigten, dass nur die bakterielle,
nicht aber die virale Meningitis mit einer Erhöhung von TNF-α im Liquor
einhergeht und dass weiterhin die Stärke der TNF-α -Erhöhung mit dem
klinisch erkennbaren Schweregrad der Erkrankung korreliert. TNF-αKonzentrationen von über 1000pg/ml waren mit epileptischen Anfällen
assoziiert, und bei den Patienten, bei denen das Zytokin auch im Plasma
gefunden wurde verlief die Erkrankung in ¾ der Fälle tödlich (Arditi et al.,
1990; Glimaker et al., 1993). Auch die Schädigung der Blut-Hirn-Schranke
bei bakteriellen Meningitiden ist mit der Stärke der TNF-α-Erhöhung im
Liquor assoziiert (Sharif et al.,1992).
Weiterhin scheinen Mikroglia aber auch bei Virusinfektionen von Bedeutung
zu sein. So tragen aktivierte Mikroglia z.B. bei der HIV-Enzephalopathie
durch schnelle Proliferation und Zytokinfreisetzung maßgeblich zur
Entstehung der frühen neurologischen Symptomatik bei (Genis et al.,1992;
Meeker et al.,1999).
Die Beteiligung von Mikroglia an pathologischen Prozessen erstreckt sich
jedoch nicht ausschließlich auf infektiöse und entzündliche Erkrankungen des
ZNS. Auch in Bezug auf Krankheitsentstehung und Verlauf
neurodegenerativer Erkrankungen scheinen sie eine wichtige Rolle zu spielen.
So wird beispielsweise das kontinuierliche Absterben von Neuronen bei M.
Parkinson u.a. durch die zytotoxische Wirkung der von Mikroglia
14
freigesetzten Faktoren vermittelt (Boje und Arora, 1992; Liu und Hong,
2003). Bei M.Alzheimer scheinen Mikroglia auf diese Weise an der Bildung
von senilen Plaques beteiligt zu sein. Des weiteren tragen sie bei
Autoimmunerkrankungen, wie der experimentellen AutoimmunEnzephalomyelitis, einem Modell für Multiple-Sklerose, durch die Interaktion
mit T-Lymphozyten über Zytokinfreisetzung zum Krankheitsprozess bei
(Übersicht: Stoll und Jander, 1999).
Proinflammatorische Wirkung von Lipopolysaccharid (LPS)
Die hauptsächliche proinflammatorische Komponente gramnegativer
Bakterien ist das Lipopolysaccharid, abgekürzt LPS (Rietschel et al.,1996). Es
hat aktivierende Wirkung auf diverse Zellen des Immunsystems und löst so
eine Entzündungsreaktion aus (Bourdiol et al., 1991). Auch bei Mikrogliazellen konnte die Aktivierung durch LPS nachgewiesen werden: LPS bindet
an den Rezeptor CD14 (Kitchens, 2000) worauf die Mikroglia mit der
Synthese und Freisetzung proinflammatorischer Zytokine und anderer
Entzündungsmediatoren reagiert. (Lee et al., 1993; Szczepanik et al., 1996).
Noch nicht sicher geklärt ist die Frage, ob auch Astrozyten durch LPS zur
Produktion inflammatorischer Zytokine angeregt werden können. So
postulierten Chung und Benveniste (1990) die Produktion von TNF-α durch
Astrozyten nach LPS-Inkubation. Dagegen konnten Lee et al. (1993) durch
Northern-Blot-Analyse und ELISA weder mRNA noch Proteine von TNF-α,
IL-1β oder IL-6 im Zytoplasma von Astrozyten, die zuvor mit LPS inkubiert
worden waren, nachweisen, was gegen diese Hypothese spricht.
Ein wichtiger gramnegativer und somit LPS enthaltender Meningitis-Erreger
ist E. coli, der vor allem als häufigster Verursacher von Meningitiden im
Säuglingsalter von großer Bedeutung ist. Im Kindesalter überwiegt die
15
Meningitis durch Hämophilus Influenzae, ein ebenfalls gramnegatives
Bakterium. Grampositive Erreger, vor allem Pneumokokken und Meningokokken, sind bei der Meningitis im Erwachsenenalter die häufigsten
Verursacher. Ihre Zellwand enthält kein LPS, dafür aber andere Komponente,
wie z.B. „Pneumococcal Cell Wall Components“ (PCW). Es konnte gezeigt
werden, dass diese PCW zumindest in Astrozyten die gleichen Mitogen
aktivierten Proteinkinasen (MAPK) aktivieren wie LPS und somit also als
Pendant von LPS im grampositiven Bereich angesehen werden können
(Schumann et al., 1998).
Obwohl heute eine potente Antibiotikatherapie zur Verfügung steht, gehen
bakterielle Meningitiden immer noch mit hohen Komplikations- und
Sterblichkeitsraten einher. Bis zu 70% der Patienten mit septischer Meningitis
zeigen neurologische Symptome wie die septische Enzephalopathie (Bone,
1991; Young et al., 1992). Epileptische Anfälle treten bei 40% aller Patienten
mit bakterieller Meningitis auf (Anderson, 1993), während pathologische
Befunde im EEG sogar bei 2/3 der Patienten festgestellt wurden (Pomeroy et
al., 1990). Da aseptische Meningitiden wesentlich komplikationsärmer
verlaufen, lässt sich vermuten, dass die starke Symptomatik der bakteriellen
Meningitiden im Wesentlichen auf die Wirkungen der proinflammatorisch
wirkenden bakteriellen Zellwandbestandteile, wie LPS, zurückzuführen ist.
Veränderung der Eigenschaften von Astrozyten unter inflammatorischen
Bedingungen
In zahlreichen Arbeiten wurde gezeigt, dass von Mikroglia produzierte
proinflammatorische Mediatoren, wie Zytokine, auch die Astrozyten in ihrer
Funktion beeinflussen. Die Effekte auf das astrozytäre Kopplungsverhalten
wurden bereits oben dargestellt. Ein weiterer Angriffspunkt von Zytokinen an
16
Astrozyten scheinen die elektrophysiologischen Eigenschaften der
astrozytären Zellmembran zu sein. So reagierten Astrozyten nach Inkubation
mit dem Zytokin TNF-α oder dem Arachidonsäurederrivat Leukotriene B4
mit einer Depolarisation des Membranpotentials. Der gleiche Effekt wurde
durch Inkubation mit LPS erzielt. (Köller et al., 1993, 1994 (a), 1994 (b),
1997; Köller, 1997; Hinkerohe et al., 2002; Smikalla et al.,2002).
Angesichts der wichtigen Aufgaben der Astrozyten in der Regulation des
extrazellulären Milieus könnten sich Störungen ihrer elektrophysiologischen
Eigenschaften oder die Unterbrechung ihres funktionellen Synzytiums auch
auf die neuronale Informationsübertragung auswirken und so zu
neurologischen Symptomen führen.
Bisher ist noch nicht vollständig geklärt, ob die Wirkung einzelner
proinflammatorischer Faktoren wie z.B. LPS direkt oder aber indirekt über
eine Aktivierung der in der Kultur enthaltenen Mikroglia zustande kommt.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von aktivierter Mikroglia und
LPS auf eine Astrozyten-Zelllinie („rat glial cells"=RGCs), die normalerweise
keine Mikroglia enthält, untersucht. Die Zelllinie soll hierbei als Modell für
Astrozyten eingesetzt werden.
Fragestellungen der Arbeit
In dieser Arbeit wurden die folgenden Fragestellungen untersucht:
Kann die funktionelle Kopplung der RGCs über Gap Junctions und die
Expression von Cx43 durch aktivierte Mikroglia oder LPS-Inkubation gestört
werden?
Wie schon erwähnt hat die Zugabe einzelner Zytokine wie TNF-α auf primäre
Astrozytenkulturen einen entkoppelnden Effekt. Dieser ließ sich bei den
RGCs in bisherigen Experimenten der Arbeitsgruppe nicht feststellen.
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Hieraus ergibt sich die Fragestellung, ob möglicherweise die Anwesenheit
von aktivierten Mikroglia eine notwendige Bedingung für den
Entkopplungseffekt ist. Die Zugabe von LPS dient zum einen der Aktivierung
der Mikroglia; weiterhin soll auch die alleinige Wirkung von LPS ohne
Anwesenheit von Mikroglia beobachtet werden. Die Experimente könnten
somit die bisherigen Erkenntnisse zum Einfluss der Mikroglia auf die
funktionelle Kopplung des Astrozytensynzytiums und somit ihrer Beteiligung
an entzündlichen Prozessen im ZNS bestätigen und ergänzen.
Haben aktivierte Mikroglia bzw. LPS einen Einfluss auf das
Ruhemembranpotential der RGCs?
Auch auf das Membranpotential der RGCs zeigte die Zugabe einzelner
Zytokine bisher nur sehr geringe Wirkung. Analog zu den Experimenten zur
funktionellen Kopplung soll daher auch hier die Bedeutung der Mikroglia
untersucht und der Vergleich zu den Wirkungen einzelner Zytokine und LPS
auf primäre Astrozytenkulturen gezogen werden. Hierdurch könnten sich
weitere Hinweise zur Bedeutung der Mikroglia in der Pathogenese von ZNSErkrankungen, insbesondere der Entstehung von epileptischen Anfällen,
ergeben. Die Untersuchung der LPS-Wirkung ist vor allem im Hinblick auf
den Pathomechanismus der bakteriellen Meningitis mit dem Symptom
Krampfanfall interessant.
Werden die Effekte von LPS auf Astrozyten direkt oder indirekt über die
Aktivierung von Mikroglia vermittelt?
In mehreren Arbeiten wurde bereits gezeigt, dass LPS auf primäre
Astrozytenkulturen sowohl einen entkoppelnden als auch
membranpotentialsenkenden Effekt hat. Es soll nun untersucht werden, ob
diese Effekte auch bei den RGCs durch die alleinige Zugabe von LPS
ausgelöst werden können oder aber dazu die gleichzeitige Anwesenheit von
18
Mikroglia benötigt wird. Ersteres würde für ein direktes Angreifen von LPS
an den Astrozyten sprechen; letzteres könnte bedeuten, dass die LPS-Wirkung
vor allem über der Aktivierung der Mikroglia vermittelt wird, die dann über
die Ausschüttung einer Vielzahl von Zytokinen den Effekt auf die Kopplung
bzw. das Membranpotential der Astrozyten hervorruft.
Ist die verwendete Zelllinie als Modell für Astrozyten im Hinblick auf die
untersuchten Fragestellungen gut geeignet?
Wie erwähnt unterschieden sich die Reaktionen der RGCs auf die Inkubation
mit einzelnen Zytokinen von denen primärer Astrozytenkulturen. Sollte sich
bei den Untersuchungen herausstellen, dass dieses nicht im Fehlen der
Mikroglia in der Zellkultur begründet ist, kann man daraus schlussfolgern,
dass sich die Zelllinie in ihren Eigenschaften stark von primären
Astrozytenkulturen unterscheidet und somit zur Untersuchung entzündlicher
Einflüsse auf die Kopplungsfähigkeit bzw. das Membranpotential als Modell
für Astrozyten weniger geeignet ist.
19
Material und Methoden
Überblick
Zur Untersuchung der zuvor aufgeführten Fragestellungen wurden Zellen
einer Glia-Zelllinie als Astrozyten-Modell über 30 Std. mit Mikrogliazellen
ko-kultiviert. Um die Mikroglia zu aktivieren, wurden die Zellkulturen z.T.
zusätzlich für 2 oder 24 Std. mit LPS inkubiert, das, wie in der Literatur
beschrieben, einen starken Aktivierungsstimulus für Mikroglia darstellt
(Szczepanik, 1996). Zur Kontrolle wurden Zellkulturen ohne Zugabe von
Mikroglia mit LPS inkubiert, um festzustellen, ob ein eventueller Effekt von
LPS direkt oder über die Aktivierung von Mikroglia zustande kommt.
Mit der Patch Clamp-Technik konnte gleichzeitig der Effekt auf die
funktionelle Kopplung der Zellen und auf das Membranruhepotential
gemessen werden.
Zusätzlich wurde mit Hilfe der Immunfluoreszenz die Expression des Gap
Junction-Proteins Cx43 dargestellt sowie durch den Mikroglia-Marker ED1
der Anteil aktivierter Mikroglia ermittelt. Die Morphologie und das
Wachstum der Kulturen wurden durch Lichtmikroskopie der Nativproben
kontrolliert.
Im Folgenden werden die einzelnen Komponenten der eingesetzten
Materialien und Methoden genauer beschrieben.
Technische Voraussetzungen
Für die Arbeit mit den Rat Glial Cells und Astrozytenkulturen waren sterile
Arbeitsplätze und Gebrauchsgegenstände erforderlich.
Die meisten Plastikgegenstände wie z.B. die Petrischalen, Pipetten und die
Well Plates wurden steril vom Hersteller bezogen (Falcon und Nunc).
20
Wiederverwertbare Gebrauchsgegenstände wie Mediumflaschen und andere
Glasbehältnisse, die Präparationsbestecke sowie die Pipettenspitzen wurden
bei 120°C und 1 bar Überdruck autoklaviert und ggf. für 8 Stunden bei 180°C
hitzesterilisiert. Die Gebrauchslösungen und Medien sowie das LPS und die
Antikörper wurden steril angeliefert, ggf. alliquotiert und bei -26°C
eingefroren. Die Phosphate Buffered Salt Solution (PBS) wurde selbst
hergestellt und anschließend autoklaviert.
Sämtliche Arbeitsschritte der Zellanzucht und Aussaat wurden unter einer
Lamina Air Flow (Holten safe 2000) durchgeführt. Hierbei war zu beachten,
dass das Luftgebläse mindestens 10 Minuten vor Arbeitsbeginn angeschaltet
wurde. Um eine größtmögliche Sterilität des Arbeitsplatzes zu gewährleisten,
musste auf sorgfältiges und sauberes Arbeiten geachtet werden. Nach
Beendigung der Arbeit wurden die Arbeitsflächen gründlich mit Ethanol 70%
gereinigt.
Zellkulturen
Die Versuche wurden mit einer Glia-Zelllinie aus Sprague-Dawley Ratten
(„rat glial cells“=RGCs) durchgeführt. Diese Zelllinie wurde bereits in
mehreren Arbeiten als Modell für Astrozyten eingesetzt (Suter et al.,1987;
Hofer et al.,1996). Der Begriff Zelllinie bedeutet, dass die Zellen die
Fähigkeit haben, sich in Vitro unbegrenzt zu vermehren. Diese
Unsterblichkeit haben sie durch Transformationen im Genom erlangt, das
heißt, sie wurden entweder aus Tumoren gewonnen oder sind künstlich mit
Onkogenen transfiziert worden. Die hier verwendete Zelllinie stammt von
einem Gliom einer Sprague-Dawley-Ratte (wild-type) ab.
Die Zellen wurden auf Zellkultur-Petrischalen Größe 100x20mm (Falcon) in
einem Nährmedium gezüchtet.
