VEGF und Flt-1 als Prognosefaktoren bei neoadjuvant behandelten
Werbung
Aus dem Institut für Pathologie an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil – Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. K.-M. Müller VEGF und Flt-1 als Prognosefaktoren bei neoadjuvant behandelten, lokal fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen Lungentumoren Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Barbara Manemann aus Münster 2003 1 Abstract Manemann Barbara VEGF und Flt-1 als Prognosefaktoren bei neoadjuvant behandelten, lokal fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen Lungentumoren Problem: Die Bedeutung des Angiogeneseparameters VEGF und seines Rezeptors Flt-1 wurde im Hinblick auf therapeutische und prognostische Relevanz an einem Kollektiv von lokoregionär fortgeschrittenen Tumoren der Stadien IIIA und IIIB untersucht. Es wird geprüft, ob diese Faktoren bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren als zusätzlicher prognostischer Indikator geeignet sein könnten. Methode: Prä- und posttherapeutisch gewonnenes Gewebe von 32 nach einem neoadjuvanten multimodalen Therapieansatz behandelten Patienten wurden untersucht. Bei den mittels immunhistochemischer Markierung nach der APAAP-Methode untersuchten Tumoren handelte es sich um 22 Plattenepithelkarzinome, 9 Adenokarzinome und einen Mischtumor. Die Expression von VEGF und Flt-1 wurde jeweils mittels eines polyklonalen, die VEGF-Expression zusätzlich mit einem monoklonalen Antikörper untersucht. Ergebnisse: Monoklonaler VEGF-Antikörper: Beim Vergleich der VEGF-negativen und positiven Tumoren ließ sich hinsichtlich der klinischen Parameter Geschlecht, Histologie, Tumorstadium und T- und N-Stadium kein signifikanter Unterschied feststellen. Tendenziell zeigte sich nach der Therapie eine Zunahme der VEGF-negativen Tumoren. Patienten mit VEGF-negativen Tumoren waren signifikant häufiger bei der für das Überleben günstigeren Gruppe mit den Regressionsgraden IIb und III einzuordnen und hatten eine signifikant längere Überlebenszeit (log-rank-Test, p=0,019). Bei dem polyklonalen VEGF-Antikörper war aufgrund seiner geringen Spezifität keine detaillierte Auswertung bezüglich der prognostischen Relevanz möglich. Bei der Auswertung der Flt-1-Expression ließ sich keine signifikante Aussage hinsichtlich Überlebenszeit, klinischer Verlaufsparameter und histomorphologischer Tumorregressionsphänomene machen. Diskussion: Im untersuchten Kollektiv konnte die immunhistochemisch ermittelte VEGFExpression als möglicher Prognosefaktor für bessere Überlebenszeiten der Patienten ermittelt werden. Die Bedeutung von Flt-1 als Prognosefaktor bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren war nicht abschließend zu beurteilen. Ausblick: Die Eignung von VEGF und Flt-1 als Prognosefaktoren bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren ist bisher nicht abschließend geklärt. Da in der Literatur auch in ihren Ergebnissen divergierenden Untersuchungen vorliegen, sollten hinsichtlich dieser Fragestellung weitere Studien durchgeführt werden. 2 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: PD Dr. med. K. Junker Korreferent: Prof. Dr. Dr. med. K.-U. Tiedjen Tag der mündlichen Prüfung: 09.12.2003 3 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 4 1.1 Einteilung bösartiger Lungentumoren 5 1.2 Therapie bösartiger Lungentumoren 7 1.2.1 Operative Therapie 7 1.2.2 Strahlentherapie bei bösartigen Lungentumoren 8 1.2.3 Chemotherapie bei bösartigen Lungentumoren 10 1.2.4 Kombinierte Radio- und Polychemotherapien 11 1.3 Angiogenese 1.3.1 VEGF 12 14 2. Fragestellung 19 3. Untersuchungsgut und Methoden 21 3.1. Untersuchungsgut 21 3.1.1 Studienpopulation 21 3.1.2 Ein- und Ausschlußkriterien zur Aufnahme in die Studie 21 3.1.3 Durchgeführte Untersuchungen 22 3.1.4 Therapieprotokoll 22 3.1.5 Remissionsverhalten und Operationsrate 23 3.1.6 Toxizität der Therapie 24 3.1.7 Prognose 24 3.2. Methoden 25 3.2.1 Histomorphologische Untersuchungen 25 3.2.2 Immunhistochemische Untersuchungen 27 3.3. Statistische Verfahren 4. Ergebnisse 31 32 4.1 Ergebnisse der immunhistochemischen Markierung mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper 32 4.1.1 Ergebnisse an prätherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut 35 4.1.2 Ergebnisse an posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut 38 4.2. Ergebnisse der immunhistochemischen Markierung mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper 43 4.2.1 Ergebnisse an prätherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut 46 4.2.2 Ergebnisse an posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut 49 1 4.3 Ergebnisse der immunhistochemischen Markierung mit dem polyklonalen Flt-1-Antikörper 5. 52 4.3.1 Ergebnisse an prätherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut 54 4.3.2. Ergebnisse an posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut 57 Diskussion 60 5.1 Mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper erzielte Resultate 61 5.1.1 Methodik 62 5.1.2 Korrelation mit klinischen Parametern 63 5.1.2.1 Vergleich der an prä- und posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut ermittelten VEGF-Expression 64 5.1.2.2 Histologischer Typ und Tumorstadium 64 5.1.2.3 Resektionsstatus 65 5.1.2.4 Klinische Tumorremission 66 5.1.2.5 Therapieinduzierte Tumorregression 66 5.1.3 Prognostische Bedeutung 68 5.1.3.1 Koexpression von VEGF und Flt-1 und ihre mögliche Eignung als Prognosefaktor 69 5.1.3.2 Fehlende VEGF-Expression als positiver Prognosefaktor 70 5.1.3.3 VEGF-mRNA-Expression als Prognosefaktor 72 5.1.3.4 Serum-VEGF als Prognosefaktor 73 5.1.3.5 VEGF-Expression ohne signifikante prognostische Aussagekraft 75 5.1.3.6 Zusammenfassung monoklonaler VEGF-Antikörper 76 5.2 Mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper erzielte Resultate 77 5.2.1 Methodik 77 5.2.2 Korrelation mit klinischen Parametern 78 5.2.3 Prognose 79 5.3 Mit dem polyklonalen Flt-1-Antikörper erzielte Resultate 80 5.3.1 Methodik 80 5.3.2 Korrelation mit klinischen Parametern 82 5.3.3 Prognose 83 6. Zusammenfassung 86 7. Literaturverzeichnis 88 8. Danksagung 104 9. Lebenslauf 105 2 Abkürzungsverzeichnis ADC Adenokarzinom APAAP Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase bFGF basic fibroblast growth factor CR complete remission (komplette Remission) CT Chemotherapie FEV forciertes exspiratorisches Volumen Flt-1 fms-like-tyrosinkinase 1 SCLC small cell lung cancer NC no change (keine Veränderung der Erkrankung) NSCLC non small cell lung cancer PEC Plattenepithelkarzinom PD progressive disease (fortschreitende Erkrankung) PR partial remission (partielle Remission) RNA ribonucleic acid RT Radiotherapie VEGF Vascular Endothelial Growth Factor WHO World Health Organisation Regressionsgrading Regressionsgrad I: Keine oder nur geringe spontane Tumorregression Regressionsgrad IIa: Unvollständige Tumorregression, mehr als 10% vitales Gewebe im Bereich des Primärtumors und/ oder großherdiger Befall der resezierten Lymphknoten Regressionsgrad IIb: Unvollständige Tumorregression, weniger als 10% vitales Gewebe im Bereich des Primärtumors und/ oder allenfalls kleinherdiger Befall der resezierten Lymphknoten Regressionsgrad III: Vollständige Tumorregression ohne Nachweis vitalen Tumorgewebes im Primärtumor und resezierten Lymphknoten Resektionsstatus R0 Resektion ohne mikroskopische oder makroskopische Tumorreste R1 Resektion mit mikroskopischen Tumorresten R2 Resektion mit makroskopischen Tumorresten 3 1. Einleitung Bösartige Tumoren der Lunge gehören weltweit zu den häufigsten Tumoren des Menschen. In den letzten Jahren ist ihre Inzidenz in der Bundesrepublik Deutschland auf 45.000 Neuerkrankungen pro Jahr und weltweit auf jährlich 1,3 Millionen gestiegen. Sie stehen jetzt für Männer und Frauen zusammengenommen an erster Stelle der zum Tode führenden Tumoren. Bei Männern sind die bösartigen Lungentumoren der häufigste tödliche Tumor; statistisch ist jeder 20. Mann betroffen. Bei Frauen stehen sie noch an dritter Stelle hinter bösartigen Brust-und Dickdarmtumoren (Laack et al. 2000). Im Gegensatz zur Inzidenz der Tumoren anderer Organe steigt diese hinsichtlich der Lunge an. Hervorzuheben ist die besonders bei Frauen und jüngeren Patienten zunehmende Inzidenz. Hier wird das veränderte Rauchverhalten von Frauen, die zahlenmäßig inzwischen fast genauso häufig rauchen wie Männer, als wesentliche Ursache angeführt (Jahn et al. 1990). Eine der anerkannten Hauptursachen für die Entstehung der bösartigen Lungentumoren ist das Rauchen. 85% der Todesfälle durch einen bösartigen Lungentumor sind auf aktives Rauchen zurückzuführen. Das Risiko steigt hierbei mit der Zahl der konsumierten Zigaretten, mit der Dauer der Exposition und dem Beginn des Tabakkonsums im jungen Lebensalter an. Als weitere Noxen sind die Exposition mit kanzerogenen Stoffen am Arbeitsplatz (z.B. Asbest, radioaktive Stäube – wie sie etwa im Uranbergbau auftreten –, Arsen, Chromstäube, Nickelstäube) und nur gering durch die sogenannte Umweltverschmutzung bekannt, wobei allerdings immer die Dosisabhängigkeit und individuelle Disposition berücksichtigt werden müssen. Eine genetische Komponente als Ursache für die Tumorrealisation wird diskutiert. Ebenso werden Faktoren wie urbane Umgebung, Einfluß natürlicher Strahlung und Vitamin-A-Mangel sowie Ernährungsgewohnheiten analysiert (Becker et al. in: Management des Lungenkarzinoms, Drings et al. 2003). Passivrauchen als pathogenetisch auch wichtiger Faktor wird noch immer kontrovers diskutiert. Es wird hierbei eine Verdopplung des Risikos, an einem bösartigen Lungentumor zu erkranken, vermutet (Häußinger et al. 1996). 4 1.1 Einteilung bösartiger Lungentumoren Nach den WHO-Klassifikationen von 1981 und 1999 dienen lichtmikroskopische und zytologische Kriterien als Basis der Diagnose bösartiger Lungentumoren. Eingeteilt werden die bösartigen Lungentumoren in kleinzellige (SCLC), die einen Anteil von ungefähr 20% ausmachen, und in die größere, ca. 80% umfassende Gruppe der nichtkleinzelligen (NSCLC) Lungentumoren, zu denen die Plattenepithelkarzinome, Adenokarzinome sowie großzellige Karzinome gehören. Berücksichtigt wird bei dieser Unterteilung, daß die nicht-kleinzelligen Lungentumoren eine langsamere Progression sowie eine längere Tumorverdopplungszeit aufweisen. Auch zeigen sie eine spätere Metastasierungstendenz und eine weniger ausgeprägte Chemosensibilität als die kleinzelligen bösartigen Lungentumoren. Diese Unterscheidungen bilden die Grundlage der voneinander abweichenden Therapieschemata der beiden großen Untergruppen bösartiger Lungentumoren. Die Anteile der einzelnen Tumortypen in der Gruppe der nicht-kleinzelligen Tumore sind im Wandel begriffen. Plattenepithelkarzinome machten in den letzten 15-20 Jahren ungefähr 40% der nicht-kleinzelligen Lungentumoren aus. Diese Zahl nimmt nach neueren Statistiken ab; in Nordamerika haben Plattenepithelkarzinome nur noch einen Anteil von 20-25%. In Europa ist ebenfalls ein Trend in diese Richtung erkennbar, die abnehmende Zahl der Plattenepithelkarzinome wird jetzt in einem Umfang von 30% der Fälle angegeben. In Nordamerika dominiert das Adenokarzinom, dessen Anteil dort von 20-25% auf mittlerweile 40% gestiegen ist. Auch in Europa stellt es, wegen zunehmender Prävalenz besonders bei Frauen, den jetzt hauptsächlich vertretenen Typ mit Zahlen bis über 40% der diagnostizierten bösartigen Lungentumoren dar. Als ursächlich für diesen anteilmäßigen Wechsel zwischen den beiden Tumortypen werden die geänderten Rauchgewohnheiten diskutiert. 10% der nicht-kleinzelligen Lungentumoren sind unverändert großzellige Tumoren (Hoffman et al. 2000; Müller in: Management des Lungenkarzinoms, Drings et al. 2003). Die Prognose und die Therapie der Erkrankung an bösartigen Tumoren der Lunge hängt ab vom Stadium der Erkrankung zur Zeit der Diagnose, also der Tumorgröße und dem Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen und Fernmetastasen, sowie vom histologischen Tumortyp. Bei den ungefähr 50% ausmachenden Tumoren mit kombinierten histologischen Wachstumsformen (Müller et al. 1997) wird der niedrigst 5 differenzierte Anteil neben dem jeweils führende histologische Typ für prognostische Aussagen herangezogen. Ein möglichst exaktes Staging ist essentiell, um die am besten geeignete Therapie festlegen zu können und damit die Chancen auf ein möglichst langes rezidivfreies Überleben zu erhöhen. Tabelle 1.1: TNM-Klassifikation bösartiger Lungentumoren (UICC 1997) T Tx T0 Tis T1 T2 T3 T4 N Nx N0 N1 N2 N3 M Mx M0 M1 Primärtumor Primärtumor nicht beurteilbar, oder Nachweis maligner Zellen in Sputum oder Bronchialsekret Kein Anhalt für Primärtumor Carcinoma in situ Tumor <3cm, umgeben von Lungengewebe oder viszeraler Pleura, Hauptbronchus frei Tumor >3cm oder Infiltration der viszeralen Pleura oder assoziierte Atelektase oder obstruktive Entzündung eines Lungenanteils bis zum Hilus oder Befall des Hauptbronchus >2cm distal der Carina Tumor jeder Größe mit direkter Infiltration der Brustwand oder des Zwerchfells oder der mediastinalen Pleura oder des parietalen Perikards oder Tumor im Hauptbronchus <2cm distal der Carina, Carina selbst nicht befallen oder Tumor mit Atelektase oder obstruktiver Entzündung der ganzen Lunge Tumor jeder Größe mit Infiltration von Mediastinum, Herz, großen Gefäßen, Trachea, Ösophagus, Wirbelkörpern und Hauptcarina oder vom Primärtumor getrennte Tumorherde im gleichen Lungenlappen oder Tumor mit malignem Pleuraerguß Regionäre Lymphknoten Regionäre Lymphknoten nicht beurteilbar Keine regionären Lymphknotenmetastasen Ipsilaterale peribronchiale und/oder ipsilaterale Hiluslymphknotenmetastasen Metastasen in ipsilateralen mediastinalen und/oder subcarinalen Lymphknoten Kontralaterale mediastinale, hiläre und/oder supraklavikuläre Lymphknoten (ipsi- und/oder kontralateral) Fernmetastasen Fernmetastasen nicht beurteilbar Keine Fernmetastasen Fernmetastasen, einschließlich vom Primärtumor getrennte Tumorherde in anderen Lungenlappen (ipsi- und/oder kontralateral) 6 Tabelle 1.2: Stadieneinteilung der bösartigen Lungentumoren (TNM-Klassifikation, 5.Auflage, 1997) Stadium Primärtumorstatus Lymphknotenstatus Metastasierungsstatus Okkult TX N0 M0 0 Tis N0 M0 IA IB II A IIB T1 T2 T1 T2 T3 T1 T2 T3 T3 jedes T T4 jedes T N0 N0 N1 N1 N0 N2 N2 N1 N2 N3 jedes N jedes N M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M0 M1 IIIA IIIB IV Insgesamt ist die Prognose schlecht: Die 5-Jahres-Überlebensrate liegt bei allen bösartigen Lungentumoren zusammengenommen bei 10% (Müller et al. 1997). 1.2 Therapie bösartiger Lungentumoren Abhängig von Stadium und Gruppe der bösartigen Lungentumoren (ob NSCLC oder SCLC) beim primären Staging gibt es unterschiedliche Therapieansätze. Der folgende Abschnitt beschäftigt sich mit der Therapie der nicht-kleinzelligen Lungentumoren. 1.2.1 Operative Therapie Bei Diagnosestellung läßt sich bei 25-30% der Patienten ein lokal begrenztes Tumorwachstum (Stadium I und II) nachweisen. Standardtherapie für diese Tumorstadien und auch für die T3N1-Tumoren (Stadium IIIA) ist nach Empfehlung der Deutschen Krebsgesellschaft (2002) Behandlungsmöglichkeit die Operation, die hierbei als effektivste gilt. Nach kompletter Resektion beträgt kurative die 5-Jahres- Überlebensrate für Patienten im Stadium I 50-75%, aber für Patienten im Stadium II nur noch 30-50%. Im Stadium IIIA muß man hinsichtlich der Prognose zwischen Patienten mit einem T3N1- Status und Patienten mit einem N2-Lymphknotenstatus unterscheiden. Beim 7 T3N1-Status liegt die 5-Jahres-Überlebensrate noch zwischen 30 und 40%, wohingegen beim N2-Lymphknotenstatus nach alleiniger Resektion eine sehr geringe Überlebenschance besteht (Schirren et al. 1995). Beim Tumorstadium III werden heterogene Krankheitsbilder zusammengefaßt. Es liegt bei ungefähr 30% der Patienten mit einem nicht-kleinzelligen bösartigen Lungentumor vor. In diesem Stadium ist das Tumorwachstum noch auf den Thorax beschränkt, infiltriert aber schon die umgebenden Strukturen wie Pleura und Perikard oder zeigt Absiedlungen in die mediastinalen oder supraklavikulären Lymphknoten. Ziel der Operation ist es immer, eine komplette Resektion des Primärtumors und der drainierenden intrapulmonalen, hilären und mediastinalen Lymphknoten zu erreichen. Besonders die vollständige Entfernung der Lymphknoten ist wichtig, da anhand des hierbei gewonnenen Materials eine genaue Bestimmung des Tumorstadiums möglich ist und mit den Lymphknoten auch die Orte der primären Metastasierung entfernt werden. Vom genauen Tumorstadium wiederum ist abhängig, welche weitere Therapie folgt und wie die wahrscheinliche Prognose des Patienten abzuleiten ist. Hauptkomplikation nach alleiniger operativer Therapie ist die Entwicklung von Fernmetastasen, da bei 80% der Patienten Fernmetastasen die Todesursache darstellen (Manegold et al. 1996). Angesichts der besonders bei fortgeschritteneren Tumoren im Stadium III unbefriedigenden Langzeitergebnisse bei alleiniger operativer Therapie mit einer 5-JahresÜberlebenszeit von 18% und weniger wird heute versucht, den Großteil der Patienten im primär inoperablen Stadium IIIA/B im Rahmen klinischer Studien nach einem multimodalen Therapiekonzept zu behandeln (Manegold et al. 1996). 1.2.2 Strahlentherapie bei bösartigen Lungentumoren Bei der Strahlentherapie sollten heute nur noch Linearbeschleuniger verwendet werden. Das Zielvolumen schließt den Tumor und seine Ausläufer mit einem Sicherheitsabstand von 1-2 cm sowie die hilären und mediastinalen Lymphknotenstationen ein. Die Referenzdosen für nicht-kleinzellige Lungentumoren liegen zwischen 60 und 70 Gy. Sie werden in einem Zeitraum von 6 Wochen appliziert. Die mediane Überlebensdauer bei Patienten im Stadium III liegt nach alleiniger primärer Strahlentherapie bei 9 bis 12 Monaten, mit einer 2-Jahres-Überlebensrate von 15 bis 25% 8 (Manegold et al. 1996). Aufgrund dieser ungünstigen Prognose werden die entsprechenden Patienten zunehmend multimodalen Therapiekonzepten zugeführt. Im Stadium I und II wird die Strahlentherapie laut Empfehlung der Deutschen Krebsgesellschaft (2002) primär als potentiell kurative Behandlungsmöglichkeit eingesetzt, wenn aus allgemeinen oder technischen Gründen eine Operation nicht möglich ist oder diese vom Patienten verweigert wird. Es existieren verschiedene Arten der Fraktionierung von Bestrahlungen. Die konventionelle Fraktionierung sieht die tägliche Applikation einer Einzeldosis an 5 Tagen in der Woche vor. Bei der Hyperfraktionierung werden zweimal täglich an 5 Tagen in der Woche kleinere Einzeldosen appliziert. Hierbei besteht die Möglichkeit, bei gleichbleibender Gesamtbestrahlungszeit die Gesamtdosis ohne Steigerung der Nebenwirkungen zu erhöhen. Bei der akzelerierten Therapie wird bei einer zwei- bis dreimaligen täglichen Bestrahlung die Gesamtbestrahlungszeit bis zum Erreichen der Gesamtdosis verkürzt. Häufig wird eine Kombination aus hyperfraktionierter und akzelerierter Bestrahlung gewählt. Der Vorteil hierbei liegt in der Verkürzung der gesamten Strahlentherapie. Durch die kürzeren Therapieintervalle erfolgt eine effiziente Proliferationshemmung des Tumors. In der CHART-Studie (continous hyperfractionated accelerated radiotherapy) wurde die akzelerierte hyperfraktionierte Strahlentherapie (eine Dosis von 1,5 Gy dreimal pro Tag für zwölf Tage ohne Unterbrechung bis zu einer Gesamtdosis von 54 Gy) mit einer konventionellen Strahlentherapie (5 mal pro Woche einmal täglich eine Dosis von 2 Gy über einen Zeitraum von 6 Wochen bis zu einer Gesamtdosis von 60 Gy) verglichen. Im Vergleich konnte in der Untergruppe der Patienten mit Plattenepithelkarzinomen ein Vorteil hinsichtlich der Fernmetastasierungsrate gezeigt werden, die um 24% reduziert wurde. Für das gesamte untersuchte Kollektiv wies die hyperfraktionierte akzelerierte Strahlentherapie einen Vorteil in bezug auf die Lokalrezidivrate (Risikoreduzierung um 21%) und die 2-Jahres-Überlebensrate (29% im Vergleich zu 20%) auf (Saunders et al. 1999). Postoperativ besteht bei resezierten Tumoren laut Empfehlung der Deutschen Krebsgesellschaft (2002) bei Tumoren im Stadium I keine Indikation zur Bestrahlung. Im Stadium II existiert nur bei mikroskopischen Tumorresten im Resektat oder Schwierigkeiten der Differenzierung zwischen hilären und tracheobronchialen 9 Lymphknotenmetastasen die Indikation zur Bestrahlung, da die Bestrahlung eher zu schlechteren Ergebnissen infolge der auftretenden Nebenwirkungen führte. Adjuvante postoperative Strahlentherapien werden beim Nachweis mediastinaler Lymphknoten im Stadium III angewandt, um eine Reduktion des Lokalrezidivrisikos zu erreichen. Eine Metaanalyse verschiedener Studien konnte aber keine signifikant bessere Überlebensrate aufzeigen (PORT Meta-Analysis Trialists Group 1998). Zum palliativen Einsatz kommt die Strahlentherapie bei Metastasen im ZNS und im Skelettsystem, bei poststenotischen Pneumonien sowie bei nicht beherrschbaren Schmerzen infolge einer Tumorinfiltration der Thoraxwand. 1.2.3 Chemotherapie bösartiger Lungentumoren Die Induktionschemotherapie hat die Verkleinerung des Primärtumors und die Beseitigung von okkulten Mikrometastasen zum Ziel. Sie kommt in zahlreichen Studien zum Einsatz und ihr Stellenwert im Behandlungskonzept der nicht-kleinzelligen Lungentumoren ist in den vergangenen Jahren deutlich gestiegen. Besonders wird ihre Anwendung im Zusammenhang mit Tumoren der Stadien IIIA und IIIB geprüft. Hier liegt die Intention auch in einer Verbesserung der Resektabilität oder auch erst in einer Ermöglichung der operativen Resektion. Die Operation kann frühestens ungefähr drei bis vier Wochen nach Therapieende durchgeführt werden. In mehreren Phase-II-Studien wurden Remissionsraten von 50 bis über 60% erreicht, mit einem Anteil von kompletten Remissionen von 10% und einer medianen Überlebenszeit von 11 bis 20 Monaten (Martini et al. 1993, Thomas et al. 1999). Im Stadium IIIA mit N2-Lymphknotenstatus wird von bis zu 65% R0-Resektionen berichtet mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 17 bis 29%. Dies wurde auch in anschließenden Phase III Studien nachvollzogen. So wurden Chemotherapie mit folgender Operation und alleinige Operation in ihren Ergebnissen verglichen. Es zeigte sich ein signifikanter Überlebensvorteil bei der Kombination. Ein Problem bei der Kombination Chemotherapie und Operation war die hohe perioperative Morbidität. Die Patienten litten verstärkt unter Pneumonien, und es waren häufiger Reintubationen erforderlich. Auch waren bei den kombiniert behandelten Patienten längere Krankenhausaufenthalte zu verzeichnen (Rosell et al. 1994, Roth et al. 1994). In bis zu 40% sind bei Diagnosestellung bösartiger Lungentumoren schon Fernmetastasen nachweisbar (Fry et al. 1996). Im damit vorliegenden Tumorstadium IV beträgt die 10 mediane Überlebenszeit nur 4 bis 6 Monaten mit sehr geringen 5-Jahres-Überlebensraten. Bei der Monotherapie metastasierter nicht-kleinzelliger bösartiger Lungentumoren gibt es bisher keine Standardtherapie. Eine höhere Remissionsrate als 15% weisen nur Cisplatin, Vindesin, Vinblastin, Ifosfamid und Mitomycin C auf. Die Kombinationschemotherapie ist mehreren Studien zufolge der Monotherapie in Remissionsdauer und Remissionsrate überlegen (Bonomi et al. 1989, Elliot et al. 1984, Crino et al. 1990). Die Kombinationstherapie erbrachte in den randomisierten Studien Remissionsraten zwischen 10 und 30%. Meistens handelte es sich dabei um platinhaltige Schemata. In sechs randomisierten Studien wurde die effektive Lebensverlängerung durch die Chemotherapie im Vergleich zur optimalen supportiven Therapie untersucht (Buccheri et al. 1990, Cartei et al. 1993, Cormier et al. 1982, Leung et al. 1992, Quoix et al. 1991, Rapp et al. 1988). Die Studien weisen nach, daß unter Chemotherapie ein geringer Überlebensvorteil und eine bessere Symptomkontrolle bei den Patienten besteht. Vor allem während der ersten sechs Monate wurde ein Rückgang der Mortalität und eine Steigerung der Lebensqualität beobachtet. Die mediane Überlebenszeit konnte von 16 bis 17 auf 28 bis 35 Wochen verlängert werden. Die Ein-Jahres-Überlebensrate wurde von 10 auf 20% verdoppelt. Bei der Analyse der Einzelsubstanzen zeigte sich, daß Alkylanzien wie Cyclophosphamid keinen, Vinca-Alkaloide oder Etoposid einen kleinen, aber nicht signifikanten und nur Cisplatin einen signifikanten Vorteil im Vergleich zur optimalen supportiven Therapie hat (Cartei et al. 1993). Bei den neuen Zytostatika konnte für Paclitaxel, Docetaxel und Vinorelbin im prospektiven Vergleich zur optimalen supportiven Therapie eine signifikante Verlängerung der medianen Überlebenszeiten der Patienten nachgewiesen werden (Manegold 2001). 