Die Rolle des p53-Status für die Sensitivität von Tumoren

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Die Rolle des p53-Status für die Sensitivität von Tumoren
gegenüber unterschiedlichen p53 Aktivatoren
Überarbeitete Version 2017
Von der Fakultät für Energie-, Verfahrens-, und Biotechnik der Universität Stuttgart
zur Erlangung der Würde eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Abhandlung
vorgelegt von
Andrea Weilbacher
aus Krumbach (Schwaben)
Hauptberichter:
Prof. Dr. Peter Scheurich
Mitberichter:
Prof. Dr. Walter E. Aulitzky
Tag der mündlichen Prüfung:
02. Juni 2014
Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut
für klinische Pharmakologie und Universität Tübingen
und
Institut für Zellbiologie und Immunologie
der Universität Stuttgart
2014
Die vorliegende Dissertation wurde am Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für
klinische Pharmakologie Stuttgart unter der Anleitung von Prof. Dr. Walter E. Aulitzky
angefertigt.
Gefördert wurde die Promotion durch ein Stipendium der Robert Bosch Stiftung.
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig und ohne
fremde Hilfe bzw. unerlaubte Hilfsmittel angefertigt, andere als die angegebenen
Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die den benutzten Quellen wörtlich oder
inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe.
Stuttgart, den 03.06.2014
Andrea Weilbacher
Danksagung
V
Danksagung
Meinen tiefsten Dank möchte ich Herrn Prof. Dr. Walter E. Aulitzky für die
Möglichkeit, meine Dissertation in seiner Arbeitsgruppe am Dr. Margarete FischerBosch-Institut für klinische Pharmakologie anfertigen zu dürfen, aussprechen. Seine
Unterstützung und seine Ratschläge in zahlreichen Diskussionen haben maßgeblich
zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Herrn Prof Dr. Peter Scheurich danke ich für die Bereitschaft, die Betreuung der
Dissertation von Seiten der Universität zu übernehmen.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Heiko van der Kuip. Ohne seine unermüdliche
Hilfs- und Diskussionsbereitschaft und seine Fähigkeiten als geduldigen Mentor wäre
diese Dissertation nicht möglich gewesen.
Meinen Kollegen Dr. Matthias Gutekunst, Dr. Michael Dengler, Dr. Jens Schmid,
Kerstin Willecke, Lea Schaaf, Dr. Meng Dong, Tabea Lieberich und Constanze
Mezger danke ich für deren Hilfe sowie für zahlreiche Diskussionen und die
angenehme Arbeitsatmosphäre während meiner Dissertation. Weiterhin möchte ich
mich bei allen Kollegen des Instituts herzlich für deren stetige Hilfe und für die
schöne Zeit am IKP bedanken.
Zudem möchte ich mich bei Herrn Dr. Thomas Mürdter und der Abteilung für
Analytische Chemie und Synthese für die Durchführung der GC/MS-Analyse zur
Prüfung der chemischen Identität von RITA bedanken.
Abschließend möchte ich mich in besonderer Weise bei meinen Eltern und bei
Andreas Bonk bedanken, die mich sowohl während meines Studiums als auch
während der Anfertigung dieser Arbeit immer unterstützt und mich begleitet haben.
Danke!
Inhaltsverzeichnis
VII
Inhaltsverzeichnis
Danksagung .............................................................................................................. V
Inhaltsverzeichnis .................................................................................................. VII
Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... XI
Zusammenfassung ................................................................................................. XV
Summary ............................................................................................................... XVII
1. Einleitung .............................................................................................................. 1
1.1 Der Transkriptionsfaktor p53 ............................................................................ 1
1.1.1 Wildtyp p53 ................................................................................................. 3
1.1.2 Mutiertes p53 .............................................................................................. 4
1.2 Die Funktion von p53 bei der Induktion von Zelltod ......................................... 6
1.2.1 p53-abhängige Apoptose ........................................................................... 6
1.2.2 Therapeutische Ansätze zur Aktivierung von p53....................................... 7
1.3 Die Bcl-2-Proteinfamilie..................................................................................... 9
1.4 Ziele der Arbeit ................................................................................................ 11
2. Material und Methoden....................................................................................... 12
2.1 Zellkulturtechnik .............................................................................................. 12
2.1.1 Verwendete Zelllinien ............................................................................... 12
2.1.2 Kulturmedium, Zusätze und Kulturbedingungen ....................................... 12
2.1.3 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels Trypanblaufärbung .................... 14
2.1.4 Kryokonservierung und Rekultivierung ..................................................... 14
2.2 Kultur von primärem Zellmaterial .................................................................... 15
2.2.1 Isolation von PBMNCs .............................................................................. 15
2.2.2 Isolation Tumor-assoziierter Fibroblasten ................................................. 16
2.3 Reagenzien ..................................................................................................... 16
2.3.1 Induktion von genotoxischem Stress ........................................................ 16
2.3.2 Inhibiton der p53-Mdm2 Interaktion .......................................................... 17
2.3.3 Aktivierung von p53 .................................................................................. 17
2.3.4 Inhibition der Caspaseaktivität .................................................................. 17
2.3.5 Inhibition anti-apoptotischer Bcl-2-Proteine .............................................. 18
2.3.6 Inhibition des MAPK-Signaltransduktionsweges ...................................... 18
2.3.7 Inhibition des Proteasoms ........................................................................ 18
VIII
Inhaltsverzeichnis
2.4 Zellanalyse mit Hilfe des Durchflusszytometers (FACS) ................................. 19
2.4.1 Nachweis von Zelltod mittels AnnexinV-FITC/PI-Färbung ........................ 19
2.4.2 Nachweis von Zelltod mittels TMRM-Färbung .......................................... 20
2.4.3 Zellzyklusanalyse mittels BrdU-Proliferationsassay.................................. 20
2.5 High-throughput qPCR mit Hilfe des BioMarkTM-HD-Systems ........................ 22
2.5.1 Generierung von RNA .............................................................................. 22
2.5.2 Spektrometrische Quantifizierung von RNA ............................................. 22
2.5.3 cDNA Synthese ........................................................................................ 23
2.5.4 qPCR mit dem BioMarkTM-HD-System ..................................................... 23
2.6 Microarrayanalyse ........................................................................................... 26
2.7 Bestimmung des p53-Status der Zelllinien durch Sequenzierung ................... 27
2.8 RNA Interferenz .............................................................................................. 28
2.9 Proteinanalyse ................................................................................................ 31
2.9.1 Herstellung eines Gesamtproteinlysats .................................................... 31
2.9.2 SDS-Page zur Auftrennung der Proteine .................................................. 32
2.9.3 Western-Blot ............................................................................................. 32
3. Ergebnisse .......................................................................................................... 36
3.1 Charakterisierung einer Zelllinienauswahl....................................................... 36
3.1.1 Bestimmung des p53-Status .................................................................... 36
3.1.2 Induktion von Zelltod und Zellzyklusarrest nach Nutlin-3, RITA und
Cisplatin............................................................................................................. 37
3.1.3 Induktion von p53-Zielgenen durch Nutlin-3, RITA und Cisplatin ............. 40
3.1.4 Die Rolle von wtp53 für die Nutlin-3-, RITA- und Cisplatin-Sensitivität ..... 48
3.2 Mechanismen des RITA-induzierten Zelltods im p53-mutierten System ......... 49
3.2.1 Die Rolle von mtp53 für die RITA-Sensitivität der mtp53-exprimierenden
Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 ...................................................................... 51
3.2.2 Die Rolle von p63 und p73 für die RITA-Sensitivität der p53-defekten
Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5 ..................................................... 52
3.2.3 Induktion von mitochondrialer Apoptose durch RITA in den p53-defekten
Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5 ..................................................... 55
3.2.4 Beteiligung der Bcl-2-Proteinfamilie am RITA-vermittelten Zelltod in den
p53-defekten Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5 ............................... 57
3.2.5 Identifikation von Signalwegen, welche den RITA-induzierten Zelltod
vermitteln können .............................................................................................. 59
Inhaltsverzeichnis
IX
3.2.6 Involvierung des JNK- und p38-MAP-Kinase-Signalweges in den RITAvermittelten Zelltod der p53-defekten Zelllinien OVCAR3 und OVCAR5 ........... 64
3.3 Mechanismen des Cisplatin-induzierten Zelltods im p53-mutierten System ... 69
3.3.1 Die Rolle von mtp53 für die Cisplatin-Sensitivität der mtp53exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 ............................................ 69
3.3.2 Die Rolle von p63 und p73 für die Cisplatin-Sensitivität der p53-defekten
Zelllinie OVCAR4 .............................................................................................. 70
3.3.3 Induktion von mitochondrialer Apoptose durch Cisplatin in den p53defekten Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 ....................................................... 72
3.3.4 Die Rolle der pro-apoptotischen BH3-only-Proteine für die CisplatinSensitivität der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4 ................................. 74
3.3.5 Die konstitutiven Level der Bcl-2-Proteine als prädiktive Marker in der
Zelllinienauswahl ............................................................................................... 75
3.3.6 Modulation von NOXA und Bcl-w zur Sensitivierung von Zellen mit geringer
Cisplatin-Sensitivität .......................................................................................... 79
4. Diskussion .......................................................................................................... 83
4.1 Reaktion von Zellen mit unterschiedlichem p53-Status auf die Behandlung mit
Nutlin-3, RITA und Cisplatin .................................................................................. 84
4.2 RITA und Cisplatin können unabhängig von der p53-Superfamilie Apoptose
induzieren ............................................................................................................. 89
4.2.1 RITA und Cisplatin können im p53-defekten System unabhängig von der
p53-Superfamilie Zelltod induzieren .................................................................. 89
4.2.2 RITA und Cisplatin können Zelltod im p53-defekten System durch die
Induktion von mitochondrialer Apoptose induzieren .......................................... 93
4.3 RITA kann durch die Aktivierung von JNK und p38 Zelltod im p53-defekten
System induzieren ................................................................................................ 97
4.4 Fazit und Ausblick ......................................................................................... 100
Literaturverzeichnis ............................................................................................. 103
Publikationen ........................................................................................................ 121
Lebenslauf............................................................................................................. 124
Abkürzungsverzeichnis
XI
Abkürzungsverzeichnis
A
Ampere
ALL
Akute lymphatische Leukämie
AML
Akute myeloische Leukämie
APS
Ammoniumpersulfat
BH3
Bcl-2 homology domain 3
BrdU
2-Bromo-5-desoxyuridin
BSA
bovine serum albumin
bzw.
beziehungsweise
°C
Grad Celsius
cDNA
complementary DNA
ChIP
Chromatin Immunpräzipritation
C-terminal
Carboxy-terminal
DAPI
4′,6-Diamidin-2-phenylindol
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
FACS
fluorescence activated cell sorter
FC
fold change
FCS
Fötales Kälberserum
FITC
Fluoreszein-Isothiocyanat
FSC
forward scatter
g
Gramm
GC/MS
Gaschromatographie-Massenspektrometrie
GOF
gain-of-function
HEPES
4-(2-hydroxyethyl)-1piperazineethanesulfonic acid
HRP
horse radish peroxidase
IgG
Immunglobulin G
kDA
kilo Dalton
l
Liter
LMTA
low melting temperature agarose
XII
Abkürzungsverzeichnis
LOF
loss-of-heterozygisity
m
Milli-
M
Molar (mol/l)
MCL
Mantelzelllymphom
min
Minute
MOMP
mitochondrial outer membrane
permeabilization
mt
mutiert
n
Nano-
NMR
Kernspinresonanzspektroskopie
N-terminal
Amino-terminal
ODXXX
optische Dichte bei XXX nm
μ
Mikro-
p
phosphoryliert
PBMNC
peripheral blood mononuclear cell
PBS
phosphate buffered saline
PCR
polymerase chain reaction
PHA-L
Phytohämagglutinin-L
PI
Propidiumiodid
qPCR
quantitative real time polymerase chain
reaction
RE
response element
RING
really interesting new gene
RMA
Robust Multi-array Average
RNA
Ribonukleinsäure
RNAi
RNA Interferenz
ROS
Reaktive Sauerstoffsspezies
rpm
Umdrehungen pro Minute (rounds per
minute)
RT
Raumtemperatur
SCID
schwere kombinierte Immundefizienz
Ser
Serin
SD
Standardabweichung
SDS
Sodiumdodecylsulfat
Abkürzungsverzeichnis
XIII
SDS-PAGE
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
sec
Sekunden
siRNA
small interfering RNA
SSC
side scatter
STA
specific target amplification
TAD
Tranaktivierungsdomäne
TBST
tris buffered saline plus Tween
TEMED
N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin
TMRM
Tetramethylrhodaminmethylester Perchlorat
TRIS
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
u.a.
unter anderem
V
Volt
v/v
Volumen/Volumen
w/v
Masse/Volumen
wt
Wildtyp
z.B.
zum Beispiel
Zusammenfassung
XV
Zusammenfassung
Die tumorsuppressiven Eigenschaften von p53 gelten als zentral bei der
Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Auf Grund dessen spielt p53 eine
Schlüsselrolle bei der Reaktion auf genomischen Stress welcher unter anderem
durch klassische Chemotherapeutika, wie beispielsweise Cisplatin, induziert wird.
In der vorliegenden Studie wurde die Rolle des p53-Status für die Sensitivität
gegenüber p53-aktivierenden Substanzen untersucht. Hierfür wurde eine Auswahl
von Zelllinien aus verschiedenen Entitäten und mit unterschiedlichen p53-Genotypen
sowie Tumor-assoziierte Fibroblasten aus der humanen Lunge und PBMNCs von
gesunden Donoren verwendet. Als p53-Aktivatoren wurden neben dem klassischen
DNA-modifizierenden Molekül Cisplatin die direkten Aktivatoren von p53, Nutlin-3
und RITA eingesetzt. Die Behandlung mit Nutlin-3 führte selektiv in wtp53exprimierenden Zellen zu einem G1-Arrest. Dieser trat auch in primären,
nichtmalignen Zellen auf. Nutlin-3 agiert somit selektiv in wtp53-exprimierenden
Zellen, nicht aber tumorselektiv. Die wtp53-selektive Wirkungsweise konnte weder
nach Cisplatin- noch nach RITA-Behandlung nachgewiesen werden. Beide
Substanzen induzierten Zelltod auch in mtp53-Systemen oder im Falle von RITA
auch in der p53-null-Zelllinie OVCAR5. Der durch Cisplatin und RITA induzierte
Zelltod in der wtp53-exprimierenden Zelllinie NTERA-2D1 konnte auf die Aktivierung
von wtp53 zurückgeführt werden. Hingegen war der in den mtp53-exprimierenden
Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 induzierte Zelltod im Falle einer Behandlung mit
Cisplatin oder RITA unabhängig von mtp53. Zudem führte die siRNA-vermittelte
Depletion von p63 und p73 zu keiner Verminderung des Zelltods. Cisplatin und RITA
können somit unabhängig von der p53-Superfamilie Zelltod in p53-defekten
Systemen induzieren. Dieser war für beide Substanzen auf die Aktivierung der
mitochondrialen Effektoren BAX und BAK zurückzuführen. Die Induktion von Zelltod
nach
Cisplatin-Behandlung
konnte
weiterhin
auf
die
Aktivierung
der
pro-
apoptotischen Bcl-2-Proteine NOXA und PUMA zurückgeführt werden. Die Analyse
der konstitutiven Expression der Bcl-2-Proteine in der gesamten Zelllinienauswahl
zeigte eine signifikante Korrelation des Verhältnisses aus pro- und anti-apoptotischen
Bcl-2-Proteinen gegenüber der Cisplatin-Sensitivität. NOXA und Bcl-w wurden in
diesem Ansatz als prädiktive Marker der Cisplatin-Sensitivität innerhalb der
XVI
Zusammenfassung
Zellauswahl identifiziert. Die Kombinationsbehandlung von Cisplatin mit dem BH3mimetic ABT-737 führte zu einer Sensitivierung von Cisplatin-insensitiven Zellen.
Im Falle der Behandlung mit RITA konnte keine Korrelation zwischen dem Verhältnis
aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen und dem durch RITA induzierten
Zelltod festgestellt werden. Jedoch erwies sich die Herunterregulation von antiapoptotischen Bcl-2-Proteinen nach RITA-Behandlung als wichtig für die Induktion
von Apoptose. Infolgedessen führte die Kombinationsbehandlung von RITA mit ABT737 zu einer Verstärkung des RITA-induzierten Zelltods in RITA-sensitiven Zellen.
RITA-insensitive Zellen blieben dabei unbeeinflusst. Weiterhin konnte der durch
RITA vermittelte Zelltod in p53-defekten Systemen auf die Aktivierung des JNK- und
p38-Signaltransduktionsweges zurückgeführt werden. Insbesondere JNK1 erwies
sich als entscheidend für die Induktion von Apoptose nach RITA-Behandlung.
Im Vergleich der drei Substanzen zeigte sich überraschenderweise eine größere
Ähnlichkeit von RITA zu Cisplatin als zu Nutlin-3. Cisplatin, als klassischer über
DNA-Schädigung wirkender p53-Aktivator, führte zur Induktion von Zelltod in
Zelllinien welche nahezu alle auch sensitiv gegenüber der Behandlung mit RITA
waren. Potentiell könnte somit auch RITA über DNA-Schädigungen Zelltod
induzieren. Intrazellulär führen jedoch beide Substanzen zu unterschiedlichen
Effekten. Während Cisplatin zu einer Hochregulation von pro-apoptotischen BH3only-Proteinen führt, induziert die Behandlung mit RITA eine Reduktion antiapoptotischer Bcl-2-Proteine. Im Falle von Cisplatin konnte die Proteinkonzentration
von NOXA und Bcl-w als Marker für die Sensitivität innerhalb der Zellauswahl
identifiziert werden. RITA hingegen induzierte Zelltod nur in einer bestimmten
Gruppe von Zellen, weshalb der Transport von RITA ein potentieller Marker für die
RITA-Sensitivität darstellen könnte.
Zusammenfassend konnte in der verwendeten Zellauswahl sowohl nach Nutlin-3-,
als auch nach Cisplatin- oder RITA-Behandlung ein Einfluss von wtp53 für die
Sensitivität nachgewiesen werden. Allerdings konnten durch Cisplatin und RITA auch
Effekte unabhängig von p53 vermittelt werden. Interessanterweise führte die
Behandlung mit RITA zu einer von der p53-Superfamilie und von der Aktivierung des
JNK-Signaltransduktionsweges
unabhängigen
Regulation
von
p53-Zielgenen.
Dementsprechend können im p53-defekten System p53-Zielgene sowie typische
p53-Funktionen durch die Aktivierung p53-unabhängiger Signalwege vermittelt
werden.
