Nachweis und Bestimmung eines Hyaluronat-Protein
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414 H. GREILING, W. MOHR UND G. BENEKE Nachweis und Bestimmung eines Hyaluronat-Protein-Komplexes in der Peritonealflüssigkeit von Ratten nach Injektion von Phytohämagglutinin Occurence and Estimation of a Hyaluronate Protein Complex in the Peritoneal Fluid of Rats after Injection of Phytohemagglutinin H . G R E I L I N G , W . M O H R u n d G . BENEKE Klinisch-Chemisches Institut der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen und Abteilung Pathologie II der Universität U l m (Z. Naturforsch. 27 b, 414—419 [1972] ; eingegangen am 20. Dezember 1971) In the peritoneal fluid of rats hyaluronate is produced after intraperitoneal injection of phytohemagglutinin. The hyaluronate concentration was quantitated spectrophotometrically after enzymatic degradation by hyaluronatlyase and a maximum amount of 90 mg% hyaluronate was found after intraperitoneal injection. T h e production of hyaluronate after phytohemagglutinin injection is dependent on the time and concentration of the phytohemagglutinin. M a x i m u m hyaluronate synthesis is about 48 h after phytohemagglutinin, after this time the hyaluronate concentration is decreased. A f t e r phytohemagglutinin stimulation we isolated a hyaluronate protein complex from the peritoneal fluid by cetylpyridinium chloride precipitation followed by chromatography on Biogel P-150. T h e dominating amino acids were aspartic acid and glutamic acid. MOHR und M i t a r b b . 1 - 3 beschrieben nach der intraperitonealen Injektion von Phytohämagglutinin bei der Ratte das Auftreten von Siegelringzellen im Mesothelzellverband und in der Peritonealflüssigkeit. In den Siegelringzellen der Peritonealflüssigkeit konnte Alcian-blau anfärbbares Material nachgewiesen werden 1 . Die Peritonealflüssigkeit war viskos und enthielt Hyaluronsäure 2 . Das Ziel der vorliegenden Untersuchungen war die Aufklärung der chemischen Zusammensetzung und Struktur des in der Peritonealflüssigkeit auftretenden Glykosaminoglykans. Material und Methode Die Untersuchungen wurden an insgesamt 55 männlichen SIV-50-Ratten (S. Ivanovas, Kißlegg/Allgäu) mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 70 g durchgeführt. Drei Kontrolltiere blieben unbehandelt, 12 Versuchstiere erhielten intraperitoneal je 1,0 ml einer 1-proz. Rinderserumalbuminlösung (Behringwerke AG, Marburg/Lahn, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung) injiziert. Durch die Applikation der Rinderserumalbuminlösung, die zum Auftreten von neutrophilen Granulozyten in der Peritonealflüssigkeit führt, sollte ausgeschlossen werden, daß eine entzündliche Reaktion den alleinigen Stimulus zur Hyaluronsäureproduktion darstellt. 40 Versuchstieren wurde intraperitoneal Phytohämagglutinin verabreicht (PHA-P, Sonderdruckanforderungen an Priv.-Doz. Dr. H. GREILING, Klinisch-Chem. Zentrallaboratorium d. M e d . Fakultät, D-5100 Aachen, Goethestr. 