21
Zusammensetzung des Mediums:
10% Fetal Calf Serum
1% Penicillin/Streptomycin (5000U/ml)
1% Nicht-essentielle Aminosäuren (Invitrogen)
1% Natrium-Pyruvat (100mM)
87% Minimum essential medium (MEM) with Earles Salts without LGlutamine (Gibco, gebrauchsfertig vom Hersteller bezogen)
Im Folgenden soll die Bedeutung der einzelnen Mediumbestandteile kurz
erklärt werden: Das Fetal Calf Serum enthält eine Mischung der
verschiedensten wachstumsfördernden Substanzen wie z.B. Polypeptide,
Hormone, Lipide und Spurenelemente, die für die Proliferation der Zellen
notwendig sind. Penicillin und Streptomycin töten als Antibiotika in die
Zellkultur gelangte Bakterien ab. Ihr Wirkspektrum umfasst jedoch nicht
sämtliche Erreger so dass Resistenzen möglich sind. Die nicht-essentiellen
Aminosäuren sowie das Na-Pyruvat dienen den Zellen als Nährstoffe für die
Proteinsynthese bzw. den Energiestoffwechsel.
Das MEM ist ein fertig vom Hersteller geliefertes Standartmedium, das
einfacher konzipiert ist als das für Primärkulturen verwendete DMEM. Es ist
ärmer an Nährstoffen und eignet sich besonders für weniger anspruchsvolle
Zellen wie z.B. verschiedene Zelllinien. Dagegen hat es einen hohen Anteil an
Ca2+ und Mg2+. Diese Kationen treten mit den Adhäsionsmolekülen der
Zellen in Wechselwirkung und ermöglichen ihnen das Anheften und
Festwachsen am Boden der Kulturschale.
Die Kulturen wurden im Inkubator bei 7% CO2 und 37°C aufbewahrt. Ein
Wasserreservoir mit großer Oberfläche sorgte für eine hohe relative
Luftfeuchtigkeit von fast 100%. Diese Inkubationsbedingungen waren
wichtig, um den für die Zellkulturen optimalen pH-Wert von 7,0-7,2
aufrechtzuerhalten.
22
Da durch den Stoffwechsel der Zellen saure Metabolite frei werden, würden
diese das Medium normalerweise nach und nach ansäuern. Um dieses zu
verhindern, setzt man ein Puffersystem ein. Dieses besteht aus dem Medium
zugesetzten Bikarbonat und dem Kohlendioxid, mit dem der Brutschrank
begast wird. Die Säure-Ionen aus dem Zellstoffwechsel werden nun von dem
Bikarbonat im Medium abgefangen und in Kohlensäure umgewandelt. Diese
befindet sich wiederum im Gleichgewicht mit dem im Wasserdampf gelösten
CO2. Daher lässt sich durch Regulation der CO2-Konzentration im Inkubator
der pH-Wert im Medium optimal einstellen. Damit die CO2-Atmosphäre auch
direkt an die Zellen gelangen kann, darf der Deckel der Petrischalen oder
Well Plates nur locker aufgesetzt sein. Die hohe Luftfeuchtigkeit im
Brutschrank ist notwendig, um zu verhindern, dass hierdurch zu viel Wasser
aus den Zellkulturgefäßen verdunstet.
Passage der RGCs
Da die Zelllinie wie bereits oben erwähnt unbegrenzt weiterwächst, mussten
die dicht konfluent gewachsenen Zellen regelmäßig wieder verdünnt und neu
ausgesät werden. Gleichzeitig wurde das Medium erneuert, da die Zellen
laufend Nährstoffe und Pufferkapazität verbraucht hatten. Die Passage der
Zellen musste etwa alle 3 Tage, sobald die Zellen in der Petrischale zu einem
konfluenten Zellrasen zusammengewachsen waren, durchgeführt werden.
Hierzu wurde zunächst das Medium abgesaugt und die Zellen mit 5ml PBS
(37°C) gewaschen. Danach wurden 2ml Trypsin/EDTA(0,1%) zugegeben, 2/3
davon wieder abgesaugt und die Zellen 5 Minuten damit inkubiert. Die so
abtrypsinierten Zellen konnten nun in 5ml Nährmedium suspendiert werden.
Um eine neue Kultur in einer Petrischale anzulegen, legte man in dieser
Schale 9,5ml Medium vor und gab dann 0,5ml der Zellsuspension dazu. Nun
konnten sich die Zellen in frischem Medium erneut vermehren.
23
Für die Versuche wurden die Rat Glial Cells auf Poly-L-Lysine-beschichteten
Deckgläschen (12mm) ausgesät. Hierzu wurden aus der abtrypsinierten
Zellsuspension 10µl entnommen und in einer Zählkammer unter dem
Mikroskop die enthaltenen Zellen ausgezählt. Auf diese Weise hatte man die
Zellkonzentration in der Suspension ermittelt und konnte hieraus berechnen,
welche Menge an Suspension benötigt wurde, um daraus die gewünschte
Anzahl an Zellen zu gewinnen. Das entsprechende Volumen wurde
entnommen und bei 1000rpm 10 Minuten zentrifugiert. Nach Absaugen des
Mediumüberstandes konnten die Zellen nun auf die gewünschte
Konzentration erneut verdünnt und dann in einer Dichte von 60000 pro
Deckgläschen ausgesät werden. Nach 45 Minuten Wartezeit zum Absetzen
der Zellen wurde zu jedem Deckglas 1ml Medium zugegeben.
Das Aussehen und Wachstumsverhalten der ausgesäten Zellen wie auch der
Kultur-Petrischalen mussten regelmäßig unter dem Mikroskop (Olympus
CK2, Japan) kontrolliert werden, um z.B. schlecht gewachsene Proben von
vornherein auszusortieren oder den richtigen Zeitpunkt für die nächste
Passage der RGCs einzuschätzen.
Anzucht der Mikroglia
Die Mikroglia konnten aus primären Astrozytenkulturen gewonnen werden,
da in diesen neben den Astrozyten immer auch Mikroglia mit enthalten sind.
Die Kulturen wurden aus Gehirnen von neugeborenen (P0-P2) Wistar-Ratten
nach der Methode nach Dermietzel et al., (1991) wie folgt präpariert:
Die Meningen wurden abgezogen und das Hirngewebe für 30 Min. in einer
0,1%igen Trypsinlösung (Invitrogen) bei 37°C inkubiert. Dann wurde es mit
Waschmedium (Dulbecos minimal essential medium with 1% Glucose, 10%
fetal calf serum) gewaschen, und danach 5 Min. mit 1%DNAse 1 (bovine
24
pancreas, Serva, Heidelberg) in PBS bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
dem Blocken der Enzym-Aktivität wurden die Zellen in Astrozyten-KulturMedium (DMEM, 10% fetal calf serum, 1% Nicht-essentielle Aminosäuren
(Invitrogen), Penicillin (50µg/ml), Streptomycin (50µg/ml) und Glutamin)
suspendiert. Hierfür wurden sie durch eine Pipette titriert, und nachfolgend
durch ein Gaze-Netz (60µm) filtriert. Danach konnten sie in Kulturflaschen
(Becton Dickinson, Heidelberg) überführt (2 Gehirne pro Flasche) und im
Brutschrank aufbewahrt werden. Nach 4 Tagen waren die Kulturen konfluent
und das Medium musste gewechselt werden.
Mikroglia haben die Eigenschaft, in Medium, das durch Astrozyten
konditioniert wurde, zu proliferieren (Frei et al., 1986). Daher wurde jetzt
weitere 5-10 Tage abgewartet und das Medium nur alle 3-4 Tage zur Hälfte
gewechselt, so dass sich die Miroglia auf der Astrozytenkultur vermehren
konnten. Nach insgesamt 9-14 Tagen war die Dichte der Mikroglia groß
genug, so dass sie für die Versuche verwendet werden konnten.
Hierzu wurden die Kulturflaschen 15 Minuten von Hand geschüttelt, so dass
sich die Mikroglia von der Kultur ablösten und im Mediumüberstand
schwammen. Dieser Überstand konnte nun entnommen werden und je nach
geschätzter Konzentration der Mikroglia 0,5-1ml davon auf die am Vortag
ausgesäten RGCs gegeben werden.
Danach wurde weitere 24-30 Std. bis zum Messen der funktionellen
Kopplung und des Membranpotentials mit der Patch Clamp-Technik
gewartet, damit sich die Mikroglia erst auf den RGCs absetzen konnten. Die
Versuchszellen waren also zum Zeitpunkt der Patch Clamp-Messung 45+/-3
Std. alt und seit 24-30 Std. mit Mikroglia inkubiert. Für die Versuche
„Mikroglia+2 Std. LPS“ und „Mikroglia+24 Std. LPS“ wurden die Zellen 2
bzw. 24 Std. vor dem Messen des Membranpotentials zusätzlich mit 1µg/ml
LPS (E.coli 026:B6, L 2654, Sigma, Taufkirchen) inkubiert.
25
Immuninkubation
Nach Messung des Membranpotentials mit der Patch Clamp-Technik wurden
die Zellen mit PBS bedeckt und bei 4°C aufbewahrt, so dass sie am
folgenden Tag mit der Immunfluoreszenz-Methode behandelt werden
konnten.
Das Prinzip der Immunhistochemie ist das Sichtbarmachen von Proteinen
durch die Verwendung von Antikörpern. Es wird zunächst ein Erstantikörper
auf das Gewebe aufgebracht, der sich gegen das Protein richtet, das
dargestellt werden soll. Der Erstantikörper dockt mit seiner variablen Domäne
am Protein an und hat es somit markiert. In einem zweiten Schritt wird nun
ein Zweitantikörper eingesetzt, der sich mit seiner variablen Region gegen
den Erstantikörper richtet und an seinem heavy-chain-Terminus mit einem
fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt ist. Somit wird das darzustellende
Protein mit dem Fluoreszenzfarbstoff markiert und kann hierdurch unter dem
Fluoreszenzmikroskop spezifisch identifiziert werden.
Für die Immuninkubation wurden die Zellen zunächst in PBS gewaschen,
dann für 10 Min in 100% Ethanol fixiert und noch einmal gewaschen.
Anschließend wurden unspezifische Bindungsstellen mit einer Blocklösung
(PBS; 1%Albumin Fraktion 5 aus Rinderserum, Merck; 10% Horse Serum,
GIBCO BRL) für 20 Min blockiert. Die Erstantikörper wurden mit
Blocklösung verdünnt und für jeweils 60 Min. bei Raumtemperatur
aufgetragen.
Folgende Erstantikörper wurden verwendet:
-Cx43 polyklonal, from rabbit (Verdünnung 1:100, Hofer, Zymed), der sich
gegen den Carboxy-Terminus (internal loop) von Cx43 richtet (Hofer et al.,
1996)
-ED1 monoklonal (1:100, Serotec MCA 341R, Eching), als Mikroglia-Marker
26
-GFAP polyklonal, gegen das Glial Fibrillary Acidic Protein (1:100, Sigma G
9269) zur Astrozytenidentifizierung
Nach drei Waschgängen mit PBS à 5 Minuten folgte die Inkubation mit den
fluoreszierenden Zweitantikörpern (Alexa 488 goat anti-rabbit, grün,
polyklonal; Alexa 568 goat anti-mouse, rot, monoklonal; Molecular Probes,
Leiden, Holland), 1:1000 mit PBS verdünnt. Anschließend musste wieder
mehrmals gründlich mit PBS gespült werden.
Um die Zellanzahl besser quantifizieren zu können, wurden die Zellkerne
zusätzlich für 10 Minuten mit dem Kernfarbstoff HOECHST 33342 (1:2500,
Sigma B2261) angefärbt. Es folgten noch 3 Waschgänge mit PBS, danach
wurden die Glasplättchen mit dem ProLong antifade kit (Molecular Probes)
auf Objektträgern fixiert. Sie konnten nun bei 4°C über mehrere Monate
gelagert werden.
Die Auswertung der Proben erfolgte durch die Mikroskopie unter dem
Immunfluoreszenz-Mikroskop Axiovert 35 (Zeiss).
Patch Clamp-Technik
Für die Messung des Membranpotentials sowie der Anzahl der gekoppelten
Zellen wurde die Patch Clamp-Technik (Axon 200-B patch clamp amplifier)
eingesetzt. Unter den unterschiedlichen Konfigurationen, die prinzipiell mit
dieser Technik möglich sind, wurde die Ganz-Zell-Ableitung (Whole Cell
Configuration) gewählt. Das Prinzip dieser Technik besteht darin, eine
einzelne Zelle unter dem Mikroskop mit einer Mikropipette anzusaugen, d. h.
die Zellmembran zu durchbrechen und so das im Inneren der Zelle
vorliegende Spannungspotential zu messen.
27
Gleichzeitig wird über die Pipette ein fluoreszierender Farbstoff in die Zelle
injiziert. Dieser Farbstoff, „Luzifer-Yellow“, ist chemisch ein
fluoreszierendes 4-Aminonaphtalimide und hat aufgrund seines geringen
Molekulargewichtes die Eigenschaft, frei durch Gap Junctions hindurch zu
diffundieren. Die Verteilung des Farbstoffs in andere Zellen wird „dyecoupling“ genannt und ist gleichzusetzen mit der elektrischen Kopplung des
Zellsynzytiums (Stewart, 1981). Nach der Injektion des Farbstoffes in einen
Astrozyten, wird sich dieser innerhalb weniger Minuten durch die Gap
Junctions auch in die benachbarten Zellen verteilen und sie anfärben.
Hierdurch kann man genau die Anzahl der mit der Ursprungszelle
gekoppelten Zellen feststellen.
Die verwendete Technik erlaubt auf diese Weise ein gleichzeitiges Messen
des Membranpotentials der Zelle und ihrer elektrischen Kopplung an
benachbarte Zellen (Gayol et al., 1999; Chvatal et al., 2001).
Im Folgenden sollen die technischen Grundlagen und das Vorgehen bei der
Patch Clamp-Technik erklärt werden:
Für das Durchführen von Patch Clamp-Experimenten ist ein komplettes Patch
Clamping-Setup erforderlich. Hierzu gehören die folgenden Komponenten:
- Ein Mikroskop, durch das die Zellen während des Patch-Vorgangs
beobachtet werden. Nur unter ständiger optischer Kontrolle ist es möglich,
eine einzelne Zelle mit der Mikropipette vorsichtig anzusaugen. Nach
erfolgreichem Patchen der Zelle kann man bei abgedunkelter
Mikroskopbeleuchtung die Verteilung des Luzifer-Yellow in die
benachbarten Zellen beobachten. Bei der vorliegenden Untersuchung wurde
ein Zeiss Axioskop mit FITC filter set verwendet.
Zusätzlich wird eine UV-Lampe eingesetzt, um den fluoreszierenden
Farbstoff sichtbar zu machen. Mit einer auf das Mikroskop aufgesetzten
28
Kamera können die Zellen und ihre Anfärbung durch Luzifer-Yellow nach
erfolgtem Patchen photographiert werden.
- Ein Mikromanipulator, mit dem die Mikropipette vorsichtig an die Zelle
herangesteuert wird, bis die optimale Position zum Ansaugen der Zelle
erreicht ist.
- Die Mikropipette, die durch Ansaugen in das Zellinnere eingebracht wird.