Summary
XVII
Summary
The tumor suppressive functions of p53 are central for maintaining genomic stability.
Due to this, p53 is a key player in the cellular response to genomic stress which is
induced by classical chemotherapeutical agents such as Cisplatin.
In this study the role of the p53 status for sensitivity towards p53 activating
substances was investigated. Therefore, a panel of cell lines from different entities
which includes all p53 genotypes was used. Additionally, tumor associated
fibroblasts from lung cancer patients and PBMNCs from healthy donors were
included in the study. As p53 activators the DNA modifying agent Cisplatin and the
direct activators of p53 Nutlin-3 and RITA were used.
Treatment with Nutlin-3 led to a selective activation of a G1 arrest in wtp53
expressing cells. This arrest was also observed in fibroblasts and PBMNCs.
Consequently, Nutlin-3 acts selectively in cells carrying wtp53 but without being
tumor selective.
This wtp53 selective mode of action was not observed after Cisplatin or RITA
treatment. Both agents induced cell death also in cells harboring mtp53.
Furthermore, RITA treatment led to the induction of cell death in the p53-null cell line
OVCAR5. As expected, the induced cell death after Cisplatin and RITA treatment in
the wtp53 expressing cell line NTERA-2D1 was due to the activation of wtp53. In
contrast, cell death induction after Cisplatin or RITA treatment in the mtp53expressing cell lines OVCAR3 and OVCAR4 was not affected by silencing mtp53.
Additionally, silencing of p63 and p73 did not reduce apoptosis after Cisplatin or
RITA treatment. Thus, Cisplatin and RITA can act independently of the p53
superfamily in p53 defective systems. However, the induction of cell death after
Cisplatin or RITA treatment in cells harboring defective p53 was due to the activation
of the mitochondrial effector proteins BAX and BAK. Furthermore, the pro-apoptotic
Bcl-2 proteins NOXA and PUMA were identified as mediators of cell death after
Cisplatin treatment. Analyzing the constitutive expression of pro- and anti-apoptotic
Bcl-2 proteins in the cell line panel a significant correlation between the ratio of proand anti-apoptotic proteins and the induced cell death after Cisplatin treatment was
observed. Thereby, NOXA and Bcl-w could be identified a predictive markers for
XVIII
Summary
Cisplatin sensitivity in this cell line panel. Treatment of Cisplatin insensitive cells with
Cisplatin and the BH3-mimetic ABT-737 lead to a sensitization these cells.
A correlation between the constitutive expression of pro- and anti-apoptotic Bcl-2
family proteins and the induced cell death after RITA treatment was not observed.
However, the down-regulation of anti-apoptotic Bcl-2 proteins after RITA treatment
could be identified as an important step for induction of apoptosis. Therefore,
treatment of RITA sensitive cells with RITA and ABT-737 led to a pronounced
induction of cell death. RITA insensitive cells were not affected by this combinational
treatment. Furthermore, the activation of the JNK and p38 signal transduction
pathway in p53 defective cells could be identified as crucial for RITA mediated cell
death. Especially JNK1 was essential to allow apoptosis development.
Interestingly, the comparison of the three agents revealed that RITA exhibits a higher
similarity to Cisplatin than to Nutlin-3. Cisplatin, which activates p53 via DNA-damage
response mechanisms, induced cell death in cell lines which are almost all sensitive
to RITA, too. This leads to the hypothesis that RITA might mediate cell death via
induction of DNA damage. However, if so, RITA and Cisplatin seem to induce
different DNA damage response mechanisms. While Cisplatin induces up-regulation
of pro-apoptotic BH3-only proteins, treatment with RITA led to the down-regulation of
anti-apoptotic Bcl-2 proteins. In the case of Cisplatin, the protein levels of NOXA and
PUMA were found to be predictive for sensitivity in the cell line panel. However, RITA
induced cell death was limited to a specific group of cell lines. This indicates that
differential RITA concentrations due to differential RITA transport might be
responsible for this observation. Therefore, specific RITA transporters might serve as
potential markers for RITA sensitivity.
In conclusion, this study demonstrates that wtp53 can mediate the sensitivity towards
Nutlin-3, Cisplatin and RITA treatment. However, in contrast to Nutlin-3, Cisplatin and
RITA can also act independently of p53. Interestingly, p53 target genes were found
to be regulated after RITA treatment independently of the p53 superfamily and the
activation of the JNK signaling pathway. Accordingly, p53 target genes and typical
functions of p53 can be mediated by the activation of p53 independent signaling
pathways.
Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 Der Transkriptionsfaktor p53
Das Protein p53 wurde 1979 erstmals durch mehrere unabhängige Arbeitsgruppen
simultan beschrieben (DeLeo et al., 1979; Kress et al., 1979; Lane and Crawford,
1979; Linzer and Levine, 1979; Melero et al., 1979; Smith et al., 1979). Die
Namensgebung erfolgte durch die damals falsch kalkulierte molekulare Masse von
53 kDa. Durch die Anwesenheit einer Prolin-reichen Region innerhalb des Proteins
kam es zu einem verzögerten Laufverhalten in der SDS-Gelelektrophorese, worauf
die Fehlkalkulation zurückzuführen war. Die korrekte molekulare Masse von p53
beträgt 43,7 kDa (Levine and Oren, 2009).
Ursprünglich wurde p53 fälschlicherweise als Onkogen klassifiziert (Eliyahu et al.,
1984, 1985; Jenkins et al., 1984; Parada et al., 1984; Wolf et al., 1984). In humanen
kolorektalen Tumoren konnte jedoch gezeigt werden, dass durch Mutationen und
Deletionen im TP53 Gen beide Wildtyp-TP53-Allele inaktiviert wurden (Baker et al.,
1989). Weiterhin führte die Überexpression von wtp53 zu einer Repression der
transformierenden Eigenschaften von MYC und HRAS (Eliyahu et al., 1989; Finlay et
al., 1989). Transgene Trp53-/- Mäuse entwickelten zudem Tumore in sehr frühen
Lebensphasen (Harvey et al., 1993; Kemp et al., 1993). Durch diese Daten konnte
p53 als typischer Tumorsuppressor klassifiziert werden.
Chromosomal ist das Protein an Position 17p13.1 lokalisiert und umfasst
20 kb genomischer DNA, die in 11 Exons und 10 Introns untergliedert sind (Lamb
and Crawford, 1986). Das durch die Translation resultierende Polypeptid beinhaltet
393 Aminosäuren und kann in fünf Domänen untergliedert werden. Der N-Terminus
von p53 gliedert sich in zwei Transaktivierungsdomänen (TAD1 und TAD2). Beide
Transaktivierungsdomänen vermitteln die Transkription von p53-Zielgenen. Dabei
unterscheidet sich die Aktivität der Aktivierungsdomänen dahingehend, dass TAD1
vorwiegend die Transkription von Genen des Zellzyklus, TAD2 die Aktivierung von
pro-apoptotischen Genen steuert (Zhu et al., 2000). Die zentrale Domäne des p53Proteins bildet die DNA-Bindedomäne, welche die Aminosäuren 93-292 umfasst und
durch die Bindung an p53-response elements (RE) die Transaktivierung von p53-
2
Einleitung
Zielgenen
steuert
(Viadiu,
2008).
Auf
die
DNA-Bindedomäne
folgt
die
Tetramerisierungsdomäne. Diese ermöglicht es, p53 zu dimerisieren, um mit einem
weiteren p53-Dimer zum aktiven Tetramer zu aggregieren (Kitayner et al., 2006).
Innerhalb dieser Domäne konnte zudem ein nukleäres Exportsignal identifiziert
werden (Stommel et al., 1999). C-terminal befindet sich eine regulatorische Domäne,
welche die spezifische Bindung der DNA-Bindedomäne an die DNA inhibieren kann.
Zudem wurden innerhalb des C-Terminus drei nukleäre Lokalisationssequenzen
identifiziert (Shaulsky et al., 1990).
Funktionell konnten p53 zahlreiche Aktivitäten, wie die Modifikation von Chromatin,
die Involvierung in Reparaturprozesse, die Assoziierung mit Proteinen, welche für die
genomische Stabilität wichtig sind, und die Aktivität als zytoplasmatisches proapoptotisches Protein zugeschrieben werden (Aylon and Oren, 2011; Helton and
Chen,
2007).
Die
zentrale
Funktion
von
p53
ist
jedoch
die
eines
Transkriptionsfaktors. Dabei reguliert p53 verschiedenste biologische Prozesse, wie
Apoptose,
Zellzyklus,
DNA-Metabolismus,
Energiemetabolismus,
Seneszenz,
Immunantwort, Zelldifferenzierung, Motilität und Migration, Angiogenese und die
Kommunikation zwischen Zellen (Menendez et al., 2009). Ohne zellulären Stress
wird die Aktivität von p53 durch ständige proteasomale Degradation minimiert. Dies
wird vornehmlich durch Mdm2, einer E3-Ubiquitin-Ligase, vermittelt. Mdm2 besitzt
C-terminal eine RING-Finger Domäne, welche die Oligomerisierung des Moleküls
ermöglicht und dessen E3-Ligase-Aktivität initiiert (Marine and Lozano, 2010).
Daneben kann Mdm2 durch die N-Terminale Bindung an p53 dessen Interaktion mit
der Transkriptionsmaschinerie unterbinden (Thut et al., 1997). Die Aktivierung von
p53 erfolgt durch verschiedene zelluläre Stressoren, wie DNA-Schäden, Hypoxie,
oxidativer Stress, metabolischer Stress sowie die Aktvierung von Onkogenen (Levine
and Oren, 2009).
Als
strukturell
und
funktionell
homologe
Proteine
zu
p53
wurden
die
Transkriptionsfaktoren p63 und p73 identifiziert (Jost et al., 1997; Kaghad et al.,
1997; Yang et al., 1998) und zusammen mit p53 als p53-Superfamilie deklariert. p63
und
p73
bilden,
ebenso
wie
p53,
Oligomere
und
transaktivieren
oder
transrepremieren typische p53-Zielgene, welche Zellzyklusarrest (CDKN1A, MDM2),
Seneszenz (CDK1, CCNB1) oder Apoptose (BAX) induzieren (Dötsch et al., 2010;
Jung et al., 2001; Su et al., 2013). Jedoch zeigte sich im Gegensatz zu p53, dass
p63 und p73 auch zentral während des Entwicklungsprozesses sind (Zawacka-
Einleitung
3
Pankau et al., 2010). Mutationen von p63 und p73 treten in Tumoren nur sporadisch
auf (Hagiwara et al., 1999; Melino et al., 2002; Sunahara et al., 1999). Eine fehlende
Expression von p73 konnte in Neuroblastomen nachgewiesen werden (Ichimiya et
al., 1999). Im Gegensatz dazu konnten Mutationen von p53 in etwa 50% aller
Tumorerkrankungen nachgewiesen werden (Murray-Zmijewski et al., 2008).
1.1.1 Wildtyp p53
In seiner Wildtypform agiert p53 (wtp53) als zentraler Tumorsuppressor. Die
tumorsuppressiven Eigenschaften werden vorwiegend durch die Regulation von
zahlreichen p53-Zielgenen vermittelt. Die Aktivierung von p53-Zielgenen erfolgt durch
die sequenzspezifische Bindung an REs, welche charakteristischerweise aus zwei
Decameren (RRRCWWGYYY…n…RRRCWWGYYY; R: Purin, Y: Pyrimidin, W:
Adenin oder Thymin) bestehen. Diese werden durch einen Abstand von n=0-13
Basenpaaren getrennt (Menendez et al., 2009). Durch genomweite Ansätze sowie
durch ChIP basierte Bindungsstudien konnten zahlreiche Gene identifiziert werden,
welche von wtp53 gebunden werden, ohne dass der Konsensussequenz des REs
exakt entsprochen wird (Hearnes et al., 2005; Smeenk et al., 2008; Wei et al., 2006).
Weiterhin konnte gezeigt werden, dass wtp53 auch im nicht-aktivierten Zustand unter
normalen zellulären Bedingungen an die DNA bindet (Shaked et al., 2008). Neben
der transkriptionellen Aktivierung von Zielgenen konnte wtp53 auch als Repressor
verschiedener zellzykusregulierender Gene identifiziert werden (Böhlig and Rother,
2011). Entscheidend für die zellulären Effekte der wtp53-Aktivierung sind das
Ausmaß des induzierten Stresses, der genetische Hintergrund der Zellen, der Zelltyp
sowie die Interaktion mit verschiedensten Signalwegen (Meek, 2009). Auf Grund
dessen ist die Proteinkonzentration, die zelluläre Lokalisation, posttranslationale
Modifikationen und das Vorhandensein bestimmter Kofaktoren entscheidend für die
Funktion und Regulation von wtp53 (Murray-Zmijewski et al., 2008). Insbesondere
spielen
hierbei
posttranslationale
Modifikationen,
wie
Phosphorylierung,
Ubiquitinierung, Acetylierung, Methylierung, Sumoylierung und Neddylierung eine
entscheidende Rolle (Kruse and Gu, 2009). Als initialer Schritt der p53-Stabilisierung
gilt die Phosphorylierung von p53. Insbesondere die N-terminale Phosphorylierungen
an Ser15 und Ser20 durch ATM, ATR, DNA-PK, Chk1 und Chk2 werden dabei als
zentral betrachtet (Kruse and Gu, 2009). Hierbei kommt es zur Dissoziation von
4
Einleitung
wtp53 und Mdm2, wodurch wtp53 stabilisiert wird. Dies hat eine Verlängerung der
geringen Halbwertszeit des wtp53-Proteins zur Folge.
1.1.2 Mutiertes p53
In einer Vielzahl von Tumoren kommt es zu einer Veränderung der Funktion von p53.
TP53-Mutationen konnten als genetische Grundlage für das Li-Fraumeni-Syndrom
identifiziert werden, welches durch das Risiko verschiedenartige Tumore in
unterschiedlichen Altersklassen zu entwickeln charakterisiert ist (Rivlin et al., 2011).
Die Mutationsrate in verschiedenen Tumoren schwankt zwischen 10% (z.B.
hämatopoetische
Tumore)
und
nahezu
100%
(z.B.
hochgradig
seröse
Ovarialkarzinome) (Rivlin et al., 2011). Insbesondere monoallelische missenseMutationen (74% aller Mutationen) sind dabei von entscheidender Bedeutung (Brosh
and Rotter, 2009). Genomisch lokalisiert sind die Mutationen vorwiegend in der DNABindedomäne, wobei ca. 30% an den Positionen R175, G245, R248, R249, R273
und R282 auftreten (Cho et al., 1994). Dabei unterbinden Mutationen an den
Positionen R248 und R273 die sequenzspezifische DNA-Bindung. Die Mutationen an
den Positionen R175, G245, R249 und R282 führen zu einer Veränderung der
Faltung des p53-Proteins (Cho et al., 1994). In der heterozygoten Situation, in
welcher sowohl ein wtp53-Allel als auch ein p53-mutiertes (mtp53) Allel vorliegt,
antagonisiert mtp53 die Funktionen von wtp53 in einer dominant-negativen Art und
Weise (Viadiu, 2008). Jedoch ist der heterozygote Phänotyp meist transient, da
häufig während der Tumorentwicklung Deletionen oder Mutationen im wtp53-Allel
auftreten (loss of heterozygosity) (Rivlin et al., 2011). Neben dem Verlust der
typischen p53-Funktionen durch Mutationen (loss-of-function-Phänotyp) ist es
weiterhin möglich, dass mtp53 neue onkogene Eigenschaften erwirbt (gain-offunction-Phänotyp) (Goldstein et al., 2011). Dazu gehören eine gesteigerte
Proliferationsrate, Reduktion von Apoptose sowie Chemoresistenzmechanismen
(Brosh and Rotter, 2009; Sigal and Rotter, 2000). Diese gain-of-function (GOF)Mechanismen können zum einen durch ein verändertes DNA-Bindemuster vermittelt
werden. Es konnte gezeigt werden, dass mtp53 DNA binden kann, jedoch war die
Bindung an gängige p53-RE deutlich reduziert (Ludwig et al., 1996; Thukral et al.,
1995). Mit Hilfe von Microarrayanalysen wurde das Transkriptom verschiedener p53Mutanten
untersucht.
Hierbei
wurde
festgestellt,
dass
das
Spektrum
der
Einleitung
5
transaktivierten Gene unterschiedlicher p53-Mutationen teilweise, jedoch nicht
vollständig überlappt (Weisz et al., 2007). Somit können verschiedene Mutationen
distinkte GOFs aufweisen. Neben der direkten Bindung an die DNA kann mtp53 an
Transkriptionsfaktoren binden und deren Funktion modulieren. SP1, ETS1, TopBP1
und NF-Y werden sowohl von wtp53 als auch von mtp53 gebunden, jedoch induziert
mtp53 die Aktivität der Transkriptionsfaktoren, wohingegen wtp53 diese repremiert
(Di Agostino et al., 2006; Bargonetti et al., 1997; Chicas et al., 2000; Hwang et al.,
2011; Kim and Deppert, 2003; Liu et al., 2011; Sampath et al., 2001; Torgeman et
al., 2001). Dies lässt auf eine Rekrutierung unterschiedlicher Kofaktoren durch wtp53
und mtp53 schließen. Zudem wird auch der Promotor des Vitamin D-Rezeptors
verstärkt durch mtp53 gebunden. Die Behandlung mit Vitamin D3, welche in wtp53exprimierenden Zellen pro-apoptotisch ist, führte in mtp53-exprimierenden Zellen
zum Überleben (Stambolsky et al., 2010). Weiterhin wurde gezeigt, dass die p53Mutanten p53R248W und p53R273H Mre11 binden und dadurch die Bindung des Mre11Rad51-NBS1-Komplexes an DNA-Doppelstrangbrüche unterbunden wird (Song et
al.,
2007).
Somit
wird
die
durch
ATM
vermittelte
Antwort
auf
DNA-
Doppelstrangbrüche inhibiert.
Neben den aktivierenden Interaktionen kann mtp53 auch inhibitorisch auf
Transkriptionsfaktoren wirken. Hierbei ist insbesondere der Effekt auf p63 und p73 zu
erwähnen. Mtp53 bildet Heterodimere mit p63 und p73, wodurch die Bindung an die
DNA und die Transaktivierung spezifischer p63/p73-Zielgene unterbunden wird
(Girardini et al., 2011; Liu et al., 2011). Kürzlich konnte jedoch gezeigt werden, dass
Komplexe aus mtp53 und p63 häufig an DNA-Abschnitte gebunden sind, welche sich
von den gängigen p63-RE unterscheiden (Martynova et al., 2012). Weiterhin ist die
Bildung eines stabilen Komplexes aus mtp53 und p73 stark durch den single
nucleotide polymorphism (SNP) an Position 72 von p53 beeinflusst (Marin et al.,
2000). P53-Mutanten, welche ein Arginin an Position 72 exprimieren, bilden stabilere
Heterodimere mit p73 als solche, die ein Prolin an Position 72 exprimieren.