2 7 - 2 9 . Difco Laboratories, Detroit; der Inhalt einer Handelsflasche, entsprechend 50 mg PHA-P Trockensubstanz, wurde mit 5,0 ml Aqua dest. rehydriert). Zu den gewählten Versuchszeiten (vgl. Tabn. 1 u. 2) wurden die Tiere in Äthernarkose dekapitiert und Peritoneal- und Pleuroflüssigkeit mit einer sterilen Pasteurpipette entnommen. Bestimmung der Hyaluronsäurekonzentration in Abhängigkeit von der Zeit nach der Phytohämagglutinin jektion und von der applizierten PhytohämagglutininM enge a) Die unbehandelten Kontrolltiere wurden zu Versuchsbeginn getötet. Die Versuchstiere die i.p. Rinderserumalbumin-Lösung erhalten hatten, wurden 24 und 48 Stdn. nach der Injektion getötet. Zur Ermittlung der Abhängigkeit der Hyaluronsäure-Konzentration in der Peritonealflüssigkeit von der Zeit nach der Injektion erhielten 14 Versuchstiere jeweils 1,0 ml PHA-P. Diese Tiere wurden nach 24, 48, 72 und 120 Stdn. getötet. Die Abhängigkeit der Hyaluronsäurekonzentration in der Peritoneal- und Pleuraflüssigkeit von der Menge des applizierten PHA-P wurde an 10 Tieren untersucht. Die Tiere erhielten intraperitoneal 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 und 10,0 mg PHA-P injiziert und wurden nach 48 Stdn. getötet. 21 weitere Tiere erhielten jeweils 10 mg PHA-P intraperitoneal injiziert. Die nach 48 Stdn. gewonnene Peritoneal- und Pleuraflüssigkeit wurde gepoolt und zur chemischen Charakterisierung der Hyaluronsäure verwandt. b) Quantitative Bestimmung der Hyaluronsäure: Die enzymatische Bestimmung der Hyaluronsäure wurde mit Hyaluronatlyase (E.C. 4.2.99.1) aus Streptokokken durchgeführt, die Hyaluronsäure quantitativ in ein un- Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschung in Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht: Creative Commons Namensnennung-Keine Bearbeitung 3.0 Deutschland Lizenz. This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution-NoDerivs 3.0 Germany License. Zum 01.01.2015 ist eine Anpassung der Lizenzbedingungen (Entfall der Creative Commons Lizenzbedingung „Keine Bearbeitung“) beabsichtigt, um eine Nachnutzung auch im Rahmen zukünftiger wissenschaftlicher Nutzungsformen zu ermöglichen. On 01.01.2015 it is planned to change the License Conditions (the removal of the Creative Commons License condition “no derivative works”). This is to allow reuse in the area of future scientific usage. HYALURONAT-PROTEIN-KOMPLEXE IN DER PERITONEALFLÜSSIGKEIT VON RATTEN gesättigtes Disaccharid abbaut. Dabei werden iV-Acetylglucosamin-Endgruppen freigesetzt. Mit der kolorimetrisdien Methode nadi MORGAN-ELSON wird die Bestimmung photometrisch bei 585 nm durchgeführt 4 . Die spektrophotometrische Methode zur Bestimmung der Hyaluronsäure konnte wegsn störender UV-absorbierender Substanzen in der Peritonealflüssigkeit nicht durchgeführt werden. Isolierung des Hyaluronat-Protein-Komplexes Peritonealflüssigkeit aus Der Hyaluronat-Protein-Komplex wurde nach folgenden zwei Verfahren präparativ isoliert: a) Die Peritonealflüssigkeit wurde bei 2000 g (Temperatur 0 °C) abzentrifugiert und mit dem 3-fachen Volumen Natriumacetat-gesättigten Alkohol gefällt. Der mit Äthanol und Äther gewaschene Niederschlag wurde getrocknet und anschließend in 6 ml H 2 0 gelöst. Danach erfolgte 24 Stdn. bei 50 — 55 °C eine Proteolyse des Proteoglykans mit Papain (Verdauungspuffer: 0,005 M Cysteinhydrochlorid, 0,005 M Titriplex III, 0,1 N Natriumacetat pH 6 ) . Die Lösung wurde nach der Proteolyse mit HCl auf einen pH von 1,3 eingestellt und die ausgefallenen Nukleotide bei 17000 