1.2.4 Kombinierte Radio- und Polychemotherapien Aufgrund von Erfolgen mit der präoperativen Polychemotherapie ging man dazu über, diese systemische Therapieform mit der lokal ausgerichteten Radiotherapie zu kombinieren. Bisher existieren keine allgemeinen Empfehlungen der Deutschen Krebsgesellschaft zur Durchführung von Radiochemotherapien (Deutsche Krebsgesellschaft 2002). Zunächst ist eine weitere Überprüfung existierender Schemata in Studien notwendig. Die Strahlentherapie soll für die lokale Tumorkontrolle sorgen und die Polychemotherapie die Mikrometastasen bekämpfen. Beide Therapieformen werden in Studien sequenziell, 11 simultan oder alternierend eingesetzt. Bisher sind die optimalen Sequenzen beider Modalitäten nicht bekannt. Furuse et al. verglichen die sequentielle mit der simultanen Radiochemotherapie. Sie fanden eine signifikant längere mediane Überlebenszeit (logrank-Test, p=0,039) für Patienten, die mit simultaner Radiochemotherapie behandelt worden waren (Furuse et al. 1999). Thomas et al (1999) behandelten im Rahmen der eigenen Phase-II-Studie 54 Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren in den Stadien IIIA und IIIB zunächst mit zwei Chemotherapiezyklen bestehend aus Carboplatin, Ifosfamid und Etoposid. Daran anschließend wurde eine hyperfraktioniert-akzelerierte Bestrahlung (Gesamtdosis 45 Gy) mit simultaner Gabe von Vindesin und Carboplatin durchgeführt. Die Studie konnte zeigen, dass diese neoadjuvante multimodale Therapie günstige Überlebenszeiten bewirkte. Die errechneten 3-Jahres-Überlebensraten nach einem medianen Beobachtungszeitraum von 44 Monaten betrugen für Patienten mit Tumoren im Stadium IIIA 35%, für die mit Tumoren im Stadium IIIB 26% und für Patienten, die nach der Therapie R0 reseziert werden konnten (63% des Kollektivs, insgesamt 34 der Studienteilnehmer) und eine Tumorregressionsrate von über 90% aufwiesen (23 der Patienten nach R0-Resektion, entspricht 68%), sogar 56%. Wie aufgeführt ist die optimale Therapie für Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren in den Stadien IIIA und IIIB noch nicht abschließend geklärt. Nach Empfehlung der Deutschen Krebsgesellschaft (2002) werden funktionell operable Patienten im Stadium IIIA primär operiert und bei durch den Pathologen festgestellten T3, N2 Tumoren und/oder mikroskopisch oder makroskopisch festgestellten Tumorresten im Resektat einer postoperativen Radiotherapie unterzogen. Patienten im fortgeschrittenen Stadium IIIA mit mehreren befallenen Lymphknotenstationen und Patienten mit Tumoren im Stadium IIIB sollten im Rahmen klinischer Studien mit neoadjuvanten Radiochemotherapien und anschließender Operation behandelt werden. Postoperativ sollte sich eine erneute Radiotherapie anschließen. 1.3 Angiogenese Als Angiogenese wird die Aussprossung neuer Kapillaren aus vorhandenen Gefäßen bezeichnet (Folkman et al. 1992). Diese Aussprossung kann entweder physiologisch geregelt ablaufen oder auch unkontrolliert in pathologischen Prozessen. Abhängig ist dies 12 vom Gleichgewicht der das Gefäßwachstum hemmenden (Angiostatin, Endostatin) und fördernden (VEGF, bFGF) Faktoren. Der Mechanismus sieht wie folgt aus: Die Endothelzellen bauen auf einen bestimmten Reiz hin ihre Basalmembranen lokal begrenzt enzymatisch ab. Die an dieser Unterbrechung der Basalmembran liegenden Endothelzellen verändern ihre Form und wachsen in das umgebende Gewebe ein. Diese Invasion wird begleitet von der Proliferation der direkt mit dem jeweils umgebenden Gewebe in Kontakt stehenden Endothelzellen, die eine sogenannte „wandernde Säule“ bilden. Hinter der voranwachsenden Linie bildet sich eine Zone der Differenzierung aus. Die Endothelzellen in diesem Gebiet beenden die Proliferation, ändern die Form und verbinden sich eng miteinander, um das Lumen einer neuen Kapillare zu bilden. Schließlich verschmelzen die sprossenden Gefäßröhren und vereinigen sich zu Schleifen, in denen das Blut jetzt in die neu vaskularisierten Gebiete fließen kann (Hanahan et a. 1996). Bei diesem Wachstumsprozeß bewegen sich die Endothelzellen auf den Ausgangspunkt der Reizung zu. Meist ist der Ausgangspunkt ein Ort mit Sauerstoffund/oder Substratmangel. Normalerweise beendet die Aufhebung der Mangelversorgung das Gefäßwachstum, bei der pathologischen Angiogenese setzt es sich aber ungehindert fort (Heits et al. 1998). Beim Erwachsenen werden unter physiologischen Bedingungen selten neue Gefäße gebildet. Ausnahmen sind hier unter anderem die zyklische Regeneration des Endometriums sowie Kapillareinsprossungen in Granulationsgewebe, das zur Reparatur von Verletzungen benötigt wird (Fox et al. 1996). Überschießende lokale Angiogenese findet man bei Tumoren. Ab einem Tumordurchmesser von 1-2mm (etwa 106 Zellen) sind die Versorgung mit Sauerstoff und Substraten und der Abtransport von Stoffwechselprodukten durch Diffusion aus dem umgebenden Gewebe nicht mehr möglich, so daß der Tumor für weiteres Wachstum auf eine eigene Gefäßversorgung angewiesen ist. Diese erste Phase des Tumorwachstums wird als avaskuläres Stadium bezeichnet (Fidler et al. 1994). Ihm folgt zunächst ein durch den Versorgungsengpaß bedingter Wachstumsstillstand. Falls der Tumor nicht in der Lage ist, eine effiziente Angiogenese aufrechtzuerhalten, resultiert ein latentes Stadium des Tumorwachstums, das auch als „Tumorschlaf“ („dormant cells“) bezeichnet wird (Holmgren et al. 1995), oder der Tumor wird nekrotisch und geht schließlich zugrunde. Falls der Tumor aber in der Lage ist, die für ihn notwendige Angiogenese zu induzieren, geht nach einer je nach Tumor unterschiedlich langen Ruheperiode das avaskuläre Stadium in das sogenannte vaskuläre Stadium über. Dieses Stadium ist dadurch 13 gekennzeichnet, daß der Tumor in großen Mengen gefäßwachstumsfördernde Stoffe wie VEGF und bFGF freisetzt. Hieraus resultiert ein rasches Einsprossen von Kapillaren aus den umliegenden Gefäßen (Mechanismus siehe oben), was wiederum eine Größenzunahme des Tumors und auch seine Metastasierung ermöglicht (Abbildung 1.1). Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der Wechselwirkungen zwischen Tumor und Gefäßsystem 1.3.1 VEGF Die VEGF-Familie besteht aus VEGF-A, -B, -C, -D, -E und dem Plazentawachstumsfaktor. Alle sind homodimere Glykoproteine mit einer relativen Molekülmasse von 34000-42000 Dalton und weisen eine strukturelle Homologie zu PDGF, dem „platelet derived growth factor“, auf (Keck et al. 1989). VEGF-A, der spezifische Wachstumsfaktor für Endothelzellen, wurde erstmalig 1983 beschrieben. Die Arbeitsgruppe um Senger et. al. (1983) isolierte einen zunächst als VPF (vaskulärer Permeabilitätsfaktor) bezeichneten Faktor aus der Aszitesflüssigkeit von Patienten, die an intraperitonealen Tumoren erkrankt waren. Wie aus seinem Namen ersichtlich, erhöht dieser Faktor die Durchlässigkeit der Kapillaren und führt so zum 14 Austritt von Flüssigkeit in das Gewebe. Nach Klonierung der VPF-DNA wurde deren Übereinstimmung mit der VEGF-DNA erkannt. Das humane Gen für VEGF, den „vascular endothelial growth factor“ oder vaskulären Endothelwachstumsfaktor, liegt auf dem Chromosom 6 p12-p21 und besteht aus 8 Exons sowie 6 Introns. Durch alternatives Splicing der RNA entstehen mehrere Isoformen, die am häufigsten untersuchten weisen Sequenzen von 121, 165, 189 und 206 Aminosäuren auf (Houck et al. 1991). Die Isoform VEGF165 ist hauptsächlich im Serum vertreten, in geringerem Ausmaß auch die Isoform VEGF121. Die Isoformen VEGF189 und VEGF206 bleiben membranständig an Heparansulfate gebunden. Verschiedene Zelltypen wie Fibroblasten, Monozyten, Makrophagen, Plasmazellen, Lymphozyten, Leberzellen, Lungengewebe, Neuroektodermalzellen und Myozyten enthalten mRNA für VEGF. Eine gesteigerte VEGF-Expression findet man bei Fehlbildungen wie z.B. dem Hämangiom und Erkrankungen wie der proliferativen Retinopathie, der Psoriasis und der rheumatoiden Arthritis (Folkman et al. 1995). Besonders in hochmalignen, schnell proliferierenden Tumorgeweben ist der Gehalt an VEGF-mRNA ebenfalls stark erhöht. Rezeptoren für VEGF werden von Endothelzellen, primitiven hämatopoetischen Stammzellen, Monozyten und Erythroleukämiezellen exprimiert. Eine mitogene Wirkung scheint VEGF aber nur auf Endothelzellen zu haben, die als aktivierte Endothelzellen wachsender Gefäße einen signifikanten Level an Flt-1, einem Rezeptor von VEGF, exprimieren. Daher wird VEGF momentan auch als einziger spezifischer Wachstumsfaktor der Angiogenese angesehen (Heits et al. 1998, Keck et al. 1989). Zwei unterschiedliche VEGF-Rezeptoren sind identifiziert und kloniert worden. Sie gehören beide zur Familie der Tyrosinkinaserezeptoren mit intrinsischer Aktivität. Sie werden als „kinase-domain insert containing receptor“ (KDR, auch VEGFR-2) und „fms-like tyrosine kinase“ (Flt-1, auch VEGFR-1) bezeichnet. Die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren führt zu einer Tyrosinphophorylierung intrazellulärer Funktionsproteine und einer Erhöhung der zytosolischen Calciumionenkonzentration (Brock et al. 1991). Die genauen Aufgaben der beiden Rezeptoren sind noch nicht endgültig geklärt. Man vermutet, daß VEGFR-2 bei Aktivierung durch VEGF das Wachstum von Endothelzellen bewirkt. VEGFR-1 reguliert dieses Wachstum über die Bildung von Stickstoffmonoxid, das die VEGFR-2 abhängige Endothelzellproliferation hemmt. VEGFR-1 bewirkt dann die Redifferenzierung der 15 Endothelzellen in kapillar-ähnliche Strukturen und die Verbindung der neuen Kapillaren untereinander (Bussolati et al. 2001). VEGF fördert die Angiogenese durch verschiedene Mechanismen. VEGF wirkt chemotaktisch auf Makrophagen, Mastzellen und Endothelzellen. Wie schon erwähnt, ist eine weitere biologische Wirkung die Erhöhung der Gefäßdurchlässigkeit, was sich in elektronenmikroskopischen Aufnahmen als eine Auflösung der engen Zell-Zellkontakte, einer Fenestration, zeigen läßt. Die hierdurch in das die Gefäße umgebende Bindegewebe gelangenden Plasmabestandteile könnten ebenso wie die Bindung von VEGF an seine Rezeptoren die Freisetzung des von WillebrandFaktors sowie die Freissetzung des Plasminogenaktivators und von Kollagenasen bewirken. Hierdurch wird eine verstärkte Adhäsion von Thrombozyten bewirkt, die daraufhin VEGF freisetzen und so durch Erhöhung der Konzentration von lokalen angiogenesefördernden Faktoren zusätzliches Gefäßwachstum bedingen (O´Byrne et al. 2003). Die Steuerung der VEGF-Produktion wurde im Tierexperiment und anhand von Zellkulturen untersucht. Es konnten verschieden Mediatoren gefunden werden, die die Synthese von VEGF mRNA hemmend oder fördernd beeinflussen. Die VEGF-Freisetzung wurde in diesen Experimenten durch Interleukin-1β, TGFβ, Östrogene und Prostaglandin E gefördert. Hemmend auf die Ausschüttung wirkten hingegen Plättchenfaktor 4 und α2Makroglobulin. Den größten Einfluß auf die VEGF-Synthese haben laut Studien das lokale Sauerstoffangebot sowie das lokale Glucoseangebot. Bei Hypoxie des Gewebes wird die VEGF mRNA vermehrt gebildet, und ihre Halbwertzeit ist verlängert (Shweiki et al. 1992). In Tumorgeweben, die regelmäßig eine heterogene Gefäßdichte aufweisen, sind die Gebiete mit hoher Vaskularisierung und ausgeprägter VEGF-Synthese in den Randgebieten der Tumoren lokalisiert. Eine zusätzliche Steigerung der VEGF-Produktion kann auch in hypoxischen, oft zentral in den Tumoren gelegenen Gebieten, die an Nekrosen grenzen, nachgewiesen werden (Plate et al. 1992). Die Angiogenese ist auch in Tumorgeweben reguliert über das Gleichgewicht zwischen den die Angiogenese fördernden Faktoren wie VEGF und bFBF (basic fibroblast growth factor) und den Inhibitoren der Angiogenese wie Thrombospondin 1, Angiostatin und Endostatin. Der genaue Mechanismus dieser Gleichgewichtskontrolle ist noch unklar. 16 Als proangiogenetisch anzusehen sind auch die Onkogene ras und raf (Grugel et al. 1995), wobei ras nicht nur ein Induktor der VEGF-Expression ist, sondern auch ein potenter Inhibitor des Thrombospondin 1, welches wiederum einen der effizientesten Inhibitoren der Angiogenese darstellt. Ebenfalls proangiogenetisch wirkt ein p53-Gendefekt. P53 gehört zu den Angiogenese inhibierenden Faktoren, da es die Bildung von Thrombospondin 1 induziert (Mukhopadhay et al. 1995). Verschiedene Studien haben gezeigt, daß VEGF mRNA in einer Vielzahl bösartiger Tumoren des Menschen gebildet wird. Zu nennen sind hier Karzinome der Niere, der Brustdrüse, der Leber, des Kolon, der Speiseröhre und der Lunge. Es wurde auch dargestellt, daß die VEGF-Expression in enger Verbindung steht mit der Neovaskularisation und korreliert ist mit einer schlechteren Prognose in verschiedenen Typen menschlicher Karzinome (Mattern et al. 1995, Volm et al. 1996b). Besonders bei nicht-kleinzelligen Tumoren der Lunge scheint die Angiogenese ein zusätzlicher prognostischer Indikator zu sein ( Fontanini et al. 1995). Nicht-kleinzellige Tumoren der Lunge exprimieren beide VEGF-Rezeptoren, so daß hier die Möglichkeit einer autokrinen Neoangiogenese durch die Tumorzellen besteht. Ein Problem der Beurteilung auftretender pathologischer VEGF-Expressionen stellt die schon normalerweise hohe VEGF-Konzentration des Lungengewebes dar. VEGF ist von Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Permeabilität des normalen Lungengewebes für Plasmabestandteile. Erhöhte VEGF-Konzentrationen führen auch in der Lunge zu gesteigerter Permeabilität der alveolaren Kapillaren durch Auftreten von Fenestrationen (Heits et al. 1998). Eine Erhöhung des VEGF-Gehaltes findet man bei jeder Entzündung des Lungengewebes. Hyperplastische Alveolarzellen vom Typ 2 enthalten ebenfalls hohe VEGF-Konzentrationen im Cytoplasma. Die die Bronchien auskleidenden Epithelzellen zeigen hingegen nur in wenigen Fällen eine VEGF-Expression. Die in vielen Fällen gesteigerte VEGF-Expression in den von diesen Epithelzellen ausgehenden Plattenepithelkarzinomen wird als ein Hinweis auf die mögliche Progression des nichtkleinzelligen Tumors aufgefaßt. Hieraus können dann prognostische Folgerungen erarbeitet werden (Fontanini et al. 1999). Fontanini et. al. zeigten erneut, daß VEGF eine prognostische Relevanz in bezug auf das Gesamtüberleben hat. Sie fanden eine signifikante Assoziation zwischen der VEGF-165-Isoform und dem Überleben sowie zwischen der Isoform VEGF-121 und auftretenden Lymphknotenmetastasen. Die 17 Isoformen VEGF 165 und 121, also die löslichen Isoformen, sind ihren Aussagen nach wichtig als Marker für die Aggressivität dieser Tumoren. Statistisch signifikante Unterschiede bei der Anzahl der Mikrogefäße wurden beim Vergleich VEGF-positiver und VEGF-negativer Tumoren gefunden; dabei war die Mikrogefäßdichte in den VEGF-positiven Tumoren signifikant höher als in den VEGFnegativen Tumoren (Masuya et al. 2001). Eine identische Korrelation fanden Takanami et al. (1997) für Flt-1-positive und -negative Tumoren. Am ausgeprägtesten war in ihrer Untersuchung die Mikrogefäßdichte in Tumoren, die sowohl eine hohe VEGFProteinexpression als auch eine starke Markierung bei der Darstellung des Rezeptors Flt-1 zeigten. Eine ebenfalls signifikante Korrelation zwischen VEGF-Expression und Mikrogefäßdichte fanden Volm et. al. (1996a), die die Wechselbeziehung zwischen Mikrogefäßdichte, VEGF-Expression und Resistenz gegenüber Doxorubicin bei nichtkleinzelligen Lungentumoren untersuchten. Sie konnten zeigen, daß im Vergleich zu Doxorubicin-sensiblen Tumoren Doxorubicin resistente Tumoren eine signifkant reduzierte Mikrogefäßdichte und damit Vaskularisation aufwiesen und auch eine signifikant niedrigere VEGF-Expression hatten. Auf diese Weise erhielten Volm et. al. ein Mittel, zuverlässig resistente Tumoren vorherzusagen. Als Ursache für die Wechselbeziehung zwischen den verschiedenen Faktoren vermuten sie die biologisch und therapeutisch wichtige Hypoxie, da bei vielen Therapien für deren maximale zytotoxische Wirksamkeit Sauerstoff essentiell ist. Geringe VEGFExpression erweist sich in dieser Studie als ein auf Subpopulationen mit schlechter Gefäßversorgung und somit limitierter Effektivität der Chemotherapie hinweisender Parameter. Dies beeinflußt auch die Überlebenschancen der Patienten (Volm et al. 1996a). Für bösartige Lungentumoren zeigten mehrere Studien, daß die intratumorale Gefäßdichte mit einer schlechteren Prognose korreliert (Mattern et al. 1996, Macchiarini et al. 1992). Ebenso wurde gezeigt, daß die Zahl der Mikrogefäße mit der Fähigkeit des Tumors zur Angiogenese korreliert. In den Sera der an bösartigen Tumoren erkrankten Patienten waren die Konzentrationen von VEGF signifikant höher als in den Sera der gesunden Kontrollgruppe. Die erhöhten Serumkonzentrationen von VEGF konnten mit einer schlechteren Prognose korreliert werden (Yamamoto 1996). Andere Studien hingegen konnten keine Korrelation zwischen erhöhten Konzentrationen von VEGF im Serum und einer schlechteren Prognose aufzeigen (Brattström 1998). Hier muß davon ausgegangen werden, daß weitere Studien zu diesem Themenkreis notwendig sind, bis valide Aussagen getroffen werden können. 18 2. Fragestellung Die nicht-kleinzelligen bösartigen Lungentumoren gehören zu den häufigsten Tumoren der Menschen. Jährlich sterben allein in der Bundesrepublik Deutschland 40.000 Personen an den Folgen dieser Erkrankung. Besonders für die ungefähr 30 Prozent der Patienten, bei denen bei Diagnosestellung ein schon lokoregionär fortgeschrittener Tumor im Stadium IIIA oder IIIB mit einer niedrigen Fünf-Jahres-Überlebensrate vorliegt, werden verbesserte Therapieschemata gesucht und daher vermehrt multimodale Therapiestrategien in Studien untersucht. Diese neoadjuvanten oder adjuvanten Chemo- oder Radiochemotherapien erzielen aber noch nicht bei allen Patienten die erwünschten Therapieergebnisse. Daher wird nach Parametern gesucht, die sowohl das Ansprechen auf die jeweilige Therapieform als auch die Prognose für das Überleben der Patienten individuell beurteilen lassen. 1. Wie stellt sich die in der vorliegenden Arbeit mittels immunhistochemischer Markierung untersuchte Expression des Angiogeneseparameters Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und seines Rezeptors Flt-1 an einem Kollektiv lokoregionär weit fortgeschrittener nicht-kleinzelliger bösartiger Lungentumoren vor und nach Therapie dar? Das Kollektiv war mit einer neoadjuvanten Kombinationschemotherapie aus Ifosfamid, Carboplatin und Etoposid sowie einer nachfolgenden hyperfraktioniert-akzelerierten Radiotherapie mit einer Gesamtdosis von 45 Gy mit simultaner Chemotherapie mit den Substanzen Carboplatin und Vindesin behandelt worden. 2. VEGF wird untersucht, weil es als wichtigster parakriner Wachstumsfaktor für Gefäßendothelzellen bekannt ist. Tumoren induzieren durch die Sekretion von VEGF die für ihre Vergrößerung und Ausbreitung notwendige Angiogenese. Autoren verschiedener Studien konnten für unterschiedliche Tumoren signifikante von der VEGF-Expression abhängige Aussagen hinsichtlich der Prognose für das Überleben ihrer Patienten treffen. Für die Gruppe der Lungentumoren gibt es noch keine Festlegung im Hinblick auf die Bedeutung der VEGF-Expression für das Überleben der Patienten. Ergebnisse hinsichtlich der therapeutischen und vor allem prognostischen Relevanz von VEGF im Zusammenhang mit neoadjuvanten Radiochemotherapien sind bisher nicht veröffentlicht worden. Ist die VEGF-Expression als Prognosemarker für die an fortgeschrittenen nichtkleinzelligen bösartigen Lungentumoren erkrankten und mit einer neoadjuvanten 19 Radiochemotherapie behandelten Studienpatienten anwendbar? Besteht ein Zusammenhang zwischen VEGF-Expression und klinischen Verlaufsparametern bzw. histomorphologischen Tumorregressionsphänomenen und dem Ansprechen auf die durchgeführte Therapie? 3. Flt-1 wird untersucht, weil es sich hierbei um einen spezifischen VEGF-Rezeptor handelt, der hauptsächlich in proliferierenden Endothelzellen, die direkt an einen Tumor angrenzen oder in ihn hineinwachsen, ausgebildet ist. Im gesunden adulten Gewebe ist er nur in geringen Mengen nachweisbar. Im Hinblick auf seine Bedeutung für das Ansprechen eines Tumors auf eine Therapie gibt es keine Veröffentlichungen. In der Literatur findet man zur prognostischen Aussagekraft von Flt-1 ähnlich wie bei VEGF widersprüchliche Angaben. Erfahrungen zu seiner therapeutischen und prognostischen Relevanz bei neoadjuvanten Therapiekonzepten liegen bisher nicht vor. Ist die immunhistochemische Flt-1-Darstellung als Prognosefaktor für das untersuchte Kollektiv einsetzbar? Einige Studien fanden eine signifikante, als Prognoseparameter geeignete Koexpression von VEGF und Flt-1. Läßt sich eine entsprechende Korrelation für das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Kollektiv finden? Parallel zu dem Vorgehen bei der Auswertung der Resultate der VEGF-Expression werden die Resultate der Flt-1-Expression klinischen Verlaufsparametern und histomorphologischen Tumorregressionsphänomenen mit der Frage gegenübergestellt, ob eine therapeutischen Relevanz von Flt-1 dargestellt werden kann. 20 3. Untersuchungsgut und Methoden 3.1 Untersuchungsgut 3.1.1 Studienpopulation Im Rahmen einer multizentrischen Phase-II-Studie zur Therapie primär nicht resektabler nicht-kleinzelliger Lungentumoren wurde von April 1992 bis September 1995 eine Gruppe von 54 Patienten rekrutiert. Diese Patienten mit einem histologisch gesicherten, lokal fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen bösartigen Lungentumor wurden nach einem multimodalen neoadjuvanten Therapieschema behandelt. Das Schema bestand aus der Kombination einer präoperativen Chemotherapie mit den Substanzen Carboplatin, Ifosfamid und Etoposid und einer anschließenden hyperfraktionierten akzelerierten Radiotherapie unter gleichzeitiger Gabe einer Chemotherapie mit den Substanzen Carboplatin und Vindesin. Dies geschah mit dem Ziel, präoperativ eine Verkleinerung der Tumormasse und damit einhergehend eine verbesserte Operabilität der Patienten zu erreichen. Das Patientenkollektiv setzte sich aus 5 Frauen und 49 Männern mit einem durchschnittlichen Alter von 56,7 Jahren (Altersspanne von 37 bis 70 Jahre) zum Zeitpunkt der Diagnose zusammen. Bei der Zuordnung zu den Tumorstadien ließen sich 25 Patienten dem Stadium IIIA und 29 Patienten dem Stadium IIIB zuordnen. Bei den Tumoren handelte es sich histomorphologisch nach dem führenden histologischen Typ um 36 Plattenepithelkarzinome, 17 Adenokarzinome und ein adenosquamöses Karzinom. 