Experimentelle Ansätze zur Untersuchung spezifischer

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung
spezifischer Prozessierung
extrazytoplasmatischer Proteine durch drei
allele Signalpeptidasen aus
Bradyrhizobium japonicum
Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
dem
Fachbereich Biologie
der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Patrick Nilles
aus Koblenz
Marburg/Lahn 2008
Vom Fachbereich Biologie
der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am 16.12.2008 angenommen.
Erstgutachter: Professor Dr. Uwe G. Maier
Zweitgutachter: Professor Dr. Michael Bölker
Tag der mündlichen Prüfung am 19.02.2009
Inhaltsverzeichnis
1.
Inhaltsverzeichnis
1.
Inhaltsverzeichnis..........................................................................................................1
2.
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen...............................................................9
3.
Übersicht......................................................................................................................12
4.
Einleitung.....................................................................................................................14
4.1
Die Rhizobien-Leguminosen-Symbiose............................................................14
4.2
Allgemeine Übersicht über die Grundlagen der Proteinprozessierung und
die Funktion von Signalpeptidasen...................................................................18
4.3
Vorarbeiten zu dieser Dissertation....................................................................21
4.3.1 Identifizierung von extrazytoplasmatische Proteine kodierenden
Genen aus B. japonicum mittels Phagen-Display..................................21
4.3.2 Funktionale und topologische Klassifizierung der identifizierten
Proteine.................................................................................................23
4.3.3 Vektorintegrationsmutagenese ausgewählter Gene für
extrazytoplasmatische Proteine.............................................................24
4.4
Im Knöllchen (nodule) exprimierte Gene (nex-Gene).......................................26
4.4.1 nex18 in S. meliloti................................................................................26
4.4.2 Die beiden nex18-Homologen von B. japonicum..................................26
4.4.3 Ähnliche Proteine in anderen Organismen............................................27
1
Inhaltsverzeichnis
4.5
Die Organismen.................................................................................................28
4.5.1 Escherichia coli.....................................................................................28
4.5.2 Bradyrhizobium japonicum...................................................................29
4.6
Ziele der vorliegenden Dissertation...................................................................32
4.6.1 Nachweis bisher unbestätigter Vektorintegrationsmutanten
in verschiedenen Genen aus B. japonicum............................................32
4.6.2 Versuche zur Erzeugung von Deletionen der beiden
nex18-Leserahmen in B. japonicum......................................................32
4.6.3 Experimente zur Etablierung eines Versuchssystems
zur Untersuchung der Signalpeptidasen aus B. japonicum
in einem stabilen genetischen Hintergrund............................................33
5.
Ergebnisse....................................................................................................................34
5.1
Nachweis der erfolgreichen Vektorintegration in Genen verschiedener extrazytoplasmatischer Proteine................................................................................34
5.1.1 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK242...................................35
5.1.2 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK305...................................37
5.1.3 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK309...................................37
5.1.4 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK409...................................38
5.1.5 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK240...................................38
2
Inhaltsverzeichnis
5.1.6 Weitere untersuchte Mutanten...............................................................39
5.1.7 Zusammenfassung der Ergebnisse.........................................................40
5.2
Einzel- und Doppeldeletionsmutanten von nex-Allelen in
B. japonicum......................................................................................................41
5.2.1 Klonierung der Deletionskonstrukte für blr2474 und bll5191..............41
5.2.2 Selektion auf Deletionsmutanten der nex18-ähnlichen Leserahmen.....44
5.2.3 Aktueller Stand der Versuche zur Erzeugung von Δblr2474- und
Δbll5191-Mutanten................................................................................46
5.3
Etablierung der verschiedenen Signalpeptidasen von B. japonicum im
Genom von E. coli.............................................................................................48
5.3.1 Entwicklung einer Strategie zum Austausch des lepB-Gens in
E.coli......................................................................................................48
5.3.2 Die Erzeugung einer transkriptionellen Einheit aus verschiedenen
sip-Leserahmen und einem Kanamycin-Resistenzgen..........................49
5.3.3 Ligation der transkriptionellen Einheit mit den flankierenden
Bereichen des lep-Operons zum Erhalt der Genaustauschkonstrukte...50
5.3.4 Expression des lep-Operons unter Verwendung eines thermosensitiven Hilfsplasmids........................................................................52
5.3.5 Transformation linearer PCR-Amplifikate der Genaustauschkonstrukte in E. coli K12 JC7623 mit pFDX600ΩAmp-lepAB............53
3
Inhaltsverzeichnis
5.3.6 Selektion auf doppelte homologe Rekombinationsereignisse durch
geeignete Bedingungen..........................................................................53
5.3.7 Überprüfung der doppelten homologen Rekombinationsereignisse durch PCR.............................................................................54
5.3.8 Wachstumsexperimente zur Charakterisierung der
Genaustauschmutanten..........................................................................54
5.3.9 Weitere Überprüfung der erhaltenen Klone..........................................59
5.3.10 Zusammenfassung der Ergebnisse für die Erzeugung der
Genaustauschmutanten..........................................................................62
6.
Diskussion....................................................................................................................63
6.1
Mögliche Funktionen einzelner extrazytoplasmatischer Proteine bei
der Etablierung einer intakten Symbiose zwischen B. japonicum
und Glycine max................................................................................................63
6.1.1 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK242...................................63
6.1.2 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK305...................................65
6.1.3 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK309...................................65
6.1.4 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK409...................................66
6.1.5 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK240...................................68
6.1.6 Mutanten ohne nachgewiesene Integration...........................................72
6.1.7 Schlussfolgerungen................................................................................72
4
Inhaltsverzeichnis
6.2
Mögliche Aufgaben der beiden Nex18-Homologen in B. japonicum...............73
6.2.1 Deletion der nex18-Homologe in B. japonicum....................................73
6.2.2 Identifizierung eines dritten nex18-ähnlichen Leserahmens, bll0507...76
6.3
Versuche zur Konstruktion sip-exprimierender E. coli-Stämme......................78
6.3.1 Konstruktion von lepB-sip-Austauschmutanten in E. coli....................78
6.3.2 Unterschiede zwischen LepB und den drei Signalpeptidasen aus
B. japonicum..........................................................................................80
6.3.3 Verwendungsmöglichkeiten der entwickelten Klonierstrategie............80
7.
Ausblick........................................................................................................................82
7.1
Weitere Experimente mit den zur Verfügung stehenden Vektorintegrationsmutanten............................................................................................................82
7.1.1 Komplementationsversuche...................................................................82
7.1.2 Folgeexperimente mit den untersuchten B. japonicum-Mutanten.........83
7.1.3 Charakterisierung weiterer Vektorintegrationsmutanten zur
Untersuchung extrazytoplasmatischer Proteine.....................................84
7.2
Untersuchungen der Nex18-Homologen aus B. japonicum..............................85
7.2.1 Charakterisierung der Deletionsmutante des offenen Leserahmens
bll5191...................................................................................................85
7.2.2 Herstellung von verschiedenen Doppeldeletionsmutanten zur Untersuchung der einzelnen nex18-ähnlichen Leserahmen...........................85
5
Inhaltsverzeichnis
7.2.3 Herstellung von Dreifach-Deletionsmutanten zur Untersuchung der
Funktion Nex18-ähnlicher Proteine in B. japonicum............................86
7.3
lepB-Deletionsmutanten....................................................................................87
7.3.1 Vektorbasierte Expression von Genen für extrazytoplasmatische
Proteine aus B. japonicum in einem genetisch stabilenTestsystem.......87
8.
Material und Methoden..............................................................................................88
8.1
Liste der verwendeten und konstruierten Plasmide...........................................88
8.2
Liste der verwendeten Bakterienstämme...........................................................89
8.3
Liste der verwendeten Oligonukleotide.............................................................90
8.4
Chemikalienverzeichnis....................................................................................93
8.5
Liste der verwendeten Kitsysteme.....................................................................94
8.6
Liste der verwendeten Enzyme.........................................................................95
8.7
Geräte und Verbrauchsmaterialien....................................................................95
8.8
Beschreibung verwendeter Arbeitsmethoden....................................................98
8.8.1 Amplifikation von Plasmiden und genomischer DNA aus Bakterien...98
8.8.2 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen.......................99
8.8.3 Aufreinigung von PCR-Amplifikaten ohne vorherige Gelelektrophorese...................................................................................................99
8.8.4 Bestimmung von DNA-Konzentrationen in Lösungen.........................99
6
Inhaltsverzeichnis
8.8.5 Bestimmung der Zelldichte von Kulturen...........................................100
8.8.6 DNA-Sequenzierung...........................................................................100
8.8.7 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA....................................100
8.8.8 Herstellung kompetenter Zellen..........................................................102
8.8.9 Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterien.........................................102
8.8.10 Konjugation von B. japonicum mittels E. coli S17-1..........................103
8.8.11 Ligation verschiedener DNA-Fragmente............................................104
8.8.12 Phosphatasebehandlung restringierter DNA-Moleküle.......................104
8.8.13 Polymerasekettenreaktion (PCR).........................................................105
8.8.14 Restriktionsanalyse von DNA-Molekülen...........................................105
8.8.15 Selektive Anzucht von Bakterien........................................................106
8.8.16 Sondenherstellung und Southern-Hybridisierung...............................106
8.8.17 Transformation von E. coli..................................................................109
8.8.18 Wachstumsbedingungen......................................................................110
8.9
Liste verwendeter Computerprogramme und Online-Tools............................110
8.9.1 Computerprogramme...........................................................................110
8.9.2 Onlinetools und Datenbanken.............................................................111
7
Inhaltsverzeichnis
9.
Medien, Puffer und Lösungen..................................................................................112
9.1
Medien.............................................................................................................112
9.2
Puffer...............................................................................................................116
9.3
Lösungen.........................................................................................................118
10.
Literaturverzeichnis..................................................................................................120
11.
Zusammenfassung.....................................................................................................131
12.
Danksagung................................................................................................................132
13.
Curriculum Vitae......................................................................................................133
14.
Erklärung...................................................................................................................134
8
Liste der verwendeten Abkürzungen
2.
Liste der verwendeten Abkürzungen
A
Adenin
abs.
absolut
Amp
Ampicillin
APS
Ammoniumpersulfat
AS
Aminosäure
ATP
Adenosin-5'-Triphosphat
B. j.
Bradyrhizobium japonicum
B. japonicum Bradyrhizobium japonicum
bll
offizielle Nomenklatur für große, auf dem entgegen dem Uhrzeigersinn
orientierten DNA-Strang des zirkulären Chromosoms kodierte, offene
Leserahmen aus B. japonicum gemäß RhizoBase (B. japonicum large left)
blr
offizielle Nomenklatur für große, auf dem im Uhrzeigersinn orientierten DNAStrang des zirkulären Chromosoms kodierte, offene Leserahmen aus
B. japonicum gemäß RhizoBase (B. japonicum large right)
bp
Basenpaar(-e)
bsl
offizielle Nomenklatur für kleine, auf dem entgegen dem Uhrzeigersinn
orientierten DNA-Strang des zirkulären Chromosoms kodierte, offene
Leserahmen aus B. japonicum gemäß RhizoBase (B. japonicum small left)
bsr
offizielle Nomenklatur für kleine, auf dem im Uhrzeigersinn orientierten DNAStrang des zirkulären Chromosoms kodierte, offene Leserahmen aus
B. japonicum gemäß RhizoBase (B. japonicum small right)
C
Cytosin
Cm
Chloramphenicol
DMF
Dimethylformamid
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic acid)
dNTPs
Mix
aus
bestehend
2-'Desoxynukleosid-5'-Triphosphaten
aus
für
Desoxyadenosin-5'-Triphosphat,
PCR-Anwendungen,
Desoxyguanosin-5'-
Triphosphat, Desoxycytidin-5'-Triphosphat und Thymidin-5'-Triphosphat.
dYT
Nährmedium für Escherichia coli (double yeast extract + tryptone)
E. c.
Escherichia coli
E. coli
Escherichia coli
9
Liste der verwendeten Abkürzungen
EDTA
Ethylendiamin-tetraacetat
EtBr
Ethidiumbromid
EtOH
Ethanol
f.c.
Endkonzentration (final concentration)
g
Gramm
G
Guanin
gDNA
genomische Gesamt-DNA
Gm
Gentamycin
h
Stunde
kb
Kilobase(-n)
kbp
Kilobasenpaare
Km
Kanamycin
l
Liter
MeOH
Methanol
mg
Milligramm
min
Minute
ml
Milliliter
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
nm
Nanometer
nt
Nukleotid
OD600
Optische Dichte bei einer Lichtwellenlänge von 600 nm
p.a.
pro analysi
PA
antibiotic medium No.3 (assay broth)
PCR
Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
P"genA"
Promotor für "genA"
PSY
Nährmedium für Bradyrhizobium japonicum (peptone salt yeast extract)
rcf
tatsächliche Zentrifugalkraft (real centrifugal force)
Rif
Rifampicin
rpm
Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
RT
Raumtemperatur
xR
Resistenz gegen die Substanz x
s
Sekunde
S. m.
Sinorhizobium meliloti
10
Liste der verwendeten Abkürzungen
S. meliloti
Sinorhizobium meliloti
Sm
Streptomycin
Spc
Spectinomycin
xS
Sensitivität gegenüber der Substanz x
T
Thymin
ta
Annealingzeit
Ta
Annealingtemperatur
TAE
Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TBE
Tris-Borat-EDTA-Puffer
Tc
Tetracyclin
telong
Elongationszeit
TEMED
Tetramethylethylendiamin
ü. N.
über Nacht
UV
Ultraviolett
v/v
Volumenanteil pro Volumenanteil (volume per volume)
w/v
Gewichtsanteil pro Volumenanteil (weight per volume)
w/w
Gewichtsanteil pro Gewichtsanteil (weight per weight)
X-Gal
5-Brom-4-Chlor-3-indoxyl-D-galactosid
Sonderzeichen
°C
Grad Celsius
::
Fusion zweier Gene zu einer transkriptionellen Einheit
∆
deletiert
ΩAmp
Ampicilin-Resistenzkassette auf Grundlage der von Prentki, Fellay und Krisch
entwickelten pHP45-Ω-Vektoren.
ΩKm
Kanamycin-Resistenzkassette auf Grundlage der von Prentki, Fellay und
Krisch entwickelten pHP45-Ω-Vektoren.
ΩSm/Spc
Streptomycin/Spectinomycin-Resistenzkassette auf Grundlage der von Prentki,
Fellay und Krisch entwickelten pHP45-Ω-Vektoren.
ΩTc
Tetracyclin-Resistenzkassette auf Grundlage der von Prentki, Fellay und
Krisch entwickelten pHP45-Ω-Vektoren.
'/"
Minute(-n) / Sekunde(-n)
11
Übersicht
3.
Übersicht
Die vorliegende Arbeit diente der Fortführung bereits begonnener Untersuchungen zur
Prozessierung von Präproteinen des Wurzelknöllchenbakteriums Bradyrhizobium japonicum.
Hierbei stand die Frage im Mittelpunkt, welche Rolle insbesondere extrazytoplasmatische
Proteine bei der Ausbildung einer funktionellen Symbiose zwischen B. japonicum und der
Wirtspflanze Glycine max spielen.
Bereits 2003 wurden zahlreiche sekretierte Proteine aus B. japonicum mithilfe eines PhagenDisplay-Systems identifiziert und nach funktionellen Gesichtspunkten geordnet (Rosander et
al., 2003). Proteine, die eine mögliche Rolle während der Symbiose spielen, wurden
ausgewählt und für Vektorintegrationsmutagenesen herangezogen. Hierbei handelt es sich um
eine besondere Form der Genunterbrechungsmutagenese, bei der über eine einfache
Rekombination eines zentralen Genbereichs ein gesamtes Plasmid in den zu unterbrechenden
Leserahmen eingebracht wird. Auf diese Weise hat die erzielte Integration nicht nur eine
direkte Auswirkung auf den betroffenen Leserahmen, sondern unterbricht auch eine mögliche
Operonstruktur durch polare Effekte auf nachfolgende Gene. Aufgrund
dieser früheren
Versuche stehen in der Arbeitsgruppe zahlreiche Mutanten mit symbiotisch auffälligem
Phänotyp zur Verfügung. Bei einem Teil dieser Mutanten wurde erstmals im Rahmen dieser
Arbeit die Vektorintegration als Mutationsursache nachgewiesen. Von besonderem Interesse
sind hierbei zwei identische Leserahmen, die Homologe von Nex18 kodieren, einem Protein,
welches in Sinorhizobium meliloti bereits als im Knöllchen exprimiert bestätigt wurde (Oke
and Long, 1999a), dessen Funktion jedoch nicht geklärt ist. Da in B. japonicum aufgrund der
absolut identischen Sequenzen der beiden Gene keine eindeutige Zuordnung der
Integrationsmutanten zum einen oder anderen ORF möglich war, sollten zur genaueren
Charakterisierung von Blr2474 und Bll5191 im Rahmen dieser Arbeit einzelne Deletionen der
beiden betroffenenen ORFs blr2474 und bll5191, sowie eine Doppeldeletionsmutante erzeugt
werden.
Das Hauptprojekt der Arbeit bestand in der Entwicklung eines gentisch stabilen
Versuchssystems
zur
Untersuchung
der
drei
verschiedenen
Signalpeptidasen
aus
B. japonicum. Hierzu sollte das Gen, welches die Leaderpeptidase LepB in Escherichia coli
kodiert, durch jeweils eines der Gene, die für die rhizobiellen Signalpeptidasen kodieren,
ersetzt werden. Die zu entwickelnde Strategie musste gestatten, ein als essentiell
beschriebenes Gen in E. coli zu eliminieren und durch ein heterologes Gen zu ersetzen.
Während Methoden zur Erzeugung konditionaler Mutanten bereits mehrfach beschrieben
12
Übersicht
wurden (Jasin and Schimmel, 1984; Hamilton et al., 1989; Link et al., 1997; Dalbert and
Smith, 1997; Chaperon, 2006), wurde im vorliegenden Fall eine Eliminierung des betroffenen
Gens angestrebt. Eine in trans-Expression von einem Plasmid sollte unterbleiben und das
eingebrachte heterologe Gen durch die Kombination von Deletion und Komplementation
unter die Kontrolle des ursprünglichen Promotors gestellt werden.
13
Einleitung
4.
Einleitung
4.1
Die Rhizobien-Leguminosen-Symbiose
Die Befähigung zur Fixierung von elementarem Luftstickstoff ist unter Prokaryoten weit
verbreitet. Die hierfür notwendigen Stoffwechselwege finden sich sowohl in Archaea (z. B.
Methanococcus voltae) (Souillard and Sibold, 1986), als auch in Gram-positiven (z. B.
Bacillus polymyxa) (Lindberg and Granhall, 1984) und Gram-negativen (z.B. Klebsiella
pneumoniae) (Cannon and Postgate, 1976) Eubakterien. Im Gegensatz zu dieser weiten
Verbreitung innerhalb der Prokaryoten fehlen die entsprechenden Stoffwechselwege in
Eukaryoten gänzlich. Diese erschließen sich daher häufig die Stickstofffixierungsleistung von
Bakterien im Rahmen einer Symbiose.
Etliche Mitglieder der Pflanzenordnung Fabales gehen diese Symbiose mit Bakterien der
Familie der Rhizobiaceae ein. Die folgende Tabelle gibt einige Beispiele, ohne Anspruch auf
Vollständigkeit zu erheben.
Fabales-Vertreter
Rhizobieller Partner
Glycine max
Bradyrhizobium japonicum
Lotus sp.
Mesorhizobium loti
Phaseolus vulgaris
Rhizobium etli
Vicia, Trifolium, Phaseolus
Rhizobium leguminosarum
Phaseolus vulgaris
Rhizobium tropici
Medicago truncatula, Medicago sativa
Sinorhizobium meliloti
Sesbania rostrata
Azorhizobium caulinodans
Tabelle 1: Beispiele für Vertreter der Fabales mit assoziierten rhizobiellen Symbiosepartnern.
Dabei entsteht zunächst im Bereich der Rhizosphäre eine lockere Bindung der Bakterien an
die
Oberfläche
der
Pflanzenwurzel.
Durch
die
Synthese
und
Sekretion
von
Lipooligosacchariden, sogenannten Nodulationsfaktoren (Nod-Faktoren) induzieren die
Bakterien die Verkrümmung (root hair curling) oder Deformation von Wurzelhaaren (Yao
and Vincent, 1969; Bhuvaneswari and Solheim, 1985; van Brussel et al., 1990). Hierdurch
entsteht eine Art Tasche, in der die Rhizobien von Pflanzengewebe umschlossen werden.
Innerhalb dieser determinierten Region kommt es nun zu einer lokalen Auflösung der
pflanzlichen Zellwände durch Hydrolyse (Newcomb, 1976; Newcomb et al., 1979; Turgeon
14
Einleitung
and Bauer, 1982). Durch Einstülpung und Erweiterung der Zellmembranen entstehen in der
Folge Infektionsschläuche, durch die die Bakterien ins Innere des Wurzelgewebes gelangen
(Callaham and Torrey, 1981; Turgeon and Bauer, 1985).
Parallel
zur
Ausbildung
der
Infektionsschläuche
werden
lokal
Zellen
des
Wurzelkortexgewebes zur Teilung angeregt. Diese bilden sogenannte Primordien aus, welche
anschließend von den Infektionsschläuchen penetriert werden und zu neuen Pflanzenorganen,
den Wurzelknöllchen, auswachsen (Libbenga and Harkes, 1973; Newcomb, 1981; Vasse and
Truchet, 1984; Wood and Newcomb 1989). Innerhalb der Knöllchen werden die Bakterien
aus dem Infektionsschlauch freigesetzt und differenzieren zu ihrem als Bakteroiden
bezeichneten Symbiosestadium aus.
Es lassen sich mehrere Arten von Knöllchen unterscheiden, die auf verschiedene Typen von
Primordien zurückgehen. Dabei sind zwei Arten besonders verbreitet, auf die sich die
nachfolgenden Erläuterungen beschränken. Bei der ersten Art wurden Zellen des inneren
Wurzelkortexes zur Teilung angeregt. Dies resultiert in einem kontinuierlich teilungsaktiven
Apikalmeristem des Knöllchens, welches über einen längeren Zeitraum von etwa sechs
Wochen permanent Zellen zum proximalen Bereich des Knöllchens abgibt und dadurch
immer weiter nach außen geschoben wird. Man spricht daher auch von indeterminierten
Knöllchen (Libbenga and Harkes, 1973; Newcomb, 1976; Dudley et al., 1987), welche eine
längliche, zigarrenähnliche Form aufweisen. Ein Beispiel für die Ausbildung solcher
indeterminierten Knöllchen bietet die Luzerne (Medicago sativa) nach Infektion durch ihren
Mikrosymbionten S. meliloti (Abb. 1a).
Innerhalb dieser indeterminierten Knöllchen finden sich alle Zustände des Endosymbionten
innerhalb bestimmter Zonen (Vasse et al., 1990). Unmittelbar hinter dem Apikalmeristem (I)
werden teilungsaktive Bakterien aus dem Infektionsschlauch entlassen (II). Diese
differenzieren im Bereich der sogenannten Interzone (IZ) zu Bakteroiden aus. Die
Stickstofffixierung findet in der symbiotischen Zone (III) statt. Im proximalen Bereich des
Knöllchens (IV) kommt es zu Alterungserscheinungen und dem damit einhergehenden Abbau
von Bakteroiden und pflanzlichem Zellmaterial (Abb. 1b).
15
Einleitung
a)
b)
Abb. 1: Indeterminierte Wurzelknöllchen. a) an Medicago truncatula, induziert durch Sinorhizobium meliloti.
(Foto: Thierry Huguet, Institut national de la recherche agronomique (INRA), Frankreich)
b) Schematischer Querschnitt. I: meristematische Zone, II: Infektionszone, IZ: Interzone II-III,
III: symbiotische Zone, IV: Alterungszone. Grün: Knöllchenparenchym; Grau: Leitbündel.
(Abbildung modifiziert nach: Foucher and Kondorosi, 2000)
Im Gegensatz dazu gehen die determinierten Knöllchen auf die Anregung äußerer
Kortexzellen zurück. Auch hierdurch entsteht ein Meristem, dessen Teilungsaktivität jedoch
zeitlich auf etwa zwei Wochen begrenzt ist. Nach einer Reihe von Zellteilungen differenziert
das mit Mikrosymbionten infizierte Gewebe aus und wird zur stickstofffixierenden
Kernregion des Knöllchens (Newcomb et al., 1979; Newcomb, 1981; Turgeon and Bauer,
1985). Aufgrund dieser zeitlich begrenzten Wachstums- und Differenzierungsphasen bilden
determinierte Knöllchen eine sphärische Form aus und weisen im Querschnitt ein Zentrum
aus stickstofffixierungsaktivem Gewebe auf. Ein Beispiel für die Ausbildung solcher
determinierten Knöllchen, die sich vorwiegend bei tropischen Leguminosen finden lassen,
zeigt die Sojapflanze (Glycine max) nach Infektion mit B. japonicum (Abb. 2a).
Aufgrund ihres nicht dauerhaft aktiven Meristems bildet sich in determinierten Knöllchen
keine Zonierung aus, wie sie in indeterminierten Knöllchen zu finden ist (Abb. 2b).
16
Einleitung
a)
b)
Abb. 2: Determinierte Wurzelknöllchen. a) an Glycine max, induziert durch B. japonicum.
(Foto: Hauke Hennecke, ETH Zürich, Schweiz)
b) Schematischer Querschnitt. I: meristematisches Gewebe, mit einer etwa 14 Tage anhaltenden
Teilungsaktivität. Durch das Ende der merestematischen Aktivität verliert sich auch der anfängliche
Gradient in der Differnzierung. Grün: Knöllchenparenchym; Grau: Leitbündel.
(Abbildung modifiziert nach: Pawlowski and Bisseling, 1996)
Obwohl einzelne Punkte wie z. B. die Veränderungen bei Wurzelhaaren (s. S. 9 für
Referenzen), die Ausbildung der Infektionsschläuche (s. S. 10 für Referenzen) oder die
Reifung der Knöllchen (s. S. 10 für Referenzen) bei der Etablierung dieser Symbiosen sehr
genau untersucht wurden und wichtige Schritte, zum Beispiel die Rolle und die Natur der
Nod-Faktoren, zumindest teilweise bekannt sind (D'Haeze, 2001), ist die Gesamtheit der
Interaktion zwischen den Vertretern der Rhizobien und ihren Wirtspflanzen weiterhin ein
Gebiet, auf dem viele Forschungsanstrengungen unternommen werden. Die sowohl von
pflanzlicher als auch von bakterieller Seite notwendige "Kommunikation" der beiden
Symbiosepartner ist in vielen Fällen noch immer ungeklärt.
Sucht man nach Faktoren, die auf bakterieller Seite für diese Interaktion notwendig sein
könnten, so sind extrazytoplasmatische Proteine, also Proteine der äußeren Membran oder
solche, die sekretiert werden, prädestinierte Kandidaten. Ein Schwerpunkt der Forschung an
symbiotischen,
stickstofffixierenden
Bakterien
ist
daher
die
Identifizierung
von
(extrazytoplasmatischen) Proteinen, die an der Ausbildung einer funktionalen Symbiose
beteiligt sind. Die vorliegende Dissertation ist die Fortsetzung von Arbeiten, die im Laufe der
17
Einleitung
letzten Jahre unternommen wurden, um solche symbioserelevanten extrazytoplasmatischen
Proteine aus B. japonicum zu identifizieren. Dabei steht vor allem die Frage im Vordergrund,
ob in diesem Bakterium einzelne Vorläuferproteine — oder definierte Gruppen von
Vorläuferproteinen — spezifisch von einer der insgesamt drei im Genom kodierten
Signalpeptidasen prozessiert werden. Diese Vermutung wird durch die Tatsache gestützt, dass
Transposoninsertionsmutanten
der
involvierten
Gene
sipS,
sipF
und
sipX
drei
unterschiedliche Phänotypen hervorrufen. In allen Fällen ist jedoch eine Störung der
Symbiose zu beobachten (Müller et al., 1995a; Müller et al., 1995b; Bairl and Müller, 1998;
Müller, persönliche Mitteilung). Sollte eine solche spezifische Prozessierung tatsächlich
vorhanden sein, wäre die Frage zu stellen, wodurch sie hervorgerufen wird und welche
physiologischen Funktionen im Organismus dadurch bedingt sind.
Zum besseren Verständnis der durchgeführten Arbeiten soll im folgenden Abschnitt zunächst
einmal ein allgemeiner Überblick über die Prozessierung von Vorläuferproteinen und die
Funktion von Signalpeptidasen gegeben werden.
4.2
Allgemeine Übersicht über die Grundlagen der Proteinprozessierung und die
Funktion von Signalpeptidasen
Proteine, die durch Translokation aus dem Zytoplasma in die äußere Membran, den
periplasmatischen Raum oder - als sekretierte Proteine - in das extrazelluläre Milieu gelangen,
werden unter dem Oberbegriff “extrazytoplasmatische Proteine” zusammengefasst. Solche
Proteine finden sich in allen Organismengruppen. Ihnen ist gemeinsam, dass sie als
Vorläuferproteine synthetisiert werden, die vor der eigentlichen Proteinsequenz ein kurzes, 15
bis 30 Aminosäuren umfassendes Polypeptid aufweisen. Dieses Signal- oder Leaderpeptid
initiiert die Translokation des gesamten Proteins über die Zytoplasmamembran und verankert
es anschließend in dieser (Dalbey et al., 1997). Für diese Vorgänge ist das Zusammenwirken
mehrerer Komponenten des sekretorischen Wegs notwendig. Durch die darauf folgende
proteolytische Trennung des Signalpeptids von den restlichen Aminosäuren ist das Protein in
der Lage, sich von der Membran zu lösen und seinen Bestimmungsort zu erreichen. Diese
Spaltung von Signalpeptid und Protein wird von Typ-I-Signalpeptidasen durchgeführt. Man
kann dabei zwei Untergruppen differenzieren: zum einen die prokaryotischen Typ-ISignalpeptidasen (P-Typ-Signalpeptidasen I) und andererseits die in Eukaryoten vorhandenen
Signalpeptidasen des endoplasmatischen Reticulums (ER-Typ-Signalpeptidasen I). Während
18
Einleitung
die P-Typ-Signalpeptidasen einzelne, membranständige Proteine sind, handelt es sich bei den
eukaryotischen Signalpeptidasen um Komplexe,
die aus
mehreren Untereinheiten
zusammengesetzt sind. So besteht beispielsweise die erste aufgereinigte ER-TypSignalpeptidase aus dem endoplasmatischen Retikulum von Zellen des Hundepankreas aus
fünf Untereinheiten (Evans et al., 1986).
Die Aktivität der Signalpeptidasen an sich ist hierbei nicht entscheidend für die Translokation
der Präproteine. Es konnte gezeigt werden, dass Vorläuferproteine mit einer veränderten,
nicht
prozessierbaren Signalpeptid-Sequenz dennoch über die Zytoplasmamembran
transloziert werden (Koshland et al., 1982; Kuhn and Wickner, 1985; Fikes and Bassford,
1987). Allerdings bleiben diese Proteine inaktiv, weil sie sich aufgrund der vom Signalpeptid
verursachten Verankerung in der Membran nicht in eine native Form falten können. In vitro
konnte jedoch gezeigt werden, dass allein der Verbleib des Signalpeptids am Protein dessen
funktionale Konformation nicht zwangsläufig verhindert und aufgereinigte Vorläuferproteine
aktiv sein können (Haugen and Heath, 1979; Ito, 1982).
Obwohl die Signalpeptidasen ihre Substrate mit sehr hoher Genauigkeit spalten, konnte bisher
keine wirkliche Konsensussequenz gefunden werden. In prokaryotischen Signalpeptiden kann
jedoch häufig eine als “A–X–A”-Motiv bezeichnete Sequenz identifiziert werden. In diesen
Fällen befinden sich an den Positionen –1 und –3 vor der Spaltstelle Alaninreste, die Position
–2 ist nahezu frei belegbar. Diese Aussagen beziehen sich jedoch ausschließlich auf
Prokaryoten. In Eukaryoten weichen die Prozessierungsvorgänge von den prokaryotischen
stark ab. So wurde für mitochondrielle Signalpeptidasen beispielsweise eine gänzlich andere
Substratspezifität gezeigt (Pratje and Guiard, 1986; Schneider et al., 1991; Behrens et al.,
1991).
Die Anzahl an Signalpeptidasen variiert selbst unter den Bakterien sehr stark. Während
E. coli mit LepB nur eine einzige Signalpeptidase besitzt (Silver and Wickner, 1983; March
and Inouye, 1985), weisen viele andere Bakterien mehrere homologe Gene auf. Wie bereits
zuvor erwähnt, verfügt das in dieser Arbeit untersuchte Bakterium B. japonicum über drei für
Signalpeptidasen kodierende Gene, die alle im zirkulären Bakterienchromosom vorliegen.
Auch bei den Gram-positiven Bakterien gibt es große Unterschiede, was die Anzahl und Lage
von Signalpeptidasegenen betrifft. So wurden in Bacillus subtilis fünf chromosomal kodierte
Signalpeptidasen (SipS, SipT, SipU, SipV und SipW) gefunden (Bolhuis et al., 1996; Tjalsma
et al., 1997; Bron et al., 1998), darüber hinaus weitere zwei auf Plasmiden kodierte (Meijer at
al., 1995). Im ebenfalls Gram-positiven Staphylococcus aureus wurden nur zwei
Signalpeptidasen (SpsA und SpsB) identifiziert, die beide chromosomal kodiert sind, von
19
Einleitung
denen eine (SpsA) jedoch wegen fehlender konservierter Aminosäuren keine katalytische
Aktivität besitzt (Cregg et al., 1996).