Dementsprechend zeigen p53-Mutanten mit einem Prolin an Position 72 höhere
Apoptoseraten auf Cisplatin, Etoposid, Taxol und Doxorubicin (Bergamaschi et al.,
2003). Ferner wurde kürzlich gezeigt, dass mtp53 prionenartige Strukturen bildet,
welche die Bindung und Inhibition von p63 und p73 beeinflussen (Ano Bom et al.,
2012; Xu et al., 2011). Weiterhin wird die Stärke der Interaktion von mtp53 mit p63
und p73 durch die Art der p53-Mutation geprägt. Strukturelle p53-Mutanten binden
6
Einleitung
mit einer höheren Affinität an p63/p73 als Mutanten, die in ihrer DNA-Bindedomäne
Mutationen aufweisen (Muller and Vousden, 2013). Jedoch können beide Arten von
p53-Mutationen die Invasivität und Metastasierung von Tumoren erhöhen sowie vor
Apoptose schützen (Muller and Vousden, 2013). Im Gegensatz hierzu wurde gezeigt,
dass p53-Mutanten, welche eine Deletion der Prolin-reichen Region aufweisen,
defizient bei der Induktion von Zellzyklusarrest sind, jedoch weiterhin die Fähigkeit
besitzen effizient Apoptose zu induzieren (Toledo et al., 2006).
1.2 Die Funktion von p53 bei der Induktion von Zelltod
1.2.1 p53-abhängige Apoptose
Die Fähigkeit von p53 Zellproliferation durch Inhibition des Zellzyklus sowie die
Induktion von Apoptose zu inhibieren beschreibt die zentrale Funktion von p53 als
Tumorsuppressor. Neben der Induktion von Apoptose ist p53 auch an der Regulation
von Zelltod durch Nekrose, Seneszenz und Autophagie beteiligt (Vaseva et al., 2012;
Zuckerman et al., 2009).
Der Tumorsuppressor p53 spielt insbesondere bei der transkriptionellen Regulation
verschiedener
Faktoren
entscheidende
Rolle.
aus
Nach
extrinsischer
einem
und
intrinsischer
apoptotischen
Stimulus
Apoptose
kommt
es
eine
zur
transkriptionellen Aktivierung von pro-apopototischen Genen, wie NOXA (PMAIP1),
PUMA (BBC3), BID, BAX, APAF1 und Fas (Riley et al., 2008; Wei et al., 2006).
Ebenso induziert p53 die transkriptionelle Repression von anti-apoptotischen Genen,
wie zum Beispiel von Bcl-2 (Wu et al., 2001). Neben den transkriptionsabhängigen
Funktionen von p53 kann p53 auch transkriptionsunabhängig Apoptose induzieren.
Der nukleäre Export von p53 erfolgt mittels Monoubiquitinierung durch geringe Level
an Mdm2 (Lenos and Jochemsen, 2011). Anschließend erfolgt die Bindung von
zytosolischem p53 an die Ubiquitin-spezifische Protease HAUSP, welche p53
deubiquitiniert und damit p53 vor dem Mdm2-abhängigen Abbau schützt (Marchenko
et al., 2007). Zytoplasmatisches p53 interagiert mit den anti-apoptotischen Proteinen
Bcl-2 und Bcl-xL, was die Freisetzung von pro-apoptotischen BH3-only Proteinen zur
Folge hat (Mihara et al., 2003). Zudem interagiert zytoplasmatisches p53 direkt mit
BAK und induziert dessen Freisetzung von Mcl-1 (Leu et al., 2004). Ebenso konnte
eine direkte Aktivierung von BAX nachgewiesen werden (Chipuk et al., 2004). In vivo
Einleitung
7
Versuche zeigten, dass in einem ersten Schritt nach einem apoptotischen Stimulus
zytoplasmatisches p53 akkumuliert, woraufhin in einem zweiten Schritt p53 in den
Nukleus
transloziert
und
durch
die
Hochregulation
von
PUMA
einen
transkriptionsabhängigen Zelltod induziert (Erster et al., 2004). Somit ist es möglich,
dass sowohl die transkriptionsabhängigen sowie die transkriptionsunabhängigen
Funktionen von p53 nötig sind, um effizient Apoptose zu induzieren (Vousden and
Prives, 2009).
1.2.2 Therapeutische Ansätze zur Aktivierung von p53
Mutationen im TP53 Gen treten in circa 50% aller Tumorerkrankungen auf. Die
andere Hälfte der Tumore exprimiert wtp53, dessen Funktion jedoch kompromittiert
ist. Mechanismen, welche zur Deregulation der wtp53-Aktivität führen, sind die
Überexpression von Mdm2 und MdmX oder die Deletion bzw. die epigenetische
Inaktivierung des Mdm2 Inhibitors ARF (Brown et al., 2009). Auf Grund dessen stellt
die Reaktivierung von p53 eine therapeutische Option dar.
Eine der am besten charakterisierten Substanzen, welche den p53-Mdm2-Komplex
inhibieren, ist das cis-Imidazolanalogon Nutlin-3 (Vassilev et al., 2004). Nutlin-3
bindet kompetitiv mit p53 an Mdm2. In nichtmalignem Gewebe ist die Aktivität von
Nutlin-3 mit der Induktion von Zellzyklusarrest assoziiert (Tovar et al., 2006; Vassilev
et al., 2004). In Tumorzellen überwiegt die Induktion von Apoptose und Seneszenz
(Cheok et al., 2011). In präklinischen Studien mit AML- und Neuroblastomzellen
konnte gezeigt werden, dass die Induktion von Apoptose selektiv in Zellen mit wtp53
auftritt (Kojima et al., 2005; Van Maerken et al., 2009). Eine Toxizität gegenüber BLymphozyten, PBMNCs und hämatopoetischen Vorläuferzellen konnte nicht
beobachtet werden (Secchiero et al., 2006). In klinischen Studien (Phase I) konnte
das Nutlin-3a Derivat RG7112 die Zellproliferation in Mdm2-überexprimiereden
Liposarkomen reduzieren (Ray-Coquard et al., 2012). Neben RG7112 befindet sich
auch der Mdm2 Antagonist JNJ-26854165 in klinischen Studien der Phase I. Dieser
induziert eine wtp53- und E2F1-abhängige Apoptose in Zellen der AML und ALL
(Kojima et al., 2010).
Mit Hilfe der Kristallstruktur des p53-Mdm2-Komplexes wurden die Spirooxidole
MI-43, MI-63, MI-219 und MI-319 identifiziert (Ding et al., 2005, 2006; Mohammad et
al., 2009; Shangary et al., 2008a; Sosin et al., 2012). Diese ahmen die Bindestellen
8
Einleitung
von p53 nach und binden selektiv an Mdm2. Ähnlich Nutlin-3a führte die Behandlung
mit den Spirooxidolen zu einer Akkumulation von wtp53 sowie zur Induktion von
Apoptose in Tumorzellen, nicht aber in Normalgewebe (Canner et al., 2009;
Mohammad et al., 2009; Shangary et al., 2008a, 2008b). Ein weiterer Inhibitor der
p53-Mdm2-Interaktion ist TDP665759, welcher in Kombination mit Doxorubicin
Tumore
in
vivo
sensitiviert
(Koblish
et
al.,
2006).
Zudem
wurde
der
p53-MdmX-Inhibitor SJ-172550 identifiziert, welcher additive zytotoxische Effekte in
Kombination mit Nutlin-3a zeigte (Reed et al., 2010). Jedoch zeigt dieser Inhibitor
eine hohe Aktivität gegenüber Thiolresten, wodurch der Inhibitor aus der weiteren
Entwicklung ausgeschlossen wurde (Wade et al., 2013).
Ein weiteres Molekül, welches die p53-Mdm2-Interaktion inhibiert, ist das ThiophenDerivat RITA (reactivation of p53 and induction of tumor cell apoptosis, NSC652287).
Im Gegensatz zu den bisher genannten Inhibitoren bindet RITA direkt an p53,
wodurch eine Aktivierung von wtp53 induziert wird (Issaeva et al., 2004). Im
Vergleich zu einer Behandlung mit Nutlin-3 führt die RITA-induzierte Aktivierung von
wtp53 vorwiegend zur Induktion von pro-apoptotischen Genen (Enge et al., 2009).
Zudem konnte kürzlich gezeigt werden, dass Mdm2-Inhibitor-resistente Tumorzellen
durch eine Behandlung mit RITA sensitiviert werden können (Jones et al., 2012).
Dabei handelte es sich um mtp53 exprimierende Lymphomzellen. Neben der wtp53
aktivierenden Eigenschaften von RITA wurde kürzlich die Fähigkeit zur Reaktivierung
von mtp53 nachgewiesen (Zhao et al., 2010a). CP-31398 zeigte ähnliche
tumorsuppressive Eigenschaften, wobei eine thermodynamische Stabilisierung des
mtp53 Proteins durch die Substanz postuliert wurde (Foster et al., 1999). Weiterhin
konnte die selektiv in mtp53-exprimierenden Zellen wirksame Substanz RETRA
identifiziert werden (Kravchenko et al., 2008). RETRA unterbindet die Interaktion von
mtp53 mit p73, wodurch eine p73-abhängig Apoptose induziert wurde (Kravchenko
et al., 2008). Als einzige mtp53 reaktivierende Substanz in der klinischen Phase
(Phase I) ist PRIMA-1 (APR-246). PRIMA-1 restauriert die transkriptionelle Aktivität
von mtp53 und induziert Apoptose in Abhängigkeit von mtp53 (Bykov et al., 2002).
Dabei zeigte die Substanz keine toxischen Effekte auf Normalgewebe.
Zentral sowohl bei der Aktivierung von wtp53 als auch bei der Reaktivierung von
mtp53 ist die Induktion von Apoptose über das Mitochondrium.
Einleitung
9
1.3 Die Bcl-2-Proteinfamilie
Funktionell gruppieren sich die Mitglieder der Bcl-2-Familie in anti- und proapoptotische Proteine. Durch Struktur- und Sequenzanalysen konnten bisher sechs
humane anti-apoptotische Bcl-2-Proteine, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, Bcl-B und A1,
identifiziert werden (Czabotar et al., 2013). Diese interagieren direkt mit den proapoptotischen
Proteinen
und
inhibieren
deren
Funktion.
Pro-apoptotische
Familienmitglieder untergliedern sich in Effektoren und BH3-only-Proteine. BAX und
BAK, die pro-apoptotischen Effektoren, können durch Oligomerisierung Poren bilden,
wodurch die Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran sowie die
Aktivierung von Caspasen induziert wird (Westphal et al., 2014). Die BH3-only
Proteine NOXA, PUMA, BIM, BID, BAD, BMF, HRK und BIK binden über die
BH3-Domäne, eine amphiphatische α-Helix, in die hydrophobe Bindetasche der antiapoptotischen Bcl-2-Proteine (Sattler et al., 1997). Ungeachtet der strukturellen
Ähnlichkeiten der BH3-only-Proteine existieren Bindungspräferenzen der BH3-onlyProteine an anti-apoptotische Bcl-2-Proteine. BIM, BID und PUMA können hierbei an
alle anti-apoptotischen Proteine binden, wobei zudem eine direkte Interaktion mit
BAX und BAK beschrieben wurde (Elkholi et al., 2011). Im Gegensatz hierzu bindet
NOXA präferentiell an Mcl-1, BAD an Bcl-2 und Bcl-xL (Ghiotto et al., 2010).
Daraus ergeben sich komplexe Interaktionen zwischen den pro- und antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitgliedern, welche die Aktivierung von BAX und BAK
und damit die Induktion von mitochondrialer Apoptose regulieren. Um diese Prozesse
zu beschreiben, wurden verschiedene Modelle der Aktivierung von BAX und BAK
postuliert. Im „direct activation“-Modell werden die BH3-only-Proteine in Aktivatoren
(tBID, BIM, PUMA) und Sensibilisatoren (z.B. NOXA, BAD) unterteilt (Letai et al.,
2002). Die Aktivatoren binden dabei sowohl an Effektoren als auch an antiapoptotischen Bcl-2-Proteine. Sensibilisatoren binden spezifisch an anti-apoptotische
Proteine, wodurch die Aktivatoren freigesetzt werden und anschließend BAX und
BAK aktivieren können (Shamas-Din et al., 2011).
Im Gegensatz hierzu können im „indirect activation“-Modell BAX und BAK nicht direkt
von BH3-only-Proteinen aktiviert werden. Nach einem apoptotischen Stimulus erfolgt
die Aktivierung der BH3-only-Proteine sowohl auf transkriptioneller als auch auf posttranslationaler Ebene. Diese binden anschließend an die in einem Komplex mit BAX
und BAK befindlichen anti-apoptotischen Bcl-2-Proteine. BAX und BAK werden
10
Einleitung
dadurch freigesetzt und induzieren MOMP. Die Induktion von Apoptose erfolgt somit
ausschließlich durch die Inhibition der anti-apoptotischen Bcl-2-Proteine durch BH3only-Proteine (Strasser et al., 2011).
Nach heutiger Ansicht führt ein apoptotischer Stimulus meist zu einer Kombination
der „direct activation“ und „indirect activation“ Modelle. Dies führte zur Postulation
des „unified“ Modells (Llambi et al., 2011). Hierbei binden die anti-apoptotischen
Proteine nicht nur an die Aktivatoren der BH3-only-Proteine, sondern auch an die
Effektoren BAX und BAK. In gesunden Zellen befinden sich BAX (zytosolisch) und
BAK (mitochondrial) in einem inaktiven Zustand, wobei keine anti-apoptotischen
Bcl-2-Proteine gebunden sind. Nach einem apoptotischen Stimulus erfolgt die
Bildung und Aktivierung von BH3-only-Proteinen, welche die anti-apoptotischen
Proteine mit hoher Affinität binden und zudem zur direkten Aktivierung von BAX und
BAK führen (Llambi et al., 2011).
Einleitung
11
1.4 Ziele der Arbeit
Der Erfolg einer Tumortherapie hängt entscheidend von der Sensitivität der
Tumorzellen gegenüber dem Therapeutikum ab. Cisplatin, eine klassische DNAschädigende
Substanz,
zeigt
in
verschiedenen
Tumoren
unterschiedliche
Wirksamkeiten. Testikulären Keimzelltumoren zeichnen sich durch eine hohe
Sensitivität
gegenüber
dem
Chemotherapeutikum
aus.
Hingegen
zeigen
Ovarialkarzinome eine initial hohe Sensitivität gegenüber Cisplatin, an welche häufig
eine vollständige Cisplatin-Resistenz anschließt. Die Tumore unterscheiden sich
fundamental in ihrem p53-Status, da testikuläre Keimzelltumore vorwiegend wtp53,
Ovarialkarzinome überwiegend mtp53 exprimieren. Zudem führt die Aktivierung von
p53 in beiden Tumorarten zu unterschiedlichen Effekten. Wtp53 gilt als zentrale
Vermittler der Chemosensitivität in Keimzelltumoren. In hochgradig serösen
Ovarialkarzinomen zeigt sich eine initial hohe Sensitivität gegenüber Cisplatin. Nach
einigen Monaten platin-basierter Chemotherapie treten jedoch vermehrt Resistenzen
auf. Bisher ist unklar, welche Rolle der p53-Status für die Sensitivität gegenüber der
Aktivierung von p53 hat. In der vorliegenden Arbeit wurde Cisplatin als typischer p53Aktivator nach DNA-Schädigung verwendet um die Rolle des p53-Status näher zu
untersuchen. Um eine direkte Aktivierung von p53 zu induzieren wurden zudem die
Inhibitoren der p53-Mdm2-Interaktion Nutlin-3 und RITA in die Studie miteinbezogen.
Im Einzelnen wurden folgende Fragestellungen bearbeitet:
 Wie unterscheidet sich die Sensitivität von Tumorzellen mit unterschiedlichem
p53-Status sowie von Tumor-assoziierten Fibroblasten aus der humanen
Lunge und PBMNCs von gesunden Donoren gegenüber den p53-Aktivatoren
Nutlin, RITA und Cisplatin?
 Welche typischen p53-Zielgene werden durch Nutlin, RITA und CisplatinBehandlung in der Zelllinienauswahl aktiviert? Inwiefern unterscheiden sich
hier Zelllinien mit wtp53 von denen mit defektem p53?
 Korreliert die Regulation der p53-Zielgene mit dem p53-Status oder mit der
Sensitivität gegenüber Nutlin-3-, RITA- oder Cisplatin-Behandlung?
 Welche Mechanismen führen zur Sensitivierung der Zellen gegenüber
Nutlin-3, RITA und Cisplatin in Abhängigkeit vom p53-Status?
12
Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1 Zellkulturtechnik
2.1.1 Verwendete Zelllinien
Für diese Arbeit wurde mit Tumorzelllinien aus verschiedenen Entitäten gearbeitet,
welche in Tabelle 2.1 aufgelistet sind.
Tabelle 2.1: Verwendete Tumorzellinien
Zelllinie
Entität
NTERA-2D1
Herkunft
embryonales
LGC Standards
Hodenkarzinom
embryonales
Dr. T. Müller,
Hodenkarzinom
Universität Halle
A549
Bronchialkarzinom
ATCC
H460
Bronchialkarzinom
ATCC
H23
Bronchialkarzinom
ATCC
Calu-1
Bronchialkarzinom
ATCC
A2780
Ovarialkarzinom
NCI-60
IGROV1
Ovarialkarzinom
NCI-60
OVCAR3
Ovarialkarzinom
NCI-60
OVCAR4
Ovarialkarzinom
NCI-60
OVCAR5
Ovarialkarzinom
NCI-60
OVCAR8
Ovarialkarzinom
NCI-60
SKOV3
Ovarialkarzinom
NCI-60
TOV-112D
Ovarialkarzinom
ATCC
2102EP
2.1.2 Kulturmedium, Zusätze und Kulturbedingungen
Für die
Kultivierung der Zelllinien,
ausgenommen
der Ovarialkarzinomlinie
TOV-112D, wurde RPMI1640-Medium verwendet, welches mit 10% FCS (v/v)
supplementiert
wurde.
Weiterhin
wurde
ein
Gemisch
aus
verschiedenen
Zusatzstoffen, welche nachfolgend aufgelistet sind, dem Medium zugesetzt.
