Die Rolle von Stammzellen bei der Regeneration und Reparatur

Belema Bedada, Fikru et al. | Die Rolle von Stammzellen bei der Regeneration und Reparatur...
Tätigkeitsbericht 2006
Entwicklungs- und Evolutionsbiologie/Genetik
Immun- und Infektionsbiologie/Medizin
Die Rolle von Stammzellen bei der Regeneration und Reparatur von
Organen
Belema Bedada, Fikru; Heil, Matthias
Max-Planck-Institut Herz- und Lungenforschung, Bad Nauheim
Korrespondierender Autor
Heil, Matthias, E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Einen wichtigen Schwerpunkt am Max-Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung in Bad Nauheim bildet die Erforschung der Prozesse, die für Regeneration und Reparatur von Organen, vor allem
des Herzens, verantwortlich sind. Frühere Studien zeigten, dass Stammzellen hierbei eine wichtige
Rolle spielen könnten. In einem ihrer Projekte beschäftigten sich die Wissenschaftler deshalb mit der
Frage, ob adulte oder embryonale Stammzellen in der Lage sind, sich zu vollständig entwickelten
Gewebszellen wie Skelett- oder Herzmuskelzellen zu differenzieren. Die Daten zeigen, dass man
durch die Verwendung bestimmter Faktoren, die für die Zelldifferenzierung wichtig sind, tatsächlich
in den Stammzellen Programme abrufen kann, die zum Erwerb von charakteristischen Eigenschaften
für Muskelzellen führen. Jedoch konnten adulte Stammzellen nicht in vollständig entwickelte Muskelzellen überführt werden. Dagegen beobachteten die Forscher in der Kulturschale die Fusion adulter Stammzellen und fertiger Muskelzellen. Dies ist als ein Hinweis auf die Aktivierung eventueller
Reparaturmechanismen zu werten: Bei der Reparatur der Muskulatur spielt nicht die Umwandlung von
Stammzellen in Muskelzellen die entscheidende Rolle, sondern vielmehr wird durch Verschmelzung
von Muskelzelle und Stammzelle die Vitalität der kranken Zelle wiederhergestellt. In einer weiteren
Studie beschäftigten sich die Max-Planck-Forscher mit der Frage, ob Stammzellen bei der Regeneration von infarktgeschädigtem Herzgewebe eine Rolle spielen. Hier konnten sie zeigen, dass die Injektion von Stammzellen aus der Skelettmuskulatur oder von Herzmuskelzellen, die aus embryonalen
Stammzellen hergestellt wurden, im Tiermodell zu einer Erhöhung der Herzfunktion nach Myokardinfarkt führte. Diese positive Wirkung basiert wahrscheinlich darauf, dass wachstumsfördernde Substanzen durch die injizierten Zellen in das geschädigte Herzgewebe freigesetzt werden.
Abstract
The Max-Planck-Institute for Heart and Lung Research in Bad Nauheim focusses on research on the
processes being responsible for regeneration and repair of organs such as the heart. Previous studies
had shown that stem cells might play an important role. In one of their projects scientists therefore
investigated the potential of adult and embryonal stem cells to differentiate into completely developed
tissue cells such as skeletal muscle or heart muscle cells. Data show that the use of specific differention factors indeed induces cell programmes which lead to the expression of typical muscle-cell specific
factors. However, stem cells could not completely be transfered into muscle cells. In contrast, researchers observed in vitro experiments the fusion of stem cells and differentiated muscle cells, which
could point towards a potential repair mechanism: Muscle repair may not be mediated by transdifferentiation of stem cells into muscle cells, but rather by fusion of stem and muscle cell. Doing so,
vitality of the “sick” cell might be improved. In a second study, Max-Planck researchers investigated
whether stem cells might contribute to the repair of heart tissue after myocardial infarction. They showed that after injection of stem cells isolated from skeletal muscles or of heart muscle cells which had
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be risen from embryonic stem cells, that at least in an animal model heart function can be improved.