Obwohl es sich bei all diesen Proteinen um prokaryotische Signalpeptidasen handelt,
unterscheiden
sie
sich
voneinander
in
ihrem
Aufbau.
Anhand
eines
Aminosäuresequenzvergleiches verschiedener Typ-I-Signalpeptidasen von Escherichia coli,
Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis und der Imp1p-Untereinheit der mitochondriellen
Signalpeptidase von Saccharomyces cerevisiae konnten fünf konservierte Domänen (A–E)
ausgemacht werden (van Dijl et al., 1992). Bei der ersten Domäne (A) handelt es sich um
einen aus hydrophoben Aminosäureresten bestehenden, in der Regel N-ständigen Bereich, der
die Zytoplasmamembran durchspannt und als Membrananker fungiert. Diese Domäne kann
jedoch mehrfach vorliegen. Aufgrund direkter Nachweise oder der Analyse vorhandener
Gensequenzen sind Signalpeptidasen mit einem (van Dijl et al., 1992; Cregg et al., 1996;
Philipp et al., 1996) , zwei (Moore and Miura, 1987; Lammertyn et al., 2004) und drei
(Fleischmann et al., 1995) Membrandurchgängen bekannt. Hinzu kommen einige, bei denen
die Domäne A einmal N-ständig auftritt und ein weiteres Mal die Peptidase C-terminal in der
Membran verankert (Schacht et al., 1998; Geukens et al., 2001).
Die Domäne B enthält einen, in allen bekannten Typ-I-Signalpeptidasen konservierten
Serinrest (Position 90 in E.c. LepB). Dieser wurde unabhängig voneinander bei mehreren
Signalpeptidasen als essentiell für die Enzymaktivität beschrieben (Sung and Dalbey, 1992;
Nunnari et al., 1993; van Dijl et al., 1995) und seine biochemische Aktivität durch
Röntgenstrukturanalyse nach Komplexbildung mit einem β-Lactam-Inhibitor nachgewiesen
(Paetzel et al., 1998). Ebenfalls durchgängig konserviert ist in allen P-Typ-Signalpeptidasen I
eine Lysin-Arginin-Sequenz (Lys-145, Arg-146 in E.c.) in der Domäne D. Der Lysinrest
wurde ebenfalls mehrfach als unabdingbar für die katalytische Funktionalität von
Signalpeptidasen beschrieben (Black, 1993; Tschantz et al., 1993; van Dijl et al., 1995). Das
Fehlen der beiden in B und D konservierten Aminosäuren führt zu der weiter oben erwähnten
Inaktivität von SpsA in S. aureus (Cregg et al., 1996). Interessanterweise fehlt das in der
Domäne D konservierte Aminosäurepaar auch in den bisher bekannten ER-TypSignalpeptidasen, für die deshalb ein anderer Wirkmechanismus vorgeschlagen wird (van
Valkenburgh et al., 1999).
Die Domänen C und E enthalten ein konserviertes Gly-Asp-Paar, beziehungsweise ein GlyAsp-Asn-Tripeptid, deren Funktionen jedoch unklar sind. Die Bereiche zwischen den
bekannten
konservierten
Domänen
zeigen,
wenn
überhaupt,
nur
sehr
geringe
Sequenzübereinstimmungen.
20
Einleitung
Die Tatsache, dass trotzdem in mehreren Fällen, ähnlich wie in B. japonicum, eine
Substratspezifität der einzelnen Signalpeptidasen beschrieben wurde (Tjalsma et al., 1997;
Linde et al., 2003, Luo et al., 2003), wirft die Frage auf, wie diese zustande kommt. Das
nahezu ubiquitäre “A–X–A”-Motiv im Signalpeptid kann hierfür alleine nicht verantwortlich
sein. Auch lässt der bisher bekannte, grundsätzliche Aufbau der Signalpeptidasen eine
Ursache für diese Substratspezifität nicht erkennen. Um dieser Frage nachzugehen und
gleichzeitig die Relevanz extrazytoplasmatischer Proteine für die Ausbildung einer
funktionalen Symbiose aufzuzeigen, wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, auf
denen die vorliegende Dissertation basiert.
4.3
Vorarbeiten zu dieser Dissertation
Die Grundlage für die vorliegende Arbeit bilden eine Reihe aufeinander aufbauender
Experimente, die seit 2003 in dem Bestreben unternommen wurden, eine Reihe von
symbioserelevanten extrazytoplasmatischen Proteinen aus B. japonicum zu identifizieren und
ihre Prozessierung durch die drei Signalpeptidasen genauer zu untersuchen. Diese
Vorarbeiten sind im Folgenden näher erläutert.
4.3.1 Identifizierung
von
extrazytoplasmatische
Proteine
kodierenden
Genen
aus
B. japonicum mittels Phagen-Display
Zur Identifizierung von Proteinen, die ein Signalpeptid aufweisen, wurde ein Phagen-DisplaySystem entwickelt und zunächst erfolgreich in Verbindung mit chromosomaler DNA von
S. aureus verwendet (Rosander et al., 2002). Dieses System basiert auf der Verwendung eines
speziellen Phagemidvektors, in dem das Gen für ein Phagenhüllprotein so modifiziert wurde,
dass das Protein ohne eigenes Signalpeptid, aber mit einem eingegliederten artifiziellen
Polypeptid synthetisiert wird. Fusioniert man dieses veränderte Gen mit einem DNA-Stück
aus dem bakteriellen Genom, so wird ein Fusionsprotein exprimiert, welches N-terminal
einen Teil eines bakteriell kodierten Proteins trägt, dann im Kernbereich die artifizielle
Sequenz (VPGAPVPYPDPLEPRA{Y}GSQ) des als E-Tag bezeichneten Polypeptids aufweist
und C-terminal durch das Phagenhüllprotein abgeschlossen wird (Abb.3). Die Besonderheit
des Systems liegt darin, dass in der Nukleotidsequenz des E-Tags an den Positionen 49 bis 51
21
Einleitung
ein Stoppkodon vorliegt. Die Expression der Phagemidvektoren erfolgt deshalb in dem
speziellen E. coli-Stamm TG1, in dem mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit Stoppkodons
supprimiert und statt dessen die Aminosäure Tyrosin eingebaut wird (Frykberg, persönliche
Mitteilung). Dadurch können Fusionskonstrukte zustande kommen, die den für das PhagenDisplay notwendigen Teil des Hüllproteins umfassen, die jedoch bei der Expression in
anderen E. coli-Stämmen mit dem zum Nachweis benötigten E-Tag enden.
zufällige Fragmente
eines bakteriellen Chromosoms
SnaBI
Prom
.
E-Tag
∆gene III
pG3DSS
AmpR
Prom
E-Tag
∆gene III
AmpR
Abb. 3: Schematische Darstellung der Klonierstrategie für das Phagen-Display-System.
Die durch Einbringen eines genomischen DNA-Fragments entstandenen, rekombinanten
Phagemidvektoren werden durch Transformation in E. coli TG1 eingebracht. Dabei wird von
der Annahme ausgegangen, dass nur ein Phagemid pro transformierter Zelle vorhanden ist,
ähnlich wie bei der Transformation mit einem rekombinanten Plasmid.
Durch eine anschließende Infektion mit einem Helferphagen wird in den E. coliTransformanden die Produktion eines Phagengemisches induziert. Während ein Teil des
Gemisches genetisch unveränderte Phagen darstellt, handelt es sich beim zweiten Teil um
rekombinante Klone. Bei diesen wird das Phagenhüllprotein nun auf Grundlage des
vektorständigen modifizierten Gens anstelle des urspünglichen Phagengenoms synthetisiert.
Die resultierenden Fusionsproteine können im Zuge des self-assembly-Prozesses der Phagen
nur dann an die Oberfläche der Zellen gelangen, wenn in dem fusionierten
22
Einleitung
bakteriengenomischen DNA-Fragment die Information für ein Signalpeptid kodiert ist. Dies
liegt daran, dass der ursprünglich für das Signalpeptid des Phagenhüllproteins kodierende Teil
des Gens auf dem Vektor wie erwähnt deletiert wurde.
Die Phagen, die ein Fusionsprotein in ihrer Hülle aufwiesen, werden über einen spezifischen
Antikörper gegen das artifizielle E-Tag aufgereinigt. Sie tragen entweder das unveränderte
Phagengenom, oder den genetisch modifizierten Phagemidvektor. Durch Verwendung einer
nur gering konzentrierten Infektionslösung des Helferphagen lässt sich das Gleichgewicht zu
Gunsten der Phagemidvektoren verschieben. Die DNA aus den rekombinanten Phagen kann
dann isoliert und durch Sequenzanalyse untersucht werden.
Das beschriebene System wurde nach der erfolgreichen Anwendung in S. aureus für ein
entsprechendes Experiment in B. japonicum modifiziert (Rosander et al., 2003). Eine
geringere Größe der Fragmente, die vor das verkürzte Phagengen fusioniert wurden, führte
dazu, dass Ausbeuten von 95 % rekombinanter Klone erreicht wurden. Die Verwendung von
Oligonukleotiden, die im Bereich des artifiziellen E-Tags bzw. des Vektors binden, erlaubt
eine Sequenzierung von aufgereinigter DNA im Fall eines Phagemidvektors, liefert aber für
unmodifizierte Phagengenome kein Ergebnis. Hierdurch war es möglich, die vor das
verkürzte Phagengen fusionierten Fragmente aus B. japonicum zu identifizieren und im
Abgleich mit der verfügbaren Genomsequenz (Kaneko et al., 2002) den jeweils getroffenen
ORF zu bestimmen.
4.3.2 Funktionale und topologische Klassifizierung der identifizierten Proteine
Die über das Phagen-Display-System gefundenen Proteine wurden hinsichtlich ihrer
vorhergesagten oder bestätigten Funktion sortiert. Dabei wurden acht Gruppen unterschieden,
die Proteine mit gleichen Charakteristika umfassten:

Periplasmatische Bindeproteine und Proteine, die Komponenten von
Transportersystemen darstellen,

Proteine der äußeren Membran,

Proteine unterschiedlicher Funktion mit Signalpeptiden,

Hypothetische Proteine mit Signalpeptid,

Signalpeptidhaltige Proteine ohne Homologien in der NCBI-Datenbank,

Signalpeptidhaltige Proteine, die in RhizoBase nicht annotiert waren, aber
gefunden werden konnten,
23
Einleitung

Klone mit Inserts, die in RhizoBase nicht gefunden werden konnten,

Putative Transmembranproteine, bei denen kein Signalpeptid identifiziert werden
konnte.
Interessant war dabei vor allem die sechste Gruppe, in der 12 Proteine erfasst wurden, deren
offene Leserahmen in der Datenbank des Kazusa-Institutes (http://bacteria.kazusa.or.jp/
rhizobase/) nicht annotiert sind, weil sie wegen ihrer geringen Größe unterhalb der
Ausschlussgrenze von 100 Aminosäuren liegen. Dies zeigt, wie sensitiv die gewählte
Methode war und wie exakt sich die erhaltenen Sequenzdaten in der Genomsequenz von
B. japonicum identifizieren ließen.
4.3.3 Vektorintegrationsmutagenese ausgewählter Gene für extrazytoplasmatische Proteine
Zur Klärung der Funktion der über das Phagen-Display gefundenen Proteine wurden
Vektorintegrationsmutanten der betroffenen Gene erzeugt. Hierzu wurde die aus den Phagen
isolierte DNA so amplifiziert, dass den getroffenen Genen das eigene Startkodon fehlte und
sie im 3'-Bereich mit der E-Tag-Sequenz endeten. Die Amplifikate wurden in den
mobilisierbaren Vektor pJQ200SK (Quandt and Hynes, 1993) kloniert und über den
speziellen E. coli-Stamm S17-1 (Simon et al., 1983) in B. japonicum USDA110spc4
(Regensburger and Hennecke, 1983) eingekreuzt. Durch einfache homologe Rekombination
im Bereich der ursprünglich im Phagemidvektor erfassten rhizobiellen DNA wurde nun der
chromosomale Leserahmen des Gens durch das E-Tag und den Plasmidrest von pJQ200SK
unterbrochen (Abb. 4). Da die vektorständige Kopie des Leserahmens kein Startkodon
umfasste, war die Expression eines intakten Genproduktes ausgeschlossen.
Für einen Teil der getroffenen Gene konnte hierdurch eine Symbioserelevanz nachgewiesen
werden, da die Mutationen zu phänotypischen Störungen in der Interaktion mit Glycine max
führten.
24
Einleitung
ne of i
E-Tag
gene of interest
pJQ200SK
ne of interest
ge ne of i
E-Tag
pJQ200SK
Abb. 4: Prinzip der Vektorintegrationsmutagenese für die im Phagen-Display gefundenen Proteine.
Eine Sonderstellung unter den durch das Phagen-Display identifizierten Proteinen nehmen die
beiden Homologe von Nex18 ein. Das Gen nex18 (nodule expressed) wurde ursprünglich bei
einer Studie über differenzierte Genexpression in Bakteroiden von S. meliloti gefunden (Oke
and Long, 1999a). Während dort nur eine einzelne Kopie des offenen Leserahmens vorliegt,
existieren in B. japonicum zwei identische Kopien eines homologen Gens. Dadurch war es
nicht
möglich
zu
bestimmen,
welcher
der
beiden
Leserahmen
durch
die
Vektorintegrationsmutagenese getroffen wurden. Auf diese besonderen Gene wird deshalb im
Kapitel 4.4 etwas näher eingegangen.
Die erzeugten Integrationsmutanten stellen eine hervorragende Basis für die Untersuchung
der postulierten Substratspezifität der verschiedenen Signalpeptidasen dar. Betrachtet man sie
in Verbindung mit einem System, in dem nur eine der drei Signalpeptidasen exprimiert wird,
so müssen mögliche Unterschiede in der Prozessierung sofort ersichtlich werden. Da ein
solches System bisher nur mit der temperatursensitiven lep-Mutante E. coli IT41 (Inada et al.,
1989) zur Verfügung stand, wird zum Abschluß dieser Einleitung im Kapitel 4.5 noch kurz
auf die beiden verwendeten Organismen E. coli und B. japonicum eingegangen und dabei
Besonderheiten im Hinblick auf die Proteinprozessierung und das Rekombinationssystem
beleuchtet.
25
Einleitung
4.4
Im Knöllchen (nodule) exprimierte Gene (nex-Gene)
4.4.1 nex18 in S. meliloti
In S. meliloti wird das 160 Aminosäuren lange Protein Nex18 im ORF SMa1077 kodiert. Das
Gen liegt auf dem Megaplasmid pSymA. In direkter Nachbarschaft finden sich die Gene für
ein kurzes Protein (74 AS) mit unbekannter Funktion (SMa1078) und das Gen für das
regulatorische Protein TspO (SMa1079).
Eine vorhergesagte Transmembrandomäne in dem kurzen Protein weist Ähnlichkeiten zu
einem Membranprotein (accession number: YP_001252966) aus Clostridium botulinum A str.
ATCC 3502 auf (Sebaihia et al., 2007). Beide Proteine sind derzeit noch der Superfamilie
DUF378 (domain of unknown function) zugeordnet. TspO ist ein tryptophanreiches
Sensorprotein. In B. japonicum gibt es zwei identische Gene, die für TspO kodieren und sich
in unmittelbarer Nähe zu den Leserahmen für die Nex18-Homologe befinden. In S. meliloti
konnte gezeigt werden, dass TspO in Abhängigkeit von der Kohlen- und Stickstoffversorgung
der Zelle eine regulatorische Wirkung auf die Expression bestimmter Gene ausübt (Davey and
de Bruijn, 2000).
Die Expression von nex18 in S. meliloti konnte wiederholt als knöllchenspezifisch bestätigt
werden (Oke and Long, 1999a; Gibson et al., 2007). Eine entsprechende Abhängigkeit in der
Induktion wird daher auch für die nex18-Loci von B. japonicum vermutet.
4.4.2 Die beiden nex18-Homologen von B. japonicum
In B. japonicum liegen zwei Gene vor, die für Nex18 kodieren. Die beiden Leserahmen
blr2474 und bll5191 weisen absolut identische Sequenzen auf. Diese Übereinstimmung
erstreckt sich auch über die jeweils benachbarten Leserahmen blr2475 bzw. bll5190, die beide
für TspO kodieren. Aus der Länge der kodierten Proteine, 167 AS für Nex18 und 154 AS für
TspO, zusammen mit der intergenischen Region, ergeben sich zwei Bereiche von jeweils
3.240 bp Länge, die sich nur durch sechs einzelne Nukleotide in der intergenischen Region
voneinander unterscheiden. Erst durch Unterschiede in weiter stromauf- und -abwärts
liegenden DNA-Bereichen ist es möglich, eine eindeutige Zuordnung zum einen oder anderen
26
Einleitung
nex18-Locus vorzunehmen. Diese Unterschiede sollten genutzt werden, um durch homologe
Rekombination Deletionsmutanten in B. japonicum zu erzeugen.
4.4.3 Ähnliche Proteine in anderen Organismen
Alle Nex18-ähnlichen Proteine weisen eine konservierte Domäne auf, die sich auch in
eukaryotischen Fasciclin I-ähnlichen Proteinen findet. Fasciclin I wurde zuerst in der
Fruchtfliege Drosophila melanogaster und der Feldheuschrecke Schistocerca nitens
gefunden. In diesen Organismen ist es für die korrekte Ausbildung der Neuronen
verantwortlich (Zinn et al., 1988; Diamond et al., 1993).
Fasciclin I-ähnliche Proteine sind jedoch in vielen Organismen konserviert. Ihnen wird häufig
eine Rolle bei der Zelladhäsion zugesprochen. In Arabidopsis thaliana (Johnson et al., 2003)
oder den Eierstöcken weiblicher Seeigel (Sato et al., 2004) sorgen Fasciclin I-ähnliche
Proteine für Kontakt zwischen Zellen des gleichen Typs. Es sind jedoch auch mehrere Fälle
beschrieben, in denen Nex18- oder Fasciclin I-ähnliche Proteine in verschiedenen
symbiotischen Gemeinschaften gefunden wurde. So wird z. B. ein Protein mit hoher
Ähnlichkeit zu Nex18 aus S. meliloti von Cyanobakterien der Gattung Nostoc exprimiert.
Diese Expression ist an die symbiotische Lebensform der Flechte Peltigera membranacea
gekoppelt. Freilebende Cyanobakterien exprimieren das Protein nicht oder nur in sehr
geringer Menge (Paulsrud and Lindblad, 2002).
Ein weiteres Beispiel für die Beteiligung eines Fasciclin I-ähnlichen Proteins an einer
Symbiose bietet die Lebensgemeinschaft der Seeanemone Anthopleura elegantissima mit der
Alge Symbiodinium muscatinei (Schwarz and Weis, 2003).
Welche Rolle die Proteine während der Symbiose spielen, ist weder in den genannten
Beispielen, noch bei den Rhizobien genau bekannt. Es konnte allerdings gezeigt werden, dass
eine Unterbrechung des offenen Leserahmens für Nex18 in S. meliloti zu etwa 50 % in der
Bildung von Knöllchen resultiert, welche keine oder nur sehr geringe Stickstofffixierungsleistung aufweisen (Oke and Long, 1999a; Oke and Long, 1999b). Es stellt sich die
Frage, ob ein ähnlicher Phänotyp auch für B. japonicum in Verbindung mit der Sojabohne zu
erwarten wäre. Die beschriebene Besonderheit der Genduplikation von nex18 führt hier
jedoch dazu, dass die mittels Vektorintegrationsmutagenese erzeugten Klone in diesem
speziellen Fall keine experimentelle Grundlage im Hinblick auf die Frage nach der Funktion
des kodierten Proteins bieten. Daher ist die Konstruktion einer Doppelmutante notwendig.
27
Einleitung
4.5
Die Organismen
4.5.1 Escherichia coli
Escherichia coli ist der wohl bekannteste mikrobiologische Labororganismus. Von Theodor
Escherich 1886 entdeckt (Monographie: "Die Darmbakterien des Säuglings und ihre
Beziehungen zur Physiologie der Verdauung." Stuttgart, 1886) und 1919 nach ihm benannt,
wird es bereits seit Beginn des zwanzigsten Jahrhunderts als Modellorganismus in der
Mikrobiologie und der Genetik genutzt. Systematisch gehört E. coli zu den Eubakterien. Als
Vertreter der Enterobacteriaceae ist es in der Klasse der γ-Proteobakterien angesiedelt und,
wie alle Mitglieder dieses Stammes, Gram-negativ. E. coli ist ein gerades, peritrich
begeißeltes Stäbchen, welches sich als fakultativer Anaerobier auch durch gemischte
Säuregärung ernähren kann.
Im Gegensatz zu vielen anderen Bakterien besitzt E. coli mit lepB nur ein einziges Gen für
eine Signalpeptidase. Das Gen wird zusammen mit dem Gen lepA in einem Operon kodiert
(March and Inouye, 1985). Notwendig für die Prozessierung von Präproteinen ist jedoch nur
das Produkt von lepB (Dibb and Wolfe, 1986).
Aufgrund seiner hohen Bedeutung in der Forschung sind bereits Genome von verschiedenen
E. coli-Stämmen vollständig sequenziert und stehen in Datenbanken zur Verfügung (z. B.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=genome oder http://ecocyc.org/. Hier finden
sich unter anderem die Genomsequenzen für folgende E. coli-Stämme: E24377A; HS;
APEC01; 536; UTI89; CFT073; K-12). Weitere Sequenzierungen werden derzeit noch
erstellt. Darüber hinaus sind viele in E. coli gefundene Plasmide vollständig sequenziert. Von
besonderer Bedeutung für die Arbeiten, die im Rahmen dieser Dissertation beziehungsweise
in vorangegangenenen Experimenten durchgeführt wurden, sind die beiden Stämme E. coli
IT41 (Inada et al., 1989) und E. coli K12 JC7623 (Kushner et al., 1971).
Die in E. coli IT41 vorliegende Punktmutation in lepB führt zu einem thermosensitiven
Phänotyp. Die permissive Temperatur liegt bei etwa 32 °C, bei 42 °C ist der Stamm ohne
genetische Komplementation nicht lebensfähig. Diese Eigenschaft machte man sich bisher zu
Nutze, um die Funktionalität von heterologen Signalpeptidasen nachzuweisen, indem man
diese in trans exprimierte und die Fähigkeit zur Komplemantation überprüfte. Das Problem
bei diesen Nachweisen ist jedoch, dass es aufgrund des auf lepB lastenden Selektionsdrucks
zu einer hohen Rate an Reversionen und Suppressormutationen kommt. Hierdurch wird eine
kontinuierliche Kontrolle des genetischen Hintergrundes notwendig. Mit der vorliegenden
28
Einleitung
Dissertation war im Wesentlichen die Aufgabe verbunden, dieses Problem zu lösen und
stabile Stammderivate zu konstruieren, die für Expressionsstudien geeignet sind.
Bei E. coli K12 JC7623 handelt es sich um einen Stamm, der mehrere Mutationen trägt, die
das Rekombinationssystem betreffen. Die Mutation der beiden Loci recB und recC, die an
sich zu einer Inhibierung der Rekombinationsfähigkeit führen müsste (Kushner et al., 1971;
Goldmark and Linn, 1972), wird in diesem Stamm durch eine Suppressormutation in sbcB
ausgeglichen (Kushner et al., 1971). Weil durch den Defekt in sbcB keine Exonuklease I
synthetisiert werden kann, ist es möglich, den Stamm E. coli K12 JC7623 mit linearen DNAFragmenten zu transformieren. Diese Fähigkeit wurde in der Vergangenheit bereits genutzt,
um Deletionsmutanten durch doppelte homologe Rekombination zu erzeugen und die Verwendung eines Vektors zu umgehen (Jasin and Schimmel, 1984; Dalbert and Smith, 1997).
4.5.2 Bradyrhizobium japonicum
Bei Bradyrhizobium japonicum handelt es sich um einen Vertreter der α-Proteobakterien. Es
ist ein langsam wachsendes, Gram-negatives Stäbchen, dessen polar-lateral angeordnete
Flagellen Ähnlichkeiten zum Flagellenapparat verschiedener Vibrio-Spezies aufweist (Kanbe
et al., 2007).
Als Mitglied der Familie Rhizobiaceae ist B. japonicum in der Lage, Luftstickstoff zu
fixieren. Dabei wechselt es, wie alle Rhizobien, von einem freilebenden Stadium in ein
ausdifferenziertes, intrazelluläres Stadium als Endosymbiont. Sein Symbiosepartner ist die
Sojapflanze (Glycine max). Ein weit verbreiteter und gut untersuchter Stamm ist B. japonicum
USDA110 (U. S. Department of Agriculture), der 1957 aus Wurzelknöllchen von aus Florida
stammenden Sojapflanzen isoliert wurde (Kuykendall and Elkan, 1976; Maier and Brill,
1978). Er zeichnet sich im Labor durch eine vergleichsweise hohe spezifische Stickstofffixierungsrate aus.
Die im Dezember 2002 abgeschlossene Genomsequezierung (Kaneko et al., 2002) ergab ein
einzelnes, zirkuläres Chromosom mit einer Gesamtgröße von 9.105.828 bp und einem
durchschnittlichen GC-Gehalt von 64,1 %. In der offiziellen Datenbank "RhizoBase" sind
aktuell (Stand: Juni 2008) 8.317 offene Leserahmen annotiert (http://bacteria.kazusa.or.jp/
rhizobase/Bradyrhizobium/index.html).
29
Einleitung
Die drei Gene für Signalpeptidasen sind mit großen Abständen im Genom verteilt. SipS ist im
Leserahmen bll1167 kodiert, SipF im Leserahmen bll5062 und SipX im Leserahmen bll5628.
Die drei Proteine weisen untereinander hohe Sequenzübereinstimmungen auf, sind jedoch im
Vergleich zu LepB von E. coli leicht unterschiedlich. Die Übereinstimmungen betragen hier
34,25 % für den Vergleich zwischen SipF und LepB, 32,82 % zwischen SipS und LepB und
31,45 % zwischen SipX und LepB (Abb.5). Für SipS und SipF konnte mit Hilfe des IT41Stamms bereits ein Funktionalitätsnachweis erbracht werden, für die dritte Signalpeptidase
SipX stand dieser bisher noch aus.
30
Einleitung
A
B.j.
B.j.
B.j.
E.c.
SipF
SipX
SipS
LepB
----------------------------------MSVTSGTKTESGVG-ETIRVVIHALL
----------------------------------MTTLEQTIRPSAQSREWKAIVILVLL
-----------------------------MSVEKMTATTTKRKSSGWGGQLVQLAGIVAA
MANMFALILVIATLVTGILWCVDKFFFAPKRRERQAAAQAAAGDSLDKATLKKVAPKPGW
:.
*
:.
A
B.j.
B.j.
B.j.
E.c.
SipF
SipX
SipS
LepB
B
I------------ALVIRTFLFQPFNIPSGSMKATLLVGDYLFVSKYSYGYSHYSIPFSP
IPV------LWSPPFLFRFFLYQPFNIPSNSMAPTLMVGDYVFAAKSAYGYDRYSFPYAP
V-------------FIAKGALAEPFYVPSGSMEPTLLIGDALLASKFPYGYGTSSLPIQI
LETGASVFPVLAIVLIVRSFIYEPFQIPSGSMMPTLLIGDFILVEKFAYG-------IKD
:
:: : : :** :**.** .**::** ::. * .**
C
25
26
31
60
73
80
78
113
D
B.j.
B.j.
B.j.
E.c.
SipF
SipX
SipS
LepB
PL-FSGRLWGSDPNRGDIVVFRLPKDDSTDYIKRVIGLPGDRVQMK-------------D
SW-ISGRFFAADPGYGDVVVFRTAKDASVDYVKRVVALPGDRVQMR-------------G
NLPESGRVFAETPKQGDVVVFRWPGDRSQAWVKRVVGLPGDRIQMR-------------Q
PIYQKTLIETGHPKRGDIVVFKYPEDPKLDYIKRAVGLPGDKVTYDPVSKELTIQPGCSS
. .
* **:***: . * . ::**.:.****::
119
126
125
173
B.j.
B.j.
B.j.
E.c.
SipF
SipX
SipS
LepB
GLLYINDTPVERQRMSEYVGEDPCGSEGGG-----------------ISRVKRWKETLPN
GQLVLNDRPVTRVALASVAGGAVCGTDDG-------------------TKIKRWRETLPN
GQLFINDRPAELK----PDGIGAAEDDNGG-----------------SEPAYRYVETLPN
GQACENALPVTYSNVEPSDFVQTFSRRNGGEATSGFFEVPKNETKENGIRLSERKETLGD
*
* *.
.*
. *** :
162
167
164
233
E
B.j.
B.j.
B.j.
E.c.
SipF
SipX
SipS
LepB
G--------VSYETLDCADNGYMDTTNVYTVPAGHFFMMGDNRDNSTDSRF---LGQVGY
G--------ASYVTYDCVDNGYLDNTSVYTVPPGHFFALGDNRDNSTDSRM---MSAMGF
G--------VSHLIFKMRDNGPLDNTPEVTVPAGHLFVLGDNRDNSADSRVPLRSGGVGL
VTHRILTVPIAQDQVGMYYQQPGQQLATWIVPPGQYFMMGDNRDNSADSRY------WGF
:
:
:
**.*: * :*******:***
*
211
216
216
287
B.j.
B.j.
B.j.
E.c.
SipF
SipX
SipS
LepB
VPQENLIGRAQMIFFSIAEGEHAWMFWRWPWAVRWNRFFKIVR
VPMDHLVGKVTRIFWSLDADG----------RLRGERMGKVWLPIDNLVGRADAVLGSWDLGMRGQPVWTWLSGFRLARFFTAVH
VPEANLVGRATAIWMSFDKQEG-----EWPTGLRLSRIGGIH:* :*:*:. : *
.* *:
254
248
259
324
Abb. 5: Alignment der Aminosäuresequenzen von SipF, SipX und SipS aus B. japonicum
gegen LepB aus E. coli. Die in Kap. 4.2 erläuterten konservierten Regionen A-E sind farblich
hinterlegt.
□ = konservierte Serin-, Lysin- und Argininreste (E. c. 90, 145, 146)
□ = sonstige in allen vier Signalpeptidasen konservierten AS-Reste
□ = teilkonservierte Reste innerhalb der rhizobiellen Proteinsequenzen
□ = teilkonservierte Reste zwischen rhizobiellen Proteinsequenzen undE. coli LepB
31
Einleitung
4.6
Ziele der vorliegenden Dissertation
Aus den beschriebenen Vorarbeiten resultieren weiterführende Fragestellungen, von denen
einige die Grundlage dieser Dissertation bilden. Die angestrebten Ziele sind nachstehend kurz
zusammengefasst und erläutert.
4.6.1 Nachweis bisher unbestätigter Vektorintegrationsmutanten in verschiedenen Genen
aus B. japonicum
Für einige der nach dem Phagen-Display erzeugten B. japonicum-Mutanten stand zu Beginn
der Arbeit ein abschließender Nachweis der erfolgreichen chromosomalen Vektorintegration
noch aus. Dieser sollte mittels PCR erbracht werden. Hierfür wurden Oligonukleotide
entworfen, die in den genomischen Bereichen vor der Integrationsstelle binden. Der
entsprechende Gegenprimer wurde als universell verwendbares Oligonukleotid an die
Sequenz des E-Tags angepasst.
Die Problematik dieses Nachweisverfahrens liegt darin, dass aufgrund der in jedem Einzelfall
unterschiedlichen
Integrationsstelle
des
Vektors
mit
unterschiedlich
langen
Amplifikationsprodukten gerechnet werden muß. Geht man von einer Integration nahe des
Beginns eines ORFs aus, so ergibt sich ein Amplifikat von nur einigen hundert Basenpaaren
Länge. Ist der Vektor hingegen am Ende des Leserahmens integriert, so können Amplfikate
von einigen Kilobasenpaaren zustande kommen. Die entsprechenden PCR-Reaktionen
müssen also für jeden Nachweis separat optimiert werden.
4.6.2 Versuche zur Erzeugung von Deletionen der beiden nex18-ähnlichen Leserahmen in
B. japonicum
Zur Untersuchung der Funktion der Nex18-Homologe in B. japonicum sollen die beiden
zugehörigen Gene blr2474 und bll5191 einzeln deletiert, sowie eine Doppeldeletion erzeugt
werden. Da die Vektorintegrationsmutagenese aus den in Kapitel 4.4.2 erläuterten Gründen
hierbei nicht zum Erfolg führen kann, wird ein Austausch der Leserahmen gegen geeignete
Resistenzmarker durch doppelte homologe Rekombination angestrebt. Hierfür sind zunächst
die entsprechenden Austauschkonstrukte zu schaffen. Diese müssen dann unter Zuhilfenahme
32
Einleitung
eines mobilisierbaren Vektors in B. japonicum eingekreuzt werden. Abschließend muß durch
geeignete Selektionsbedingungen ein Verlust des Vektors herbeigeführt werden. Mögliche
resultierende Klone sind abschließend in Pflanzentests auf ihren Phänotyp hin zu untersuchen.
4.6.3 Experimente zur Etablierung eines Versuchssystems zur Untersuchung der
Signalpeptidasen aus B. japonicum in einem stabilen genetischen Hintergrund
Neben den beiden vorstehend beschriebenen Projekten soll im Rahmen dieser Arbeit ein
genetisch stabiles System geschaffen werden, um die Substratspezifität der verschiedenen
Signalpeptidasen aus B. japonicum zu klären. Die erläuterten Probleme beim Arbeiten mit
E. coli IT41 sollen dabei möglichst eliminiert werden. Die Entwicklung einer entsprechenden
Strategie und die Durchführung der geplanten Klonierungen bilden das Hauptziel der
vorliegenden Dissertation. Als Ausgangspunkt für die zu entwickelnde Strategie wird auf die
Tatsache zurückgegriffen, dass für zwei der drei Signalpeptidasen die Fähigkeit gezeigt ist,
E. coli IT41 zu komplementieren. Dementsprechend sollte es auch möglich sein, das
lepB-Gen in E. coli durch die jeweiligen heterologen Gene aus B. japonicum zu ersetzen.