Material und Methoden
RPMI1640-Medium
13
Biochrom AG, Berlin
Zusatzstoffe à 500 ml RPMI-Medium:
10 % (v/v) FCS (fetales Kälberserum)
Gibco, Karlsruhe
0,1 g/l Penicillin/Streptomycin (je 10000 Units)
Gibco, Karlsruhe
1 mM Natriumpyruvat
Gibco, Karlsruhe
2 mM L-Glutamin
Biochrom AG, Berlin
3 ml 100 x nicht- essentielle Aminosäuren
Biochrom AG, Berlin
0,05 mM 2-Mercaptoethanol
Merck, Darmstadt
10 mM HEPES (2-(4-Hydroxyethyl)-1-
Merck, Darmstadt
piperazinyl)ethanolsulfonsäure), pH 7,4
0,13 mM L-Asparagin
Serva, Heidelberg
Die Ovarialkarzinomlinie TOV-112D wurde in einer 1:1-Mischung der Medien
MCDB105 und Medium199 kultiviert. Das MCDB105 Medium wurde zuvor mit
1,5 g/l NaHCO3 und das Medium 199 mit 2,2 g/l NaHCO3 supplementiert.
Abschließend wurde der Medienmischung 15% FCS zugefügt.
MCDB Medium
Tebu-Bio, Offenbach
Medium 199
Biochrom AG, Berlin
Die Kultivierung der Zellen erfolgte bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2 im
CO2-Inkubator. Die regelmäßige Passagierung der Zellen sowie deren Kultivierung
für Versuche wurden unter der Sterilbank durchgeführt. Zur Passagierung der Zellen
wurde das vorhandene Medium verworfen und mit 1xPBS nachgespült. Die
adhärenten Zellen wurden durch Trypsin/EDTA abgelöst. Die Reaktion des Trypsins
wurde durch Zugabe des entsprechenden Mediums gestoppt. Nach einem
Zentrifugationsschritt (RT, 1400 rpm, 5 min) wurden die Zellen in einer definierten
Menge an Medium aufgenommen und die Lebendzellzahl bestimmt.
14
Material und Methoden
CO2-Inkubator
Heraeus, Hanau
Sterilbank LaminAir HB2472
Corning, USA
Sterile Pipetten
Corning, USA
50 ml Polypropylenröhrchen, FALCON
Becton Dickinson, USA
Trypsin/EDTA
Gibco, Karlsruhe
PBS
Biochrom AG, Berlin
2.1.3 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels Trypanblaufärbung
Trypanblau ist ein anionischer Diazofarbstoff, welcher nur in toten Zellen akkumuliert.
Lebende Zellen bleiben ungefärbt.
Für die Bestimmung der Lebendzellzahl wurde Trypanblau (1:10 in PBS) und die
Zellsuspension im Verhältnis 1:10 vermischt und die Anzahl der vitalen Zellen mit
Hilfe einer Neubauer-Zählkammer unter dem Hellfeldmikroskop bestimmt.
Zellzahl
Anzahl ausgezählter Großquadrate
=
Zellzahl
x
Vedünnungsfaktor x 10
4
=
ml
Trypanblau 0,5% (w/v)
Biochrom AG, Berlin
Neubauer-Zählkammer
Roth, Karlsruhe
Hellfeldmikroskop
Zeiss, Jena
2.1.4 Kryokonservierung und Rekultivierung
Um genetische Veränderungen durch Selektionsprozesse innerhalb der Zellkultur zu
vermeiden, wurden die Zelllinien in Abständen von vier Monaten neu in Kultur
genommen.
Für die Kryokonservierung wurde eine definierte Zellmenge in 1 ml FCS mit
10% DMSO resuspendiert und das gesamte Volumen in ein Kryo-Röhrchen
überführt. Dieses wurde in eine mit 99,9% Isopropanol befüllte Einfrierbox gestellt
und für 24 h bei -80°C tiefgefroren. Anschließend wurden die Zellen in flüssigem
Stickstoff dauerkonserviert.
Material und Methoden
15
Die Rekultivierung erfolgte, indem dauerkonservierte Zellen im Wasserbad bei 37°C
angetaut und in ein steriles 50 ml Polypropylen Röhrchen überführt wurden. Die
Zellen wurden anschließend in RPMI-Medium aufgenommen und bei RT, 1400 rpm
für 5 min zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in entsprechendem Medium
resuspendiert und die Zellsuspension zur Kultivierung in Zellkulturflaschen überführt.
DMSO
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
5100 Cryo 1°C Einfrierbox ‚Mr. Frosty‘
Nalgene Nunc International
1,8 ml Cryo Tube TM
Nalgene Nunc International
2.2 Kultur von primärem Zellmaterial
2.2.1 Isolation von PBMNCs
Die Isolation von peripherial blood mononuclear cells (PBMNCs) erfolgte durch eine
Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation aus Vollblut. Dabei bildet sich ein Zellsediment
aus Erythrozyten und Granulozyten, ein Überstand aus Plasma und Thrombozyten
und eine Interphase, welche die PBMNCs enthält. Rechtlich abgedeckt wurde die
Verwendung von PBMNCs durch ein Ethikvotum (#035-06-f).
Für die Isolation wurde EDTA-Blut 1:1 mit 1xPBS verdünnt. 25 ml Ficoll wurden nun
mit 25 ml Blut/PBS vorsichtig überschichtet. Anschließend erfolgte die Zentrifugation
mit niedrigster Beschleunigung und ohne Bremse (RT, 300 rpm, 25 min). Die
Interphase wurde in ein neues Gefäß überführt und erneut zentrifugiert (RT,
1400 rpm, 5 min). Abschließend wurde das Zellpellet in 1xPBS aufgenommen und
die Zellzahl bestimmt. Für die Versuche wurden 1·106 Zellen/ml ausgesät. Die
Stimulation der PBMNCs erfolgte durch Phytohämagglutinin-L (PHA-L) in einer
Konzentration von 2,5 µg/ml.
EDTA-S-Monovette® K3E (9 ml)
Sarstedt, Nümbrecht
BIOCOLL Separating Solution (Ficoll)
Biochrom AG, Berlin
Phytohämaaglutinin-L
Roche, Mannheim
16
Material und Methoden
2.2.2 Isolation Tumor-assoziierter Fibroblasten
Für
die
Isolation
von
Tumor-assoziierten
Fibroblasten
wurde
frisches
Lungentumorgewebe verwendet. Rechtlich abgedeckt wurde die Verwendung von
frischem
Tumormaterial
durch
ein
Ethikvotum
(#159/2011BO2)
und
eine
Einverständniserklärung der Patienten. Nach der mechanischen Zerkleinerung des
Gewebes wurde dieses enzymatisch verdaut, wofür Cell Rinse-Puffer (120 mmol/L
NaCl, 5,6 mmol/L Glucose, 2,5 mmol/L MgCl2 x 6H20, 5,4 mmol/L KCl, 1mmol/L
NaH2PO4, 20 mmol/L HEPES, pH 7,2), supplementiert mit Kollagenase (167 U/ml)
und DNase (250 U/ml), zugesetzt wurde. Nach 90 minütiger Inkubation bei 37°C
wurde das Gewebe über ein Zellsieb mit einer Porengröße von 70 μm filtriert, um die
Zellen zu vereinzeln. Anschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert (RT, 1400
rpm, 5 min), das Zellpellet in RPMI1640 Medium mit 10% FCS aufgenommen und
zur Kultivierung in Zellkulturflaschen überführt. Die Kultivierung erfolge bei 37°C und
5% CO2. Um sicherzustellen, dass nur adhärierte Zellen weiterkultiviert werden,
wurde das Medium nach 24 h abgesaugt, die Zellen mit 1x PBS gewaschen und
frisches Medium zugegeben. Nach der Expansion der Fibroblasten erfolgte die
Dauerkonservierung der Zellen in flüssigem Stickstoff. Nach dem Auftauprozess
wurden die Fibroblasten erneut expandiert und in Passage 6 mit Cisplatin, Nutlin-3
oder RITA behandelt.
MgCl2
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
NaH2PO4
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
DNase (250 U/ml)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Kollagenase (167 U/ml)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Protease (0,25 mg/ml)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Cell Strainer 70 μm
Becton Dickinson, USA
2.3 Reagenzien
2.3.1 Induktion von genotoxischem Stress
Genotoxischer Stress wurde auf die Zellen durch die Zugabe von Cisplatin
(cis-Diammindichloridoplatin(II)) ausgeübt. Cisplatin führt in seiner aktiven Form zur
Quervernetzung des DNA-Doppelstrangs, wodurch die Replikation und Transkription
Material und Methoden
17
gehemmt wird. Die Behandlung der Zellen erfolgte mit einer Cisplatinkonzentration
von 10 µM.
Cisplatin 1mg/ml
Apotheke Robert-Bosch-Krankenhaus, Stuttgart
2.3.2 Inhibiton der p53-Mdm2 Interaktion
Nutlin-3, ein cis-Imidazol-Analogon, bindet an Mdm2 und unterbindet so die
Interaktion von Mdm2 mit p53 (Vassilev et al., 2004). Dadurch kommt zur
Stabilisierung von p53. Nutlin-3 wurde in einer Konzentration von 10 µM eingesetzt.
Nutlin- 3
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
2.3.3 Aktivierung von p53
Die direkte Induktion von p53 erfolgte durch RITA (2,5-bis(5-Hydroxymethyl-2thienyl)Furan).
RITA
bindet
an
den
N-Terminus
von
p53,
wodurch
eine
Konformationsänderung ausgelöst wird. Diese verhindert die Interaktion mit Mdm2
(Issaeva et al., 2004). RITA wurde in einer Konzentration von 1 µM eingesetzt.
RITA
Biozol, Eching
2.3.4 Inhibition der Caspaseaktivität
Caspasen sind Cysteinproteasen, welche durch die Induktion von Apoptose aktiviert
werden.
Die Hemmung dieser Proteasen erfolgte mit dem pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-FMK
(Carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]-fluoromethylketone). Dieser bindet
irreversibel an das katalytische Zentrum der Proteasen. Der Inhibitor wurde in einer
Konzentration von 50 µM eingesetzt.
z-VAD-FMK
Bachem, Bubendorf (CH)
18
Material und Methoden
2.3.5 Inhibition anti-apoptotischer Bcl-2-Proteine
ABT-737 ist ein zellpermeables Nitrophenylsulfonylbenzamid, welches die antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie, Bcl-2, Bcl-xL und Bcl-w, hochaffin binden
kann (Oltersdorf et al., 2005). ABT-737 wurde in einer Konzentration von 1 µM
eingesetzt.
ABT-737
ChemieTek, USA
2.3.6 Inhibition des MAPK-Signaltransduktionsweges
Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) können prinzipiell in drei Untergruppen,
ERKs (extracellular-signal-regulated kinases), JNKs (Jun amino-terminal kinases),
und p38 MAPKs (stress-activated protein kinases) unterteilt werden (Morrison, 2012).
Insbesondere JNK und p38 besitzen pro-apoptotische Funktionen.
Die Inhibition von JNK erfolgte durch SP600125, die von p38 durch den p38-MAPKinase-Inhibitor III. SP600125 wurde in einer Konzentration von 5 µM eingesetzt, der
p38-MAP-Kinase-Inhibitor III in einer Konzentration von 1 µM.
p38-MAP-Kinase-Inhibitor III
SP600125
Calbiochem, USA
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
2.3.7 Inhibition des Proteasoms
Bortezomib ist ein borsäurehaltiges Dipeptid, welches an das 26S Proteasom bindet
und dieses in seiner Aktivität hemmt. Dadurch werden p53 sowie andere Proteine,
welche proteasomal degradiert werden, akkumuliert. Bortezomib wurde in einer
Konzentration von 20 nM eingesetzt.
Bortezomib
Toronto Research Chemicals (TRC), Kanada
Material und Methoden
19
2.4 Zellanalyse mit Hilfe des Durchflusszytometers (FACS)
Das
für
diese
Arbeit
verwendete
Durchflusszytometer
detektiert
das
Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FSC), das Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSC)
und vier verschiedene Fluoreszenzspektralbereiche (FL 1-4).
Fluorescence Activated Cell Analyzer ‚FACSCalibur‘
Becton Dickinson, USA
Laser:
luftgekühlter Argon-Ionen Laser: 488 nm
roter Diodenlaser: 635 nm
Detektoren/Filter:
530 nm (Kurzpassfilter)
585 nm (Kurzpassfilter)
661 nm (Kurzpassfilter)
670 nm (Langpassfilter)
Software:
CELLQuestTM Pro Software
Becton Dickinson, USA
2.4.1 Nachweis von Zelltod mittels AnnexinV-FITC/PI-Färbung
Während
des
apoptotischen
Prozesses
kommt
es
zu
charakteristischen
Veränderungen innerhalb der Zellen, wie zum Verlust der Membransymmetrie,
welche schon in frühen apoptotischen Stadien auftritt. Dabei wird das Phospholipid
Phosphatidylserin von der inneren auf die äußere Membranseite transloziert.
AnnexinV, ein 35-36 kDa großes, Ca2+-abhängiges Phospholipidbindeprotein, hat
eine hohe Affinität zu Phosphatidylserin. Durch die Konjugation von FluoreszeinIsothiocyanat
(FITC)
an
AnnexinV
wird
die
Bindung
des
Proteins
an
Phosphatidylserin messbar.
In späten apoptotischen Stadien oder in nekrotischen Zellen kommt es zu einem
Verlust der Membranintegrität. Um diese Phänomene von frühen apoptotischen
Stadien zu differenzieren wird neben AnnexinV-FITC, Propidiumiodid (PI) zur
Färbung eingesetzt. Zellen mit intakter Membran schließen PI aus, wohingegen der
Verlust der Membranintegrität zur Aufnahme von PI führt. PI interkaliert in die
Nukleinsäuren der Zelle und färbt spät-apoptotische oder nekrotische Zellen an.
20
Material und Methoden
Für die Versuche wurden die Zellen durch Trypsinieren geerntet und pelletiert (5 min,
1400 rpm, RT). Nach sukzessiven Waschschritten in PBS und Annexin-Bindepuffer
(ABP; 0,1 M HEPES/NaOH pH7,4, 1,4 M NaCl, 25 mM CaCl2) wurde das Zellpellet in
100 µl AnnexinV-FITC-Färbelösung (5% (v/v) AnnexinV-FITC, 2,5% (v/v) PI-Lösung
(Stammlösung 50 µg/ml), 92,5% (v/v) ABP) aufgenommen und für 10 min im Dunkeln
inkubiert. Anschließend wurden 400 µl ABP zugegeben und die Zellen im FACS
analysiert.
AnnexinV-FITC
BD PharMingen, USA
Propidiumiodid Stammlösung (1 mg/ml)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
2.4.2 Nachweis von Zelltod mittels TMRM-Färbung
TMRM
(Tetramethylrhodaminmethylester
Perchlorat)
ist
ein
anionischer,
membranpermeabler Farbstoff, durch welchen Veränderungen des mitochondrialen
Membranpotentials nachgewiesen werden können. Der Farbstoff akkumuliert an der
positiv geladenen, äußeren mitochondrialen Membran intakter Zellen. Durch die
Induktion
von
Zelltod
Membranpotentials,
kommt
wodurch
es
zu
einem
Verlust
des
mitochondrialen
TMRM
nicht
mehr
akkumulieren
kann
(Elmore et al., 2004).
Für die Färbung wurden die Zellen trypsiniert, pelletiert und anschließend mit 50 nM
TMRM in 500 µl 1x PBS für 20 min bei 37°C inkubiert. Die Messung erfolgte am
Durchflusszytometer.
TMRM (Tetramethylrhodaminmethylester Perchlorat)
Molecular Probes, USA
2.4.3 Zellzyklusanalyse mittels BrdU-Proliferationsassay
Mit
Hilfe
der
Messung
des DNA-Gehalts
ist
es möglich,
die
einzelnen
Zellzyklusstadien zu analysieren. Durch den Farbstoff Propidiumiodid, welcher sich in
doppelsträngige Nukleinsäuren einlagert, kann der DNA-Gehalt einer Zelle bestimmt
werden. Apoptotische Zellen verlieren Teile der DNA-Fragmente und inkorporieren
auf Grund dessen weniger PI. Dieser Zustand wird auch als SubG1 bezeichnet.
Material und Methoden
21
Um neben dem DNA-Gehalt auch die Synthese von DNA nachweisen zu können,
wurden die Zellen 45 min vor der Ernte mit BrdU versetzt. BrdU ist ein Uridinderivat,
welches während der S-Phase anstelle von Thymidin in die DNA eingebaut werden
kann. Der Einbau von BrdU wurde durch die Zugabe eines Fluorochrom-markierten
anti-BrdU-Antikörpers nachgewiesen.
Die SubG1-Phase enthält die Zellen, die BrdU negativ sind und weniger als 2N DNA
besitzen.
In
der
Chromosomensatz
G1-Phase
besitzen
befinden
aber
BrdU
sich
Zellen,
negativ
sind,
die
da
einen
sie
einfachen
keine
DNA
synthetisieren. In der S-Phase findet die Replikation des Chromosomensatzes statt.
Auf Grund dessen wird BrdU in den neu gebildeten DNA Doppelstrang eingebaut.
Zellen in der S-Phase sind dementsprechend BrdU positiv und haben einen DNA
Gehalt der zwischen 2N und 4N liegt. Zellen mit einem doppelten Chromosomensatz
befinden sich in der G2-Phase. Sie sind BrdU negativ, da die DNA-Synthese
abgeschlossen ist und die Zellen in die Mitosephase eintreten können.
Für den Versuch wurden die Zellen nach der Inkubationszeit mit BrdU durch
Trypsinieren geerntet, zentrifugiert (5 min, 1400 rpm, RT) und das Pellet mit 1 ml
-20°C kaltem 70% (v/v) Ethanol über Nacht fixiert. Nach erneutem Pelletieren (5 min,
900 rpm, RT) der Zellen wurden diese zur Denaturierung mit 1 ml 2N HCl für
30 min inkubiert, erneut zentrifugiert und mit 0,1 M Boraxlösung neutralisiert.
Anschließend folgten mehrere Waschschritte mit einer PBS/BSA/Tween-Lösung (1%
(v/v) BSA, 0,5% (v/v) Tween). Daraufhin wurde das Zellpellet mit dem Anti-BrdUAntikörper für 30 min bei 4°C inkubiert. Der Sekundärantikörper, welcher mit FITC
markiert ist, wurde nach einem erneuten Waschschritt für 30 min bei 4°C zu den
Zellen gegeben. Nach einem weiteren Waschschritt in Glucose/PBS wurden die
Zellen in PI-Färbelösung (5% (v/v) PI-Lösung (Stammlösung 1mg/ml), 1% RNase A
(Stammlösung 100 mg/ml), 95% (v/v) PBS) aufgenommen. Die darin enthaltene
RNase A dient zum Verdau der RNA und verhindert so deren störende Färbung.