Es werden dünne Glaspipetten verwendet, die mit Hilfe eines Pipetten-Pullers
aus feinen Glasröhrchen selbst hergestellt werden. Der Pipetten-Puller muss
so eingestellt werden, dass die gezogenen Pipetten den passenden
Öffnungsdurchmesser erhalten. Der elektrische Widerstand der Pipette darf
nicht zu groß sein. In diesem Fall betrug er idealerweise 5-6 mOhm (Köller et
al, 1994). Es ist wichtig, dass die Pipette gute Seals bildet. Dies bedeutet, dass
die Pipette nach Durchbrechen der Zellmembran dieses Membranstück gut
isoliert und möglichst wenige Leckströme entstehen, die den Messvorgang
stören würden. Die Pipette wird mit intrazellulärer Lösung, die in der
Zusammensetzung dem intrazellulären Milieu der Zelle entspricht (in mMol:
Ka-Gluconat (135), KCl (20), MgCl2 (2), Hepes (10), EGTA (10), pH 7,4),
gefüllt. In der intrazellulären Lösung ist der Luzifer-Yellow-Farbstoff gelöst
(5%wt/vol). Für gute Messergebnisse ist zu beachten, dass die Pipette erst
kurze Zeit vor der Verwendung hergestellt wird, da es bei längeren
Aufbewahrungszeiten bereits zur Abstumpfung der feinen Pipettenspitze
kommen kann.
- Ein Vorverstärker (Headstage). An diesem ist eine Elektrode angebracht,
über die der Strom in die mit Pipettenlösung gefüllte Pipette fließen kann. Das
Headstage ist über eine mechanische Steuerung mit dem Mikromanipulator
verbunden. Über das Headstage kann so die Position der Pipette verändert
werden.
29
- Der Verstärker. Über ihn wird ein Spannungsimpuls abgegeben und so der
Stromfluss über die Pipette aufrecht erhalten. Gleichzeitig kann nach dem
Patchen der Zelle das Membranpotential gemessen werden.
- Ein Computer. Mit dem Programm Clampex 7.0 kann das Spannungssignal
des Verstärkers mittels einer Oszilloskopanzeige auf den Computerbildschirm
dargestellt und so der ganze Messvorgang direkt am Computer ausgewertet
und gespeichert werden.
- Ein Pumpensystem. Die Zellen liegen während des Versuchs in einer
Ringer-Lösung (Zusammensetzung in mM: Na (147), Ka (4,0), Ca (2,2) Cl
(156); Braun, Melsungen). Damit die Lösung nicht z.B. durch ausgelaufenen
Farbstoff verunreinigt wird, zirkuliert sie durch ein Pumpensystem. Mit
langsamer Geschwindigkeit fließt sie über einen Schlauch auf den
Objektträger und wird durch einen zweiten Schlauch wieder abgepumpt, so
dass die Zellen immer von frischer Lösung umspült werden.
- Ein vibrationsausgleichender Tisch, auf dem das Mikroskop steht. Dieser ist
wichtig, da beim Heranfahren der Pipette an die Zelle und vor allem während
des Patchvorganges schon kleine Erschütterungen zum Abbrechen der
Pipettenspitze führen können.
Für ein Patch-Experiment wird zunächst das Deckgläschen mit den Zellen in
das Ringer-Bad auf dem Objekttisch gelegt und die Zellen mit dem
Mikroskop scharfgestellt. Man wählt eine gesund aussehende Zelle zum
Patchen aus und stellt den Objektträger so ein, dass sie sich etwa in der Mitte
des Sichtfensters befindet.
Die Mikropipette wird mit Hilfe einer Kanüle vorsichtig etwa zur Hälfte mit
der Luzifer-Yellow-Lösung gefüllt, wobei darauf geachtet werden muss, dass
keine Luftbläschen entstehen. Danach wird die Pipette auf die Mikroelektrode
aufgesteckt, so dass sich das Elektroden-Ende in der Lösung befindet, und an
der Elektrodenhalterung am Headstage festgeschraubt. Über den mit der
30
Pipette verbundenen dünnen Kunststoffschlauch wird ein leichter Überdruck
an der Pipettenspitze angelegt. Nun wird die Mikropipette auf den
Objektträger heruntergefahren, bis die Spitze in die Badlösung eintaucht.
Der Verstärker wird nun eingeschaltet und mit Hilfe der Offsetkorrektur so
eingestellt, dass bei I=0A das abzulesende Potential auch gleich Null ist.
Als nächstes wird ein automatischer Testpuls von 5mV alle 5ms angelegt, der
auf der Oszilloskopanzeige des Computers erscheint. Der Strom fließt nun
über die Mikropipette in die Ringer-Lösung und über eine zweite sich in der
Lösung befindende Elektrode wieder heraus zurück zum Verstärker. Im SealTest-Modus kann so anhand der Stromantwort der Pipette ihr Widerstand
bestimmt werden. Der Stromfluss sollte etwa 1nΑ betragen. Danach wird der
Seal-Test ausgeschaltet und der Spannungspuls im Clampex-Programm des
Computers auf 10mV umgestellt. Der Stromfluss sollte nun etwa 2nA
betragen.
Jetzt manövriert man mit Hilfe des Mikromanipulators die Pipettenspitze
unter Sicht vorsichtig an die Membran der zu patchenden Zelle heran. Wenn
man schon sehr nah an der Zellmembran ist, zeigt sich dies auf dem
Oszilloskop in einer geringen Abnahme des Stromflusses durch die
Widerstandserhöhung. Nun saugt man die Zelle über den Kunststoffschlauch
mit dem Mund an. Beim Durchdringen der Zellmembran entsteht ein GigaSeal, die Anzeige auf dem Bildschirm springt nach oben, und es sind
kapazitive Ströme am Anfang und Ende des Pulses zu sehen. Durch das im
Inneren der Zelle vorliegende Spannungspotential wird der Stromfluss über
die Pipette verändert. Man gleicht nun im Holding Command-Modus den
Strom wieder auf Null ab. Beim Umschalten am Verstärker auf Vhold/Ihold
wird die hierfür benötigte Spannung angezeigt. Sie entspricht dem
Ruhemembranpotential der Zelle, welches auf diese Weise direkt abgelesen
werden kann.
31
Sofort nach dem Einbringen der Pipettenspitze in den Intrazellulärraum
diffundiert das in der Pipette enthaltene Luzifer-Yellow in die Zelle hinein
und verteilt sich darin. Wenn die Zelle über durchgängige Gap Junctions mit
anderen gekoppelt ist, kann man beobachten, wie der Farbstoff nach und nach
auch diese anfärbt. Dies wird am besten sichtbar, wenn die normale
Mikroskopbeleuchtung abgedeckt wird, da dann unter UV-Licht nur noch der
fluoreszierende Farbstoff zu sehen ist. Nach 2 und 10 Minuten werden Photos
gemacht, auf denen dann später in Ruhe die gekoppelten Zellen ausgezählt
werden können. Zusätzlich wird noch ein Photo in Phasenkontrasttechnik
gemacht, d. h. ohne Abdunklung, aber mit maximal verringerter
Beleuchtungsstärke. Auf diese Weise erhält man einen guten Überblick über
die tatsächliche Lage der Zellen zueinander.
Beschreibende und analytische Statistik
Die auf den RGCs ko-kultivierten Mikroglia konnten nach Messung des
Membranpotentials in der Immuninkubation mit Hilfe des ED1 Antikörper
markiert und so identifiziert und ausgezählt werden. Die Dichte betrug bei
allen Proben zwischen 5 und 12%, was ungefähr der natürlichen MikrogliaDichte des Gehirns unter physiologischen Bedingungen entspricht.
Da Mikroglia nur im aktivierten Zustand proinflammatorische Zytokine
produzieren (Kloss et al., 1997, Ledeboer et al., 2000), war der Anteil der
aktivierten Mikroglia ein wichtiger zu ermittelnder Parameter. Wie bereits
erwähnt lässt sich der Aktivierungsgrad der Mikroglia anhand der
Morphologie ermitteln (Kreutzberg, 1996; Stoll et al., 1998; Stoll und
Jander,1999):
Unter inflammatorischen Bedingungen verändert sich die Morphologie der
Mikroglia vom ruhenden, ramifizierten Phänotyp (kleine Zellkörper mit nur
kleinem perinukleären und submembranösen zytoplasmatischen Rand; dünne
32
Zellausläufer, die länger als der Durchmesser des Zellkörpers sind) über einen
intermediären Typ zum aktivierten runden phagozytierenden Phänotyp (kurze
Zellausläufer, großer Zellkörper-Durchmesser; mehrere zytoplasmatische
Vakuolen im perinukleären Randbereich) (Booth und Thomas, 1991; Slepko
und Levi, 1996). Durch Auszählen konnte der Prozentsatz des aktivierten
Phänotyps bezogen auf alle sich innerhalb eines Sichtfensters befindenden
Mikroglia festgestellt und als Marker für die Stärke der entzündlichen
Reaktion der Mikroglia verwendet werden.
Die Cx43-Expression wurde visuell unter dem Immunfluoreszenz-Mikroskop
ausgewertet. Es wurde eine Rangskala von 25%, 50%, 75% und 100% Cx43Positivität aufgestellt und die Proben den entsprechenden Prozentsätzen
zugeordnet. Die Cx43-Positivität wurde als Immunreaktivität pro Sichtfeld
(10 x 0,2mm²) definiert.
Der Median für jeweils eine Versuchsbedingung ergab sich hier aus
mindestens 4 Einzelergebnissen. Bei der Messung des Membranpotentials
wurden pro Versuchsvariable mindestens 11 Einzelmessungen durchgeführt,
bei der Ermittlung der Kopplung der Zellen waren es mindestens 8.
Die Unterschiede zwischen den Medianen der Einzelergebnisse wurden mit
dem Mann-Whitney-Test (one-tailed) auf Signifikanz geprüft.
Für die Deskriptiv- und Prüfstatistik sowie die graphischen Darstellungen
(Diagramme) wurde das Programm GraphPad Prism Version 3.00 für
Windows (GraphPad software, San Diego California USA) eingesetzt.
33
Ergebnisse
Für die verschiedenen Versuchsvariablen werden die folgenden Abkürzungen
verwendet:
M pur= über 30 Std. mit Mikroglia ko-kultivierte Zellen
M+2h LPS= über 30 Std. mit Mikroglia ko-kultivierte und für 2 Std. mit LPS
inkubierte Zellen
M+24h LPS= über 30 Std. mit Mikroglia ko-kultivierte und für 24 Std. mit
LPS inkubierte Zellen
2h LPS pur= für 2 Std. mit LPS inkubierte Zellen ohne Mikroglia
24h LPS pur= für 24 Std. mit LPS inkubierte Zellen ohne Mikroglia
RGCs= rat glial cells
Bei den angegebenen Spannungswerten des Membranpotentials wurde jeweils
nur der Betrag der Spannung angegeben; es handelt sich bei den Messwerten
jedoch ausnahmslos um im Verhältnis zum Extrazellulärraum negative
Spannungen (-mV).
Funktionelle Kopplung
(siehe Grafik Abb. 1 und Photos Abb. 2-5)
Die funktionelle Kopplung der RGCs wurde mittels der Injektion von LuziferYellow ermittelt. 10 Minuten nach dem Patchen der Zelle wurde ein Photo
erstellt und auf diesem die durch den Farbstoff angefärbten Zellen ausgezählt,
wobei die gepatchte Zelle nicht mitgezählt wurde.
Im Hinblick auf die Ergebnisse mit primären Astrozytenkulturen erwartete
man eine Verminderung der funktionellen Kopplung unter entzündlichen
Bedingungen. Interessanterweise trat dieser Effekt bei den RGCs nicht ein:
34
Als Kontrollwert ergab sich für die mittlere Anzahl miteinander gekoppelter
Zellen der Wert 4,5 (Median, range 0-16). Anhand der Kontrollmessungen
kann man erkennen, dass die gemessenen Werte eine breite Streuung
aufwiesen. Dies kann zum Teil dadurch bedingt sein, dass die Zelldichte
variierte, obwohl die Zellen zum Zeitpunkt des Patchens alle gleich alt waren
und möglichst immer Stellen mit ungefähr gleicher Dichte zum Patchen
ausgewählt wurden. Es muss beachtet werden, dass auch bei den
Kontrollzellen dreimal keine Kopplung festgestellt wurde. Dies tritt immer
wieder auf und kann zum Beispiel dadurch bedingt sein, dass sich die Zelle
gerade in der Mitose befindet oder als frisch entstandene Zelle noch nicht in
den Zellverband eingegliedert ist.
Schaut man sich nun die mit LPS pur inkubierten Zellen an, so stellt man fest,
dass sich weder bei 2 Std. Inkubationszeit mit 4,5 (range 0-16) gekoppelten
Zellen noch nach 24 Std. mit 7,0 (range 0-14) eine signifikante Veränderung
der funktionellen Kopplung ergeben hat (p=0,4868 für 2h LPS pur; p=0,3153
für 24h LPS pur).
Bemerkenswerterweise erhielt man ähnliche Ergebnisse auch für die
zusätzlich mit Mikroglia ko-kultivierten RGCs: Bei den Proben M+2h LPS
und M+24h LPS zeigte sich mit 3,5 (range 0-17) und 4,5 (range 0-12)
gekoppelten Zellen kein statistisch signifikanter Unterschied zum
Kontrollwert 4,5 (p= 0,5 für M+2h LPS und p= 0,3421 für M+24h LPS). Bei
der Probe M pur schien die Anzahl der gekoppelten Zellen mit 8,5 (range 012) ganz entgegen der Erwartung sogar zuzunehmen. Hierbei muss aber die
große Streubreite der Einzelwerte beachtet werden. Die statistische Testung
mit dem Mann-Whitney-Test ergab mit p=0,4484 ebenfalls keinerlei
signifikante Abweichung vom Kontrollwert.
35
Abb. 1: Funktionelle Kopplung der RGCs 10 Min nach Farbstoffapplikation
Man kommt also zu dem Ergebnis dass unter keiner der Versuchbedingungen
eine signifikante Veränderung im Kopplungsverhalten der RGCs beobachtet
werden konnte. Die Tatsache, dass auch durch stärkste inflammatorische
Bedingungen (M+24h LPS) keine Verminderung der funktionellen Kopplung
erzielt wird, weist darauf hin, dass die Zelllinie diesbezüglich gegenüber
äußeren Einflüssen proinflammatorischer Art weitgehend resistent ist.
36
Abbildungen 2-7: Funktionelle Kopplung (Patch Clamp-Technik)
Abb. 2: Kontrolle RGCs
Abb. 3: Kontrolle RGCs, Kontrastaufnahme
Abb. 4: RGCs +Mikroglia (M pur)
Abb. 5: RGCs +Mikroglia +2 Std.
LPS-Inkubation (M+2h LPS)
Abb. 6: Kontrollexperiment primäre
Astrozytenkulturen: Kontrolle
Abb. 7: Kontrollexperiment Astrozytenkulturen: 2 Std. Inkubation mit LPS,
Kontrastaufnahme
37
Erläuterungen zu Abb. 2-7: Funktionelle Kopplung (Patch Clamp-Technik)
Abb. 2: Kontrolle RGCs
Man sieht die gepatchte Zelle durch das injizierte Luzifer-Yellow neongelb
angefärbt. Es lassen sich gut der runde Zellkörper und die länglichen
Ausläufer der Zelle erkennen. Um die Zelle herum sind etwa 20 weitere
RGCs erkennbar, die von dem Farbstoff schwächer angefärbt sind. Der
Farbstoff ist über Gap Junctions von der gepatchten Zelle in die
Nachbarzellen hinein diffundiert, was zeigt, dass diese Zellen funktionell
miteinander gekoppelt sind.