3.1.2 Ein- und Ausschlußkriterien zur Aufnahme in die Studie Voraussetzungen für die Aufnahme in die Studie war ein histologisch gesicherter nichtkleinzelliger bösartiger Tumor der Lunge. Weiterhin mußten sich die Patienten in einem guten Allgemeinzustand befinden (Karnofsky>70%) und über eine ausreichende Leberund Nierenfunktion Knochenmarkreserve verfügen. Wichtig (Leukozyten>4000/µl, war auch eine genügend Thrombozyten>100.000/µl) und große die funktionelle Operabilität (FEV1>1,0 Liter). Alle Patienten mußten schriftlich ihr Einverständnis erklären. Ausschlußkriterien waren eine schon zuvor durchgeführte Resektion des Primärtumors und eine nicht im Zusammenhang mit der Studie erhaltene Chemo- oder Radiotherapie. 21 Ein gleichzeitiger maligner Zweittumor in einem anderen Organ sowie eine manifeste Infektion vor Therapiebeginn führten ebenfalls zum Ausschluß von der Studienteilnahme. 3.1.3 Durchgeführte Untersuchungen Nach Anamnese und klinischer Untersuchung sowie der histologischen Diagnosesicherung unterzogen sich die Patienten dem Primärstaging. Neben bildgebenden Verfahren wie Röntgen des Thorax in zwei Ebenen, Computertomographie des Thorax, des Abdomens und des Schädels sowie einer Skelettszintigraphie wurden eine Bodyplethysmographie, Bronchoskopie und Mediastinoskopie mit Lymphknotenbiopsien durchgeführt. Im Einzelfall war auch eine diagnostische Thorakotomie notwendig, um das Tumorstadium beurteilen zu können. 3.1.4 Therapieprotokoll Der Therapieplan enthielt drei Blöcke neoadjuvanter Behandlung. Die ersten beiden Blöcke setzten sich aus einer Kombinationschemotherapie zusammen. Die verwendeten Substanzen waren Ifosfamid, Carboplatin und Etoposid (ICESchema). An den Tagen 1, 3 und 5 wurden Ifosfamid (1500mg/m2 Körperoberfläche) und Etoposid (100mg/m2 Körperoberfläche) gegeben. Die Gabe von Carboplatin fand nur an Tag 1 in einer Menge von 300mg/m2 Körperoberfläche statt. Anschließend an diesen ersten Block wurde mit der Therapie pausiert, um eine Regeneration des Blutbildes zu ermöglichen. Die Wiederholung dieses ersten Blockes sollte dann ab Tag 22 erfolgen. Nach Durchführung der ersten beiden Blöcke schloß sich zwei Wochen später das erste Zwischenstaging an. An bildgebenden Verfahren wurden hierzu Röntgen des Thorax in zwei Ebenen, eine Computertomographie des Thorax und eine Sonographie des Abdomens eingesetzt. Anschließend wurde der dritte Block, die Radiotherapie, als hyperfraktionierte akzelerierte Bestrahlung begonnen. Eine Gesamtdosis von 45 Gy wurde in drei Wochen verabreicht. An 5 Tagen in der Woche wurde eine tägliche Herddosis von zweimal 1,5 Gy appliziert. Zusätzlich erhielten die Patienten an den Tagen 1, 8 und 15 eine Chemotherapie bestehend aus Carboplatin (100mg/m2 Körperoberfläche) und Vindesin (3mg absolut). Nach Abschluß dieses dritten Blockes erfolgte drei Wochen später das zweite Zwischenstaging mit der Frage nach der Operabilität. Die Bewertung erfolgte gemäß den Kriterien der Southwest Oncology Group (SWOG) (Green et. al. 1992). 22 Im Durchschnitt 7 Wochen nach Therapieende erfolgte die radikale Operation mit kurativer Zielsetzung. Gefolgt wurde sie von einem erneuten Staging drei bis sechs Wochen nach der Operation. Wenn keine Operation möglich war oder nur eine inkomplette Resektion durchgeführt werden konnte, folgte eine konventionelle Radiotherapie mit einer Gesamtdosis von 16 Gy. 3.1.5 Remissionsverhalten und Operationsrate Remission bezeichnet das Zurückgehen von Krankheitserscheinungen, z.B. das Nachlassen eines Fiebers. Als komplette Remission wird ein Zustand nach Therapie bezeichnet, der durch vollständiges Verschwinden aller erfaßbaren Hinweise auf eine Krankheit gekennzeichnet ist. Darunter fallen auch: kein erneutes Auftreten von Läsionen und von in Beziehung zur Erkrankung stehenden Symptomen sowie eine Normalisierung vor der Therapie eventuell pathologischer Laborwerte. Als partielle Remission wird ein Rückgang der Läsionen um 50% oder mehr bezeichnet, einhergehend mit dem Nichtfortschreiten vorhandener meßbarer Läsionen und ohne erneutes Auftreten von Läsionen (Green et al 1992). Anhand der bildgebenden Verfahren beurteilt, erreichten nach zwei Zyklen von den 54 Patienten 1 Patient eine komplette Remission (CR) und 20 Patienten eine partielle Remission (PR). Einen Progress der Erkrankung (PD) erlitt 1 Patient, der an einer Blutung infolge einer Gefäßarrosion in der Lunge durch den Tumor zu Beginn des zweiten Chemotherapieblockes verstarb. Insgesamt war bei 41% der Patienten nach Beendigung der Chemotherapie ein Ansprechen auf die Therapie (PR+CR) zu sehen. Nach Durchführung der simultanen Radiochemotherapie zeigten von 54 Patienten 5 Patienten eine komplette Remission (CR) und weitere 32 Patienten eine partielle Remission (PR). Bei vier Patienten wurde ein Fortschreiten der Erkrankung beobachtet. Von diesen zeigten drei Patienten eine Metastasierung. Der vierte Patient erlitt die oben erwähnte Tumorblutung zu Beginn des zweiten Chemotherapiezyklus. Insgesamt zeigten den bildgebenden Verfahren zufolge 70% der Patienten ein Ansprechen auf die Therapie (CR+PR). Nach Abschluß der Radiochemotherapie wurden 40 Patienten (75%) mit kurativer Zielsetzung operiert. Drei Patienten waren technisch inoperabel, zwei Patienten waren 23 funktionell inoperabel, vier Patienten lehnten nun die Operation ab. Drei Patienten hatten Fernmetastasen entwickelt und zwei waren bereits vorher verstorben. Ein Patient verstarb an einer Tumorblutung, der andere an einer Pneumonitis. In 34 Fällen konnte eine R0Resektion durchgeführt werden, in 6 Fällen gelang nur eine inkomplette Resektion. 20 der Patienten im Stadium IIIA (80%) konnten operiert werden, 17 von ihnen erhielten eine R0und 3 eine R1-Resektion. Im Stadium IIIB wurden ebenfalls 20 Patienten (69%) operiert. Auch hier gelang in 17 Fällen eine R0-Resektion. In einem Fall war nur eine R1-Resektion und in 2 Fällen eine R2-Resektion möglich. 3.1.6 Toxizität der Therapie (SWOG-Kriterien) Als Nebenwirkungen der ICE-Induktionschemotherapie wurden in insgesamt 107 Zyklen 15 Leukopenien Grad III/IV (Leukozytenzahlen <1900/µl bzw. <1000/µl) und fünf Thrombopenien Grad III/IV (Thrombozytenzahlen <49.900/µl bzw. <25.000/µl) beobachtet (Thomas et al 1999). Die Toxizität der Chemotherapie war somit als mäßig einzustufen. Infolge der Radiochemotherapie zeigte sich ein anderes Nebenwirkungsprofil. Von den Patienten entwickelten 4 Ösophagitiden Grad III/IV (Patient nicht mehr in der Lage, feste Nahrung zu sich zu nehmen (Grad III), parenterale Ernährung nötig oder komplette Obstruktion oder Perforation (Grad IV)) und 5 Pneumonitiden Grad III/IV (Sauerstoffbedarf/ Beatmungspflichtigkeit), von denen zwei letal verliefen, in einem Zeitraum von 70 bzw. 80 Tagen nach Ende der Radiotherapie. Auch postoperativ kam es zu letalen Komplikationen. Von drei Patienten, die an einer Pneumonie erkrankten, verstarb einer. Bronchusstumpfinsuffizienzen traten bei 5 Patienten auf, bei zwei Patienten verliefen sie letal. Die therapieassoziierte Letalität betrug somit insgesamt 9% (5 Todesfälle). 3.1.7 Prognose Nach einer medianen Nachbeobachtungszeit von 44 Monaten (38,4 bis 46,6 Monate) sind 37 Patienten verstorben. Ausgehend vom Zeitpunkt der Erstdiagnose betrug damit die mediane Überlebenszeit insgesamt 20,4 Monate. Die 1-Jahres-Überlebensrate betrug 68,5%, die 2-Jahres-Überlebensrate noch 39,8%. Eine bessere mediane Überlebenszeit von 24,8 Monaten zeigten die Patienten nach R0-Resektion. Auch die 1- bzw. 2-JahresÜberlebensrate von 79,4 bzw. 52,4% fiel bei ihnen günstiger aus. Von den 34 Patienten 24 nach R0-Resektion lebten nach der medianen Nachbeobachtungszeit von 44 Monaten noch 15 Patienten (44%). 3.2 Methoden Das für diese Arbeit verwendete Untersuchungsgut stammt von Patienten, die an einer Multi-Center-Studie teilnahmen, welche unter der Leitung der Medizinischen Klinik A der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster (PD Dr. med. M. Thomas) durchgeführt wurde. Als Referenzpathologie war das Institut für Pathologie an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil, Universitätsklinik, an dieser Studie beteiligt (PD Dr. med. K. Junker, Professor Dr. med. K.-M. Müller). 3.2.1 Histomorphologische Untersuchungen Das im Rahmen der Untersuchungen zur Stellung der Primärdiagnose, zum Primärstaging (Bronchusbiopsie und Mediastinoskopie) und bei den Resektionen gewonnene Material wurde im Institut für Pathologie an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil aufgearbeitet. Nach makroskopischer Inspektion des Primärtumors und der resezierten Lymphknoten wurden die abgrenzbarem Areale mit noch intaktem oder ehemaligem Tumorgewebe vollständig in Paraffin eingebettet. Als Basis für die histologische Klassifikation und die Beurteilung der histomorphologischen Tumorregression dienten von allen Präparaten jeweils nach Hämatoxylin-Eosin (HE) und van Gieson (EvG) gefärbte Schnitte. Anhand der angefertigten Schnittpräparate wurden geeignete Blöcke der Primärbiopsie und des Resektates für weitere immunhistochemische Untersuchungen ausgewählt. Von den ursprünglich 54 Studienpatienten wurden 32 Patienten im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht. Von diesen lag noch bei 19 Patienten präoperativ gewonnenes Material mit für die geplanten immunhistochemischen Markierungen ausreichendem Tumorgewebe vor. Es handelte sich dabei um 9 Bronchusbiopsien und um 10 Mediastinoskopien. Bei insgesamt 13 Fällen der Studienpopulation war für weitere Untersuchungen ausreichendes Gewebe nicht mehr vorhanden. Posttherapeutisch nach der Radiochemotherapie durch Resektionen gewonnenes Gewebe enthielt für die geplanten Untersuchungen bei 26 Patienten ausreichendes Tumorgewebe. 25 Insgesamt lag also von 19 Patienten prätherapeutisch und von 26 Patienten posttherapeutisch gewonnenes, für die immunhistochemischen Untersuchungen ausreichendes Material vor. Bei 13 Patienten konnten sowohl an prä- als auch posttherapeutisch erhaltenem Material die Markierungen durchgeführt werden. Bei den untersuchten Tumoren handelte es sich um 9 Adenokarzinome, 22 Plattenepithelkarzinome, und in einem Fall lag ein Mischtumor mit Anteilen eines Adenound eines Plattenepithelkarzinoms vor. Neben der Tumorremission als klinischen Parameter des Ansprechens der Tumoren auf die neoadjuvante Therapie wurden die Auswirkungen der Therapie zusätzlich histomorphologisch beurteilt. Der Begriff der morphologisch faßbaren Tumorregression beschreibt die histologischen Veränderungen von Tumoren nach der Therapie. Für das im folgenden aufgelistete Regressionsgrading (Junker et al. 1997) konnte eine Bedeutung als prognostisch signifikanter Parameter für das in dieser Arbeit verwendete Material gezeigt werden. Die untersuchten Tumoren wurden auf verschiedene Kriterien hin beurteilt, unter anderem auf das Vorliegen und die Ausdehnung von vitalem Tumorgewebe, von Tumornekrosen und Vernarbungen sowie schaumzelliger Reaktion (Abbildung 3.1). Regressionsgrading Regressionsgrad I: Keine oder nur geringe spontane Tumorregression Regressionsgrad IIa: Unvollständige Tumorregression, mehr als 10% vitales Gewebe im Bereich des Primärtumors und/ oder großherdiger Befall der resezierten Lymphknoten Regressionsgrad IIb: Unvollständige Tumorregression, weniger als 10% vitales Gewebe im Bereich des Primärtumors und/ oder allenfalls kleinherdiger Befall der resezierten Lymphknoten Regressionsgrad III: Vollständige Tumorregression ohne Nachweis vitalen Tumorgewebes im Primärtumor und resezierten Lymphknoten Für Patienten mit einem nicht-kleinzelligen Lungentumor im Stadium III, die in den Operationspräparaten einen Regressionsgrad von IIb und III aufwiesen, konnte gezeigt werden, daß dies als signifikanter Parameter für eine längere Überlebenszeit galt. 26 Abbildung 3.1: Kokardenförmiger Herd mit zentraler therapieinduzierter Nekrosezone, umgebendem Schaumzellsaum, Übergang in gefäßreiches Granulationsgewebe und peripherer Vernarbung (Junker et al. 1997) 3.2.2 Immunhistochemische Untersuchungen Verwendete Antikörper Vascular endothelial growth factor (VEGF), polyklonal und monoklonal Der „Vascular endothelial growth factor“ (VEGF) ist ein dimeres Glykoprotein. Er wird für den wichtigsten Faktor der Tumorangiogenese gehalten. Mehrere Isoformen des VEGF sind beschrieben worden (Ferrara et al. 1991). Ihre mitogene Aktivität scheint sich auf Endothelzellen zu beschränken. Im Rahmen der für diese Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurde zum einen der polyklonale Antikörper VEGF (A-20) (Firma Santa Cruz Biotechnology, USA) eingesetzt, der aus gereinigten Kaninchen-Antikörpern (sc-152) besteht. Das KaninchenIgG bindet an die Aminosäuren 1-20 am Aminoende des VEGF menschlichen Ursprungs an. VEGF (A-20) reagiert mit den Aminosäuren der VEGF-Isoformen 165, 189 und 121. Zum anderen wurden mit VEGF (C-1) immunhistochemische Färbungen durchgeführt. Dies ist ein monoklonaler Mausantikörper (IgG1), ebenfalls hergestellt von der Firma Santa Cruz Biotechnology. Er korrespondiert mit den Aminosäuren 1-140 des humanen VEGF. VEGF (C-1) (sc-7269) reagiert mit dem VEGF von Ratte, Maus und 27 Mensch. Ob die Reaktion auf bestimmte Isoformen des VEGF beschränkt ist, ist zur Zeit laut Angaben der Firma nicht bekannt. Es gibt keine Kreuzreaktionen mit VEGF-B und VEGF-C. Zellmembran-Rezeptor-Tyrosinkinase (Flt-1) Die Zellmembran-Rezeptor-Tyrosinkinase Flt-1 ist beteiligt beim Wachstum von Gefäßendothelzellen. Sie ist charakterisiert durch 7 immunglobulinähnliche extrazellulär liegende Sequenzen. Flt-1 ist eng verwandt mit zwei anderen ebenfalls das Gefäßwachstum steuernden Tyrosinkinasen, Flk-1 und Flt-4. Bei Flt-1 und Flk-1 konnte gezeigt werden, daß sie eine hohe Affinität zu VEGF besitzen. Flt-1 (C-17) (sc-316) ist ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der gegen ein Peptid gerichtet ist, das mit den Aminosäuren 1312-1328 am carboxyterminalen Ende des Flt-1Vorläufers humanen Ursprungs korrespondiert. Er reagiert mit Flt-1 von Maus, Ratte und Mensch. Kreuzreaktionen mit anderen VEGF-Rezeptoren oder anderen Tyrosinkinasen existieren nicht. Die Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase (APAAP) Methode Für die immunhistochemischen Markierungen wurden zunächst 3-4 µm dicke Schnittpräparate des formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebes auf einen speziellen Kapillarspaltobjektträger der Firma DAKO aufgezogen. Daran anschließend wurden die Präparate über Nacht bei 37 Grad Celsius im Wärmeschrank getrocknet. Als nächster Schritt folgte die Entparaffinierung mit Xylol und die Rehydratation in einer absteigenden Isopropanol-Alkoholreihe( 100%, 96%, 70%) sowie eine Waschung in TrisPuffer (pH 7,2). In Abhängigkeit vom verwendeten Primärantikörper erfolgten unterschiedliche Vorbehandlungen zur Demaskierung der Antigenepitope. Bei der APAAP-Methode besitzt der Primärantikörper eine hohe Sensitivität auch schon für sehr geringe Konzentrationen des jeweiligen Antigens. Nach der Reaktion des Primärantikörpers mit dem Antigen wird der Sekundärantikörper, oder auch Brückenantikörper, zugesetzt. An diesen bindet dann der APAAP-Komplex (Abbildung 3.2). Zur Intensivierung der Reaktion können die letzten beiden Schritte auch mehrfach wiederholt werden (Cordell et al. 1984). Durch die Aktivität der alkalischen Phosphatase erhält man bei Zugabe eines Chromogens mit dem Farbstoff Neufuchsin eine rote 28 Farbreaktion. Die alkalische Phosphatase wirkt in diesem Fall als Katalysator auf das Substrat. Es kommt zu einer Komplexbildung von Enzym und Substrat, an die sich wiederum das Chromogen anlagert. APAAP-Komplex Link-Sekundärantikörper Primärantikörper Antigen Abbildung 3.2 Schematische Darstellung der APAAP-Methode (Noll und Schaub-Kuhnen 2000) Für den monoklonalen VEGF-Antikörper wurden die Schnitte in 1mM EDTA-Puffer (PH 8,0) 15 Minuten in der Mikrowelle bei 600 Watt vorbehandelt und anschließend für weitere 10 Minuten im warmen Puffer stehengelassen. Der polyklonale VEGF-Antikörper erforderte eine enzymatische Vorbehandlung des Gewebes. Hierfür wurden die Schnitte für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Proteinase K (0,4mg/ml, Fa. DAKO, Hamburg) behandelt. Der polyklonale Flt-1-Antikörper benötigte keine Vorbehandlung der Schnittpräparate. Die Bearbeitung der Schnittpräparate erfolgte ab hier automatisch mit Hilfe des Chem Mate 500 der Firma DAKO (Hamburg). Der Primärantikörper wurde in der jeweiligen Gebrauchsverdünnung für 25 Minuten bei Raumtemperatur aufgetragen. Anschließend wurde mit einer Pufferlösung (Puffer-Kit K5006, Fa. DAKO) gespült. Bei den polyklonalen Antikörpern wurde danach „mausifiziert“, d.h., es wurde mit mouse-anti-rabbit-Serum (MAR)(1:300 in Diluent verdünnt, Fa. DAKO) für 25 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Bei dem monoklonalen VEGF-Antikörper entfiel dieser Schritt. 29 Darauf wurden die Präparate gespült und für erneut 25 Minuten bei Raumtemperatur jetzt mit einem Link-Sekundärantikörper (Kit firma DAVO K5002) inkubiert. Nach dem Waschen in der Pufferlösung wurde für weitere 25 Minuten der APAAP-Komplex aufgebracht. Zur Verstärkung der Reaktion wurden nach Spülungen mit der Pufferlösung wiederholt Link-Sekundär-Antikörper und APAAP-Komplex für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur auf die Gewebeschnitte gegeben. Abschließend erfolgte nach Spülung mit der Pufferlösung die Färbung mit der Substratlösung (Chromogen Neufuchsin). Die Inkubationszeit betrug viermal 5 Minuten, wobei intermittierend immer wieder mit Puffer gespült wurde. Anschließend erfolgte die Kernfärbung mit Mayers-Hämatoxylin, danach das Bläuen der Präparate zunächst in Wasser und darauf in Aqua dest. Zuletzt wurden die Schnittpräparate in aufsteigender Alkoholreihe dehydriert und über Xylol mit Eukitt eingedeckt. Tabelle 3.1: Charakteristika der Primärantikörper (M = monoklonal, P = polyklonal) Antigen Antikörper VEGF VEGF Flt-1 Hersteller VEGF (A- Santa 20) Biotechnology VEGF (C-1) Santa Biotechnology Flt (C-17) Santa Biotechnology M/P Spezies Cruz P Cruz M Cruz P Isotyp Verdünnung Kaninchen IgG (sc152)2a Maus IgG 1 : 200 Kaninchen IgG (sc316) 1 : 30 1 : 400 Immunhistochemische Untersuchungen wurden für die polyklonalen Antikörper für VEGF und Flt-1 und den monoklonalen Antikörper für VEGF an jeweils einem Schnittpräparat pro Patient durchgeführt. Die Auswertung der immunhistochemischen Anfärbungen berücksichtigte sowohl die Färbeintensität als qualitative Beurteilung als auch den prozentualen Anteil der positiven Zellen (quantitativer Ansatz). Die Färbeintensität wurde in vier Abstufungen unterteilt: 0 für negativ, 1 für schwach, 2 für mittlere und 3 für stark positive Markierung der Zellen. Der prozentuale Anteil der positiven Zellen wurde ebenfalls in vier Abstufungen unterteilt: 0 bedeutete 0% positive Zellen, 1 bedeutete weniger als 25% 30 positive Zellen, 2 bedeutete 26-50% positive Zellen und 3 bedeutete mehr als 50% positive Zellen. Der entsprechende Immuno-Score bestand aus einer Summe der Färbeintensität (a) und des prozentualen Anteils (b). Die Summe aus a + b erreichte einen maximalen Score von 6. Ein Score größer als 4 wurde als positiver immunhistochemischer Befund gewertet (Mattern 1995; Takashi 1998). 3.3 Statistische Verfahren Zur Klärung der Abhängigkeit zweier klassifizierter Variablen wurden Vierfeldertafeln gebildet und die Prüfung auf statistische Signifikanz aufgrund der geringen Anzahl an Proben mit dem Fisher`s-Exact-Test durchgeführt. Verbundene dichotome Variablen wurden mit dem McNemar-Test untersucht. Zur Validierung und zum Vergleich der Überlebenszeit wurden Überlebenskurven nach Kaplan-Meier (1958) berechnet. Das Datum der Erstdiagnose (erste Histologie) war hier der Ausgangspunkt. Zum Vergleich verschiedener Merkmale und ihrer Auswirkungen hinsichtlich des Gesamtüberlebens wurde der log-rank-Test durchgeführt. Für alle Testverfahren wurde die Irrtumswahrscheinlichkeit p für den Fehler erster Art auf 5% festgelegt, d.h, ein p-Wert von p<0,05 wurde als signifikant angesehen. 31 4. Ergebnisse Für diese Arbeit wurde Untersuchungsgut eines Kollektivs von 32 Patienten untersucht, die im Rahmen einer Phase-II-Studie einer neoadjuvanten Radiochemotherapie unterzogen wurden. Das Durchschnittsalter betrug 57,4 Jahre. Bei 19 Patienten lag ausreichendes Material für die Untersuchungen an prätherapeutisch gewonnenem Gewebe vor. Es handelt sich dabei um 9 Bronchusbiopsien und um 10 Mediastinoskopien. Posttherapeutisch im Rahmen von Resektionen gewonnenes Material enthielt noch bei 25 Patienten genügend Material für die immunhistochemischen Untersuchungen. Von den 25 posttherapeutisch gewonnenen Proben waren 20 als R0-reseziert, 4 als R1- und eine Probe als R2-reseziert eingestuft worden. Bei 13 Patienten lag sowohl prä- als auch posttherapeutisch erworbenes Gewebe vor. 4.1 Ergebnisse der immunhistochemischen Markierung mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper Bei dem monoklonalen VEGF-Antikörper handelt es sich um einen monoklonalen Mausantikörper (IgG1). Dieser Antikörper korrespondiert mit den Aminosäuren 1-140 des humanen VEGF. Bei diesem Antikörper gab es positive Reaktionen des umgebenden Lungengewebes, wenn auch in weitaus geringerem Ausmaß als bei dem polyklonalen VEGF-Antikörper. Zu den markierten Strukturen gehörten Makrophagen, Plasmazellen, das Endothel der Gefäße, das Flimmerepithel der Bronchien, seltener Erythrozyten und Drüsenepithelien sowie Typ 2 Pneumozyten. Die mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper darstellbaren Zellen der Tumoren und des umgebenden Gewebes sind exemplarisch in den folgenden Abbildungen erfaßt (Abbildung 4.1 bis 4.5). 