The positive effect most likely is based on a mechanism, in which growth stimulating substances are
released into the damaged heart tissue by the injected cells.
I. Entstehung von Zellen mit gewebsspezifischen Eigenschaften aus adulten Stammzellen des
Knochenmarks
Üblicherweise unterscheidet man grundlegend zwei verschiedene Arten von Stammzellen. Beiden ist
gemein, dass sie zunächst undifferenziert sind, das heißt man kann sie keiner fertigen Gewebszelle
zuordnen. Zum einen handelt es sich dabei um so genannte „embryonale Stammzellen“. Sie sind für
die Embryonalentwicklung eines Organismus verantwortlich, wobei aus ihnen alle im Körper vorkommenden Gewebstypen entstehen. Dagegen werden bestimmte Zellen im fertig entwickelten Organismus, die ebenfalls die Fähigkeit besitzen, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, als „adulte
Stammzellen“ bezeichnet. Klassischerweise wurden adulte Stammzellen im Knochenmark untersucht, insbesondere weil ebendort auch die Blutbildung aus Blutstammzellen, den hämatopoietischen
Stammzellen, abläuft und für den Nachschub an Blutzellen sorgt. Weniger bekannt ist dagegen, dass
adulte Stammzellen auch in nahezu allen Organen zu finden sind. Ihre Funktion dort ist noch nicht
völlig entschlüsselt; man geht aber davon aus, dass sie für die Gewebsregeneration beispielsweise in
Leber, Herz und Skelettmuskulatur wichtig sind. Es ist denkbar, dass die adulten Stammzellen an Reparaturen nach Verletzungen beteiligt sind (zum Beispiel bei Muskelverletzungen), zum anderen dass
der immer wiederkehrende spontane Verlust einzelner Zellen in den Organen durch diese Stammzellen
kompensiert wird.
Die Wissenschaftler am MPI für Herz- und Lungenforschung beschäftigen sich mit der noch immer
ungeklärten Frage, auf welche Weise diese undifferenzierten Stammzellen die Eigenschaften einer
kompletten Gewebszelle erhalten. Prinzipiell sind zwei Mechanismen denkbar: Entweder empfängt die
Stammzelle ein Signal, das ihre Weiterentwicklung in Richtung Gewebszelle einleitet. In diesem Falle
würde eine Stammzelle sich also in eine Gewebszelle differenzieren. Im Gegensatz dazu könnte es
aber auch sein, dass Zellen, die nicht unbedingt die Eigenschaften einer „typischen“ Stammzelle haben
müssten, mit einer (kranken) Gewebszelle verschmelzen („fusionieren“). Dadurch könnten sie die
gewebstypischen Eigenschaften der ursprünglichen Zelle annehmen und so das jeweilige, geschädigte
Gewebe erneuern.
Herstellung zweier Stammzelllinien
Um im Labor der Frage nachgehen zu können, welcher der beiden möglichen Mechanismen nun
tatsächlich für die Entwicklung spezialisierter Zellen aus Stammzellen verantwortlich ist, war es zunächst wichtig, eine reine Kultur dieser Zellen anzulegen. Daher wurden aus allen aus dem Knochenmark einer Maus gewonnenen Zellen zwei einzelne Zellen zunächst isoliert und in Kultur genommen
und dann zu einer Population genetisch identischer Zellen, einer so genannten Stammzelllinie, herangezogen. Die charakteristischen Eigenschaften der beiden Linien wurden zunächst intensiv analysiert.