Abb. 3: Kontrolle RGCs, Kontrastaufnahme
Im Kontrastbild lässt sich die tatsächliche Dichte der gewachsenen Zellen
besser erkennen. Wieder sieht man die gepatchte Zelle, in der in diesem Fall
noch die Spitze der Mikropipette steckt, und kann erkennen, wie sich das
Luzifer-Yellow in die umliegenden Zellen verteilt.
Abb. 4: RGCs +Mikroglia (M pur)
Auch hier ist deutlich zu sehen, dass sich der Farbstoff in mehrere
benachbarte Zellen ausbreitet. Die Ko-Kultivierung mit Mikroglia hat also
keine Inhibition der funktionellen Kopplung bewirkt.
Abb. 5: RGCs +Mikroglia +2 Std. LPS-Inkubation (M+2h LPS)
Das Bild zeigt die Anfangsphase der Farbstoffausbreitung 2 Minuten nach der
Luzifer-Yellow-Injektion. Man kann sehen, dass der Farbstoff bereits
innerhalb dieser kurzen Zeitspanne in zwei der benachbarten Zellen
hineindiffundiert ist und diese angefärbt hat.
38
Abb. 6: Kontrollexperiment primäre Astrozytenkulturen: Kontrolle
Hier wurde an einer primären Astrozytenkultur die funktionelle Kopplung
unter
nicht-entzündlichen Bedingungen gemessen. Man sieht wie bei den RGCs die
deutliche Ausbreitung des Farbstoffs in die durch Gap Junctions mit der
gepatchten Zelle verbundenen Astrozyten.
Abb. 7: Kontrollexperiment primäre Astrozytenkulturen: 2 Std. Inkubation
mit LPS
Man sieht die gepatchte Zelle mit ihren Ausläufern stark angefärbt. Im
Gegensatz zu dem vorherigen Bild ist hier nach der zweistündigen Inkubation
mit LPS aber keine Ausbreitung von Luzifer-Yellow in andere Zellen zu
sehen. Das LPS hat also die funktionelle Kopplung der Astrozyten
unterbunden.
39
Cx43-Expression
(siehe Grafik Abb. 8 u. Photos Abb. 9-12)
Mit Hilfe der Immunfluoreszenz konnte die Expression des Proteins Cx43 in
der Zellmembran der RGCs sichtbar gemacht werden. Wie zuvor beschrieben
ist Cx43 das zellspezifische Connexin der astrozytären Gap Junctions. Es
kann daher als Marker für die Stärke der Kopplung zwischen den Zellen
dienen.
In diesen Untersuchungen wurden die Ergebnisse aus den Patch ClampExperimenten bestätigt: Als Kontrollwert ergab sich ein Median von 75%
(range 50-100%). Bei den Proben, die über 24 Std. mit LPS inkubiert waren,
betrug die mittlere Cx43-Expression nur 50% (range 25-75%). Dieser Wert
unterscheidet sich aber mit p=0,1032 statistisch nicht signifikant von der
Kontrolle. Für die 2h LPS pur-Proben wurde mit 75% (range 50-75%) sogar
exakt der gleiche Median wie bei der Kontrolle ermittelt (p=0,2567).
Auch für die mit Mikroglia ko-kultivierten Proben ergab sich keine
wesentliche Veränderung der Cx43-Expression. So zeigten lediglich die
Mikroglia pur-Proben mit 87,5% (range 50-100%) eine leichte Steigerung
gegenüber der Kontrolle (mit p=0,2697 statistisch nicht signifikant). Die
Proben M+24h LPS und M+2h LPS unterschieden sich mit jeweils 75%
Cx43-Expression (range 50-75% und 75-75%) wiederum nicht von der
Kontrolle.
Die mittels Immunfluoreszenz gewonnenen Ergebnisse bestärken die These,
dass die RGCs sich in ihrem Kopplungsverhalten von entzündlichen
Umgebungsbedingungen nicht beeinflussen lassen.
40
Abb. 8: Expression von Cx43 in der Immunfluoreszenz
41
Abbildungen 9-12: Darstellung von Cx43 in der Immunfluoreszenz
Abb. 9: Kontrolle RGCs, Vergr.: 63fach
Abb. 10: RGCs +Mikroglia (M pur),
Vergr.: 63fach
Abb. 11: RGCs +Mikroglia +2 Std. LPSInkubation (M+2h LPS), Vergr.: 63fach
Abb. 12: RGCs +Mikroglia +24 Std. LPSInkubation (M+24h LPS), Vergr.:63fach
42
Erläuterungen zu Abb. 9-12: Darstellung von Cx43 in der Immunfluoreszenz
Abb. 9: Kontrolle RGCs, Vergrößerung (Objektiv): 63fach
Durch Einsatz eines Antikörpers gegen das Protein Cx43 und nachfolgende
Grün-Markierung durch den Zweit-Antikörper wird hier die Expression von
Cx43 und somit der Gap Junctions dargestellt. Man sieht bei der Kontrolle die
hohe Dichte des als grüne Pünktchen erscheinenden Cx43. Die hohe Cx43Expression lässt sich als starke funktionelle Kopplung der Zellen
untereinander deuten.
Abb. 10: RGCs +Mikroglia (M pur), Vergr.: 63fach
Abb. 11: RGCs +Mikroglia +2 Std. LPS-Inkubation (M+2h LPS),
Vergr.: 63fach
Abb. 12: RGCs +Mikroglia +24 Std. LPS-Inkubation (M+24h LPS),
Vergr.: 63fach
Man erkennt auf den Bildern die deutliche Expression von Cx43. Diese mag
im Vergleich zur Kontrolle evtl. leicht schwächer erscheinen. Hierbei muss
aber beachtet werden, dass die Zelldichte bei den mit Mikroglia kokultivierten Proben geringer ist. Dies fällt vor allem bei der M+24h LPSProbe (Abb. 11) auf.
Man kann also feststellen, dass weder durch die Ko-Kultivierung mit
Mikroglia allein, noch durch die zusätzliche LPS-Inkubation eine deutliche
Verminderung der Expression von Cx43 und damit der funktionellen
Kopplung über Gap Junctions bewirkt worden ist.
43
Membranpotentialmessung
(siehe Grafik Abb. 13)
Zunächst war es notwendig einen für die verwendete Zelllinie unter den
angewandten Versuchsbedingungen gültigen Vergleichswert für das normale
Ruhemembranpotential zu ermitteln. Es ergab sich aus einer Anzahl von 20
Einzelmessungen ein mittleres Membranpotential von 26,28mV (Median;
range 6,50-43,10mV). Dieser Wert variiert stark von dem unter unseren
Versuchsbedingungen gemessenen mittleren Membranpotential von primären
Astrozytenkulturen, das bei 41,0mV liegt. Die RGCs scheinen also auch unter
nicht entzündlichen Bedingungen ein generell niedrigeres Ruhemembranpotential zu haben. Dieses wurde auch in anderen Experimenten der
Arbeitsgruppe bestätigt, so dass man einen durch den Untersucher bedingten
systematischen Fehler ausschließen kann.
Die recht große Streuungsbreite der Einzelergebnisse lässt sich dagegen auch
bei primären Astrozytenkulturen feststellen. Es wird sogar vermutet, dass die
unterschiedlich niedrigen Ruhepotentiale innerhalb eines Astrozytären
Synzytiums wichtig für den transzellulären Kalium-Transport sind (McKhann
et al, 1997).
Bemerkenswerterweise bewirkte die Inkubation mit LPS bei den reinen RGCKulturen keine signifikante Veränderung des Membranruhepotentials. Nach 2
Std. Inkubationszeit wurde ein mittleres Membranpotential von 22,90mV
(range 8,20-38,60mV) gemessen; auch nach 24 Std. zeigte sich mit einem
mittleren Membranpotential von 22,0mV (range 10,90-29,50mV) kein
wesentlicher Effekt von LPS. Zwar ist eine geringe Veränderung in Richtung
Depolarisation zu beobachten, da diese aber statistisch nicht signifikant ist
(p=0,0597 für 24h LPS pur; p= 0,3475 für 2h LPS pur), muss man davon
44
ausgehen, dass höchstens ein marginaler, von der LPS-Inkubationszeit
abhängiger Effekt vorliegt.
Im Gegensatz dazu ließ sich bei allen mit Mikroglia ko-kultivierten Zellen
eine signifikante Verschiebung des mittleren Membranpotentials in Richtung
Depolarisation beobachten, wobei die nicht zusätzlich aktivierten Zellkulturen
(M pur) mit 18,30mV (range 6,20-32,60mV) den schwächsten Effekt
aufwiesen (p=0,0158). Ein ähnliches Ergebnis erhält man für die M+2h LPSProben (16,95mV, range 9,90-29,80mV; p=0,0195), während die M+24h
LPS-Proben mit einem mittleren Membranpotential von 8,90mV (range 2,6021,20mV) die stärkste Depolarisation um 17,30 mV gegenüber der Kontrolle
(p<0,0001, hochgradig signifikant) zeigten.
Aus diesen Daten kann man schließen, dass:
a) LPS alleine keinen direkten Effekt auf das Membranpotential der RGCs
hat,
b) die kokultivierten Mikroglia Entzündungsmediatoren (z.B. LTB4, TNF-α,
IL-1β, NO) ausschütten, die eine Depolarisation der RGCs bewirken oder
aber durch direkte Zellkontakte diese Depolarisation herbeiführen,
c) die durch die Mikroglia bewirkte Depolarisation umso stärker ist, je stärker
die Mikroglia durch zusätzliche LPS-Stimulation aktiviert waren, wobei
offensichtlich eine ausreichend lange Dauer der LPS-Inkubation (24 Std. vs. 2
Std.) für einen maximalen Effekt ausschlaggebend war.
45
Abb. 13: Membranruhepotential der Astrozytenzelllinie unter den
verschiedenen inflammatorischen Bedingungen.
46
Mikroglianachweis in der Immunfluoreszenz
(siehe Photos Abb. 14-19)
Mit Hilfe der Immunfluoreszenz wurde im nachhinein kontrolliert, ob die
zuvor gepatchten Zellen auch tatsächlich in ausreichender Dichte mit den
Mikroglia ko-kultiviert waren. Die durchschnittliche Dichte der Mikroglia
wurde durch Auszählen der ED1-positiven Zellen ermittelt und betrug 9,7%
(Median, range 5,0-11,4%, Anzahl der ausgewerteten Proben (n)=4). Proben,
die dieser Dichte nicht entsprachen, wurden aus der Wertung genommen.
Weiterhin wurden die ED1-markierten Mikroglia anhand ihrer Morphologie
in den RRT (resting-ramified-type) und RPT (rounded-phagocytic-type)
eingeteilt und so der Anteil der aktivierten Mikroglia ermittelt. Bei den
M+24h LPS-Proben betrug der Anteil der aktivierten Mikroglia
durchschnittlich 87,61% (Median, range 70,0-92,3%), während bei den M+2h
LPS-Proben durchschnittlich 56,35% (range 35,3-70%) der Mikroglia
aktiviert waren. Die M pur-Proben waren in den ausgezählten Sichtfenstern
im Durchschnitt zu 70,0% (range 60,0-80,0%) aktiviert. Dieser Anteil
erscheint im Vergleich zu dem bisher gemessenen Prozentsatz des RPT in
Astrozytenkulturen unter Ruhebedingungen von 41,5% (Faustmann et al.,
2003) recht hoch. Man muss hierbei aber bedenken, dass die Aktivierung der
Mikroglia auch durch viele andere Faktoren unabhängig von LPS beeinflusst
werden kann. Es ist beispielsweise gut möglich, dass die starke mechanische
Manipulation der Mikroglia beim Abklopfen von den Astrozytenkulturen zu
einer Aktivierungsreaktion geführt hat. Als weitere Störfaktoren kommen
Verunreinigungen der Proben in Frage, die auch bei sorgfältigem Arbeiten
unter sterilen Bedingungen nicht ganz ausgeschlossen werden können. Da die
Primärkulturen aus verschiedenen Tieren gewonnen werden, kann der
Aktivierungsgrad der Mikroglia auch schon bei der Präparation der
Versuchstiere durch eine vorbestehende Entzündung beeinflusst sein. Man
47
kann daher annehmen, dass bei den zur Auszählung verwendeten
Immuninkubationsproben M pur durch nicht kontrollierbare zusätzliche
Einflüsse ein recht hoher Aktivierungsgrad vorlag.
Da hier aber nur der Einfluss von LPS getestet werden soll, muss man die
Ergebnisse im Hinblick auf diesen Einflussfaktor interpretieren: Wenn man
die Proben M+2h LPS und M+24h LPS vergleicht, kommt man zu dem
Schluss, dass die lange Inkubationszeit von LPS über 24 Std. eine starke
zusätzliche Aktivierung der Mikroglia bewirkt. Die 2stündige LPS-Inkubation
hatte offenbar eine weniger starke Wirkung; der ermittelte Anteil des RPT
liegt aber immer noch deutlich über dem oben genannten Referenzwert der
Arbeitsgruppe für nicht entzündlich beeinflusste Mikroglia.
Offensichtlich war also die über 24 Std. andauernde LPS-Inkubation der
stärkste Aktivierungsstimulus. Dieser Sachverhalt stimmt mit den
Ergebnissen der Membranpotentialmessung überein, die ebenfalls auf eine
starke Wirkung der LPS-Inkubation über 24 Std. hinweisen.
48
Abbildungen 14-19: Mikroglianachweis in der Immunfluoreszenz
Abb. 14: Mikroglia (M pur),
Vergr.: 63fach
Abb. 15: Mikroglia, 2 Std. LPS-Inkubation
(M+2h LPS), Vergr.: 63fach
Abb. 16: Mikroglia, 24 Std. LPS-Inkubation
(M+24h LPS), Vergr.: 40fach
Abb. 17: Mikroglia, 24 Std. LPS-Inkubation
(M+24h LPS), Vergr.: 63fach
Abb.18: Kontrolle RGCs, HoechstKernfärbung, Vergr.: 40fach
Abb. 19: Mikroglia, 24 Std. LPS-Inkubation
(M+24h LPS), Hoechst-Kernfärbung,
Dreifach- Filter, Vergr.: 40fach
49
Erläuterungen zu Abb. 14-19: Mikroglianachweis in der Immunfluoreszenz
Abb. 14: Mikroglia (M pur), Vergr.: 63fach
Man sieht unter dem Fluoreszenzmikroskop die mit dem ED1-Antikörper
markierten Mikroglia, die durch den Zweit-Antikörper rot angefärbt sind. Die
Mikroglia befinden sich teilweise im aktivierten, abgerundeten Zustand, zum
Teil sieht man aber auch längliche Zellausläufer, die den ramifizierten bzw.
intermediären Phänotyp kennzeichnen. Im Hintergrund lassen sich sehr
schwach dunkelviolettfarbig die RGCs erkennen, auf denen die Mikroglia
aufsitzen.