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit dem 6-fachen Volumen Natriumacetat-gesättigten Alkohol versetzt und der Niederschlag nach 12-stdg. Stehen bei 0 bis 4 °C bei 17000 g abzentrifugiert und zweimal mit Äthanol gewaschen und getrocknet (Ausbeute: aus 14 ml Peritonealexsudat 61 m g ) . Anschließend erfolgte eine Repräzipitation durch Auflösen des Niederschlages in 16 ml H 2 0 , abzentrifugieren bei 20000 g, wiederum Fällung mit der 3-fachen Menge Natriumacetat-gesättigten Alkohols und 3-faches Waschen mit Äthanol (Ausbeute: 33 m g ) . Die Hyaluronsäure wurde in 15 ml H 2 0 gelöst und an einer Biogel-P-150-Säule (H = 57 cm, D = 1,4 cm) chromatographiert. Die Elution erfolgte mit 10-proz. Äthanol, der Nachweis der Hyaluronsäure enthaltenden Fraktionen wurde über die Glucuronsäurebestimmung mit der Carbazolreaktion durchgeführt. b) Da der Hyaluronat-Protein-Komplex mit Cetylpyridiniumchlorid fällbar ist, wurde für die zweite Darstellung 10 ml des vorher hochtourig (20000 g) abzentrifugierten Peritoneal-Exsudates mit 1,5 ml einer 5-proz. Cetylpyridiniumchloridlösung (CPC) versetzt. Dabei kommt es ebenfalls, wie bei der Hyaluronsäure aus Nabelschnur, zu einem fädigen CPC-Hyaluronatniederschlag. Nach Waschen des Niederschlags mit 5-proz. CPC-Lösung und Abdekantieren der CPC-Lösung wurde der Niederschlag mit 8 ml Natriumchloridgesättigtem Alkohol versetzt und 48 Stdn. stehen gelassen. Nach erneutem Abzentrifugieren und Dekantieren wurde der Niederschlag noch zweimal mit Äthanol und Äther gewaschen. Die getrocknete Substanz wurde in 10 ml 0,05 N Natriumacetat gequollen (8 Stdn.), dann homogenisiert und bei 20000 g zentrifugiert. Die klare Lösung wurde anschließend an Biogel P-150 chromatographiert, wobei als Elutionsmittel 0,05 N Natriumacetat verwandt wurde. Das eluierte Hyaluronat 415 erschien in den gleichen Fraktionen wie gereinigte Hyaluronsäure aus Nabelschnur. Die mit der Carbazolreaktion identifizierten Röhrcheninhalte wurden gepoolt, eingeengt und mit dem 3-fachen Volumen an Natriumacetat-gesättigten Alkohol versetzt. Nachweis des ungesättigten Disaccharids aus dem isolierten Hyaluronat-Protein-Komplex nach Hyaluronatlyasebehandlung Die nach den Verfahren a und b isolierten Hyaluronat-Protein-Komplexe wurden in 2,5 ml Phosphatpuffer pH 6,4 gelöst. Es wurde vom Ungelösten abzentrifugiert und nach Zugabe von 0,5 ml 0,15 M NaCl-Lösung 0,1 ml Hyaluronatlyase aus Streptokokken zugegeben. Nach 5-stdg. Inkubation wurde der Ansatz mit 0,5 ml (ca. 20% w/v) Perchlorsäure versetzt und das UV-Spektrum mit dem UV-Spektralphotometer DK 2 bestimmt 4 . Das durch Hyaluronatlyase aus Hyaluronsäure entstehende 4,5-ungesättigte Uronid konnte ebenfalls aus einem Mikroansatz papierchromatographisch nach Anfärbung mit dem Morgan-Elson-Reagenz und durch seine UV-Absorption nachgewiesen werden 5 und wurde mit reinem Disaccharid, das aus Nabelschnur-Hyaluronsäure nach Hyaluronatlyasebehandlung gewonnen wurde, verglichen. Sedimentationsversuche (Phywe U 60 H) der analytischen Ultrazentrifuge Die Peritonealflüssigkeit wurde für diese Versuche unverdünnt, oder mit physiologischer Kochsalzlösung 1 : 2 verdünnt, verwendet. Die Sedimentation wurde im 50 000-UPM-Rotor bei 20 °C durchgeführt. Bausteinanalysen Komplexes des isolierten