32 Abbildung 4.1: Plattenepithelkarzinom; männlich, 56 Jahre, Stadium IIIA. Darstellung mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper. T = Tumor Abbildung 4.2: Adenokarzinom; männlich, 52 Jahre, Stadium IIIB. Darstellung mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper. T = Tumor, E = Endothelzelle 33 Abbildung 4.3: Zytoplasmatische Markierung von Gefäßendothelien, männlich, 70 Jahre. Darstellung mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper. E = Endothelzellen, PZ = Plasmazellen, T = Tumor Abbildung 4.4: Zytoplasmatische Markierung von Makrophagen (MP) und Pneumozyten Typ 2 (P), männlich, 52 Jahre, Stadium IIIB. Darstellung mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper. Abbildung 4.5: Zytoplasmatische Markierung von Plasmazellen (PZ). Männlich, 70 Jahre. Darstellung mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper. 34 4.1.1 Ergebnisse an prätherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut Bei der immunhistochemischen Untersuchung wurden von 19 Patienten prätherapeutisch gewonnene Mediastinoskopien und Bronchusbiopsien markiert. Bei den Patienten handelte es sich um 15 Männer und 4 Frauen mit einem Durchschnittsalter von 57,0 Jahren. Bei 8 der Proben war das immunhistochemische Ergebnis positiv (42%), bei 11 Proben negativ. Insgesamt lagen 8 Adenokarzinome und 11 Plattenepithelkarzinome vor. Vor Therapie zeigten von diesen Tumoren 3 Adenokarzinome und 8 Plattenepithelkarzinome ein negatives, hingegen 5 Adenokarzinome und 3 Plattenepithelkarzinome ein positives Ergebnis gemäß dem oben dargestellten Score. Hinsichtlich der Geschlechtsverteilung, der oben dokumentierten führenden Histologie, des klinischen Stadiums sowie des T- und N-Stadiums ließen sich keine signifikanten Unterschiede zeigen. (Tab. 4.1) Von den 19 Patienten lagen bei 17 Patienten Daten zum Resektionsstatus nach Operation vor. Von den 13 Tumoren nach R0-Resektion waren 8 VEGF-negativ (62%) und nur 5 VEGF-positiv. Ein VEGF-positiver und zwei VEGF-negative Tumoren wurden R1reseziert. Kein VEGF-negativer Tumor wurde R2-reseziert. Bei dem Vergleich der mit dem monoklonalen Antikörper nachgewiesenen VEGFExpression mit dem histomorphologischen Regressionsverhalten zeigte sich ein statistisch signifikante Unterschied. Von den 10 als VEGF-negativ bewerteten Proben wurden 9 (90%) dem Regressionsgrad IIB-III zugordnet, von den VEGF-positiven Proben nur 2 (29%) von 7 Gewebeproben (Fisher´s Exact-Test, p=0,035). Eine signifikante Korrelation zwischen VEGF-Expression und klinischem Remissionsstatus ließ sich dagegen nicht nachweisen (Tab. 4.2). Beim Vergleich der Überlebenszeiten konnten für Patienten mit VEGF-negativen Tumoren gegenüber VEGF-positiven Tumoren statistisch signifikant längere Überlebenszeiten nachgewiesen werden (log-rank-Test, p=0,019) (Abbildung 4.6). Bei den Patienten nach R0-Resektion ließ sich allerdings kein signifikanter Unterschied bezüglich der Überlebenszeiten in Abhängigkeit von der VEGF-Expression nachweisen (log-rank-Test, p=0,15). Aber auch im Fall der Patienten nach R0-Resektion zeigten sich längere Überlebenszeiten bei den VEGF-negativen Tumoren. (Tab. 4.3) 35 Tabelle 4.1: Vergleich der VEGF-Expression (monoklonaler Antikörper) im prätherapeutisch gewonnenen Biopsiegut mit klinischen Patientendaten (Fisher´s Exact Test) VEGFmono+ VEGFmono- P Alter MW 54,3 59 Geschlecht 0,60 männlich 7 8 weiblich 1 3 Histologie 0,18 ADC 5 3 PEC 3 8 Stadium 0,18 IIIA 3 8 IIIB 5 3 T-Stadium 1,00 T0-2 6 8 T3-4 1 1 N-Stadium 1,00 N0-1 3 5 N2 4 4 Operation (R-Status) 1,00 R0 5 8 R1 1 2 R2 1 0 PEC=Plattenepithelkarzinom, ADC=Adenokarzinom Tabelle 4.2: Histomorphologisch bestimmter Regressionsgrad und klinisches Remissionsverhalten im Vergleich mit VEGF-Expressionen (monoklonaler Antikörper) in prätherapeutisch gewonnenem Biopsiegut (Fisher´s Exact Test) VEGFmono+ VEGFmono- P Regressionsgrading 0,035 RG I-IIA 5 1 RG IIB-III 2 9 Remission 1,00 PD/NC 2 2 PR/CR 6 9 36 1,2 1,0 geschätzte Wahrscheinlichkeit ,8 ,6 ,4 VEGF positiv ,2 VEGF negativ 0,0 0 1000 2000 3000 Tage Abbildung 4.6: Graphische Darstellung der Gesamtüberlebenszeit nach Kaplan und Meier in Abhängigkeit von der mit dem monoklonalen Antikörper nachgewiesenen prätherapeutischen VEGF-Expression Tabelle 4.3: Mediane Überlebenszeiten in Tagen aller Patienten und der Patienten nach R0-Resektion in Abhängigkeit von der VEGF-Expression in prätherapeutisch gewonnenen Biopsiepräparaten (monoklonaler Antikörper) (log-rank-Test) VEGF positiv VEGF negativ P Mediane Überlebenszeiten n=19 408 899 0,019 Mediane Überlebenszeiten R0-Resezierter n=13 483 899 0,15 37 4.1.2 Ergebnisse an posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut An nach Therapie erhaltenem Untersuchungsgut lag Gewebe von 25 Patienten vor, 23 Männern und 2 Frauen mit einem durchschnittlichen Alter von 57,2 Jahren. 18 (72%) der Proben zeigten ein negatives immunhistochemisches Ergebnis, 7 ein positives. Zusammengefaßt lagen nach Therapie Resektate von 6 Adenokarzinomen, 18 Plattenepithelkarzinomen und einem Mischtumor mit Anteilen sowohl eines Plattenepithelals auch eines Adenokarzinoms vor. Von diesen Tumoren wiesen nach Therapie 12 Plattenepithelkarzinome und 5 Adenokarzinome ein negatives, 6 Plattenepithel- und ein Adenokarzinom dagegen ein positives Resultat hinsichtlich der VEGF-Expression auf. Eine statistisch signifikante Abhängigkeit zwischen der Verteilung auf die führenden histologischen Typen oder der Stadieneinteilung und der VEGF-Expression ließ sich nicht nachweisen. 12 Tumoren werden dem Stadium IIIA, davon zwei als VEGF positiv und 10 als VEGF negativ beurteilt, und 13 Tumoren dem Stadium IIIB, davon 5 als positiv und 8 als negativ beurteilt, zugeordnet. In bezug auf die Geschlechtsverteilung, das T- sowie N-Stadium und die histologische Regressionsgraduierung ließ sich ebenfalls keine statistisch signifikante Aussage machen. (Tab. 4.4, 4.5) Entsprechend der klinischen Remissionsbeurteilung wurden die Tumoren in zwei Gruppen eingeteilt: fortschreitende Erkrankung/keine Veränderung (PD/NC) und partielle/komplette Remission (PR/CR). Im Vergleich mit der VEGF-Expression im posttherapeutisch gewonnenen Untersuchungsgut zeigte sich, daß von den 18 nach Therapie als VEGFnegativ beurteilten Tumorpräparaten 17 (94%) in der Gruppe partielle/komplette Remission zu finden waren. Die 7 mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper als positiv bewerteten Proben teilten sich auf in 4 der Gruppe PD/NC und drei der Gruppe PR/CR. Diese Ergebnisse in der klinischen Remissionsbeurteilung wurden statistisch als signifikant bewertet (p=0,012). Eine negative VEGF-Expression ging mit einem günstigeren Remissionsverhalten einher. In bezug auf das Überleben des Gesamtkollektivs ließ sich, wenn auch kein signifikantes Ergebnis, so doch ein Trend nachweisen. Patienten mit einem VEGF-negativen Resttumor zeigten die Tendenz zu einer längeren Überlebenszeit als Patienten mit einem VEGFpositiven Tumor (log-rank-Test, p=0,11). 38 Dieses zeigt sich auch in dem Kollektiv der Patienten nach R0-Resektion (Tab. 4.6). In dieser Gruppe ist die Überlebenszeit der Patienten mit VEGF-negativen Tumoren deutlich (log-rank-Test, p=0,09) günstiger als in der VEGF-positiven Vergleichsgruppe. (Abbildung 4.7) Bei 13 Patienten war ein direkter Vergleich von prä- und posttherapeutisch gewonnenem Material möglich. Die Verteilung der immunhistochemischen Ergebnisse erlaubte hier keine weiteren statistisch signifikanten Aussagen. (Tab. 4.7) Bei der Berücksichtigung der konkreten Score-Werte fällt auf, daß der Unterschied positiv-negativ bei den einzelnen Resultaten nicht in jedem Fall stark abweichend war, sondern Cut-off-bedingt sich in einigen Fällen nur durch einen Bewertungspunkt auszeichnete. So war in 3 Fällen der Unterschied zwischen der Bewertung vor und nach der Therapie nur ein Punkt, der aber in der Score-Wertung die Werte 4 oder 5 bedingte, also direkt im Cut-off-Bereich gelegen. 39 Tabelle 4.4: Vergleich der VEGF-Expression im posttherapeutisch gewonnenen Untersuchungsgut (monoklonaler Antikörper) mit klinischen Patientendaten (Fisher´s Exact Test) VEGFmono+ VEGFmono- P Alter MW 57,6 56,8 Geschlecht 1,00 Männlich 7 16 Weiblich 0 2 Histologie 0,59 ADC 1 5 PEC 6 12 PEC/ADC 0 1 Stadium 0,38 IIIA 2 10 IIIB 5 8 T-Stadium 0,50 T1-2 5 14 T3-4 1 1 N-Stadium 0,66 N0-1 3 10 N2 3 6 Operation (R-Status) 0,60 R0 5 15 R1 1 3 R2 1 0 PEC=Plattenepithelkarzinom, ADC=Adenokarzinom Tabelle 4.5: Histomorphologisches Remissionsverhalten (monoklonaler Regressionsgrading im Vergleich Antikörper) in mit und der klinisches VEGF-Expression posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut (Fisher´s Exact Test) VEGFmono+ VEGFmono- P Regressionsgrading 0,66 RG I-IIA 2 8 RG IIB-III 5 10 Remission 0,012 PD/NC 4 1 PR/CR 3 17 40 Tabelle 4.7: Vergleich der mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper im prä- und posttherapeutisch gewonnenen Untersuchungsgut erzielten Resultate (McNemar-Test) VEGF monoklonal Nach Therapie P negativ positiv vor Therapie 1,00 negativ 5 2 positiv 4 2 41 Tabelle 4.6: Mediane Überlebenszeiten in Tagen aller Patienten und der Patienten nach R0-Resektion in posttherapeutisch Abhängigkeit von der VEGF-Expression gewonnenen Untersuchungsgut im (monoklonaler Antikörper) (log-rank-Test) VEGF positiv VEGF negativ P Mediane Überlebenszeiten n=25 435 756 0,11 Mediane Überlebenszeiten R0-Resezierter n=20 435 928 0,09 1,2 1,0 geschätzte Wahrscheinlichkeit ,8 ,6 ,4 VEGF positiv ,2 VEGF negativ 0,0 0 1000 2000 3000 Tage Abbildung 4.7: Graphische Darstellung der Gesamtüberlebenszeit nach Kaplan und Meier der Patienten nach R0-Resektion in Abhängigkeit von der im posttherapeutisch gewonnenen Untersuchungsgut mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper nachgewiesenen VEGF-Expression 42 4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Markierung mit dem polyklonalen VEGFAntikörper Bei dem polyklonalen VEGF-Antikörper handelt es sich um einen aus gereinigten Kaninchenantikörpern bestehenden Antikörper. Er reagiert mit den Aminosäuren der VEGF-Isoformen 165, 189 und 121. Neben den Tumorzellen stellte der Antikörper auch verschiedene andere Zellen und Strukturen des normalen Lungengewebes dar, so unter anderem Makrophagen, die glatte Muskulatur der Gefäße und Bronchien, Drüsenepithelien, das Flimmerepithel der Bronchialschleimhaut, das Endothel der Gefäße, Nekrosezonen, Erythrozyten, Knorpel, Pneumozyten Typ 2 und Plattenepitheldysplasien. Am häufigsten von diesen Strukturen wurden Makrophagen, Flimmerepithel und das Endothel markiert. Beim Endothel waren bei positivem Befund sowohl Tumorgefäße als auch die Gefäße des den Tumor umgebenden Lungenparenchyms gleichermaßen dargestellt. Die mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper darstellbaren Zellen der Tumoren und des umgebenden Gewebes sind exemplarisch in den folgenden Abbildungen erfaßt (Abbildung 4.8 bis 4.12). 43 Abbildung 4.8: Plattenepithelkarzinom; männlich, 59 Jahre, Stadium IIIA. Darstellung mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper. T = Tumor Abbildung 4.9: Adenokarzinom; männlich, 52 Jahre, Stadium IIIB. Darstellung mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper. T = Tumor 44 Abbildung 4.10: Zytoplasmatische Markierung von Makrophagen (MP)und Pneumozyten Typ 2 (P); männlich, 52 Jahre. Darstellung mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper. Abbildung 4.11: Zytoplasmatische Markierung von Nervenfasern (N) und Muskelzellen (M); männlich, 52 Jahre; Darstellung mit dem polyklonalen VEGFAntikörper. E = Endothelzelle, G = Ganglienzelle Abbildung 4.12: Zytoplasmatische Markierung von Muskelzellen (M) und Drüsenausführungsgängen (D); männlich, 52 Jahre. Darstellung mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper. 45 4.2.1 Ergebnisse an prätherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut Für die immunhistochemischen Untersuchungen lagen wie bei den Untersuchungen mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper von 19 Patienten Proben vor Einleitung der neoadjuvanten Therapie vor. Es handelte sich bei den Tumoren um 8 Adenokarzinome und 11 Plattenepithelkarzinome. Bis auf ein Plattenepithelkarzinom zeigten bei der Markierung mit diesem Antikörper alle übrigen Tumoren eine positive Reaktion. Durch diese geringen Unterschiede im immunhistochemischen Ergebnis konnten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich des Alters, des Geschlechts, der Histologie, des klinischen Stadiums und des T- oder N-Stadiums nachgewiesen werden. (Tab. 4.8) Ebenso konnten für das Kollektiv aller Patienten, bei denen die Untersuchung an prätherapeutisch gewonnenem Material mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper vorlag, keine signifikanten Aussagen bezüglich des klinischen Remissionsverhaltens und histomorphologischer Regressionsphänomene vorgenommen werden (Tab. 4.9). Das als negativ in der immunhistochemischen Darstellung beurteilte Plattenepithelkarzinom wies ausgeprägte Regressionsphänomene auf (Regressionsgrading IIB-III) und konnte R0reseziert werden. Zum Überleben in Abhängigkeit von der mit dem polyklonalen Antikörper bestimmten VEGF-Expression kann keine Aussage mit Hilfe der Schätzungen nach Kaplan und Meier gemacht werden. Der Vergleich des VEGF-Nachweises im prätherapeutisch gewonnenen Untersuchungsgut mit monoklonalen und den polyklonalen VEGF-Antikörpern erbrachte keine signifikante Korrelation. (Tab. 4.10) 46 Tabelle 4.8: Vergleich der Befunde des prätherapeutisch gewonnenen Untersuchungsgutes mit dem polyklonalen Antikörper zur VEGFExpression mit klinischen Patientendaten VEGFpoly+ VEGFpolyMW 56,8 60 Alter Geschlecht männlich weiblich Histologie ADC PEC Stadium IIIA IIIB T-Stadium T0-2 T3-4 N-Stadium N0-1 N2 Operation (R-Status) R0 R1 R2 14 4 1 0 8 10 0 1 11 7 0 1 13 2 1 0 7 8 1 0 12 3 1 1 0 0 PEC=Plattenepithelkarzinom, ADC=Adenokarzinom, Tabelle 4.9: Histomorphologisches Remissionsverhalten Regressionsgrading im Vergleich mit der und klinisches VEGF-Expression in prätherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut (polyklonalen Antikörper) VEGFpoly+ VEGFpolyRegressionsgrading RG I-IIA RG IIB-III Remission PD/NC PR/CR 6 10 0 1 4 14 0 1 47 Tabelle 4.10: Vergleich der VEGF-Markierung in prätherapeutisch gewonnenem Biopsiegut durch monoklonale und polyklonale Antikörper (Fisher´s Exact Test) VEGF (monoklonal) vor Therapie P VEGF (polyklonal) Negativ Negativ 1 Positiv 0 vor Therapie Positiv 10 8 1,00 48 4.2.2 Ergebnisse an posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut Posttherapeutisch gewonnenes Material wurde von 26 Patienten untersucht, 24 männlichen und 2 weiblichen, mit einem Altersdurchschnitt von 57,2 Jahren. Bei den Tumoren handelt es sich um 6 Adenokarzinome, 19 Plattenepithelkarzinome und einen Mischtumor mit Anteilen sowohl eines Plattenepithel- als auch eines Adenokarzinoms. Der polyklonale VEGF-Antikörper war bei dem adenosquamösen Karzinom, bei 10 Plattenepithelkarzinomen und 3 Adenokarzinomen positiv (53,8%). Negativ bei der Markierung blieben die restlichen drei Adeno- und 9 Plattenepithelkarzinome. Es ließen sich keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Alters, des Geschlechts, des histologischen Typs, des klinischen Stadiums sowie des T- und NStadiums nachweisen (Tab. 4.11). Bei den 26 Operationsresektaten konnten bei Korrelation hinsichtlich des klinischen Remissionsverhaltens und des histomorphologischen Tumorregressionsgradings in Abhängigkeit vom VEGF-Status keine signifikanten Unterschiede aufgezeigt werden. (Tab. 4.12) Auch bei der statistischen Auswertung hinsichtlich möglicher Aussagen zu den Überlebenszeiten wurde kein signifikantes Ergebnis gefunden. Ein identisches Ergebnis ergab sich bei der Untersuchung des Kollektivs der Patienten nach R0-Resektion. (Tab. 4.13) Von 13 Patienten lagen Präparate sowohl von Bronchusbiopsien und Mediastinoskopien als auch vom Resektatmaterial für einen direkten Vergleich zwischen prä- und posttherapeutischer VEGF-Expression vor. Die statistische Auswertung der Daten zu diesem Material (Tab. 4.14) wurde aufgrund der am prätherapeutisch gewonnenen Untersuchungsgut ermittelten Ergebnisse mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper nicht durchgeführt. 49 Tabelle 4.11: Vergleich der VEGF-Expression posttherapeutisch gewonnenem (polyklonalen Untersuchungsgut Antikörper) mit in klinischen Patientendaten (Fisher´s Exact Test) VEGFpoly+ VEGFpoly- P Alter MW 58,5 55,7 Geschlecht 1,00 Männlich 13 11 Weiblich 1 1 Histologie 0,64 ADC 3 3 PEC 10 9 PEC/ADC 1 Stadium 0,70 IIIA 6 7 IIIB 8 5 T-Stadium 0,48 T1-2 9 10 T3-4 2 0 N-Stadium 0,42 N0-1 6 7 N2 6 3 Operation (R-Status) 0,32 R0 9 11 R1 3 1 R2 1 0 PEC=Plattenepithelkarzinom, ADC=Adenokarzinom Tabelle 4.12: Mediane Überlebenszeiten aller Patienten und der Patienten nach R0Resektion in Abhängigkeit von der an posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut mit dem polyklonalen Antikörper ermittelten VEGFExpression (log-rank-Test) in Tagen VEGF positiv VEGF negativ P Mediane Überlebenszeiten n=26 501 483 0,54 Mediane Überlebenszeiten R0-Resezierter n=20 899 756 0,98 50 Tabelle 4.13: Histomorphologisches Remissionsverhalten gewonnenen Regressionsgrading im Vergleich Untersuchungsgut mit mit dem und der im klinisches posttherapeutisch polyklonalen Antikörper ermittelten VEGF-Expression (Fisher´s Exact Test) Regressionsgrading RG I-IIA RG IIB-III Remission PD/NC PR/CR VEGFpoly+ VEGFpoly- P 0,69 6 4 7 8 0,65 4 2 10 10 Tabelle 4.14: Mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper an prä- und posttherapeutisch gewonnenem Gewebe erzielte Resultate VEGF polyklonal nach Therapie negativ positiv vor Therapie negativ 1 0 positiv 6 6 51 4.3 Ergebnisse der immunhistochemischen Markierung mit dem polyklonalen Flt-1Antikörper Bei dem polyklonalen Flt-1-Antikörper handelt es sich um einen polyklonalen Kaninchenantikörper, der gegen ein Peptid gerichtet ist, das mit den Aminosäuren 13121328 des carboxyterminalen Endes das Flt-1 Vorläufers humanen Ursprungs korrespondiert. Wie bei den anderen Antikörpern gab es auch in diesem Fall positive Reaktionen des umgebenden Lungengewebes. Der Flt-1-Antikörper war unter anderem positiv bei glatter Muskulatur, Erythrozyten, Bronchialepithel, Drüsenepithel, Gefäßendothel, Knorpel, Makrophagen und Typ 2 Pneumozyten. Auffällig war die meist sehr starke Markierung von Verhornungen bei den Plattenepithelkarzinomen und den meist zentral in den Tumoren liegenden Nekrosen. In dem direkt an die Nekrosezonen angrenzenden Tumorstroma war die Markierung für Flt-1 in der Mehrzahl der untersuchten Gewebe negativ, häufig waren dagegen bei diesen Fällen die an das erhaltene Bindegewebe grenzenden Ränder dieser Tumoren stark positiv. Die mit dem polyklonalen Flt-1-Antikörper darstellbaren Zellen in Tumoren und umgebendem Gewebe sind exemplarisch in den folgenden Abbildungen erfaßt (Abbildung 4.13 und 4.14). 52 Abbildung 4.13: Plattenepithelkarzinom, männlich, 59 Jahre, Stadium IIIA. Darstellung mit dem Flt-1-Antikörper. T = Tumor Abbildung 4.14: Zytoplasmatische Markierung von Muskelzellen (M) der Media. Männlich, 59 Jahre. Darstellung mit dem Flt-1-Antikörper. 53 4.3.1 Ergebnisse an prätherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut Bei der immunhistochemischen Untersuchung wurde wiederum von 19 Patienten prätherapeutisches Material untersucht, und zwar das Material von 15 Männern und 4 Frauen mit einem durchschnittlichen Alter von 57,0 Jahren. Bei der histologischen Untersuchung waren 12 Präparate negativ und 7 (37%) positiv. Bei der Stadienunterteilung waren 8 Präparate des Stadiums IIIA und 4 des Stadiums IIIB negativ. Positiv waren hingegen 3 Tumoren im Stadium IIIA und 4 im Stadium IIIB. In diesem Fall sowie auch bei der Verteilung auf die Geschlechter, die Histologie und das T- und N-Stadium gab es wie bei allen vorherigen Untersuchungen zu diesen Parametern kein statistisch signifikantes Ergebnis. (Tab. 4.15) Die Zuordnung der als Flt-1-negativ und Flt-1-positiv beurteilten Proben in die Gruppen des histologischen Regressionsverhaltens und des klinischen Remissionsverhaltens ergab keine statistisch signifikante Korrelation. (Tab. 4.16) Bei der Beurteilung des Gesamtüberlebens dieses Kollektivs von 19 Patienten waren mit einem p=0,82 (log-rank-Test) keine signifikant unterschiedlichen Überlebenszeiten bezüglich der Flt-1-Expression nachzuweisen. Dieses Ergebnis stimmte mit den Ergebnissen bei der Untersuchung der Gruppe der Patienten nach R0-Resektion überein. (Tab. 4.17) Zwischen der an prätherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut immunhistochemisch nachgewiesenen Flt-1-Expression und der mit dem polyklonalen (Tab. 4.18) oder dem monoklonalen (Tab. 4.19) Antikörper nachgewiesenen VEGF-Expression ließ sich eine statistisch signifikante Abhängigkeit nicht nachweisen. 54 Tabelle 4.15: Vergleich der Flt-1-Expression im prätherapeutisch gewonnenen Biopsiegut mit klinischen Patientendaten (Fisher´s Exact Test) Flt-1+ Flt-1 - P Alter MW 54,1 58,6 Geschlecht 0,38 männlich 4 11 weiblich 3 1 Histologie 1,00 ADC 3 5 PEC 4 7 Stadium 0,38 IIIA 3 8 IIIB 4 4 T-Stadium 1,00 T0-2 5 9 T3-4 1 1 N-Stadium 0,12 N0-1 1 7 N2 5 3 Operation (R-Status) 0,60 R0 6 7 R1 0 3 R2 1 0 PEC=Plattenepithelkarzinom, ADC=Adenokarzinom Tabelle 4.16: Histomorphologisch Remissionsverhalten bestimmter im Regressionsgrad Vergleich mit der und klinisches Flt-1-Expression in prätherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut (Fisher´s Exact Test) Regressionsgrading RG I-IIA RG IIB-III Remission PD/NC PR/CR Flt-1 + Flt-1- P 0,64 3 3 4 7 0,60 2 2 5 10 55 Tabelle 4.17: Mediane Überlebenszeiten in Tagen aller Patienten und der Patienten nach R0-Resektion in Abhängigkeit von Flt-1-Expressionen in prätherapeutisch gewonnenen Biopsiepräparaten (log-rank-Test) Flt-1 positiv Flt-1 negativ P Mediane Überlebenszeiten n=19 676 703 0,82 Mediane Überlebenszeiten R0-Resezierter n=13 676 756 0,66 Tabelle 4.18: Abhängigkeit zwischen Untersuchungsgut der ermittelten an prätherapeutisch Expression von VEGF gewonnenem (polyklonaler Antikörper) und Flt-1 (Fisher´s Exact Test) VEGF poly+ VEGFpoly- P Flt-1 positiv 7 0 Negativ 11 Tabelle 4.19: Abhängigkeit 1,00 1 zwischen der an prätherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut ermittelten Expression von VEGF (monoklonaler Antikörper) und Flt-1 (Fisher´s Exact Test) VEGF mono+ VEGFmono- P Flt-1 positiv 3 4 negativ 5 7 1,00 56 4.3.2 Ergebnisse an posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut Von 26 Patienten, davon 24 Männer und zwei Frauen mit einem Durchschnittsalter von 57,2 Jahren, wurde Resektatmaterial in der Immunhistochemie mit dem polyklonalen AntiFlt-1-Antikörper untersucht. Bei diesem Material handelte es sich um 6 Adeno- und 19 Plattenepithelkarzinome sowie den schon mehrmals erwähnten Mischtumor. In der Immunhistochemie positiv war ein Plattenepithelkarzinom (5%) eines männlichen Patienten. Die restlichen Tumoren wurden nach dem angewandten Score als negativ bewertet. Der immunhistochemisch als positiv beurteilte Tumor befand sich im Stadium IIIA. Die restlichen Tumoren waren gleichmäßig, aber nicht signifikant auf die Stadien verteilt (12 befanden sich im Stadium IIIA und 13 im Stadium IIIB). Es ließen sich hinsichtlich des Alters, des Geschlechts, der histologischen Tumorart, des Tsowie N-Stadiums, des histomorphologischen Regressionsgradings und des klinischen Remissionsverhaltens keine signifikanten Unterschiede nachweisen. (Tab. 4.20, Tab. 4.21) Bei der Überlebensanalyse waren sowohl für das Gesamtkollektiv als auch für das kleinere Kollektiv der Patienten nach R0-Resektion keine signifikant unterschiedlichen Überlebenszeiten aufzuzeigen. (Tab. 4.22) Bei dem Vergleich der 13 Gewebeproben, an denen prä- und posttherapeutische Untersuchungen durchgeführt werden konnten, fiel auf, daß von den 6 vor Therapie als Flt1-positiv bewerteten nach Therapie nur noch eine Probe als positiv in der immunhistochemischen Untersuchung beurteilt wurde. (Tab. 4.23) Beim Vergleich der Score-Werte zeigt sich, daß bei vier dieser in der Bewertung von positiv zu negativ veränderten Proben der Unterschied einen Bewertungspunkt ausmacht. Diese vier Proben sind mit ihrer Bewertung direkt im Cut-Off-Bereich gelegen. Bei den negativ beurteilten Gewebeproben änderte sich nichts in der Beurteilung. Sowohl in den Biopsien als auch in den Resektaten waren die gleichen Proben negativ. In der statistischen Auswertung ergab sich eine grenzwertig signifikante Aussage (p=0,063). 