Mittels immunologischer Verfahren und durch Genanalysen konnten die Wissenschaftler so sehen,
dass eine Reihe typischer Zellmarker (bestimmte Proteine, die nur auf einer bestimmten Zelle oder
auf wenigen Zelltypen zu finden sind) auf beiden Zelllinien zu finden sind. Allerdings war die Expressionsstärke zweier wichtiger Stammzell-Marker (CD34 und sca-1) unterschiedlich. Dies gab einen
Hinweis darauf, dass es nicht die eine Stammzelle zu geben scheint, sondern die Population sich aus
verschiedenen, ähnlichen Zellen zusammensetzt. Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass in
den adulten Stammzellen auch einige Gene aktiv sind, die eigentlich charakteristisch für embryonale
Stammzellen sind, so zum Beispiel Gene mit den Namen Oct3/4, SSEA-1, Rex-1 und B-myb.
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Ausbildung von Muskelmarkern nach Stimulierung
Die Muskelzellen in der Skelettmuskulatur und im Herzen sind zwar im Prinzip recht ähnlich aufgebaut, unterscheiden sich aber im Detail. Während der Embryonalentwicklung entscheidet die Anwesenheit bestimmter Proteine darüber, ob aus den undifferenzierten embryonalen Stammzellen eine
Skelett- oder eine Herzmuskelzelle entsteht. Da die verantwortlichen Faktoren zum großen Teil bekannt sind, konnten die Forscher dieses Wissen nutzen und die Zellen in die eine oder andere Richtung
schicken: In der Kulturschale wurden nun die beiden Stammzelllinien mit einigen dieser Entwicklungfaktoren (eine wichtige Rolle spielen unter anderem verschiedene „wnt“-Proteine) behandelt (Abb.
1).
Abb. 1: Immunhistologische Charakterisierung einer adulten Stammzelllinie. Nach Stimulierung der Zellen
mit verschiedenen so genannten wnt-Molekülen (a-c) konnte in den Zellen die Bildung von Proteinen („myosin
heavy chain“, rot gefärbt) gezeigt werden, die typisch für Skelettmuskelzellen sind. Dagegen war dieses Markerprotein in unstimulierten Zellen (d) nicht nachweisbar. Abb.1e zeigt eine Muskelzelle, die als Positivkontrolle
verwendet wurde. Zur besseren Orientierung wurden Zellkerne mit einem Kernfarbstoff blau angefärbt.
Urheber: Max-Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung/Heil
Alternativ wurden andere im Embryo ablaufende Mechanismen wie die epigenetische Reprogrammierung – hier handelt es sich um eine dauerhafte Modifikation der Gene ohne Veränderung der primären
Basenfolge – imitiert. Tatsächlich zeigten die Stammzellen daraufhin eine Vielzahl Muskelzell-spezifischer Marker (u. a. waren die Gene Myf5, MyoD, Pax7, Myogenin und MRF4 aktiv), was einen Hinweis darauf gab, dass eine Entwicklung in Richtung Muskelzelle stattgefunden hatte. Zudem wurden
auch für Muskelzellen wichtige Strukturproteine gebildet. Zusätzlich bedienten die Wissenschaftler
sich eines besonderen Kunstgriffs, um die Daten abzusichern. So wurden die Zellen mit einem fremden Gen beladen, das für einen grünen Fluoreszenzfarbstoff codiert. Gleichzeitig wurde sichergestellt, dass dieser grüne Farbstoff nur dann gebildet wurde, wenn die Zelle auch die schwere Kette
des Muskelproteins Myosin herstellt. Die Tatsache, dass die meisten Zellen nach einer gewissen Zeit
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unter UV-Licht grün leuchteten, war somit ein weiterer Beleg für die Anwesenheit des Muskelproteins.
Außerdem konnte noch ein für Skelettmuskelzellen typischer Vorgang nachgewiesen werden, nämlich
die Fusion von Einzelzellen (Abb. 2 und 3). Kultivierte man die aus den Stammzellen hervorgegangenen Zellen zusammen mit voll entwickelten Muskelzellen, konnte häufig das Verschmelzen von Zellen
beider Abstammung beobachtet werden.
Abb. 2: Die obere Abbildung zeigt in der Bildmitte das Produkt der Fusion einer multipotenten, adulten Stammzelle, durch die Expression eines grün fluoreszierenden Proteins markiert, mit einer Herzmuskelzelle (rot gefärbt). Daneben sind nicht fusionierte Stamm- und Herzmuskelzellen.