Hyaluronat-Protein- Die quantitative Bestimmung der Hexosamine und der Aminosäuren wurde mit einem Aminosäurenanalysator (Technicon) durchgeführt. Zur Hydrolyse wurden etwa 5 mg des Hyaluronat-Protein-Komplexes in 2,5 ml 3 N HCl gelöst. Die Substanz wurde in Anlehnung an das Verfahren von MOORE und STEIN 6 in Bomben- rohren durch zweimaliges Einfrieren und Auftauen im Vakuum von Luftsauerstoff befreit und nach Abschmelzen der Bombenrohre im Vakuum 20 Stdn. bei 105 °C hydrolysiert. Die Trennung zwischen Glucosamin und Galaktosamin und den Aminosäuren erfolgte nach einem bereits früher beschriebenen Verfahren 7 . Ergebnisse Quantitative Bestimmung der Hyaluronsäure Die Peritonealflüssigkeit unbehandelter Kontrolltiere und Versuchstiere 2 4 bzw. 4 8 Stdn. nach der Rinderserumalbumininjektion enthält keine Hyaluronsäure (Tab. 1 ) . Nach der intraperitonealen PHA-Injektion dagegen ließ sich schon nach 2 4 Stdn. Hyaluronsäure nachweisen (Tab. 1 ) . Das Maximum H. GREILING, W. MOHR UND G. BENEKE 416 Hyaluronsäure-Konzentration 24 48 Versuchstiere nach R S A i.p. 0 0 Versuchstiere nach P H A i.p. 55,1 Versuchszeit [Stunden] 120 72 75,1 (43,3-64,4) [mg-%] (61,5-91,0) 52,6 (21,3-83,9) 3,0 (0-6) T a b . 1. Mittlere Hyaluronsäure-Konzentration in der Peritonealflüssigkeit von Ratten nach i.p. Injektion von R S A serumalbumin) bzw. P H A (Phytohämagglutinin) in A b h ä n g i g k e i t von der Versuchszeit. Menge des injizierten P H A 1,0 4,0 2,0 6,0 (Rinder- 8,0 10,0 [mg] Hyaluronsäurekonzentration in d e r P e r i t o n e a l f l ü s s i g k e i t 0 Hyaluronsäurekonzentration in d e r P l e u r a f l ü s s i g k e i t T a b . 2. 52,7 (49,1-56,3) 27,9 (16,1-39,8) 20,9 49,7 ( 4 9 , 5 -- 4 9 , 9 ) 69,9 ( 6 4 , 2 - -75,7) 56,0 41,5 43,8 (34,1-- 5 3 , 6 ) 46,0 ( 3 5 , 6 - -56,4) 63,3 52,5 A b h ä n g i g k e i t der Hyaluronsäurekonzentration [mg-%] in der Peritoneal- und Pleuraflüssigkeit von der M e n g e des intraperitoneal injizierten P H A (Phytohämagglutinin, 4 8 h p . i . ) . der Hyaluronsäure-Konzentration war nach 4 8 Stdn. 2-desoxy-D-glucose) erreicht. charakteristisches U V - M a x i m u m bei 2 3 2 nm identi- 72 Stdn. nach der Hyaluronsäure-Konzentration Injektion gering war die abgesunken, fiziert. Ebenfalls wurde zeigt das ebenfalls durch sein Kondensationsprodukt nach 1 2 0 Stdn. waren nur noch Spuren von Hyalu- von Dimethylaminobenzaldehyd mit dem Disaccharid ronsäure vorhanden (Tab. 1 ) . aus Hyaluronsäure, das durch A b b a u von Perito- Wie aus Tab. 2 hervorgeht, ist Hyaluronsäure nach der intraperitonealen Injektion nicht nur in der nealflüssigkeit mit Hyaluronatlyase wrurde, zwrei Absorptionsmaxima gewonnen bei 5 4 4 nm und Peritoneal-, sondern auch in der Pleuraflüssigkeit 585 nm, wenn die Reaktion nach LELOIR 8 ausge- nachweisbar. Es findet sich dabei eine Abhängigkeit führt wird. Körper- b ) Die Ergebnisse der Aminozuckeranalyse und höhlen von der Menge des applizierten Phytohäm- der Hyaluronsäure-Konzentration der Aminosäurenanalyse der isolierten Hyaluronat- agglutinins. Während sich nach der Injektion von Protein-Komplexe aus dem Peritonealexsudat zeigt 1 mg Phytohämagglutinin in den nur in der Peritoneal- Tab. 3. Beide Substanzen weisen einen relativ hohen flüssigkeit Hyaluronsäure nachweisen