Nach einer Inkubationszeit von 10 min wurden die Zellen am FACS vermessen.
22
Material und Methoden
BrdU
Sigma-Aldrich, Steinheim
Anti-BrdU- Antikörper
GAM-FITC Sekundärantikörper
Becton Dickinson, USA
Dianova, Hamburg
Tween 20
Merck, Darmstadt
Ethanol
Merck, Darmstadt
Glucose
Sigma-Aldrich, Steinheim
Propidiumiodid
Sigma-Aldrich, Steinheim
RNase A
Qiagen, Hilden
2.5 High-throughput qPCR mit Hilfe des BioMarkTM-HD-Systems
2.5.1 Generierung von RNA
Zur Generierung von RNA wurden die Zellen trypsiniert, pelletiert (4°C, 1400 rpm,
5 min) und anschließend mit dem mirVana miRNA Isolation Kit nach Angaben des
Herstellers aufgereinigt.
mirVana miRNA Isolation Kit
Ambion, USA
2.5.2 Spektrometrische Quantifizierung von RNA
Die Quantifizierung der isolierten Ribonukleinsäuren erfolgte durch Messung der
Absorption im ultravioletten Spektralbereich. Zur Konzentrationsbestimmung wurde
die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Eine OD von 1
entsprach hier einer Konzentration von 40 µg/ml RNA. Zudem konnte durch eine
zusätzliche Messung der Absorption bei 280 nm die Reinheit des Isolats bestimmt
werden. Befand sich der Wert des Quotienten aus OD260 und OD280 im Bereich 1,8
bis 2, so war das Isolat von ausreichend hoher Reinheit. Niedrigere Werte weisen auf
Protein- oder Phenolkontaminationen hin. Höhere Werte hingegen zeugen von einem
hohen Anteil an denaturierter DNA.
NanoDrop Spectrophotometer Peqlab
ND-100
Biotechnologie GmbH, Erlangen
Material und Methoden
23
2.5.3 cDNA Synthese
Die isolierte RNA wurde mit Hilfe des RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit in
DNA überschrieben. Als Primer wurden Oligo(dT) Primer verwendet. Von jeder RNAIsolation wurde 250ng RNA eingesetzt.
RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit
Fermentas, USA
Mastercycler Gradient
Eppendorf, Hamburg
2.5.4 qPCR mit dem BioMarkTM-HD-System
Die Genexpressionsanalyse erfolgte durch das BioMarkTM-HD-System, welches die
Möglichkeit bietet, entweder 48 Gene und 48 Proben oder 96 Gene und 96 Proben
simultan zu messen.
Um eine spezifische Anreicherung der Gene zu erreichen, wurde zunächst eine
specific target amplification (STA) durchgeführt, wofür ein Gemisch der verwendeten
TaqMan® Gene Expression Assays hergestellt wurde. Die verwendeten Assays für
das 48x48 System sind in Tabelle 2.2 aufgelistet.
Tabelle 2.2: Verwendete TaqMan® Gene Expression Assays im 48x48 Format
Genname Assay Nummer
Genname
Assay Nummer
1
ABCB1
Hs01067802_m1
24 HGF
Hs00300159_m1
2
AIFM2
Hs01097300_m1
25 hTERT
Hs00972656_m1
3
APAF1
Hs00559441_m1
26 IER3
Hs00174674_m1
4
ATF3
Hs00231069_m1
27 IGFBP3
Hs00426287_m1
5
BAX
Hs00180269_m1
28 LRDD
Hs00388035_m1
6
BBC3
Hs00248075_m1
29 Mdm2
Hs00234753_m1
7
Bcl-2
Hs00608023_m1
30 Mdm4
Hs00159092_m1
8
Bcl-xl
Hs00236329_m1
31 Met
Hs01565584_m1
9
BID
Hs00609632_m1
32 P53AIP1
Hs00986095_m1
10
BTG2
Hs00198887_m1
33 PCNA
Hs00696862_m1
11
CD95
Hs00531110_m1
34 PMAIP1
Hs00560402_m1
12
CDC25C
Hs00156411_m1
35 RB1
Hs01078066_m1
13
CDK1
Hs00938777_m1
36 TBP
Hs00427620_m1
14
CDKN1A
Hs00355782_m1
37 TNFRSF10A
Hs00269492_m1
15
CGNG1
Hs00171112_m1
38 TNFRSF10B
Hs00366278_m1
24
Material und Methoden
16
c-myc
Hs00905030_m1
39 TNFRSF10C Hs00182570_m1
17
Cyclin B1
Hs01030097_m1
40 TNFRSF10D Hs00388742_m1
18
CyclinA
Hs00996788_m1
41 TP53
Hs01034249_m1
19
CyclinK
Hs00171095_m1
42 TP53i3
Hs00153280_m1
20
EGFR
Hs01076078_m1
43 TP53INP1
Hs01003820_m1
21
FasL
Hs00181225_m1
44 TP63
Hs00978340_m1
22
Fos
Hs00170630_m1
45 TP73
Hs01056230_m1
23
GADD45α Hs00169255_m1
46 ZMAT3
Hs00536976_m1
Für das 96x96 Format wurden die in Tabelle 2.3 aufgelisteten TaqMan® Gene
Expression Assays verwendet.
Tabelle 2.3: Verwendete TaqMan® Gene Expression Assays im 96x96 Format
Genname Assay Nummer
Genname
Assay Nummer
1
ALOX12
Hs00911144_m1
48 HSP90AA1 Hs00743767_sH
2
ATF2
Hs01095345_m1
49 HSPA4
Hs00382884_m1
3
ATF4
Hs00909569_g1
50 HSPA5
Hs99999174_m1
4
ATF6
Hs00232586_m1
51 HSPB2
Hs00155436_m1
5
ATG12
Hs00740818_m1
52 Jun
Hs99999141_s1
6
ATG5
Hs00355492_m1
53 JunD
Hs04187679_s1
7
ATG7
Hs00197348_m1
54 KLF6
Hs00810569_m1
8
ATM
Hs00175892_m1
55 MAFF
Hs00544822_m1
9
ATR
Hs00169878_m1
56 MAPK8
Hs00177083_m1
10 BAD
Hs00188930_m1
57 Mcl1
Hs01050896_m1
11 BAK
Hs00940250_g1
58 MLH1
Hs00179866_m1
12 BCL2A1
Hs00187845_m1
59 MSH2
Hs00954125_m1
13 Bcl2L13
Hs00209787_m1
60 NLRP2
Hs00215284_m1
14 Bcl2L14
Hs00373302_m1
61 NOS2A
Hs01075523_m1
15 Bcl2L2
Hs00187848_m1
62 NQO1
Hs00168547_m1
16 BECN1
Hs01011599_m1
63 Oas1
Hs00973635_m1
17 BIK
Hs00154189_m1
64 P2RY13
Hs01090437_g1
18 BIRC2
Hs01112284_m1
65 PARP1
Hs00242302_m1
19 BLM
Hs00172060_m1
66 PLA2G6
Hs00185926_m1
20 BMF
Hs00372937_m1
67 PPP1R15A Hs00169585_m1
21 BNIP3
Hs00969289_m1
68 PRDX1
Hs00602020_mH
22 BRCA1
Hs01556185_m1
69 PVR
Hs00197846_m1
23 CDKN1B
Hs00153277_m1
70 RAD51
Hs00947968_m1
Material und Methoden
25
24 CFLAR
Hs01116281_m1
71 RIPK1
Hs00169407_m1
25 CHEK1
Hs00967506_m1
72 RPA1
Hs00161419_m1
26 Cyr61
Hs00155479_m1
73 RPRM
Hs04189060_s1
27 DDB2
Hs03044953_m1
74 RRM2B
Hs00968430_m1
28 DDIT3
Hs01090850_m1
75 Senp2
Hs00989699_m1
29 DNAJC3
Hs00534489_m1
76 SESN1
Hs00902787_m1
30 DUSP1
Hs00610256_g1
77 SFN
Hs00968567_s1
31 EDEM1
Hs00976004_m1
78 SHISA5
Hs00429977_m1
32 EDEM2
Hs01076556_m1
79 SIRT1
Hs01009005_m1
33 EGR1
Hs00152928_m1
80 SOD1
Hs00916176_m1
34 EPHB1
Hs00174725_m1
81 SOD2
Hs00167309_m1
35 ETS1
Hs00428293_m1
82 SQSTM1
Hs00177654_m1
36 FANCA
Hs01116661_m1
83 SUMO1
Hs02339311_g1
37 FANCD2
Hs00395700_m1
84 TBP
Hs00427620_m1
38 FANCG
Hs00184947_m1
85 TRAF1
Hs01090169_m1
39 FANCM
Hs00326216_m1
86 TRAF2
Hs00184192_m1
40 FEN1
Hs01099393_g1
87 TXN
Hs00828652_m1
41 FOSL1
Hs04187685_m1
88 XBP1(S)
Hs03929085_g1
42 FTH1
Hs01000476_g1
89 XBP1(U)
Hs02856596_m1
43 GRB2
Hs01074929_m1
90 XIAP
Hs00745222_s1
44 GSTP1
Hs00168310_m1
91 XPC
Hs01104213_m1
45 HIF1A
Hs00153153_m1
92 XRCC1
Hs00959834_m1
46 HMOX1
Hs01110250_m1
93 XRCC3
Hs00193725_m1
47 HRK
Hs01388767_g1
94 Zfp36
Hs00185658_m1
Anschließend wurde jede cDNA mit einem Anteil der vereinigten TaqMan ® Gene
Expression Assays und mit einem Anteil TaqMan PreAmp Master Mix (2x) versetzt.
Folgendes PCR-Programm wurde für die Amplifikationsreaktion verwendet:
 10 min bei 95°C
 14 Zyklen:
15 sec 95°C
4 min 60°C
Abschließend wurde die Genexpressionsanalyse mittels BioMarkTM-HD-System nach
Anleitung des Herstellers ausgeführt.
Die Auswertung der Daten erfolgte, indem zunächst die ΔΔCt-Werte aus Kontrolle
und Behandlung berechnet wurden. Als Referenzgen wurde das TATA box binding
26
Material und Methoden
protein
(TBP)
verwendet.
Anschließend
Genespring-12.5-GX-PA-Software
wurde
durchgeführt,
eine
Clusteranalyse
wobei
das
mittels
Euklidische
Ähnlichkeitsmaß verwendet wurde, welches mit einem Complete-Linkage-Verfahren
kombiniert wurde.
20x TaqMan® Gene Expression Assays
®
TaqMan PreAmp Master Mix (2x)
Applied Biosystems, USA
Applied Biosystems, USA
2x Assay Loading Reagent
Fluidigm, USA
20x GE Sample Loading Reagent
Fluidigm, USA
®
TaqMan Universal PCR Master Mix (2x)
TM
48.48 Dynamic Array
Applied Biosystems, USA
IFC
Fluidigm, USA
96.96 Dynamic ArrayTM IFC
Fluidigm, USA
IFC Controller MX
Fluidigm, USA
IFC Controller HX
Fluidigm, USA
BioMarkTM-HD-System
Fluidigm, USA
Genespring 12.5-GX-PA Software
Agilent Technologies, USA
2.6 Microarrayanalyse
Zur Bestimmung der globalen Genexpression wurde eine Microarrayanalyse mittels
GeneChip® Human Gene 2.0 ST Arrays durchgeführt. In drei unabhängigen
Experimenten wurden dafür OVCAR5 Zellen für 8 h Stunden mit RITA behandelt und
anschließend die RNA isoliert. Die Integrität der RNA wurde mittels RNA 6000 Nano
Kit überprüft. Die darauffolgende Durchführung des Microarrays erfolgte nach
Angaben des Herstellers.
Für die Datenauswertung wurden die Signalintensitäten mit Hilfe der Genespring
12.5-GX-PA-Software RMA normalisiert. Signifikante Unterschiede wurden mittels
gepaartem t-Test bestimmt und eine Signalwegsanalyse durchgeführt.
Material und Methoden
27
RNA 6000 Nano Kit
Agilent Technologies, USA
2100 Bioanalyzer
Agilent Technologies, USA
GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array (6 Arrays)
WT Expression Kit (10 reactions)
Affymetrix, USA
Ambion, USA
WT Terminal Labeling and Controls Kit (10 reactions)
Affymetrix, USA
GeneChip® Hybridization Wash and Stain Kit (30 reactions)
Affymetrix, USA
GeneChip® Fluidics Station 450Dx
Affymetrix, USA
®
Affymetrix, USA
®
GeneChip Hybridization Oven 645
Affymetrix, USA
GeneChip® Command Console® Software (AGCC)
Affymetrix, USA
GeneChip Scanner
2.7 Bestimmung des p53-Status der Zelllinien durch Sequenzierung
Für die Sequenzierung der TP53-Exons 4, 5, 6, 7, 8, 8-9 und 10 wurde zunächst aus
synthetisierter cDNA das TP53 Gen amplifiziert. Folgendes Primerpaar wurde dafür
verwendet:
p53 – sense:
5’- GTG ACA CGC TTC CCT GGA T -3’
p53 – antisense:
5’- CCA CAA CAA AAC ACC AGT GC -3’
Nach der elektrophoretischen Separation wurde das PCR-Fragment mittels QIAquick
Gel Extraction Kit aufgereinigt. Die Didesoxysequenzierreaktion erfolgte mit dem
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Beide Kits wurden nach Angaben
des Herstellers verwendet.
Folgendes PCR Programm wurde hierfür verwendet:
 2 min bei 95°C
 40 Zyklen:
30 sec bei 94°C
30 sec bei 60°C
30 sec bei 72 °C
 10 min bei 72°C
Anschließend erfolgte die Aufreinigung der Sequenzierreaktion mit Hilfe des
BigDye®XTerminatorTM Purification Kit nach Angaben des Herstellers.
28
Material und Methoden
Die Generierung der Daten erfolgte mittels 3500Dx-Genetic-Anaylzer und der
GeneMapper-v4.1-Software. Abschließend erfolgte die Analyse der Sequenz durch
die Software Chromas Lite 2.01.
QIAquick Gel Extraction Kit
Quiagen, Hilden
®
Applied Biosystems, USA
®
BigDye XTerminatorTM Purification Kit
Applied Biosystems, USA
3500Dx Genetic Anaylzer
Applied Biosystems, USA
GeneMapper v4.1 Software
Applied Biosystems, USA
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
Chromas Lite 2.01
Technelysium Pty. Ltd., Australien
2.8 RNA Interferenz
Um den Einfluss einzelner Faktoren auf die Induktion von Zelltod nach Cisplatinoder RITA-Behandlung zu untersuchen, wurden die Zellen liposomal mit siRNAs
transfiziert. Dafür wurden die Zellen zunächst in geringer Dichte ausgesät. Eine
Mischung aus vier siRNAs gegen ein Zielgen wurde anschließend in einem
bestimmten Verhältnis, optimiert für jede Zelllinie, in Opti-MEM I Reduced Serum
Medium verdünnt. Die Zelllinien OVCAR3, -4, -5 wurden mit einer siRNAEndkonzentration von 20 nM, NTERA-2D1 mit einer Endkonzentration von 15 nM
transfiziert. Die verwendeten siRNAs sowie deren Sequenzen sind in Tabelle 2.4
aufgeführt.
Material und Methoden
29
Tabelle 2.4: Sequenzen der verwendeten siRNAs
Genname
TP53
TP63
TP73
BAX
BAK
BID
BAD
PMAIP1 (NOXA)
BBC3 (PUMA)
ATF3
FOS
JUN
MAPK8 (JNK1)
Gensequenz
GAGGUUGGCUCUGACUGUA
GCACAGAGGAAGAGAAUCU
GAAGAAACCACUGGAUGGA
GCUUCGAGAUGUUCCGAGA
CAUCAUGUCUGGACUAUUU
CAAACAAGAUUGAGAUUAG
GCACACAGACAAAUGAAUU
CGACAGUCUUGUACAAUUU
GCAAGCAGCCCAUCAAGGA
GAGACGAGGACAAGUACUA
CUGCAGAACCUGACCAUUG
GGCCAUGCCUGUUUACAAG
ACAUGUUUUCUGACGGCAA
CAUUGGACUUCCUCCGGGA
CUGAGCAGAUCAUGAAGAC
GAACUGAUCAGAACCAUCA
CAACCGACGCUAUGACUCA
GCUUCGUGGUCGACUUCAU
CGACAUCAACCGACGCUAU
CAGAGAAUGCCUAUGAGUA
GCACCUACGUGAGGAGCUU
GCCAGAAGCUACUGCGAUG
GAGUAAGGGCACUGACGGA
UGCAAUACAUACCACGCUA
GCAACGCAGAUGCGGCAAA
CAGAGUUUGAGCCGAGUGA
GUGACGAGUUUGUGGACUC
GUUCCAGAUCCCAGAGUUU
GCAAGAACGCUCAACCGAG
CUGGAAGUCGAGUGUGCUA
AAUCUGAUAUCCAAACUCU
AAACUGAACUUCCGGCAGA
CGGACGACCUCAACGCACA
CCGAGAUGGAGCCCAAUUA
CCUGGAGGGUCCUGUACAA
GGCGGAGACAAGAGGAGCA
GCGACGAGAAAGAAAUAAG
AGACGGAGUGCCUGCAGAA
CACUGGUGUUUGAGGAUUU
GGUUUGCCAUCCAGAACAA
GGGAUAGCCUCUCUUACUA
GAACAGUUAUCUCCAGAAG
GGAGACAGACCAACUAGAA
AGACCGAGCCCUUUGAUGA
UGGAAACGACCUUCUAUGA
UAACGCAGCAGUUGCAAAC
GAGCGGACCUUAUGGCUAC
AAGUCAUGAACCACGUUAA
AGGAAUAGUAUGCGCAGCU
ACAGAGAGCUAGUUCUUAU
GAACCAAGAAUGGAGUUAU
GAUGACGCCUUAUGUAGUG
Bcl-w
unbekannte Sequenz
BIM
unbekannte Sequenz
control siRNA
UAGCGACUAAACACAUCAA
Mit Ausnahme der siRNAs von BIM und Bcl-w, welche von Santa Cruz verwendet
wurden, wurden sämtliche anderen siRNAs von Dharmacon bezogen. Zudem
wurden die siRNAs von BIM und Bcl-w in einer Endkonzentration von 30 nM
eingesetzt.
30
Material und Methoden
Als liposomales Transfektionsreagenz wurde für die Zelllinien OVCAR3, -4, und -5,
DharmaFECT1
verwendet.