Untere Abbildung: Die Kombination von Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie zeigt die Expression des
grünen Stammzellmarkers im Zellkern einer Hybrid-Herzmuskelzelle. Daneben sind mehrere nicht fusionierte
Zellen zu sehen.
Urheber: Max-Planck-Institut für Herz- und Lungenforschung/Heil
Auf halben Weg stehengeblieben?
Obwohl es durch die Behandlung der Stammzellen mit den Entwicklungsfaktoren gelang, eine ganze
Reihe von Genen zu aktivieren, die für Herz- oder Skelettmuskelzellen typisch sind, sind letztendlich
einige Einschränkungen zu machen. Es mangelte den Zellen nämlich am Ende noch immer an einigen
wichtigen funktionellen und morphologischen Eigenschaften, die eigentlich für Muskelzellen charakteristisch wären. So zeigten sie beispielsweise keine Kontraktionsaktivität, was natürlich für Muskelzellen beiden Typs entscheidend wäre. Hier gilt es nun, die Frage nach dem Warum zu klären. Denkbar
wäre, dass der Cocktail der Entwicklungsfaktoren nicht komplett war, sodass die Zellen den letzten
Differenzierungsschritt nicht machen konnten. Denkbar wäre aber auch, dass adulte Stammzellen
letztendlich gar nicht das Potenzial besitzen, komplette und funktionelle Muskelzellen zu werden. Ein
Mechanismus, wie diese Zellen dennoch an der Regeneration der Muskulatur beteiligt sein könnten,
kann man aus einem weiteren Experiment ableiten: Wurden Stamm- und Muskelzelle zwar in einem
Gefäß, darin aber räumlich getrennt kultiviert, sodass alle wichtigen Signalmoleküle aus den Muskelzellen freien Zugang zu den Stammzellen hatten, blieb eine Differenzierung der Stammzellen in Muskelzellen aus. Als man hingegen die räumliche Trennung aufhob, konnte die Fusion von Stammzellen
und Muskelzellen beobachten werden.
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Abb. 3: Nachweis einer Fusion von Stammzelle und Muskelzelle.
In diesem Experiment wurden menschliche mesenchymale Stammzellen, die einen grünen Fluoreszenzfarbstoff
produzieren, zusammen mit Muskelzellen aus der Maus kultiviert. Die Abbildung zeigt das Ergebnis der Fusion:
In der fusionierten Zelle können sowohl der grüne Farbstoff aus der Stammzelle als auch ein für Muskelzellen
typisches Protein (rot; wegen der Überlagerung beider Farben teilweise orange). Gleichzeitig besitzt das Fusionsprodukt sowohl Zellkerne aus der Maus (blau) als auch Kerne aus der menschlichen Stammzelle (Pfeile), die
sich durch ihre Größe und schwächere Blaufärbung von Maus-Zellkernen unterscheiden lassen.
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Differenzierung in alle Richtungen möglich
Für die Wissenschaftler war weiterhin die Frage interessant, ob die beiden Stammzelllinien auch ein
Potenzial zur Differenzierung in andere spezifische Gewebszellen besitzen. Nach gleichem Schema
wie bei der muskelspezifischen Differenzierung wurden die Zellen nun mit anderen Faktoren behandelt. Gab man Faktoren zu den Zellen, die in der Embryonalentwicklung an der Entwicklung von
Nervenzellen beteiligt sind, zeigten sich in den ehemaligen Stammzellen Nerven-spezifische Marker.
Nach der Behandlung mit Faktoren für die Knochenbildung wurden charakteristische Marker für Knochenzellen gefunden. Außerdem induzierte die Behandlung mit einem Leberzellen-Wachstumsfaktor
die Expression von Albumin und SEK-1, ein Hinweis auf Leberzellen. Aus diesen Versuchen konnte
abgeleitet werden, dass es sich bei den kultivierten Stammzellen um Zellen handelt, die einen geringen
Differenzierungsgrad aufweisen und eine ausgeprägte Fähigkeit besitzen, sich in verschiedene gewebsspezifische Zellen zu entwickeln.