läßt, kommt es Asparaginsäure- und Glutaminsäuregehalt auf. Die von einer PHA-Menge von 2 mg an in beiden Kör- nach Proteolyse mit Papain gewonnene Substanz hat perhöhlen zum Auftreten von Hyaluronsäure. In der einen doppelt so hohen Hyaluronsäuregehalt wie die Pleuraflüssigkeit ist die Konzentration der Hyalu- mit Cetylpyridiniumchlorid gefällte Substanz. Inter- ronsäure etwas geringer als in der Peritonealflüssig- essanterweise konnte in beiden Präparaten Galak- keit. Die maximale Konzentration wurde in der Peri- tosamin in Spuren nachgewiesen werden. tonealflüssigkeit nach etwa 6 mg Phytohämagglutinin beobachtet. Identifizierung des Hyaluronat-Protein-Komplexes in der Peritonealflüssigkeit nach Phytohämaggluti- nin-Stimulation a) Das Die Aminosäurenzusammensetzung Ähnlichkeit isolierte mit aus humaner dem weist große Hyaluronat-Protein-Komplex Synovialflüssigkeit Substanz hat einen relativ hohen auf. Auch diese Asparaginsäure- und Glutaminsäuregehalt 9 . c) In der nativen Peritonealflüssigkeit wurde nach Proteohyaluronat wird durch der Phytohämagglutinin-Applikation ein spitzer Hyaluronatlyase zu einem ungesättigten Uronid ab- Extragradient bei der analytischen Ultrazentrifugen- gebaut, welches papierchromatographisch nachgewie- untersuchung ( 5 0 0 0 0 g ) nachgewiesen. Dieser spitze sen werden kann und identisch ist mit dem Disaccha- Extragradient verschwindet, wenn man die Perito- rid, welches aus Nabelschnurhyaluronsäure isoliert nealflüssigkeit mit Hyaluronatglykanohydrolase be- werden kann. Diese 4,5-ungesättigte Uronid (D-zJ-4- handelt. Dabei wird die Hyaluronsäure zu nieder- Glucopyranosyluronsäure-/3-[l —v 3 ] - 2 - a c e t a m i d o - polymeren Oligosacchariden abgebaut. HYALURONAT-PROTEIN-KOMPLEXE IN DER PERITONEALFLÜSSIGKEIT VON RATTEN Asparaginsäure, Threonin und Serin enthält. Ein- Hyal uronat-Protein-Komplex Asparaginsäure Threonin Serin Glutaminsäure Prolin Glycin Aianin Valln Cystin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Ornithin Lysin Tryptophan Histidin Arginin N H 3 die Proliferation von Lymphozyten in vitro, die erst- //Mol/ 100 m g rel. Mol. % /(Mol./ 100 m g rel. Mol.% 69,7 19,5 19,2 70,1 19,8 19,1 38,4 12,9 6,9 3,7 8,3 35,0 13,9 17,6 0.6 42,8 16,58 4,64 4,57 16,68 4,71 4,54 9,14 3,07 1,64 0,88 1,97 8,33 3,31 4,19 0,14 10,18 44,5 23,3 23,8 51,0 23,6 29,3 31,6 17,2 7,1 6,2 8,7 30,7 15,7 18,3 0,7 28,7 11,47 6.00 6,13 13,14 6,08 7,55 8,14 4,43 1,83 1,60 2,24 7,91 4,05 4,72 0,18 7,40 kubation mit Phytohämagglutinin bestehen in einem — — — diskutiert werden: 8,1 14,7 38,8 31,8 0,5 Glucosamin Galaktosamin gehend untersucht sind die Wirkungen des P H A auf II I 417 — 1,93 3,50 — — — 2,78 4,35 10,8 16,9 30,6 15,3 1,7 — — mals von NOWELL 15 beschrieben wurden. Die initialen Veränderungen der Lymphozyten nach der Ingesteigerten 3 H-Uridin-Einbau nach wenigen Stdn. in die zytoplasmatische R N S und einem gesteigerten 14 C-Leucin-Einbau 16 sowie einer gesteigerten Aktivi- tät an DNS gebundener und löslicher merase 17. RNA-Poly- Frühzeitig ist die Glucoseutilisation der L y m p h o z y t e n e r h ö h t 1 8 . V o n HAUSEN u n d STEIN wurde die Induktion einer Uridinkinase 19 beschrie- ben. FISHER und MUELLER 2 0 fanden einen erhöhten Phosphatidylinosit-Umsatz. Für die