NTERA-2D1
Zellen
wurden
mit
DharmaFECT3
transfiziert. Das Transfektionsreagenz wurde im Verhältnis 1:25 mit Opti-MEM I
Reduced Serum Medium verdünnt. Nach der Inkubation (5 min, RT) wurden die
verdünnten siRNAs im Verhätnis 1:1 mit verdünntem DharmaFECT versetzt. Nach
einer weiteren Inkubationszeit (20 min, RT) wurde die Transfektionslösung im
Verhältnis 1:10
mit Zellkulturmedium
verdünnt.
Anschließend
erfolgte
eine
sechsstündige Inkubation der Zellen mit Transfektionslösung, an welche ein
Mediumwechsel folgte. Um eine effiziente Reduktion des relevanten Proteins zu
erreichen, wurden sämtliche Experimente 48h nach der Transfektion durchgeführt.
Im Falle von p63 wurde zudem eine Transfektion mit ON-TARGETplus siRNAs
ausgeführt. Diese speziell modifizierten siRNAs besitzen eine geringere off-target
Aktivität. Die Sequenzen dieser siRNAs sind in Tabelle 2.5 aufgelistet.
Tabelle 2.5: Sequenzen der p63 ON-TARGETplus siRNAs
Genname
ON-TARGETplus Set of 4 Upgrade sip63
J-003330-12
ON-TARGETplus Set of 4 Upgrade sip63
J-003330-13
ON-TARGETplus Set of 4 Upgrade sip63
J-003330-14
ON-TARGETplus Set of 4 Upgrade sip63
J-003330-15
Gensequenz
UCUAUCAGAUUGAGCAUUA
GCACACAGACAAAUGAAUU
CGACAGUCUUGUACAAUUU
GAUGAACUGUUAUACUUAC
Opti-MEM I Reduced Serum Medium
Gibco, Karlsruhe
DharmaFECT1
Dharmacon, UK
DharmaFECT3
Dharmacon, UK
Material und Methoden
31
2.9 Proteinanalyse
2.9.1 Herstellung eines Gesamtproteinlysats
Zur Proteinextraktion wurden die adhärenten Zellen trypsiniert und pelletiert (4°C,
1400 rpm, 5 min). Die Zellpellets wurden mit 1 ml kaltem 1xPBS gewaschen, der
Überstand abgesaugt und die Zellpellets in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
Das gefrorene Pellet wurde in Lysepuffer (50 mM Tris, 250 mM NaCl, 0,1% Triton X100, 5 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert und sowohl Protease- als auch
Phosphataseinhibitoren zugesetzt. Für einen vollständigen Zellaufschluss wurden die
Zellpellets sonifiziert (50 Zyklen, 20 sec) und anschließend abzentrifugiert (4°C,
13000 rpm, 15 min). Die Überstände wurden zur Proteinbestimmung verwendet und
das Pellet verworfen. Die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des
Bradford-Assays
durchgeführt,
um
im
weiteren
Versuchsverlauf
identische
Proteinmengen einsetzen zu können. Dafür wurden jeweils 800 µl H2O, 200 µl
Bradfordreagenz und 1 µl Probenüberstand vermischt. Zur Erstellung einer
Standardkurve wurde eine BSA-Verdünnungsreihe angefertigt. Die optischen Dichten
der Ansätze wurden anschließend am Photometer bei 595 nm gemessen. Identische
Probenmengen wurden daraufhin mit 1xLämmli-Puffer (62,5 mM Tris/HCl, 20% (v/v),
Glycerol, 5% (v/v) β-Mercaptoethanol, 2% (w/v) SDS, 1% Bromphenolblau, pH 6,8)
versetzt und für 5 min bei 95°C aufgekocht.
TRIS
EDTA
Triton X-100
NaCl
PhosphoSTOP (phosphatase
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich, Steinheim
Fluka Chemie AG, Buchs (CH)
Merck, Darmstadt
Roche, Mannheim
inhibitor cocktail tablets)
protease inhibitor cocktail tablets
Ultraschall Homogenisator Sonopuls HD200
Roche, Mannheim
Bandelin Elektronik, Berlin
MS72 Mikrospitze aus Titan
advanced protein assay reagent (5x)
Cytoskeleton Inc., USA
BSA
Sigma-Aldrich, Steinheim
Novaspec II Visible Spectrophotometer
GE Healthcare, München
Glycerol
Bromphenolblau
Meck, Darmstadt
Sigma-Aldrich, Steinheim
32
Material und Methoden
2.9.2 SDS-Page zur Auftrennung der Proteine
Die Auftrennung der Proteine erfolgte bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
nach Molekulargewicht. Für die Gelelektrophorese wurden Gele bestehend aus
Acrylamid, 1,5 mM Tris-Puffer pH 8,8 und SDS hergestellt. Durch unterschiedliche
Acrylamidkonzentrationen wurde die Dichte der Gele variiert. Hochprozentige
Acrylamidgele wurden verwendet um Proteine mit niedrigem Molekulargewicht zu
trennen. Proteine mit hohem Molekulargewicht wurden mit Gelen niedriger
Acrylamidkonzentration getrennt. Sehr kleine Proteine mit einem Molekulargewicht
<10 kDa wurden mit Hilfe von Gradientengelen (5-20% Acrylamid) separiert.
Nach der Polymerisierung des Gels wurde neben den Proben weiterhin ein Marker
zur Größenidentifikation der Proteine aufgetragen. Die Proteinauftrennung erfolgte in
Elektrophoresekammern, welche mit Elektrophoresepuffer (25 mM Tris-Base,
0,2 M Glycin, 1% SDS) gefüllt wurden. Die Elektrophorese wurde bei konstanten
6 mA über Nacht durchgeführt.
Ammoniumpersulfat (APS)
TEMED
Bio-Rad, München
Roth, Karlsruhe
30% Acrylamid/Bis-Lösung (37, 5:1)
Bio-Rad, München
Vertikal-Elektrophoresekammer, Protean® II xi Cell‘
Bio-Rad, München
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)
Cell Signaling, USA
2.9.3 Western-Blot
Die Übertragung der mit Hilfe der SDS-Page aufgetrennten Proteine auf eine
Nitrocellulosemembran erfolgte durch eine Trans-Blot®-Semi-Dry-Transferkammer.
Auf diese wurden drei Lagen Filterpapier gelegt und anschließend die in
Transferpuffer (0,025 M Tris-HCl, 0,192 M Glycin, 20% (v/v) Methanol, 1% (w/v)
SDS) vorinkubierte Membran sowie das Acrylamidgel luftblasenfrei aufgebracht. Auf
das Acrylamidgel wurden wiederum drei Lagen Filterpapier aufgelegt. Der Blot
erfolgte bei konstanten 15 V für 1,5 h. Anschließend wurde die Membran kurz in
1xTBST (400 g NaCl, 10 g KCl, 150 g Tris-Base, pH 7,4; ad. 5000 ml Aqua dest.)
gewaschen und danach für 1 h in 5% Magermilch gelegt. Durch die Inkubation der
Membran in Magermilch wird die Bindung der später eingesetzten Antikörper an
unspezifische Bindestellen unterbunden. Nach der Inkubationszeit folgten drei
weitere Waschschritte in TBST, an deren Anschluss die Behandlung der Membran
Material und Methoden
33
mit dem Primärantikörper erfolgte. Der jeweilige Primärantikörper (siehe Tabelle 2.6)
wurde nach Angaben des Herstellers entweder in 5% (w/v) BSA in 1xTBST, Western
Blocking Reagent (1:20 in 1xTBS) oder 5%iger Magermilch verwendet und bei 4°C
über Nacht inkubiert.
Tabelle 2.6: Eingesetzte Primärantikörper
Antikörper
Spezies
Firma
Verdünnung
ATF3
Kaninchen
Santa Cruz, USA
1:500
BAD
Kaninchen
Cell Signaling, USA
1:500
BAK
Kaninchen
Cell Signaling, USA
1:500
BAX
Kaninchen
Cell Signaling, USA
1:1000
Bcl-2
Kaninchen
Cell Signaling, USA
1:1000
Bcl-xL
Kaninchen
Cell Signaling, USA
1:1000
BID
Kaninchen
Cell Signaling, USA
1:1000
BIM
Kaninchen
Cell Signaling, USA
1:500
Bcl-w
Kaninchen
Cell Signaling, USA
1:500
JNK1
Maus
Cell Signaling, USA
1:1000
p-c-Jun (Ser73)
Kaninchen
Upstate, USA
1:1000
Mcl-1
Kaninchen
Cell Signaling, USA
1:500
NOXA
Maus
Calbiochem, USA
1:500
Maus
Santa Cruz, USA
1:4000
p63 (4A4)
Maus
Santa Cruz, USA
p73
Kaninchen
Abcam, UK
1:1000
PUMA
Kaninchen
Cell Signaling, USA
1:500
p53
(DO-1 und Pab181)
Nach der Inkubation wurde die Membran vier mal 15 min in 1xTBST gewaschen und
anschließend mit einem Peroxidase (POD)-gekoppelten Sekundärantikörper (siehe
Tabelle 2.7) behandelt. Die Inkubation mit dem Sekundärantikörper erfolgte bei RT
für 1 h.
34
Material und Methoden
Tabelle 2.7: Eingesetzte konjugierte Sekundärantikörper
Antikörper
Spezies
Firma
Verdünnung
anti-KaninchenIgG-HRP
anti-Maus-IgG-HRP
Ziege
Cell Signaling, USA
1:2000
Ziege
Cell Signaling, USA
1:2000
Anschließend wurde erneut vier mal 15 min mit 1xTBST gewaschen. Die Detektion
der gebundenen Antikörper erfolgte über eine Chemilumineszenz-Reaktion, bei der
das „SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate“ nach Anleitung des
Herstellers verwendet wurde. Das Signal wurde detektiert, indem die Membran
gegen einen speziellen Röntgenfilm exponiert wurde, dessen anschließende
Entwicklung die Signale erkennbar machte. Die densitometrische Auswertung
erfolgte über die Software AIDA (advanced image data analyzer), Version 2.31.
Um die Beladung des Gels überprüfen zu können, wurde die Membran von den
Primär-
und
Sekundärantikörpern
befreit,
indem
eine
Behandlung
mit
SDS-β-Mercaptoethanol-Stripping-Lösung bei 52°C für 20 min (62,5 mM Tris-HCl,
2% (w/v) SDS, 100 mM β-Mercaptoethanol; pH 6,7) durchgeführt wurde.
Anschließend wurde erneut mit 1xTBST gewaschen und mit 5% Magermilch
geblockt. Die Membran konnte nun mit den Primärantikörper, welcher das
Haushaltsgen GAPDH (Glycerinalgehyd 3-phosphat Dehydrogenase) detektiert,
inkubiert werden. Abschließend erfolgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper
(Tabelle 2.8).
Tabelle 2.8: Primar- und Sekundärantikörper zur Detektion von GAPDH
Antikörper
Spezies
Firma
Verdünnung
GAPDH
Kaninchen
Cell Signaling, USA
1:5000
anti-KaninchenIgG-HRP
Ziege
Cell Signaling, USA
1:2000
Material und Methoden
35
Magermilchpulver
Fluka, Buchs (CH)
KCl
Merck, Darmstadt
Methanol
Merck, Darmstadt
PVDF Membran
Trans-Blot® Semi-Dry Transfer Cell
Filterpapier ‚Gel-Blotting Papier‘
‚Western Blocking Reagent‘
Autoradiographie Kassette
‚Lumi-Film‘, Chemiluminescent
Boehringer Mannheim, Mannheim
Bio-Rad, München
Schleicher & Schuell, Dassel
Roche, Mannheim
Amersham Biosciences, Freiburg
Roche, Mannheim
Detection Film
‚SuperSignal® West Dura Extended
Pierce Biotechnology, USA
Duration Substrate‘
‚LAS-1000‘, Luminescent imager
Medical Systems, USA
Analyzer with Fujifilm
electronically cooled CCD camera System
Advanced image data analyzer
Raytest, Straubenhardt
(AIDA 2.31)
Entwicklungsmaschine, Curix60
AGFA, Düsseldorf
36
Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1 Charakterisierung einer Zelllinienauswahl
3.1.1 Bestimmung des p53-Status
Für diese Arbeit wurde eine Gruppe von Zelllinien aus verschiedenen Entitäten
(embryonales Hodenkarzinom, Bronchialkarzinom, Ovarialkarzinom) ausgewählt und
zunächst hinsichtlich ihres p53-Status charakterisiert (Tabelle 3.1).
Tabelle 3.1: p53-Status der Zelllinienauswahl
Zelllinie
Entität
p53-Status
NTERA-2D1
embryonales Hodenkarzinom
wt
2102EP
embryonales Hodenkarzinom
wt
A549
Bronchialkarzinom
wt
H460
Bronchialkarzinom
wt
H23
Bronchialkarzinom
M246I (heterozygot)
Calu-1
Bronchialkarzinom
Deletion (p53-null, STOPP-Codon)
A2780
Ovarialkarzinom
wt
IGROV1
Ovarialkarzinom
Y126C (heterozygot)
OVCAR3
Ovarialkarzinom
R248Q
OVCAR4
Ovarialkarzinom
L130V
OVCAR5
Ovarialkarzinom
Insertion (p53-null, STOPP-Codon)
OVCAR8
Ovarialkarzinom
Deletion
SKOV3
Ovarialkarzinom
Deletion (p53-null, STOPP-Codon)
TOV-112D
Ovarialkarzinom
R175H
Dabei konnte in 5 Zelllinien wtp53, in 6 Zelllinien mtp53 und in 4 Zelllinien der
p53-null-Status
festgestellt
werden.
Neben
den
Zelllinien
wurden
für
die
nachfolgenden Untersuchungen zudem Tumor-assoziierte Fibroblasten aus der
humanen Lunge, welche charakteristischerweise p53 in der Wildtyp-Form aufweisen
(Schmid et al., 2012; Qiu et al., 2008) und PBMNCs von gesunden Probanden
verwendet.
Ergebnisse
37
3.1.2 Induktion von Zelltod und Zellzyklusarrest nach Nutlin-3, RITA und
Cisplatin
Der Einfluss der p53-Aktivatoren Nutlin-3, RITA und Cisplatin auf den Zelltod und
den Zellzyklusarrest wurde in Abhängigkeit des p53-Status mit Hilfe der zuvor
beschriebenen Zellauswahl untersucht (Abbildung 3.1).
38
Ergebnisse
Abbildung 3.1: Induktion von Zelltod und Zellzyklusarrest 48h nach (A) Nutlin-3-, (B) RITAund (C) Cisplatin-Behandlung. wtp53 exprimierende Zellen sind in schwarz, mtp53
exprimierende Zellen in blau und p53-null Zellen in grau dargestellt. Zellen mit
heterozygotem Phänotyp sind durch ein blau-schwarzes Muster gekennzeichnet. 1. Zeile:
Im Gegensatz zu Nutlin-3 konnte nach RITA und Cisplatin-Behandlung Zelltod auch in p53
mutierten oder im Falle von RITA auch in p53-null Zellen, nachgewiesen werden. Die
Messung des Zelltods erfolgte durch eine AnnexinV-FITC/PI-Färbung-Färbung am
Durchflusszytometer. Dargestellt wurde die prozentuale Induktion AnnexinV-FITC/PIFärbung positiver Zellen nach Behandlung. Die Werte entsprechen den Mittelwerten aus drei
unabhängigen Experimenten ±SD. 2.-5. Zeile: Im Gegensatz zu dem Nutlin-3 induzierten G1Arrest in wtp53-Zellen wurde durch RITA kein Zellzyklusarrest, durch Cisplatin ein SPhasenarrest unabhängig vom p53-Status induziert. Die Zellzyklusmessung erfolgte durch
einen Behandlungspuls mit BrdU und einer Färbung mit anti-BrdU-Antikörper sowie PI am
Durchflusszytometer. Dargestellt sind die prozentualen Unterschiede in SubG1-, G1-, S- und
G2-Phase nach Behandlung. Die Werte entsprechen den Mittelwerten aus drei
unabhängigen Experimenten ±SD.
Übereinstimmend mit vorangegangenen Studien (Tovar et al., 2006) führte die
Behandlung mit Nutlin-3 ausschließlich in Zellen mit wtp53 zu einer Reaktion. Zelltod
wurde
in
der
embryonalen
Hodenkarzinomlinie
NTERA-2D1
und
der
Bronchialkarzinomlinie H460 ausgelöst (Abbildung 3.1 A, 1. Grafik). Für die Zelllinie
NTERA-2D1 konnte kürzlich eine besondere Sensitivität gegenüber der Aktivierung
von p53 nachgewiesen werden (Gutekunst et al., 2011). Auf Ebene des Zellzyklus
führte Nutlin-3 zu einem G1-Arrest, welcher in allen wtp53-exprimierenden Zelllinien,
außer der hypersensitiven NTERA-2D1 Linie auftrat (Abbildung 3.1 A, 2.-5. Grafik).
Zudem konnte ein G1-Arrest sowohl in Fibroblasten als auch in PBMNCs
nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnte durch die Behandlung mit RITA
keine Veränderung im aktiven Zellzyklus festgestellt werden (Abbildung 3.1 B, 3.-5.
Grafik). Jedoch wurde durch RITA in 7 von 11 Tumorzelllinien Zelltod induziert
(Abbildung 3.1 B, 1. und 2. Grafik). Auffallend dabei war die Induktion von Zelltod
nicht nur in wtp53 und mtp53-Zellen, sondern auch in der p53-null-Linie OVCAR5.
Zudem konnte festgestellt werden, dass die Zellen klar in zwei Gruppen hinsichtlich
ihrer Sensitivität trennbar waren; sensitive Zellen mit einer Induktion von Zelltod von
mehr als 60% nach 48 h und wenig sensitive Zellen mit einer Induktion von weniger
als 15% Zelltod nach 48 h. Beachtenswert ist hierbei der insensitive Phänotyp von
Fibroblasten und PBMNCs.
Im Falle von Cisplatin konnte ein kontinuierliches Spektrum an Sensitivitäten
innerhalb der Zelllinienauswahl festgestellt werden (Abbildung 3.1 C, 1. Graphik).
Dabei wurde Zelltod sowohl in Zellen mit wtp53 als auch in Zellen mit mtp53
induziert. Gemäß früheren Studien (Bugarcić et al., 2008) zeigten auch PBMNCs von
gesunden
Probanden
eine
hohe
Sensitivität
gegenüber
Cisplatin.
Auf
Ergebnisse
39
Zellzyklusebene konnte ein S-Phasenarrest beobachtet werden, welcher unabhängig
vom p53-Status und unabhängig von der Sensitivität der Zellen gegenüber Cisplatin
induziert wurde (Abbildung 3.1 C 2.-5. Grafik). Somit kommt es innerhalb der
Zelllinienauswahl zu unterschiedlichen Reaktionen auf die Substanzen (Tabelle 3.2).