33
Ergebnisse
5.
Ergebnisse
5.1
Nachweis der erfolgreichen Vektorintegration in Genen verschiedener extrazytoplasmatischer Proteine
Bei einigen der durch die beschriebenen Vorarbeiten (vgl. Kapitel 4) erhaltenen Mutanten war
eine Vektor-Integration bisher noch nicht genau erfasst und verifiziert. Im Rahmen dieser
Arbeit sollten daher einige der noch nicht charakterisierten Mutanten hinsichtlich der
erfolgreichen Insertion untersucht werden. Dazu wurden solche Mutanten ausgewählt, bei
denen die Vektorintegration zu auffälligen Phänotypen geführt hat. Zur genaueren
Charakterisierung sollten die zu Grunde liegenden Plasmide mit den E-Tag-Fusionen später in
den zu konstruierenden lepB-sip-Austauschmutanten exprimiert werden. Die für den
Nachweis angewendete Strategie machte es sich zunutze, dass durch die zur Verfügung
stehende Genomsequenz von B. japonicum (Kaneko et al., 2002) die Ableitung von
Oligonukleotidsequenzen aus den genomischen DNA-Bereichen möglich war. Während für
den integrierten Vektor stets das gleiche, im Bereich des E-Tags bindende Oligonukleotid als
reverser Primer verwendet werden konnte, musste für jede Nachweisreaktion ein spezifischer
Vorwärtsprimer entworfen werden (Abb.6).
In Abhängigkeit von der Position des spezifischen Primers und dem, in jedem Einzelfall
unterschiedlichen, Integrationsort des Vektors ergaben sich spezifische Längen für die zu
erwartenden Amplifikationsprodukte, die zwischen einigen hundert Basenpaaren für eine
Integration nahe dem Anfang des Leserahmens und etwas mehr als der gesamten
Leserahmenlänge für eine endständige Insertion variierten (Abb. 6).
Nach erfolgreicher Amplifikation wurden die PCR-Produkte in den Vektor pCR4Blunt-TOPO
(Invitrogen) kloniert. Durch ihre exakte Größe und eine Sequenzanalyse konnte die
Vektorintegration verifiziert und die zufällige Amplifikation eines anderen DNA-Fragments
gleicher Länge ausgeschlossen werden.
Die untersuchten Klone und die jeweiligen Ergebnisse der Nachweis-PCRs sind auf den
nächsten Seiten näher erläutert.
34
Ergebnisse
Kürzeres PCR-Amplifikat nach Integration des
Vektors im Anfangsbereich des betroffenen ORFs.
ne of interest
ge ne of i
E-Tag
pJQ200SK
Längeres PCR-Amplifikat nach Integration des
Vektors im Endbereich des betroffenen ORFs.
ge n e
o f
i n t e r e
n e
o f
i n t e r e s t
E-Tag
pJQ200SK
Abb. 6: Nachweis und Lokalisierung der Vektorintegration mittels PCR.
5.1.1 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK242
Die Mutante BJ-FK242 unterscheidet sich von den übrigen untersuchten Mutanten, denn ihr
liegt eine Vektorintegration im intergenischen Bereich vor einem offenen Leserahmen
zugrunde. Diese hat jedoch eine Unterbrechung des Operons zur Folge, wodurch das Genprodukt des nachfolgenden offenen Leserahmens nicht synthetisiert wird.
Der betroffene ORF bll3735 kodiert für ein putatives Protein der äußeren Membran
(http://bacteria.kazusa.or.jp/rhizobase/Bradyrhizobium/cgi-bin/orfinfo.cgi?title=chr&name=
bll3735&iden=1). Das Genprodukt mit einer Größe von 223 Aminosäuren wird der
Superfamilie
OmpA-ähnlicher
Proteine
zugerechnet
("Superfamily",
Version 1.69:
http://supfam.org/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi?ipid=SSF56925), die sich durch acht
oder mehr β-Faltblatt-Strukturen als Membrandurchgänge auszeichen. Benannt ist diese
Protein-Superfamilie nach dem äußeren Membranprotein OmpA aus E. coli, bei dem die
35
Ergebnisse
konservierten Membrandurchgänge ursprünglich identifiziert (Vogel et al., 1985) und durch
Röntgenstrukturanalyse bestätigt wurden (Pautsch et al., 1998).
Für den Nachweis einer Vektor-Integration wurde ein Amplifikat mit einer Länge von
2.066 bp erwartet. Die PCR-Reaktion lieferte ein Fragment, welches den Erwartungen
entsprach (Abb. 8a). Das bedeutet, dass die nachgewiesene Insertion des Vektors tatsächlich
in Leserichtung vor dem offenen Leserahmen bll3735 erfolgt ist. Ausgehend von der Größe
des Amplifikats und der Auswertung der vorhandenen Sequenzdaten ist die Vektorintegration
93 bp hinter dem Stoppkodon von Leserahmen bll3736 erfolgt, was zu einem Stoppkodon im
Leseraster bei Position 142 (nach dem Stoppkodon von bll3736) und der Unterbrechung der
Operonstruktur durch den integrierten Vektor führt (Abb. 7).
...ATGATCCGCTTCCTGCTCGTTCTCGTCATGCTTGCCGGCACCGCCGGTGC
CGTCGTCGCCTATGGCGATCCCGATCAGATCGCGCGCGCGAGCAACAAGG
TCTCGCACATCTTCCGCACCCAGACCGTCACACCGGCACCCGCCGTGCAG
ATCCAGCGCGGCCAGGGCGGTGAATTCGCGCTGCGCGCGAAGATCAACGG
CGTCGCCGCACCGATGGTGATCGACACCGGTGCGACCTCCGTGGTGCTGA
CCTGGGAAACCGCAAAGGCGATCGGGCTGCCGCTCGAGATGCTCGAATAT
GACGTCGATCTCGAAACCGCGGGCGGCCACACCAAGGCGGCCCGGCTCAC
GCTCGACCGTCTTGCCGTCGGCCACCTCGTTGAGAAATCGGTGCCGGCCC
TCGTCGTGCAGCGCGGGCAGATGAAGACCAATCTGCTCGGCATGAGCTTC
CTCGACCGCCTGGAGAGCTGGGGCGTGCGCGCCGACAAGCTGATGCTCAC
CGGTTATCCGGAGCTCCAGAGCAGCCCCCGCCGCGCGCGGATGGCGGTCG
ACTAGACCGCCCACGCGAGCCGCCGCTCGCCAGCCAACAGGCTCGATCGC
GCGGGCTGTGACCCATCCAGACCACGACTTCAGTTGGCGCGCCGCGAAgt
acccggtgcgccggtgccgtatccggacccactggaaccgcgtgcgtag.
.....ATGATGACTGCAAGAGCCGCGGT........
Abb. 7: Sequenz der intergenischen Region (grau hinterlegt) zwischen bll3735 und bll3736 und des
Leserahmens bll3736 (hellgrün hinterlegt), in Transkriptionsrichtung angegeben. Durch die Vektorintegration wird über das E-Tag (blau hinterlegt) ein weiteres Stoppkodon (tag) in das Leseraster
eingebracht. Die Operonstruktur wird durch die Vektorintegration unterbrochen und es kommt zu
einem Ausfall von bll3735 (hellgelb hinterlegt).
Das durch die Nachweis-PCR erhaltene Amplifikat wurde in den Vektor pCR4Blunt-TOPO
kloniert, um mittels Sequenzierung die zufällige Amplifikation eines unspezifischen
Fragments gleicher Größe auszuschließen.
36
Ergebnisse
5.1.2 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK305
In der Mutante BJ-FK305 ist mit blr2992 ein Gen ausgeschaltet, das für ein unbekanntes
RlpA-ähnliches Protein mit einer Länge von 163 Aminosäuren kodiert. RlpA (rare lipoprotein
A) aus E. coli ist ein Protein, welches aufgrund seines Signalpeptides mit anderen, bekannten
Lipoproteinen in Verbindung gebracht wurde (Takase et al., 1987). Die genaue Funktion des
Genproduktes ist auch in E. coli unbekannt, es konnte jedoch gezeigt werden, dass eine
verkürzte Form von RlpA in der Lage ist, als Suppressor für eine Nullmutation von prc, dem
Gen für die periplasmatische Protease, zu fungieren (Bass et al., 1996).
Das für den Nachweis einer Vektorintegration als Amplifikationsprodukt zu erwartende
Fragment sollte eine Größe von 2.286 bp besitzen. Während das Amplifikat zunächst
unsauber und zu klein erschien (Abb. 8a), konnte durch weitere Optimierung der PCRReaktion zu einem späteren Zeitpunkt die unspezifische Bande bei ~800 bp deutlich reduziert
und ein Amplifikat der erwarteten Größe erzielt werden (Abb. 8c).
5.1.3 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK309
In dieser Mutante wurde der offene Leserahmen blr6636 erfasst, der laut RhizoBase für eine
Untereinheit der ATP-Synthase kodiert. Das Protein weist eine Größe von 262 Aminosären
auf und wurde von Mayer et al. identifiziert (NCBI Nucleotide, direct submission, accession
number AF101072). Wie jedoch in der Diskussion der Ergebnisse in Kapitel 6 erläutert wird,
ist die dem Protein zugeordnete Funktion fraglich.
Für den Nachweis einer erfolgreichen Vektorintegration im Leserahmen blr6636 wurde die
Amplifikation eines 2.860 bp großen Fragmentes erwartet. Dieses konnte auch nachgewiesen
werden (Abb. 8a). Durch die anschließende Sequenzanalyse wurde ein unspezifisches
Amplifikat ausgeschlossen.
37
Ergebnisse
5.1.4 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK409
Die Mutante BJ-FK409 erfasst mit dem im offenen Leserahmen blr5829 kodierten
hypothetischen Protein ein Genprodukt, welches Homologien zu FlaD aus Caulobacter
crescentus aufweist. In diesem Organismus stellt FlaD eine Komponente im Basalkörper des
Flagellums dar, deren Fehlen zu einer Störung in der zeitlich und räumlich organisierten de
novo-Synthese des Flagellenapparates führt (Hahnenberger et al., 1987). Das Protein aus
B. japonicum hat eine Größe von 382 Aminosäuren und ist damit deutlich länger als das 267
Aminosäuren lange Homolog aus C. crescentus.
Der Leserahmen in der B. japonicum Mutante BJ-FK409 wurde an Position 484 durch die
Integration des Vektors unterbrochen. Auch in diesem Fall wurde die Insertion durch
Amplifikation eines Fragments mit einer erwarteten Größe von 3.151 bp nachgewiesen (Abb.
8a) und das Amplifikat durch eine Sequenzanalyse als korrekt bestätigt.
5.1.5 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK240
Diese Mutante enthält den offenen Leserahmen blr2197, der Ähnlichkeiten zum Gen ptxB aus
dem Keuchhustenerreger Bordetella pertussis aufweist. In diesem Organismus kodiert ptxB
für einen Teil der sogenannten B-Untereinheit des Pertussis-Toxins. Neuere Ergebnisse haben
gezeigt, dass bereits diese Untereinheit, ein Heteropentamer, in der Lage ist, die Proliferation
von T-Zellen zu stimulieren (Schneider et al., 2007). Die Funktion des kodierten Proteins in
B. japonicum ist unbekannt.
Die Unterbrechung des offenen Leserahmens durch Insertion des Vektors konnte auch in der
Mutante BJ-FK240 durch Amplifikation eines 1,7 kbp-Fragmentes nachgewiesen werden,
was der erwarteten Größe von exakt 1.700 bp entsprach (Abb. 8b). Die Überprüfung des
Amplifikats erfolgte ebenfalls durch Sequenzanalyse.
38
Ergebnisse
c
b
a
2
M
3
4
1
2
M
1
M
1
2
10,0 kb
8,0 kb
6,0 kb
5,0 kb
4,0 kb
3,0 kb
2,5 kb
2,0 kb
1,5 kb
1,0 kb
0,8 kb
0,6 kb
0,4 kb
0,2 kb
Abb. 8: Nachweis der Vektorintegration in verschiedenen offenen Leserahmen von B. japonicum.
a) Spur 1: Mutante BJ-FK409, Spur 2: Mutante BJ-FK309, Spur 3: Mutante BJ-FK305, Spur 4:
Mutante BJ-FK242. b) Spur 1: Mutante BJ-FK240. c) Spuren 1+2: Mutante BJ-FK305, verbesserte
PCR-Bedingungen.
5.1.6 Weitere untersuchte Mutanten
In zwei weiteren untersuchten Mutanten konnte trotz wiederholten Versuchen zur
Optimierung der Amplifikation unter verschiedenen Bedingungen kein Nachweis über eine
Vektor-Integration erbracht werden. Hierbei handelte es sich zum einen um die Mutante
BJ-FK315, die mit dem offenen Leserahmen bll2431 für ein hypothetisches Protein von 155
Aminosäuren
Größe
Proteintranslokator
kodiert,
welches
(twin-arginine
Ähnlichkeiten
translocation
zu
einem
pathway
Sec-unabhängigen
signal)
aufweist
(http://bacteria.kazusa.or.jp/rhizobase/Bradyrhizobium/cgi-bin/exinfo.cgi?title=chr&name=
bll2431&iden=1). Der zweite Fall, in dem keine Insertion nachgewiesen werden konnte,
betrifft die Mutante BJ-FK343. Hierbei ist der offene Leserahmen blr7958 erfasst. Das Gen
kodiert für einen multiplen Toxinexporter (multidrug resistance efflux pump) mit einer Größe
von 446 Aminosäuren.
39
Ergebnisse
5.1.7 Zusammenfassung der Ergebnisse
In
fünf
der
insgesamt
sieben
untersuchten
Mutanten
wurde
eine
erfolgreiche
Vektorintegrationsmutagenese nachgewiesen. In vier Fällen wurde dabei ein Leserahmen
direkt getroffen, in einem weiteren Fall wurde die Operonstruktur in der dem betroffenen
Leserahmen vorgelagerten Region durch Integration des Vektors unterbrochen. Trotz der
variierenden Längen der für den Nachweis zu erwartenden Amplifikate, die von dem genauen
Ort der Insertion abhängig sind, konnte die angewendete Methode mit einer ausreichenden
Sensitivität ausgeführt werden, um unspezifische Nebenprodukte weitestgehend zu
eliminieren. Darüber hinaus resultiert aus den Versuchen die Verfügbarkeit der Amplifikate in
dem zur Sequenzanalyse geeigneten Vektor pCR4Blunt-TOPO.
40
Ergebnisse
5.2
Einzel- und Doppeldeletionsmutanten von nex-Allelen in B. japonicum
5.2.1 Klonierung der Deletionskonstrukte für blr2474 und bll5191
Da die Erzeugung von Mutanten, bei denen jeweils ein oder beide Leserahmen für Nex18
inaktiviert sind, durch eine Vektorintegrationsmutagenese nicht zu bewerkstelligen ist, wurde
eine neue Strategie für die Deletion der beiden nex18-Loci in B. japonicum entwickelt. Dafür
wurden zunächst Fragmente mit Größen von ca. 1,5 – 2,2 kb aus den genomischen Regionen
amplifiziert, die sich stromauf- und stromabwärts an die identischen Sequenzen von blr2474
und tspO bzw. bll5191 und tspO anschließen. In diesen DNA-Abschnitten unterscheidet sich
das Genom deutlich, so dass eine gerichtete Rekombination ermöglicht wird. Die
resultierenden Flanken nex18-Fl. 1, nex18-Fl. 2, nex18-Fl. 3 und nex18-Fl. 4 wurden zunächst
einzeln in pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) kloniert. Die entstandenen Plasmide wurden mit
pCR4Bl-n1, pCR4Bl-n2, pCR4Bl-n3 und pCR4Bl-n4 bezeichnet (Abb. 9).
Die beiden jeweils zusammengehörenden Flanken 1 und 2 bzw. 3 und 4 wurden anschließend
durch geeignete Restriktionen und Ligation in einem Vektor zusammen geführt. Durch die für
die Amplifikation verwendeten Oligonukleotide und die vor der Zusammenführung
durchgeführten Restriktionen wurde zwischen den beiden Flanken nex18-Fl. 1 und nex18-Fl.
2, bzw. nex18-Fl. 3 und nex18-Fl. 4 jeweils eine singuläre KpnI-Restriktionsschnittstelle
erzeugt, in die später geeignete Resistenzkassetten eingebracht wurden. Die resultierenden
Plasmide wurden mit pCR4Bl-n12 und pCR4Bl-n34 bezeichnet (Abb.9).
Um die Erzeugung einer Doppeldeletionsmutante zu erleichtern, wurden bereits für die
Einzeldeletionen zwei verschiedene Resistenzmarker verwendet. Hierfür wurde auf zwei
modifizierte Ω-Kassetten (Prentki and Krisch, 1984; Fellay et al., 1987) zurückgegriffen. Da
B. japonicum in insgesamt acht ORFs (bll0941, bll2252, blr2617, blr4186, bll5360, blr6230,
blr7890 und blr7893) für eigene β-Lactamasen kodiert, kam die Verwendung einer
Ampicillinresistenz nicht in Frage. Darüber hinaus wurde zur Selektion gegen den zu
verwendenden mobilisierbaren Vektor pJQ200SK (Quandt and Hynes, 1993) bereits
Gentamycin verwendet, so dass auch diese Kassette nicht mehr zur Verfügung stand. Daher
musste
auf
die
Resistenzmarker
gegenüber
Kanamycin
(Ω-Km)
und
Streptomycin/Spectinomycin (Ω-Sm/Spc) zurückgegriffen werden. Diese Auswahl machte es
notwendig, eine der beiden Konstruktionen aus dem bisher verwendeten pTOPO-Vektor in
41
Ergebnisse
ein anderes Replikon zu verlagern, da pCR4Blunt-TOPO ebenfalls eine Kanamycinresistenz
vermittelt und eine positive Selektion auf das Vorhandensein der Ω-Km-Kassette nicht
möglich war. Zu beachten war dabei, dass der neue Vektor keine KpnI-Schnittstelle aufweisen
durfte, da diese singulär zwischen den beiden Flanken benötigt wurde, um die Ω-Kassette
einzubringen. Mit pACYC177 (Chang and Cohen, 1978) wurde ein Plasmid eingesetzt, das
diese Voraussetzung erfüllte. Das Insert von pCR4Bl-n12 wurde amplifiziert und in die
singuläre SmaI-Schnittstelle von pACYC177
kloniert. Dadurch wurde das aphI-Gen
unterbrochen und der resultierende Vektor pACYC177-n12 war kanamycinsensitiv (Abb. 9).
Die beiden ausgewählten Resistenzkassetten wurden amplifiziert und mit KpnI restringiert.
Über die singulären KpnI-Schnittstellen in den Plasmiden pACYC177-n12 und pCR4Bl-n34
erfolgte anschließend die Klonierung. Hieraus resultierten die beiden Plasmide pACYC177n12ΩKm und pCR4Bl-n34ΩSm/Spc (Abb. 9).
Die fertigen Deletionskonstrukte wurden, genau wie die einzelnen Zwischenschritte, durch
Restriktionsanalysen überprüft. Um sie in B. japonicum einbringen zu können, wurden die
Konstrukte amplifiziert und die PCR-Produkte in die singuläre SmaI-Schnittstelle des
mobilisierbaren Vektors pJQ200SK kloniert (Abb. 9). Die Transformation erfolgte direkt in
den zur Konjugation befähigten E. coli-Stamm S17-1. Um eine Möglichkeit zur Eliminierung
dieses Donorstammes nach der erfolgten Einkreuzung der Deletionskonstrukte in
B. japonicum
zu
haben,
wurde
als
Rezipientenstamm B. japonicum USDA110rif15
ausgewählt. Hierbei handelt es sich um ein Derivat des Wildtypstammes mit einer
Spontanresistenz gegenüber Rifampicin (Regensburger and Hennecke, 1984).
42
pACYC177
ΩKm
n
- 34
Ω-Km
Ω-Km
PCR
pCR4Bl
pCR4Bl
tspO
pCR4Bl
pACYC177
nex18-n
-F34
l. 2
he Übersicht
Abb.
der9:Einzelschritte
Schematisc bei der Klonierung der
n
- 12 pJQ200SK
n34
n
- 12
n
-SK
12
n
- 12
pCR4Bl
n
- 1342
blr2474
pCR4Bl
Ω-Km
GmR
Ω-Sm/Spc
pJQ200SK
ΩSm/Spc
GmR
Ω-Sm/Spc
nex18-Deletionskonstrukte.
ΩKm
-
pJQ200
GmR
Ω-Km
pCR4Bl
pCR4Bl
tspO
nex18-Fl. 4
Ω-Sm/Spc
ΩSm/Spc
bll5191
Ω-Sm/Spc
Ergebnisse
43
Ergebnisse
5.2.2 Selektion auf Deletionsmutanten der nex18-ähnlichen Leserahmen
Die Kreuzung des Rezipientenstammes B. japonicum USDA110rif15 mit dem Donorstamm
E. coli S17-1 erfolgte zunächst auf 20E-Agarplatten. Nach einer Inkubationszeit von vier
Tagen wurde das Bakteriengemisch auf PSY-Platten mit 100 µg/ml Rifampicin und
150 µg/ml Streptomycin bzw. Kanamycin übertragen, um positiv auf B. japonicum-Klone zu
selektieren, die einen pJQ200SK-Vektor mit Deletionskonstrukt aufgenommen hatten. Diese
Primärselektion lieferte in der ersten Runde von Kreuzungsexperimenten über 500 Klone für
die Einkreuzung von pJQ200SK-n12ΩKm und 245 Klone für die Einkreuzung von
pJQ200SK-n34ΩSm/Spc.
Zur Unterscheidung von einfachen und doppelten Rekombinationsereignissen wurden 500
Klone von nex18-Fl. 1+2+ΩKm sowie die 245 Klone für nex18-Fl. 3+4+ΩSm/Spc
anschließend auf PSY-Platten mit 150 µg/ml Gentamycin und 100 µg/ml Rifampicin
überimpft. Parallel erfolgte die Vereinzelung auf frischen Platten des primären
Selektionsmediums. Im Falle einer doppelten homologen Rekombination müsste der Verlust
des Vektors zu einer Gentamycinsensitivität führen (Abb. 10).
Tatsächlich war bei keinem der getesteten Klone ein Wachstum unter den beschriebenen
sekundären Selektionsbedingungen festzustellen. Weil ein solches Ergebnis aufgrund der
hohen Anzahl an Klonen unwahrscheinlich erschien, wurden die Klone zunächst erneut
vereinzelt. Da ein möglicher Synergieeffekt der verwendeten Antiobiotika trotz reduzierter
Konzentrationen im Vergleich zu Einzelselektionen nicht ausgeschlossen werden konnte,
wurde diese zweite Vereinzelung auf PSY-Platten durchgeführt, die nur 200 µg/ml
Gentamycin und kein Rifampicin enthielten. Diese Konzentration hat sich in etlichen
vorangegangenen Arbeiten als geeignet für die Selektion von B. japonicum mit Gm als
einzigem Resistenzmarker herausgestellt.
Auch unter diesen weniger stringenten Bedingungen für die Sekundärselektion zeigte keiner
der getesten 745 Klone eine Gentamycinresistenz. Gleichzeitig war ein unbeeinträchtigtes
Wachstum auf den Primärselektionsmedien zu beobachten. Zur Überprüfung möglicher
doppelter Rekombinationsereignisse wurde von einem Teil der Klone genomische DNA
amplifiziert
und
diese
als
Ausgangsmaterial
für
Kontroll-PCRs
verwendet.
Als
Oligonukleotide wurden der Vorwärtsprimer zur Amplifikation von Flanke 1 mit dem
Reversprimer der Flanke 2, bzw. der Vorwärtsprimer für Flanke 3 mit dem Reversprimer der
Flanke 4 kombiniert. Im Fall einer doppelten homologen Rekombination sollte sich für den
Austausch von blr2474 ein Fragment von 5.589 bp Länge amplifizieren lassen, für den
44
Ergebnisse
Austausch von bll5191 ein Fragment von 5.886 bp. Diese würden sich deutlich von den zu
erwartenden Wildtypfragmenten unterscheiden, die Längen von 6.506 bp (blr2474) bzw.
6.981 bp (bll5191) aufweisen. Optional wurden zur Kontrolle die beiden Primer "nex-1genom" und "nex-3-genom" mit Oligonukleotiden kombiniert, die im Bereich der
Resistenzkassetten binden ("ΩKm-5'-out" und "ΩSm-5'-out"). In diesem Fall sollten sich für
rekombinante Klone Amplifikate von 2.754 bp beziehungsweise 3.348 bp ergeben, während
unter Wildtypbedingungen nicht mit einem Amplifikat zu rechnen wäre (Abb. 10).
GmR
GmR
pJQ200SK
pJQ200SK
ΩSm/Spc
ΩKm
tspO
tspO
blr2474
bll5191
GmS/KmR nach
doppelter
homologer
Rekombination
GmS/SmR nach
doppelter
homologer
Rekombination
GmR nach einfacher
homologer Rekombination
ΩSm/Spc
ΩKm
2754 bp
3348 bp
beziehungsweise
beziehungsweise
5886 bp
5589 bp
6506 bp
6981 bp
tspO
tspO
bll5191
blr2474
Abb. 10: Strategie zum Nachweis der erfolgreichen Deletion der beiden nex18-Allele in B. japonicum.
45
Ergebnisse
Die PCR-Experimente lieferten in allen getesteten Fällen lediglich Fragmente in den Größen,
die für die unmodifizierten nex18-Leserahmen zu erwarten waren. Trotz der vorhandenen
Resistenz gegenüber Kanamycin bzw. Streptomycin und der Sensitivität gegenüber
Gentamycin handelte es sich also bei den getesteten Klonen nicht um Deletionsmutanten von
nex18.
5.2.3 Aktueller Stand der Versuche zur Erzeugung von Δblr2474- und Δbll5191-Mutanten
Aufgrund der Tatsache, dass die ersten Kreuzungsexperimente nicht zum Erfolg geführt
haben, wurde eine zweite Versuchsreihe gestartet. Da zwischenzeitlich in anderen in der
Arbeitsgruppe durchgeführten Experimenten ähnliche Probleme bei der Selektion mit
Gentamycin aufgetreten waren, wie sie bei den ersten Kreuzungsansätzen beobachtet wurden,
wurde als Sekundärselektion eine Methode gewählt, die von Gay et al. (Gay et al., 1985)
beschrieben wurde. Dabei kommt es durch die Expression von Levansurcase aus Bacillus
subtilis in verschiedenen Gram-negativen Bakterien zu einer Zelllyse bzw. zu einer Inhibition
des Zellwachstums. Notwendig für diesen Effekt ist eine Konzentration von 5 % Saccharose
im Medium. Da der verwendete Vektor pJQ200SK auf eine Reihe von Suizidvektoren
zurückgeht, die auf dieser Selektionsmöglichkeit basieren (Hynes et al., 1989), verfügt er über
das sacB Gen, welches für Levansucrase kodiert.
Die neuen Kreuzungen wurden zunächst ebenfalls auf 20E-Medium ausgebracht und dann
nach vier Tagen Inkubationszeit auf PSY-Agar mit 5 % Saccharose und 150 µg/ml
Kanamycin
bzw.
Streptomycin
übertragen.
Durch
den
lethalen
Effekt
der
Levansucraseexpression bei erhalten gebliebenem pJQ200SK wurde hierdurch ein positiver
Selektionsdruck auf den Verlust des Vektors aufgebaut. Auf den saccharosehaltigen Platten
wachsende Kolonien wurden nach weiteren vier bis fünf Tagen auf PSY-Agar mit 100 µg/ml
Rifampicin und 150 µg/ml Kanamycin bzw. Streptomycin vereinzelt und genomische DNA
mithilfe des GenomiPhi-Kits amplifiziert. Die Überprüfung einer möglichen doppelten
homologen Rekombination erfolgte auf diese Gesamt-DNA mittels PCR mit den
Primerpaaren "nex-1-genom"/"ΩKm-5'-out" und "nex-3-genom"/"ΩSm-5'-out".
Aus dieser Versuchsreihe gingen neun Klone hervor, die eine Deletion des Leserahmens
bll5191 aufweisen (Abb. 11). Deletionen des Leserahmens blr2474 konnten bisher keine
erzeugt werden.
46
Ergebnisse
10,0 kb
8,0 kb
6,0 kb
5,0 kb
4,0 kb
3,0 kb
2,5 kb
2,0 kb
1,5 kb
1,0 kb
0,8 kb
0,6 kb
0,4 kb
0,2 kb
Abb. 11: Nachweis der erfolgreichen Integration der ΩSm-Kassette bei gleichzeitiger Deletion des
Leserahmens bll5191. Die PCR wurde mit den Primern "nex-3-genom" und "ΩSm-5'-out" auf
genomische Gesamt-DNA durchgeführt. Erwartet wurde ein Amplifikat von 3348 bp, welches auch
erzielt wurde (roter Pfeil).
47
Ergebnisse
5.3
Etablierung der verschiedenen Signalpeptidasen von B. japonicum im Genom
von E. coli
5.3.1 Entwicklung einer Strategie zum Austausch des lepB-Gens in E. coli
Der erfolgreiche Austausch eines essentiellen Gens kann nur dann erfolgen, wenn gleichzeitig
ein funktionales Gen als Ersatz eingebracht wird. Aufgrund der vorhergegangenen
Experimente mit dem thermosensitiven E. coli-Stamm IT41 (Inada et. al, 1989) war bekannt,
dass sowohl sipF als auch sipS aus B. japonicum diese Ersatzrolle für lepB aus E. coli
übernehmen können. Mit einer vektorbasierten Expression der beiden Signalpeptidasen war
zuvor eine Komplementation des thermosensitiven, lethalen Phänotyps von IT41 gelungen.
Gleichzeitig
dienten diese
Versuche
als
Beweis
der
Funktionalität
der
beiden
Signalpeptidasen (Müller et al., 1995b; Bairl and Müller, 1998). Ein entsprechender Nachweis
für die Funktionalität von SipX wurde durch die Instabilität des IT41-Stammes verhindert.
Bei den Arbeiten mit diesem herkömmlichen Testsystem traten zwei Probleme auf. Zum
einen wurde vermutet, dass es in E. coli IT41 trotz des beschriebenen Genotyps eine gewisse
Menge an korrekt translatierter Leaderpeptidase geben müsse, um den Stamm überhaupt
lebensfähig zu halten (Cregg et al., 1996). Zweitens war, bedingt durch den auf lepB
liegenden Selektionsdruck, die Rate an Reversionen und Suppressormutationen sehr hoch.
Zur Eliminierung dieser Probleme sollte ein genetisch stabiles System geschaffen werden,
welches die Expression der rhizobiellen Signalpeptidasen einzeln ermöglichte und
gleichzeitig die Problematik der Reversion oder Suppression ausschloss. Die aus diesen
Vorgaben im Verlauf dieser Dissertation entwickelte Strategie sah wie folgt aus:
1.) Kombination eines putativ komplementierenden Gens mit einer KmResistenzkassette zu einer transkriptionellen Einheit. Überprüfung dieser
Fusionskonstrukte durch Sequenzanalysen.
2.) Kombination dieser Fusionskonstrukte mit den flankierenden Bereichen des lepOperons in einem low-copy-Plasmid. Dabei wird der endogene Promoter PlepAB
nicht mit in die flankierenden Bereiche eingebracht.
3.) Expression einer intakten Kopie des lepB-Gens von einem Hilfsplasmid mit
thermosensitiver Replikationsinitiation und einem zweiten Seletionsmarker (Amp)
in einem recBC–/sbcB– E. coli-Stamm.
48
Ergebnisse
4.) Transformation linearer PCR-Amplifikate der in Schritt 2.) erzeugten
Austauschkonstrukte in den mit dem Hilfsplasmid versehenen E. coli-Stamm.
5.) Screen für doppelte homologe Rekombinationsereignisse durch geeignete
Selektionsbedingungen.
6.) Verifikation des Genaustausches durch PCR.
Die Ergebnisse aller sechs Punkte sind im Folgenden einzeln beschrieben.
5.3.2 Die Erzeugung einer transkriptionellen Einheit aus verschiedenen sip-Leserahmen und
einem Kanamycin-Resistenzgen
Der erste Schritt zum Austausch von lepB gegen jedes der drei sip-Gene aus B. japonicum
war die Herstellung transkriptioneller Einheiten aus sipF, sipS und sipX in Kombination mit
dem Kanamycinresistenz verleihenden Gen aphA-3. Die drei unterschiedlichen sip-Allele
wurden dazu von genomischer DNA ausgehend amplifiziert und über die singuläre BamHISchnittstelle in den Vektor pUC18K (Ménard et al., 1993) kloniert. In Abhängigkeit von der
Insertorientierung entstanden dadurch transkriptionelle Fusionen mit dem vektorständigen
(Abb. 12).
aphA-3-Gen
Die
korrekte
Orientierung
des
Inserts
wurde
durch
Restriktionsanalyse überprüft. Bei Klonen mit Insertionen in erwünschter Ausrichtung wurde
die in-frame-Fusion durch DNA-Sequenzanalyse sichergestellt.
SacI
XbaI
PstI
HindIII
SalI SphI
EcoRI
KpnI
EcoRV
aphA-3
RBS
CC CGG GTG ACT AAC TAG GAG GAA TAA ATG
SmaI STOP STOP STOP
RBS
TAG TAC CTG GAG GGA ATA ATG ACC CGG GGA TCC
BamHI
Abb. 12: Die aphA-3-Kassette aus pUC18K. Das Gen steht unter der Kontrolle des vektoreigenen lac-Promotors.