Abb. 15: Mikroglia, 2 Std. LPS-Inkubation (M+2h LPS), Vergr.: 63fach
Im Bild erkennt man mehrere Mikroglia, die sich größtenteils im
intermediären Phänotyp befinden. Dies kann man als Ausdruck der
beginnenden Aktivierungsreaktion unter dem Entzündungsreiz von LPS
ansehen. Rechts im Bild findet man eine schon fast abgerundete Zelle, links
dagegen einen noch ramifizierten Phänotyp mit eher kleinem Zellkörper,
schmalem Zytoplasmasaum und dünnen Ausläufern, die länger als der
Durchmesser des Zellkörpers sind.
Abb. 16: Mikroglia, 24 Std. LPS-Inkubation (M+24h LPS), Vergr.: 40fach
In der geringeren Vergrößerung lässt sich gut erkennen wie die Mikroglia auf
den schwach rot erkennbaren RGCs verteilt sind. Man sieht, dass sich nach
der 24stündigen LPS-Inkubation die meisten der Mikroglia in der
abgerundeten aktivierten Form befinden.
Abb. 17: Mikroglia, 24 Std. LPS-Inkubation (M+24h LPS), Vergr.: 63fach
Hier sind besonders gut drei Mikroglia im aktivierten Phänotyp erkennbar:
Die Zellkörper sind abgerundet und voluminös; Zellausläufer sind gar nicht
50
vorhanden. Auf dem Bild lediglich schwach zu erkennen sind die Vakuolen
im Zytoplasma der Zellen. In diesen befinden sich Zytokine und weitere
Entzündungssubstanzen, die dann in den Extrazellulärraum entleert werden
können.
Abb. 18: Kontrolle RGCs, Hoechst-Kernfärbung, Vergr.: 40fach
Mit der Hoechst-Färbung lassen sich spezifisch nur die Zellkerne anfärben.
Man kann so gut die Dichte der Zellkultur feststellen. Das Bild zeigt eine
RGC-Kultur ohne Mikroglia. Man sieht das konfluente, dichte Wachstum und
die gleichmäßige Verteilung der Zellkerne.
Abb. 19: Mikroglia, 24 Std. LPS-Inkubation (M+24h LPS), HoechstKernfärbung, Dreifach-Filter, Vergr.: 40fach
Mit einem Dreifach-Filter lassen sich sowohl die Kernfärbung als auch die
roten und grünen Fluoreszenzfarbstoffe gleichzeitig ansehen.
Man sieht hier die blauen Zellkerne der RGCs und darauf vier rot angefärbte,
aktivierte Mikroglia. Die grünen Punkte in den Zellmembranen der RGCs
markieren das Gap Junction-Protein Cx43, wobei die Anfärbung durch den
grünen Fluoreszenzfarbstoff hier recht schwach ausgefallen ist.
Es fällt auf, dass die Zelldichte der RGCs nach 24 Std. LPS-Inkubation
deutlich geringer ist als bei der Kontrolle. Z.T. haben sich regelrechte Löcher
gebildet, so dass die Zellen nicht mehr konfluent sind.
51
Morphologische Veränderungen
(siehe Photos Abb. 20-23)
Es fiel auf, dass sich die RGCs in den M+24h LPS- Proben auch in
morphologischer Hinsicht von den Kontrollen unterschieden. Obwohl alle
Zellproben zum gleichen Zeitpunkt und in gleicher Zelldichte ausgesät
wurden, waren die M+24h LPS-Proben nach 2 Tagen wesentlich dünner
gewachsen als die Kontrollen. Die Zellen nahmen eine langgestreckte,
spindelige Form mit schmalem, z.T. blasigem Zytoplasmasaum und langen
Zellausläufern an. Stellenweise lagerten sich die Makro- und Mikrogliazellen
auch zu granulomartigen Knoten zusammen. Unter den anderen
durchgeführten Versuchsbedingungen zeigten sich solche Effekte nicht.
In der Kernfärbung und Beurteilung unter dem Fluoreszenzmikroskop kann
man ebenfalls die geringere Dichte der M+24h LPS ausmachen; es zeigt sich
aber keine erhöhte Apoptoserate, so dass Apoptose wohl nicht als Ursache
dafür in Frage kommt.
Von den aktivierten Mikroglia scheinen also Stoffe freigesetzt zu werden, die
nach genügend langer Einwirkungszeit (24 Std.) diese Veränderungen
bewirken und über eine Hemmung der Proliferation oder eine erhöhte
Absterbungsrate der Zellen zu einer geringeren Dichte der Zellkultur führen.
52
Abbildungen 20-23: Morphologie
Abb. 20: Kontrolle RGCs, Vergr.: 20fach
Abb. 21: RGCs +Mikroglia +24 Std. LPSInkubation (M+24h LPS), Vergr.: 20fach
Abb. 22: RGCs +Mikroglia +24 Std. LPSInkubation (M+24h LPS), Vergr.: 40fach
Abb. 23: RGCs +Mikroglia +24 Std. LPSInkubation (M+24h LPS), Vergr.: 40fach
53
Erläuterungen zu Abb. 20-23: Morphologie
Erläuterungen zu Abb. 20: Kontrolle RGCs, Vergr.: 20fach
Das Bild zeigt die RGCs 45 Std. nach dem Aussähen auf dem Deckgläschen.
Man sieht, dass die Zellen in dieser Zeit zu einem dichten, konfluenten
Zellrasen herangewachsen sind und die Deckglasoberfläche vollständig
bedecken.
Abb. 21-23: RGCs +Mikroglia +24 Std. LPS-Inkubation (M+24h LPS),
Vergr.: Abb. 21: 20fach, Abb. 22, 23: 40fach
Man erkennt die RGCs mit ihren hellen Zellkörpern und langen Ausläufern.
Darauf befinden sich die kleineren runden, im Bild etwas dunkler
erscheinenden Mikroglia. Ihr Zytoplasma erscheint durch die enthaltenen
Vakuolen blasig und unregelmäßig.
Es fällt auf, dass die Zelldichte der RGCs hier wesentlich geringer ist als bei
der Kontrolle, obwohl beide Proben zum gleichen Zeitpunkt ausgesät wurden.
Die Zellen bilden keinen konfluenten Zellrasen mehr, sondern hängen nur
noch zum Teil mit ihren Ausläufern zusammen, während große Teile des
Deckgläschens gar nicht von Zellen bedeckt sind. An einigen Stellen haben
sich die RGCs zu granulomartigen Knoten zusammengelagert (Abb. 23 unten
links), während in der Umgebung nur einzelne Zellen zu sehen sind. Die
RGCs fallen außerdem durch ihre sehr kleinen Zellkörper auf, mit viel
schmalerem perinukleären Rand als bei den Kontrollen. Außerdem haben sie
lange, dünne, stark verzweigte Ausläufer entwickelt, durch die die einzelnen
Zellen miteinander verbunden sind.
Man kann also deutlich feststellen, dass die über 24 Std. mit LPS aktivierte
Mikroglia zu einer Verringerung der Zelldichte sowie einer veränderten
Morphologie der RGCs geführt hat.
54
Kontrollexperiment: Primäre Astrozytenkulturen
(siehe Photos Abb. 6 u. 7)
Die Experimente dieser Arbeit stehen im Vergleich zu bereits veröffentlichten
Ergebnissen der Arbeitsgruppe (Faustmann et al., 2003; Hinkerohe et al.,
2002; Smikalla et al., 2002). In diesen Arbeiten wurden primäre
Astrozytenkulturen, die natürlicherweise auch Mikroglia enthalten, unter dem
Einfluss verschiedener entzündlicher Bedingungen untersucht: Die Inkubation
der primären Astrozytenkulturen mit LPS bewirkte eine signifikante
Verschiebung des Membranpotentials in Richtung Depolarisation sowie eine
prozentuale Zunahme des aktivierten Mikroglia-Phänotyps. Diese Ergebnisse
stimmen mit den in der vorliegenden Arbeit ermittelten Wirkungen von LPS
auf die RGCs überein, wenn man annimmt, das LPS nicht direkt, sondern
über die Aktivierung von Mikroglia wirkt.
Im Unterschied zu den RGCs zeigte sich bei den primären Astrozytenkulturen
nach LPS-Inkubation auch eine signifikante Reduktion der funktionellen
Kopplung sowie eine signifikante Verminderung der Cx43-Expression.
Zur Selbstkontrolle wurde dieses Experiment von mir in Stichproben noch
einmal nachgestellt, um eine Untersucherabhängigkeit der Ergebnisse
auszuschließen:
Bei der Membranpotentialmessung ergab sich für die Kontrollen ein mittleres
Membranpotential von 42,6 (Median, range 26,9-76,0mV, n=5), während
nach 2 Std. LPS-Inkubation das Membranpotential auf 29,4mV (range 24,535,5mV, n=3) abgesunken war (24 Std. LPS-Inkubation nicht untersucht).
Bei der funktionellen Kopplung zeigte sich sowohl nach 2 Std. LPSInkubation als auch nach 24 Std. mit jeweils 0 gekoppelten Zellen (Median,
range 0-1, n=3 für 2h LPS und range 0-3, n=3 für 24h LPS) eine deutliche
Verminderung gegenüber den Kontrollen mit 8,5 (range 6-11, n=2)
gekoppelten Zellen.
55
Die ermittelten Werte stehen in guter Übereinstimmung mit den oben
genannten Ergebnissen der Arbeitsgruppe, womit ein personenbezogener
Untersuchungsfehler weitgehend ausgeschlossen werden kann.
56
Diskussion
Aus den gewonnenen Ergebnissen lassen sich die folgenden Schlüsse ziehen:
Funktionelle Kopplung der RGCs
Die RGCs lassen sich weder durch Inkubation mit LPS alleine noch durch
Ko-Kultivierung mit Mikroglia und zusätzlicher LPS-Aktivierung in ihrem
Kopplungsverhalten bzw. der Expression von Cx43 beeinflussen. Dieses
Verhalten unterscheidet sich stark von dem primärer Astrozytenkulturen. In
zahlreichen Experimenten konnte an diesen gezeigt werden, dass die
Inkubation mit LPS oder Zytokinen wie IL-1β eine deutliche Verminderung
der funktionellen Kopplung bewirkt (Hinkerohe et al., 2002; Smikalla et al.,
2002). Das gleiche Verhalten der primären Astrozytenkulturen zeigte sich bei
einem pathologisch erhöhten Mikroglia-Anteil (Faustmann et al., 2003). Die
physiologische Reaktion von Astrozyten auf entzündliche Einflüsse scheint
also in einer Verminderung ihrer Kopplung, sprich, der Downregulation von
Cx43 zu liegen. Warum zeigen also die RGCs diese Reaktion nicht?
Schon in bereits veröffentlichten Arbeiten, bei denen diese Zelllinie eingesetzt
wurde, wird sie als sehr stark gekoppelt beschrieben (Suter et al., 1987).
Besonders interessant ist in dieser Hinsicht die Arbeit von Hofer et al., 1996.
Die Zelllinie wurde hier zur Untersuchung des Wirkmechanismus des
C-erbB2/neu-Onkogens eingesetzt. Mittels eines retroviralen Vektors wurde
das Onkogen in das Genom der Zelllinie eingebracht. Wie auch in der
vorliegenden Arbeit wurde die interzelluläre Kopplung mittels LuziferYellow-Injektion gemessen. Es zeigte sich eine signifikante Verminderung
der Kopplungsfähigkeit bei den mit dem neu-Onkogen-infizierten Zellen. In
der Immunfluoreszenz fand man bei den neu+-Zellen eine schwache, diffuse
57
Cx43-Aktivität im Zytoplasma, während die neu--Kontrollzellen die für die
Zelllinie typische starke Cx43-Expression an der Zellmembran aufwiesen.
Die Arbeit zeigt also, dass durch Veränderungen im Genom der Zelllinie ihre
starke Kopplungsfähigkeit durchaus unterdrückt werden kann. Dagegen
scheint die Zelllinie gegenüber entzündlichen Einflüssen von außen resistent
zu sein.
Diese Beobachtungen weisen auf einen genetischen Defekt in der
Signalkaskade der Entzündungsmediatoren hin. Die Zytokine wirken an
normalen Astrozyten über die Aktivierung eines Rezeptors, der dann
intrazellulär eine Phosphorilierungskaskade in Gang setzt, durch die dann
schließlich Cx43 phosphoriliert und dadurch herunterreguliert wird.
Bei den RGCs könnten nun beispielsweise zytokinspezifische Rezeptoren wie
der TNF-α-Rezeptor fehlerhaft oder gar nicht angelegt sein. In
Untersuchungen an malignen Gliomzellen wurde bereits festgestellt, dass
diese oftmals Veränderungen des TNF-α-Rezeptors aufweisen. So löste
beispielsweise die Exposition von RG-2-Gliomzellen mit rekombinantem
TNF-α (rHuTNF-α) nicht die inflammatorischen und zytotoxischen Effekte
aus, wie sie bei gesunden Gehirnzellen auftreten. In Rezeptor-BindungsUntersuchungen fand man heraus, dass die Gliomzellen keine spezifischen
Rezeptoren für rHuTNF-α exprimierten (Kiwit et al., 1991). In einer weiteren
Arbeit an verschiedenen Zelllinien von humanen malignen Gliomen konnte
gezeigt werden, dass bei einigen der Fas/APO-1-Rezeptor ein
Apoptoserezeptor der TNF-α−Familie, nicht exprimiert wurde. Sämtliche der
untersuchten Zelllinien waren gegenüber TNF-α-induzierter Zytotoxizität
unempfindlich; bei den Fas/APO-1-positiven Zellen konnte jedoch durch
gleichzeitige Behandlung mit RNA- und Proteinsynthesehemmern ein
Ansprechen auf TNF-α erreicht werden (Weller et al., 1994).
Als mögliche Gründe für das Nichtansprechen der RGCs auf Zytokine
kommen auch Störungen der durch den Rezeptor aktivierten intrazellulären
58
Signalkaskade in Betracht. So könnte beispielsweise durch einen
Enzymdefekt die Phosphorilierung von Cx43 unterbrochen werden.
Aufgrund der gewonnenen Ergebnisse ist also anzunehmen, dass die extreme
Kopplungsstärke der RGCs in einer Mutation ihres Genoms begründet ist.
Diese Annahme wird bekräftigt durch die Tatsache, dass es sich bei den
RGCs um eine aus Tumorzellen gewonnene Zelllinie handelt. Die
gemeinsame Eigenschaft von Tumorzellen liegt in einer durch Mutation
bedingten Veränderung ihres Wachstumsverhaltens. Es ist anzunehmen, dass
bei der hier verwendeten Zelllinie zudem noch weitere Genomveränderungen
im Bereich der Signalkaskade von Zytokinen stattgefunden haben, wie sie
bereits in den oben erwähnten Arbeiten an Gliomzelllinien beobachtet
wurden.
Die gewonnenen Ergebnisse zum Kopplungsverhalten der RGCs weisen
insgesamt darauf hin, dass sich die RGCs in ihrer Reaktion auf entzündliche
Einflüsse stark von primären Astrozytenkulturen unterscheiden und daher in
diesem Bezug als Modell für eine Astrozytenkultur nicht gut geeignet sind.