Biosynthese der in der Peritoneal- und Pleuraflüssigkeit nachgewiesenen Hyaluronsäure müssen mehrere Mechanismen 1. Phytohämagglutinin induziert eine de Hyaluronsäure-Synthese. novo- — HAYDEN und Mitarbb. Tab. 3. Aminosäurenanalysen und Hexosamingehalt von zwei Hyaluronat-Protein-Komplexen aus der Peritonealflüssigkeit von Ratten nach P H A i.p. gesteigerten Einbau von Glucosamin-l- 1 4 C. Gleich- zeitig war damit ein vermehrter Einbau von Leucin14 C Diskussion fanden in Lymphozyten, 21 die in Gegenwart von P H A kultiviert wurden, einen in die Proteine und von 3 H-Thymidin in die DNS 2 4 Stdn. nach der PHA-Zugabe verbunden. Das Die Produktion von Hyaluronsäure ist sowohl in Glucosamin-l- 1 fC wird hauptsächlich ( 8 4 % ) in die vivo als auch in vitro eine typische Funktion junger U D P - N - Acetylglucosaminfraktion Fibroblasten 1 0 . A u d i Synoviazellen, die sich mor- UDP-/V-Acetylglucosamin für die Synthese der Hya- phologisch von Fibroblasten abgrenzen lassen, pro- luronsäure als aktivierte Vorstufe benötigt wird, wäre duzieren in vivo und in vitro Hyaluronsäure. Als vorstellbar, daß in den Mesothelzellen Syntheseort der Zellen der Golgi-Apparat Hyaluronsäure werden n»12. konnte in wahrscheinlich eingebaut. Da (von denen diesen zu vermuten ist, daß sie die Hyaluronsäure syntheti- gemacht sieren) durch das Phytohämagglutinin eine Aktivie- Aus Untersuchungen von CASTOR und rung der Biosynthese von UDP-V-Acetylglucosamin NAYLOR 13 ist bekannt, daß auch Zellen aus Pleura- stattfindet und damit das Reaktionsgi eidige wicht zur und Pericardexsudaten in vitro Hyaluronsäure pro- Hyaluronsäuresynthese verschoben wird. duzieren können. In den vorliegenden Untersuchungen konnte gezeigt wrerden, daß Phytohämagglutinin zu einer starken Stimulation der Hyaluronsäuresynthese in peritonealen bzw. pleuralen Zellen führt. Eine ähnliche Wirkung von P H A ist auch aus in vitro Unter- 2. Phytohämagglutinin führt Hyaluronsäuresynthese siologischen zu einer in Zellen Bedingungen gesteigerten die unter Hyaluronsäure physynthe- tisieren. Experimentelle Beweise, daß die gefundene Hya- suchungen an Zellkulturen bekannt. Nach der Zu- luronsäure gabe von Phytohämagglutinin zu Fibroblasten-Kul- fehlen jedoch, da in unseren Versuchen die enzyma- turen fanden YARON und CASTOR 14 eine gering ge- tisch steigerte Hyaluronsäuresynthese. grenze bei etwa 1 mg-% aufweist. Es ist daher nicht Phytohämagglutinin ein V-Acetylglucosamin Glykoprotein, (aus phaseolus vulgaris) ist und Hexose das als dominierende enthaltendes Aminosäuren durch eine de novo-Synthese angewandte Methode eine entsteht, Empfindlichkeits- auszuschließen, daß auch Mesothelzellen unter physiologischen Bedingungen eine sehr geringe Hya- luronsäureproduktion aufweisen. Für diese Annahme H. GREILING, W. MOHR UND G. BENEKE 418 sprechen insbesondere histochemische Untersuchun- geführt gen, da in Mesothelzellen Alcianblau-positive Gra- Grundsubstanz des submesothelialen nula vorhanden sind22. Das Vorkommen einer in die wird, könnten auch Peritonealflüssigkeit Abbauprodukte der Bindegewebes übertreten. Das ver- hohen Hyaluronsäurekonzentration in Ergußflüssig- mehrte Auftreten von lysosomalen keiten von Mesothelionen abbauenden Enzymen würde jedoch letzten Endes 23_25, güssen