Tabelle 3.2: Zelllinien welche eine Reaktion gegenüber Nutlin-3, RITA oder Cisplatin zeigen
Reaktion auf Nutlin-3:
Zelllinie
Induktion G1-Arrest,
bzw. Hypersensitivität
NTERA-2D1
+
(hypersensitiv)
Reaktion auf RITA:
Zelltod
Reaktion auf
Cisplatin:
Zelltod
+
+
2102EP
+
+
+
A549
+
-
-
H460
+
+
+
H23
-
-
+
Calu-1
-
-
-
A2780
+
-
-
IGROV1
+
+
-
OVCAR3
-
+
+
OVCAR4
-
+
+
OVCAR5
-
+
-
OVCAR8
-
-
-
SKOV3
-
-
-
TOV-112D
-
-
+
PBMNC
+
-
+
Fibroblasten
+
-
-
Zusammenfassend konnte ein selektiver Effekt auf wtp53 exprimierende Zellen nach
Nutlin-3-Behandlungen nachgewiesen werden. Im Falle einer Behandlung mit
Cisplatin oder RITA traten auch Effekte in mtp53-Zellen, im Falle von RITA sogar in
p53-null Zellen auf.
40
Ergebnisse
3.1.3 Induktion von p53-Zielgenen durch Nutlin-3, RITA und Cisplatin
Um die Aktivität von p53 als Transkriptionsfaktor näher zu untersuchen, wurde die
Expression
von
45
bona
fide
p53-Zielgenen
(Tabelle
2.2)
in
einem
Hochdurchsatzverfahren gemessen (Riley et al., 2008; Wei et al., 2006).
Die Behandlung mit Nutlin-3 führte zu einer Regulation von Zielgenen vorwiegend in
Zellen mit wtp53, weshalb das Clusterverfahren eine Gruppierung hinsichtlich des
p53-Status ergab (Abbildung 3.2).
Abbildung 3.2: Induktion von bona fide p53-Zielgenen, insbesondere in Zellen mit wtp53.
Für die Genexpressionsanalyse wurden die Zellen 8 h mit und ohne Nutlin-3 inkubiert, die
RNA isoliert, cDNA synthetisiert und eine spezifische Anreicherung der Zielgene
durchgeführt. Die Messung erfolgte mit Hilfe des BioMark TM-HD-Systems. Nach der
Berechnung der ΔΔCt-Werte wurde eine Clusteranalyse nach Euklidischem Gleichheitsmaß
mit anschließendem Complete-Linkage-Verfahren durchgeführt. Die Clusterbildung erfolgte
sowohl hinsichtlich der Zellen als auch hinsichtlich der Gene. Der Farbverlauf beschreibt die
Mittelwerte der log2 ΔΔCt-Werte aus drei unabhängigen Experimenten.
Ergebnisse
41
Die nähere Betrachtung der zwei Gruppen ergab 19 Gene, welche selektiv in Zellen
mit wtp53 reguliert wurden (Benjamini-Hochberg korrigierter gepaarter t-Test p<0,05,
FC>2; Tabelle 3.3).
Tabelle 3.3: Signifikant regulierte p53-Zielgene nach Behandlung mit Nutlin-3
Hochregulierte Gene nach Nutlin-3-Behandlung
(p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2)
Cluster wtp53
Genname
FC
CDKN1A
10.209
BTG2
9.81
TNFRSF10C
7.02
TP53INP1
6.78
PUMA (BBC3)
6.45
TP53i3
5.77
GADD45A
4.61
FAS (CD95)
4.54
ZMAT3
3.85
LRDD
3.58
TNFRSF10A
3.29
TNFRSF10B
3.26
TNFRSF10D
2.94
ATF3
2.94
IER3
2.88
Mdm2
2.59
PMAIP1
2.33
CGNG1
2.29
BAX
2.18
Cluster mtp53
p-Wert
4.63E-07
2.17E-06
9.64E-05
1.53E-05
3.94E-05
0.000935
3.08E-05
2.53E-05
6.20E-05
5.42E-06
0.000148
8.61E-06
0.000111
0.000148
0.000153
4.05E-08
0.000212
2.14E-05
0.000131
Beachtenswert hierbei war die ausschließliche Hochregulation von Genen in Zellen
mit wtp53. Signifikant herunterregulierte Gene konnten nicht identifiziert werden.
Ebenso konnte in der Gruppe der Zellen mit mtp53 kein signifikant reguliertes Gen
ermittelt werden. Übereinstimmend mit vorangegangenen Studien (Enge et al., 2009;
Tovar et al., 2006) und der vorwiegenden Induktion eines G1-Arrests in Zellen mit
wtp53 wurden durch Nutlin-3 überwiegend zellzyklusassoziierte Gene reguliert.
Im Gegensatz hierzu konnte nach RITA-Behandlung eine differentielle Regulation
von p53-Zielgenen vornehmlich in RITA-sensitiven Zellen nachgewiesen werden
(Abbildung 3.3).
42
Ergebnisse
Abbildung 3.3: Regulation von bona fide p53-Zielgenen, insbesondere in RITA-sensitiven
Zellen. Für die Genexpressionsanalyse wurden die Zellen 8 h mit und ohne RITA inkubiert,
die RNA isoliert, cDNA synthetisiert und eine spezifische Anreicherung der Zielgene
durchgeführt. Die Messung erfolgte mit Hilfe des BioMarkTM-HD-Systems. Nach der
Berechnung der ΔΔCt-Werte wurde eine Clusteranalyse nach Euklidischem Gleichheitsmaß
mit anschließendem Complete-Linkage-Verfahren durchgeführt. Die Clusterbildung erfolgte
sowohl hinsichtlich der Zellen als auch hinsichtlich der Gene. Der Farbverlauf beschreibt die
Mittelwerte der log2 ΔΔCt-Werte aus drei unabhängigen Experimenten.
Statistische Untersuchungen ergaben 10 hochregulierte und 3 herunterregulierte
Gene in der Gruppe der RITA-sensitiven Zellen (Benjamini-Hochberg korrigierter
gepaarter t-Test p<0,05, FC>2; Tabelle 3.4).
Ergebnisse
43
Tabelle 3.4: Signifikant regulierte p53-Zielgene nach Behandlung mit RITA; Gruppierung
nach Sensitivität
Hochregulierte Gene nach RITA-Behandlung
(p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2)
Cluster RITA sensitiv
Genname
FC
p-Wert
ATF3
11.94
7.23E-05
Fos
5.89
0.001036
PMAIP1
5.28
4.85E-05
GADD45A
4.48
0.000194
BTG2
3.48
0.005894
CDKN1A
3.42
0.001063
IER3
2.99
0.001798
PUMA (BBC3)
2.87
0.041790
TNFRSF10D
2.27
0.000470
TNFRSF10C
2.18
0.004000
Cluster RITA insensitiv
Genname
FC
p-Wert
ATF3
2.09
0.003002
Herunterregulierte Gene nach RITA-Behandlung
(p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2)
Cluster RITA sensitiv
Genname
FC
p-Wert
Bcl-2
2.67
0.000927
APAF1
2.28
0.000683
TP63
2.22
0.026636
Cluster RITA insensitiv
In Zellen mit einem geringen Ansprechen auf RITA konnte nur 1 Gen (ATF3)
identifiziert werden, welches durch RITA reguliert wurde. Dies wurde im Vergleich zu
RITA-sensitiven Zellen jedoch deutlich geringer induziert. Grundsätzlich führte die
Behandlung mit RITA zu einer vorwiegenden Regulation pro-apoptotischer Gene.
Weiterhin ist zu beachten, dass sowohl Fibroblasten als auch PBMNCs in die Gruppe
der RITA-insensitiven Zellen einzuordnen waren und demnach nur eine geringe
Regulation der p53-Zielgene aufwiesen.
Da RITA klassischerweise als p53-Aktivator gilt (Issaeva et al., 2004), wurde im
Weiteren eine Gruppierung der Zellen hinsichtlich des p53-Status vorgenommen und
eine statistische Analyse durchgeführt (Benjamini-Hochberg korrigierter gepaarter tTest p<0,05, FC>2; Tabelle 3.5).
44
Ergebnisse
Tabelle 3.5: Signifikant regulierte p53-Zielgene nach Behandlung mit RITA; Gruppierung
nach p53-Status
Hochregulierte Gene nach RITA-Behandlung
(p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2)
wtp53
FC
3.10587
2.28310
Genname
GADD45α
PMAIP1
p-Wert
0.038970
0.026160
Genname
ATF3
PMAIP
GADD45α
mtp53
FC
5.20536
3.03143
2.39495
p-Wert
0.001266
0.004366
0.000862
Im Vergleich zur Gruppierung nach der Sensitivität führte die Gruppierung nach p53Status zu einer deutlich geringeren Anzahl an regulierten Genen (Tabelle 3.5). In
wtp53-Zellen wurden 2 Gene, in Zellen mit mtp53 3 Gene hochreguliert. Eine
Herunterregulation von Genen konnte nicht beobachtet werden. Dies lässt auf p53
unabhängige Effekte von RITA schießen.
Im Vergleich zu Nutlin-3 und RITA wurde auch die differentielle Regulation der 45
bona
fide
p53-Zielgene
(Abbildung 3.4).
nach
einer
Behandlung
mit
Cisplatin
untersucht
Ergebnisse
45
Abbildung 3.4: Regulation von bona fide p53-Zielgenen, insbesondere in Zellen mit wtp53
nachzuweisen. Jedoch sind auch differentielle Effekte im mtp53-System zu beobachten. Für
die Genexpressionsanalyse wurden die Zellen 8 h mit und ohne Cisplatin inkubiert, die RNA
isoliert, cDNA synthetisiert und eine spezifische Anreicherung der Zielgene durchgeführt. Die
Messung erfolgte mit Hilfe des BioMarkTM-HD-Systems. Nach der Berechnung der ΔΔCtWerte wurde eine Clusteranalyse nach Euklidischem Gleichheitsmaß mit anschließendem
Complete-Linkage-Verfahren durchgeführt. Die Clusterbildung erfolgte sowohl hinsichtlich
der Zellen als auch hinsichtlich der Gene. Der Farbverlauf beschreibt die Mittelwerte der log2
ΔΔCt-Werte aus drei unabhängigen Experimenten.
Ähnlich der Behandlung mit Nutlin-3 konnte nach der Clusteranalyse eine
Gruppierung nach p53-Status festgestellt werden. Im Gegensatz zu einer
Behandlung mit Nutlin-3 konnten jedoch auch in Zellen mit mtp53 eine differentielle
Expression von p53-Zielgenen nachgewiesen werden (Tabelle 3.6).
46
Ergebnisse
Tabelle 3.6: Signifikant regulierte p53-Zielgene nach Behandlung mit Cisplatin; Gruppierung
nach p53-Status
Hochregulierte Gene nach Cisplatin-Behandlung
(p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2)
Cluster wtp53
Genname
FC
BTG2
4.75
CDKN1A
4.14
PUMA (BBC3)
3.99
TP53INP1
3.18
GADD45A
2.84
ATF3
2.60
TNFRSF10C
2.59
IER3
2.39
PMAIP1
2.06
TNFRSF10D
2.05
FAS (CD95)
2.04
p-Wert
0.000527
0.000972
0.000864
0.000864
0.000481
1.77E-05
0.003696
0.009076
0.001510
0.001496
0.005565
Cluster mtp53
Genname
FC
ATF3
2.65
BTG2
2.31
PMAIP1
2.08
p-Wert
0.005582
0.000968
0.007430
Herunterregulierte Gene nach Cisplatin-Behandlung
(p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2)
Genname
Bcl-2
TP63
In
der
Cluster wtp53
FC
-2.85
-2.08
wtp53-exprimierenden
p-Wert
0.002104
0.024143
Gruppe
Cluster mtp53
Genname
FC
Bcl-2
-2.53
TP63
-2.45
wurden
11
hochregulierte
p-Wert
0.011143
0.015093
und
2
herunterregulierte Gene identifiziert. Zudem wurden in Zellen mit mtp53 3 Gene
hoch- und 2 Gene herunterreguliert. Bemerkenswert hierbei ist, dass alle Gene,
welche signifikant in Zellen mit mtp53 reguliert wurden, auch in der Gruppe mit wtp53
auftraten.
Da sich im Falle von Cisplatin das Clustering der Zellen von der Sensitivität der
Zellen gegenüber Cisplatin unterscheidet, wurde eine weitere statistische Analyse
nach einer Gruppierung hinsichtlich der Sensitivität durchgeführt (BenjaminiHochberg korrigierter gepaarter t-Test p<0,05, FC>2; Tabelle 3.7).
Ergebnisse
47
Tabelle 3.7: Signifikant regulierte p53-Zielgene nach Behandlung mit Cisplatin; Gruppierung
nach Cisplatin-Sensitivität
Hochregulierte Gene nach Cisplatin-Behandlung
(p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2)
Cisplatin sensitiv
Genname
FC
BTG2
3.47
CDKN1A
3.41
ATF3
3.22
GADD45A
2.92
TNFRSF10C
2.77
PUMA (BBC3)
2.73
TP53INP1
2.49
PMAIP1
2.26
TNFRSF10D
2.09
Bcl-2
0.36
p-Wert
0.008151
0.008151
0.003816
0.003816
0.004415
0.039024
0.039024
0.010417
0.004415
0.017155
Cisplatin insensitiv
Genname
FC
p-Wert
BTG2
3.19
0.000469
CDKN1A
2.43
0.004010
ATF3
2.23
0.000186
PUMA (BBC3)
2.19
0.007183
Herunterregulierte Gene nach Cisplatin-Behandlung
(p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2)
Genname
TP63
Cisplatin sensitiv
FC
-2.51
p-Wert
0.010417
Cisplatin insensitiv
Genname
FC
p-Wert
Bcl-2
-2.58
0.0015717
Ähnlich wie im Falle der Gruppierung nach p53-Status wurden in der Gruppe der
Cisplatin-sensitiven Zellen 10 Gene hoch- und 1 Gen herunterreguliert (Tabele 3.7).
Zudem wurden in der Gruppe der Cisplatin-insensitiven Zellen 4 Gene hoch- und 1
Gen herunterreguliert.
Somit konnte durch die Analyse von 45 bona fide p53-Zielgenen ein selektiver Effekt
von Nutlin-3 auf wtp53 exprimierende Zellen nachgewiesen werden. Eine
Behandlung mit Cisplatin führte auf transkriptioneller Ebene vorwiegend in Zellen mit
wtp53 zu signifikanten Effekten. Jedoch wurde auch in Systemen mit mtp53 eine
differentielle Expression von p53-Zielgenen beobachtet. Im Gegensatz hierzu konnte
durch RITA kein dominanter Effekt auf Zellen mit wtp53 beobachtet werden. Die
differentielle Regulation von p53-Zielgenen erfolgte vorwiegend in RITA-sensitiven
Zellen, was auch durch das Clustering dargestellt ist. Auf die Separation in RITAsensitive und RITA-insensitive Zellen hatte weder die Entität noch der p53-Status
einen Einfluss.
48
Ergebnisse
3.1.4 Die Rolle von wtp53 für die Nutlin-3-, RITA- und Cisplatin-Sensitivität
Bekanntermaßen gelten Nutlin-3, RITA und Cisplatin als Aktivatoren von wtp53
(Blagosklonny, 2002; Issaeva et al., 2004; Vassilev et al., 2004). In der untersuchten
Zelllinienauswahl konnte insbesondere für Nutlin-3 und Cisplatin ein Einfluss von
wtp53 hinsichtlich der Reaktion auf die Behandlung festgestellt werden. Weiterhin
wurden wtp53-Zellen mit einer hohen Sensitivität gegenüber RITA identifiziert.
Um den Einfluss von wtp53 auf die Sensitivität gegenüber Nutlin-3, RITA und
Cisplatin zu untersuchen, wurden beispielhaft in der wtp53-exprimierenden Zelllinie
NTERA-2D1 RNAi-Experimente durchgeführt (Abbildung 3.5).
Abbildung 3.5: Die siRNA-vermittelte Depletion von wtp53 führt zu einer Verminderung des
Zelltods sowohl nach (A) Nutlin-3-, (B) RITA- und (C) Cisplatin-Behandlung in NTERA-2D1.
1. Zeile: Überprüfung der Effizienz des Knockdowns mittels Western-Blot. 2. Zeile:
Differentielle Expression der 45 bona fide p53-Zielgene nach Nutlin-3-, RITA- und CisplatinBehandlung. Nach 8 h Inkubation mit und ohne Nutlin-3, RITA oder Cisplatin erfolgte die
Isolation der RNA mit anschließender Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen die
log2 ΔΔCt-Werte der Kontrolle (x-Achse) aufgetragen gegen die log2 ΔΔCt-Werte nach
TP53-Knockdown (y-Achse). Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert des p53-Zielgens aus
drei unabhängigen Experimenten. 3. Zeile: 48 h nach Inkubation wurden die Zellen mit
AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder
Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante
Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05
mit (*) gekennzeichnet.
Ergebnisse
49
Wie in Abbildung 3.5, 1. Zeile gezeigt wird, war der Knockdown von TP53 sowohl im
unbehandelten als auch im behandelten Fall effizient. Bei der Betrachtung der
differentiellen Expression der p53-Zielgene hatte die Reduktion des p53-Proteins
eine verringerte Induktion der Gene nach Nutlin-3-, RITA- und Cisplatin-Behandlung
zur
Folge
(Abbildung
3.2,
2.
Zeile).
Dies
war
insbesondere
nach
Nutlin-3- und Cisplatin-Behandlung zu beobachten. Weiterhin konnte durch den
Knockdown von TP53 der induzierte Zelltod durch Nutlin-3, RITA und Cisplatin
nahezu vollständig verhindert werden (Abbildung 3.2, 3. Zeile).
Infolgedessen konnte die wichtige Funktion von wtp53 auf die Sensitivität gegenüber
bekannten p53-Aktivatoren bestätigt werden.
3.2 Mechanismen des RITA-induzierten Zelltods im p53-mutierten
System
Dem Thiophen-Derivat RITA (reactivation of p53 and induction of tumor cell
apoptosis) konnten in zahlreichen Studien wtp53-reaktivierende Eigenschaften
nachgewiesen werden (Enge et al., 2009; Grinkevich et al., 2009; Hedström et al.,
2009; Issaeva et al., 2004; Li et al., 2011; Roh et al., 2012; Saha et al., 2010, 2012;
Spinnler et al., 2011; Wang and Yan, 2011). Zudem zeigte der Inhibitor der p53Mdm2-Interaktion die Fähigkeit zur Reaktivierung von mtp53 (Burmakin et al., 2013;
Zhao et al., 2010a).