Daher empfiehlt es sich in weiteren Studien zur Untersuchung entzündlicher
Einflüsse auf die funktionelle Kopplung von Astrozyten besser primäre
Astrozytenkulturen als Versuchszellen einzusetzen. Mit ihren veränderten
Wachstumseigenschaften eignen sich die RGCs jedoch weiterhin als
interessantes Modell für tumorpathologische Untersuchungen und könnten in
diesem Forschungsbereich vielfältige Verwendung finden.
Beeinflussung des Membranruhepotentials
Das wichtigste Ergebnis dieser Arbeit ist die Entdeckung, dass aktivierte
Mikroglia in der Lage sind, eine hochsignifikante Depolarisation der RGCs
herbeizuführen. Dies ist vor allem im Hinblick darauf bemerkenswert, dass
59
die Zugabe von LPS alleine oder einzelnen Zytokinen wie TNF-α
(vorliegendes Ergebnis der Arbeitsgruppe) kaum einen Effekt auf das
Ruhemembranpotentialzeigen. Daher stellt sich nun die Frage nach möglichen
Wirkmechanismen, über die diese Depolarisation ausgelöst werden könnte.
Aktivierte Mikroglia produziert ein breites Spektrum an entzündungsfördernden und potentiell zytotoxischen Substanzen. Dazu gehören Zytokine
(u.a. IL-1β, TNF-α, IL6, IL12), Arachidonsäuremetaboliten (z.B. Leukotrien
B4), Prostanoide, proteolytische Enzyme, reaktive Sauerstoffmetabolite und
reaktive Stickstoffmetabolite wie z.B. Stickstoffmonoxid (NO) (Banati et al.,
1993; Lee et al., 1993; Slepko und Levi, 1996). Man kann annehmen, dass im
vorliegenden Experiment eine Vielzahl dieser Substanzen durch die aktivierte
Mikroglia freigesetzt wurde, so dass sich mehrere Möglichkeiten für das
tatsächliche Effektormolekül ergeben, wobei natürlich auch die Kombination
mehrerer Moleküle in Frage kommt.
Es lassen sich also mehrere Thesen für einen möglichen Wirkmechanismus
der Depolarisation aufstellen, die im Folgenden erörtert werden sollen:
1. Direkte Depolarisation durch Leukotriene B4
Die Inkubation von primären Astrozytenkulturen mit dem
Arachidonsäurederivat Leukotrien B4 (LTB4) bewirkt bei diesen eine
Depolarisation (Köller et al., 1993).
Leukotriene werden während eines Entzündungsprozesses von Makrophagen
bzw. Mikroglia und auch Astrozyten selbst freigesetzt. Erhöhte Liquorwerte
von Leukotrienen wurden bei verschiedenen Erkrankungen des ZNS, wie bei
Ischämie (Moskowitz et al., 1984; Chen et al., 1986) oder dem
tumorumgebenden vasogenen Ödem (Black et al., 1986), gefunden. Von den
unterschiedlichen Leukotrienen bewirkte nur LTB4 eine Depolarisation, nicht
aber andere, wie LTC4 oder LTD4. Durch Hinzufügen von Ca2+, welches die
Durchlässigkeit der Ca2+-Kanäle verringert, wurde die Depolarisation nicht
60
beeinflusst, so dass man annehmen kann, dass die Wirkung von LTB4 nicht
an Ca2+-Kanälen angreift. Dagegen ließ sich durch den Ka-Kanal-Blocker
Ba2+ (ohne LTB4-Zugabe) eine Depolarisation vom selben Ausmaß wie
durch LTB4 bewirken. Man kann deshalb annehmen, dass LTB4 ebenfalls
durch Blockade der Ka-Durchlässigkeit wirkt. Die depolarisierende Wirkung
von LTB4 ließ sich durch Zugabe des Protein-Synthese-Inhibitors
Cycloheximide aufheben, was darauf hinweist, dass für die Wirkung von
LTB4 eine Neusynthese von Protein erforderlich ist.
Die Autoren schlossen aus den Ergebnissen, dass LTB4 wahrscheinlich die
Synthese eines Proteins induziert, welches die Durchlässigkeit von KaKanälen reduziert und dadurch eine Depolarisation herbeiführt. Die
angenommene Wirkung von LTB4 auf die Durchgängigkeit von K+-Kanälen
scheint besonders interessant im Hinblick auf die These, dass Epilepsie im
Zusammenhang mit einer Verminderung von Kalium aufnehmenden Kanälen
(inwardly rectifying K+ channels=Kir) und dadurch gestörter K+-Pufferung
durch die Astrozyten steht (Bordey und Sontheimer 1998).
Da interessanterweise so unterschiedliche Moleküle wie LPS und LTB4 eine
Depolarisation von Astrozyten bewirkten, kam die Idee auf, dass beide
Substanzen als Aktivatoren eines höhergeordneten immunologischen
Prozesses dienen, der dann zur Depolarisation führt. Als Marker für die
immunologische Aktivierung wurde daher die Konzentration des
Entzündungsmediators IL-6 gemessen. Im Gegensatz zu LPS induzierte
LTB4 keine zusätzliche Ausschüttung von IL-6, weshalb man hier von einem
direkten Wirkmechanismus unabhängig von zusätzlichen Entzündungsmediatoren ausgehen kann (Köller et al., 1994 (a)). Durch Zugabe des
Medikaments Dexamethason, das zur Cortison-Gruppe gehört, ließ sich die
Depolarisation durch LTB4 aufheben. Dies erscheint verständlich, da
Cortisone direkt in den Arachidonsäuremetabolismus eingreifen und so die
Leukotrien-Synthese hemmen.
61
2. Indirekte Depolarisation durch Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α)
Das Zytokin TNF-α bewirkt bei Inkubation mit primären Astrozytenkulturen
eine Depolarisation. Als Wirkmechanismus wird die Aktivierung der ProteinKinase-C (PKC) angesehen. Dies wurde dadurch gezeigt, dass die Zugabe der
PKC-Antagonisten Staurosporine und H7 den Effekt aufhob, während er sich
durch die direkte PKC-Aktivierung mittels des Phorbol-Esters Phorbol 12Myristat 13 Acetat (PMA) nachstellen ließ. Bei Messungen der einzelnen
Ströme durch verschiedene Ionenkanäle zeigte sich eine deutliche
Verminderung des Stromflusses durch „inwardly rectifying“ K+-Kanäle.
Offensichtlich bewirkt die Aktivierung der PKC eine Reduktion der
Durchlässigkeit dieser Kanäle (Köller et al., 1998).
Zuvor war bereits gezeigt worden, dass die Depolarisation von Astrozyten bei
Inkubation mit Liquor von Meningitis-Patienten durch das darin enthaltene
TNF-α bewirkt wird: Astrozytenkulturen, die über 90 Min in den Liquores
von Patienten mit septischer Meningitis gebadet wurden, zeigten in allen
Fällen eine Depolarisation des Membranpotentials. Durch das Hinzufügen
eines Antikörpers gegen TNF-α konnten die Membraneigenschaften wieder
normalisiert werden, was beweist, dass in diesem Fall TNF-α der
hauptsächliche Auslöser der Depolarisation war (Köller, 1997).
Im Kontrast dazu steht, dass in eigenen Versuchen der Arbeitsgruppe die
Inkubation der RGCs mit rekombinantem TNF-α nur einen marginalen Effekt
auf das Membranpotential hatte. Bemerkenswerterweise zeigte sich dagegen
bei der intrazellulären Injektion von TNF-α eine signifikante Depolarisation
(bisher nicht veröffentlichte Ergebnisse der Arbeitsgruppe).
Somit ist das von den Mikroglia ausgeschüttete TNF-α als alleiniger, direkter
Auslöser der Depolarisation in den Messungen dieser Arbeit eher
unwahrscheinlich, da es wie rekombinantes TNF-α über den TNF-α-Rezeptor
von außen wirken müsste. Aber nicht nur Mikroglia, sondern auch die
Astrozyten selbst können nach Stimulation durch den Entzündungsmediator
62
IL-1β TNF-α produzieren (Lee et al, 1993). Es wäre also möglich, dass die
aktivierte Mikroglia über Ausschüttung von IL-1β die Astrozyten zur
Synthese von TNF-α anregt, welches in diesen dann direkt intrazellulär
wirken kann und die Depolarisation hervorruft. Dies würde allerdings
voraussetzen, dass es neben der Rezeptoraktivierung von außen einen
weiteren Wirkmechanismus von TNF-α geben muss, der direkt intrazellulär
angreift.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass TNF-α zur Auslösung der
Depolarisation zusätzliche Ko-Faktoren benötigt, die ebenfalls von den
Mikroglia freigesetzt werden, wie beispielweise weitere Zytokine, so dass es
nur in Anwesenheit von Mikroglia seine Wirkung entfalten kann.
TNF-α ist als Entzündungsmediator bei der Entstehung und Entwicklung
verschiedenster Erkrankungen beteiligt, so finden sich vor allem bei
Meningitis und Enzephalitis, aber auch bei Ischämischen Gehirnläsionen,
HIV-Enzephalopathie oder neurodegenerativen Erkrankungen wie MS
erhöhte TNF-α-Werte im Liquor der Patienten. Ebenso wie LTB4 greift TNFα in die Kalium-Durchlässigkeit der Astozyten ein und könnte so zur
Entstehung von Epilepsie beitragen.
3. Depolarisation durch synergistische Wirkung mehrerer
Entzündungsmediatoren
Bei der experimentellen Inkubation der RGCs mit einzelnen rekombinanten
Entzündungsmediatoren wie z.B. TNF-α zeigten sich wie schon erwähnt nur
sehr geringe Effekte auf das Membranpotential (Ergebnisse der
Arbeitsgruppe). Wenn man die große Anzahl der unterschiedlichen von der
Mikroglia freigesetzten Zytokine bedenkt, kann vermutet werden, dass sich
diese Effekte durch das Zusammenspiel mehrerer Zytokine addieren und so
durch synergistische Wirkung die beobachtete starke Depolarisation
herbeiführen.
63
Wie bereits oben erwähnt wäre ebenso denkbar, dass für die volle
depolarisierende Wirkung eines Zytokins, wie z.B. TNF-α, andere von
Mikroglia ausgeschütteten Stoffe als Ko-Faktoren vorhanden sein müssen, so
dass ein einzelnes Zytokin nur in Anwesenheit von Mikroglia seine Wirkung
entfalten kann. Schon an der Vielfalt der freigesetzten Stoffe kann man
erkennen, dass die Entzündungsreaktion der Gliazellen ein sehr komplexer
Prozess ist, der nicht nur auf Einzelwirkungen von Entzündungsmediatoren
reduziert werden kann.
4. Zytotoxische Wirkung von NO und Zytokinen
In mehreren Arbeiten wurde gezeigt, dass von Mikroglia freigesetztes
Stickstoffmonoxid (NO) und reaktive Nitrogen-Metaboliten direkt
neurotoxisch wirken (Boje und Arora, 1992; Brosnan et al., 1994; Chao et al.,
1992). Ebenso weisen Zytokine wie TNF-α und IL-1β potentiell
neurotoxische Wirkung auf (Jeohn et al., 1998). Auch durch LPS induzierte
Neurotoxizität wird über die Freisetzung von NO und Zytokinen aus
Mikroglia vermittelt. So zeigten Gehirnregionen mit hoher Mikrogliadichte
wie die Substanzia Nigra nach LPS-Injektion eine wesentlich höhere
Sterberate von Neuronen als Regionen mit geringer Mikrogliadichte (Kim et
al., 2000). Die zytotoxische Wirkung von NO und Zytokinen in hohen Dosen
ist aber nicht neuronenselektiv. Neben weiteren Zellarten reagieren auch
Astrozyten sensibel auf die schädigenden Stoffe. Erst kürzlich konnte gezeigt
werden, dass von Makrophagen freigesetztes NO und INF-γ zytotoxisch auf
Zellen eines Glioms wirkten (Kito et al., 2003).
Es wäre also möglich, dass die aktivierte Mikroglia NO und Zytokine in so
hoher Konzentration freisetzt, dass dies nach der langen Zeitspanne von
24 Std. bereits zytotoxisch auf die RGCs wirkt. Die drohende Nekrose von
Zellen geht mit einem Verlust der Membranstabilität einher und könnte somit
64
die Absenkung des Membranruhepotentials in Richtung Depolarisation
bewirken.
Im Einklang mit dieser Theorie steht die Beobachtung, dass die M+24h LPSProben eine geringere Zelldichte und veränderte Morphologie aufwiesen als
die zum gleichen Zeitpunkt und mit gleicher Zellanzahl ausgesäten
Kontrollproben. Eine Begründung könnte darin liegen, dass die freigesetzten
zytotoxischen Substanzen die Proliferation der Kultur hemmen. Eine weitere
Möglichkeit ist, dass sie bei den Zellen Nekrose auslösen und die
abgestorbenen Zellen dann von den Mikroglia phagozytiert werden, so dass
sich Lücken im astrozytären Netzwerk bilden und die Zelldichte somit
vermindert wird. Hierfür sprechen die deutlichen morphologischen
Veränderungen mit Schrumpfung und Blasenbildung, die man nach 24 Std.
LPS-Inkubation bei den mit Mikroglia ko-kultivierten RGCs beobachten
konnte. Dieser morphologische Phänotyp könnte Ausdruck eines
Selbstschutzmechanismus und der Abwehr gegenüber den zytotoxischen
Stoffen sein. Möglicherweise bieten die Zellen durch ihre sehr kleinen
schmalen Zellkörper diesen Substanzen weniger Angriffspunkte. Auch die
granulomartige Zusammenlagerung der Astro- und Mikroglia könnte einem
Abwehrmechanismus in diesem Sinne entsprechen. Interessanterweise findet
man ähnliche Anhäufungen von Gliazellen auch bei der HIVEnzephalopathie, als typische perivaskuläre Gliaknötchen, sowie bei weiteren
viralen Infektionen des ZNS. Es scheint sich also um eine Reaktion auf starke
zellschädigende Einflüsse zu handeln.
Verständlich ist auch, dass Zellen unter zytotoxischen Bedingungen nicht
proliferieren, sondern ihre Stoffwechselenergie auf die Aufrechterhaltung der
überlebensnotwendigen Zellfunktionen verwenden. Wenn der
Zellstoffwechsel aber durch zu starke zytotoxische Schädigung schließlich
zusammenbricht, steht nicht mehr genug Energie für die ATP-verbrauchende
Na+/Ka+-Pumpe zur Verfügung, so dass diese insuffizient wird. Da das
65
negative Ruhemembranpotential von Zellen durch die Triebkraft dieser
Pumpe aufrechterhalten wird, würde ein allmähliches Versagen bald zu einer
Depolarisation des Membranpotentials und schließlich zu seinem
Zusammenbruch führen.