unterschiedlicher Genese aber auch bei Er26, Hyaluronsäure- spricht ebenfalls auch zu einem A b b a u der in der Peritonealflüssig- für die Fähigkeit der Mesothelzellen, unter bestimm- keit vorhandenen Hyaluronsäure führen. Hyaluron- ten Bedingungen vermehrt Hyaluronsäure zu produ- säure sollte demnach in der Peritonealflüssigkeit in zieren. Demnach kann vermutet werden, daß unter kurzer Zeit nicht mehr nachweisbar sein. Für diese physiologischen Bedingungen eine geringe Hyaluron- Möglichkeit spricht zumindest die Tatsache, daß 120 säureproduktion stattfindet, die jedoch unter experimentellen Bedingungen stimuliert werden kann. Es könnte dabei sowohl in den maligne entarteten Mesothelzellen als auch in den Mesothelzellen nach der PHA-Applikation normalerweise die zu einer Aufhebung Hyaluronsäuresynthese eines gering haltenden Repressors kommen. 3. Lysosomale Enzyme Stunden nach der PHA-Injektion in der Peritonealflüssigkeit Die chemischen Analysen sprechen für das Auftreten verstärkten eines in Hyaluronsäure-Protein-Komplexes der Peritonealflüssigkeit nach der i. p. PHA-Applikation. führen zu einem nur noch Spuren von Hyaluronsäure vor- handen sind. Hyaluronsäure-Protein-Komplexe wurden bereits in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis zuerst von HAMERMAN 3 4 be- Hyaluronsäure-Abbau. schrieben. W i r konnten ebenfalls aus der SynovialAus Untersuchungen von ALLISON LUCCI 27 ist bekannt, daß die in vitro von Lymphozyten einer in Kulturmedien Labilisierung der und MAL- Inkubation mit P H A zu Lymphozytenmembranen führt. In den Mesothelzellen der Ratte, die bei unbehandelten Kontrolltieren Enzyme enthalten 2 8 ' Applikation 29, keine hydrolytischen kommt es nach der PHA- zum Auftreten von saurer Phospha- tase 3 0 . Es wäre nun vorstellbar, daß hydrolytische Enzyme der Mesothelzellen und der Makrophagen im submesothelialen Bindegewebe (Alveolarmakro- phagen enthalten Hyaluronidase 3 1 ) die Grundsub- stanz abbauen. In gleicher Weise, wie das Erscheinen eines durch Hyaluronat-glykanohydrolase ab- baubarenGlykosaminoglykans im Serum von Patienten mit malignen Tumoren 32 ' 3 3 , (Neuroblastomen flüssigkeit von Patienten mit rheumatoider Arthritis und auch aus der Nabelschnur Proteohyaluronate isolieren, bei denen ein Peptid kovalent am Polysaccharid gebunden ist 3 5 . Das vorliegende isolierte Proteohyaluronat aus der Peritonealflüssigkeit ist ein weiterer Hinweis für die Existenz von Hyaluronsäure-Protein-Komplexen in Körperflüssigkeiten. Die bisher isolierten Mengen sind jedoch noch zu gering um den Beweis für eine kovalente Bindung des Proteinanteils zur Polysaccharidkette der Hyaluronsäure zu erbringen. Der Galaktosaminanteil in dem Hyaluronat-Protein-Komplex könnte darauf hinweisen, daß das isolierte Proteoglykan noch Chondroitinsulfat oder ein Galaktosamin-haltiges Glykoprotein enthält. Der hohe Anteil an Asparaginsäure auf den verstärkten Abbau und Glutaminsäure könnte dafür sprechen, daß diese der Bindegewebsgrundsubstanz in der Wachstums- Aminosäuren an der Bindung der Polysaccharidkette front des infiltrierend wachsenden Tumors zurück- zum Proteinanteil beteiligt sind. Reticulumzellsarkom 1 W. MOHR, G. 33) BENEKE U. L . MURR, Experientia [Basel] 7 2 W. MOHR, G . BENEKE U. L . M U R R , B e i t r . P a t h . 