Durch Klonierung in die markierte BamHI-Schnittstelle kann eine in-frame-Fusion mit einem zweiten
Gen geschaffen werden, welches dann ebenfalls vomlac-Promotor kontrolliert wird.
RBS = Ribosomenbindestelle. Abbildung modifiziert nach: Ménard et al., 1993.
49
Ergebnisse
5.3.3 Ligation der transkriptionellen Einheit mit den flankierenden Bereichen des lepOperons zum Erhalt der Genaustauschkonstrukte
Die zur Rekombination erforderlichen homologen Bereiche wurden geschaffen, indem
zunächst ein 3.881 bp großes Fragment amplifiziert wurde, welches den C-terminalen Teil
von lepA, den gesamten lepB- sowie den gesamten rnc-Leserahmen enthielt. Zu beachten ist
hierbei, dass der Promotor des lep-Operons, PlepAB, nicht auf dem amplifizierten Fragment
vorlag. Dieses Fragment wurde über BamHI und SalI in den Vektor pHSG575 (Takeshita et
al., 1987) kloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit pHSG575-lepAB bezeichnet.
Ausgehend von pHSG575-lepAB wurde durch Amplifikation ein rekombinantes Plasmid
geschaffen, das die lepB-flankierenden Bereiche enthielt, im lepB-ORF selbst jedoch eine
Deletion von 514 bp aufwies. Randständig wurden durch die für diese Amplifikation
verwendeten Oligonukleotide XbaI-Schnittstellen eingefügt.
Die überprüften Fusionskassetten aus Schritt 5.3.2 wurden in der Folge so amplifiziert, dass
durch die verwendeten Oligonukleotide ebenfalls randständige XbaI-Schnittstellen in die
Sequenz eingebracht wurden. Diese Restriktionsschnittstellen wurden verwendet, um die
Kassetten in die entsprechenden Schnittstellen des, wie oben beschrieben erstellten, Plasmids
pHSG575-lepAB∆ zu ligieren. Die resultierenden Plasmide wurden mit pHSG575-lepAB∆Km::sipF,
pHSG575-lepAB∆-Km::sipS,
und
pHSG575-lepAB∆-Km::sipX
bezeichnet
(Abb. 13).
50
rnc
pHSG575
Prnc
P
sip*
3aphA
-
pUC18K::
lepA
PlepAB
' lepA
rseC
rnc
lepABΔ
lepB
lepAB
XbaI
sip*
sip*
' lepA
sip*
3-aphA
3-aphA
rnc
XbaI
rnc
' lepB XbaI
pHSG575 kloniert. Durch einen zweiten Amplifikationsschritt wird eine Deletion in lepBtegeschaffen,
aus
die mit einer Fusionskasset
sip*-ORF und 3-aphA *aufgefüllt
=
wird.
S, F oder X.
lepABΔ-Km:: sip*. Ein verkürzter Teil des lep-Operons wird ohne den eigenen Promoterbereich amplifiziert und in
XbaI lepB'
' lepA
' lepA
pHSG575
pHSG575
lepB
lepB
pHSG575 lepABΔ-Km:: sip*
rnc
crn
-Vektoren
Abb. 13: Prinzip
pHSG575
zur Klonierung der verschiedenen
-
-
-
era
Prnc
Ergebnisse
51
Ergebnisse
5.3.4 Expression des lep-Operons unter Verwendung eines thermosensitiven Hilfsplasmids
Ein erfolgreicher Genaustausch von lepB hin zu einem der sip-Allele erforderte die doppelte
homologe Rekombination eines linearen DNA-Fragments. Da die recBC–/sbcB–-Mutation im
E. coli-Stamm K12 JC7623 (Kushner et al., 1971) solche linearen Fragmente zwar vor Abbau
schützt, gleichzeitig jedoch die Rate und Geschwindigkeit an Rekombinationsereignissen
reduziert (Kushner et al., 1971; Goldmark and Linn, 1972), zeigte sich im Verlauf der
Versuche,
dass
es
nicht
ausreichte,
einfach
die
linearen
Amplifikate
der
Genaustauschkonstrukte in E. coli K12 JC7623 zu transformieren. Offensichtlich war das
Vorhandensein einer intakten Kopie von lepB bis zur vollständigen Rekombination absolut
erforderlich. Daher sollte über ein Hilfsplasmid zunächst eine intakte Kopie des gesamten lepOperons zur Verfügung gestellt werden. Für die Konstruktion des Hilfsplasmids wurde mit
dem Vektor pFDX600 (Vögele et al., 1991) ein Plasmid ausgewählt, welches einen
temperatursensitiven Replikationsursprung besitzt. Diese Eigenschaft ermöglichte es, nach
Abschluss der Transformationsexperimente durch eine Erhöhung der Temperatur, bei der die
Transformanden angezogen wurden, das Plasmid aus den Zellen zu entfernen.
Zur Konstruktion des Hilfsplasmids wurde zunächst die Ω-Amp-Kassette aus dem Plasmid
pKT254ΩAmp (Fellay et al., 1987) amplifiziert und über die randständigen BamHISchnittstellen in pFDX600 kloniert. Hierdurch wurde das Plasmid pFDX600ΩAmp erzeugt.
In einer zweiten Ligation wurde dann ein Amplifikat des gesamten lep-Operons einschließlich
des endogenen Promotors PlepAB in die singuläre SmaI-Schnittstelle von pFDX600ΩAmp
eingefügt. Durch diesen Schritt wurde gleichzeitig das im Ursprungsvektor pFDX600
vorhandene Kanamycin-Resistenzgen inaktiviert.
Das so entstandene rekombinante Plasmid pFDX600ΩAmp-lepAB wurde anschließend in den
für die weiteren Experimente zu verwendenden E. coli-Stamm K12 JC7623 transformiert.
Sowohl vor als auch nach der erfolgten Transformation in diesen Stamm wurde das Plasmid
auf einen möglichen Verlust der thermosensitiven Replikation untersucht. In allen
verwendeten Klonen war ein temperaturabhängiger Verlust der Replikationsfähigkeit des
Plasmids gewährleistet.
52
Ergebnisse
5.3.5 Transformation linearer PCR-Amplifikate der Genaustauschkonstrukte in E. coli K12
JC7623 mit pFDX600ΩAmp-lepAB
Ausgehend von dem mit dem Hilfsplasmid pFDX600ΩAmp-lepAB ausgestatteten Stamm
wurden elektrokompetente Zellen erzeugt, die anschließend mit linearen PCR-Amplifikaten
der zuvor hergestellten Austauschkontrukte transformiert wurden. Diese Amplifikate wurden
auf Grundlage der drei Plasmide pHSG575-lepAB∆-Km::sipF, pHSG575-lepAB∆-Km::sipS,
und pHSG575-lepAB∆-Km::sipX erzeugt (vgl. Kapitel 5.3.3). Nach der Transformation
wurden die Zellen zunächst auf Doppelselektivmedium mit Ampicillin und Kanamycin
ausgestrichen und bei 28 °C angezogen, um sowohl auf das Vorhandensein des Hilfsplasmids
als auch auf die erwünschte doppelte homologe Rekombination zu selektieren.
5.3.6 Selektion auf doppelte homologe Rekombinationsereignisse durch geeignete
Bedingungen
Die durch die Transformation mit den linearen DNA-Fragmenten erhaltenen Klone wurden
nach einer über Nacht erfolgten Anzucht bei 28 °C auf antibiotikafreie PA-Agarplatten
vereinzelt und bei 42 °C inkubiert. Durch diesen Schritt wurde eine weitere Replikation des
Hilfsplasmids unterbunden. Nach 16 Stunden erfolgte eine Überimpfung auf frische, ebenfalls
antibiotikafreie Platten und eine weitere Inkubation bei 42 °C für 16 Stunden. Dieser Schritt
wurde dreimal wiederholt, um einen Verlust des Hilfsplasmids sicherzustellen. Abschließend
wurden die Zellen auf Agarplatten mit kanamycinhaltigem PA-Medium überimpft, um Klone
zu identifizieren, die eine entsprechende Resistenz ausgebildet hatten. Dies konnte nur dann
der Fall sein, wenn die in den verwendeten Amplifikaten promotorlose Kassette mit dem
aphA-3-Gen hinter einen Promotorbereich integriert wurde. Gleichzeitig wurde die
Sensitivität der Klone gegenüber Ampicillin, welche aus dem vollständigen Verlust des
Hilfsplasmids resultieren muss, durch Ausstrich auf entsprechendem Selektivmedium
überprüft. Durch diesen Schritt konnte sowohl eine Rekombination des Plasmids in die
genomische lep-Region, als auch die Rekombination der Austauschkonstrukte in das
Hilfsplasmid bei gleichzeitigem Verlust der Thermosensitivität ausgeschlossen werden.
53
Ergebnisse
5.3.7 Überprüfung der doppelten homologen Rekombinationsereignisse durch PCR
Zur abschließenden Überprüfung der erhaltenen Genaustauschmutanten wurden zwei PCRReaktionen verwendet. Die benutzten Oligonukleotidpaare waren dabei so gewählt, dass
jeweils einer der Primer im Bereich des aus pUC18K stammenden aphA-3 band, der
entsprechende Gegenprimer in genomischen DNA-Bereichen von E. coli, die stromauf- oder
stromabwärts des ausgetauschten Bereichs lagen (Abb. 14a). Da die Länge der einzelnen
eingebrachten Fragmente bekannt war, ließen sich die zu erwartenden Größen für die aus
diesen Nachweis-PCRs resultierenden Amplifikate genau vorhersagen. Die Größe des ersten
Fragments musste in allen Fällen 2619 bp betragen, da sich der Abstand der beiden
Oligonukleotide über den stromaufwärts gelegenen genomischen Bereich und den erfassten
Bereich von aphA-3 nicht änderte. Durch die unterschiedliche Größe der drei sip-Gene
ergaben sich für die zweite Primerkombination jedoch leicht unterschiedliche Fragmentlängen
bei der Amplifikation. Erwartet wurden 2179 bp für die Austauschmutante Km::sipF, 2195 bp
für die Mutante mit Km::sipS und 2157 bp für den Fall des Genaustauschs mit Km::sipX.
Die Ergebnisse der beiden PCR-Reaktionen entsprachen den Erwartungen für eine
erfolgreiche Rekombination in insgesamt sieben Fällen. Es war davon auszugehen, dass es in
zwei Fällen zu einem Austausch von lepB gegen die Kassette Km::sipF gekommen ist. In
einem Fall wurde die Kassette Km::sipS erfolgreich in die genomische Region eingebracht,
die Rekombination mit Km::sipX konnte in vier Fällen nachgewiesen werden (Abb. 14b). Die
erhaltenenen Amplifikate der Nachweis-PCR wurden zusätzlich durch Sequenzanalyse als
korrekt bestätigt.
5.3.8 Wachstumsexperimente zur Charakterisierung der Genaustauschmutanten
Die für die verschiedenen Signalpeptidasen bereits gezeigten (Tjalsma et al., 1997; Linde et
al., 2003, Luo et al., 2003) oder vermuteten Unterschiede in der Substratspezifität beziehen
sich maßgeblich auf Unterschiede innerhalb eines bestimmten Organismus. Da die hierbei
auftretenden Varianzen zum Teil bereits sehr stark sind, wurden aufgrund der überschrittenen
Speziesgrenze neben den genotypischen Veränderungen bei den erzielten Klonen auch
phänotypische Ausprägungen erwartet. Zur Charakterisierung solcher möglichen Phänotypen
wurden experimentelle Bedingungen gewählt, unter denen ein Auftreten eventueller
phänotypischer Merkmale wahrscheinlich war. Eine reduzierte Leistungsfähigkeit der
eingebrachten
rhizobiellen
Signalpeptidasen
im
Vergleich
zur
E. coli-eigenen
54
Ergebnisse
Leaderpeptidase sollte sich vor allem unter Stressbedingungen bemerkbar machen, wenn der
Bedarf an extrazytoplasmatischen Proteinen – und damit an Proteinprozessierung durch die
Signalpeptidase – erhöht ist.
Ausgehend von dieser Annahme wurden für die erzeugten lepB-Austauschmutanten Versuche
durchgeführt, um ein möglicherweise verändertes Wachstumsverhalten unter Stressbedingungen festzustellen. Hierzu wurden Wachstumskurven in LBG-Medium bei
verschiedenen Temperaturen und mit teilweise erhöhten Salzkonzentrationen gemessen und
mit denen des zugrunde liegenden Stammes E. coli K12 JC7623 (Kushner et al., 1971)
verglichen.
Weder für erhöhte Temperaturen noch für osmotische Stressbedingungen konnte jedoch bei
den sieben Klonen ein, im Vergleich zum Wildtyp, verändertes Wachstumsverhalten
festgestellt werden (Abb. 15 und 16). Diese Ergebnisse ließen Zweifel an der korrekten
Deletion des lepB-ORFs aufkommen und machten eine weitere Überprüfung der Klone
notwendig.
55
Ergebnisse
a
Prnc
rnc
sip*
aphA-3
'lepA
Prnc
PlepAB
rnc
lepB
lepA
era
rseC
Prnc
PlepAB
rnc
sip*
era
lepA
rseC
aphA-3
lep DO
lep UP
Kan
End
Kan
Start
b
lep DO + Kan End
Kan Start + lep UP
M 1
2
3
4 5
6
7
8
1
2
3
4
5
6
7
8 M
Abb. 14: Methode zum Nachweis des erfolgreichen Genaustausches von lepB gegen die Kassetten aus sipORF und aphA-3. a) Die amplifizierten Kassetten werden als lineare Fragmente inE. coli K12 JC7623
transformiert. Über doppelte homologe Rekombination kommt es zum Genaustausch.
b) Doppelter Nachweis mittels PCR. Die verwendeten Primer sind in a) durch schwarze Dreiecke
angedeutet. Spuren 1+2: aphA-3::sipF, Spur 3: aphA-3::sipS, Spuren 4–7: aphA3::sipX,
Spur 8: E. coli K12 JC7623-Wildtyp.
56
Ergebnisse
Wachstumskurven bei 28°C
OD 600
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Km::sipF168.2
Km::sipF168.3
Km::sipS176.1
Km::sipX176.1
Km::sipX176.2
Km::sipX176.3
Km::sipX176.4
JC7623 wt
0'
20' 40' 60' 80' 100' 120' 140' 160' 180' 200' 220' 240' 260'
t (min)
Wachstumskurven bei 37°C
OD 600
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Km::sipF168.2
Km::sipF168.3
Km::sipS176.1
Km::sipX176.1
Km::sipX176.2
Km::sipX176.3
Km::sipX176.4
JC7623 wt
0'
20' 40' 60' 80' 100' 120' 140' 160' 180' 200' 220' 240' 260'
t (min)
OD 600
Wachstumskurven bei 42°C
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Km::sipF168.2
Km::sipF168.3
Km::sipS176.1
Km::sipX176.1
Km::sipX176.2
Km::sipX176.3
Km::sipX176.4
JC7623 wt
0'
20' 40' 60' 80' 100' 120' 140' 160' 180' 200' 220' 240' 260'
t (min)
Abb. 15: Wachstumskurven der verschiedenen lepB-sip*-Austauschmutanten im Vergleich zum Wildtyp
des Stammes E. coli K12 JC7623. Anzucht bei 28 °C, 37 °C und 42 °C in LBG-Medium.
57
Ergebnisse
OD 600
Wachstumskurve 42°C, LBG + 50 mM NaCl
3,5
3,4
3,3
3,2
3,1
3
2,9
2,8
2,7
2,6
2,5
2,4
2,3
2,2
2,1
2
1,9
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Km::sipF168.2
Km::sipF168.3
Km::sipS176.1
Km::sipX176.1
Km::sipX176.2
Km::sipX176.3
Km::sipX176.4
JC7623 wt
0'
20'
40'
60'
80'
100'
120'
140'
160'
180'
200'
220'
240'
260'
280'
300'
320'
340'
t (min)
OD 600
Wachstumskurve 42°C, LBG + 100mM NaCl
3,5
3,4
3,3
3,2
3,1
3
2,9
2,8
2,7
2,6
2,5
2,4
2,3
2,2
2,1
2
1,9
1,8
1,7
1,6
1,5
1,4
1,3
1,2
1,1
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Km::sipF168.2
Km::sipF168.3
Km::sipS176.1
Km::sipX176.1
Km::sipX176.2
Km::sipX176.3
Km::sipX176.4
JC7623 wt
0'
20'
40'
60'
80'
100'
120'
140'
160'
180'
200'
220'
240'
260'
280'
300'
320'
t (min)
Abb. 16: Wachstumskurven der verschiedenen lepB-sip*-Austauschmutanten im Vergleich zum Wildtyp
des Stammes E. coli K12 JC7623. Anzucht bei 42 °C in LBG-Medium mit erhöhten
Salzkonzentrationen.
58
Ergebnisse
5.3.9 Weitere Überprüfung der erhaltenen Klone
Hierfür wurden zunächst die ursprünglichen PCR-Kontrollen wiederholt. Die positiven
Ergebnisse ließen sich hierdurch bestätigen. Allerdings wurde hierdurch nur die Integration
der Austauschkonstrukte in die genomische Zielregion des lep-Operons gezeigt, nicht jedoch
die Abwesenheit von lepB. Zur Überprüfung der erfolgreichen Deletion von lepB wurden
parallel zwei Strategien verfolgt. Zum einen wurde eine Southern-Hybridisierung mit einer
gegen einen internen Bereich des Leserahmens gerichteten DIG-markierten Sonde
durchgeführt. Zum anderen wurden zwei weitere Oligonukleotide so entworfen, dass sie
jeweils im unmittelbaren Anfangs- und Endbereich des Leserahmens binden, die auch in den
Austauschkonstrukten erhalten geblieben sind (Abb. 13 und 15). Bei einer erfolgreichen
Deletion sollte, abhängig vom enthaltenen sip-ORF, ein Amplifikat von etwa 2,0 kb Größe
auftreten. Im Fall des Wildtypzustandes für lepB war ein Amplifikat von 975 bp zu erwarten.
Für die Southern-Hybridisierung ergab sich ein Hybridisierungsmuster, welches für einen
Wildtyp zu erwarten gewesen wäre (Abb. 17). Dieses Ergebniss stand jedoch im Widerspruch
zu den positiven Ergebnissen der PCR-Nachweisen die eine Integration des Austauschkonstruktes im chromosomalen Kontext des lep-Operons zwingend voraussetzten (Abb. 14).
Gleichzeitig zeigte die weitere PCR-Kontrolle beide Amplifikationskonstrukte (in Abb. 18
exemplarisch für den Klon Km::sipF 168.2 gezeigt). Benutzte man Eluate der Amplifikate als
Ausgangsmaterial für weitere PCRs, so ließen sich entsprechende interne Bereiche des lepBLeserahmens beziehungsweise des jeweiligen Austauschkonstruktes amplifizieren, was
ausschloss, dass es sich bei den erhaltenen Fragmenten um zufällige, unspezifische
Amplifikate gleicher Größe handelte (in Abb. 18 exemplarisch für den Klon Km::sipF 168.2
gezeigt).
59
Ergebnisse
Abb. 17: Gelbild und fertige Membran der Southern-Hybridisierung mit einer gegen den deletierten
Bereich von lepB gerichteten Sonde. Als Restriktionsenzym wurde PstI verwendet.
Spuren 1+2: aphA-3::sipF, Spur 3: aphA-3::sipS, Spuren 4-6: aphA-3::sipX,
Spur 7: E. coli K12 Wildtyp. Es zeigt sich in allen Fällen ein dem Wildtyp
entsprechendes Hybridisierungsmuster.
60
Ergebnisse
KanEnd
KanStart
lepB-if lepB-ir
sip*
aphA-3
lepB
lepB-5
lepB-3
lepB-3
lepB-5
Erste PCR mit Primern lepB-3 und
lepB-5. Erwartete Amplifikatgröße für
rekombinante Klone:
Ca. 2,0 kb in Abhängigkeit des
jeweiligen sip-Leserahmens.
Erste PCR mit Primern lepB-3 und
lepB-5. Erwartete Amplifikatgröße für
Wildtypzustand:
975 bp
Beide Fragmentgrößen vorhanden
Beide Fragmente wurden isoliert.
PCR auf Eluat des kleinen Fragments mit Primern lepB-if
und lepB-ir liefert Amplifikat in der erwarteten Größe von
300 bp. Zur Kontrolle wurde der Ansatz auch auf gDNA des
Klons JC7623 Km::sipF 168.2 und des Wildtyps JC7623
durchgeführt.
PCRs auf Eluat des großen Fragments mit Primern
lepB-5 und KanStart bzw. lepB-3 und KanEnd liefern
Amplifikate in den erwarteten Größen von 500 bp
bzw. 900 bp
Abb. 18: Überprüfung der erhaltenen Klone durch zwei aufeinander folgende PCRs.
Auf die beiden Amplifikationsprodukte der ersten PCR werden drei sogenannte "nested PCRs"
durchgeführt, um zu bestätigen, dass es sich um die vermuteten Amplifikate handelt.
61
Ergebnisse
5.3.10 Zusammenfassung der Ergebnisse für die Erzeugung der Genaustauschmutanten
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Erzeugung lebensfähiger lepBDeletionsmutanten von E. coli angestrebt. Durch die gezielte Weiterentwicklung einer
Methode, die zur Herstellung konditional lethaler Mutationen in E. coli bereits mehrfach
beschrieben war (Jasin and Schimmel, 1984; Hamilton et al., 1989; Link et al., 1997; Dalbert
and Smith, 1997; Chaperon, 2006) sollte erreicht werden, dass die bisher immer benötigte in
trans-Expression des intakten Gens unterbleiben kann. Die resultierenden Mutanten sollten
somit keinen konditionalen Phänotyp zeigen, sondern eine tatsächliche Deletion des
ursprünglichen Gens aufweisen. Sie würden damit über die auch heute noch übliche (Liang
and Liu, 2008) Methode hinausgehen, bei der nach wie vor das deletierte Gen durch in transExpression komplementiert wird.
Zwar konnte mittels der entwickelten Strategie und der durchgeführten Experimente eine
Rekombination der Austauschkonstrukte in die gewünschte chromosomale Region erzielt
werden, abschließende Überprüfungen zeigten jedoch, dass der lepB-Leserahmen an einer
bisher nicht identifizierten Stelle des Genoms dupliziert wurde und erhalten geblieben ist.
Die Tatsache, dass die entwickelte Methode in allen drei Fällen zur erfolgreichen Integration
des Austauschkonstruktes in der gewünschten Zielregion geführt hat, zeigt, dass sie
prinzipiell funktional ist und sich universell einsetzen lässt, um Deletionen zu erzeugen. Auch
die ursprünglich angestrebte Möglichkeit, auf diese Weise ein essentielles Gen durch ein
komplementierendes heterologes Gen zu ersetzen ist nicht endgültig widerlegt. Im Fall der
Leaderpeptidase von E. coli ist dieses Vorhaben jedoch nicht gelungen. Dies deutet darauf
hin, dass anders als bisher angenommen, die rhizobiellen Signalpeptidasen nicht in der Lage
sind, den Ausfall von lepB zu komplementieren.
62
Diskussion
6.
Diskussion
6.1
Mögliche Funktionen einzelner extrazytoplasmatischer Proteine bei der
Etablierung einer intakten Symbiose zwischen B. japonicum und Glycine max
Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Mutanten von B. japonicum
untersucht, bei denen durch die Integration eines rekombinanten Plasmids in das Chromosom
Leserahmen für extrazytoplasmatische Proteine, bzw. die zur Expression notwendige
Operonstruktur unterbrochen waren. Dabei wurden die Vektorintegrationen als kausal für die
Mutationen nachgewiesen. Auf den folgenden Seiten sollen die Ergebnisse, die bei diesen
Nachweisen erzielt wurden, in Zusammenhang mit bereits zuvor bekannten Fakten gebracht
und interpretiert werden. Dabei werden zunächst die beschriebenen Phänotypen der einzelnen
Mutanten (Müller and Bonnard, 2004; Bonnard, 2006) noch einmal erläutert. Im Anschluss
daran soll versucht werden, für jede der untersuchten Mutanten den jeweils beobachteten
Phänotyp mit dem bestätigten Ausfall des entsprechenden Leserahmens zu erklären. Die
hierfür entwickelten Modelle haben zum Teil einen stark hypothetischen Charakter und
bedürfen weitergehender Untersuchungen, um sie zu bekräftigen.
6.1.1 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK242
Die Mutante BJ-FK242 fiel bei der phänotypischen Untersuchung verschiedener
Genunterbrechungsmutanten durch eine deutlich reduzierte Nitrogenaseaktivität auf.
Inokuliert man Glycine max mit Zellen von BJ-FK242, so bilden die Pflanzen viele, jedoch
sehr kleine Knöllchen, die wegen eines sehr geringen Gehalts an oder völligem Fehlen von
Leghämoglobin
im
Querschnitt
weißlich
erscheinen.
Elektronenmikroskopische
Untersuchungen von Wurzelknöllchen haben gezeigt, dass die Bakteroiden deformiert sind
und sich große Vakuolen in den betroffenen Pflanzenzellen bilden. Letzteres deutet auf
Degradationsprozesse hin, wobei unklar bleibt, ob diese von pflanzlicher oder bakterieller
Seite induziert werden. Als weiteres Indiz für eine Beeinträchtigung der Bakteroiden kann das
Vorhandensein großer Stärkekörner in den Zellen des Wurzelknöllchens angesehen werden.
Bei einer korrekt ausgebildeten Symbiose wird die Stärke durch pflanzliche Enzyme abgebaut
und den Bakterien als Nährstoff in Form energiereicher Kohlenhydratverbindungen zur
Verfügung gestellt (Müller and Bonnard, 2004).
63
Diskussion
Die Ergebnisse der Sequenzanalysen zeigen, dass die Vektorintegration nicht direkt im
Leserahmen bll3735, sondern in der intergenischen Region vor bll3735 erfolgt ist. Das
bedeutet, dass keine direkte Fusion mit einem Signalpeptid erfolgt ist und es sich bei dem, der
Mutante BJ-FK242 zugrunde liegenden Phagemidklon um einen zufällig erfassten
Hintergrundklon handelt. Dieser ist durch das Überlesen des Stoppkodons von bll3736
aufgrund der für E. coli TG1 beschriebenen Suppressionsfähigkeit (vgl. Kapitel 4.3.1)
zustande gekommen. Dennoch führt die Vektorintegration in diesem Fall zu einem Fehlen des
nachfolgenden Genproduktes wegen eines polaren Effekts, da durch die Rekombination die
Operonstruktur vor dem Leserahmen bll3735 unterbrochen wird.
Der nur indirekt betroffene Leserahmen bll3735 kodiert für ein putatives Membranprotein,
welches Ähnlichkeiten zu OmpA aus E. coli aufweist. OmpA ist ein Porin, welches die
Diffusion kleiner Solute, wie z. B. Arabinose, Glukose und Saccharose ermöglicht (Sugawara
and Nikaido, 1992). Schon lange war bekannt, dass OmpA eine Rolle bei der Formgebung der
Zelle spielt (Sonntag et al., 1978). Ein neueres Ergebnis belegt, dass die Expression von ompA
in E. coli als Teil der Ntr-Antwort bei Stickstoffmangel heraufreguliert wird (Baev et al.,
2006).
Nimmt man diese Erkenntnisse aus E. coli und den für BJ-FK242 beschriebenen Phänotyp
zusammen, so lässt sich daraus folgende, noch sehr vage Hypothese entwickeln: Durch das
Fehlen des Genproduktes wäre der reduzierte Stärkeabbau zu erklären, da mit OmpA ein
möglicher Aufnahmeweg für die resultierenden Kohlenhydratverbindungen nicht zur
Verfügung stehen würde und der Verbrauch entsprechend reduziert wäre. Die eingeschränkte
Nährstoffversorgung könnte auf bakterieller Seite zu einer allgemeinen Verlangsamung der
Schritte führen, die für die Interaktion mit dem Wirt notwendig sind. Dies könnte eine
veränderten Reaktion der Pflanze bedingen, wodurch pflanzliche Schritte, die für die
Knöllchenreifung notwendig sind, unterbleiben. Hierdurch ließe sich das fehlende
Leghämoglobin erklären, was unmittelbar zu einer erhöhten O2-Konzentration innerhalb des
Knöllchengewebes führt. Dies wiederum würde die sauerstoffempfindliche Nitrogenase
zerstören und deren reduzierte bzw. fehlende Aktivität erklären. Die Unfähigkeit der
Bakterien, auf den, sowohl für die Pflanze als auch sie selbst resultierenden Stickstoffmangel
durch eine verstärkte Expression des ompA-Homologs zu reagieren, könnte schließlich zu
einer Degradation der Bakteroiden mit der damit verbundenen Vakuolisierung der Wirtszelle
führen.
Zur Untermauerung dieser Hypothese sind jedoch weitere Versuche notwendig.
64
Diskussion
6.1.2 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK305
Die Infektion von Glycine max mit der B. japonicum-Mutante BJ-FK305 führt ebenfalls zu
einer reduzierten Nitrogenaseaktivität. Elektronenmikroskopische Aufnahmen infizierter
Zellen zeigen eine geringe Besiedlungsdichte des Knöllchengewebes bei gleichzeitigem
reduziertem Stärkeumsatz. Neben der geringen Anzahl an intakten Bakteroiden zeigen sich
deutliche Hinweise auf lytische Degradation von Bakteroiden in Form von Membranresten
und Zelltrümmern (Müller and Bonnard, 2004).
Die Vektorintegration erfolgte im Leserahmen blr2992, der als letzter von zwei ORFs in
einem Operon für ein RlpA-ähnliches Protein kodiert. Eine verkürzte Form (AS-Reste 1–102)
von RlpA in E. coli fungiert als Suppressor für eine Nullmutation von prc, dem Gen für die
periplasmatische Protease (Bass et al., 1996). Die genaue Funktion des Genproduktes ist
jedoch sowohl in E. coli als auch in B. japonicum unbekannt, so dass über die Beschreibung
des Phänotyps hinaus keine Interpretation des Ergebnisses möglich ist. Es konnten jedoch
normal ausgebildete Infektionsschläuche nachgewiesen werden, was auf ein ungestörtes
Eindringen der Bakterien in die Wirtspflanze schließen lässt und eher eine Störung bei der
Versorgung
der
Bakteroiden
oder
der
Ausbildung
und
Aufrechterhaltung
der
Kompartimentierung nahe legt (Müller and Bonnard, 2004).
6.1.3 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK309
Im Gegensatz zu den übrigen untersuchten Fällen führt eine Infektion von Glycine max mit
Zellen der B. japonicum-Mutante BJ-FK309 nur zu einem schwachen Phänotyp. Die
Nitrogenaseaktivität ist gegenüber Wildtypinfektionen nicht signifikant vermindert (Müller
and Bonnard, 2004). Lediglich die elektronenmikroskopische Untersuchung zeigt, dass es zu
einem verringerten Stärkeabbau im infizierten Gewebe kommt. Auffällig ist jedoch eine
ausgeprägte Vakuolisierung des Gewebes, was auf eine Degradation der Bakteroide und/oder
des pflanzlichen Zytosols hindeutet (Müller and Bonnard, 2004).
Die Vektorintegration im Genom der Mutante BJ-FK309 erfolgte im Leserahmen blr6636.
Dieser kodiert laut Annotation des Kazusa-Instituts für eine ATP-Synthase-Untereinheit.
Diese Annotation muss jedoch aus zwei Gründen heraus angezweifelt werden. Erstens sind
die bekannten ATP-Synthasen in B. japonicum entweder monocistronisch kodierte ATPSynthasen, die spezifisch für die Energieversorgung des Flagellenapparates sind (blr2201 und
65
Diskussion
blr6885), oder es handelt sich um in einem zusammenhängenden Operon kodierte
Untereinheiten (bll0439 bis bll0443 sowie bll1185 bis bls1189). Die einzelne Untereinheit,
die für blr6636 annotiert ist, lässt sich jedoch weder den beiden Operons zuordnen, noch
weist sie Ähnlichkeiten zu einer flagellenspezifischen ATP-Syntase auf. Als zweites Indiz für
eine falsche Annotation muss die Tatsache gewertet werden, dass eine BlastP-Suche nach
Sequenzähnlichkeiten in anderen Proteinen unter keinen Umständen eine Übereinstimmung
mit ATP-Synthasen (oder deren Untereinheiten) aus anderen Organismen ergibt. Als beste
Suchergebnisse werden statt dessen Proteine angegeben, die der ErfK/YbiS/YcfS/YnhGSuperfamilie zugeordnet sind. Hierbei handelt es sich um möglicherweise enzymatisch aktive
Proteine, die eine konservierte Region mit Histidin- und Cysteinresten aufweisen. In einigen
Fällen konnten putative Peptidoglykan-Bindestellen nachgewiesen werden.
Die phänotypischen Merkmale von BJ-FK309 könnten jedoch mit einem polaren Effekt auf
den nachfolgenden Leserahmen blr6637 erklärt werden, der für eine Cytochrom-c-Peroxidase
zur Entgiftung von Sauerstoffradikalen kodiert. Hierbei fungiert H2O2 als terminaler
Elektronenakzeptor. Ein Ausfall des Genproduktes würde möglicherweise zu einer
Akkumulation von H2O2 führen. Überflüssiges H2O2 wurde mit der Degradation von
Bakteroiden in Medicago sativa und Pisum sativum in Verbindung gebracht, wo es als eine
der Substanzen identifiziert wurde, die Alterungsprozesse im Knöllchen auslösen (Rubio et
al., 2004). Da diese Vorgänge während der Alterung indeterminierter Wurzelknöllchen als
normale Prozesse auftreten, wäre ein gravierender Phänotyp auch in determinierten Knöllchen
nicht zu erwarten. Die beobachteten leichten Veränderungen und der Abbau von Bakteroiden
wären mit diesen Prozessen jedoch zu erklären, da durch die Akkumulation von H2O2 ein
vorzeitiger oder artifizieller Alterungsprozess ausgelöst werden könnte.