5. Depolarisation durch direkte Zellkontakte von Mikroglia und RGCs
Es wurde bereits gezeigt, dass die Inhibition der Gap Junctions in primären
Astrozytenkulturen durch Zugabe von Mikroglia den direkten Kontakt zu den
Mikrogliazellen erfordert ( Rouach et al., 2002). Die Autoren beobachteten
eine Verminderung der Kopplung über Gap Junctions nach zusätzlicher
Zugabe von Mikroglia über 24 Std.. Bei Unterbrechung des direkten
Kontaktes der Zellen durch Einsätze zeigte sich dieser Effekt nicht, obwohl
sich die Zellen immer noch in einem gemeinsamen Medium befanden. Dieses
weist darauf hin, dass die Inhibition der Gap Junctions nicht durch lösliche,
sich im Medium befindliche Stoffe, sondern durch membranassoziierte
Faktoren der Mikroglia ausgelöst wurde.
Im Hinblick darauf wäre es möglich, dass auch die depolarisierende Wirkung
aktivierter Mikroglia auf Astrozyten über den direkten Zellkontakt zu den
Mikrogliazellen vermittelt wird.
Wirkung von LPS
Ein weiteres interessantes Ergebnis dieser Arbeit ist die Beobachtung, dass
LPS alleine keine Depolarisation der RGCs auslöst, wohl aber in Verbindung
mit der Mikroglia. Hierbei ist noch einmal zu betonen, dass RGC-Kulturen als
Zelllinie normalerweise keine Mikroglia enthalten.
Die Wirkung von LPS auf das Membranpotential von Astrozyten ist bereits
mehrfach untersucht worden. Köller et al. zeigten 1994 (b) erstmals, dass die
66
Inkubation mit LPS in Konzentrationen von 1.0-10 µg/ml bei Astrozyten in
Primärkulturen eine Depolarisation hervorruft. Dieser Effekt war von der
extrazellulären Na+-Konzentration abhängig und ließ sich durch Zugabe des
Na+-Kanal-Blockers Amilorid aufheben. Die Autoren kamen deshalb zu dem
Schluss, dass die Depolarisation über einen Natrium-abhängigen
Transportmechanismus zustande kommt und vermuteten eine Aktivierung des
Na+/Ca2+-Transporters als zugrundeliegenden Mechanismus. Dieselben
Autoren hatten bereits den ebenfalls depolarisierenden Effekt von LTB4
entdeckt. Da sie bei zwei so unterschiedlichen Stoffen die gleiche Wirkung
gefunden hatten, kamen sie wie schon erwähnt zu der Hypothese, dass die
Depolarisation Teil einer immunologischen Aktivierung und somit Ausdruck
der Immunantwort von Astrozyten sein könnte. Um dieses festzustellen,
wurde die IL-6-Produktion durch die Astrozyten als Marker für ihre
immunologische Aktivierung bestimmt. LPS bewirkte eine deutliche IL-6Freisetzung. Nach Blockade der Depolarisation durch Amiloride zeigte sich
keine Reduktion der IL-6-Freisetzung, woraus die Autoren schlossen, dass die
IL-6-Freisetzung nicht durch die Depolarisation, sondern durch einen davon
unabhängigen Wirkmechanismus ausgelöst wurde (Köller et al., 1994 (a)).
Auch in Experimenten unserer Arbeitsgruppe wurde die Wirkung von LPS
auf Astrozyten untersucht. Es wurde ebenfalls eine deutliche Depolarisation
des Membranpotentials festgestellt. Gleichzeitig wurde mit Hilfe der
Immunfluoreszenz der Anteil an aktivierter Mikroglia bestimmt. Man fand
heraus, dass LPS eine deutliche Zunahme des aktivierten Phänotyps bewirkte
(Hinkerohe et al., 2002; Smikalla et al., 2002).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit scheinen den genannten Arbeiten zu
widersprechen, da durch alleinige LPS-Inkubation der RGCs kein Effekt auf
das Membranpotential erzielt wurde. Beim Vergleich muss man aber
beachten, dass bei den genannten Arbeiten mit primären Astrozytenkulturen
gearbeitet wurde, die im Gegensatz zu den RGCs immer auch Mikroglia
67
enthalten, welche durch LPS aktiviert werden können. Man könnte also
annehmen, dass auch hier die depolarisierende Wirkung nicht direkt durch
LPS-Wirkung auf die Astrozyten zustande kam, sondern über die Aktivierung
der in der Kultur enthaltenen Mikroglia vermittelt wurde. Die aktivierte
Mikroglia könnte dann durch die oben erörterten Mechanismen wie
beispielsweise die Freisetzung von Zytokinen, die Absenkung des
Ruhemembranpotentials herbeiführen.
Man kann vermuten, dass der Angriffspunkt des Effektorstoffes an der
astrozytären Zellmembran, wodurch letztendlich die Depolarisation ausgelöst
wird, ein Natrium-abhängiger Transporter oder Kanal ist, was die Blockade
der Depolarisation durch Amilorid erklären würde.
Die Hypothese, dass LPS als Aktivator eines immunologischen Prozesses
wirkt, wurde wie oben erwähnt bereits in der Literatur aufgestellt. Diesem
Prozess muss aber nicht notwendigerweise wie angenommen die Aktivierung
der Astrozyten selbst zugrunde liegen. Mikroglia sind als
Monozytenabkömmlinge die wesentlich potenteren Immuneffektorzellen und
damit für die Vermittlung von immunologischen Prozessen besonders
wichtig. In einer Arbeit, in der speziell die Freisetzung von Zytokinen durch
Mikroglia und Astrozyten nach LPS-Inkubation gemessen wurde, zeigte sich,
dass LPS bei den Mikroglia eine starke Zytokinfreisetzung hervorrief,
während es bei Astrozyten keine Zytokinproduktion induzierte (Lee et al.,
1993).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen stark darauf hin, dass LPS
keinen direkten Effekt auf das Membranpotential von Astrozyten hat, sondern
seine Wirkung indirekt über die Aktivierung von Mikroglia entfaltet. Wie
eben erläutert, ist dies eine schlüssige Theorie, die auch den Ergebnissen der
bisherigen Arbeiten zu diesem Thema nicht widerspricht.
68
Pathophysiologische Bedeutung der Ergebnisse
Welche Auswirkungen kann nun die beobachtete Veränderung des
Membranruhepotentials von Astrozyten auf den Organismus haben?
Wie bereits erwähnt, sind Astrozyten normalerweise für die
Aufrechterhaltung eines für die Neuronen optimalen extrazellulären Milieus
zuständig und garantieren so die Funktionsfähigkeit der neuronalen
Informationsübertragung. Zu den wichtigsten Funktionen gehören die
Pufferung des bei neuronaler Aktivität ansteigenden extrazellulären Kaliums
u.a. durch „inwardly rectifying“-K+-Kanäle (Kir) und die Regulation des pHWertes. Weitere direkt für die neuronale Funktion besonders wichtige
Aufgaben sind die Aufnahme von Neurotransmittern, insbesondere von
Glutamat, und die Bereitstellung von Stoffwechselsubstraten für die
Neuronen.
Die Depolarisation von Astrozyten und die damit einhergehenden
Veränderungen des transmembranösen elektrochemischen Gradienten stört
viele dieser Funktionen, was schwerwiegende Folgen haben kann. So führte
z.B. die selektive Vergiftung von Gliazellen zu einer Entgleisung des
extrazellulären Milieus mit starkem Anstieg der K+- Gutamat- und GABAKonzentrationen sowie des pH-Wertes. Hierdurch wurden schließlich
sogenannte „Spreading depression (SD) waves“ ausgelöst. Diese lassen sich
als Wellen neuronaler Unterdrückung beschreiben, die sich von ihrem
Entstehungsort, hier dem Neokortex, in andere Regionen des Gehirns
ausbreiten. Zusätzlich war die Empfindlichkeit der Neuronen gegenüber den
SD waves stark erhöht so dass 8 Std. nach Vergiftung der Gliazellen ein
massives Absterben von Neuronen sichtbar wurde. (Largo et al., 1996).
Insbesondere die Entstehung und Triggerung von Epilepsie scheint im
direkten Zusammenhang mit gestörter Astrozytenfunktion zu stehen
(Übersicht: Bordey und Sontheimer):
69
Durch ein depolarisiertes Membranpotential wird die Aufnahme von
extrazellulär ansteigendem Kalium durch Kir-Kanale gestört, da der
elektrochemische Gradient verringert ist. Für TNF-α und LTB4 wird, wie
oben erwähnt, sogar ein direktes Angreifen an Kalium-Kanälen und somit die
Verminderung ihrer Ionendurchlässigkeit vermutet.
In mehreren Arbeiten wurde bereits gezeigt, welche Folgen eine gestörte
Ka+-Pufferung auf die neuronale Erregbarkeit haben kann: Besonders
bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang ein Experiment von Janigro et
al. (1997). Die Autoren blockierten an Hippocampalen Slices selektiv die KirKanäle der Astrozyten durch extrazelluläre Applikation von Caesium.
Experimentelle orthodrome Aktivierung löste bei den zuvor in Caesium
gebadeten Slices spontane epileptische Aktivität aus. Weiterhin verhinderte
Caesium das Aufrechterhalten der Langzeit-Unterdrückung von Neuronen
(„Long-Term Depression“). Bei Messung der extrazellulären Ka+Konzentration stellte man fest, dass diese stark erhöht war. Die Autoren
kamen daher zu dem Schluss, dass eine defekte Funktion des Kir-Kanals an
Astrozyten über eine erhöhte extrazelluläre Ka+-Konzentration Epilepsie
auslösen kann. Diese These wurde durch eine weitere Arbeit gestützt, in der
histologische Proben von Epilepsiepatienten untersucht wurden. In
Gewebeproben aus epileptischen Foci fand man an den Astrozyten gehäuft
ein Fehlen des „inwardly rectifying"-Kalium-Kanals sowie ein depolarisiertes
Membranpotential (Bordey und Sontheimer, 1998).
Es wird angenommen, dass die durch gestörte Kaliumaufnahme der
Gliazellen erhöhte extrazelluläre Kaliumkonzentration die Neuronen
depolarisiert und damit näher an die Schwelle zur Aktionspotentialauslösung
bringt (Balestrino et al., 1986). Bei jeder neuronalen Aktivität wird Ka+ von
den Neuronen in den extrazellulären Raum freigesetzt. Die Astrozyten
verhindern normalerweise durch Abpufferung des Ka+, dass dieses sich zu
hohen Konzentrationen anstaut. Wenn dieser Mechanismus nun aber gestört
70
ist, steigt die Ka+-Konzentration bei starker neuronaler Aktivität auf ein zu
hohes Level an. Hierdurch wird die neuronale Erregbarkeit erhöht, was
wiederum zu verstärkter Neuronenaktivität und somit weiterer Ka+Freisetzung führt. Es entsteht also ein sich selbst verstärkender Prozess, der
schließlich in unkontrollierten neuronalen Entladungen in Form von Epilepsie
mündet.
Ein weiterer wesentlicher Mechanismus, der durch ein depolarisiertes
Membranpotential gestört wird, ist die Aufnahme von Glutamat. Glutamat ist
der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter des ZNS und wird bei
neuronaler Aktivität aus den Synapsen freigesetzt. Da die postsynaptischen
Glutamatrezeptoren hochsensibel auf kleinste Änderungen der
Glutamatkonzentration im synaptischen Spalt reagieren, können schon leicht
erhöhte extrazelluläre Glutamatlevel schnell zur Neurotoxizität führen. Daher
ist die Wiederaufnahme von Glutamat in Neuronen und Astrozyten über einen
Na+-abhängigen Glutamat-Transporter bei verstärkter neuronaler Aktivität
von großer Wichtigkeit. Ein Fehlen dieses Transporters in Knockout-Studien
führte zu Exzitotoxizität und löste epileptische Anfälle aus (Rothstein et al.,
1996; Tanaka et al., 1997). Zusätzlich bewirkt erhöhtes Glutamat das
Anschwellen der Astrozyten, was die weitere Freisetzung von Glutamat
induziert und selbst als möglicherweise epilepsieauslösende Bedingung
angesehen wird.
Da die Aktivität des Glutamat-Transporters von dem transmembranösen
Spannungsgradienten abhängt, wird diese durch ein depolarisiertes
Membranpotential stark beeinträchtigt. Des weiteren ist bekannt, dass eine
Reihe der von Mikroglia freigesetzten Stoffe, u.a. Arachidonsäure, NO und
Zytokine, auch direkt als Inhibitoren des Glutamat-Transporters wirken.
Zusammenfassend kann also festgestellt werden, dass die Depolarisation von
Astrozyten auf mehrere Weisen epileptogen wirkt und daher als möglicher
Auslöser oder zusätzlicher Trigger bei der Entstehung von epileptischen
71
Anfällen, insbesondere bei Krankheitsbildern, die mit der Aktivierung von
Mikroglia einhergehen, angesehen werden muss. Ein Beispiel wäre die
Meningitis bei der es neben starken Kopfschmerzen und Bewusstseinseintrübung auch zu epileptischen Anfällen kommen kann. Vor allem bei
bakteriellen Meningitiden sind die LPS- und Zytokinkonzentrationen erhöht
und korrelieren mit dem Schweregrad der neurologischen Symptome
(Mustafa et al., 1989, 1, 2; Mertsola et al., 1991; Stearman und Southgate,
1994). Insbesondere die Wahrscheinlichkeit, epileptische Anfälle zu
entwickeln, stieg mit der Höhe des LPS- und Zytokintiters. So führte eine
LPS-Konzentration von über 1 µl im Liquor, also derselben Menge, wie sie
im vorliegenden Experiment eingesetzt wurde, zu einer signifikanten
Erhöhung des Anfallsrisikos (Arditi et al., 1990). Der zugrundeliegende
pathophysiologische Mechanismus könnte dem in dieser Arbeit eingesetzten
In Vitro-Modell sehr ähnlich sein, mit Aktivierung der Mikroglia durch das in
der Zellmembran gramnegativer Bakterien enthaltene LPS, Depolarisation der
Astrozyten und dadurch schließlich gestörter Neuronenfunktion und
Auslösung eines epileptischen Anfalls.
Die Beeinträchtigung der neuronalen Aktivität durch gestörte
Astrozytenfunktion muss jedoch noch nicht zwangsläufig zu epileptischen
Anfällen führen. Ein Ungleichgewicht des extrazellulären Milieus könnte sich
auf vielfältige Art und Weise störend auf die neuronale
Informationsübertragung auswirken und so z.B. zu Symptomen wie
psychomotorischer Verlangsamung und Bewusstseinseintrübung führen.
Diese Symptome treten unspezifisch bei vielen entzündlichen Erkrankungen
des ZNS auf und haben die Eigenschaft, sich unter antiinflammatorischer oder
antimikrobieller Therapie schnell und ohne bleibende Schäden wieder
zurückzubilden. Sie gehen normalerweise nicht mit im MRT erkennbaren
Gewebe-Läsionen einher, wohl aber korrelieren sie mit den Konzentrationen
72
an inflammatorischen Zytokinen im Liquor. Aus diesen Beobachtungen
resultierte die Theorie, dass bei Entzündung freigesetzte Mediatorenstoffe für
die neurologischen Störungen verantwortlich sind (Übersichtsarbeit: Köller et
al., 1997).