1 4 2 , 8 J . L . REISSIG, J . L . S T R O H M I N G E R U. L . F . L E L O I R , J . b i o l . 345 9 M . J . H o w , V . J . M . L O N G U. D . R . S T A N W O R T H , Chemistry 2 1 7 , 9 5 9 [ 1 9 5 5 ] . 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Fusion of Isolated Mitochondria with Tissue Culture Cells * K . RADSAK * * , W . SAWICKI * * * , and H . KOPROWSKI T h e Wistar Institute of A n a t o m y and Biology, 36th and Spruce Streets, Philadelphia, Pennsylvania (Z. Naturforsch. 27 b , 419—423 [1972] ; received November 2, 1971) Experiments were undertaken to study the effect of introducing isolated mammalian cell mito chondria into tissue culture cells. T h e D N A of isolated mitochondria was labeled in vitro with 3 H thymidine. Incorporation of 3 H-thymidine into mitochondrial D N A was increased tenfold by the addition of bovine serum albumin and sucrose to the assay. Labeled H e L a cell mitochondria were fused with W I 3 8 (human fibroblast) and I-T-22 (Bromodeoxyuridine resistant mouse cell line) cells in the presence of Sendai virus and autoradiographs were made. T h e results indicated that isolated mitochondria may have been introduced into the cells b y the fusion process. Fusion of mitochondria isolated f r o m mouse tumor cell lines with isogenic primary mouse e m b r y o fibroblasts i n d u c e d permanent growth of these cells in tissue culture, whereas isolated mitochondria of mouse e m b r y o fibroblasts or allogenic tumor cells did not have this effect. Recent investigations have studied intensively the structure and mode of function of mitochondrial DNA-, R N A - and protein synthesizing systems1-3. These reports stress consistently the partial indepen- cells might cast some light on this problem. LETTRE and WRBA Ehrlich dence of the mitochondrial systems f r o m those di- Ehrlich rected b y the n u c l e u s 4 ' 5 . Whether tively. mitochondrial D N A contributes to the genetic determination of 8 a n d NASS 9 w e r e the first to r e p o r t possibility of uptake of isolated mitochondria ascites tumors and chicken liver the of by ascites tumor cells and L-cells, respec- W e attempted in pilot experiments to introduce mammalian cells, however, and if so, in what way, isolated continues to be an enigma 6- 7 . Investigations into the means of the fusion factor of Sendai virus. Our mitochondria into heterogeneic cells by effect of an uptake of isolated mitochondria by intact results showed that isolated mitochondria may have Requests for reprints should b e sent of to Dr. K . RADSAK, H y g i e n e Institute, Univ. of D-3550 Marburg, Pilgrimstein 2, W . Germany. * This investigation was supported in part b y P u b l i c Health Service Research Grants R 0 1 - C A 0 4 5 3 4 and R 0 1 - C A 10815 f r o m the National Cancer Institute. * * Fellow of Deutsche Forschungsgemeinschaft at the Wistar Institute. Present address: Hygiene Inst., Univ. D - 3 5 5 0 Marburg, Pilgrimstein 2, W . Germany. * * * Fellow of the Wistar Institute from the Department of Histology and Embryology, A c a d e m y of M e d i c i n e , Warsaw, Poland. — Present a d r e s s : Department of Histology and Embryology, A c a d e m y of M e d i c i n e , ul. Chalubinskiego 5, Warsaw, Poland.