6.1.4 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK409
Einen stark ausgeprägten Phänotyp weisen Knöllchen auf, die auf eine Infektion mit der
Mutante BJ-FK409 zurückzuführen sind. Die Pflanzen bilden ineffektive Knöllchen aus, die
über
keine
Nitrogenaseaktivität
verfügen.
Betrachtet
man
das
Knöllchen
im
elektronenmikroskopischen Schnitt, so stellt man fest, dass das zentrale Gewebe nicht oder
nur sehr spärlich von B. japonicum. besiedelt ist. Die zu beobachtenden Infektionsschläuche
weisen ein stark vergrößertes Volumen auf (Müller and Bonnard, 2004).
66
Diskussion
Die Integration des Vektors erfolgte in diesem Fall im Leserahmen blr5829, der für ein
Protein kodiert, welches eine Ähnlichkeit zu FlaD aus Caulobacter crescentus aufweist. FlaD
stellt in C. crescentus eine Komponente des Flagellenapparates dar. Eine Deletion des Gens
führt zu einem Abbruch bei der de novo-Synthese des Flagellums (Hahneberger et al., 1987).
Die in diesem Zusammenhang geäußerte Vermutung, wonach flaD für die außergewöhnliche,
in C. crescentus vorhandene E-Ring-Komponente des Basalkörpers kodiert, wurde jedoch
einige Jahre später relativiert (Dingwall et al., 1992).
Blr5829 weist jedoch eine ähnlich hohe Sequenzübereinstimmung zu FlaD aus Vibrio auf.
FlaD ist in Vibrio eines von vier Flagellin-Genen, die für dass polare Flagellum benötigt
werden. Sein Ausfall resultiert in Mutanten, die zwar noch beweglich sind, die jedoch im
Vergleich zum Wildtyp deutlich langsamer schwimmen. Ferner wird vermutet, dass die
polare Flagelle als eine Art taktiler Sensor funktioniert, der das Bakterium über Kontakt zu
Oberflächen informiert. Wird eine normale Schwimmbewegung verhindert, dann induziert die
fehlende Bewegung der polaren Flagelle die Ausbildung eines lateralen Flagellensatzes der
für Schwärmbewegungen notwendig ist (McCarter, 1995). Eine Störung beim Aufbau der
polaren Flagelle könnte daher auch zu Störungen bei der Induktion von Schwärmbewegungen
führen.
Der Flagellenapparat von B. japonicum ist, wie kürzlich gezeigt wurde, vergleichbar mit dem
von Vibrio (Kanbe et al., 2007), wo Störungen im Flagellenapparat zu einer erheblichen
Reduktion der Virulenz führen (Ran and Haeng, 2003). Diese sind unter anderem durch eine
Reduzierung der Adhäsionsfähigkeit bedingt. Göttfert und Mitarbeiter (Kanbe et al., 2007)
haben ebenfalls eine Veränderung des Schwärmverhaltens bei der Deletion der einen oder
anderen Art von Flagellen in B. japonicum beobachtet und diese in Zusammenhang mit der
Adhäsion an der Wurzeloberfläche diskutiert. Eine hiermit einhergehende Störung der
Infektion wäre denkbar, da für ein erfolgreiches Eindringen der Bakterien in die Pflanze eine
Anheftung an die Wurzeloberfläche erfolgen muss (Yao and Vincent, 1969; Bhuvaneswari
and Solheim, 1985; van Brussel et al., 1990).
Eine weitergehende und etwas spekulativere Hypothese wäre die Vermutung, dass die in die
Wurzel eindringenden Bakterien selbst Einfluß auf die Morphologie des Infektionsschlauches
nehmen können. Bisher geht man davon aus, dass die Invagination der Membranen der
Wurzelzellen ein Prozess ist, der zwar durch die Interaktion der Bakterien an der
Wurzeloberfläche mit der Pflanze initiiert wird, dann jedoch von pflanzlicher Seite fortgeführt
wird (Napoli et al., 1975; Callaham and Torrey, 1981; Turgeon and Bauer, 1985). Die
Bakterien werden innerhalb des begrenzten Lumens durch Zellteilung quasi weiter
67
Diskussion
"geschoben". Dieser Vorgang würde jedoch keine Erklärung für die beobachtete
Vergrößerung des Lumens der Infektionsschläuche bieten. Hingegen würde eine aktive
Schwimmbewegung der Bakterien durch den Infektionsschlauch mehr Raum benötigen, wenn
die Hauptflagelle aufgrund einer Gendeletion fehlen würde, beziehungsweise es hierdurch zu
einer Störung in der Schwärmbewegung kommen würde. Gleichzeitig wären Bakterien mit
einem solchen Defekt deutlich langsamer als der Wildtyp (McCarter, 1995; Kanbe et al.,
2007), was eine reduzierte Infektionsrate zur Folge hätte. Wären die Bakterien nun, wie
eingangs angedacht, in der Lage, die morphologische Gestaltung des Infektionsschlauchs zu
beeinflussen, dann ließe sich damit dem erhöhten Raumbedarf durch eine Vergrößerung des
Lumens entgegenwirken. Eine Kompensation der reduzierten Fortbewegungsgeschwindigkeit
wäre jedoch auch hierdurch nicht möglich, so dass die Wurzelknöllchen dennoch nur sehr
spärlich besiedelt werden können.
Diese seitens der Bakterien "aktive" Form der Infektion würde auch erklären, wie es zu
Mischinfektionen innnerhalb einzelner Wurzelknöllchen kommen kann, die bereits seit
Langem für verschiedene Symbiosen zwischen Rhizobien und Leguminosen bekannt sind
(Lindemann et al., 1974; Johnston and Beringer, 1975). Auch in diesem Fall sind jedoch
weitere Versuche zur Bekräftigung der aufgezeigten Hypothese notwendig.
6.1.5 Bradyrhizobium japonicum-Mutante BJ-FK240
Pflanzen, die mit Zellen der B. japonicum-Mutante BJ-FK240 infiziert wurden zeigen im
elektronenmikroskopischen Bild eine starke Akkumulation von poly-β-Hydroxy-Buttersäure
und Stärkekörnern, die vermutlich aus der deutlich reduzierten Besiedlung des
Knöllchengewebes resultiert. Darüber hinaus finden sich große vakuolisierte Bereiche in den
infizierten Zellen. Im makroskopischen Bereich wurden, im Vergleich zum Wildtyp, kleinere
Knöllchen und eine verringerte Nitrogenaseaktivität beobachtet. (Müller, persönliche
Mitteilung)
Die Vektorintegration erfolgte im Leserahmen blr 2197, der von seiner chromosomalen
Umgebung her entweder das letzte Gen in einem Operon oder ein monocistronisches Operon
ist. Durch diese Gegebenheit können polare Effekte auf nachfolgende Gene durch die
Vektorintegration ausgeschlossen werden.
Die Datenbank des Kazusa-Instituts gibt für Blr2197 eine Ähnlichkeit zu einer
Toxinuntereinheit aus Bordetella pertussis (Keuschhustenerreger) an, die im Gen ptxB kodiert
68
Diskussion
wird. Ein Sequenzalignment der beiden Proteine zeigt zwei zum Teil konservierte Domänen,
die als APT-Domäne (Aerolysin/Pertussis Toxin) und als Pertussis S2S3-Domäne bezeichnet
sind (Abb. 19).
B.p. PtxB
B.j. Blr2197
MPIDRKTLCHLLSVLPLALLGSHVARASTPGIVIPPQEQITQHGGPYGRCANKTRALTVA
MRIACASYFLLVALSLPTTARAGEQVLEFKLVTRPVDVKVTEVANVEGQTVMSGKMFGVA
* *
:
*:::
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:
.
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60
60
B.p. PtxB
B.j. Blr2197
ELR-GSGDLQEYLR--HVTRG------WSIFALYDGTYLGGEYGGVIKDGTPGGAFDLKT 111
FFKDGRIAVKDFVNSSDLLKGSGPMFGYSTYTFDDGSSITARYAGAIKDGKAKGEYTILS 120
:: *
:::::. .: :*
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B.p. PtxB
B.j. Blr2197
TFCIMTTRNTGQPATDHYYSNVTATRLLSSTNSRLCAVFVRSGQPVIGACTSPYDGKYWS 171
--------GTGT------YANATGTGGFESVQSGFKGAFLYDGRFIVKTP---------- 156
.**
*:*.*.* :.*.:* : ..*: .*: :: :
B.p. PtxB
B.j. Blr2197
MYSRLRKMLYLIYVAGISVRVHVSKEEQYYDYEDATFETYALTGISICNPGSSLC----- 226
------------------------------------------------------------
Abb. 19: Alignment der Aminosäuresequenzen von B. japonicum Blr2197 und Bordetella pertussis PtxB
□ = konservierte AS-Reste
□ = teilkonservierte Reste zwischen der rhizobiellen Proteinsequenz undB. pertussis PtxB
= konservierte Region: Aerolysin/Pertussis Toxin (APT)
= konservierte Region: Pertussis S2S3, C-terminale Domäne
Identische AS: 30/226 = 13,27 %
Ähnliche AS: 63/226 = 27,88 %
Gesamt: 93/226 = 41,15 %
Wie bei dem Genprodukt von blr2197 handelt es sich auch bei PtxB um ein sekretiertes
Protein (Schneider et al., 2007). Die Bezeichnung Toxinuntereinheit ist missverständlich,
denn die eigentliche Funktion von PtxB ist die Bindung an ein Rezeptormolekül auf der
Zelloberfläche, durch die erst das Eindringen des eigentlichen Toxins in die Zelle ermöglicht
wird (Wong and Rosoff, 1996). Die toxische Wirkung an sich geht von der in die Zelle
eindringenden A-Untereinheit aus. Denkbar wäre also, dass es sich bei einem der beiden
Genprodukte PtxB oder Blr2197 um ein Protein handelt, welches einen Funktionswandel
erfahren hat und dessen Fähigkeit zur Bindung an einen Oberflächenrezeptor einer Wirtszelle
nun in neuem Kontext betrachtet werden muss.
Selbst bei einer Einbindung des Proteins in eine neue Funktion ist jedoch von einem
ähnlichen Rezeptor für die beiden Proteine auszugehen. Einer der für PtxB in Betracht
kommenden Rezeptoren an der Oberfläche von T-Lymphozyten ist das humane Protein HPT
69
Diskussion
(Haptoglobin) (Rogers et al., 1990). Sucht man nach Proteinen in Pflanzen, die eine
Sequenzähnlichkeit zu HPT aufweisen, so findet man unter anderem das Genprodukt
ABN08036 aus Medicago truncatula, der Wirtspflanze von S. meliloti. Im noch nicht
vollständig sequenzierten und annotierten Genom von Glycine max finden sich darüber hinaus
vier aufeinander folgende und zum Teil überlappende ESTs (Expressed Sequence Tags), die
in insgesamt 15 HSPs (High-scoring Segment Pairs) mit der Sequenz aus M. truncatula
Übereinstimmungen ergeben (Abb. 20).
Sowohl ein als Ligand funktionierendes Protein als auch ein möglicher Rezeptor wären
demnach vermutlich in beiden Systemen vorhanden.
Hieraus
ließe sich eine Ergänzung des
bisherigen Modells zur
Induktion der
Nodulationsvorgänge entwickeln. Während die primären Vorgänge durch die Nod-Faktoren
über
größere
Entfernungen
ausgelöst
werden,
könnte
es
sekundäre,
für
die
knöllchenspezifische Gewebedifferenzierung notwendige Vorgänge geben, die einen direkten
Zell-Zell-Kontakt erfordern. Eine denkbare Funktion von Blr2197 im Rahmen der Symbiose
von B. japonicum mit Glycine max könnte es sein, dass, ähnlich wie durch PtxB (GrenierBrossette et al., 1991), die Proliferation von Zellen angeregt bzw. die meristematische
Aktivität im Knöllchengewebe verstärkt werden. In diesem System könnte einer der Schlüssel
für das Zustandekommen von determinierten und indeterminierten Knöllchen liegen, da durch
eine zeitlich begrenzte Expression von Blr2197 auch die Aktivität des Meristems zeitlich
beeinflusst werden könnte.
Eine zweite Möglichkeit wäre die Annahme, dass B. japonicum durch eine chemotaktische
Interaktion die Infektionsschläuche zu den, durch die Wirkung der Nod-Faktoren in der
Entstehung befindlichen, Wurzelknöllchen leitet. Hierfür wären unter Umständen bereits sehr
geringe Mengen von Blr2197 ausreichend. Für PtxB ist beschrieben, dass bereits
Konzentrationen im femtomolaren Bereich ausreichen, um humane und Maus-Mastzellen zur
Migration anzuregen (Jackson et al., 2005). Wenn im Gewebe der durch die Nod-Faktoren
induzierten Knöllchen nun ein zu Blr2197 passender Rezeptor spezifisch exprimiert würde, so
könnte hierdurch ein chemischer Gradient aufgebaut werden, der den eindringenden Bakterien
quasi als "Wegweiser" zum Knöllchengewebe dient.
70
Medicago-Proteins ABN08036 zu mehreren ESTs aus Glycine max. Wie die ganz unten in der Grafik dargestellten putativen
Genprodukte zeigen, wird ein ähnliches Protein auch fürG. max vermutet.
stimmungen desAbb. 20: Überein
Diskussion
71
Diskussion
6.1.6 Mutanten ohne nachgewiesene Integration
Für die beiden B. japonicum-Mutanten BJ-FK315 und BJ-FK343 konnte trotz mehrfacher
Wiederholung der Versuche keine Vektorintegration nachgewiesen werden. Erwartet wurde
Unterbrechungen der Leserahmen bll2431 für BJ-FK315 und blr7958 für BJ-FK343. Da das
Nachweisverfahren für die restlichen Fälle problemlos anzuwenden war, könnte in diesen
beiden Fällen eine zu geringe Spezifität der verwendeten Oligonukleotide vorliegen. Es ist
aber auch nicht auszuschließen, dass es sich in diesen beiden Fällen nicht um Mutanten
handelt, die durch eine Vektorintegration zustande gekommen sind, sondern um falschpositive Hintergrundklone, die in den vorausgegangenen Screens mit erfasst wurden.
6.1.7 Schlussfolgerungen
Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die gewählte Methode zum Nachweis der
Vektorintegration geeignet ist. Mit nur geringen Optimierungsarbeiten war es möglich, in
nahezu allen Fällen eindeutige PCR-Amplifikate zu erzielen, die für die nachfolgenden
Sequenzierungen eingesetzt werden konnten. Dadurch wird es in Zukunft möglich sein,
weitere noch nicht verifizierte Klone der E-Tag-Expressionsgenbank schnell zu überprüfen
und die Integration des Vektors als Mutationsursache zu verifizieren. Das Spektrum der
bereits in der geringen Zahl überprüfter Mutanten vertretenen Proteine macht deutlich, wie
komplex der Prozess der Etablierung der Symbiose ist und von wie vielen unterschiedlichen
Faktoren er beeinflusst wird.
72
Diskussion
6.2
Mögliche Aufgaben der beiden nex18-Homologen in B. japonicum
6.2.1 Deletion der nex18-Homologe in B. japonicum
Die beiden nex18-ähnlichen Gene in B. japonicum kodieren zwei identische Proteine, die
jeweils mit einem Signalpeptid ausgestattet sind. Um die Funktion dieser Genprodukte zu
klären, sollten im Rahmen dieser Arbeit Deletionsmutanten der beiden Leserahmen blr2474
und bll5191 erzeugt werden. Das Problem hierbei lag in der bereits in der Einleitung
beschriebene völligen Sequenzübereinstimmung der Leserahmen und der sie umgebenden
genomischen Bereiche. Aus diesem Problem heraus wurde eine Strategie entwickelt, die es
ermöglichen sollte, trotz der identischen Genomabschnitte spezifische und unterscheidbare
Deletionesmutanten für die beiden Leserahmen blr2474 und bll5191 zu erzeugen.
Der gewählte Ansatz beruht auf der Verwendung von zwei verschiedenen Resistenzmarkern,
die sich von den übrigen, zur positiven Selektion auf den verwendeten Bradyrhizobien-Stamm
beziehungsweise den zur Anwendung kommenden mobilisierbaren Vektor benutzten
Resistenzgenen unterscheiden. Hierfür wurden die von Prentki, Krisch und Fellay
entwickelten Ω-Fragmente zur Vermittlung einer Kanamycinresistenz bzw. einer Resistenz
gegen Streptomycin und Spectinomycin herangezogen (Prentki and Krisch, 1984; Fellay et
al., 1987).
Jeweils eine dieser Resistenzkassetten sollte – zwischen die für beide Genorte
unterschiedlichen stromauf- und -abwärtsgelegenen Flankenbereiche kloniert – das
eigentliche Gen durch doppelte homologe Rekombination ersetzen.
Die ersten durchgeführten Kreuzungsexperimente lieferten eine hohe Zahl an kanamycinbzw. streptomycinresistenten Klonen, bei denen durch geeignete Sekundärselektion auf
Gentamycinsensitivität auch von einer doppelten homologen Rekombination auszugehen war.
Die untersuchten Klone stellten sich jedoch als falsch positiv heraus. Eine mögliche
Erklärung hierfür wäre, dass es in B. japonicum, ähnlich wie in anderen Bakterien
beschrieben, sogenannte Integrons geben könnte. Diese Strukturen sind in der Lage,
Resistenzgene in bestimmte Regionen des Bakterienchromosoms zu integrieren (Fluit and
Schmitz, 1999; Ploy et al., 2000; Rowe-Magnus and Mazel, 2002), wodurch der verwendete
Stamm eine Kanamycin- bzw. Streptomycinresistenz erworben haben könnte, ohne dass es
tatsächlich zu einer doppelten homologen Rekombination gekommen ist. Dies könnte durch
die repetitiven Sequenzen am 5'- und 3'-Ende der Ω-Fragmente noch gefördert werden. Von
73
Diskussion
verschiedenen Rhizobienarten ist eine sehr hohe Genomplastizität bekannt (Romero and
Palacios, 1997; Flores et al., 2005), die unter anderem durch repetitive Sequenzen begünstigt
wird. Ein auf der Grundlage dieser Vermutung durchgeführter Sequenzvergleich ergab zudem
Ähnlichkeiten (ca. 55 % und ca. 44 %) von zwei bradyrhizobiellen Integrasen (blr0446 und
bll2138) zur Integron-assoziierten Integrase IntI1 aus E. coli (Abb. 21 und 22).
E.c. IntI1
B.j. Blr0446
MKTATAPLPPLRSVK--VLDQLRERIRYL----HYSLRTEQAYVNWVRAFIRFHG----MSKAAAPQIELASADPSIAQEMTRWLSHLGAERRLSPKTLEAYGRDLRQCLDFLCNHWGE
*..*:**
* *.. : ::: . : :*
: * :* :** . :* : *
49
60
E.c. IntI1
B.j. Blr0446
---VRHPATLGSSEVEAFLSWLANERKVSVSTHRQALAALLF--FYGKVLCTDLPWLQEI 104
RVTLKRFAALEATDVRAFMAMRRADDIAGRSLMRALAGLRSFGRFLEREGKGKVGALSAI 120
::: *:* :::*.**::
: .. * *
.
* * :
.: *. *
E.c. IntI1
B.j. Blr0446
GRPRPSRRLPVVLTPDEVVRILG-----------FLEGEHRLFAQLLYGTGMRISEGLQL 153
RAPKVAKSLPKPLPMASAKRLADADERAGEERETWILARDAAVMALLYGSGLRISEALGL 180
*: :: ** *. .. *: .
:: ... . ****:*:****.* *
E.c. IntI1
B.j. Blr0446
RVKDLD-FDHGTIIVREGKGSKDRALMLPESLAPSLREQLSRARAWWLKDQAEGRSGVAL 212
KRREVPKPGEGDVLVVTGKGNKTRMVPVLQNVLALVQEYVS-----------------MC 223
: :::
..* ::* ***.* * : : :.: . ::* :*
E.c. IntI1
B.j. Blr0446
PDALERKYPRAGHSWPWFWVFAQHTHSTDPRSGVVRRHHMYDQTFQRAFKRAVEQAGITK 272
PYPLPAEGP----------IFVG-----------ARGGPLSPRIIQLAMERLRGALGLPD 262
* .* : *
:*.
.*
: : :* *::*
*:..
E.c. IntI1
B.j. Blr0446
PATPHTLRHSFATALLRSGYDIRTVQDLLGHSDVSTTMIYTHVLKVGGAGVRSPLDALPP 332
SATPHALRHSFATHLLSRGGDLRAIQELLGHSSLSTTQIYTGIDSERLLEVYASAHPRR- 321
.****:******* ** * *:*::*:*****.:*** *** : .
* :. ..
E.c. IntI1
B.j. Blr0446
LTSE
----
336
321
Abb. 21: Alignment der Aminosäuresequenzen der Integrasen Blr0446 aus B. japonicum IntI1 aus E. coli.
□ = konservierte AS-Reste
□ = teilkonservierte Reste zwischen der rhizobiellen Proteinsequenz undE. coli IntI1
Identische AS: 87/336 = 25,89 %
Ähnliche AS: 98/336 = 29,17 %
Gesamt: 185/336 = 55,06 %
74
Diskussion
E.c. IntI1
B.j. Bll2138
-----------------------------------------------------------MATKGRQGMAKSSEDHCHGLRCMDAGDLDPLVTEFTRHLTVLGHKSLTVSGYDAAARHLA
E.c. IntI1
B.j. Bll2138
--MKTATAPLPPLRS--VKVLDQLRERIRYLHYSLRTEQAYVNWVRAFIRFHG-----VR 51
QWLTLAKIAVADIDDGVADRFARHRCRCPGIRRERSVSAKYVRRVRRFIEFLGERGIVQR 120
:. *. .:. : . .. : : * *
:: . .. **. ** **.* *
*
E.c. IntI1
B.j. Bll2138
HPATLGSSEVEAFLSWLANERKVSVSTHRQALAALLFFYGKVLCTDLPWLQEIGRPRPSR 111
KPKPALPTPHRRVVEFQDCVTELTIDRHGRMVMRLLPALGIRPRSWNAQLIRDVIIAETK 180
:* . .: . .:.:
::::. * : : **
*
: . * .
::
E.c. IntI1
B.j. Bll2138
RLPVVLTPDEVVRILGFLEGEHRLFAQLLYGTGMRISEGLQ-----------LRVKDLDF 160
RVSLAYVKTMTMALRGYLR---FLSARGLCRAGLDQAVPIIPQWRLSSLPRYIRSSDVET 237
*:.:. .
.: : *:*.
* *: * :*: : :
:* .*::
E.c. IntI1
B.j. Bll2138
DHGTIIVREGKGSKDRALMLPESLAPSLREQLSRARAWWLKDQAEGRSGVALPDALER-- 218
LIATCDQTTATGVRDRAILL---LLARLGLRAGDILSLRLTDVDWQQATLSVRGKGRRET 294
.*
..* :***::*
* . * : .
: *.*
:: ::: . .*
E.c. IntI1
B.j. Bll2138
--KYPRAGHSWPWFWVFAQHTHSTDPRSGVVR----RHHMYDQTFQRAFKRAVEQAGITK 272
RLPLPQDAGDALLAYLDQARPHVADVRIFFMSNAPIRPLTGSSAVSDVVRSAIRKAGIPV 354
*: . .
::
:.* :* * .:
*
..:.. ..: *:.:***.
E.c. IntI1
B.j. Bll2138
PAT-PHTLRHSFATALLRSGYDIRTVQDLLGHSDVSTTMIYTHVLKVGGAGVRSPLDALP 331
PSNGANLLRHSAATAMLRGGATLDTVGAVLRHRSPDMTAHYAKVDVTMLLQIAQPWPGDA 414
*:. .: **** ***:**.* : ** :* * . . * *::* .
: .* . .
E.c. IntI1
B.j. Bll2138
PLTSE
-----
60
336
414
Abb. 22: Alignment der Aminosäuresequenzen der Integrasen Bll2138 aus B. japonicum IntI1 aus E. coli.
□ = konservierte AS-Reste
□ = teilkonservierte Reste zwischen der rhizobiellen Proteinsequenz undE. coli IntI1
Identische AS: 66/414 = 15,94 %
Ähnliche AS: 117/414 = 28,26 % Gesamt: 183/414 = 44,20 %
Als mögliche Lösung des Problems wurde für eine weitere Runde an Kreuzungsexperimenten
ein anderes Selektionsverfahren verwendet. Dieses basiert auf der Selektion gegen einen
toxischen Effekt des auf dem Shuttelvektor kodierten Genprodukts Levansucrase. In
Gegenwart von Saccharose im Medium erfolgt bei Zellen, die Levansucrase exprimieren, eine
lytische Reaktion (Gay et al., 1985; Hynes et al., 1989).
Vergleicht man die beiden Selektionsverfahren miteinander, so ist davon auszugehen, dass die
Levansucraseselektion eine doppelte homologe Rekombination stärker bedingt als die
Selektion auf eine Gentamycinsensitivität. Da der verwendete Vektor pJQ200SK in
B. japonicum nicht replikationsfähig ist, wird hier zwar eine einfache Rekombination
erzwungen, ein zweites Rekombinationsereignis ist jedoch nicht erforderlich. Genau dieses
zweite, gewünschte Rekombinationsereignis, wird durch das Zustandekommen einer
toxischen Wirkung im Fall der Expression von Levansucrase erzwungen. Hingegen führt die
75
Diskussion
Sekundärselektion auf Gentamycin notwendigerweise zum Erhalt des Vektors nach einem
einfachen Rekombinationsereignis, so dass nur ein geringer Teil der durch die
Primärselektion erfassten Klone tatsächlich ein zweites Rekombinationsereignis und damit
eine Sensitivität gegenüber Gentamycin aufweist.
Tatsächlich ergab die zweite Runde an Kreuzungsexperimenten eine deutlich geringere
Anzahl an Klonen, die die Selektionsbedingungen erfüllten. Für den Leserahmen bll5191
wurden insgesamt 12 mögliche Deletionsmutanten erzielt, während für den Leserahmen
blr2474 nur fünf Kandidaten zur Verfügung standen. Von diesen konnten neun Klone als
Deletionsmutanten des Leserahmens bll5191 bestätigt werden. Die für blr2474 erhaltenen
Klone stellten sich als Falschpositive heraus.
Obwohl die Gesamtzahl an Kolonien nach der Kreuzung wesentlich geringer ausfällt, ist
durch die Nutzung eines konditional lethalen Selektionsmarkers die Rate an doppelten
Rekombinationsereignissen deutlich erhöht worden.
6.2.2 Identifizierung eines dritten nex18-ähnlichen Leserahmens, bll0507
Im Rahmen von Sequenzanalysen über die Datenbank RhizoBase konnte während der
Anfertigung dieser Arbeit ein dritter offener Leserahmen identifiziert werden, der hohe
Ähnlichkeiten zu den beiden nex18-ähnlichen Leserahmen blr2474 und bll5191 aufweist. Es
handelt sich hierbei um den ORF bll0507 (Abb. 23).
B.j. Blr2474
B.j. Bll5191
B.j. Bll0507
MSR--VGIASKAAVVMAVVGLAIGSTFARAS-----------NQDIVDTAVGAGQFKTLA
MSR--VGIASKAAVVMAVVGLAIGSTFARAS-----------NQDIVDTAVGAGQFKTLA
MSKRIAYLAAAAFSALAITATVVAPARAEEKTVMVGGAAMFPSKNIVQNAVNSKDHTTLV
**: . :*: * .:*:.. .:..: *. .
.::**:.**.: :..**.
47
47
60
B.j. Blr2474
B.j. Bll5191
B.j. Bll0507
AALKAADLVATLKGPGPFTVFAPTDEAFAKLPAGTVENLLKPENKAKLTAILTYHVVPGA 107
AALKAADLVATLKGPGPFTVFAPTDEAFAKLPAGTVENLLKPENKAKLTAILTYHVVPGA 107
AAVKAAGLVPTLESKGPFTVFAPTNAAFGKLPAGTVDNLVKPENKATLTKILTYHVVPGK 120
**:***.**.**:. *********: **.*******:**:******.** *********
B.j. Blr2474
B.j. Bll5191
B.j. Bll0507
VKAEQVTKLDQAKTVNGAMVKVTTKGGKVTINDAT-----VVKADIPASNGMIHVIDKVI 162
VKAEQVTKLDQAKTVNGAMVKVTTKGGKVTINDAT-----VVKADIPASNGMIHVIDKVI 162
LEASDLTDGKKLKTAEGEELTVKKMDGKTWIVDAKGGTSMVTISNVNQSNGVIHVVDTVL 180
::*.::*. .: **.:* :.*.. .**. * **.
*. ::: ***:***:*.*:
B.j. Blr2474
B.j. Bll5191
B.j. Bll0507
LPPQN 167
LPPQN 167
MPAT- 184
:*.
Abb. 23: Alignment der Aminosäuresequenzen der Leserahmen Blr2474, Bll5191 und Bll0507 aus
B. japonicum. □ = konservierte AS-Reste □ = teilkonservierte Reste zwischen den Proteinsequenzen von
Blr2474, Bll5191 und Bll0507.
Identische AS: 79/184 = 42,93 %
Ähnliche AS: 64/184 = 34,78 %
Gesamt: 144/184 = 78,26 %
76
Diskussion
Dieses Gen wird vom Kazusa-Institut als konserviertes hypothetisches Protein mit
unbekannter Funktion beschrieben. Allerdings lässt sich auch in dem von bll0507 kodierten
Protein eine fasciclin-ähnliche Domäne identifizieren.
Anders als in den Fällen blr2474 und bll5191 folgt auf bll0507 jedoch kein tspO, sondern ein
Gen, welches möglicherweise für eine Cytochrom B-Untereinheit kodiert. Die genaue
Funktion des von bll0506 kodierten Proteins ist jedoch ebenfalls unbekannt.
77
Diskussion
6.3
Versuche zur Konstruktion sip-exprimierender E. coli-Stämme
6.3.1 Konstruktion von lepB-sip-Austausmutanten in E. coli
Zur Untersuchung der einzelnen Signalpeptidasen aus B. japonicum sollte ein System
geschaffen werden, in dem jeweils nur eines der drei Gene exprimiert wird. Hierzu wären
verschiedene Doppeldeletionsmutanten von B. japonicum denkbar gewesen. Problematisch ist
jedoch das langsame Wachstum von B. japonicum, welches sich durch das Fehlen bereits
einer Signalpeptidase noch weiter reduziert (Müller et al., 1995a). Um darüber hinaus die
bereits bestehende Expressionsgenbank nutzen zu können, wurde eine Fremdexpression
einzelner sip-Gene in E. coli gegenüber einer Doppeldeletionsmutante in B. japonicum
favorisiert.
Da bereits Erkenntnisse aus Komplementationsexperimenten mit dem lepts-Stamm E. coli
IT41 (Inada et al., 1989) vorlagen (Müller et al., 1995b; Bairl and Müller, 1998), wurde die
hier zugrunde liegende Überlegung weiter entwickelt. Ein sip-Allel, welches bei einer
in trans-Expression geeignet ist, den thermosensitiven, konditional lethalen Phänotyp von
E. coli IT41 zu komplementieren, müsste sich auch dafür verwenden lassen, das singuläre,
essentielle Gen der E. coli-eigenen Leaderpeptidase zu ersetzen. Hierdurch würden drei, im
Vergleich zu B. japonicum schnellwachsende, Stämme mit einem stabilen genetischen
Hintergrund geschaffen, in denen jeweils nur eine einzige bradyrhizobielle Signalpeptidase
zur Verfügung stehen würde. Diese Stämme wären geeignet, um die von Rosander et al.
geschaffene Expressionsgenbank der verschiedenen Genunterbrechungsmutanten (Rosander
et al., 2003) auf Unterschiede in der Prozessierung verschiedener Vorläuferproteine hin zu
untersuchen. Die komplementierende Eigenschaft wurde für die beiden Signalpeptidasen SipS
und SipF bereits gezeigt (Müller et al., 1995b; Bairl and Müller, 1998). Für die dritte
Signalpeptidase, SipX, stand ein entsprechender Nachweis bisher noch aus.
Da aufgrund der gezeigten Funktionalität von SipS und SipF in E. coli IT41 eine
entsprechende experimentelle Grundlage gegeben war, wurde eine bereits mehrfach
beschriebe Methode (Jasin and Schimmel, 1984; Hamilton et al., 1989; Dalbert and Smith,
1997) zur Deletion chromosomaler Kopien eines essentiellen Gens in E. coli unter
Zuhilfenahme eines komplementierenden Plasmids für die geplanten Genaustauschexperimente weiterentwickelt. Mit dieser Maßnahme wurde das Ziel verfolgt, auf die bisher
immer benötigte in trans-Expression eines komplementierenden Gens verzichten zu können.
78
Diskussion
Hierzu sollte das komplementierende Gen direkt das zu deletierende Gen ersetzen und unter
die Kontrolle des chromosomalen Promotors gebracht werden.
Der E. coli-Stamm K12 JC7623 (Kushner et al., 1971) wurde zunächst mit einem
thermosensitiven Hilfsplasmid ausgestattet, welches eine intakte Kopie von lepB trug und
dann mit linearen DNA-Fragmenten transformiert, die die einzubringenden sip-Leserahmen
zwischen homologen Flankenbereichen enthielten. Nach entsprechenden Primär- und
Sekundärselektionen, die eine doppelte homologe Rekombination ins Chromosom von
solchen in das Hilfsplasmid trennen sollten, wurden die verbleibenden Klone durch zwei
PCR-Ansätze überprüft.