In diesem Zusammenhang ist eine ganze Reihe von Erkrankungen zu nennen,
die alle mit einer Aktivierung von Mikroglia und damit der Freisetzung
proinflammatorischer Substanzen einhergehen. So zeigten beispielsweise
Multiple-Sklerose-Patienten mit isolierter Rinden-Läsion oder N.opticusNeuritis reduzierte Leistungen in psychometrischen Tests, was darauf
hinweist, dass diese Störung höherer Hirnleistungen nicht direkt durch die
Krankheitsherde, sondern eher durch lösliche Stoffe, wie Zytokine bewirkt
wird (Callanan et al., 1989). Weiterhin wurde gezeigt, dass der Schweregrad
der klinischen Symptome von Patienten mit Multiple-Sklerose mit der
Konzentration von TNF-α, IFN-γ und IL-6 im Liquor korreliert
(Moreau et al., 1996). Die intraokkuläre Injektion von TNF-α bewirkte ein
reversibles Ansteigen an visuell evozierten Potentialen über 24h (Brosnan et
al., 1989), was auf einen funktionellen, nicht aber demyelinisierenden Effekt
auf den N. opticus hinweist, der möglicherweise durch eine Depolarisation
von Astrozyten durch TNF-α bedingt sein könnte.
Auch in der Pathogenese der HIV-assoziierten Enzephalopathie scheinen
Mikroglia eine wichtige Rolle zu spielen. So zeigte sich in NeuronenKulturen, die mit dem feline immundeficiency virus, einem Modell für HIV,
infiziert worden waren eine dramatische Proliferation der Mikroglia (Meeker
et al.,1999). Die HIV-Enzephalopathie zeichnet sich durch frühe
neurologische Symptomatik mit Demenzentwicklung aus, die auch schon bei
relativ geringer Anzahl von infizierten Gehirnzellen auftritt (Glass et al.,
1993). Dies weist darauf hin, dass nicht nur der Funktionsausfall der wenigen
infizierten Zellen, sondern vielmehr die von infizierten Zellen freigesetzten
Zytokine für die Symptomatik verantwortlich sind. Mikroglia werden als
73
direkte Zielzellen von dem HI-Virus infiziert, was diese zur Produktion von
Zytokinen anregt und so eine Entzündungskaskade in Gang setzt, die in ihrer
Wirkung sämtliche, auch die nicht infizierten Zellen mit einbezieht und so zur
Beeinträchtigung der neuronalen Funktion führt. Obwohl die HIVirusproteine auch direkt mit Neuronen interferieren können, scheint die
Entzündungsreaktion mit den stark erhöhten Zytokinkonzentrationen und der
damit einhergehenden Störung der Astrozytenfunktion im Wesentlichen für
die frühe Symptomatik der HIV-Enzephalopathie verantwortlich zu sein
(Genis et al., 1992).
Angesichts der hier gezeigten großen Bedeutung der gestörten
Astrozytenfunktion in verschiedenen Erkrankungen des ZNS kommt natürlich
auch die Frage nach möglichen therapeutischen Interventionen auf. Da in
dieser Arbeit gezeigt wurde, dass die Aktivierung von Mikroglia als starker
Störfaktor auf die elektrophysiologischen Eigenschaften der Astrozyten wirkt,
ergibt sich hier ein wichtiger Angriffspunkt.
Beispielsweise wurde gezeigt, dass das Opioid-Derivat Naloxone die LPSinduzierte Aktivierung von Mikroglia verhindert, indem es die Bindungsstelle
von LPS an der Zellmembran blockiert. Der Einsatz von Naloxone in einer
mit LPS inkubierten gemischten Neuronen-Glia-Kultur führte zu einer
signifikant geringeren Freisetzung von Zytokinen, NO und Superoxiden durch
Mikroglia und zu einer geringeren Sterblichkeit dopaminerger Neurone, die
normalerweise durch den hohen Mikrogliaanteil der Substanzia Nigra
besonders empfindlich auf LPS reagieren (Liu et al., 2000; Kim et al., 2000).
Da Naloxone sich durch geringe Toxizität und wenige unerwünschte
Wirkungen auszeichnet, könnte es sich als vielversprechender Therapieansatz
erweisen. So könnte es z.B. in der Akuttherapie der bakteriellen Meningitis
durch schnellen Wirkungseintritt die akute Symptomatik verbessern und
epileptische Anfälle verhindern, noch bevor die antibiotische Therapie ihre
74
Wirkung erzielen kann. Allerdings kann Naloxone nur die
Mikrogliaktivierung speziell durch LPS unterbinden, nicht aber die
Aktivierung durch andere Einflüsse, wie es z.B. bei HIV-Enzephalitis oder
MS der Fall ist.
Ebenfalls über die Hemmung der Mikroglia-Aktivierung neuroprotektiv wirkt
Vitamin E. Li et al. zeigten 2001, dass durch vorherige Inkubation mit
Vitamin E die LPS-induzierte Aktivierung der Mikroglia und die konsekutive
Ausschüttung von Entzündungsmediatoren gehemmt werden konnten. Dieses
führte in der untersuchten Mikroglia-Neuronen-Ko-Kultur zu einer
signifikanten Verminderung des entzündungsbedingten Absterben von
Neuronen. Die Autoren kamen zu der Annahme, dass Vit. E in die
Signalkaskade der Mikroglia-Aktivierung eingreift und sie somit behindert.
Möglicherweise könnte dieser Angriffspunkt in der Signalkaskade auch
unabhängig vom Aktivierungsreiz, in diesem Fall LPS, sein. Hierdurch
würden sich die therapeutischen Einsatzmöglichkeiten von Vit. E im
Gegensatz zu Naloxone auf eine große Anzahl von Erkrankungen wie MS,
Alzheimer, Virus-Enzephalitiden, Tumoren oder Infarkte erweitern, bei denen
die Mikroglia-Aktivierung durch andere Faktoren als LPS ausgelöst wird.
Bereits im klinischen Einsatz bewährt haben sich rekombinante Antikörper
gegen TNF-α, die z.B. in der Therapie der Autoimmunerkrankungen Morbus
Crohn und Rheumatoide Arthritis mit Erfolg eingesetzt werden. Leider zeigte
sich der TNF-α-Antikörper bis jetzt für die Behandlung entzündlicher
Erkrankungen des ZNS wegen zu starker neurologischer Nebenwirkungen
nicht geeignet. Dennoch ergibt sich hier ein interessanter Angriffspunkt; auch
die Entwicklung von Antikörpern gegen weitere Zytokine könnte
vielversprechend sein.
75
Ausblick
Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse bieten viele Ansätze für weitere
Forschungsarbeiten. So wäre es beispielsweise interessant, die Auswirkungen
der aktivierten Mikroglia auf die extrazelluläre Ka+-Konzentration zu
messen, um festzustellen, wie stark die Pufferleistung der Astrozyten wirklich
beeinträchtigt wird.
Analog zu dem bereits genannten Experiment von Janigro et al. (1997) könnte
untersucht werden, ob auch durch Zugabe von aktivierter Mikroglia
epileptische Aktivität ausgelöst werden kann. Hierfür könnte man allerdings
nicht die RGCs oder primäre Astrozytenkulturen einsetzen, sondern müsste
wie die Autoren mit Slices arbeiten, die auch noch die Neuronen enthalten.
Besonders viele Ansatzpunkte für weitere Forschungsarbeiten bietet die Frage
nach dem tatsächlichen Effektorstoff, der von den Mikroglia freigesetzt wird
und dann zur Depolarisation führt. In dieser Arbeit wurden verschiedene
Theorien dafür aufgestellt, denen man in weiteren Untersuchungen
detaillierter nachgehen könnte. Auch der Wirkmechanismus des
Effektorstoffes an der Zellmembran, wodurch letztendlich die Depolarisation
ausgelöst wird, ist noch nicht sicher geklärt. Um diesen weiter zu erforschen,
müssten die in Frage kommenden Kanäle und Transporter systematisch
getestet werden. Dazu könnte man die RGCs zusätzlich mit verschiedenen
Substanzen wie z.B. Kanalblockern inkubieren und beobachten, ob hierdurch
eine Veränderung der Depolarisation bewirkt wird. Dieses würde dann auf
einen durch die bestimmte Substanz beeinflussten Wirkmechanismus
hinweisen.
So wäre es z.B. sehr interessant zu untersuchen, ob die Depolarisation Na+oder Ka+- abhängig ist und sich durch Konzentrationsänderungen dieser
Ionen oder die Zugabe des Na-Kanal-Blockers Amilorid beeinflussen lässt.
Durch die zusätzliche Inkubation mit einem PCK-Antagonisten könnte man
feststellen, ob auch hier der Wirkmechanismus über eine Aktivierung der
76
Protein-Kinase C abläuft, wie es für die Wirkung von TNF-α bewiesen
wurde. Mittels des Protein-Synthese-Inhibitors Cycloheximide ließe sich
herausfinden, ob die De-Novo-Synthese von Protein für die Auslösung der
Depolarisation erforderlich ist.
Auch könnte man versuchen, die Depolarisation durch den Einsatz von
Medikamenten zu blockieren. Beispielsweise könnte getestet werden, ob
Glukokortikoide wie z.B. Dexamethason den Effekt abschwächen können. Da
aber Glukokortikoide auf mehrere verschiedene Arten hemmend auf das
Immunsystem wirken, kann hierdurch nicht auf den Wirkmechanismus
rückgeschlossen werden. Das oben erwähnte Naloxone sollte
erwartungsgemäß durch Blockade des LPS-Rezeptors an Mikroglia hemmend
auf die LPS-induzierte Mikroglia-Aktivierung wirken und so die
Depolarisation abschwächen.
Eine weitere Möglichkeit wäre zu testen, ob der Effekt auch eintritt, wenn
sich die Mikroglia nicht im direkten Kontakt mit den RGCs befinden, sondern
von diesen z.B. durch einen Filter getrennt sind, wie es in der Arbeit von
Rouch et al. (2002) untersucht wurde. Hierbei könnte festgestellt werden, ob
membran-assoziierte Faktoren der Mikroglia für die Depolarisation
notwendig sind oder nur lösliche Substanzen, die ins Medium abgegeben
werden, zum Effekt führen. Die alleinige Inkubation der RGCs mit Mikrogliakonditionierten Medium reicht zur Untersuchung dieses Sachverhaltes nicht
aus, da man nicht wissen kann, ob die im Medium gelösten Substanzen nicht
schon nach kurzer Zeit von den RGCs abgebaut werden oder aber auf andere
Weise ihre Wirksamkeit verlieren. Man müsste bei diesem Versuch also
sicherstellen, dass das Medium fortlaufend über 24 Std. frisch von den
Mikroglia konditioniert wird.
Im Hinblick auf die festgestellten veränderten Kopplungseigenschaften der
RGCs könnte man im Bereich der Tumorforschung untersuchen, ob die RGCs
durch andere Stoffe, wie z.B. Zytostatika, entkoppelt werden können und in
77
welchem Maß die funktionelle Kopplung mit dem Wachstumsverhalten der
Glia-Zelllinie zusammenhängt.
Zusammenfassung
Diese Arbeit hat gezeigt, dass LPS als potenter Stimulus die Umwandlung
von Mikroglia in den aktivierten Typ induziert und diese daraufhin über einen
noch nicht vollständig geklärten Wirkmechanismus eine Depolarisation des
Ruhemembranpotentials von Astrozyten bewirkt.
Die Bedeutung der Mikroglia in der Pathophysiologie des ZNS wurde durch
diese Ergebnisse nachdrücklich unterstrichen. Es konnten wichtige
Anhaltspunkte dafür gefunden werden, dass aktivierte Mikroglia in
entzündlichen Erkrankungen des ZNS, insbesondere der bakteriellen
Meningitis, durch Störung der elektrophysiologischen Eigenschaften von
Astrozyten eine wesentliche pathogenetische Rolle spielen.
Des weiteren ergaben sich aus den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen
neue Hinweise zum Wirkmechanismus von LPS. Die gewonnenen Ergebnisse
lassen vermuten, dass LPS nicht direkt eine Depolarisation des
Membranpotentials von Astrozyten bewirkt, sondern indirekt über die
Aktivierung von Mikroglia seine Wirkung entfaltet. Aus dieser These ergeben
sich neue Erklärungsmodelle insbesondere zur Pathophysiologie der
bakteriellen Meningitis. Den Mikroglia, als unerlässliche Vermittler der durch
LPS ausgelösten Entzündungswirkung kommt hierbei eine noch größere
Bedeutung als bisher angenommen zu.
Die gewonnenen Erkenntnisse tragen zum besseren Verständnis von
entzündlichen Erkrankungen des ZNS bei und könnten somit für die
Entwicklung neuer Therapieoptionen von Nutzen sein.
78
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astrocytic gap junctions in rat brain as suggested by LM and EM immunohistochemistry of
connexin43 expression. J Comp Neurol, 302(4), 853-883.
Young, G. B., Bolton, C. F., Archibald, Y. M., Austin, T. W., & Wells, G. A. (1992). The
electroencephalogram in sepsis-associated encephalopathy. J Clin Neurophysiol, 9(1), 145152.
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Danksagung
Ich danke Pedro M. Faustmann für die hervorragende Anleitung und
hilfreichen Kommentare zu dieser Arbeit. Vielen Dank an Katharina Heupel,
Daniel Hinkerohe, Dirk Smikalla und Dominika Szlachta für die nette
Anleitung und Hilfe. Weiterhin danke ich Sabine Schreiber-Minjoli, Bernhard
Vornefeld, Petra Parakenings, Monika Birkelbach und Markus Wüthrich für
die technische Hilfe und Beratung. Dank auch an die Medizinische Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum (Kommission für Finanzautonomie,
Ergänzungs- u. Reservemittel, KOFFER) für die finanzielle Unterstützung zur
Einrichtung eines neuen Arbeitsplatzes.
Herzlichen Dank an Lothar Möller für die Durchsicht des Textes und ganz
besonders an Jörg Lücke für seine Hilfe und Unterstützung während des
gesamten Entstehungsprozesses dieser Arbeit.
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Lebenslauf
Persönliche Daten:
Möller, Anna Caroline
Wihelmstr. 66
44137 Dortmund
Telefon: 0231/1656246
Geboren am 11.04.1979 in Köln
Familienstand: ledig
Staatsangehörigkeit: deutsch
Schulausbildung:
1985-1989: Grundschule, Halle (Westf.)
1989-1998: Kreisgymnasium Halle (Westf.),
Abschluss: Abitur (Note: 1,9)
Studium:
Seit April 1999: Studium der Humanmedizin an der
Westfälischen Wilhelms-Universität Münster
Frühjahr 2001: Ärztliche Vorprüfung (Note: 2,0)
Frühjahr 2002: Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
(Note: 2,0)
Juli 2002: Beginn der Doktorarbeit bei PD Dr. Pedro
Faustmann, Universität Bochum
Frühjahr 2004: Zweiter Abschnitt der Ärztlichen
Prüfung (Note: 1,66)
April 2004 - März 2005: Praktisches Jahr im Klinikum
Dortmund (Akademisches Lehrkrankenhaus der
Universität Münster)
Freiwilliges
Soziales Jahr:
August 1998 - März 1999 im Johannes-Hospital,
Bielefeld
Fremdsprachenkenntnisse:
Englisch fließend in Wort und Schrift,
gute Kenntnisse in Französisch
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