57 Tabelle 4.20: Vergleich der Flt-1-Expression in posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut mit klinischen Patientendaten Flt-1 + Flt-1 - P Alter MW 59 57,1 Geschlecht 1,00* männlich 1 23 weiblich 2 Histologie 1,00 ADC 0 6 PEC 1 18 PEC/ADC 0 1 Stadium 1,00 IIIA 1 12 IIIB 0 13 T-Stadium 1,00 T1-2 1 18 T3-4 0 2 N-Stadium 0,41 N0-1 0 13 N2 1 8 Operation (R-Status) 1,00 R0 1 19 R1 0 4 R2 0 1 PEC=Plattenepithelkarzinom, ADC=Adenokarzinom Tabelle 4.21: Histomorphologisches Remissionsverhalten Regressionsgrading im Vergleich mit der und klinisches Flt-1-Expression in posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut (Fisher´s Exact Test) Flt-1 + Flt-1 - p Regressionsgrading 1,00 RG I-IIA 0 10 RG IIB-III 1 14 Remission 0,23 PD/NC 1 5 PR/CR 0 20 58 Tabelle 4.22: Mediane Überlebenszeiten in Tagen aller und der Patienten nach R0Resektion in Abhängigkeit von der Flt-1-Expression in posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut (log-rank-Test) Flt-1 positiv Flt-1 negativ P Mediane Überlebenszeiten n=25 435 899 0,52 Mediane Überlebenszeiten R0-Resezierter n=20 435 703 0,35 Tabelle 4.23: Vergleich der mit dem Flt-1-Antikörper an prä- und posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut erzielten Resultaten (McNemar-Test) Flt-1 nach Therapie P negativ positiv vor Therapie 0,063 negativ 7 0 positiv 5 1 59 5. Diskussion Die Prognose für Patienten mit einem nicht-kleinzelligen Lungentumor ist mit einer FünfJahres-Überlebensrate zwischen 8 und 13% nach wie vor als ungünstig einzustufen (Mountain 1997). Es sind verschiedene Parameter bekannt, die mit einer schlechteren Prognose korrelierbar sind. Zu diesen gehören das Stadium des jeweiligen Tumors nach der TNM-Klassifikation, sein Differenzierungsgrad und der histologische Subtyp. Auch Alter und Geschlecht sowie der Allgemeinzustand stellten sich als relevant für die Aussage bezüglich der zu erwartenden Überlebenszeit des Patienten heraus. In dieser Arbeit wird ein Kollektiv von Patienten untersucht, deren Tumoren nach dem klinischen Staging dem Stadium IIIA oder IIIB zugeordnet wurden. Ungefähr 30% der Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren werden erst in diesem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert. Abhängig von dem Befall der Lymphknoten sinkt die Fünf-Jahres-Überlebensrate bei diesem Kollektiv auf unter 10% (Bunn et al. 1998). Verschiedene Studien beschäftigen sich mit der Überprüfung von Therapien, die eine Verbesserung der Überlebensraten in dieser Patientengruppe ermöglichen sollen. Gleichzeitig werden mögliche Prognosefaktoren analysiert. Prognosefaktoren bei Tumoren dienen vielen Zwecken (Wiethege et al. 2000). Sie sind zum einen notwendig, um die natürliche Entwicklung der Tumoren zu verstehen und um hinsichtlich eines Parameters homogene Patientengruppen identifizieren zu können. Zum anderen beinhalten sie die Möglichkeit, Gruppen von Patienten mit zu erwartenden günstigeren oder ungünstigeren Ergebnissen zu charakterisieren und damit den Erfolg einer Therapie vorherzusagen und entsprechende Nachfolgestrategien planen zu können (Volm et.al. 1998). Eine große Zahl an möglichen Prognosefaktoren für die Gruppe der Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren wurde untersucht. Bisher wies keiner der untersuchten Faktoren die erforderliche Selektivität auf, um als suffizienter Prognosefaktor dienen zu können (Junker 2001). Das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Gewebe von insgesamt 32 Patienten entstammt einer Phase-II-Studie, in der ursprünglich 54 Patienten mit lokoregionär fortgeschrittenen nicht-kleinzelligen Tumoren mit einem neoadjuvanten multimodalen Therapieansatz behandelt wurden. Die Therapie bestand aus der Kombination einer präoperativen Chemotherapie mit Carboplatin, Ifosfamid und Etoposid und darauf folgender hyperfraktionierter akzelerierter Radiotherapie mit simultaner Chemotherapie mit Carboplatin und Vindesin. 60 Anhand dieses Studienkollektivs konnte gezeigt werden, daß unter anderem die therapieinduzierte Tumorregression einen relevanten Prognosefaktor darstellt. Die Tumorregression wird dabei in 4 Grade eingeteilt. Grad I beschreibt die spontane Tumorregression, bei Grad IIa enthalten die Proben mehr als 10%, bei Grad IIb weniger als 10% vitales Tumorgewebe. Bei Grad III liegt eine komplette Tumorregression vor, kein vitales Tumorgewebe ist mehr nachweisbar. Untersuchungen am Studienmaterial zeigten, daß ein Regressionsgrad von IIb/III, also insgesamt weniger als 10% vitales Tumorgewebe, mit einer signifikant längeren Überlebensdauer einherging (Junker et al. 2001). An dem sowohl vor als auch nach der Therapie gewonnenem Material wurde im Rahmen dieser Arbeit die Bedeutung des Vascular Endothelial Growth Factors und eines seiner Rezeptoren, dem Flt-1-Rezeptor, im Hinblick auf eventuelle prognostische Relevanz immunhistochemisch untersucht. Dieser Faktor spielt eine wichtige Rolle in der Neovaskularisierung. Die Neovaskularisierung ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung des Tumorwachstums, da sie sowohl die Sauerstoffversorgung und die Nährstoffperfusion als auch die Entfernung von Stoffwechselendprodukten ermöglicht. Wachstumsfaktoren können die Tumorentwicklung und –progression durch mehrere Mechanismen regulieren. Dies beinhaltet autonomes unkontrolliertes Wachstum infolge einer autokrinen Produktion endogener Wachstumsfaktoren, die spezifische auf Tumorzellmembranen lokalisierte Rezeptoren aktivieren. Dieser Mechanismus liegt z.B. bei der Induktion der Tumorvaskularisation vor. Durch von Tumorzellen sezernierten angiogene Wachstumsfaktoren erfolgt die parakrine Stimulation von normalen endothelialen Zellen. Wichtigster parakriner Mediator der Angiogenese ist der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). Bei den nicht-kleinzelligen Lungentumoren existieren für den Vascular Endothelial Growth Factor verschiedene Studien mit abweichenden Ergebnissen in bezug auf seine Bedeutung als Prognoseparameter. 5.1 Mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper erzielte Resultate VEGF ist ein homodimeres Glykoprotein mit einer relativen molekularen Masse von 34000-42000 Dalton (Keck 1989), dessen Gen auf Chromosom 6 liegt. Durch alternatives 61 Splicing entstehen mehrere nach ihren Aminosäuresequenzen benannte Isoformen des VEGF. VEGF erhöht die Gefäßpermeabilität und stimuliert direkt das Wachstum von Endothelzellen sowie die Angiogenese. In Tumorgeweben findet eine Steigerung der VEGF-Produktion vor allem in den hypoxischen Bereichen wie im Tumorzentrum, angrenzend an Tumornekrosen oder am Tumorrand statt (Giatromanolaki et al. 2000). VEGF wird für einen der wichtigsten die Angiogenese fördernden Stoffe gehalten, unter anderem auch weil die spezifische Inhibition durch Antikörper von VEGF die Tumorvaskularisation vermindert und wesentlich das primäre Tumorwachstum in vivo hemmt (Kim et al. 1993, Harmey et al. 2002). Die Gruppe um Mattern untersuchte an 91 menschlichen Plattenepithelkarzinomen der Lunge den Zusammenhang zwischen der Expression von VEGF und der intratumoralen Gefäßdichte sowie der Proliferation der Tumorzellen (Mattern et al. 1996). Die Patienten hatten ein durchschnittliches Alter von 59 Jahren. Die Tumoren wurden den Stadien I (15%), II (11%) und III (74%) zugeordnet. Bei der statistischen Analyse fand sich bei dem Vergleich der immunhistochemischen Markierung mit dem VEGF-Antikörper und dem PCNA-Antikörper (proliferating cell nuclear antigen) in den VEGF-positiven Tumoren eine signifikant ausgeprägtere Markierung mit dem Antikörper, der zum Nachweis der Tumorzellproliferation benutzt wurde (Wilcoxon rank sum test, p<0,0001). Zusätzlich fanden Mattern et al. eine signifikante Korrelation zwischen zunehmendem PCNAMarkierungsindex und steigendem VEGF-Score (Jonckheere Test, p<0,0001). Die Mikrogefäßdichte korrelierte ebenfalls positiv (Wilcoxon test, p<0,05) mit der VEGFExpression. Sie war signifikant größer in VEGF-positiven Tumoren als in VEGFnegativen Tumoren. Diese Ergebnisse deuten an, daß die Proliferation dieser Tumoren eng in Beziehung zu ihrer VEGF-Expression steht. VEGF wirkt diesen Daten zufolge in Lungentumoren als Wachstumsfaktor für die Endothelzellen der Gefäße. 5.1.1 Methodik Die VEGF-Expression in Tumoren ist mit verschiedensten Methoden untersucht und bewertet worden. Dazu gehören Methoden wie die Immunhistochemie (Yamazaki et al. 1994), Enzym-Immunoessays (Toi et al 1996), in-situ-Hybridisierung (Paley et al. 1997) und Northern Blot Analyse (Samoto et al. 1995). 62 Unabhängig von der benutzten Methode existieren Grenzen in bezug auf die Aufdeckung feiner Unterschiede in der Genexpression. Hinweisend auf diese Unterschiede ist die Heterogenität der VEGF-Expression schon innerhalb eines einzigen Paraffinblockes oder resezierten Gewebes (Paley et al. 1997; Takahashi et al. 1997). Eine Ursache für die Heterogenität der VEGF-Expression ist die Tendenz entzündeten, hypoxischen oder fibrosierten Gewebes, mit einer erhöhten VEGF-Expression zu reagieren. Dieser Zustand liegt gerade auch in den Randgebieten und zentralen Anteilen von Tumoren vor. Diese Beobachtungen tragen mit zur Diskussion darüber bei, ob VEGF als ein genereller unabhängiger Prognosefaktor für nicht-kleinzellige Lungentumoren Anwendung finden kann oder nicht. Zum immunhistochemischen Nachweis von VEGF an formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Material stand für diese Arbeit ein monoklonaler Mausantikörper (IgG1), (Firma Santa Cruz Biotechnology, USA), zur Verfügung. Er korrespondiert mit den Aminosäuren 1-140 des humanen VEGF. Nach Immunlokalisation ist die VEGF-Expression in der Literatur nach unterschiedlichen Kriterien bewertet worden. Enthalten sind unter anderem die Beurteilung allein nach dem Prozentsatz der markierten Zellen (Fontanini et al. 1998), nach der Intensität der Reaktion und auch nach verschiedenen Kombinationen dieser beiden (Volm et al. 1998; Shibusa et al. 1998). Ein Score aus dem Anteil der markierten Zellen und der Intensität der Markierung wird in einigen Studien durch Multiplikation (Baillie et al. 2001), in anderen durch Addition der Einzelergebnisse (Shibusa et al. 1998) errechnet. Auch bei Anwendung identischer Scores unterscheiden sich die einzelnen Studien in den Festlegungen von positiven und negativen Ergebnissen, so daß Vergleiche der verschiedenen Publikationen schwierig durchzuführen sind. 5.1.2 Korrelation mit klinischen Parametern Von den untersuchten prätherapeutischen Proben waren 28% der Plattenepithelkarzinome und 62% der Adenokarzinome positiv für VEGF. Der Prozentsatz der VEGF-positiven Plattenepithelkarzinome ist niedriger als in verschiedenen veröffentlichten Studien, die im Durchschnitt 58% der Tumoren als positiv darstellen konnten (Mattern et al. 1996; Giatromanolaki et al. 1998). Bei den Adenokarzinomen finden sich in der Literatur im Vergleich zur vorliegenden Arbeit ähnliche Prozentangaben bei der immunhistochemischen Markierung. Giatromanolaki et al. (1998) fanden in 58% der 63 untersuchten Adenokarzinome eine deutliche VEGF-Expression, ebenso Takanami et al. (1997). Posttherapeutisch waren die positiven Markierungen für VEGF bei den Adenokarzinomen wesentlich geringer ausgeprägt. Von den untersuchten Adenokarzinomen waren nur 20% positiv. Dieser geringere Prozentsatz an als positiv bei der VEGF-Markierung bewerteten Adenokarzinomen kann teilweise durch den Cut-off des verwendeten Scores erklärt werden. Bei der Berücksichtigung der Score-Werte finden sich mehrere Fälle, die mit Score-Wert 4 beurteilt und so um einen Score-Punkt von der als positiv anzusehenden Wertung entfernt als negativ eingestuft wurden. Bei den Plattenepithelkarzinome blieb die Rate der positiven Tumoren mit posttherapeutisch 32% nahezu konstant. 5.1.2.1 Vergleich der an prä- und posttherapeutisch gewonnenem Untersuchungsgut ermittelten VEGF-Expression Der direkte Vergleich der prä- und posttherapeutischen VEGF-Expression bei den 13 Fällen, von denen entsprechendes Material vorlag, zeigte keine signifikanten Veränderungen. Vier Tumoren (30%) änderten ihren VEGF-Status und waren nach der Therapie negativ für VEGF. Bei einer Probe änderte sich die VEGF-Markierung nach der Therapie in positiv für VEGF. Bei acht der Tumoren änderte sich die Expression des VEGF-Proteins unter der Therapie nicht. Insgesamt kann man von einer Zunahme der VEGF-negativen Tumoren nach der Therapie sprechen, auch wenn sich nur eine Tendenz und kein signifikantes Ergebnis abzeichnet. In der Literatur gibt es zur Veränderung der VEGF-Expression im Vergleich der prä- und posttherapeutischen Ausprägung keine entsprechenden Arbeiten, so daß hier noch ein Bedarf an weiteren Untersuchungen besteht. Dies gilt besonders im Hinblick auf die Möglichkeit der Validierung eines weiteren Faktors für die Beurteilung des Ansprechens auf bestimmte Therapien und einer daraus ableitbaren günstigeren oder schlechteren Prognose bei den jeweiligen Veränderungen. 5.1.2.2 Geschlechtsverteilung, histologischer Typ und Tumorstadium Bei der Auswertung der Ergebnisse ließen sich sowohl an prä- als auch an posttherapeutischem Material hinsichtlich der Geschlechtsverteilung, der Histologie (Adeno- versus Plattenepithelkarzinom), des klinischen Stadiums (IIIA versus IIIB) und 64 des T- (T1-2 versus T3-4) und N-Stadiums (N0-1 versus N2) keine signifikanten Unterschiede beim Vergleich der VEGF-negativen und -positiven Proben feststellen. Dieses Ergebnis stimmt mit der Studie von Yano et. al (2000) überein. Diese Arbeitsgruppe untersuchte die Tumoren von 108 Patienten aus allen klinischen Stadien. 73% der Patienten waren Männer, 27% Frauen. Der Altersdurchschnitt betrug 62,8 Jahre. Die Tumoren teilten sich in 37% Plattenepithelkarzinome, 47% Adenokarzinome und 16% großzellige Tumoren auf. Im Rahmen der statistischen Auswertung fand die Arbeitsgruppe ebenfalls keine signifikanten Korrelationen für VEGF-Expression und Geschlecht, Differenzierung und Stadium. Allerdings konnte sie im Unterschied zu der in dieser Arbeit untersuchten Population zeigen, daß die VEGF-Expression in Adenokarzinomen signifikant ausgeprägter war als in den anderen Tumoren. Ähnliche Resultate erzielte die Gruppe um Baillie et al. (2001). Sie arbeitete mit einem Kollektiv von 81 Patienten, die nicht-kleinzellige Lungentumoren aus den Stadien I bis IIIa aufwiesen. Bei diesen Untersuchungen fanden sie zwar im Unterschied zu Yano et al. (2000) keine signifikant ausgeprägtere VEGF-Expression in einem bestimmten Tumortyp (untersucht wurden Adenokarzinome und Plattenepithelkarzinome), im übrigen fanden sie aber übereinstimmend mit den in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnissen ebenfalls keine signifikant unterschiedlichen Ergebnisse bei der Korrelation von VEGFExpression und Geschlecht, dem klinischen Stadium sowie dem T- oder N-Stadium der Tumoren. 5.1.2.3 Resektionsstatus Auch die Verteilung des Resektionsstatus, der bei 17 der 19 prätherapeutisch untersuchten Proben bekannt war, ergab kein signifikant unterschiedliches Ergebnis. Nur eine Tendenz zeichnete sich ab. So waren von den 13 Tumoren nach R0-Resektion 8 VEGF-negativ (62%) und nur 5 VEGF-positiv. Keiner der VEGF-negativen Tumoren mußte R2-reseziert werden. Hier ging die immunhistochemisch nicht nachzuweisende VEGF-Expression mit einer für die Prognose des Patienten günstigeren Resektion einher. Bei der statistischen Untersuchung des posttherapeutischen resezierten Materials ergab sich keine signifikante Aussage hinsichtlich des Resektionsstatus (Fisher´s Exact Test, p=0,60). Bei der Literaturrecherche fanden sich keine Studien mit vergleichbaren Aussagen. Die Schlußfolgerung, daß die Kombination aus VEGF-Negativität und R0-Resektion günstiger für den Patienten sei, ließ sich mit der Überlebensanalyse nach Kaplan und Meier nicht als signifikante Aussage darstellen. Bei den Überlebenszeiten zeigte sich nur der 65 Trend zu längeren Überlebenszeiten bei Patienten nach R0-Resektion mit VEGF-negativen Tumoren (mediane Überlebenszeit 899 Tage) gegenüber Patienten nach R0-Resektion mit VEGF-positiven Tumoren (mediane Überlebenszeit 483 Tage) ab (log-Rank-Test p=0,15). 5.1.2.4 Klinische Tumorremission Bei der Beurteilung prätherapeutische des Kollektiv klinischen keine Remissionsverhaltens signifikante Zuordnung ließ sich für das darstellen, in der posttherapeutischen Gruppe aber zeigte sich, daß von den 18 nach Therapie als VEGFnegativ beurteilten Tumoren 17 (94%) in der Gruppe partielle/komplette Remission zu finden waren. Die 7 mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper als positiv bewerteten Proben teilten sich auf in 4 der Gruppe PD/NC und 3 der Gruppe PR/CR. Diese Verteilung in der klinischen Remissionsbeurteilung wurde statistisch als signifikant bewertet (p=0,012). Eine negative VEGF-Expression ging mit einem günstigeren Ansprechen auf die Therapie einher. 5.1.2.5 Therapieinduzierte Tumorregression Ein günstigeres Ansprechen auf die Therapie bei negativer VEGF-Expression konnte ebenfalls anhand der Auswertung der Ergebnisse zur VEGF-Expression und der Tumorregression gezeigt werden. Anknüpfend an die Ergebnisse der Tumorregressionsuntersuchung von Junker et al. (2001), die eine längere Überlebenszeit für die Regressionsgrade IIb und III zeigten, konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, daß in prätherapeutisch gewonnenen Biopsien VEGF-negativen Tumoren signifikant häufiger in der Gruppe mit den Regressionsgraden IIb und III zu finden waren. Gerade bei der geringen Größe des Kollektivs stellte dieses signifikante Ergebnis (log-rank-Test, p=0,035) einen Hinweis für eine prognostisch günstigere Entwicklung bei VEGF-negativen Tumoren im Vergleich zu mit dem monoklonalen Antikörper als positiv beurteilten Tumoren dar. In dem nach Abschluß der neoadjuvanten Therapie resezierten Material ließ sich kein signifikanter Zusammenhang zwischen Tumorregression und VEGF-Status aufzeigen. 66 Daß die VEGF-Expression möglicherweise von Bedeutung ist für das Ansprechen der jeweiligen Tumoren auf die Chemo- bzw. Radiotherapie, versuchten verschiedene Studien zu zeigen. Volm et al. (1997b) konnten in einer in Vitro-Studie zeigen, daß eine signifikante Beziehung zwischen dem Ansprechen auf eine Doxorubicintherapie und der VEGFExpression besteht. Bei den untersuchten 153 Tumoren von bisher unbehandelten Patienten fanden sie in den auf Doxorubicin resistenten Tumoren eine geringere immunhistochemisch nachweisbare Expression von VEGF als in den sensiblen (p<0,001). Schon 1996 hatte die gleiche Arbeitsgruppe (Volm et al. 1996a) bei der Untersuchung an 152 nicht-kleinzelligen Lungentumoren einen signifikanten Zusammenhang sowohl zwischen geringer Mikrogefäßdichte als auch reduzierter Expression von VEGF und der Resistenz der so klassifizierten Tumoren gegenüber Doxorubicin darstellen können. Diese Daten von Volm et al. weichen von den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ab, die beim untersuchten Kollektiv, wie oben dargestellt, ein besseres Ansprechen auf die Therapie bei negativer VEGF-Expression zeigen konnte. Erklärt werden könnte das Untersuchungsergebnis z.B. damit, daß bei Tumoren die negative VEGF-Expression, wie auch von Volm et al. gezeigt, oft mit einer geringen Mikrogefäßdichte korreliert ist. Diese bedingt zum einen Hypoxie der Tumorzellen und damit ein Fehlen des für die maximale zytotoxische Wirkung essentiellen Sauerstoffes. Die Hypoxie führt weiterhin zur Förderung der Expression resistenzfördernder Proteine. Zum anderen beinhaltet eine geringere Gefäßversorgung das Problem einer möglicherweise unzureichenden Chemotherapieanflutung und folgend verminderter Effektivität der Therapie in vivo. In der eigenen Phase-II-Studie wurden die Patienten mit einer neoadjuvanten Radiochemotherapie behandelt, welche für Tumoren mit negativer VEGF-Expression statistisch signifikant ein besseres Ansprechen zeigte. Hinweise für die Grundlagen der Wirkungsmechanismen fanden Katoh et al. (1995). Diese Arbeitsgruppe beschäftigte sich mit der Bedeutung der VEGF-Expression für die Reaktion von Zellen auf ionisierende Strahlung. Sie setzten hierfür gesunde hämatopoietische Zellen und leukämische Zellen Gammastrahlung aus und erhielten das Ergebnis, daß VEGF den apoptotischen Zelltod verhinderte und somit die malignen und gesunden Zellen am Leben erhielt. Shimada et al. (2002) untersuchten die prätherapeutische VEGF-Expression mittels immunhistochemischer Markierung bei 52 an bösartigen Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus erkrankten Patienten, die mit einer neoadjuvanten Radiotherapie (40 Gy) und 67 gleichzeitiger Chemotherapie bestehend aus Cisplatin und 5-Fluorouracil behandelt wurden. Sie fanden ebenfalls ein signifikant schlechteres Ansprechen auf die Therapie bei den VEGF-positiven Tumoren im Vergleich zu den VEGF-negativen Tumoren. Sie postulierten ein Model, nach dem VEGF zum Schutz der Tumorgefäße vor Radiochemotherapien beiträgt, was dann zu Therapieresistenz führt. Die Arbeitsgruppe um Harmey et al. konnte ebenfalls zeigen, daß VEGF Tumorzellen vor einer Radiochemotherapie-induzierten Apoptose schützt. Desweiteren fanden sie einen durch Chemo- und Radiotherapien induzierten Anstieg der VEGFExpression, also eine durch die Therapie selbst verursachte Zunahme der Resistenz der Tumorzellen (Harmey et al. 2002). Im Rahmen anderer Studien kam es zur Aktivierung der Angiogenese und Gefäßregenerierung zwischen einzelnen Therapieblöcken. Dies hatte ein rapides Tumorwachstum und Versagen der Radiotherapie zur Folge (Koukourakis 2001). Diese verschiedenen beschriebenen Auswirkungen von Radiochemotherapien auf die VEGF-Expression von Tumorzellen erklärt möglicherweise den nicht darstellbaren Zusammenhang zwischen Tumorregression und VEGF-Status bei dem im Rahmen dieser Arbeit untersuchten, nach der Therapie gewonnenem Material. Für die Gruppe der nicht-kleinzelligen Lungentumoren sind bisher keine Untersuchungen zu Ansprechraten auf Radiochemotherapien in Abhängigkeit von der VEGF-Expression veröffentlicht worden. 