Es wurden positive Ergebnisse für alle drei angestrebten Varianten eines Genaustausches
erzielt. Im Rahmen von Wachstumsexperimenten, mit denen die Genaustauschmutanten näher
charakterisiert werden sollten, traten jedoch Zweifel an einer vollständigen Deletion von lepB
auf. Eine zusätzliche Überprüfung mittels Southern-Hybridisierung und weiterer PCRs
bestätigte, dass die genomische Region um lepB im Gesamtgenom erhalten geblieben ist. Die
Ergebnisse der urspünglichen Nachweisexperimente bedingen jedoch die erfolgreiche
Integration der Austauschkonstrukte im chromosomalen Bereich des lep-Operons. Durch die
Sensitivität gegenüber Ampicillin und der Befähigung zum Wachstum bei 42 °C ist
gleichzeitig von einem Verlust des Hilfsplasmids auszugehen. Daraus folgt die
Notwendigkeit, eine Duplikation der genomischen Region um lepB zu postulieren. An dem
vorgeschlagenen Modell für den konditional lethalen Phänotyp von E. coli IT41 wurden
bereits früher Zweifel geäußert (Cregg et al., 1996). Damals wurde eine durch fehlerhaftes
Ablesen des mutierten Kodons bedingte Restaktivität von lepB diskutiert. Diese
Notwendigkeit zum Erhalt einer intakten Kopie von lepB scheint durch die vorliegenden
Ergebnisse bestätigt zu werden. Es wäre zu überprüfen, ob es auch bei E. coli IT41 zu der
vermuteten Duplikation der lepB-umgebenden Region gekommen ist. Unter diesem
Gesichtspunkt sind auch die bisher mit Hilfe des Stammes IT41 durchgeführten
Funktionalitätsnachweise für andere Signalpeptidasen neu zu betrachten. Zwar lässt sich der
thermosensitive Phänotyp von IT41 durch zusätzliche Expression einer Signalpeptidase
unterdrücken, inwieweit dies aber bei einem vorhandenen Rest von aktivem LepB als
absoluter Nachweis der Funktionalität betrachtet werden darf ist fraglich.
Da darüber hinaus E. coli-Mutanten bekannt sind, die im Zuge der Replikation
Chromosomendimere ausbilden, diese aber nicht auflösen können (Blakely et al., 1991) bleibt
die Frage offen, ob das beobachtete parallele Vorkommen von lepB in seiner Wildtypform
und dem integrierten Austauschkonstrukt auf ein ähnliches Phänomen zurück geht. Es bleibt
79
Diskussion
zu klären, ob es sich um ein zufälliges Ereignis handelt, oder ob in Bakterien zum Erhalt
essentieller Gene Schutzmechanismen etabliert sind, die unter bestimmten Voraussetzungen
zu Genomrearrangements führen. Dabei könnte es sich um ein generelles Modell zur
Erklärung der Flexibilität bakterieller Genome handeln.
6.3.2 Unterschiede zwischen LepB und den drei Signalpeptidasen aus B. japonicum
Betrachtet man die Aminosäuresequenzen der für die Austauschexperimente verwendeten
Signalpeptidasen aus B. japonicum und vergleicht sie mit der Sequenz von LepB (Abb. 5, S.
31), so fallen im Bereich der beiden Domänen B und C die durchgängig konservierten
Aminosäurereste auf. Neben diesen, für die Funktion absolut notwendigen Positionen sind in
den genannten Domänen aber die Positionen 86 und 144 (in LepB) als ausschlaggebend für
die Substratspezifität beschrieben worden (Karla et al., 2005; Ekici et al., 2006).
Während SipF an beiden Positionen Isoleucinreste aufweist, wie sie auch in LepB vorhanden
sind, ist in SipX die I144 (LepB) entsprechende Position durch einen Valinrest ersetzt. Im Fall
von SipS sind sogar beide Isoleucinreste durch Valinreste ersetzt. Ob in diesen Unterschieden
ein Grund für die in B. japonicum vermutete Substratspezifität der verschiedenen
Signalpeptidasen liegt, müssen weitere Experimente zeigen. Ebenso wären diese Unterschiede
als möglicher Grund dafür zu sehen, dass sich die Signalpeptidasen nicht zur vollständigen
Komplementation von LepB verwenden lassen, obwohl sie – wie durch die Experimente in
E. coli IT41 gezeigt – einen Überschneidungsbereich in der Funktionalität aufweisen.
6.3.3 Verwendungsmöglichkeiten der entwickelten Klonierstrategie
Die zur Konstruktion der E. coli K12 JC7623-Derivate entwickelte Methode, die zur Deletion
des essentiellen lepB-Gens ohne Erfordung einer in trans-Komplementation gedacht war, ist
als allgemein anwendbare Methode zur Deletion essentieller Gene zu betrachten. Einzige
Voraussetzung ist ein bekanntes heterologes Gen, welches benutzt werden kann, um den zu
deletierenden Leserahmen zu ersetzen; eine Premisse, die für die verschiedenen
Signalpeptidasen aus B. japonicum im Hinblick auf E. coli lepB nach derzeitigem
Kenntnisstand nicht gegeben ist. Ein grundsätzlicher Vorteil der Methode liegt darin, dass
durch Verwendung des chromosomalen Promotors des deletierten Gens zur Expression des
80
Diskussion
neu eingebrachten Leserahmens Gendosiseffekte weniger als bisher zu Beeinträchtigungen
führen sollten.
81
Ausblick
7.
Ausblick
7.1
Weitere Experimente mit den zur Verfügung stehenden Vektorintegrationsmutanten
7.1.1 Komplementationsversuche
Nachdem fünf Insertionsmutanten durch PCR-Verfahren bestätigt waren, wurden erste
Ansätze unternommen, um eine Komplementation der beobachteten Phänotypen, entweder
durch in trans exprimierte Kopien der intakten Gene oder eine erfolgreiche doppelte
homologe Rekombination, herbei zu führen. Hierzu wurden die entsprechenden genomischen
Bereiche aus B. japonicum USDA110 amplifiziert (Abb. 24) und in den Vektor pJQ200SK
ligiert. Da es jedoch auf Grund der Größe der Amplifikationsprodukte (bis zu 8 kbp) und von
zum Teil noch nicht endgültig geklärten Operonstrukturen zu massiven Problemen
hinsichtlich der geplanten Experimente kam, stehen Ergebnisse hierzu noch aus.
1
2
3
4
5
6
M
7
8
9
10
11
12
Abb. 24: Amplifikation intakter genomischer Bereiche zur Komplementation der untersuchten Mutanten.
Spuren 1+2: FK-409, Spuren 3+4: FK-343, Spuren 5+6: FK-309, Spuren 7+8: FK-305, Spuren 9+10:
FK-240, Spuren 11+12: FK-242. Spur M: DNA-Größenmarker "Smart Ladder".
82
Ausblick
7.1.2 Folgeexperimente mit den untersuchten B. japonicum-Mutanten
Neben den Versuchen, die untersuchten Mutanten durch Einbringen eines intakten
Wildtypgens zu komplementieren sind ebenfalls Ansätze notwendig, um die Funktion der von
der Vektorintegration betroffenen Genprodukte zu untersuchen. Hierfür könnten sowohl
Komplementationsexperimente mit ähnlichen Genen aus anderen Organismen dienen, als
auch Versuche, bestehende Mutanten anderer Organismen mit den bradyrhizobiellen Genen
zu komplementieren. Desweiteren wären eventuell Erkenntnisse aus Interaktionsstudien zu
erzielen. Welche Möglichkeiten sich für die jeweilige Mutante ergeben ist im Folgenden kurz
erläutert.
Die B. japonicum-Mutante BJ-FK305 ließe sich auf zwei Wegen weiter charakterisieren. Es
wäre zum einen zu untersuchen, ob die Expression einer verkürzten Version von Blr2992 in
der Lage ist, die prc-Mutation von E. coli ebenso zu retten, wie eine verkürzte Form von
RlpA. Darüber hinaus werden in den beiden Leserahmen blr0434 und bll4822 in
B. japonicum zwei Proteasen kodiert, die jeweils 50 % Sequenzähnlichkeit zu Prc aus E. coli
aufweisen. Ein Ausfall dieser beiden Proteasen sollte im Umkehrschluss bei gleicher
Proteinfunktion auch durch eine verkürzte Form sowohl von RlpA, als auch von Blr2992 zu
komplementieren sein.
Für die Mutante BJ-FK242 wären zunächst Expressionsstudien interessant, um die Regulation
von bll3735 unter Stickstoffmangelbedingungen zu betrachten. Die Frage ist, ob es hierbei
Parallelen zur Regulation von ompA aus E. coli gibt. Sollten sich tatsächlich Ähnlichkeiten
finden lassen, so könnte eine Komplementation von BJ-FK242 mit ompA aus E. coli
angedacht werden.
Für die Mutante BJ-FK240 wären ebenfalls mehrere Folgeexperimente denkbar. Zum einen
sollte über Co-Prezipitation nach möglichen Interaktionspartnern gesucht werden. Um die
vorgeschlagene Hypothese zur Proteinfunktion zu festigen, wäre auch eine mögliche
Interaktion von Blr2197 mit Hpt_human zu überprüfen. Sollte sich eine solche nachweisen
lassen, dann könnte auch versucht werden, BJ-FK240 mit PtxB aus Bordatella pertussis zu
komplementieren.
Im Fall der Mutante BJ-FK309 sollte zunächst überprüft werden, ob eine direkte Deletion der
Cytochrom-c-Peroxidase (blr6637) zum gleichen Phänotyp führt. Dadurch ließe sich eine
konkrete Aussage darüber treffen, ob die Veränderungen tatsächlich durch den Ausfall von
Blr6636 bedingt sind oder, wie vermutet, durch einen polaren Effekt auf den nachfolgenden
83
Ausblick
Leserahmen zustande kommen. Unabhängig vom Grund für den beobachteten Phänotypen
bleibt auch die Frage zu klären, ob die aktuelle Annotation für blr6636 fehlerhaft ist.
Folgeexperimente mit der Mutante BJ-FK409 könnten sowohl genetische als auch
morphologische Versuche beinhalten. So wäre eine Komplementation mit FlaD aus
C. crescentus oder Vibrio genauso anzudenken, wie die Untersuchung der Schwärmbewegung
von BJ-FK409 auf Oberflächen oder die mikroskopische Betrachtung möglicher
morphologischer Veränderungen des Flagellenapparates in der Mutante.
Für die beiden Mutanten BJ-FK343 und BJ-FK315 wäre zunächst eine Wiederholung der
Kreuzungsexperimente durchzuführen, um eine nachweisbare Vektorintegration in den
jeweiligen Leserahmen zu schaffen.
7.1.3 Charakterisierung
weiterer
Vektorintegrationsmutanten
zur
Untersuchung
extrazytoplasmatischer Proteine
Neben den im Zuge dieser Arbeit untersuchten Vektorintegrationsmutanten wurden durch die
vorangegangenen Experimente etliche weitere Klone erzeugt, die bisher noch nicht
vollständig charakterisiert sind. Ein langfristiges Ziel sollte daher die Expression dieser Klone
in
einem
geeigneten
Testsystem
sein,
um
die
Prozessierung
der
erfassten
extrazytoplasmatischen Proteine zu untersuchen.
Da ähnlich wie bei den bereits untersuchten Klonen auch hier damit zu rechnen ist, dass
einzelne Proteine Ähnlichkeiten zu bekannten Proteinen aus anderen Organismen aufweisen,
könnte eine umfassende Untersuchung das Verständnis sowohl für die Prozessierung
extrazytoplasmatischer Proteine selbst, als auch für deren Rolle bei der Etablierung der
Symbiose verbessern.
84
Ausblick
7.2
Untersuchungen der Nex18-Homologen aus B. japonicum
7.2.1 Charakterisierung der Deletionsmutante des offenen Leserahmens bll5191
Zur Charakterisierung der Deletionsmutante des ORFs bll5191 sind weiter Versuche
notwendig. So sollte als nächstes in einem Pflanzentest ermittelt werden, ob die Mutante in
der Lage ist, bei Glycine max effiziente Nodulationen herbeizuführen. Außerdem wäre eine
Messung
der
Stickstofffixierungsleistung
möglicher
zustandekommender
Knöllchen
durchzuführen. Da durch das Vorhandensein der identischen Kopie des Gens mit ORF
blr2474 die Möglichkeit zur Kompensation durch verstärkte Expression nicht ausgeschlossen
werden kann, wären auch Expressionsstudien in Betracht zu ziehen.
7.2.2 Herstellung von verschiedenen Doppeldeletionsmutanten zur Untersuchung der
einzelnen nex18-ähnlichen Leserahmen
Neben der genauen Charakterisierung der im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen
Deletionsmutante von bll5191 sollten weiter Anstrengungen unternommen werden, um
sowohl den zweiten nex18-ähnlichen Leserahmen blr2474 als auch den neu identifizierten
Leserahmen bll0507 zu deletieren. Neben diesen beiden zusätzlichen Einzeldeletionsmutanten
sollte ein weiteres Ziel die Konstruktion verschiedener Kombinationen von Doppeldeletionsmutanten sein. Als Ausgangspunkt hierfür kann die Deletionsmutante von bll5191
dienen und jeweils ein weiterer Leserahmen durch einen zweiten Selektionsmarker deletiert
werden. Bei den so zu konstruierenden Doppeldeletionsmutanten wäre die Frage von
besonderem Interesse, ob sich Effekte, die bei der Charakterisierung der momentan zur
Verfügung stehenden Einzeldeletionsmutante möglicherweise beobachtet werden, sich durch
das Fehlen eines zweiten Leserahmens verstärken lassen. Ebenfalls wäre zu untersuchen, ob
die Doppeldeletion von bll5191 und blr2474 die gleichen Auswirkungen hat, wie eine
Doppeldeletion bll5191/bll0507 beziehungsweise blr2474/bll0507.
85
Ausblick
7.2.3 Herstellung von Dreifach-Deletionsmutanten zur Untersuchung der Funktion Nex18ähnlicher Proteine in B. japonicum
Zur Klärung der Aufgaben Nex18-ähnlicher Proteine in B. japonicum könnte neben den
bereits erläuterten Doppeldeletionen auch die Erzeugung einer Dreifach-Deletionsmutante der
Leserahmen bll0507, blr2474 und bll5191 notwendig sein. Hierbei wäre unter Umständen
eine neue Strategie für die Selektion positiver Klone nötig, da die für B. japonicum zur
Verfügung stehenden Resistenzmarker aufgrund des benötigten Kreuzungsverfahrens sehr
begrenzt sind. Denkbar wäre, zunächst auf Grundlage der beschriebenen Arbeiten eine
Doppeldeletion von blr2474 und bll5191 durch Einkreuzen der ΩSm/Spc-Resistenzkassette in
den Genort blr2474 in der Deletionsmutante von bll5191 zu erzeugen. In einem zweiten
Schritt könnte dann der ORF bll0507 durch ein Reportergen ersetzt werden, welches nicht
zwangsläufig eine Resistenz vermitteln muss. Möglich wäre zum Beispiel ein mit einem
Exportsignal ausgestattetes, modifiziertes GFP. Die durch dieses Protein zustande kommende
Färbung der Kolonien würde eine ausreichende Methode für eine Vorauswahl zu
überprüfender Klone bieten.
86
Ausblick
7.3
lepB-Deletionsmutanten
7.3.1 Vektorbasierte Expression von Genen für extrazytoplasmatische Proteine aus
B. japonicum in einem genetisch stabilen Testsystem
Da die gewählte Methode zum Austausch des lepB-ORFs gegen jeweils eines der
Signalpeptidasegene aus B. japonicum nicht zum Erfolg geführt hat, muss eine alternative
Strategie gefunden werden, um das gewünschte genetisch stabile Testsystem zu schaffen.
Denkbar
wären
hierbei
zum
einen
weitere
Versuche
zur
Erzeugung
von
Doppeldeletionsmutanten in B. japonicum, zum anderen aber auch eine Verfolgung der
gewählten Strategie in E. coli mit anderen Mitteln. Besonders wäre hierbei das in der
Vergangenheit ebenfalls schon erfolgreich für Deletionserzeugungen in E. coli verwendete
LambdaRED-System in Betracht zu ziehen (Kang et al., 2004; Yu et al., 2008).
Nach wie vor ist die Notwendigkeit eines solchen Testsystems gegeben, denn zur
Untersuchung
einer
möglichen
differenzierten
Prozessierung
verschiedener
extrazytoplasmatischer Proteine durch die drei Signalpeptidasen sollen die zur Verfügung
stehenden E-Tag-Klone aus der Expressionsgenbank in Systemen getestet werden, in denen
jeweils nur eine Signalpeptidase aus B. japonicum zur Verfügung steht.
Die Möglichkeiten zum Nachweis einer Prozessierung, derzeit noch auf die Detektion des
E-Tags durch monoklonale Antikörper beschränkt, sollen erweitert werden. Besonders für
sekretierte Proteine eignet sich ein Nachweisverfahren, welches auf eine von Sakaguchi und
Mitarbeitern entwickeltes Verfahren zurückgreift (Kobayashi et al., 1988). Hierbei wird ein
β-Lactamasegen ohne eigene Signalpeptidsequenz als Reporter mit dem Signalpeptid des zu
untersuchenden Leserahmens gekoppelt. Bei korrekter Prozessierung wird β-Lactamase in das
Medium abgegeben. Ein durch die Enzymaktivität hervorgerufener Farbstoffumsatz macht die
optische Erfassung der Prozessierung möglich. Hierdurch können größere Durchsatzmengen
in Screens erreicht werden.
87
Material und Methoden
8.
Material und Methoden
8.1
Liste der verwendeten und konstruierten Plasmide
Die folgende Liste erfasst die bei der Erstellung dieser Dissertation verwendeten
kommerziellen
und
nichtkommerziellen
Vektoren,
sowie
die
aus
Experimenten
hervorgegangenen rekombinanten Plasmide einschließlich der wichtigsten Merkmale und
ihrem Verwendungszweck.
Vektorname
Ursprungsvektor
Verwendung / wichtige
Quelle / Referenz
Merkmale
Ampr, Kmr
pACYC177
pACYC142
Chang and Cohen, 1978
r
Amp , enthält die nex18-Flankenbereiche 1
pACYC177-n12
pACYC177
diese Arbeit
&2
r
r
Amp , Km , enthält die nex18-
pACYC177-n12ΩKm
pACYC177-n12
diese Arbeit
Flankenbereiche 1 & 2 & ΩKm
Ampr, Kmr, lacZα, M13 fwd.- und rev.-
pCR2.1-TOPO
n.a.
Invitrogen
Bindestellen, Klonier- & Sequenziervektor
Ampr, Kmr, lacZα::ccdB, , M13 fwd.- und
pCR4Blunt-TOPO
n.a.
Invitrogen
rev.-,T3-, T7-Bindestellen, Klonier- &
Sequenziervektor
Ampr, Kmr, enthält nex18-Flankenbereich 1
pCR4Bl-n1
pCR4Blunt-TOPO
diese Arbeit
r
r
Amp , Km , enthält nex18-Flankenbereich 2
pCR4Bl-n2
pCR4Blunt-TOPO
diese Arbeit
Ampr, Kmr, enthält nex18-Flankenbereich 3
pCR4Bl-n3
pCR4Blunt-TOPO
diese Arbeit
r
r
Amp , Km , enthält nex18-Flankenbereich 4
pCR4Bl-n4
pCR4Blunt-TOPO
diese Arbeit
Ampr, Kmr, enthält nex18-Flankenbereiche 1
pCR4Bl-n12
pCR4Bl-n1
diese Arbeit
&2
Ampr, Kmr, enthält nex18-Flankenbereiche 3
pCR4Bl-n34
pCR4Bl-n3
diese Arbeit
&4
Ampr, Kmr, Smr, enthält nex18-
pCR4Bl-n34ΩSm/Spc
pCR4Bl-n34
diese Arbeit
Flankenbereiche 3 & 4 & ΩSm
Kmr, low copy-Plasmid mit
pFDX600
pHSG415
Vögele et al., 1991
thermosensitivem Replikon
Kmr, Ampr, low copy-Plasmid mit
pFDX600ΩAmp
pFDX600
diese Arbeit
thermosensitivem Replikon und ΩAmp
Ampr, low copy-Plasmid mit
pFDX600ΩAmp-lepAB
pFDX600ΩAmp
diese Arbeit
thermosensitivem Replikon, lepAB und
ΩAmp
Ampr, zusätzliche Resistenz entsprechend
pHP45Ω
pHP45
Prentki and Krisch, 1984
der jeweiligen Ω-Kassette.
Trägerplasmid der verschiedenen Ω-
Fellay et al., 1987
Kassetten für Tcr, Smr / Spcr, Kmr
Cmr, low copy-Plasmid
pHSG575
pHSG415r
Takeshita et al., 1987
r
Cm , low copy-Plasmid mit intaktem lepAB-
pHSG575-lepAB
pHSG575
diese Arbeit
Operon
Cmr, low copy-Plasmid mit deletiertem
pHSG575-lepAB∆
pHSG575-lepAB
diese Arbeit
lepAB-Operon
Cmr, Kmr, low copy-Plasmid mit deletiertem
pHSG575-lepAB∆-
pHSG575-lepAB∆
diese Arbeit
lepAB-Operon und Fusionskonstrukt
Km::sipF
Km::sipF
88
Material und Methoden
Cmr, Kmr, low copy-Plasmid mit deletiertem
pHSG575-lepAB∆-
pHSG575-lepAB∆
diese Arbeit
lepAB-Operon und Fusionskonstrukt
Km::sipS
Km::sipS
Cmr, Kmr, low copy-Plasmid mit deletiertem
pHSG575-lepAB∆-
pHSG575-lepAB∆
diese Arbeit
lepAB-Operon und Fusionskonstrukt
Km::sipX
Km::sipX
Gmr, lacZ, mobilisierbarer Suicide-
pJQ200SK
pJQ199
Quandt and Hynes, 1993
Shuttlevektor zur Konjugation von
B. japonicum
Gmr, Kmr, lacZ, mobilisierbarer Suicide-
pJQ200SK-n12ΩKm
pJQ200SK
diese Arbeit
Shuttlevektor zur Konjugation von
B. japonicum mit komplettem
Deletionskonstrukt für blr2474
Gmr, Smr, lacZ, mobilisierbarer Suicide-
pJQ200SK-n34ΩSm/Spc
pJQ200SK
diese Arbeit
Shuttlevektor zur Konjugation von
B. japonicum mit komplettem
Deletionskonstrukt für bll5191
Kmr, Ampr
pKT254ΩAmp
pKT254
Fellay et al., 1987
Trägerplasmid für die ΩAmp-Kassette
Ampr, lac' IOPZα
pUC18
pBR322
Yanisch-Perron et al.,
1985
Ampr, Kmr
pUC18K
pUC18
Ménard et al., 1993
r
r
Amp , Km , enthält die transkriptionelle
pUC18K::sipF
pUC18K
diese Arbeit
Fusion aphA3::sipF
Ampr, Kmr, enthält die transkriptionelle
pUC18K::sipS
pUC18K
diese Arbeit
Fusion aphA3::sipS
Ampr, Kmr, enthält die transkriptionelle
pUC18K::sipX
pUC18K
diese Arbeit
Fusion aphA3::sipX
Tabelle 2: Liste der verwendeten und konstruierten Plasmide
8.2
Liste der verwendeten Bakterienstämme
Die im Verlauf dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind in der nachstehenden
Tabelle mit ihren wichtigsten genetischen Merkmalen aufgeführt.
Bakterienstamm
Genetische Merkmale
Quelle / Referenz
Wildtypstamm 3I1b110 des US Department of Agriculture
B. j. USDA110
Kuykendall and Elkan, 1976
(USDA), Beltsville, MD (USA)
Maier and Brill, 1978
Spontane Spcr-Mutante des Wildtypstammes USDA110
B. j. USDA110Spc4
Regensburger and Hennecke, 1983
r
Spontane Rif -Mutante des Wildtypstammes USDA110
B. j. USDA110Rif15
Regensburger and Hennecke, 1984
F-λ-(Φ80dlacZΔM15), Δ(lacZYA-argF)U169 endA1, recA1,
E. c. DH5α
Hanahan, 1983
supE44, thi-1, gyrA96, hsdR17(rK-mK+), relA1, phoA
Wildtypstamm
E. c. K12
Lederberg, 1947
recB21, recC22, sbcB15, sbcC201, argE3, hisG4, proA2,
E. c. K12 JC7623
Kushner et al., 1971
thr-1, ara-14, galK2, lacY1, mtl-1, xyl-5, rpsL31, supE44,
tsx-33, leuB6, thi-1
thi, pro, recA, hsdR-, hsdM+, RP4Tc::Mu, Km::Tn7, Tpr,
E. c. S17-1
Simon et al., 1983
Smr, Spcr
F- mcrA∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ∆lacX74,
E. c. TOP10
Invitrogen™
recA1, deoR, araD139, ∆(ara-leu)7697, galU, galK, rpsL
(Smr), endA1, nupG
Tabelle 3: Liste der verwendeten Bakterienstämme
89
Material und Methoden
8.3
Liste der verwendeten Oligonukleotide
In der folgenden Liste sind die im Laufe dieser Arbeit zu Anwendung gekommenen Oligonukleotide einschließlich ihrer Sequenz erfasst. Desweiteren ist angegeben, welcher DNABereich mit dem entsprechenden Primer amplifiziert wurde und mit welchem Gegenprimer er
zur Amplifikation kombiniert wurde.
Primerbezeichnung Sequenz
Verwendungszweck
Amplifikation des Flankenbereichs von blr2474 mit
5'-CAG AAG ATC TCA TCG ATC GCG GTG-3'
2472-R
Primer tspO-5up; Überprüfung der doppelten
Rekombination mit Primer 2478-L
Amplifikation des Flankenbereichs von blr2474 mit
5'-TGA CGG AAG CCA AGA TCT GGT CTG-3'
2478-L
Primer tspO-3down; Überprüfung der doppelten
Rekombination mit Primer 2472-R
Amplifikation des Flankenbereichs von bll5191 mit
5'-CTA CTT TGG CAG ATC TAT TCA CGC CG-3'
5187-R
Primer tspO-3down; Überprüfung der doppelten
Rekombination mit Primer 5194-L
Amplifikation des Flankenbereichs von bll5191 mit
5'-CTG CCC TAT TTG GTT CAC ACC AAC AG-3'
5194-L
Primer tspO-5up; Überprüfung der doppelten
Rekombination mit Primer 5187-R
Zusammen mit Ecrnc eine Möglichkeit zur
5'-GCG GCG TTT CTA TTA ATA CAG ACG-3'
EclepA
Überprüfung der doppelten homologen Rekombination.
Forwardprimer zur Amplifikation des 'lepA-lepB-rnc-
5'-TCG CCT GAT ACG CGC CTT CAG-3'
EcBlep
Fragments und des Gesamtoperons für das Hilfsplasmid
Reverser Primer zur Amplifikation des 'lepA-lepB-rnc-
5'-GAA ACC ACG TCA AGA GAA G-3'
EclepS
Fragments
Alternativer Reversprimer zur Amplifikation des 'lepA-
5'-GCT CGA GGC CGG GCA GGG CGT AGA A-3'
EclepX
lepB-rnc-Fragments
Primer zur Amplifikation des Plasmids pHSG575-
5'-AAT CTA GAA GGC GAA TGG CCG ACT G-3'
EclepXb
lepABΔ zusammen mit EcXblep
Zusammen mit EclepA eine Möglichkeit zur
5'-GCA GGA CAA ATG CGC GCT G-3'
Ecrnc
Überprüfung der doppelten homologen Rekombination.
Primer zur Amplifikation des Plasmids pHSG575-
5'-TTT CTA GAC CAC GAT ATC GCC GCG-3'
EcXblep
lepABΔ zusammen mit EclepXb
Interner Forwardprimer zur Überprüfung der 550-nt-
5'-ACA ATG CGG TGA CGA GTT GTC TG-3'
era-i
Deletion in lepB. Gegenprimer zu lepA-i.
Reversprimer zur Verifizierung der Vektorintegration
5'-GGA TCC CTA GGC ACG CGG TTC-3'
ETAG66
in den verschiedenen B. japonicum-Mutanten
Fwd.-Primer zur Verifizierung der Vektorintegration in
5'-GAA GTT CCA GGA AGT CGG CCT G-3'
FK240f
BJ-FK240; Fwd.-Primer zur Amplifikation des
Wildtyp-Genomabschnitts zu
Komplementationszwecken.
Reversprimer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-CTG GAC CCC GCC GCA AAT GGC-3'
FK240r
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken.
Fwd.-Primer zur Verifizierung der Vektorintegration in
5'-GAC TCA GGC AGC TAC AAC CTC GAT G-3'
FK242f
BJ-FK242; Fwd.-Primer zur Amplifikation des
Wildtyp-Genomabschnitts zu
Komplementationszwecken.
Reversprimer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-CGG CGC CTA TGC GCG GAT G-3'
FK242r
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken.
Fwd.-Primer zur Verifizierung der Vektorintegration in
5'-TCG GAG CAC TCG TCG GCG AG-3'
FK305f1
BJ-FK305; Fwd.-Primer zur Amplifikation des
Wildtyp-Genomabschnitts zu
Komplementationszwecken.
Fwd.-Primer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-GCG CAG GCG CGG CTC TTG-3'
FK305f2
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken.
Reversprimer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-CGG CGT CTA CAT GTC GAC GGA G-3'
FK305r
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken.
90
Material und Methoden
Fwd.-Primer zur Verifizierung der Vektorintegration in
5'-GCC GAC CAC GAG CCA GAT CTT G-3'
FK309f
BJ-FK309; Fwd.-Primer zur Amplifikation des
Wildtyp-Genomabschnitts zu
Komplementationszwecken.
Reversprimer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-TCG AGG ATG CGG TTC GCG CTG-3'
FK309r
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken.
Fwd.-Primer zur Verifizierung der Vektorintegration in
5'-GTT CTC CGC AGG TGC TTC CAT CG-3'
FK343f
BJ-FK343; Fwd.-Primer zur Amplifikation des
Wildtyp-Genomabschnitts zu
Komplementationszwecken.
Reversprimer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-CCA CGG CGC GCA CGA TGT TCG-3'
FK343r
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken.
Fwd.-Primer zur Verifizierung der Vektorintegration in
5'-GGC CAT GGT CTC GGA GAG TTC G-3'
FK409f
BJ-FK409; Fwd.-Primer zur Amplifikation des
Wildtyp-Genomabschnitts zu
Komplementationszwecken.
Reversprimer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-TCT CCG GCG AGG CGA TGT CG-3'
FK409r
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken.
modifizierter, IRD-800-markierter M13-fwd. Primer
5'-CGC CAT TCA GGC TGC GCA ACT G-3'
FP-800
zur DNA-Sequenzierung
Gegenprimer zu lep DO. Verwendet zur Überprüfung
5'-TGA CTT ACT GGG GAT CAA GCC TG-3'
Kan End
der doppelten homologen Rekombination.
Gegenprimer zu lep UP. Verwendet zur Überprüfung
5'-CAC CAG CTT ATA TAC CTT AGC AGG AG-3'
Kan Start
der doppelten homologen Rekombination.
5'-IRD-800 markierter Primer zur DNA-Sequenzierung
5'-GGG GAT CAA GCC TGA TTG GGA G-3'
Km-ATG-out-800
aus aphA3 von pUC18K
Reverser, interner Primer zur Überprüfung der 550-nt-
5'-GCC CAT CCA AGC TGC CTG C-3'
lepA-i
Deletion in lepB. Gegenprimer zu era-i.
Gegenprimer zu lepB-5. Überprüfung der erfolgreichen
5'-TGG CTA TTA ATG GAT GCC GCC AAT G-3'
lepB-3
Deletion von lepB.
Gegenprimer zu lepB-3. Überprüfung der erfolgreichen
5'-CCC TTA GGA GTT GGC ATG GCG-3'
lepB-5
Deletion von lepB.
Gegenprimer zu Kan End. Verwendet zur Überprüfung
5'-TCG TCC GGC GTC CAG CG-3'
lep DO
der doppelten homologen Rekombination.
Herstellung einer DIG-markierten Sonde für Southern-
5'-TGT CGC GGT TGT CGC CC-3'
lep-if
hybridisierung, nested PCR auf lepB-Amplifikat
Herstellung einer DIG-markierten Sonde für Southern-
5'-GAA AAC GCG CTG CCG GTC-3'
lep-ir
hybridisierung, nested PCR auf lepB-Amplifikat
Gegenprimer zu Kan Start. Verwendet zur Überprüfung
5'-GGC AAC CGA TCA TCT TAA GCG TG-3'
lep UP
der doppelten homologen Rekombination.