II. Können aus embryonalen Stammzellen entwickelte Zellen oder adulte Muskelstammzellen
ein Infarkt-geschädigtes Herz heilen?
Gegenwärtig wird intensiv die Frage diskutiert, inwieweit Stammzellen zur Regeneration der Herzmuskulatur nach einem Infarkt beitragen. Zwar gibt es einige Forschergruppen, die berichten, dass
verschiedene Stammzellpopulationen nach einem solchen Myokardinfarkt in der Herzwand zu finden
seien und zudem die Funktion von Herzmuskelzellen oder Zellen der Blutgefäßwand übernähmen; die
Studien sind allerdings umstritten. Allein ein Blick auf die gesundheitliche Entwicklung von Infarktpatienten zeigt, dass derlei Prozesse in der Regel zumindest nicht allzu effektiv sein können. Im Gegensatz dazu steht die Frage, inwieweit man aus Stammzellen gezüchtete Herzzellen therapeutisch nutzen
kann, um zerstörtes Myokard (Herzmuskel) zu regenerieren. Zu dieser Fragestellung konnte das Team
in Bad Nauheim einige interessante Daten gewinnen. Ihr Experiment bestand darin, Stammzellen aus
der Skelettmuskulatur oder alternativ Herzmuskelzellen, die aus embryonalen Stammzellen herangezogen worden waren, in das Myokard von Mäusen zu injizieren. Bei diesen Tieren war zuvor durch
den Verschluss eines Herzkranzgefäßes experimentell ein Infarkt ausgelöst worden. Mittels moderner
Verfahren, zu dem die Magnetresonanztomographie gehört (hier steht ein Gerät zur Verfügung, das
speziell für Untersuchungen an Kleintieren entwickelt wurde), konnte die Herzfunktion nach Auslösung des Myokardinfarkts untersucht werden (Abb. 4). Tatsächlich stellten sie fest, dass die Injektion
der beiden Zelltypen in das geschädigte Gewebe langfristig zu einer verbesserten Pumpleistung des
Herzens führte. Zudem zeigten histologische Untersuchungen vier Wochen nach Versuchsbeginn, dass
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bei den mit den Zellen behandelten Mäusen die Dimension des Infarktgebietes kleiner ausfiel, ebenfalls ein Hinweis auf einen positiven Effekt der Zellen. Entsprechend war bei diesen Mäusen auch
weniger Narbengewebe zu finden, das als Folge des Infarkts gebildet wird. Jedoch fanden die Forscher
in den Herzen der so behandelten Mäuse zu diesem Zeitpunkt keine Zelle mehr im Myokard, die aus
den ursprünglich injizierten Zellen hervorgegangen war. Stattdessen konnten sie allerdings zeigen,
dass die Stammzellen in der Lage waren, verschiedene wachstumsfördernde Substanzen abzugeben.
Dies bedeutet demnach, dass der positive Effekt der injizierten Stammzellen nicht primär auf den Ersatz zerstörter Herzzellen zurückzuführen ist. Vielmehr werden Faktoren freigesetzt, die anschließend
einen Regenerationsprozess fördern, der auf den ursprünglichen Herzmuskelzellen basiert.
Abb. 4: So genannter Vierkammerblick auf das Herz einer Maus mittels Magnet-Resonanztomographie. In der
Darstellung kann man die beiden Herzkammern (Ventrikel), die Vorhöfe (Atrien) sowie die Aorta deutlich erkennen. Mit dem speziell für die Untersuchung von Kleintieren konstruierten Gerät, das mit einer Feldstärke von 7,1
Tesla arbeitet, lassen sich Details bis ungefähr 20 Mikrometer Größe darstellen.
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