5.1.3 Prognostische Bedeutung Bei einigen Tumoren, so Mammatumoren (Weidner et al. 1991), Magentumoren (Tanigawa et al. 1997a), Ösophagustumoren (Tanigawa et al. 1997b) und Colontumoren (Takahashi et al. 1997) konnte gezeigt werden, daß VEGF einen relevanten Prognoseparameter darstellt. Bei den bösartigen Tumoren der Lunge ist VEGF bisher nicht als Prognoseparameter etabliert, da die vorliegenden Untersuchungsergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen zu abweichenden Ergebnissen kommen. Ähnlich verhält es sich mit Arbeiten zu dem VEGFRezeptor Flt-1 und bei Veröffentlichungen zur Koexpression der beiden Faktoren. 68 5.1.3.1 Koexpression von VEGF und Flt-1 und ihre mögliche Eignung als Prognosefaktor Eine signifikante Koexpression von VEGF und seinem Rezeptor Flt-1 konnte in der vorliegenden Arbeit nicht gezeigt werden. Dieses Ergebnis stimmt mit einem Teil der veröffentlichten Studien überein, wohingegen andere Veröffentlichungen eine signifikante Korrelation der Expression von VEGF und Flt-1 nachweisen konnten. So beschäftigten sich Volm et al. (1997a) mit 109 Proben von Plattenepithelkarzinomen der Stadien I, II und IIIa, die sie immunhistochemisch im Hinblick auf die Expression von VEGF und Flt-1 untersuchten. Markierungen mit dem VEGF-Antikörper sahen sie in 59% der Fälle und mit dem Flt-1-Antikörper in 68% der Fälle. Es konnte keine signifikante Korrelation zwischen der VEGF- und der Flt-1Expression gezeigt werden, ebensowenig für VEGF oder Flt-1 und dem Vorliegen von Metastasen oder dem klinischen Tumorstadium. Flt-1 korrelierte im Kollektiv von Volm et al. nicht signifikant mit dem Überleben, wohingegen für VEGF eine signifikante Übereinstimmung mit längerem Überleben bei in der Immunhistochemie nicht markierten, also VEGF negativen Tumoren gezeigt wurde (log rank, p=0,019). Volm et al. fanden VEGF als unabhängigen Prognosefaktor für das Überleben von Patienten mit Plattenepithelkarzinomen. Takanami et al. (1997) konnten hingegen zeigen, daß bei von ihnen untersuchten 118 Patienten mit pulmonalem Adenokarzinom in allen klinischen Stadien die Expression von VEGF und Flt-1 signifikant korrelierte und daß die beiden Faktoren, wenn sie nicht durch immunhistochemische Markierungen nachgewiesen werden konnten, sowohl einzeln als auch in Kombination signifikant mit einem längeren Überleben der jeweiligen Patienten verknüpft waren. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen Decaussin et al. (1999). Sie untersuchten Proben von 69 Patienten mit nicht-kleinzelligen Tumoren der Stadien I und II. Von den markierten Tumoren waren 60% VEGF-positiv und 54% für Flt-1 positiv. Sie fanden zusätzlich eine deutliche Verstärkung der immunhistochemischen Markierung und damit der VEGF- und Flt-1-Expression in der Peripherie der Tumoren und in infiltrierend wachsenden malignen Zellen. Dies wurde als Hinweis auf die autokrine Funktion des VEGF gewertet. VEGF trägt hiernach als Wachstumsfaktor für die Tumorgefäße über eine autokrine Schleife zur Expansion der Tumoren bei. Ein ähnliches Muster der immunhistochemischen Markierungen wurde in dem im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Kollektiv gefunden. 69 Für die VEGF-positiven und Flt-1-positiven Tumoren bestand eine signifikante Korrelation (Fisher´s Exact Test, p=0,018). Im Gegensatz zu Takanami et al. gelang es Decaussin et al. nicht, statistisch signifikante Zusammenhänge bezüglich der Expression von VEGF und Flt-1 und dem Überleben der Patienten zu demonstrieren. 5.1.3.2 Fehlende VEGF-Expression als positiver Prognosefaktor Weitere Studien beschäftigen sich allein mit der Untersuchung der Bedeutung der VEGFExpression. So fanden Takashi et al. (1998) eine signifikante Korrelation zwischen negativer VEGFExpression und längerem Überleben. Sie hatten die VEGF-Expression von 44 Adenokarzinomen im Stadium I mittels immunhistochemischer Markierung durch einen VEGF-Antikörper untersucht und postulierten nach diesen Ergebnissen die VEGFExpression als möglichen Prognosefaktor für Überlebenszeiten von Patienten mit Adenokarzinomen der Lunge in frühen Tumorstadien. In einer retrospektiven Studie untersuchten O`Byrne et al. (2000) immunhistochemisch 223 chirurgisch gewonnene Proben von Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren. Die Tumoren wurden als operabel eingestuft und als T1-3, N0-2 beurteilt. Neben der Tumorgröße, dem Lymphknotenstatus und der Mikrogefäßdichte war VEGF in diesem Kollektiv ein signifikanter Prognosefaktor. Ebenfalls O`Byrne et al. (2003) konnten an einem Kollektiv von 189 Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren zeigen, daß eine immunhistochemisch nachgewiesene ausgeprägte VEGF-Expression signifikant mit einer kürzeren Überlebenszeit der Patienten einherging (log-rank-Test, p = 0,02). Volm et al. (2003) fanden bei 150 Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren in den Stadien I bis IIIA für in der immunhistochemischen Markierung für VEGF-positive Tumoren eine kürzere mediane Überlebenszeit als bei VEGF-negativen Tumoren. Ebenfalls Volm et al. zeigten an einer Gruppe von 121 Patienten mit bisher unbehandelten Plattenepithelkarzinomen der Stadien I, II und III unter anderem die Bedeutung von VEGF für die Prognose der Patienten (Volm et al. 1998). Bei der Auswertung der mittels immunhistochemischer Markierung gewonnenen Ergebnisse fanden sie eine signifikant kürzere mittlere Überlebenszeit bei Patienten mit VEGF-positiven Tumoren (log-rank- 70 Test, p=0,006). Somit erschien VEGF in dieser Studie als möglicher Prognosefaktor für die Überlebenswahrscheinlichkeit bei Plattenepithelkarzinomen. Zusätzlich untersuchten Volm et al. die Tumoren auf mögliche Kombinationen von klinischen Parametern und zellulären Faktoren, um so die Differenzierung hinsichtlich einer prognostischen Aussage verbessern zu können. Resultat der Analysen war, daß die Kombination von VEGF mit dem etablierten klinischen Prognosefaktor der Lymphknotenbeteiligung geeignet war, die Aussage bezüglich der Prognose des jeweiligen Patienten genauer zu differenzieren als die Anwendung der jeweiligen Prognoseparameter allein. Bei der Auswertung der eigenen Ergebnisse war, wie oben angeführt, keine statistisch signifikante Korrelation von Lymphknotenstatus und VEGF-Expression zu zeigen. In einer weiteren Studie zu frühen Stadien der Lungentumoren beurteilten Han et al. (2001) die Resektionspräparate von 85 Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren der Stadien IA-B im Hinblick auf die prognostische Signifikanz von VEGF-Überexpression, intratumoraler Mikrogefäßdichte und Lymphgefäßinvasion. Als immunhistochemische Marker setzten sie VEGF- und CD31-Antikörper ein. Die Überlebensrate in ihrem Kollektiv war für Patienten mit VEGF-negativen Tumoren signifikant höher als für Patienten mit VEGF-positiven Tumoren (log rank Test, p=0,018). Gleiches galt für Patienten mit niedriger Gefäßdichte im Vergleich zu Patienten mit Tumoren, die eine hohe Mikrogefäßdichte aufwiesen. Eine starke VEGF-Expression war ebenfalls positiv mit einer hohen Mikrogefäßdichte korreliert. In der Multivarianzanalyse waren hohe VEGFExpression, Tumorgröße und Lymphgefäßinvasion unabhängige Faktoren, die mit einer schlechteren Prognose einhergingen. Die vorliegende Arbeit läßt sich den bisher aufgeführten Studien zuordnen, bei denen VEGF als möglicher Prognosefaktor gefunden wurde. Bei dem Vergleich der Gesamtüberlebenszeiten der Patienten des untersuchten Kollektivs konnte an dem prätherapeutisch gewonnenen Material mit Hilfe der KaplanMeier-Analyse gezeigt werden, daß die Patienten mit in der immunhistochemischen Markierung VEGF-Protein-negativen Tumoren gegenüber den Patienten mit VEGFpositiven Tumoren statistisch über eine signifikant längere Überlebenszeit verfügten (logrank-test, p=0,019). In diesem kleinen Kollektiv kann die VEGF-Expression demnach als möglicher Prognosefaktor identifiziert werden. 71 Bei den posttherapeutisch chirurgisch gewonnenen Resektaten ließ sich für das Gesamtüberleben keine signifikante Aussage treffen. Es zeigte sich nur eine Tendenz zu einer längeren Überlebenszeit für Patienten mit VEGF-negativen Tumoren (log-rank-test, p=0,11). Deutlicher war diese Tendenz noch in der Untergruppe der Patienten nach R0Resektion (log-rank-test, p=0,09). 5.1.3.3 VEGF-mRNA-Expression als Prognosefaktor Im Unterschied zu den bisher vorgestellten Studien, die die VEGF-Expression allein immunhistochemisch untersuchten, existieren verschiedene Studien, die die VEGFExpression mit Hilfe anderer Methoden erfassen. So beurteilte die Arbeitsgruppe um Fontanini (Fontanini et al. 1999) die Expression der VEGF-mRNA. Sie hatten das chirurgisch gewonnene Material von 42 Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren der Stadien I, II und III zur Verfügung. Fontanini et al. fanden in der RT-PCR-Diagnostik in 78% der Tumoren eine Expression der VEGF-mRNA. Die sezernierten Isoformen VEGF-121 und VEGF-165 waren mit 76% sowie 57% am häufigsten vertreten. In dieser Studie zeigten Patienten mit VEGF-mRNA-negativen Tumoren eine günstigere Überlebensrate (log rank Test, p=0,02) als die Patienten mit VEGF-mRNApositiven Tumoren. Bei der Aufteilung in die einzelnen Isoformen fand sich nur für die Isoform 165 ein signifikantes Ergebnis. Die negativen Tumoren zeigten auch hier eine längere Überlebenszeit als die positiven (log rank Test, p=0,01). Damit sind die beiden löslichen VEGF-Isoformen 121 und 165 in ihrer Bedeutung als Marker für die Aggressivität und damit der Prognose dieser Tumore aufgezeigt worden. Yuan et al. (2000) studierten die mögliche Korrelation zwischen der VEGF-mRNA der einzelnen VEGF-Subtypen und ihrer Proteinexpression mit dem histologischen Typ, der Tumorangiogenese, dem Überleben der Patienten und dem Eintreten eines Rückfalls bei nicht-kleinzelligen Tumoren der Lunge. Von den 72 untersuchten Tumoren waren 37 Plattenepithelkarzinome und 35 Adenokarzinome; davon wurden 28 dem Stadium I, 10 dem Stadium II und 34 dem Stadium IIIA oder IIIB zugeordnet. Die VEGF-mRNA wurde mittels RT-PCR quantifiziert, die Proteinexpression und die Mikrogefäßdichte mittels immunhistochemischer Markierung. Bei dem Vergleich des VEGF-mRNA Gehaltes in Tumor- und umgebendem normalem Gewebe fand sich in allen Tumoren ein signifikant größerer Gehalt an mRNA als im normalen Gewebe. Der Gehalt an VEGF-mRNA in den Tumoren korrelierte ebenfalls signifikant mit der VEGF-Proteinexpression und der Mikrogefäßdichte. Die Adenokarzinome zeigten insgesamt eine ausgeprägtere VEGF72 mRNA-Expression und höhere Scores für die VEGF-Proteinmarkierung als die Plattenepithelkarzinome. Hohe tumorale mRNA-Expression war zusätzlich noch assoziiert mit den fortgeschrittenen Tumorstadien IIIA und IIIB sowie Lymphknotenmetastasen, hoher Mikrogefäßdichte, kurzer Patientenüberlebenszeit und frühen Rückfällen. Ähnlich waren die Korrelationen bei der VEGF-Proteinexpression. Sie war positiv verknüpft mit hoher Mikrogefäßdichte, kurzen Überlebenszeiten der Patienten sowie ebenfalls frühen Rückfällen. Patienten mit sowohl ausgeprägter VEGF-Proteinexpression als auch VEGF-mRNA-Spiegeln hatten eine signifikant kürzere Überlebenszeit und frühere Rückfälle. In der Multivarianzanalyse dieses Kollektivs waren der Lymphknotenstatus und die VEGF-Proteinexpression die wichtigsten unabhängigen Prognosefaktoren für Überleben und Rezidiventwicklung. Zusammenfassend waren also die gesamte VEGF-mRNA- sowie Protein-Expression eng mit dem histologischen Subtyp, der Tumorangiogenese, dem Überleben und dem Eintreten eines Rückfalls assoziiert. Die hohe VEGF-Expression in Adenokarzinomen könnte zu deren größerem metastatischen Potential beitragen. Ebenfalls Yuan et al. differenzierten in einer nachfolgenden Studie die mögliche Eignung der einzelnen VEGF-Isoformen als Prognosefaktoren bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren genauer. Mittels RT-PCR untersuchten sie die mRNA-Expression der VEGF-Isoformen 121, 165 189 und 206 bei 57 nicht-kleinzelligen Lungentumoren. Die Tumorangiogenese stellten sie durch immunhist ochemische Markierung dar. Für Tumoren mit stark ausgeprägter Expression der VEGF-Isoform 189 ließ sich statistisch signifikant eine kürzere Überlebenszeit der Patienten nachweisen (log-rank-Test, p=0,0001). Für die anderen Isoformen ergab sich kein signifikantes Ergebnis beim Vergleich schwacher und starker VEGF-mRNA-Expressionen. Die Arbeitsgruppe postulierte den VEGF-mRNA Nachweis der Isoform 189 als anwendbaren Prognosefaktor bei Patienten mit nichtkleinzelligen Lungentumoren (Yuan et al. 2001). 5.1.3.4 Serum-VEGF als Prognosefaktor Ebenfalls mit einem Kollektiv von nicht-kleinzelligen bösartigen Lungentumoren beschäftigten sich Imoto et al. (1998). Mittels eines Anti-VEGF-Antikörpers markierten sie 91 Proben vollständig resezierter Tumoren, untersuchten mittels Faktor VIII die Mikrogefäßdichte und mittels einer Immunosorbent-Assay-Technik die Serumkonzentration an löslichem VEGF. Die VEGF-Serumkonzentration war in den T3-4 Tumoren signifikant höher als in den T1-2 Tumoren. Dies stimmt mit der Hypothese 73 überein, daß die VEGF-Expression erst in späteren Tumorstadien bei größerem Tumorvolumen ansteigt. Wie zuvor in anderen Studien auch war die Prognose für Patienten mit positivem VEGF-Nachweis signifikant schlechter als für Patienten ohne VEGF-Nachweis (p=0,002). Der Multivarianzanalyse zufolge waren -ähnlich der Studie von Volm et al. (1998)- die VEGF-Proteinexpression sowie der Lymphknotenstatus unabhängige Prognosefaktoren. Tabelle 5.1: Autor Fehlende VEGF-Expression als positiver Prognosemarker Kollektiv Methode Ergebnisse Volm et al. 109 PEC 1997a Stadien I, II, IIIa Takanami 118 ADC et al. 1997 alle Stadien IHC Takashi et al. 1998 Volm et al. 1998 IHC signifikant längeres Gesamtüberleben (p= 0,019), VEGF- und Flt-1Expression nicht korreliert VEGF- und Flt-1-Expression signifikant korreliert; beide Faktoren wenn negativ mit signifikant günstigerer Prognose korreliert signifikant längeres Überleben 44 ADC Stadium I 121 PEC Stadien I, II, III Imoto et al. 91 NSCLC 1998 alle Stadien Han et al. 2001 Fontanini et al. 1999 85 NSCLC Stadien Ia-b 42 NSCLC Stadien I, II, III Yuan et al. 72 NSCLC 2000 Stadien I, II, IIIA, IIIB Fontanini et al. 1998 O`Byrne et al. 2000 IHC IHC Nachweis der Serumkonzentration von VEGF mittels Immunosorbent-Assay IHC RT-PCR günstgere Überlebensrate VEGFmRNA-negativer Tumoren RT-PCR, IHC VEGF–mRNA und –Proteinexpression mit kürzeren Überlebenszeiten korreliert; hohe tumorale VEGFmRNA-Expression in fortgeschrittenen Tumorstadien positive VEGF-Expression beeinflußt Überleben der Patienten negativ VEGF signifikanter Prognosefaktor 107 NSCLC Stadium I 223 NSCLC Stadien I, II; IIIA 98 NSCLC alle Stadien IHC O`Byrne et 189 NSCLC Stadien IAal. 2003 IIIA IHC Sheng et al. 2000 mittlere Überlebenszeit bei VEGFpositiven Tumoren signifikant kürzer (p= 0,006) Signifikant günstigere Prognose bei negativem VEGF-Nachweis; Serumkonzentration bei T3-4 signifikant höher als bei T1-2 Log-rank-Test p= 0,018 IHC IHC positive VEGF-Expression beeinflußt Überlebenszeit negativ, VEGF als unabhängiger Prognosefaktor hohe VEGF-Expression der Tumoren von negativer prognostischer Signifikanz (log-rank-Test, p=0,02) 74 Eine Reihe von Studienergebnissen (Tab. 5.1) sprechen folglich für die These, daß VEGF als Prognosefaktor für das Überleben von Patienten mit bösartigen nicht-kleinzelligen Lungentumoren möglicherweise geeignet sein könnte, wie es auch im eigenen untersuchten Kollektiv gezeigt werden konnte. Aber die Bedeutung wird noch kontrovers diskutiert, da die Resultate anderer Studien gerade diese prognostische Aussagekraft nicht stützen konnten. 5.1.3.5 VEGF-Expression ohne signifikante prognostische Aussagekraft So untersuchten Yano et al. (2000) ein Kollektiv von 108 Patienten mit bösartigen Lungentumoren aller klinischen Stadien. Bei der immunhistochemischen Markierung mit VEGF fanden sie in der statistischen Auswertung beim Vergleich der histologischen Subtypen bei den Adenokarzinomen eine signifikant häufigere positive Markierung mit dem VEGF-Antikörper als bei den anderen untersuchten Subtypen. Bei der Analyse nach Kaplan-Meier fanden Yano et al. aber weder für die VEGF-negativen noch für die VEGFpositiven Tumoren eine signifikante Korrelation mit der Überlebenszeit der Patienten. Somit war VEGF in diesem Kollektiv nicht als unabhängiger Prognosefaktor geeignet. Ähnliche Resultate erzielte die Gruppe um Baillie et al. (2001). Sie arbeitete mit einem Kollektiv von 81 Patienten, die nicht-kleinzellige Lungentumoren aus den Stadien I bis IIIa aufwiesen. Bei den Untersuchungen fanden sie keine signifikanten Übereinstimmungen zwischen der VEGF-Expression und klinischen Parametern. Bei der Überlebensanalyse ergab sich zwar ein Trend für längeres Überleben im Patientenkollektiv mit der niedrigen VEGF-Expression, das Ergebnis war aber nicht signifikant. Betreffend die Frage nach der Bedeutung von VEGF-Serumkonzentrationen für die Prognose von Patienten mit nicht-kleinzelligen Lungentumoren, veröffentlichten unter anderem Brattström et al. 1998 eine Studie. Abweichend zu den Ergebnissen von Imoto et al. (1998), die, wie oben aufgeführt, erhöhte Serumwerte für VEGF als mit einer ungünstigeren Prognose einhergehend aufzeigen konnten, konnten Brattström et al. dies bei ihrem Kollektiv, bestehend aus 68 nicht-kleinzelligen Lungentumoren aus allen Stadien, nicht nachweisen. Bei 39% der Tumoren war der Serumspiegel für VEGF erhöht, es konnte aber weder für die Histologie noch für das jeweilige Tumorstadium eine signifikante Korrelation errechnet werden. Ebenso ergab sich keine signifikante Korrelation bezüglich des Gesamtüberlebens und normalen bzw. erhöhten VEGFSerumwerten. 75 Tabelle 5.2: VEGF-Expression ohne prognostische Bedeutung Autor Kollektiv Methode Ergebnisse Yano et al 2000 Baillie et al 2001 108 NSCLC alle Stadien 81 NSCLC Stadien I, II, IIIA IHC IHC Decaussin et 69 NSCLC IHC al 1999 Stadien I und II Brattström et 68 NSCLC ale ELISA al 1998 Stadien keine signifikante Korrelation der VEGF-Expression mit den Überlebenszeiten VEGF-Expression allein ohne prognostische Aussagekraft, Kombination hoher Vaskularisierungsrate und niedriger VEGF-Expression mit längerer Überlebenszeit VEGF- und Flt-1-Expression ohne Einfluß auf das Überleben der Patienten keine Korrelation von erhöhten VEGF-Serumspiegeln und dem Überleben der Patienten Insgesamt existieren zum Thema VEGF und seiner Eignung als Prognosefaktor viele sich ergänzende, aber auch sich vollständig widersprechende Arbeiten. Die vorliegende Arbeit läßt sich, wie oben aufgeführt, den Studien zuordnen, bei denen VEGF als möglicher Prognosefaktor gefunden wurde. 5.1.3.6 Zusammenfassung monoklonaler VEGF-Antikörper Zusammenfassend konnten bei der Auswertung der Ergebnisse des mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper untersuchten Gewebes keine signifikanten Korrelationen in bezug auf die Geschlechtsverteilung, die Histologie, das klinische Stadium, das T- oder N-Stadium sowie den Resektionsstatus beim Vergleich der VEGF-negativen und –positiven Proben aufgezeigt werden. Auch die Koexpression von VEGF und seinem Rezeptor Flt-1 war nicht signifikant. Hinsichtlich des klinischen Remissionsverhaltens ergab sich eine signifikante Korrelation von posttherapeutisch negativer VEGF-Expression und günstigerem Ansprechen auf die Therapie. Die immunhistochemisch prätherapeutische negative VEGFExpression ging auch bei der Zuordnung zu den Ergebnissen der Tumorregression statistisch signifikant häufiger mit einem besseren Ansprechen auf die Therapie einher. Es konnte gezeigt werden, daß VEGF-negative Tumoren signifikant häufiger in der Gruppe mit den Regressionsgraden IIb und III zu finden waren. Diese Regressionsgrade IIb und III waren zuvor längeren Überlebenszeiten der Patienten zugeordnet worden. Bei den posttherapeutisch chirurgisch gewonnenen Resektaten ließ sich für das Gesamtüberleben keine signifikante Aussage treffen, es ließen sich aber tendenziell günstigere Überlebenszeiten für Patienten mit VEGF-negativen Tumoren aufzeigen. Die 76 statistische Auswertung der Gesamtüberlebenszeiten der Patienten konnte hingegen an dem prätherapeutisch gewonnenen Material mit Hilfe der Kaplan-Meier-Analyse zeigen, daß die Patienten mit in der immunhistochemischen Markierung VEGF-Protein-negativen Tumoren gegenüber den Patienten mit VEGF-positiven Tumoren statistisch signifikant längere Überlebenszeit aufwiesen (log-rank-test, p=0,019). In diesem kleinen Kollektiv konnte die VEGF-Expression demnach als möglicher Prognosefaktor dargestellt werden. 