Gegenprimer zu ΩKm-5'-out. Überprüfung der
5'-CCT CCG GGT AAA GCT CGA AG-3'
nex-1-genom
erfolgreichen Deletion von blr2474
Gegenprimer zu ΩSm-5'-out. Überprüfung der
5'-CTC TGA CGC CCA ATC TTC GG-3'
nex-3-genom
erfolgreichen Deletion von bl5191
fwd. und rev. zur Amplifikation der Ω-Kassetten unter
5'-ATG GTA CCT GCA GAA TTC CCG GGG ATC CGG TG-3'
Ω-2
Generierung folgender zusätzlicher Schnittstellen:
KpnI, PstI
Gegenprimer zu nex-1-genom. Überprüfung der
5'-GGC AGC GTG AAG CTC AGA TC-3'
ΩKm-5'-out
erfolgreichen Deletion von blr2474
Gegenprimer zu nex-3-genom. Überprüfung der
5'-GGT ACA GCG CAG TAA CCG G-3'
ΩSm-5'-out
erfolgreichen Deletion von bl5191
Reversprimer zur Amplifikation des intakten lep-
5'-CAT AAC AAA TGC GAG GAC GTT TCC AG-3'
pro-lepA
Operons zur Konstruktion des Hilfsplasmids
Primer zur Amplifikation der Fusionen von sip-ORF
5'-CTG CAG GTC GAC TCT AG-3'
PSXbSTOP
und aphA3-Kassette. Gegenprimer zu XbATGKm
modifizierter, IRD-800-markierter M13-rev. Primer zur
5'-GTC AGT GAG CGA GGA AGC GGA AG-3'
RP-800
DNA-Sequenzierung
Reversprimer zur Amplifizierung des sipF-ORFs aus
5'-TAG ATC TTT CAT CGG ACG ATT TTG AAG AAG-3'
sipF3
B. japonicum
Fwd.-Primer zur Amplifikation des sipF-ORFs aus
5'-CAG ATC TTC GGG AAC GAA AAC TGA AAG C-3'
sipF5
B. japonicum
Reversprimer zur Amplifizierung des sipS-ORFs aus
5'-TGG ATC CGG TCA ATG CAC GGC G-3'
sipS3
B. japonicum
Fwd.-Primer zur Amplifikation des sipS-ORFs aus
5'-AGG ATC CAG AAG ATG ACT GCG ACC ACC A-3'
sipS5
B. japonicum
Alternativer fwd.-Primer zur Amplifikation des sipS-
5'-TGG ATC CAA GAT GAC TGC GAC CAC CAC C-3'
sipS5-2
ORFs aus B. japonicum
91
Material und Methoden
Reversprimer zur Amplifizierung des sipX-ORFs aus
5'-CGG ATC CTC ACC ACA CCT TCC CCA-3'
sipX3
B. japonicum
Fwd.-Primer zur Amplifikation des sipX-ORFs aus
5'-GGG ATC CAA ACG ATC CGC CCC TCG-3'
sipX5
B. japonicum
Alternativer fwd.-Primer zur Amplifikation des sipX-
5'-CGG ATC CGA GCA AAC GAT CCG CCC-3'
sipX5-2
ORFs aus B. japonicum
Alternativer fwd.-Primer zur Amplifikation des sipX-
5'-TGG ATC CCA AAC GAT CCG CCC CTC G-3'
sipX5-3
ORFs aus B. japonicum
Primer zur Amplifikation der Flankenbereiche von
5'-GGG TAC CTG ATG GGC CGG TCG AGA G-3'
tspO-3down
blr2474 und bll5191. Als fwd.-Primer mit 5187-R, als
rev.-Primer mit 2478-L verwendet.
Primer zur Amplifikation der Flankenbereiche von
5'-GGT ACC GAA TCT TGA TTT ATG AGT ACA CGG CCT A-3'
tspO-5up
blr2474 und bll5191. Als fwd.-Primer mit 2472-R, als
rev.-Primer mit 5194-L verwendet.
Fwd.-Primer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-ATCTAG AGT CCA AAG AAG CTT TGC CTG CAC ATG C-3'
Xba242f
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken unter
Einführung einer zusätzlichen XbaI-Schnittstelle für
Klonierungen.
Reversprimer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-TTC TAG AGT GCA AAC TGC TCG GGC CCG-3'
Xba242r
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken unter
Einführung einer zusätzlichen XbaI-Schnittstelle für
Klonierungen.
Fwd.-Primer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-ATC TAG AGG TCG TCG ACG AAC TGC GCC-3'
Xba305-1f
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken unter
Einführung einer zusätzlichen XbaI-Schnittstelle für
Klonierungen.
Fwd.-Primer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-CTC TAG AGC TGC AGG CCG CCG ACA AG-3'
Xba305-2f
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken unter
Einführung einer zusätzlichen XbaI-Schnittstelle für
Klonierungen.
Reversprimer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-TTC TAG AGA GCC TGC CGT CGT GAA GAA ATA CG-3'
Xba305r
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken unter
Einführung einer zusätzlichen XbaI-Schnittstelle für
Klonierungen.
Fwd.-Primer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-ATC TAG ACT TGG CGA CCT GCC GCA TGA AG-3'
Xba309f
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken unter
Einführung einer zusätzlichen XbaI-Schnittstelle für
Klonierungen.
Reversprimer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-TTC TAG ACT GTC GAC CTC GGC CGA CAG-3'
Xba309r
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken unter
Einführung einer zusätzlichen XbaI-Schnittstelle für
Klonierungen.
Fwd.-Primer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-ATC TAG AGC AAG CTT GGG CGA TGC GTG AAA G-3'
Xba343f
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken unter
Einführung einer zusätzlichen XbaI-Schnittstelle für
Klonierungen.
Reversprimer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-TTC TAG ACG GGA TCC AGA GCT GGT CGC-3'
Xba343r
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken unter
Einführung einer zusätzlichen XbaI-Schnittstelle für
Klonierungen.
Fwd.-Primer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-ATC TAG ACG TTT TCG GCA GCG GCC TTC G-3'
Xba409f
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken unter
Einführung einer zusätzlichen XbaI-Schnittstelle für
Klonierungen.
Reversprimer zur Amplifikation des Wildtyp-
5'-TTC TAG ACG ATC CTC GAT ATC GCC AGG GTG-3'
Xba409r
Genomabschnitts zu Komplementationszwecken unter
Einführung einer zusätzlichen XbaI-Schnittstelle für
Klonierungen.
Primer zur Amplifikation der Fusionen von sip-ORF
5'-GAT CTA GAT GAC TAA CTA GGA GGA ATA AAT G-3'
XbATGKm
und aphA3-Kassette. Gegenprimer zu PSXbSTOP
Tabelle 4: Liste der verwendeten Oligonukleotide
92
Material und Methoden
8.4
Chemikalienverzeichnis
Im folgenden Verzeichnis sind die verwendeten Chemikalien mit Bezugsquelle angegeben.
Sind mehrere Hersteller/Bezugsquellen angegeben, so wurden die Chemikalien (sofern nicht
anders angegeben) äquivalent eingesetzt.
Bezeichnung
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Agar-Agar
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Agarose
Eurogentec S.A., 4102 Seraing, Belgien
Ammoniumpersulfat (APS)
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, 89552 Steinheim
Ampicillin-Natriumsalz (Amp)
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Biotin ≥98,5 %, p.a.
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Borsäure
Riedel-deHaën GmbH, 30926 Seelze
Bromphenolblau
Serva Electrophoresis GmbH, 69115 Heidelberg
Calciumdichlorid-Dihydrat
Mallinckrodt Baker B.V., 7412 VA Deventer,
Niederlande
Chloramphenicol (Cm)
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Di-Kalium-hydrogenphosphat
Merck KGaA, 64271 Darmstadt
Dimethylformamid (DMF)
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Dimethylsulfoxyd (DMSO)
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Di-Natrium-hydrogenphosphat
Merck KGaA, 64271 Darmstadt
Ethylendiamin-tetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
(EDTA) ≥ 99% p.a.
Essigsäure; 99,8%, p.a.
Riedel-deHaën GmbH, 30926 Seelze
Ethanol; abs., p.a.
Lenz Chemie GmbH, 56457 Westerburg
Ethanol; vergällt
Lenz Chemie GmbH, 56457 Westerburg
Ethidiumbromid (EtBr)
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
plus
Gelmatrix KB
5,5%
LI-COR Biosciences GmbH,
61352 Bad Homburg
Gentamycinsulfat (Gm)
Serva Electrophoresis GmbH, 69115 Heidelberg
Glycerin; p.a.
Merck KGaA, 64271 Darmstadt
Hefeextrakt
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Isopropanol (2-Propanol); abs., p.a.
Merck KGaA, 64271 Darmstadt
Kalium-dihydrogenphosphat
Merck KGaA, 64271 Darmstadt
Kaliumchlorid
Merck KGaA, 64271 Darmstadt
Kanamycinsulfat (Km)
Serva Electrophoresis GmbH, 69115 Heidelberg
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Magnesiumdichlorid-Hexahaydrat; p.a.
Merck KGaA, 64271 Darmstadt
93
Material und Methoden
Natriumchlorid; 99,5% p.a.
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Pepton aus Casein, tryptisch verdaut
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Polyethylenglykol (PEG 4000)
Fermentas GmbH, 68789 St. Leon-Rot
Rifampicin
Serva Electrophoresis GmbH, 69115 Heidelberg
Spectinomycin-dihydrochlorid-pentahydrat (Spc)
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, 89552 Steinheim
Serva Electrophoresis GmbH, 69115 Heidelberg
Stickstoff, lq.
Fachbereich Chemie, Philipps-Universität, 35043
Marburg
Streptomycinsulfat (Sm)
Serva Electrophoresis GmbH, 69115 Heidelberg
plus
TBE-Puffer KB
; 10x, gebrauchsfertig
LI-COR Biosciences GmbH,
61352 Bad Homburg
TEMED
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Tetracyclin Hydrochlorid (Tc)
Serva Electrophoresis GmbH, 69115 Heidelberg
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Tris; Pufferan® ≥ 99,9%, p.a.
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
X-Gal; (5-Brom-4-Chlor-3-indoxyl-D-galactosid)
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Tabelle 5: Chemikalienverzeichnis
8.5
Liste der verwendeten Kitsysteme
Folgende Kits wurden für die Versuche im Rahmen dieser Arbeit verwendet. Soweit in
Kapitel 8.8 keine Ausnahmen angegeben sind, erfolgte die Benutzung gemäß den Angaben
der Herstellerfirmen.
Kitbezeichnung
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Auto DNA Sequencing Kit
Fermentas GmbH, 68789 St. Leon-Rot
GenomiPhi™ DNA Amplification Kit
GE Healthcare Customer Center Deutschland, 80807
GenomiPhi™ V2 DNA Amplification Kit
München
Nucleospin Multi-8 Plasmid
Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, 52355 Düren
QIAGEN Plasmid Midi Kit
QIAGEN GmbH, 40724 Hilden
QIAquick Gel Extraction Kit (50)
QIAGEN GmbH, 40724 Hilden
QIAquick PCR Purification Kit (50)
QIAGEN GmbH, 40724 Hilden
TempliPhi™ 500 Amplification Kit
GE Healthcare Customer Center Deutschland, 80807
München
TOPO-TA Cloning®-Kit
Invitrogen GmbH, 76131 Karlsruhe
Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit for Sequencing Invitrogen GmbH, 76131 Karlsruhe
Tabelle 6: Liste der verwendeten Kits
94
Material und Methoden
8.6
Liste der verwendeten Enzyme
Enzym
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Long PCR Enzyme Mix
Fermentas GmbH, 68789 St. Leon-Rot
Pfu Polymerase
Fermentas GmbH, 68789 St. Leon-Rot
Phusion™ High Fidelity DNA Polymerase
Finnzymes Oy, 02150 Espoo, Finnland
Restriktionsendonukleasen
Fermentas GmbH, 68789 St. Leon-Rot
Zu Beginn der Arbeit wurden z.T. noch Restbestände von
Restriktionsenzymen der Fa. Amersham Biosciences (Little Chalfont,
Buckinghamshire, HP7 9NA, Großbritannien) verwendet. Der
Wechsel zu Produkten der Fermentas GmbH erfolgte fließend im
Jahr 2005.
Shrimp Alkalische Phosphatase (SAP)
USB Corporation, Cleveland, Ohio 44128, USA
Taq DNA Polymerase, nativ mit BSA
Fermentas GmbH, 68789 St. Leon-Rot
T4 DNA Ligase
Fermentas GmbH, 68789 St. Leon-Rot
Tabelle 7: Liste der verwendeten Enzyme
8.7
Geräte und Verbrauchsmaterialien
Die folgende Liste gibt einen Überblick über die verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialien.
Bezeichnung
Hersteller bzw. Bezugsquelle
Autoklav "FVB 4.0"
Integra Biosciences GmbH, 35461 Fernwald
Autoklav "Fedigari FVS-3"
Integra Biosciences GmbH, 35461 Fernwald
Analysewaage L610D
Satorius AG, 37075 Göttingen
Brutschrank (37°C)
Binder GmbH, 78532 Tuttlingen
Brutschrank (42°C)
Binder GmbH, 78532 Tuttlingen
DNA-Sequenzierer "Gene ReadIR 4200"
LI-COR Biosciences GmbH,
61352 Bad Homburg
Einwegspitzen für Feinpipetten 0,2 - 10,0 µl
Sarstedt AG & Co., 51582 Nümbrecht
Einwegspitzen für Feinpipetten 2,0 - 200,0 µl
Sarstedt AG & Co., 51582 Nümbrecht
Einwegspitzen für Feinpipette 200,0 - 1000,0 µl
Sarstedt AG & Co., 51582 Nümbrecht
Einwegspitzen "multi Tip" für Multipette Plus, versch.
Eppendorf AG, 22339 Hamburg
Volumina
Einwegspritzen 60 ml
Becton Dickinson GmbH, 69126 Heidelberg
Elektrophoreseapparatur "Mupid-21"
Eurogentec S.A., 4102 Seraing, Belgien
Elektrophoreseapparatur "Mupid-exU"
Eurogentec S.A., 4102 Seraing, Belgien
Elektroporationsgerät "Gene Pulser"
Bio-Rad Laboratories GmbH, 80939 München
95
Material und Methoden
Elektroporationsküvetten, 2mm
Eurogentec S.A., 4102 Seraing, Belgien
Feinpipette 0,2 - 2,0 µl
Gilson International B.V. Deutschland,
65555 Limburg-Offheim
Feinpipette 0,5 - 10,0 µl
Gilson International B.V. Deutschland,
65555 Limburg-Offheim
Feinpipette 2,0 - 20,0 µl
Gilson International B.V. Deutschland,
65555 Limburg-Offheim
Feinpipette 10,0 - 100,0 µl
Gilson International B.V. Deutschland,
65555 Limburg-Offheim
Feinpipette 20,0 - 200,0 µl
Gilson International B.V. Deutschland,
65555 Limburg-Offheim
Feinpipette 200,0 - 1000,0 µl
Gilson International B.V. Deutschland,
65555 Limburg-Offheim
Feinwaage BP61
Satorius AG, 37075 Göttingen
Geldokumentationsanlage
INTAS Science Imaging Instruments GmbH,
37079 Göttingen
Glas-Messpipetten 5,0 ml; 10,0 ml; 20,0 ml
Brand GmbH & Co. KG, 97861 Wertheim
Hybridisierungsofen
Appligene-Oncor, F-67402 Illkirch, Frankreich
Küchenwaage (Soehnle)
LEIFHEIT AG, 56377 Nassau
Kühlzentrifuge
Beckman-Coulter GmbH, 47807 Krefeld
Laborspühlmaschine "G7733"
Miele &Cie. KG, 33332 Gütersloh
Laborthermometer
MAGV GmbH, 35466 Rabenau
Laborwaage 822-21
Gottl. Kern & Sohn GmbH,
72336 Balingen-Frommern
Magnetrührer "MR2000"
Heidolph Instruments GmbH & Co. KG,
91126 Schwabach
Magnetrührer mit Heizfunktion "MR2002"
Heidolph Instruments GmbH & Co. KG,
91126 Schwabach
Mikrowellenherd "intelloWAVE"
LG Electronics Deutschland GmbH,
47877 Willich
Multipette Plus
Eppendorf AG, 22339 Hamburg
Parafilm
MAGV GmbH, 35466 Rabenau
PCR-Gerät "T Gradient"
Biometra biomedizinische Analytik GmbH,
37079 Göttingen
PCR-Reaktionsgefäße "Multipiy Pro" 0,2 ml (farblos)
Sarstedt AG & Co., 51582 Nümbrecht
PCR-Reaktionsgefäße 0,2 ml (farbig sortiert für
Biozym Scientific GmbH,
Sequenzierungen)
31833 Hess. Oldendorf
PCR-Reaktionsgefäße "Multiply-µStrip Pro" 8er-Kette; Sarstedt AG & Co., 51582 Nümbrecht
0,2 ml
Petrischalen
Sarstedt AG & Co., 51582 Nümbrecht
96
Material und Methoden
Ph-Meter "320"
Mettler-Toledo GmbH, 35396 Gießen
Photometer "GeneQuant II" zur Bestimmung von
Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge
DNA-Konzentrationen in Lösungen
CB4 0FJ, Großbritannien
Photometer zur Zelldichtebestimmung "cell density
WPA biowave, Cambridge CB1 6NW, Großbritannien
meter CO 8000"
Reaktionsgefäße 1,5 ml
Sarstedt AG & Co., 51582 Nümbrecht
Eppendorf AG, 22339 Hamburg
Reaktionsgefäße 2,0 ml
Eppendorf AG, 22339 Hamburg
Röhre, 15 ml ("Falcontube")
Sarstedt AG & Co., 51582 Nümbrecht
Röhre, 50 ml ("Falcontube")
Sarstedt AG & Co., 51582 Nümbrecht
Rollinkubatoren für Kulturröhrchen
Elektronikwerkstatt Fachbereich Biologie , PhilippsUniversität, 35043 Marburg
Schüttelbrett für Kulturgefäße
INFORS AG, CH-4103 Bottmingen, Schweiz
Schüttler für Reaktionsgefäße 1,5/2,0 ml "Mixer 5432" Eppendorf AG, 22339 Hamburg
Spektrophotometer "NanoDrop ND-1000"
peqLab Biotechnologie GmbH, 91052 Erlangen
Spritzenvorsatzfilter
Schleicher & Schuell MicroScience GmbH,
37586 Dassel
Sterilarbeitsbank
Babcock-BSH AG, 47829 Krefeld-Uerdingen
(am 31.03.2003 geschlossen)
Sterilarbeitsbank "LaminAIR"
Heraeus Holding GmbH, 63450 Hanau
Thermoblock "Techne Dri-Block DB-3"
Thermo-DUX GmbH, 97866 Wertheim
Thermoblock "HB-2"
Wealtec Corp., Sparks, NV89431, USA
Thermoschüttler für Reaktionsgefäße
Eppendorf AG, 22339 Hamburg
1,5 / 2,0 ml
Tischzentrifuge "BioFuge"
Heraeus Instruments GmbH, 37539 Bad Grund
Tischzentrifuge "Mikro24-48"
Andreas Hettich GmbH & Co. KG,
78532 Tuttlingen
Tisch-Kühlzentrifuge "5417R"
Eppendorf AG, 22339 Hamburg
UV-Crosslinker
Stratagene, 1101 CB Amsterdam, Niederlande
UV-Transilluminator
UVP Inc., San Gabriel, CA 91778, USA
Vakuumapparatur zur Plasmidisolation mittels
Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, 52355 Düren
Nucleospin Multi-8 Plasmid-Kit
- Vakuumpumpe zu o.a. Apparatur
KNF Neuberger GmbH, 79112 Freiburg i. Br.
Vakuumkonzentrator "SpeedVac"
Bachofer GmbH, 72770 Reutlingen
Vortexer
Heidolph Instruments GmbH & Co. KG,
91126 Schwabach
Wärmeschrank (65°)
Haereus Instruments GmbH, 37539 Bad Grund
Wasserbad "19 A" (16°C)
Julabo Labortechnik GmbH, 77960 Seelbach
Zentrifuge für PCR-Reaktionsgefäße 02, ml
Carl Roth GmbH & Co. KG, 76185 Karlsruhe
Tabelle 8: Liste der Geräte und Verbrauchsmaterialien
97
Material und Methoden
8.8
Beschreibung verwendeter Arbeitsmethoden
8.8.1 Amplifikation von Plasmiden und genomischer DNA aus Bakterien
Die bisherige Methode zum Erhalt genomischer Gesamt-DNA aus Bakterien sah einen
Zellaufschluss mit anschließender Phenol-Chloroform-Extraktion der Proteinbestandteile vor.
Um dies zu umgehen wurde genomische Gesamt-DNA mithilfe des GenomiPhi™ DNA
Amplification Kits amplifiziert. Dabei wurde das Volumen der Reaktionsansätze gegenüber
dem Herstellerprotokoll halbiert. Eine geringe Menge einer ü. N. angezogenen
Vereinzelungskolonie oder 0,5 µl einer ü. N.-Kultur wurden zunächst in 4,5 µl Probenpuffer
aufgenommen und bei 95 °C für 3 min. in einem "T Gradient"-PCR-Block denaturiert.
Anschließend wurden 4,5 µl Reaktionspuffer und 0,5 µl Enzymmix zugesetzt und die
Reaktion 16 - 18 Stunden bei 30 ° C in einem Hybridisierungsofen inkubiert. Bei dem ab
Ende 2007 verwendeten, neu definierten GenomiPhi™ V2 DNA Amplification Kit betrug die
Inkubationszeit bei 30 °C lediglich 4 Stunden. Diese erfolgte in der Regel im PCR-Block.
Abschließend wurde das Enzym durch Inkubation des Reaktionsansatzes bei 65 °C für
10 min. inaktiviert. Die fertigen Amplifikationsprodukte wurden vor weiteren Anwendungen
1 : 5 mit H2O bidest. verdünnt.
Parallel zu den herkömmlichen Plasmidisolationsmethoden wurde im Rahmen dieser Arbeit
auch das TempliPhi™ 500 Amplification Kit verwendet, um Plasmid-DNA nach dem "rolling
circle"-Prinzip aus bakteriellen Zellen zu amplifizieren. Das Kit
wurde gemäß
Herstellerprotokoll verwendet. Da die erhaltenen Plasmide als Concatemere vorliegen sind sie
für weitere Arbeitsschritte meist erst nach Behandlung mit einer Endonuklease zu verwenden,
deren Erkennungssequenz in der Gesamtsequenz des Plasmids einmalig ist. Die beschriebene
Methode fand daher meist nur zu Kontrollzwecken Anwendung, bei denen die Amplifikate
sofort in Restriktionsanalysen eingesetzt wurden. Plasmidaufreinigungen für anschließende
Klonier- und Sequenzierarbeiten wurden nach den unter 8.8.9 beschriebenen Methoden
angefertigt.
98
Material und Methoden
8.8.2 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Zur Aufreinigung bestimmter DNA-Fragmente aus einem Agarosegel wurde das QIAquick
Gel Extraction Kit verwendet. Abweichend vom Protokoll des Herstellers wurde der
Waschschritt lediglich mit 750 µl statt der angegebenen 800 µl Waschpuffer durchgeführt, um
ein Austreten der Pufferlösung bei Verschließen der Säulen zu verhindern. Die Elution der
DNA erfolgte standardmäßig mit 50 µl H2O bidest.
8.8.3 Aufreinigung von PCR-Amplifikaten ohne vorherige Gelelektrophorese
Die direkte Aufreinigung von PCR-Amplifikaten wurde mithilfe des QIAquick PCR
Purification Kits durchgeführt. Anders als vom Hersteller vorgegeben wurde der Waschschritt
nur mit 750 µl statt mit 800 µl Waschpuffer durchgeführt, um ein Austreten des Puffers beim
Schließen der Säulen zu vermeiden. Die Elution der DNA erfolgte mit 30 µl H2O bidest., um
die Verdünnung des PCR-Produktes möglichst gering zu halten.
8.8.4 Bestimmung von DNA-Konzentrationen in Lösungen
Standardmäßig erfolgte eine grobe Einschätzung der DNA-Konzentrationen lediglich anhand
der bekannten Konzentrationen der zur Gelelektrophorese verwendeten Längenstandards. Für
genauere Abschätzungen wurde ein speziell für die Mengenabschätzung entwickelter
Mengenstandard der Firma Fermentas verwendet.
Wurden
für
Folgeanwendungen,
wie
z. B.
schwierige
Ligationen,
eine
genaue
Konzentrationsmessung benötigt, so erfolgte diese photospektrometrisch. Hierfür wurde
zunächst ein Photometer des Typs "Gene Quant II" verwendet. Seit Anfang 2008 stand in der
Arbeitgruppe von Prof. Dr. Uwe Maier ein Spektrophotometer des Typs "NanoDrop" zur
exakten Bestimmung von DNA-Konzentrationen in Lösungen zur Verfügung.
99
Material und Methoden
8.8.5 Bestimmung der Zelldichte von Kulturen
Zur Bestimmung der Zelldichte in Flüssigkulturen wurde die optische Dichte bei einer
Wellenlänge von 600 nm (OD600) gemessen. Ein OD600-Wert von 1,0 entspricht dabei einer
Zelldichte von 109 Zellen pro ml Kultur. Für die Messung wurde ein Photometer des Typs
"CO 8000" verwendet.
8.8.6 DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung von DNA-Fragmenten erfolgte mittels des Auto DNA Sequencing Kits
der Firma Fermentas, basierend auf der Sequenziermethode nach Sanger (Sanger et al., 1977).
Die Verwendung des Kits erfolgte gemäß Herstellerangaben, eingesetzte DNA wurde durch
Plasmid-Minipräparationen wie unter 8.8.9 beschrieben isoliert. Als Standardprimer wurden
für Sequenzierungen aus den beiden pTOPO-Vektoren modifizierte, am 5'-Ende IRD 800markierte M13 forward- und revers-Primer verwendet. Für die Sequenzierung verschiedener
Konstrukte in anderen Vektoren kamen weitere IRD 800-markierte Oligonukleotide zum
Einsatz (vgl. Tabelle 4 für Sequenzen).
Die Auftrennung der Sequenzierreaktionen erfolgte in einem 5,5 %-igen Polyacrylamid-Gel
(KBplus-Matrix, LI-COR Biosciences GmbH) mit 1  TBE (KBplus-Matrix, LI-COR
Biosciences GmbH) als Laufpuffer.
Als Analysegerät wurde ein "Gene ReadIR 4200" (ebenfalls LI-COR Biosciences GmbH)
verwendet.
8.8.7 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA
Die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte in Geräten der Firma
Eurogentec bei 100 Volt. Standardmäßig wurden TAE-Gele mit einer Konzentration von
0,8 % Agarose verwendet. Als Laufpuffer wurde 0,5  TAE benutzt. Die Färbung mit EtBr
erfolgte nach der Auftrennung in einem seperaten Färbebad. Zur Analyse und Dokumentation
der Gele wurde eine Anlage der Firma INTAS benutzt.
Als Längenstandard wurde vorwiegend die "Smart Ladder" von Eurogentec benutzt,
zwischenzeitlich fanden jedoch auch verschiedene Längenstandards aus der "Gene Ruler"-
100
Material und Methoden
Produktserie der Firma Fermentas Verwendung. War eine möglichst genaue Konzentrationsabschätzung der aufgetrennten DNA-Fragmente notwendig, so wurde ein Produkt der Reihe
"Mass Ruler", ebenfalls von Fermentas verwendet. Die Auftrennungsschemata der
verwendeten DNA-Standards sind nachfolgend wiedergegeben:
a)
b)
c)
Abb. 25: Auftrennungsmuster der verschiedenen zur Anwendung gekommenen DNA-Größenund Mengenstandards. a) Smart Ladder von Eurogentec, b) Fast Ruler-Produkte von
Fermentas, c) Mass Ruler-Produkte von Fermentas.
101
Material und Methoden
8.8.8 Herstellung kompetenter Zellen
a)
Chemokompetente Zellen
Die Herstellung chemokompetenter Zellen erfolgte nach einem modifizierten Protokoll auf
Basis der Methode von Mandel und Higa (Mandel and Higa, 1970). Ausgehend von einer
dichten ü. N.-Kultur wurden 100 ml dYT- oder LBG-Medium im Verhältnis 1 : 1000 in
einem Erlmeyerkolben angeimpft. Die Zellen wurden bei 120 rpm schüttelnd inkubiert und
bis zu einer OD600 von 0,6 - 0,8 wachsen lassen. Nach Erreichen der OD wurden die Zellen
durch Zentrifugation bei 5500  g, 15 min. und 4 °C geerntet. Ein erster Waschschritt
erfolgte durch Resuspendieren des Pellets in 50 ml eiskalter MgCl2-Lösung (100 mM).
Anschließend wurden die Zellen erneut pelletiert (5500  g, 10 min., 4 °C) und in 20 ml
eiskalter CaCl2-Lösung (100 mM) resuspendiert. Es folgte eine Inkubation im Eis für 20 - 30
min. und danach eine erneute Zentrifugation (5500  g, 10 min., 4 °C). Das Pellet wurde in 1
ml eiskalter CaCl2-Lösung (50 mM) + 15 % Glycerin aufgenommen, à 50 µl aliquotiert und
in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Zellen wurden anschließend bei -70 °C bis zur
Verwendung gelagert. Zur Bestimmung der Transformationseffizienz wurde jeweils ein
Aliquot der Zellen mit pUC18-DNA transformiert.
b)
Elektrokompetente Zellen
Zur Herstellung elektrokompetenter Zellen wurde das Protokoll aus dem Buch "Der
Experimentator" (Mülhardt, 2006) verwendet, welches eine Modifizierung der Methode von
Dower (Dower et al., 1988) darstellt. Anders als angegeben wurde zur Anzucht der Kulturen
LBG- oder dYT-Medium verwendet. Testtransformationen der jeweiligen Zellen wurden mit
pUC18-DNA durchgeführt.
8.8.9 Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterien
a)
Minipräparation
Für die standardmäßige Isolation von Plasmid-DNA mittels Minipräparation wurden 3 ml
dYT-Medium mit geeignetem Antibiotikum in einem Kulturröhrchen angeimpft und die
102
Material und Methoden
Kultur ü. N. im Rollinkubator angezogen. Die Präparation wurde mit dem NucleoSpin
Multi-8 Kit der Firma Macherey-Nagel nach den Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Die
abschließende Elution der Plasmid-DNA erfolgte in 125 µl H2O bidest.
b)
Midipräparation
Bei der Verwendung des low copy-Plasmids pFDX600 waren teilweise DNA-Präparationen
aus größeren Kulturvolumen notwendig, um genügend Plasmid-DNA für nachfolgende
Arbeitsschritte zu erhalten. Diese Midipräparationen wurden mit dem Plasmid Midi Kit der
Firma QIAGEN durchgeführt. Die Anzucht der Bakterien erfolgte in zwei Schritten. Zunächst
wurden 3 ml selektiven dYT-Mediums beimpft und ü. N. im Rollinkubator angezogen. Von
dieser Starterkultur ausgehend wurden am nächsten Tag 100 ml selektives dYT-Medium im
Verhältnis 1 : 1000 beimpft. Die Inkubation erfolgte bei 120 rpm auf einem Schüttelbrett,
ebenfalls ü. N. Die Hauptkultur wurde dann gemäß dem Herstellerprotokoll für eine
Midipräparation von low copy-Plasmiden eingesetzt.
8.8.10 Konjugation von B. japonicum mittels E. coli S17-1
Anders als bei E. coli ist es nicht möglich, B. japonicum direkt kompetent zu machen und
DNA durch eine Transformation in die Zelle einzubringen. Plasmide, die in B. japonicum
gebracht werden sollten, wurden daher zunächst in den E. coli-Stamm S17-1 transformiert.
Dieser Stamm ist zur bakteriellen Konjugation befähigt und somit in der Lage, Plasmide an
andere Bakterien weiterzugeben. Die Konjugationen wurden wie folgt durchgeführt:
Der Donorstamm S17-1 wurde in 3 ml LB-Medium bis zu einer OD600 von 0,6 angezogen.
Getrennt davon wurde der Rezipientenstamm (B. j. USDA110 Spc4 oder B. j. USDA110
Rif15) in 10 ml PSY-Medium bis zu einer OD600 von 1,0 angezogen. 250 µl der E. coli-Kultur
wurden dann mit 1000 µl der B. japonicum-Kultur in einem 2 ml-Reaktionsgefäß gemischt.
Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation (15.000  g, 1 min., RT) pelletiert und
nach Abgießen des Überstandes im Rücklauf resuspendiert. Dieses Zellgemisch wurde auf
eine 20E-Agarplatte aufgetropft und dann, ohne das Gemisch zu verteilen, bei 28 °C für drei
bis vier Tage inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit wurde die entstandene Mischkolonie
mithilfe eines sterilen Mikrospatels von der Agarplatte abgenommen und in einem 1,5 mlReaktionsgefäß in 250 µl YEM-Medium resuspendiert. Von dieser Suspension wurden
103
Material und Methoden
verschiedene
Mengen
auf
PSY-Platten
ausgestrichen,
die
durch
entsprechende
Antibiotikakombinationen und -konzentrationen eine Selektion auf B. japonicum mit
erfolgreichen Konjugationsereignissen erlaubten. Hierbei erfolgte die Primärselektion über
Spc (200 µg/ml) bzw. Rif (100 µg/ml), um ein Wachstum des Donorstammes zu verhindern.
Die Sekundärselektion erfolgte gegen einen über das Plasmid eingebrachten Resistenzmarker.
Die hierbei eingesetzten Antibiotikakonzentrationen sind der Tabelle 9 (Kap. 8.8.15) zu
entnehmen.
8.8.11 Ligation verschiedener DNA-Fragmente
Für die Ligation von verschiedenen DNA-Fragmenten wurde die T4 DNA Polymerase von
Fermentas benutzt. Mengenverhältnisse wurden anhand der folgenden Formel berechnet und
eingesetzt:
Menge Vektor-DNA in ng • 5 • Vektorlänge in bp
Insertlänge in bp
_
¯
Menge Insert-DNA
in ng
Bei Ligationen von Fragmenten mit glatten Enden wurde dem Reaktionsansatz 5 % (f.c.) PEG
zugesetzt. Dies erhöht die Rate an Ligationsereignissen wesentlich (Pheiffer et al., 1983).
Die Ligationen wurden in einem Gesamtvolumen von 50 µl angesetzt und in der Regel ü. N.
in einem Wasserbad bei 16 °C inkubiert. Vor einer Transformation wurde das
Ligationsgemisch für 10 min. auf 65 °C erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren und dadurch
die Tranformationsrate zu erhöhen.
8.8.12 Phosphatasebehandlung restringierter DNA-Moleküle
War die Dephosphorilierung eines Vektors vor einer Ligation notwendig, so wurde hierfür
alkalische Shrimp-Phosphatase (SAP) der Firma USB verwendet. Diese besitzt gegenüber der
üblicherweise verwendeten Kälberdarmphosphatase (CIAP) den Vorteil, dass sie bei einer
Temperatur von 65 °C für 15 min. hitzeinaktivierbar ist. Eine Aufreinigung der
dephosphorilierten DNA kann also entfallen. Das Enzym wurde gemäß den Angaben des
Herstellers verwendet.
104
Material und Methoden
8.8.13 Polymerasekettenreaktion (PCR)
PCR-Reaktionen wurden, mit Ausnahme der Nachweis-PCRs für die E-Tag-Insertionen (vgl.
Kap. 5.1), mit Phusion-Polymerase der Firma Finnzymes durchgeführt. Dabei wurden die
Reaktionen
hinsichtlich Oligonukleotid-Anlagerungszeit
und -temperatur
auf die
Verwendung von GC-Puffer und DMSO optimiert. Soweit nicht explizit erwähnt wurde der
im Folgenden beschriebene Standardansatz für PCRs verwendet:
12,0 µl H2O bidest.
4,0 µl GC-Puffer
1,0 µl je Oligonukleotid (5 pmol / µl)
0,8 µl Template-DNA
0,6 µl DMSO (f.c. 3 % v/v)
0,4 µl dNTPs (10 mM)
0,2 µl Phusion-Polymerase
Alle PCR-Reaktionen wurden in einem Gerät des Typs "T Gradient" von Biometra
durchgeführt. Nach erfolgter Amplifikation erfolgte eine Kontrolle der Produkte durch
Gelelektrophorese. PCR-Produkte wurden bei 4 °C kurzfristig bzw. bei -20 °C über längere
Zeiträume gelagert.
8.8.14 Restriktionsanalyse von DNA-Molekülen
Zur Restriktionsanalyse von PCR-Amplifikaten und Plasmiden wurden Restriktionsendonukleasen der Firma Fermentas benutzt. Zu Beginn der Arbeit wurden zum Teil noch
vorhandene Restbestände an Restriktionsenzymen der Firma Amersham aufgebraucht.
Restriktionen wurden standardmäßig in einem Gesamtvolumen von 20 µl durchgeführt. Bei
Restriktionen mit mehreren Enzymen gleichzeitig wurde der Puffer nach den Empfehlungen
der Fermentas-Onlinehilfe (www.fermentas.com/doubledigest/index.html) verwendet.
Inkubationen bei 37 °C erfolgten in einem Brutschrank der Firma Binder, Inkubationen bei
30 °C wurden in einem Thermoschüttler der Firma Eppendorf durchgeführt. Die
Hitzeinaktivierung von Enzymen erfolgte ebenfalls in dem genannten Thermoschüttler oder in
einem Heizblock der Firma Wealtec.
105
Material und Methoden
8.8.15 Selektive Anzucht von Bakterien
Bei selektiver Anzucht von Bakterien wurden den entsprechenden Medien Antibiotika in den
folgenden Konzentrationen zugesetzt:
Antibiotikum
f.c. für E. coli
f.c. für B. japonicum
Ampicillin
100 µg / ml
- nicht verwendet -
Chloramphenicol
25 µg / ml
- nicht verwendet -
Gentamycin
10 µg / ml
200 µg / ml
Kanamycin
50 µg / ml
150 µg / ml
Rifampicin
- nicht verwendet -
100 µg / ml
Spectinomycin
- nicht verwendet -
200 µg / ml
Streptomycin
35 µg / ml
- nicht verwendet -
Tetracyclin
10 µg / ml
- nicht verwendet -
50 µg / ml + 25 µg / ml
- nicht verwendet -
Gentamycin + Spectinomycin
- nicht verwendet -
200 µg / ml + 200 µg / ml
Rifampicin + Kanamycin
- nicht verwendet -
100 µg / ml + 150 µg / ml
Rifampicin + Streptomycin
- nicht verwendet -
100 µg / ml + 150 µg / ml
Rifampicin + Gentamycin
- nicht verwendet -
100 µg / ml + 150 µg / ml
Ampicillin + Kanamycin
Tabelle 9: Liste der eingesetzten Antibiotika mit entsprechenden Konzentrationen
8.8.16 Sondenherstellung und Southern-Hybridisierung
a)
Herstellung einer DIG-markierten Sonde
Bei der Southern-Hybridisierung (Southern, 1975) wird ein bestimmter DNA-Bereich als
Fragment innerhalb einer mittels Elektrophorese aufgetrennten, durch Endonukleasebehandlung aufgespaltenen Gesamt-DNA durch Bindung einer markierten DNA- oder RNASonde nachgewiesen. Die Markierung der als Sonde eingesetzten Nukleinsäure kann dabei
auf verschiedene Arten erfolgen. Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten
Hybridisierungsexperimente wurde ein Kit der Firma Boehringer verwendet, welches die
Markierung der Sonde mittels Digoxigenin-11-dUTP ermöglicht. Hierzu wurde die als Sonde
zu verwendende Nukleinsäure mittels PCR amplifiziert. Als Matrize wurde DNA eingesetzt,
die den zu detektierenden Bereich umfasst. Die optimale Größe einer Sonde liegt dabei im
Bereich von etwa 300 bis 500 bp Länge. Dem PCR-Ansatz wurden 0,4 µl einer 1 mM
106
Material und Methoden
Digoxigenin-11-dUTP-Lösung zugesetzt. Gegenüber dem Standard-PCR-Ansatz (vgl. Kapitel
8.8.13) reduziert sich die Menge an eingesetztem H2O bidest auf 11,6 µl. Im Zuge der
Amplifikation wurde nun in einem gewissen Maße das markierte dUTP anstatt des
unmarkierten dTTP eingebaut. Eine erfolgreiche Markierung der Sonde ist nachprüfbar, da
das Amplifikationsprodukt durch den Einbau des markierten Nukleotids bei einer
gelelektrophoretischen Auftrennung größer erscheint, als ein entsprechendes Amplifikat mit
nicht markierten Nukleotiden. Zwanzig Mikroliter des Amplifikats werden in 20 ml
Hybridisierungspuffer verdünnt und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. Eine
ausreichend markierte Sonde kann nach Verwendung mindestens dreimal wieder verwendet
werden.
b)
Transferieren der DNA auf eine Nylonmembran
Die für die Hybridisierung benötigte DNA wurde als Gesamt-DNA mithilfe des
GenomiPhi™-Kits amplifiziert (vgl. Kapitel 8.8.1). Nach der Restriktion mit geeigneten
Endonukleasen wurde die DNA gelelektrophoretisch aufgetrennt. Um später eine
Größenbestimmung der Fragmente auf der Membran zu ermöglichen wurde bei der
Geldokumentation ein
Lineal
mit
abgebildet.
Dies
erlaubt
die
Korrelation der
Zentimetereinteilung mit dem DNA-Längenstandard. Anschließend wurde die DNA mittels
eines Vakuum-Blotters der Firma Pharmacia auf eine Nylonmembran des Herstellers Pall
transferiert. Dazu wurde die Membran auf die zuvor gewässerte, poröse Platte der Apperatur
aufgelegt. Mithilfe einer Folie wurden dann die Bereiche, die beim Blotten nicht vom
Agarosegel bedeckt wurden luftdicht abgedeckt. Auf die ausgesparte Fläche konnte dann das
Agarosegel aufgebracht werden. Die Denaturierung der DNA erfolgte durch Überschichten
des Gels mit Denaturierungspuffer bei angelegtem Unterdruck von -35 mbar über einen
Zeitraum von 20 Minuten. Danach wurde ein Neutralisierungsschritt durch Überschichten mit
Neutralisierungspuffer bei gleichem Unterdruck und ebenfalls für 20 min. durchgeführt. Der
eigentliche Transfer der DNA auf die Nylonmembran erfolgte bei -45 mbar über 20 min.,
während denen das Gel weiterhin mit Neutralisierungspuffer überschichtet blieb. Nach
erfolgtem Transfer wurde die DNA durch Bestrahlung mit UV-Licht (sog. cross linking) über
ein spezielles Programm in einem Gerät der Firma Stratagene auf der Membran fixiert.
107
Material und Methoden
c)
Zur
Durchführung der Hybridisierungsreaktion
Vorbereitung
der
Hybridisierung
wurde
die
Membran
in
einer
speziellen
Hybridisierungsröhre mit etwa 20 ml Hybridisierungspuffer bei 65°C in einem Rollinkubator
für 30 Minuten inkubiert. Nach dieser Präinkubation wurde der Puffer verworfen und die wie
im Abschnitt a) beschrieben vorbereitete Sonde zugegeben. Die weitere Inkubation erfolgte
ebenfalls bei 65°C über Nacht.
Am nächsten Morgen wurde die Sonde abgenommen (Lagerung bei -20°C) und die Membran
für zweimal fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Waschpuffer 1 gewaschen, gefolgt von
zwei fünfzehnminütigen Waschschritten in Waschpuffer 2. Eine Aufbewahrung der Membran
ist in Waschpuffer 2 für einige Zeit möglich. Zum Abschluss der Waschreihe erfolgte ein
Waschschritt in Waschpuffer 3 für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Hierfür kann anstelle
des Waschpuffers 3 auch reiner Maleinsäurepuffer verwendet werden.
Die Membran wurde anschließend ebenfalls bei Raumtemperatur für 30 Minuten mit 20 ml
Blockingpuffer in einem Roller inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 2 µl eines
Antikörperkonjungats, welches gegen die Digoxigeninmarkierung des dUTPs gerichtet ist.
Die Inkubation mit dem Antikörper erfolgte für weitere 30 Minuten. Danach wurde die
Membran weitere zwei Mal für je 15 Minuten mit Maleinsäurepuffer und fünf Minuten mit
Detektionspuffer gewaschen.
d)
Nachweisreaktion mittels Immunopräzipitation
Sofort nach Abschluss der Hybridisierung wurde die Membran mit 20 ml Färbelösung in
Plastikfolie eingeschweißt und im Dunkeln für mindestens zwei Stunden inkubiert. Die an
den Antikörper gekoppelte alkalische Phosphatase katalysierte in dieser Zeit die Umsetzung
des in der Färbelösung enthaltenen X-Phosphats zu einem Keton. Durch eine Dimerisierung
wurde im Folgenden H+ freigesetzt, welches das ebenfalls in der Färbelösung enthaltene NBT
reduzierte. Hierduch fiel ein Farbstoffpräzipitat aus, welches die unmittelbare Umgebung der
Antikörpermoleküle dunkelviolett färbte. Zum Beenden der Färbereaktion wurde die
Membran mit reichlich H2O bidest gewaschen und dann in 1  TE-Puffer bei 4°C gelagert.
108
Material und Methoden
8.8.17 Transformation von E. coli
a)
Transformation chemisch kompetenter Zellen
Für die Transformation von chemokompetenten Zellen wurden diese zunächst auf Eis
aufgetaut. Zu je 50 µl kompetenter Zellen wurden dann 10 µl eines hitzeinaktivierten
Ligationsansatzes pipettiert und vorsichtig durchmischt. Die Ansätze wurden für 30 min. auf
Eis inkubiert, anschließend erfolgte ein Hitzeschock bei 42 °C für 90 sec. im Thermoschüttler
(Eppendorf) oder in einem entsprechend temperierten Wasserbad. Nach Zugabe von 800 µl
dYT- oder LBG-Medium wurden die Zellen zur Regeneration für 1 - 2 h bei 28 °C bzw.
37 °C (vgl. Kap. 8.8.18) im Roller inkubiert. Anschließend wurde für 1 min. bei 25.000  g
zentrifugiert, der Überstand abgegossen und das Pellet im Rücklauf resuspendiert. Das
Ausplattieren erfolgte auf PA-Agarplatten,
denen ggf.
Antibiotika
in geeigneter
Konzentration (vgl. Kap. 8.8.15) zugesetzt waren.
b)
Transformation elektrokompetenter Zellen
Die Transformation elektrokompetenter Zellen erfolgte in einem Elektroporationsgerät der
Firma Bio-Rad mit 2 mm-Elektroporationsküvetten der Firma Eurogentec. Die Einstellungen
für den Elektroschock waren 2,4 Volt bei einem Widerstand von 200 Ohm und einer
Kapazität von 25 Mikrofarad. Als Ausschlußgrenze wurde eine Zeitkonstante von weniger als
3,5 msec. angesetzt. Die Zellen wurden zunächst auf Eis aufgetaut, dann mit 2 µl eines hitzeinaktivierten Ligationsansatzes gemischt und in eine, auf Eis vorgekühlte, Elektroporationsküvette überführt. Es folgte der Strompuls mit den oben angegebenen Bedingungen, danach
wurden dem Ansatz sofort 800 µl auf 28 °C bzw. 37 °C (vgl. Kap. 8.8.18) vorgewärmtes
SOC-Medium zugesetzt und dieser dann in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Die
Regenerationszeit betrug mindestens eine Stunde bei der geeigneten Wachstumstemperatur
(vgl. Kap. 8.8.18).
Nach der Regeneration wurden 100 µl des Ansatzes direkt auf geeigneten PA-Agarplatten
ausgestrichen. Der Rest des Ansatzes wurde durch Zentrifugation für 1 min. bei 25.000  g
peletiert, der Überstand abgegossen und das Pellet im Rücklauf resuspendiert. Das
Ausplattieren erfolgte auch hier auf PA-Agarplatten, denen ggf. Antibiotika in geeigneter
Konzentration (vgl. Kap. 8.8.15) zugesetzt waren.
109
Material und Methoden
8.8.18 Wachstumsbedingungen
Die Anzucht von B. japonicum erfolgte grundsätzlich bei 28 °C. Als Standardmedium wurde
PSY verwendet, dem als Festmedium 1,5 % (w/v) Agar-Agar zugesetzt waren. Falls nötig
wurden Antibiotika gemäß Tabelle 9 zugesetzt. Als Medium für Konjugationsexperimente
wurde 20E verwendet. Auch in diesem Fall wurde das Festmedium durch Zusatz von 1,5 %
(w/v) Agar-Agar hergestellt. Flüssigkulturen wurden in einem Rollinkubator für 4 - 5 Tage
angezogen.
Die Anzucht von E. coli erfolgte bei 37 °C in einem Brutschrank der Firma Binder. Als
Standardmedium wurde dYT verwendet, dem bei Bedarf Agar-Agar (1,5 % w/v) sowie
Antibiotika (vgl. Tabelle 9) zugesetzt wurde. Die Inkubation von Flüssigkulturen erfolgte
ebenfalls in einem Rollinkubator, in der Regel als ü. N.-Kultur.
E. coli-Stämme, die mit dem Plasmid pFDX600 und den davon abgeleiteten Derivaten (vgl.
Tabelle 2) transformiert waren, wurden wegen des thermosensitiven Replikons des Vektors
bei einer Temperatur von 28 °C angezogen. Hierdurch wurden z. T. verlängerte
Anzuchtzeiten (bis zu 1,5 Tage) und Regenerationszeiten bei Transformationen (bis zu 6 h)
verwendet, als dies für unmodifizierte E. coli-Stämme der Fall war. Als Standardmedium
wurde auch hier dYT verwendet, wie für E. coli allgemein beschrieben.
8.9
Verwendete Computerprogramme und Onlinetools
8.9.1 Computerprogramme
Zur in silico-Bearbeitung von DNA-Sequenzen wurde das Programm "DNA Strider" für
MacOS10 verwendet. Dieses "open source"-Programm ermöglicht auch die Modifizierung
der Sequenzen zur Planung von Klonierungsschritten, die Erstellung von Restriktionskarten,
sowie Alignments von maximal zwei Sequenzen.
Die Erfassung der Bilddaten zur Geldokumentation erfolgte mit der zur entsprechenden
Anlage gehörigen Software der Firma INTAS. Die Einbindung von Gelbildern in
Abbildungen dieser Arbeit erfolgte mit "Adobe Photoshop 7.0" und "MS PowerPoint 2000".
110
Material und Methoden
Zur Erfassung und Auswertung von DNA-Sequenzierungen wurde die Software "e-Seq V3.0"
von LI-COR verwendet.
8.9.2 Onlinetools und Datenbanken
Als
Datenbanken
für
Genom-
und
Proteinsequenzen
wurden
"RhizoBase"
(http://bacteria.kazusa.or.jp/rhizobase/) für B. japonicum und S. meliloti, sowie "EcoCYC"
(http://ecocyc.org/) für E. coli K12 verwendet. Beide Datenbanken erlauben die
Homologiesuche in Genomen anderer Organismen und bieten direkte Verlinkungen auf
externe Datenbankeinträge, wie z. B. die Proteindatenbank "SwissProt" (http://www.
expasy.ch/sprot/). Als Genom- und Proteindatenbank für M. truncatula und G. max wurde
"PlantGDB" (http://www.plantgdb.org/) verwendet.
Sequenzdaten für Vektoren wurden zum Teil über die Internetangebote der entsprechenden
Firmen bezogen. Zusätzlich wurde auf die Einträge der Datenbanken "VectorDB"
(http://seq.yeastgenome.org/vectordb/) und "NCBI nucleotide" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
sites/entrez?db=nucleotide) zurückgegriffen.
Die
Datenbanken
des
"National
Center
for
Biotechnology
Information"
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) wurden darüber hinaus auch für die Literatursuche (PubMed)
und den Datenbankabgleich von DNA- und Proteinsequenzen (diverse BLAST-Algorithmen;
Altschul et al., 1997) genutzt.
Die in dieser Arbeit gezeigten Alignments von DNA- und Proteinsequenzen wurden mit Hilfe
des Onlineprogramms "ClustalW2" (Larkin et al., 2007) auf der Internetseite des EMBL-EBI
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) mit den dort gegebenen Kriterien erstellt.
111
Puffer und Lösungen
9.
Medien, Puffer und Lösungen
9.1
Medien
20E-Medium :
0,182 % (w/v)
0,2 % (w/v)
0,46 % (w/v)
Mannit
Hefeextrakt
Glycerin
10,0 ml
Lösung 1
10,0 ml
Lösung 2
10,0 ml
Lösung 3
10,0 ml
Lösung 4
10,0 ml
Lösung 5
1,0 ml
Lösung 6
pH auf 6,8 einstellen
dYT-Medium:
1,6 % (w/v)
Pepton, tryptisch verdaut
1,0 % (w/v)
Hefeextrakt
0,5 % (w/v)
Natriumchlorid
auf pH 7,4 einstellen mit NaOH
dYT-Glycerin-Medium:
1,6 % (w/v)
Pepton, tryptisch verdaut
1,0 % (w/v)
Hefeextrakt
0,5 % (w/v)
Natriumchlorid
80,0 % (v/v)
87% Glycerin (f.c. 69,6%)
auf pH 7,4 einstellen mit NaOH
112
Puffer und Lösungen
LB-Medium:
1,0 % (w/v)
Pepton, tryptisch verdaut
1,0 % (w/v)
Natriumchlorid
0,5 % (w/v)
Hefeextrakt
auf pH 7,5 einstellen mit NaOH
LBG-Medium:
1,0 % (w/v)
Pepton, tryptisch verdaut
0,5 % (w/v)
Hefeextrakt
0,5 % (w/v)
Natriumchlorid
0,2 % (w/v)
Glucose
auf pH 7,4 einstellen mit NaOH
M9-Minimalmedium:
0,6 % (w/v)
Di-Natrium-Hydrogenphosphat
0,3 % (w/v)
Kalium-Di-Hydrogenphosphat
0,05 % (w/v)
0,1 % (w/v)
Natriumchlorid
Ammoniumchlorid
auf pH 7,4 einstellen und autoklavieren. Nach dem
Autoklavieren folgende weitere Bestandteile zusetzen:
0,1 ml
1 M Calcium-Di-chloridlösung
1,0 ml
1 M Magnesiumsulfatlösung
10,0 ml
20 % (w/v) Glucoselösung, sterilfiltriert
113
Puffer und Lösungen
M63-Minimalmedium:
1,36% (w/v) Kalium-Di-Hydrogenphosphat
0,2 % (w/v) Di-Ammoniumsulfat
0,0005 ‰ (w/v) Eisensulfat-Hepta-Hydrat ( 0,5 mg/l)
auf pH 7,0 einstellen mit KOH, autoklavieren. Nach dem
Autoklavieren folgende weitere Bestandteile zusetzen:
1,0 ml
10,0 ml
1 M Magnesiumsulfat-Hepta-Hydrat
20 % (w/v) Glucoselösung, sterilfiltriert
PA-Medium:
1,75 % (w/v)
Oxoid antibiotic medium No.3 (assay broth)
PSY-Medium:
0,3 % (w/v)
Pepton, tryptisch verdaut
0,1 % (w/v)
Hefeextrakt
0,03 % (w/v)
Kalium-Di-Hydrogenphosphat
0,03 % (w/v)
Di-Natrium-Hydrogenphosphat
0,05 ‰ (w/v) Calcium-Di-Chlorid ( 50,0 mg/l)
auf pH 6,8 einstellen und autoklavieren. Nach dem
Autoklavieren folgende weitere Bestandteile zusetzen:
1,0 ml
Spurenelemente-Stammlösung
1,0 ml
Biotinstammlösung
114
Puffer und Lösungen
PSY-Sucrose-Medium:
0,3 % (w/v)
Pepton, tryptisch verdaut
0,1 % (w/v)
Hefeextrakt
0,03 % (w/v)
Kalium-Di-Hydrogenphosphat
0,03 % (w/v)
Di-Natrium-Hydrogenphosphat
0,05 ‰ (w/v) Calcium-Di-Chlorid ( 50,0 mg/l)
in 898 ml H2O bidest. lösen, auf pH 6,8 einstellen und
autoklavieren. Nach dem Autoklavieren folgende weitere
Bestandteile zusetzen:
SOC-Medium:
1,0 ml
Spurenelemente-Stammlösung
1,0 ml
Biotinstammlösung
100,0 ml
50 % (w/v) Saccharoselösung, sterilfiltriert
2,0 % (w/v)
Pepton, tryptisch verdaut
0,5 % (w/v)
Hefeextrakt
0,05 % (w/v)
10,0 ml
5,0 ml
20,0 ml
Natriumchlorid
0,25 M Kaliumchloridlösung
2,0 M Magnesium-Di-Chloridlösung
1,0 M Glucoselösung, sterilfiltriert
pH 7,0 einstellen mit NaOH
YEM-Medium:
1,46 % (w/v)
50mM MOPS
1,0 % (w/v)
Manitol
0,04 % (w/v)
Hefeextrakt
115
Puffer und Lösungen
9.2
Puffer
Blockingpuffer:
1:10
(für Southern-Blot)
verdünnte Blocking-Stocklösung
in Maleinsäurepuffer
Denaturierungspuffer:
1,5 M
NaCl
(für Southern-Blot)
0,5 M
NaOH
Detektionspuffer:
0,1 M
Tris-HCl
(für Southern-Blot)
0,1 M
NaCl
0,01 M
MgCl2
auf pH 9,5 einstellen mit NaOH
DNA-Auftragspuffer:
125 mM
EDTA pH 8,0
44,6 % (v/v) Glycerin
0,125 % (w/v) Bromphenolblau
Hybridisierungspuffer:
5
SSC
(für Southern-Blot)
1%
(w/v) Blockingreagenz
0,1 %
(w/v) N-Laurylsarcosin
0,02 % (w/v) SDS
Maleinsäurepuffer:
0,1 M
Maleinsäure
(für Southern-Blot)
0,15 M
NaCl
0,01 M
MgCl2
auf pH 7,5 einstellen mit NaOH
116
Puffer und Lösungen
Neutralisierungspuffer:
1M
Ammoniumacetat
TAE-Puffer:
40 mM
TRIS-Eisessig (pH 7,8)
(1)
10 mM
Natriumacetat
1 mM
EDTA
(für Southern-Blot)
auf pH 7,8 einstellen mit Eisessig
TBE-Puffer:
50 mM
TRIS
(1)
2,5 mM
Na2EDTA
50 mM
Borat
TBE-Puffer (KBplus):
1 Pack Fertigmischung/l, gemäß Herstellerangabe.
(10)
1 TBE enthält f.c.: 0,089 M TRIS Base
0,089 M Borat
0,002 M Na2EDTA
Waschpuffer 1:
2
SSC
(für Southern-Blot)
0,1 %
SDS
Waschpuffer 2:
0,1
SSC
(für Southern-Blot)
0,1%
SDS
Waschpuffer 3:
0,3 % (w/v)
Tween 20
(für Southern-Blot)
in Maleinsäurepuffer
117
Puffer und Lösungen
9.3
Lösungen
Biotin-Stammlösung:
0,1 g/ml
Biotin
(1000)
Blocking-Stocklsg.:
10,0 % (w/v) Blockingreagenz
(10)
In Maleinsäurepuffer unter Erhitzen lösen.
Färbelösung:
45 µl
NBT-Lösung (75 mg/ml) in DMF
(für Southern-Blot)
35 µl
X-Phosphatlösung (50 mg/ml) in DMF
In 10 ml Detektionspuffer aufnehmen und frisch verwenden.
Spurenelemente-Lsg.:
1,0 g/l
H3BO3
(nach Werner et al.,
0,2 g/l
ZnSO4  7 H2O
0,05 g/l
CuSO4  5 H2O
0,05 g/l
MnCl2  4 H2O
0,01 g/l
Na2MoO4  2 H2O
1975)
0,1 g/l
Lösung 1 für 20E:
FeCl3
6,8 g/l
KH2PO4
8,7 g/l
K2HPO4
Lösung 2 für 20E:
37,0 g/l
MgSO4  7 H2O
Lösung 3 für 20E:
7,3 g/l
CaCl2  2 H2O
118
Puffer und Lösungen
Lösung 4 für 20E:
50,6 g/l
KNO3
Lösung 5 für 20E:
0,48 g/l
NaMoO4  2 H2O
Lösung 6 für 20E:
6,95 g/l
FeSO4  7 H2O
9,30 g/l
Triplex III
Alle Lösungen nach dem Ansetzen autoklavieren und bei 4°C lagern.
119
Literaturverzeichnis
10.
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130
Zusammenfassung
11.
Zusammenfassung
Aus Vorarbeiten mit ausgesuchten rekombinanten Klonen einer E-Tag Expressionsgenfusionsbank gingen mehrere Genunterbrechungsmutanten von B. japonicum hervor, die einen
auffälligen symbiotischen Phänotyp aufwiesen. In drei voneinander verschiedenen
methodischen Ansätzen wurde die Bedeutung von Genen für extrazytoplasmatische Proteine
aus B. japonicum bei der Ausbildung einer effektiven Symbiose mit der Sojabohne (Glycine
max) untersucht. Zum einen wurde durch ein spezifisches DNA-Amplifikationsverfahren der
Nachweis erbracht, dass die untersuchten Stämme jeweils tatsächlich die vermuteten
Manipulationen der betroffenen Genregionen aufwiesen. Zum zweiten wurde in dem
Sonderfall der nex18-Genregion, die im B. japonicum Genom zwei Mal in identischer Form –
jedoch an verschiedenen Positionen – vorliegt, eine Mutationsstrategie mit dem Ziel
entwickelt, Einzel- und Doppelmutanten zu konstruieren. Das im Wurzelknöllchen (nodule)
exprimierte Gen nex18 wurde zunächst in S. meliloti identifiziert und als bedeutsam für eine
effektive Symbiose beschrieben. Die flankierenden Bereiche der entsprechenden Genregionen
aus B. japonicum wurden amplifiziert und mit zentralen Resistenzkassetten (SmR bzw. KmR)
ausgestattet. Durch zweifache homologe Rekombination wurde der intakte ORF bll5191
durch die Streptomycin-Resistenzkassette ersetzt. Das zweite Gen (blr2474) konnte bislang
nicht durch eine entsprechend vorbereitete KmR-Kassette eliminiert werden.
Die Klone der E-Tag Expressionsgenbank kodieren in der Regel für Proteine mit
N-terminalem Signalpeptid. Da in B. japonicum drei verschiedene Signalpeptidasegene
existieren
und
Mutationen
in
diesen
Genen
sich
unterschiedlich
auf
die
Symbioseeigenschaften auswirken, sollte die Frage untersucht werden, ob und wie eine
Substratspezifität zwischen den Signalpeptidasen und den noch zu prozessierenden
Vorläuferproteinen ausgeprägt ist. Um einen möglichst großen Teil der E-TagFusionsproteine aus B. japonicum in E. coli testen zu können, sollten genetisch stabile und
definierte Stammderivate konstruiert werden, in denen jeweils eine der drei Signalpeptidasen
aus B. japonicum die singuläre Leaderpetidase von E. coli ersetzt. Obwohl durch spezifische
PCR-Technik und DNA-Sequenzierung gezeigt werden konnte, dass der Genaustausch wie
erwünscht erfolgt ist, beweisen DNA-Hybridisierungen und PCR-Amplifikate, dass die
Stammkonstrukte weiterhin eine intakte lepB Kopie beinhalten. Ob hier eine vollständige oder
partielle Duplikation des Bakterienchromosoms vorliegt, bleibt zur Klärung durch
weiterführende Experimente offen.
131
Danksagung
12.
Danksagung
Ich danke Herrn Professor Dr. Uwe Maier für die Bereitschaft, mich als Doktorand
anzunehmen und sich als Erstkorrektor meiner Dissertation zur Verfügung zu stellen. Mein
besonderer Dank gilt auch Herrn Dr. Peter Müller, der mir als Betreuer im Laufe der letzten
vier Jahre zur Seite stand. Die vielen Gespräche während dieser Zeit waren stets sachlich und
konstruktiv. Herr Dr. Müller war immer darum bemüht, auftretende Probleme zu lösen und
mir ein möglichst produktives Arbeitsumfeld zu schaffen.
Desweiteren möchte ich Herrn Professor Dr. Michael Bölker für die Erstellung des
Zweitgutachtens meiner Arbeit, sowie Frau Professor Dr. Renate Renkawitz-Pohl und Herrn
Professor Dr. Erhard Mörschel als Mitglieder der Prüfungskommision danken.
Ich danke der DFG für die Finanzierung dieser Arbeit im Rahmen des SFB395, Teilprojekt
A4. Zu außerordentlichem Dank verpflichtet bin ich in diesem Zusammenhang Herrn
Professor Dr. Dietrich Werner, der mir die Weiterführung meiner Arbeit trotz einer
Finanzierungslücke nach dem Ende der DFG-Förderung durch Bereitstellung eigener
Drittmittel ermöglichte.
Heidemarie Thierfelder, Lucette Claudet, Cornelia Ellendt und Torsten Bauschke danke ich
für eine angenehme und freundliche Arbeitsatmosphäre im Labor, anregende und
aufmunternde Gespräche und Hilfe, wenn sie nötig war.
Katja Geßner danke ich für das Korrekturlesen meiner Arbeit und ihre Hilfe, wenn ich drohte
an MS Word oder Powerpoint zu verzweifeln.
Neben den genannten Personen aus meinem beruflichen Umfeld der vergangenen vier Jahre
möchte ich aber auch jenen danken, die mich im privaten Umfeld während dieser Zeit nie
alleine gelassen haben. Allen vorweg danke ich meiner Familie, auf deren Unterstützung ich
mich jederzeit verlassen konnte. Troll, Kurt und den Mitgliedern der "Montags-" und
"Mittwochsrunden" danke ich dafür, dass sie mich immer wieder daran erinnerten, dass es ein
Leben außerhalb der Uni gibt. Aber auch viele weitere Freunde, die hier namentlich nicht alle
erwähnt werden können, haben mir die Kraft, den Mut und die Ausgeglichenheit gegeben bis
zum Ende durchzuhalten. Ich danke ihnen allen für offene Ohren, Geduld und sehr viel
Rücksichtnahme.
132
Curriculum Vitae
13.
Curriculum Vitae
Patrick Nilles
Geboren am: 09.10.1976
In:
Koblenz/Rhein
Schulische Ausbildung
Juli 1983 – Juni 1987
Joseph-Kehrein Grundschule, Montabaur
Aug. 1987 – Juli 1997
Staatl. Mons-Tabor-Gymnasium, Montabaur
Abgeschlossen mit der allgem. Hochschulreife
Wehrdienst
Nov. 1997 – Aug. 1998
Stabs-Fernmelderegiment 310,
Heeresführungskommando, Falckenstein-Kaserne
Koblenz/Rhein
Hochschulausbildung
Okt. 1998 – Sept. 2004
Studium der Biologie an der Philipps-Universität
Marburg, Abschluss als Diplom-Biologe.
Studienschwerpunkte:
Zellbiologie
Molekulargenetik
Virologie
Titel der Diplomarbeit:
„Untersuchungen zur Rolle der Proteinkinase
Don3 bei der Zellteilung von Ustilago maydis“
seit Jan. 2005 – Dez. 2008
Doktorand der Biologie an der Philipps-Universität
Marburg, AG Prof. Dr. Maier
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Erklärung
14.
Erklärung
Ich versichere, dass ich meine Dissertation "Experimentelle Ansätze zur Untersuchung
spezifischer Prozessierung extrazytoplasmatischer Proteine durch drei allele Signalpeptidasen
aus Bradyrhizobium japonicum" selbstständig, ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und mich
dabei keiner anderen als der von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfen bedient
habe.
Die Dissertation wurde in der jetzigen oder einer ähnlichen Form noch bei keiner anderen
Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Prüfungszwecken gedient.
Marburg, den 16.12.2008
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(Ort/Datum)
(Patrick Nilles)
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