5.2 Mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper erzielte Resultate In dieser Arbeit wurde als zweiter Antikörper gegen das VEGF-Protein der polyklonale Antikörper VEGF (Firma Santa Cruz Biotechnology, USA) eingesetzt, der aus gereinigten Kaninchen-Antikörpern (sc-152) besteht. Die Kaninchenantikörper binden an die Aminosäuren 1–20 am Aminoende der VEGF-Varianten 165, 189 und 121 menschlichen Ursprungs an. 5.2.1 Methodik Hier gelten zunächst analog die Ausführungen zum monoklonalen VEGF-Antikörper. Neben den Tumorzellen stellte der polyklonale Antikörper auch verschiedene andere Strukturen des normalen Lungengewebes dar. Makrophagen, Riesenzellen, die glatte Muskulatur der Gefäße und Bronchien, Drüsenepithelien, das Flimmerepithel der Bronchialschleimhaut, das Endothel der Gefäße, Nekrosezonen, Erythrozyten, Knorpel, kubisch transformiertes Alveolarepithel und Plattenepitheldysplasien waren immunhistochemisch markiert worden.. Am häufigsten von diesen Strukturen wurden Makrophagen, Flimmerepithel und das Endothel markiert. Beim Endothel waren bei positivem Befund sowohl Tumorgefäße als auch die Gefäße des umgebenden Stromas gleichermaßen dargestellt. In der Literatur findet man neben der Markierung von Gefäßendothel und dem Zytoplasma der Tumorzellen als markierte Strukturen ebenfalls Fibroblasten, normale Alveolen, bronchiales Epithel (Takanami et al. 1997), glatte Muskulatur (Takashi et al. 1998), Entzündungszellen und Drüsenepithel (Baillie et al. 2001). Somit entspricht die Markierung durch den Antikörper dem auch in anderen Studien beobachteten Muster. Keine dieser Studien konnte aber die im Rahmen der eigenen Untersuchungen beobachtete Vielfalt an positiv markierten Strukturen aufweisen. Zu diskutieren ist die Ursache für diese anscheinend nicht selektive Markierung der Zellen mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper. In der Literatur finden sich Angaben zu 77 Problemen bei der Beurteilung immunhistochemischer Markierung auf Grund von ausgeprägter Umgebungsmarkierung (Takanami et al. 1997), die auch im Fall des hier benutzten polyklonalen Antikörpers in einigen Fällen vorlag. Weitere mögliche Ursachen sind eine nicht ausreichende Spezifität des Antikörpers, Artefakte durch die Formalinfixierung oder eine mögliche Heterogenität des jeweiligen Tumors für die Expression von VEGF. 5.2.2 Korrelation mit klinischen Parametern Bei der immunhistochemischen Untersuchung lagen von 19 Patienten, 15 Männern und 4 Frauen mit einem Altersdurchschnitt von 57 Jahren, Proben vor Einleitung der neoadjuvanten Therapie vor. Es handelte sich bei den Tumoren um 8 Adenokarzinome und 11 Plattenepithelkarzinome. Bis auf ein Plattenepithelkarzinom waren bei der Markierung mit diesem Antikörper die Reaktionen aller übrigen Tumoren positiv. Eine derartig hohe Rate von positiv markierten Tumoren ist in der Literatur nicht beschrieben. Wie oben erwähnt, sind im Durchschnitt 60% der Tumoren positiv für VEGF. Im Vergleich mit dem monoklonalen Antikörper waren bei der Markierung mit dem polyklonalen Antikörper 10 Tumoren positiv, die mit dem monoklonalen Antikörper als negativ beurteilt worden waren. Bei dem einzigen mit dem polyklonalen Antikörper als negativ beurteilten Tumor stimmten die beiden Antikörper überein. Aufgrund dieses geringen Unterschiedes im immunhistochemischen Ergebnis konnten für das Kollektiv aller Patienten, bei denen die prätherapeutische Untersuchung mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper vorlag, keine statistischen Berechnungen hinsichtlich des Geschlechts, der Histologie, des klinischen Stadiums und des T- oder NStadiums durchgeführt werden. Ebenso verhielt es sich bezüglich der Ergebnisse zum klinischen Remissionsverhalten und zu den histomorphologischen Regressionsphänomenen. Das als negativ in der immunhistochemischen Darstellung beurteilte Plattenepithelkarzinom wies ausgeprägte Regressionsphänomene auf (Regressionsgrading IIB), konnte R0-reseziert werden und ging mit bisherigem Überleben des Patienten einher. Insofern stellt dies eine gute Prognose bei negativem VEGF-Befund dar, die in ihrer Aussage aber nicht signifikant sein kann. Zum Überleben des Kollektivs der untersuchten Patienten, von denen prätherapeutisches Material vorlag, konnte ebenfalls keine Aussage mit Hilfe der Schätzungen nach Kaplan und Meier erzielt werden. 78 Entsprechend der zur Verfügung stehenden Materialien bei den Untersuchungen mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper lagen auch in diesem Fall sowohl Bronchusbiopsien und Mediastinoskopien als auch Resektatmaterial von 13 Patienten für einen direkten Vergleich von prä- und posttherapeutischer VEGF-Expression vor. Die statistische Auswertung der Daten zu diesem Material wurde aufgrund der prätherapeutisch erhaltenen Ergebnisse mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper nicht durchgeführt. Posttherapeutisch gewonnenes Material wurde von 26 Patienten untersucht, 24 männlichen und 2 weiblichen, mit einem Altersdurchschnitt von 57,2 Jahren. Bei den Tumoren handelt es sich um 6 Adenokarzinome, 19 Plattenepithelkarzinome und ein adenosquamöses Karzinom. Der polyklonale VEGF-Antikörper war bei dem adenosquamösen Karzinom, bei 10 Plattenepithelkarzinomen und 3 Adenokarzinomen positiv (53,8%). Negativ bei der Markierung blieben die restlichen drei Adeno- und 9 Plattenepithelkarzinome. Beim Vergleich der beiden VEGF-Antikörper waren wiederum 10 mit dem monoklonalen Antikörper als VEGF-negativ beurteilte Tumoren in der Markierung mit dem polyklonalen Antikörper VEGF-positiv. Drei mit dem monoklonalen Antikörper als positiv beurteilte Tumoren waren bei der polyklonalen Markierung negativ. Es zeigt sich bei der immunhistochemischen Markierung der Resektatproben nur bei knapp der Hälfte der Tumoren eine Übereinstimmung in der Markierung mit den Antikörpern. Bei den 26 Operationspräparaten ließen sich keine signifikanten Unterschiede bezüglich des Geschlechts, des histologischen Typs (Plattenepithelkarzinom oder Adenokarzinom), des klinischen Stadiums (IIIA oder IIIB) sowie des T- (T0-2 oder T3-4) und N-Stadiums (N0-1 oder N2) nachweisen. Ebenso konnten hinsichtlich des klinischen Remissionsverhaltens und der histomorphologischen Tumorregression in Abhängigkeit vom VEGF-Status keine signifikanten Unterschiede aufgezeigt werden. 5.2.3 Prognose Auch bei der statistischen Auswertung hinsichtlich möglicher Aussagen zum Gesamtüberleben wurde kein statistisch signifikantes Ergebnis erzielt. Ein identisches Ergebnis ergab sich bei der Untersuchung des Kollektivs der Patienten nach R0-Resektion. Zusammenfassend ließen sich mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper keine signifikanten Aussagen zur Korrelation mit klinischen Parametern, histomorphologischer Regression, 79 klinischem Remissionsverhalten und dem Überleben der Patienten treffen. Die wesentliche Ursache ist hierbei in der geringen Spezifität dieses Antikörpers zu sehen. 5.3 Mit dem polyklonalen Flt-1-Antikörper erzielte Resultate Die Zellmembran-Rezeptor-Tyrosinkinase Flt-1 wird nur in aktivierten Endothelzellen wachsender Gefäße in einem signifikanten Umfang exprimiert. Sie ist eng verwandt mit zwei anderen ebenfalls das Gefäßwachstum steuernden Tyrosinkinasen, Flk-1 und Flt-4. Bei Flt-1 und Flk-1 konnte gezeigt werden, daß sie eine hohe Affinität für VEGF besitzen. 1992 beobachteten Plate et al., daß der VEGF-Rezeptor Flt-1 hauptsächlich in proliferierenden Endothelzellen, die direkt an einen Tumor angrenzen oder in ihn hineinwachsen, ausgebildet und in Gefäßen von gesundem Gewebe kaum nachweisbar ist. Noch nicht endgültig geklärt ist die Frage, ob Flt-1 selbst die Tumorangiogenese induzieren kann. Studien stellten die Hypothese auf, daß die Tyrosinkinasedomäne von Flt1 notwendig sein könnte für die Induktion der Angiogenese (Hiratsuka et al. 2001). Für Nierenzellkarzinome konnten Brown et al. (1993) eine ausgeprägte Expression von VEGF-mRNA und Protein zeigen. Zusätzlich wiesen die Endothelzellen der Tumorgefäße im Gegensatz zu den Gefäßen des umgebenden gesunden Gewebes neben einer starken Markierung für das VEGF-Protein ebenfalls eine hohe Expression an Flt-1mRNA auf. Aus diesen Ergebnissen schlossen die Autoren auf eine wichtige Funktion von VEGF und seinem Rezeptor Flt-1 für die Angiogenese in Nierenzellkarzinomen. Einer der Hauptfaktoren für eine Zunahme der Flt-1-Expression in Endothelzellen ist der VEGF selbst. Barleon et al. (1997) konnten nachweisen, daß die Isoformen 121, 165 und 189 des VEGF in humanen Endothelzellen einen Anstieg der Flt-1-mRNA und der Flt1-Protein-Expression bewirkten. Somit können Tumorzellen über eine gesteigerte VEGFExpression auch eine Steigerung der Flt-1-Expression verursachen und damit wiederum die Angiogenese fördern. Barleon et al. (1996) zeigten als erste eine weitere Funktion des Flt-1-Rezeptors auf. Sie fanden, daß VEGF-Exposition bei Monozyten zur Migration führt und daß diese chemotaktische Antwort der Monozyten durch den VEGF-Rezeptor Flt-1 vermittelt wird. 5.3.1 Methodik Ein Großteil der Studien weist Flt-1 immunhistochemisch mittels spezifischer Antikörper nach (exemplarisch: Takanami et al. 1997; Volm et al. 1997a). Andere weisen die Flt-180 mRNA mittels Northern Blot Analysis nach oder die lösliche Form des Flt-1 mit Hilfe eines Flt-1-spezifischen ELISA-Assays (Barleon et al. 1997). Der für die Markierung der bearbeiteten Gewebeproben dieser Arbeit benutzte Anti-Flt-1Antikörper ist ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der gegen ein Peptid gerichtet ist, das mit den Aminosäuren 1312-1328 am carboxyterminalen Ende des Flt-1-Vorläufers humanen Ursprungs korrespondiert. Er reagiert mit Flt-1 von Maus, Ratte und Mensch. Kreuzreaktionen mit Flk-1, Flt-4 oder anderen Tyrosinkinasen sollten nicht existieren. Über die Häufigkeit der für die Flt-1-Expression positiven Tumoren findet man in der Literatur unterschiedliche Angaben. Takanami et. al. (1997) bewerteten von 118 Adenokarzinomen 55% als Flt-1-positiv, wohingegen Volm et al. (1997a) von 153 nichtkleinzelligen Lungentumoren 62% als Flt-1-positiv bewerteten. Bei den eigenen Untersuchungen ergaben sich geringere Zahlen. So waren bei der Auswertung der immunhistochemischen Markierung des in der vorliegenden Arbeit verwendeten Studienmaterials von den 19 prätherapeutisch gewonnenen Präparaten 37% für Flt-1 positiv. Der Flt-1-Antikörper war beim eigenen Studienmaterial unter anderem positiv bei glatter Muskulatur, Erythrozyten, Bronchialepithel, Gefäßendothel, Riesenzellen, Makrophagen und kubisch transformierten Alveolarepithelien. Tolnay et al (1998) fanden bei Untersuchungen mit einem Flt-1-Antikörper vom gleichen Hersteller (Firma Santa Cruz Biotechnology, USA) starke Markierungen von Makrophagen und Riesenzellen sowie eine schwache Markierung von Gefäßendothelzellen. Gesunde Bronchialepithelzellen wurden bei Tolnay et al nicht dargestellt. In der Literatur findet man Angaben über den immunhistochemischen Nachweis von Flt-1 in der Mucosa der Bronchien, glatten Muskelzellen, hyperplastischen Typ II Pneumozyten und Alveolarmakrophagen (Decaussin et al. 1999). Endothelzellen und Fibroblasten in gesundem Gewebe wurden durch den Flt-1-Antikörper nicht markiert, Endothelzellen und Fibroblasten im Tumorgewebe so wie die Tumorzellen selbst hingegen schon. Auffällig war bei den untersuchten Tumoren der vorliegenden Arbeit die meist sehr starke Markierung von Verhornungen bei den Plattenepithelkarzinomen und den meist zentral in den Tumoren liegenden Nekrosen. Bei diesen Nekrosezonen fehlte in den direkt angrenzenden Bereichen die positive Reaktion, dafür waren häufig die zum Stroma liegenden Ränder dieser Tumoren stark positiv. Ähnliche Ergebnisse beschreiben Decaussin et al. (1999). Signifikant erhöht war bei dieser Arbeitsgruppe die Expression 81 von sowohl VEGF als auch Flt-1 an den Rändern großer Nekrosegebiete, in der Peripherie der Tumoren und in kleinen Tumorzellhaufen, die in gesundes Gewebe eindrangen. Dies spricht für die Hypothese, daß chronische und akute Hypoxie die Expression von VEGF und Flt-1 induzieren kann. 5.3.2. Korrelation mit klinischen Parametern Bei der Stadienunterteilung des Studienmaterials waren 8 Präparate des Stadiums IIIA negativ und 4 des Stadiums IIIB. Positiv waren hingegen 3 Präparate von Tumoren des Stadiums IIIA und 4 des Stadiums IIIB. Bei der beschriebenen Verteilung auf die einzelnen Tumorstadien (IIIA oder IIIB) sowie auch bei der Verteilung auf die Geschlechter, den histologischen Typ (Plattenepithelkarzinom oder Adenokarzinom) und das T- (T0-2 oder T3-4) und NStadium (N0-1 oder N2) gab es wie bei allen vorherigen Untersuchungen zu diesen Parametern weder bei der Beurteilung des prätherapeutisch noch bei der Beurteilung des posttherapeutisch erhaltenen Materials statistisch signifikante Unterschiede. In der Literatur gibt es nur wenige Arbeiten, die die Flt-1 Expression mit klinischen Daten korrelieren. So fanden Volm et al. (1997a) übereinstimmend mit den eigenen Daten in einem Kollektiv von 109 Plattenepithelkarzinomen mit den klinischen Stadien I, II und IIIA keine signifikante Korrelation zwischen Flt-1-Expression und klinischem Stadium sowie Flt-1Expression und Metastasierung. Die Zuordnung der als Flt-1-negativ und Flt-1-positiv beurteilten Proben in die Gruppen des histologischen Regressionsverhaltens und des klinischen Remissionsverhaltens ergab ebenfalls in beiden Kollektiven keine statistisch signifikanten Unterschiede. Wie bei VEGF fehlen bei Patienten mit bösartigen Lungentumoren auch für Flt-1 bisher weitere Untersuchungen zu den Auswirkungen einer Radiochemotherapie auf die Expression dieses Proteins und seiner Bedeutung für Aussagen zur Prognose der jeweiligen Patienten. Veröffentlicht wurden bisher nur Ergebnisse von in vitro Studien betreffend die Bedeutung der hier untersuchten Angiogenesefaktoren für das Ansprechen auf Chemotherapeutika. Bei der im Folgenden dargestellten Studie ist zu berücksichtigen, daß das untersuchte Therapeutikum nicht in der dieser Arbeit zugrundeliegenden Phase-IIStudie verwendet wurde. 82 So untersuchten Volm et al. (1997b) unter anderem die Bedeutung des Rezeptors Flt-1 für das Ansprechen auf Doxorubicin in vitro. Sie fanden eine signifikante Korrelation zwischen der Flt-1-Expression und dem Ansprechen auf das Medikament. Tumoren mit niedriger Flt-1-Expression waren signifikant häufiger resistent gegen die Doxorubicinwirkung als Tumoren mit ausgeprägter Flt-1-Protein-Expression (Fisher`s Exact Test, p<0,01). Wie auch schon bei der Diskussion der Ergebnisse des monoklonalen VEGFAntikörpers erwähnt, deckt sich diese Beobachtung nicht mit dem Ansprechen der Tumoren auf die neoadjuvante Therapie in der dieser Arbeit zugrundeliegenden Phase II Studie. Bei dem Vergleich der 13 Gewebeproben, an denen prä- und posttherapeutische Untersuchungen durchgeführt werden konnten, fiel posttherapeutisch eine Zunahme der als negativ beurteilten Proben auf. In der statistischen Auswertung ergab sich ein grenzwertig signifikanter Unterschied in der Flt-1-Expression (p=0,063). Diese Aussage muß bei der Berücksichtigung der genauen Score-Werte relativiert werden, da bei 4 Proben der Unterschied in der Score-Wertung, direkt im Cut-off-Bereich gelegen, nur einen Punkt beträgt (von 5 auf 4 abgefallen), also nur ein geringer Unterschied, der weiterer Abklärung in Studien bedarf. Die prätherapeutisch und posttherapeutisch immunhistochemisch nachgewiesene Flt-1Expression zeigte sowohl beim Vergleich mit dem polyklonalen als auch mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper keine signifikante Koexpression. Dieses Ergebnis stimmt mit Ergebnissen veröffentlichter Studien überein. So untersuchten Volm et al. (1997a) ein Kollektiv von 109 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen im Hinblick auf die Bedeutung der VEGF- und Flt-1-Expression. Von den 109 Tumoren waren 69, also 68%, positiv für Flt-1 markiert worden. Eine positive Korrelation mit der VEGF-Expression konnte aber nicht beobachtet werden. 5.3.3 Prognose Bei der Beurteilung des Gesamtüberlebens des hier untersuchten Kollektivs von 19 Patienten waren mit einem p=0,85 (log-rank Test) keine signifikant unterschiedlichen Überlebenszeiten bezüglich der prätherapeutischen Flt-1-Expression nachzuweisen. Dieses 83 Ergebnis stimmte mit den Ergebnissen bei der Untersuchung der Gruppe der Patienten nach R0-Resektion überein. Anhand der Daten zur Flt-1-Expression bei den posttherapeutisch gewonnenen Resektaten waren ebenfalls in der Überlebensanalyse sowohl für das Gesamtkollektiv als auch für das kleinere Kollektiv der Patienten nach R0-Resektion keine signifikant unterschiedlichen medianen Überlebenszeiten aufzuzeigen. In der Literatur ist ähnlich wie bei den Aussagen zur VEGF-Expression die Datenlage widersprüchlich. So konstatierten Takanami et al. (1997) eine signifikante Korrelation zwischen einer Verminderung sowohl der VEGF-Expression als auch der Flt-1-Expression mit reduzierter Tumorangiogenese und verlängertem Überleben der Patienten. Volm et al. (1997a) untersuchten ein Kollektiv von 109 Patienten mit Plattenepithelkarzinomen ebenfalls im Hinblick auf die Bedeutung der VEGF- und Flt-1Expression. Eine positive Korrelation mit der VEGF-Expression konnte nicht beobachtet werden. Bei der Korrelation von Flt-1-Proteinexpression und der Überlebenszeit der Patienten konnten Volm et al. im Gegensatz zu Takanami et al. kein statistisch signifikantes Resultat erzielen. Decaussin et al. (1999) konnten bei den von ihnen untersuchten 69 Proben von nicht-kleinzelligen bösartigen Lungentumoren positive Korrelationen für die VEGF- und Flt-1-Expression in Tumorgefäßendothelzellen und Tumorzellen nachweisen. Für die Mikrogefäßdichte und das Überleben der Patienten ließen sich aber wiederum keine Korrelationen mit der Expression von Flt-1 finden. Für dieses Kollektiv an Tumoren mit den Stadien I und II war Flt-1 also ebenfalls kein Faktor für die Beurteilung der möglichen Prognose hinsichtlich der Überlebenszeiten dieser Patienten. Weitere Arbeiten zur Bedeutung der Flt-1-Expression bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren liegen nicht vor. Die sowohl bei VEGF als auch Flt-1 gegensätzlichen Aussagen zur möglichen prognostischen Bedeutung dieser Faktoren können ihren Ursprung in mehreren Punkten haben. Zum einen weichen die Protokolle für die immunhistochemische Markierung voneinander ab, zum anderen werden in jeder Studie unterschiedliche Antikörper benutzt. Besonders bei der Auswertung der immunhistochemischen Markierungen durch die AntiVEGF-Antikörper gibt es eine Vielzahl unterschiedlicher Bewertungsschemata. Zusätzlich weichen die Zusammensetzungen der untersuchten Patientengruppen vor allem in bezug 84 auf Histologie und klinisches Stadium häufig voneinander ab. Eine Vergleichbarkeit von Resultaten unterschiedlicher Studien ist damit kaum gegeben. Zusammenfassend ließ sich bei dem im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Kollektiv keine signifikante Korrelation von Flt-1-Expression und klinischen Patientendaten sowie der histomorphologischen Regression und dem klinischen Remissionsverhalten aufzeigen. Übereinstimmend mit den Ergebnissen von Volm et al (1997a) ließen sich signifikant unterschiedliche Überlebenszeiten der Patienten in Abhängigkeit von der Flt-1Proteinexpression nicht nachweisen. Die mögliche Bedeutung von Flt-1 als Prognosefaktor bei nicht-kleinzelligen Lungentumoren, die nach multimodalen Therapiekonzepten behandelt werden, ist aber noch nicht abschließend zu beurteilen. 85 6. Zusammenfassung Lungenkarzinome stellen die häufigsten bösartigen Tumoren westlicher Industrienationen dar. Allein in Deutschland muß jährlich mit circa 45.000 Neuerkrankungen gerechnet werden. Die Therapie richtet sich nach dem jeweiligen Tumorstadium. Für nichtkleinzellige Lungentumoren der Stadien I und II gilt die operative Therapie als effektivste kurative Behandlungsmöglichkeit. Im Stadium IV werden, neben den etablierten palliativen und supportiven Maßnahmen mit dem Ziel einer verbesserten Lebensqualität, im Rahmen von Studien auch Chemotherapien mit der Zielsetzung einer möglichen Lebenszeitverlängerung untersucht. Bei Patienten mit lokal fortgeschrittenen Tumoren (Stadium III) werden zunehmend multimodale Therapiestrategien geprüft. Diese neoadjuvanten oder auch adjuvanten Therapien erzielen bisher aber nur bei einem Teil dieses Patientenkollektivs die gewünschten Therapieergebnisse. Daher werden Parameter gesucht, die die Optimierung und Individualisierung der Therapie dieser Patientengruppe ermöglichen. Anhand von Material, das im Rahmen einer Phase-II-Studie zur neoadjuvanten Radiochemotherapie bei Patienten mit lokal fortgeschrittenen bösartigen nichtkleinzelligen Lungentumoren gewonnen wurde, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit der Angiogeneseparameter VEGF und sein Rezeptor Flt-1 im Hinblick auf eine mögliche prognostische und therapeutische Bedeutung untersucht. Die VEGF-Expression wurde sowohl mittels immunhistochemischer Markierung durch einen monoklonalen als auch einen polyklonalen Antikörper dargestellt. Bei der Auswertung der immunhistochemischen Markierung mit dem monoklonalen VEGF-Antikörper ergab der VEGF-Status keine signifikante Korrelation zu klinischen Daten oder zum Resektionsstatus. Hinsichtlich des klinischen Remissionsverhaltens ergab sich eine signifikante Korrelation von posttherapeutisch negativer VEGF-Expression (72% der Proben) und günstigerem Ansprechen auf die Therapie. Ein prädiktiver Wert der VEGF-Expression für die Länge des Gesamtüberlebens ließ sich nicht mit statistischer Signifikanz nachweisen, wohl aber konnten tendentiell günstigere Überlebenszeiten für Patienten mit posttherapeutisch VEGF-negativen Tumoren aufgezeigt werden. Die prätherapeutisch negative VEGF-Expression (58% der Proben) ging ebenfalls mit einem besseren Ansprechen auf die Therapie einher. VEGF-negative Tumoren waren 86 signifikant häufiger in der für die Prognose günstigeren Gruppe mit den Regressionsgraden IIb und III zu finden als VEGF-positive Tumoren. Mit Hilfe der Schätzungen der Gesamtüberlebenszeiten der Patienten nach Kaplan und Meier konnte an dem prätherapeutisch gewonnenen Material gezeigt werden, daß die Patienten mit in der immunhistochemischen Markierung VEGF-negativen Tumoren gegenüber den Patienten mit VEGF-positiven Tumoren eine statistisch signifikant längere Überlebenszeit aufwiesen. In diesem kleinen Kollektiv konnte die VEGF-Expression demnach als möglicher Prognosefaktor dargestellt werden. Die mit dem polyklonalen VEGF-Antikörper erzielten Ergebnisse ließen keine statistische Auswertung zu. Die wesentliche Ursache ist hierbei in der geringen Spezifität des verwendeten Antikörpers zu sehen. Die Flt-1-Expression hatte im zur Verfügung stehenden Kollektiv keinen Einfluß auf das klinische oder histomorphologische Ansprechen der Tumoren auf die Therapie. Auch ließen sich signifikant unterschiedliche Überlebenszeiten der Patienten in Abhängigkeit von der Flt-1-Expression nicht nachweisen. Eine statistisch signifikante Koexpression von VEGF und seinem Rezeptor Flt-1 ließ sich ebenfalls nicht nachweisen. Zusammenfassend ließ sich VEGF in diesem kleinen Kollektiv als ein Faktor darstellen, der möglicherweise prognostische und therapeutische Bedeutung bei multimodalen Behandlungkonzepten lokal fortgeschrittener bösartiger nicht-kleinzelliger Lungentumoren erlangen könnte. Diese Ergebnisse müssen in größeren Studien weiter überprüft werden, vor allem da bisher veröffentlichte Untersuchungen zu sowohl übereinstimmenden als auch abweichenden Ergebnissen im Hinblick auf die Eignung von VEGF als Prognosefaktor kommen. Auch die mögliche Bedeutung von Flt-1 als Prognosefaktor in diesem Patientenkollektiv ist noch nicht abschließend zu beurteilen. 87 7. Literaturverzeichnis 1) Baillie, R., Carlile, J., Pendleton, L., Schor, A.M. Prognostic value of vascularity and vascular endothelial growth factor expression in non-small cell lung cancer. J. Clin. Pathol. 54, 116-120 (2001) 2) Barleon, B., Sozzani, S., Zhou, D., Weich, H.A., Mantovani, A., Marme, D. Migration of Human Monocytes in Response to Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Is Mediated via the VEGF Receptor flt-1. Blood 87(8), 3336-3343 (1996) 3) Barleon, B., Siemeister, G., Martiny-Baron, G., Weindel, K., Herzog, C., Marme, D. Vascular Endothelial Growth Factor Up-Regulates Its Receptor fms-like Tyrosine Kinase 1 (FLT-1) and a Souble Variant of FLT-1 in Human Vascular Endothelial Cells. Cancer Res. 57, 5421-5425 (1997) 4) Bonomi, P.D., Finkelstein, D.M., Ruckdeschel, J.C. Combination chemotherapy versus single agent followed by combination chemotherapy in stage IV non-small cell lung cancer: A study of the eastern cooperative oncology group. J. Clin. Oncol. 7, 1602-1613 (1989) 5) Brattström, D., Bergqvist, M., Larsson, A., Holmertz, J., Hesselius, P., Rosenberg, L., Brodin, O., Wagenius, G. Basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor in sera from non-small cell lung cancer patients. Anticancer Res. 18, 1123-1128 (1998) 6) Brock, T., Dvorak, H.F., Senger, D.R. Tumor-secreted vascular permeability factor increases cytosolic Ca2+ and von Willebrand factor release in human endothelial cells. Am. J. Pathol. 138, 213-221 (1991) 88 7) Brown, L.F., Berse, B., Jackman, R.W., Tognazzi, K., Manseau, E.J., Dvorak, H.F., Senger, D.R. Increased Expression of Vascular Permeability Factor (Vascular Endothelial Growth Factor) and It´s Receptors in Kidney and Bladder Carcinomas. Am. J. Pathol. 143, 1255-1262 (1993) 8) Buccheri, G., Ferigno, D., Rosso, A. Further evidence in favour of chemotherapy for inoperable non-small cell lung cancer. Lung Cancer 6, 87-98 (1990) 9) Bunn, P.A., Kelly, K. New chemotherapeutic agents prolong survival and improve qualitiy of life in nonsmall cell lung cancer: A review of the literature and future directions. Clin. Can. Res. 5, 1087-1100 (1998) 10) Bussolati, B., Dunk, C., Grohman, M., Kontos, C.D., Mason, J., Ahmed, A. Vascular endothelial growth factor receptor-1 modulates vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesis via nitric oxide. Am. J. Pathol. 159(3), 993-1008 (2001) 11) Cartei, G., Cartei, F., Cantone, A. Cisplatin-cyclophosphamide-mitomycin combination chemotherapy with supportive care versus supportive care alone for treatment of metastatic non-small cell lung cancer. J. Natl. Cancer Inst. 85, 794-800 (1993) 12) Cordell, J.L., Falini, B., Erber, W.N., Ghosh, A.K., Abdulaziz, Z., MacDonald, S., Pulford, K.A., Stein, H., Mason, D.Y. Immunoenzymatic labeling of monoclonal antibodies using immune complexes of alkaline phosphatase and monoclonal anti-alkaline phosphatase (APAAP complexes). J. Histochem. Cytochem. 32, 219-229 (1984) 89 13) Cormier, Y., Bergeron, D., La Forge, J. Benefits of polychemotherapy in advanced non-small cell bronchogenic carcinoma. Cancer 50, 845-849 (1982) 14) Crino, L., Tonato, M., Darwish, S. A randomized trial of three cisplatin-containing regimens in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC): A study of the Umbrian Lung Cancer Group. Cancer Chemother. Pharmacol. 26, 52-56 (1990) 15) Decaussin, M., Sartelet, H., Robert, C., Moro, D., Claraz, C., Brambilla, C., Brambilla, E. Expression of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and its two receptors (VEGF-R1-Flt1 and VEGF-R2-Flk1/KDR) in Non-Small Cell Lung Carcinomas (NSCLC): Correlation with Angiogenesis and Survival. J. Pathol. 188, 369-377 (1999) 16) Deutsche Krebsgesellschaft Kurzgefasste Interdisziplinäre Leitlinien 2002 Diagnose und Therapie maligner Erkrankungen Zuckschwerdt 3. Auflage 2002 17) Drings, P., Dienemann, H., Wannenmacher, M. (Hrsg.) Management des Lungenkarzinoms Becker, H., Wahrendorf, J., S. 15-18 Müller, K.-M., S. 148-150 Springer Verlag Berlin Heidelberg 2003 18) Elliot, J.A., Ahmedzai, S., Hole, D. Vindesine and cisplatin combination chemotherapy compared with vindesine as a single agent in the management of non-small cell lung cancer: a randomized study. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 20, 1025-1032 (1984) 90 19) Ferrara ,N., Houck, K.A., Jakeman, L.B., Winer, J., Leung, D.W. The vascular endothelial growth factor family of polypeptides. J. Cell Biochem. 47, 211-218 (1991) 20) Fidler, I., Ellis, L.M. The implications of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis. Cell 79, 185-188 (1994) 21) Folkman, J., Shing, Y. Angiogenesis. J. Biol. Chem. 267, 10931-10934 (1992) 22) Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat. Med. 1(1), 27-31 (1995) 23) Fontanini, G., Bigini, D., Vignati, S., Basolo, F., Mussi, A., Lucchi, M., Chine, S., Angeletti, C.A., Harris, A.L., Bevilacqua, G. Microvessel count predicts metastatic disease and survival in non-small cell lung cancer. J. Pathol. 177, 57-63 (1995) 24) Fontanini, G., Boldrini, L., Vignati, S. Bcl2 and p53 regulate vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis in non-small cell lung carcinoma. Eur. J. Cancer 34, 718-23 (1998) 25) Fontanini, G., Boldrini, L., Chine, S., Pisaturo, F., Basolo, F., Calcinai, A., Lucchi, M., Mussi, A., Angeletti, C.A., Bevilacqua, G. Expression of vascular endothelial growth factor mRNA in non-small-cell lung carcinomas. Br. J. Cancer 79(2), 363-369 (1999) 91 26) Fox, S.B., Gatter, K.C., Harris, A.L. Tumour angiogenesis: review article. J. Pathol. 179, 232-37 (1996) 27) Fry, W.A., Menck, H.R., Winchester, W.P. The National Cancer Data Base report on lung cancer. Cancer 77(9), 1947-55 (1996) 28) Furuse, K., Fukuoka, M., Kawahara, M., Nishikawa, H., Takada, Y., Kudoh, S., Katagami, N., Ariyoshi, Y. Phase III study of concurrent versus sequential thoracic radiotherapy in combination with mitomycin, vindesine, and cisplatin in unresectable stage III nonsmall-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 17(9), 2692-2699 (1999) 29) Giatromanolaki, A., Koukourakis, M.I., Kakolyris, S., Turley, H., Scott, P.A.E., Pezzella, F., Georgoulias, V., Harris, A.L. and Gatter, K.C. Vascular Endothelial Growth Factor, Wild-Type p53, and angiogenesis in Early Operable Non-Small Cell Lung Cancer. Clin. Cancer Res. 4, 3017-3024 (1998) 30) Giatromanolaki, A., Koukourakis, M.I., Sivridis, E., O´Byrne, K., Harris, A.L. and Gatter, K.C. Invading edge versus inner patterns of vascularisation: an interplay between angiogenic and vascular survival factors defines the clinical behaviour of non-small cell lung cancer. J. Pathol. 192(2), 140-9 (2000) 31) Green, S., Weiss, G.R. Southwest Oncology Group standard response criteria, endpoint definitions and toxicity criteria. Invest. New Drugs 10, 239-253 (1992) 92 32) Grugel, S., Finkenzeller, G., Weindel, K., Barleon, B., Marme, D. Both v-H-ras and v-raf stimulate expression of the vascular endothelial growth factor in NIH-3T3. J. Biol. Chem. 270, 25915-25919 (1995) 33) Häußinger, K., Huber, R.M. Bronchialkarzinom (Lungenkrebs). Pneumologie 50, 599-603 (1996) 34) Han, H., Silverman, J.F., Santucci, T.S., Macherey, R.S., Dámato, T.A., Tung, M.Y., Weyant, R.J., Landreneau, R.J. Vascular Endothelial growth factor expression in stage I non-small cell lung cancer correlates with neoangiogenesis and a poor prognosis. Ann. Surg. Oncol. 8(1), 72-9 (2001) 35) Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and Emerging Mechanisms of the Angiogenic Switch during Tumorigenesis. Cell 86, 353-364 (1996) 36) Harmey, J.H., Bouchier-Hayes, D. Vascular endothelial growth factor (VEGF), a survival factor for tumour cells: implications for anti-angiogenic therapy. Bioessays 24(3), 280-283 (2002) 37) Heits, F., Wiedemann, G.J., Jelkmann, W. Der vaskuläre Wachstumsfaktor VEGF stimuliert die Angiogenese im Guten wie im Bösen. Dtsch. Med. Wschr. 123, 259-265 (1998) 38) Hiratsuka, S., Maru, Y., Okada, A., Seiki, M., Noda, T., Shibuya, M. Involvement of Flt-1 Tyrosine Kinase (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1) in Pathological Angiogenesis. Cancer Res. 61, 1207-1213 (2001) 93 39) Hoffman, P.C., Mauer, A.M., Vokes, E.E. Lung cancer. Lancet 355, 479-85 (2000) 40) Holmgren, L., O’Reilly, M.S., Folkman, J. Dormancy of micrometastases: balanced proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis suppression. Nat. Med. 1, 149-153 (1995) 41) Houck, K.A., Ferrara, J., Winer, J., Cachianes, G., Li, B., Leung, D.W. The vascular endothelial growth factor family. Identification of a fourth molecular species and characterisation of alternative splicing of RNA. Mol. Endocrinol. 5, 1806-1814 (1991) 42) Imoto, H., Osaki, T., Taga, S., Ohagami, A., Ichiyoshi, Y., Yasumoto, K. Vascular endothelial growth factor expression in non-small cell lung cancer: prognostic significance in squamous cell carcinoma. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 115(5), 1007-14 (1998) 43) Jahn, I., Jöckel, K.-H., Ahrens, W., Drescher, K., Müller, K.-M., Witzko, K.-H. Ergebnisse der Epidemiologie des Lungenkrebses bei Frauen. Pneumologie 44, 114-23 (1990) 44) Junker, K., Thomas, M., Schulmann, K., Klinke, F., Bosse, U., Müller, K.-M. Tumour regression in non-small-cell-lung cancer following neoadjuvant therapy. Histological assessment. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 123(9), 469-77 (1997) 45) Junker, K. Prognostic factors in stage I/II non-small cell lung cancer. Lung Cancer 33(Suppl. 1), S17-24 (2001) 94 46) Junker, K., Langner, K., Klinke, F., Bosse, U., Thomas, M. Grading of tumor regression in non-small cell lung cancer: morphology and prognosis. Chest 120(5), 1584-1591 (2001) 47) Katoh, O., Tauchi, H., Kawaishi, K., Kimura, A., Satow, Y. Expression of the vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor gene, KDR, in hematopoietic cells and inhibitory effect of VEGF on apoptotic cell death caused by ionizing radiation. Cancer Res. 55, 5687-5692 (1995) 48) Kaplan, E.L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958) 49) Keck, P.J., Hauser, S.D., Krivi, G. Vascular permeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF. Science 246, 1309-12 (1989) 50) Kim, K.J., Li, B., Winer, J., Armanini, M., Gillett, N., Phillips, H.S., Ferrara, N. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo. Nature 362, 841-844 (1993) 51) Koukourakis, M.I. Tumour angiogenesis and response to radiotherapy. Anticancer Res. 21(6B), 4285-4300 (2001) 52) Laack, E., Hossfeld, D.K. Therapie des nichtkleinzelligen Brochialkarzinoms. Dt. Ärzteblatt 97(7), A-373-A-384 (2000) 95 53) Leung, W.T., Shiu, W.C.T., Pang, J.C.K. Combined chemotherapy and radiotherapy versus best supportive care in the treatment of inoperable non-small cell lung cancer. Oncology 49, 321-326 (1992) 54) Macchiarini, P., Fontanini, G., Hardin, M.J., Squartini, F., Angeletti, C.A. Relation of neovascularisation to metastasis of non-small cell lung cancer. Lancet 340, 145-46 (1992) 55) Manegold, C., Schirren, P., Schneider, P., Drings, P. Gegenwärtiger Stand der interdisziplinären Therapie des Stadium III des Bronchialkarzinoms. Pneumologie 50, 735-40 (1996) 56) Manegold, C. Chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer:standards. Lung Cancer 34(Suppl. 2), S165-170 (2001) 57) Martini, N., Kris, M.G., Flehinger, B.J. Preoperative chemotherapy for stage IIIa (N2) lung cancer: The Sloan-Kettering experience with 136 patients. Ann. Thorac. Surg. 55, 1365-1374 (1993) 58) Masuya, D., Huang, C., Liu, D., Kameyama, K., Hayashi, E., Yamauchi, A., Kobayashi, S., Haba, R., Yokomise, H. The intratumoral expression of vascular endothelial growth factor and interleukin-8 associated with angiogenesis in nonsmall cell lung carcinoma patients. Cancer 92(10), 2628-2638 (2001) 59) Mattern, J., Koomagi, R., Volm, M. Vascular endothelial growth factor expression and angiogenesis in non-small cell lung carcinomas. Int. J. Oncol. 6, 1059-1062 (1995) 96 60) Mattern, J., Koomagi, R., Volm, M. Association of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral microvessel density and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma. Br. J. Cancer 73(7), 931-4 (1996) 61) Müller, K.-M., Wiethege, T., Tolnay, E., Junker, K. Variable Biologie der Lungentumoren. Prognosefaktoren durch den Pathologen ? Atemw.-Lungenkrh. 23(6), 302-307 (1997) 62) Mukopadhyay, D., Tsiokas, L., Sukhatme, V.P. Wild-type p53 and v-src exert opposing influences on human vascular endothelial growth factor expression. Cancer Res. 55, 6161-6165 (1995) 63) Noll, S., Schaub-Kuhnen, S. Praxis der Immunhistochemie Urban und Fischer Verlag München Jena 2000 64) O´Byrne, K.J., Koukourakis, M.I., Giatromanolaki, A., Cox, G., Turley, H., Steward, W.P., Gatter, K., Harris, A.L. Vascular endothelial growth factor, platelet-derived endothelial cell growth factor and angiogenesis in non-small cell lung cancer. Br. J. Cancer 82(8), 1427-32 (2000) 65) O´Byrne, K.J., Goddard, J., Giatromanolaki, A., Koukourakis, M.I. Vascular endothelial growth factor expression in non-small cell lung cancer. Methods Mol. Med. 74, 357-373 (2003) 66) Paley, P.J., Staskus, K.A., Gebhard, K. Vascular endothelial growth factor expression in early stage ovarian carcinoma. Cancer 80, 98-106 (1997) 97 67) Plate, K.H., Breier, G., Weich, H.A., Risau, W. Vascular endothelial growth factor is a potential tumor angiogenesis factor in human gliomas in vivo. Nature 359, 845-848 (1992) 68) PORT Meta-analysis Trialists Group Postoperative radiotherapy in non-small cell lung cancer: systematic review and meta-analysis of individual patient data from nine randomised controlled trials. Lancet 352, 257-263 (1998) 69) Quoix, E., Dietemann, A., Charbonneau, J. La chimiotherapie comportant due cisplatine - est elle utile dans le cancer bronchique non microcellulaire au stade IV? Resultats d`une etude randomisee. Bull. Cancer 78, 341-346 (1991) 70) Rapp, E., Pater, J.L., Willan, A. Chemotherapy can prolong survival in patients with advanced non-small cell lung cancer - report of a Canadian multicenter randomized trial. J. Clin. Oncol. 6, 633-641 (1988) 71) Rosell, R., Gomez-Codina, J., Camps, C. A randomized trial comparing pre-operative chemotherapy plus surgery with surgery alone in patients with non-small cell lung cancer. N. Engl. J. Med. 330, 153-158 (1994) 72) Roth, J., Fossella, F., Komaki, R. A randomized trial comparing pre-operative chemotherapy and surgery with surgery alone in resectable stage IIIA non-small cell lung cancer. J. Natl. Cancer Inst. 86, 673-680 (1994) 73) Samoto, K., Ikezaki, K., Ono, M. Expression of vascular endothelial growth factor and its possible relation with neovascularisation in human brain tumors. Cancer Res. 55, 1189-1193 (1995) 98 74) Saunders, M.I., Dische, S., Barrett, N. Continous hyperfractionated, accelerated radiotherapy (CHART) versus conventional radiotherapy in non-small cell lung cancer: mature data from the randomized multicenter trial. CHART Steering committee. Radiother. Oncol. 52(2), 137-148 (1999) 75) Schirren, J., Richter, W., Trainer, C. Chirurgie des Bronchialkarzinoms im Stadium IIIA: Indikation - Technik – Ergebnisse. Langenbecks Arch. Chir. Suppl. II (Kongreßbericht) (1995) 76) Senger, D.R., Galli, S.J., Dvorak, A.M., Perruzzi, C.A., Harvey, V.S., Dvorak, H.F. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science 219, 983-985 (1983) 77) Sheng, H., Aoe, M., Doihara, H., Andou, A., Shimizu, N. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in primary lung carcinoma. Acta Med. Okayama 54(3), 119-126 (2000) 78) Shibusa, T., Shijubo, N., Abe, S. Tumor angiogenesis and vascular endothelial growth factor expression in stage I lung adenocarcinoma. Clin. Cancer Res. 4, 1483-7 (1998) 79) Shimada, H., Hoshino, T., Okazumi, S., Matsubara, H., Funami, Y., Nabeya, Y., Hayashi, H., Takeda, A., Shiratori, T., Uno, T., Ito, H., Ochiai, T. Expression of angiogenic factors predicts response to chemoradiotherapy and prognosis of oesophageal squamous cell carcinoma. Br. J. Cancer 86, 552-557 (2002) 99 80) Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., Keshet, E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxiainitiated angiogenesis. Nature 359, 843-845 (1992) 81) Takanami, I., Tanaka, F., Hashizume, T., Kodaira, S. Vascular Endothelial Growth Factor and its Receptor Correlate with Angiogenesis and Survival in Pulmonary Adenocarcinoma. Anticancer Res. 17, 2811-2814 (1997) 82) Takahashi, Y., Tucker, S.L., Kitadai, Y., Koura, A.N., Ellis, L.M. Vessel counts and expression of vascular endothelial growth factor as prognostic factor in node-negative colon cancer. Arch. Surg. 132, 541-546 (1997) 83) Takashi, S., Noriharu, S., Shosaku, A. Tumor Angiogenesis and Vascular Endothelial Growth Factor Expression in Stage I Lung Adenocarcinoma. Clin. Cancer Res. 4, 1483-1487 (1998) 84) Tanigawa, N., Matsumura, M., Amaya, H., Shimomatsuya, T. Correlation between expression of vascular endothelial growth factor and tumor vascularity, and patients outcome in human gastric carcinoma. J. Clin. Oncol. 15, 826-832 (1997a) 85) Tanigawa, N., Matsumura, M., Amaya, H., Kitaoka, A., Tanaka, T. Tumor vascularity correlates with prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer 79, 220-225 (1997b) 86) Thomas, M., Rübe, C., Semik, M., von Eiff, M., Freitag, L., Macha, H.N., Wagner, W., Klinke, F., Scheld, H.H., Willich, N., Berdel, W.E., Junker, K. Impact of Preoperative Bimodality Induction Including Twice-daily Radiation on Tumor Regression and Survival in Stage III Non-Small-Cell Lung Cancer. J. Clin. Oncol. 17, 1185-1193 (1999) 100 87) Toi, M., Kondo, S., Suzuki, H. Quantitative analysis of vascular endothelial growth factor expression in primary breast cancer. Cancer 77, 1101-1106 (1996) 88) Tolnay, E., Kuhnen, C., Voss, B., Wiethege, T., Müller, K.-M. Expression and localisation of vascular endothelial growth factor and its receptor flt in pulmonary sarcoidosis. Virchows Arch. 432, 61-65 (1998) 89) UICC TNM Klassifikation maligner Tumoren Springer Verlag 4. Auflage, Berlin Heidelberg New York, 1997 90) Volm, M., Koomagi, R., Mattern, J. Interrelationships between Microvessel Density, Expression of VEGF and Resistence to Doxorubicin of Non-Small Cell Lung Carcinoma. Anticancer Res. 16, 213-218 (1996a) 91) Volm, M., Koomagi, R., Mattern, J. Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in primary lung carcinomas and the incidence of metastasis. Int. J. Oncol. 9, 711-714 (1996b) 92) Volm, M., Koomagi, R., Mattern, J. Prognostic value of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in squamous cell lung cancer. Int. J. Cancer 74(1), 64-8 (1997a) 93) Volm, M., Koomagi, R., Mattern, J., Stammler, G. Angiogenic Growth Factors and their Receptors in Non-Small Cell Lung Carcinomas and their Relationship to Drug Response in Vitro. Anticancer Res. 17, 99-104 (1997b) 101 94) Volm, M., Rittgen, W., Drings, P. Prognostic value or ERBB-1, VEGF, cyclin A, FOS, JUN and MYC in patients with sqamous cell lung carcinoma. Br. J. Cancer 77, 663-9 (1998) 95) Volm, M., Koomagi, R. Prognostic relevance of angiogenic, proliferative, and apoptotic factors in lung carcinomas. A case review. Methods Mol. Med. 74, 269-282 (2003) 96) Weidner, N., Semple, J.P., Welch, W.R., Folkman, J. Tumor angiogenesis and metastasis- correlation in invasive breast carcinoma. New Engl. J. Med. 324, 1-8 (1991) 97) WHO International Classifikation of Tumors. Histological Typing of Lung Tumors. Springer Verlag 2. Auflage, Geneva, 1981 98) Wiethege, T., Junker, K., Johnen, G., Krismann, M., Müller, K.-M. Pathologie und Molekularbiologie bösartiger pulmonaler Tumoren. Pathologe 21(6), 404-423 (2000) 99) Yamamoto, Y., Toi, M., Kondo, S., Matsumoto, T., Suzuki, H., Kitamura, M., Tsuruta, K., Taniguchi, T. Concentrations of vascular endothelial growth factor in sera of normal controls and cancer patients. Clin. Cancer Res. 2(5), 821-26 (1996) 100) Yamazaki, K., Abe, S., Takekawa, H. Tumor angiogenesis in human lung adenocarcinoma. Cancer 74, 2245-2250 (1994) 102 101) Yano, T., Tanikawa, S., Fujie, T., Masutani, M., Horie, T. Vascular endothelial growth factor and neovascularisation in non-small cell lung cancer. Eur. J. Cancer 36, 601-608 (2000) 102) Yuan, A., Yu, C.J., Chen, W.J., Lin, F.Y., Kuo, S.H., Luh, K.T.; Yang, P.C. Correlation of total VEGF mRNA and protein expression with histologic type, tumor angiogensis, patient survival and timing of relapse in non-small cell lung cancer. Int. J. Cancer 89(6), 475-83 (2000) 103) Yuan, A., Yu C.J., Kuo, S.H., Chen, W.J., Lin, F.Y., Luh, K.T., Yang, P.C., Lee, Y.C. Vascular endothelial growth factor 189mRNA isoform expression specifically correlates with tumor angiogenesis, patient survival, and postoperative relapse in non-small cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 19(2), 432-441 (2001) 103 8. Danksagung Mein Dank gilt Herrn Professor Dr. med. K.-M. Müller für die gute Betreuung und die konstruktiven Anregungen bei der Fertigstellung dieser Arbeit. Zu Dank verpflichtet bin ich Herrn PD Dr. med. K. Junker für die jederzeit vorhandene gute Betreuung und hilfreiche Unterstützung bei der Erstellung dieser Arbeit. Vielen Dank auch für die Überlassung dieses sehr interessanten Themas im Zusammenhang mit Lungentumoren. Für die Bereitstellung des Studienmaterials danke ich Herrn Dr. med. Bosse, Herrn Prof. Dr. med. Bürrig und Herrn Prof. Dr. med. Böcker sowie für die Weitergabe der klinischen Daten Herrn PD Dr. med. Thomas. Vielen Dank auch an Herrn Dr. med. Karsten Schulmann, der besonders in der Anfangsphase dieser Arbeit von großer Hilfe war. Von den Mitarbeitern des Instituts für Pathologie an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil danke ich besonders Frau Schaub für die Unterstützung bei den immunhistochemischen Färbungen und Frau Troske für die tatkräftige Hilfe bei der Bearbeitung der Abbildungen. Vielen Dank auch an Herrn Herbert Efing und Herrn Bernhard Schmidt für die Hilfe beim Einrichten und Korrekturlesen dieser Arbeit. Zuletzt auch Dank an meine Eltern, die durch ihr Anspornen in schwierigen Phasen ebenfalls einen Anteil an der Fertigstellung dieser Arbeit hatten. 104 9. Lebenslauf Persönliche Daten: Barbara Manemann Aachenerstr. 31b, 45711 Datteln geboren am: 26.September 1975 in Münster, Westfalen Staatsangehörigkeit: deutsch Familienstand: ledig Ausbildung: 1982-1986 Maria-Frieden-Grundschule in Coesfeld 1986-1995 St.-Pius Gymnasium in Coesfeld (1995 Abschluß: Allgemeine Hochschulreife 1995-2001 Studentin der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum August 1997 Ärztliche Vorprüfung August 1998 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung August 2000 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Feb. 1999- Juni 2000 Studentische Hilfskraft am Institut für Pathologie der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil in Bochum, Direktor: Prof. Dr. med. K.-M. Müller Oktober 2000 1. Tertial des Praktischen Jahres in der Medizinischen Klinik am Knappschaftskrankenhaus in Bochum Februar 2001 2. Tertial in der Chirurgie des St. Luke’s Hospital in Valetta/Malta Juni 2001 3. Tertial in der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. JosefHospital in Bochum November 2001 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Ab Dezember 2001 Ärztin im Praktikum an der Vestischen Kinder- und Jugendklinik in Datteln Seit Juni 2003 Assistenzärztin an der Vestischen Kinder- und Jugendklinik in Datteln Interessen: Seit dem 10. Lebensjahr Violoncellounterricht; Mitglied eines Streichquartetts seit 1998; während des Studiums Mitglied des Universitätssinfonieorchesters, zur Zeit Mitglied des Collegium musicum in Münster 105