Bei der Charakterisierung der Zelllinienauswahl konnte ein hohe Sensitivität der
p53-null-Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5 gegenüber RITA-Behandlung festgestellt
werden. Auf Grund dieses überraschenden Ergebnisses wurde zunächst die
chemische Identität von RITA überprüft. Dafür wurde RITA von zwei Herstellern
bezogen
und
die
chemische
Zusammensetzung
mittels
(durchgeführt von Dr. T. Mürdter) analysiert (Abbildung 3.6).
GC/MS-Analyse
50
Ergebnisse
Abbildung 3.6: Bestätigung der chemischen Identität von RITA. RITA bezogen von zwei
verschiedenen Herstellern wurde durch BSTFA bei 60°C für 30 min derivatisiert. Die Proben
wurden auf einer DB-5 Kapillarsäule mit einem linearen Temperaturgradienten von
80°C - 280°C in 30 min mittels GC (7890A, Agilent Technologies, Germany) separiert. Das
Bis(trimethylsilyl)-Derivat von RITA wurde mit Hilfe einer massenspektrometrischen Analyse
(5975C Agilent Technologies, Germany) detektiert.
Sowohl die Retentionszeiten (Abbildung 3.6 A) als auch das positive Spektrum der
Elektronenstoßionisation (Abbildung 3.6 B) waren in beiden Proben identisch. Zudem
entsprachen die erhaltenen Daten einem bereits publizierten Spektrum (Phillip et al.,
2002). Die chemische Identität von RITA konnte damit eindeutig bestätigt werden.
Ergebnisse
51
3.2.1 Die Rolle von mtp53 für die RITA-Sensitivität der mtp53-exprimierenden
Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4
Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit RITA eine Reaktivierung
von mtp53 zur Folge hat, wodurch ein p53-abhängiger Zelltod induziert wird (Zhao et
al., 2010a). Auf Grund dessen wurde die Funktion von mtp53 auf den RITAinduzierten Zelltod in den mtp53-exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4
näher untersucht (Abbildung 3.7).
Abbildung 3.7: RITA kann unabhängig von mtp53 Zelltod induzieren. Für die RNAiExperimente wurden die mtp53-exprimierenden Zelllinien (A) OVCAR3 und (B) OVCAR4
verwendet. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienz des TP53-Knockdowns mittels Western-BlotAnalyse. 2. Zeile: Differentielle Expression der 45 bona fide p53-Zielgene nach RITABehandlung. Nach 8 h Inkubation mit und ohne RITA erfolgte die Isolation der RNA mit
anschließender Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen die log2 ΔΔCt-Werte der
Kontrolle (x-Achse) aufgetragen gegen die log2 ΔΔCt-Werte nach TP53 Knockdown (yAchse). Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert des p53-Zielgens aus drei unabhängigen
Experimenten. 3. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit
AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder
Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD.
52
Ergebnisse
Die Überprüfung der Knockdown-Effizienz ergab eine effektive Reduktion des p53Proteins sowohl unbehandelt also auch nach RITA-Behandlung (Abbildung 3.7,
1. Zeile). Jedoch führte die Reduktion des p53-Proteins nicht zu einer signifikant
veränderten Regulation (Mann-Whitney-Test, Bonferoni-Holm korrigiert) der p53Zielgene (Abbildung 3.7, 2. Zeile). Bemerkenswert dabei war das Ausbleiben einer
Regulation von einer Gruppe von Genen (p21 (CDKN1A), NOXA (PMAIP1), PUMA
(BBC3), GADD45α, c-MYC, BCL-2), welche in mehreren Studien als Gene
identifiziert wurden, die durch RITA p53-abhängig reguliert werden (Burmakin et al.,
2013; Enge et al., 2009; Grinkevich et al., 2009; Zhao et al., 2010a, 2010b). Eine
Ausnahme bildete dabei TP63, welches in der Linie OVCAR3 herunterreguliert wurde
(Abbildung 3.7 A, 2.Zeile). Zudem konnte der RITA vermittelte Zelltod durch den
Knockdown von TP53 nicht reduziert werden (Abbildung 3.7, 3. Zeile).
Auf Grundlage dieser Ergebnisse konnte geschlossen werden, dass RITA neben den
bekannten wtp53-abhängigen Effekten in Zellen mit mtp53 auch Zelltod unabhängig
von p53 induzieren kann.
3.2.2 Die Rolle von p63 und p73 für die RITA-Sensitivität der p53-defekten
Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5
Neben p53 beinhaltet die p53-Superfamilie auch die Transkriptionsfaktoren p63 und
p73. Da die amino-terminale Transaktivierungsdomäne, die DNA-Bindedomäne und
die carboxy-terminale Oligomerisierungsdomäne von p53, p63 und p73 hoch
konserviert sind (Dötsch et al., 2010) und die Zielgene teilweise überlappen (Collavin
et al., 2010; Li and Prives, 2007), wurde der Einfluss von p63 und p73 auf den RITAvermittelten Zelltod näher betrachtet (Abbildung 3.8).
Ergebnisse
53
Abbildung 3.8: RITA kann unabhängig von p63 und p73 Zelltod induzieren. Für die
Knockdown-Experimente wurde die mtp53-exprimierende Zelllinie OVCAR4 verwendet. 1.
Zeile: Überprüfung der Effizienz des (A) TP63- und (B) TP73-Knockdowns mittels WesternBlot-Analyse. 2. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit TMRM
gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel
aus drei unabhängigen Experimenten ±SD.
Die Effizienz des Knockdowns von TP63 und TP73 konnte durch Western-BlotAnalyse nachgewiesen werden (Abbildung 3.8, 1. Zeile). Jedoch führte weder der
Knockdown von TP63 noch der von TP73 zu einer Abnahme des Zelltods nach
RITA-Behandlung (Abbildung 3.8, 2. Zeile).
Um einen Einfluss von mtp53 auf p63 und p73 (Melino, 2011; Zawacka-Pankau et
al., 2010) ausschließen zu können, wurde weiterhin ein simultaner Knockdown von
TP63 und TP73 in der p53-null-Linie OVCAR5 durchgeführt (Abbildung 3.9).
54
Ergebnisse
Abbildung 3.9: RITA kann Zelltod unabhängig von (A) p63, (B) p73 und (C) p63+p73 in der
p53-null-Linie OVCAR5 induzieren. 1. Zeile: Die Überprüfung der Knockdown-Effizienz
wurde mittels qPCR durchgeführt. Dargestellt wurde die relative Expression von TP63 und
TP73 aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels
zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet.
2. Zeile: Differentielle Expression der 45 bona fide p53-Zielgene nach RITA-Behandlung.
Nach 8 h Inkubation mit und ohne RITA erfolgte die Isolation der RNA mit anschließender
Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen die log2 ΔΔCt-Werte der Kontrolle (xAchse) aufgetragen gegen die log2 ΔΔCt-Werte nach TP63-, TP73- oder TP63+TP73Knockdown (y-Achse). Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert des p53-Zielgens aus drei
unabhängigen Experimenten. 3. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die
Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer
gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD.
Wie in Abbildung 3.9, 1. Zeile gezeigt wird, war der Knockdown sowohl von p63 als
auch von p73 effektiv. Übereinstimmend mit den Ergebnissen aus der mtp53exprimierenden Linie OVCAR4 (Abbildung 3.8) konnte auch in der p53-null-Zelllinie
OVCAR5 weder durch TP63 noch durch TP73-Knockdown, ein Effekt auf die
Expression der p53-Zielgene oder auf die Induktion von Zelltod festgestellt werden
(Abbildung 3.9 A und B). Zudem zeigte auch der simultane Knockdown von TP63
und TP73 keinen Effekt auf die Genexpression oder den Zelltod (Abbildung 3.9 C).
Daraus kann geschlossen werden, dass RITA unabhängig von p53, p63 und p73
Zelltod induzieren kann.
Ergebnisse
55
3.2.3 Induktion von mitochondrialer Apoptose durch RITA in den p53-defekten
Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5
In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte die Induktion eines Caspaseabhängigen Zelltods in Zelllinien des Multiplen Myeloms nach RITA-Behandlung
nachgewiesen werden (Saha et al., 2010). Auf Grund dessen wurde im Weiteren
untersucht, inwieweit die Aktivierung von Caspasen für den Zelltod in RITAsensitiven Zellen mit mtp53- oder p53-null-Status notwendig ist (Abbildung 3.10).
Abbildung 3.10: Induktion eines Caspase-abhängigen Zelltods nach RITA-Behandlung.
(A) OVCAR3- und (B) OVCAR5-Zellen wurden mit und ohne dem pan-Caspase Inhibitor
z-VAD-FMK 2 h vorinkubiert. Anschließend erfolgte die Inkubation mit und ohne
RITA für 48 h. Die Färbung der Zellen erfolgte mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung am
Durchflusszytometer. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen
Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test
berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet.
Die Inhibition der Caspase-Kaskade mit z-VAD-FMK führte zu einer vollständigen
Hemmung des Zelltods nach RITA-Behandlung (Abbildung 3.10 A und B).
Da
die
Aktivierung
der
Caspase-Kaskade
häufig
zur
Depolarisation
der
mitochondrialen Membran führt, wurde im Folgenden untersucht, welchen Einfluss
die pro-apoptotischen, mitochondrialen Effektoren BAX und BAK auf den RITAinduzierten Zelltod in mtp53- oder p53-null-Zellen haben (Abbildung 3.11).
56
Ergebnisse
Abbildung 3.11: Induktion von MOMP durch RITA Behandlung. (A) Abhängigkeit der durch
RITA induzierten mitochondrialen Permeabilisation von den porenbildenen Effektorproteinen
BAX und BAK in der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4. 1. Zeile: Überprüfung der
Effizienz der Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 2. Zeile: 48 h nach Behandlung mit
und ohne RITA wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer
gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD.
Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und pWerte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. (B) Abhängigkeit der durch RITA induzierten
mitochondrialen Permeabilisation von den porenbildenen Effektorproteinen BAX und BAK in
der p53-null-Linie OVCAR5. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienz der Knockdowns mittels
Western-Blot-Analyse. 2. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen
mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen.
Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante
Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05
mit (*) gekennzeichnet.
Ergebnisse
57
Die Effektivität des BAX und BAK Knockdowns konnte mittels Western-Blot-Analyse
nachgewiesen werden (Abbildung 3.11 A und B, 1. Zeile). Die simultane Depletion
von BAX und BAK führte in beiden Ovarialkarzinom-Zelllinien zu einer vollständigen
Hemmung des Zelltods. Im Falle der p53-null-Linie konnte durch einen alleinigen
Knockdown von BAK der Zelltod partiell gehemmt werden (Abbildung 3.11 B,
2. Zeile Mitte).
Anhand der vorliegenden Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass RITA im mtp53und p53-null-System Zelltod durch die Aktivierung der Caspase-Kaskade sowie
durch die Depolarisation der mitochondrialen Membran in Abhängigkeit von BAX und
BAK auslösen kann.
3.2.4 Beteiligung der Bcl-2-Proteinfamilie am RITA-vermittelten Zelltod in den
p53-defekten Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5
Bei der Analyse der 45 bona fide p53-Zielgene konnten in der Gruppe der RITAsensitiven Zellen NOXA (PMAIP1) und PUMA (BBC3) als mit am stärksten
hochregulierte Gene identifiziert werden (Tabelle 3.4). Auf Grund dessen wurde die
Rolle der pro-apoptotischen BH3-only-Proteine NOXA, PUMA, BIM, BID und BAD
näher betrachtet.
Abbildung 3.12: RITA kann unabhängig von NOXA, PUMA, BIM, BID und BAD Apoptose in
der mtp53-Linie OVCAR4 induzieren. Links: Überprüfung der Effizienz der Knockdowns
mittels Western-Blot-Analyse. Rechts: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die
Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken
repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD.
58
Ergebnisse
Wie Abbildung 3.12 links zeigt, war der Knockdown der BH3-only-Proteine effizient.
Trotz der deutlichen Reduktion der jeweiligen Proteinexpression hatte dies keinen
Einfluss auf das Überleben der mtp53-exprimierenden Zellen (Abbildung 3.12,
rechts).
Neben NOXA und PUMA wurde bei der Analyse der p53-Zielgene auch das antiapoptotische Gen BCL-2 signifikant herunterreguliert (Tabelle 3.4). Auf Grund
dessen wurde die Regulation von Bcl-2 auf Proteinebene in der mtp53-Linie
OVCAR4 und der p53-null-Linie OVCAR5 näher untersucht (Abbildung 3.13).
Ergebnisse
59
Abbildung 3.13: RITA induziert die Herunterregulation anti-apoptotischer Bcl-2-Proteine. (A)
Western-Blot-Experimente zeigen die Proteinlevel der anti-apoptotischen Bcl-2-Proteine Bcl2, Bcl-xL, Bcl-w und Mcl-1 nach Inkubation der Ovarialkarzinom-Zelllinien OVCAR4 und
OVCAR5 mit und ohne RITA nach 8 h Behandlung. (B) ABT-737, ein BH3-mimetic, wirkt
synergistisch mit RITA in RITA-sensitiven Zellen. RITA-sensitive (1. Zeile) und RITAinsensitive Zellen (2. Zeile) wurden mit ABT-737 2 h vor RITA-Behandlung vorinkubiert. Nach
16 h (OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5) oder 24 h (OVCAR8, SKOV3, PBMNC) wurden die
Zellen mit TMRM gefärbt und die Depolarisierung der mitochondrialen Membran im
Durchflusszytomer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen
Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test
berechnet und p-Werte<0,05 mittels (*) gekennzeichnet.
Das anti-apoptotische Protein Bcl-2 wurde in der Linie OVCAR4 auch auf
Proteinebene durch RITA herunterreguliert (Abbildung 3.13 A). Da das Bcl-2-Protein
in der p53-null-Zelllinie OVCAR5 nicht detektierbar war, wurden zudem die antiapoptotischen Proteine Bcl-xL, Bcl-w und Mcl-1 näher betrachtet. Eine Behandlung
mit RITA führte hierbei zu einer Reduktion des Proteinlevels von Mcl-1 in beiden
Zelllinien. Bcl-xL wurde in der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4 reduziert.
Daraus ergab sich die Reduktion von mindestens einem anti-apoptotischen Bcl-2Proteinfamilienmitglied nach einer Behandlung mit RITA.
Durch die synergistische Wirkung des BH3-mimetics ABT-737 mit RITA in RITAsensitiven Zelllinien konnte die wichtige Rolle der anti-apoptotischen Faktoren der
Bcl-2-Proteinfamilie bestätigt werden (Abbildung 3.13 B, 1. Zeile). Interessanterweise
konnte eine Induktion von Zelltod nach ABT-737 und RITA-Behandlung in RITAinsensitiven Zellen nicht nachgewiesen werden (Abbildung 3.13 B, 2. Zeile).
3.2.5 Identifikation von Signalwegen, welche den RITA-induzierten Zelltod
vermitteln können
Bisher konnte geklärt werden, dass der RITA-induzierte Zelltod in mtp53exprimierenden Zellen oder in p53-null-Zellen unabhängig von der p53-Superfamilie
vermittelt werden kann. Weiterhin wurde die zentrale Rolle der mitochondrialen
Effektorproteine BAX und BAK sowie die Herunterregulation von anti-apoptotischen
Bcl-2-Proteinfamilienmitgliedern bei der RITA induzieren Apoptose im p53-defekten
System nachgewiesen.
Für die Identifikation von Signalwegen, welche den RITA-induzierten Zelltod in Zellen
mit defektem p53 vermitteln, wurde die Genexpression von Genen zentraler
Signaltransduktionswege (Apoptose, Autophagie, DNA-Reparatur, Nekrose, ERStress, MAPK-Kaskade, NF-κB, oxidativer Stress) (Ferreiro et al., 2010; Hakem,
60
Ergebnisse
2008; Han et al., 2011; van Loo et al., 2002; Oeckinghaus et al., 2011; Ray et al.,
2012;
Rosenfeldt
and
Ryan,
2011;
Samali
et
al.,
2010)
in
einem
Hochdurchsatzverfahren gemessen. (Tabelle 2.3). Für die Genexpressionsanalyse
wurden die Ovarialkarzinom-Zelllinien OVCAR3, -4, -5, -8, A2780, SKOV3,
TOV-112D und IGROV1 verwendet (Abbildung 3.14).
Ergebnisse
61
Abbildung 3.14: Regulation von 94 Genen zentraler zellulärer Signaltransduktionswege in
Ovarialkarzinom-Zelllinien nach RITA-Behandlung. Für die Genexpressionsanalyse wurden
die Zellen 8 h mit und ohne RITA inkubiert, die RNA isoliert, cDNA synthetisiert und eine
spezifische Anreicherung der Zielgene durchgeführt. Die Messung erfolgte mit Hilfe des
BioMarkTM-HD-Systems. Nach der Berechnung der ΔΔCt-Werte wurde eine Clusteranalyse
nach Euklidischem Gleichheitsmaß mit anschließendem Complete-Linkage-Verfahren
durchgeführt. Die Clusterbildung erfolgte sowohl hinsichtlich der Zellen als auch hinsichtlich
der Gene. Der Farbverlauf beschreibt die Mittelwerte der log2 ΔΔCt-Werte aus drei
unabhängigen Experimenten.
Wie schon bei der Analyse der p53-Zielgene (Abbildung 3.3), ergab auch die
Untersuchung der 94 Gene zentraler Signaltransduktionswege eine Gliederung in
RITA-sensitive
und
RITA-insensitive
Zellen
(Abbildung
3.14).
Statistische
Untersuchungen ergaben in der Gruppe der RITA-sensitiven Zellen ein signifikant
hochreguliertes Gen und 3 herunterregulierte Gene (Benjamini-Hochberg korrigierter
gepaarter t-Test p<0,05, FC>2; Tabelle 3.8).
Tabelle 3.8: Signifikant regulierte Gene zentraler Signaltransduktionswege nach Behandlung
mit RITA
Hochregulierte Gene nach RITA-Behandlung
(p-Wert <0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2)
Genname
DDIT3
RITA sensitiv
FC
3.23
RITA insensitiv
p-Wert
0.004585
Herunterregulierte Gene nach RITA-Behandlung
(p-Wert <0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2)
Genname
ATM
FANCM
BLM
RITA sensitiv
FC
-2.37
-2.13
-2.10
RITA insensitiv
p-Wert
0.021588
0.019861
0.004585
Bemerkenswert hierbei ist die durch RITA induzierte Herunterregulation von Genen,
welche für wichtige DNA-Reparaturproteine kodieren.
Neben der Expressionsanalyse von Regulatoren zentraler Signaltranduktionswege
wurde eine Transkriptomanalyse der p53-null-Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5
nach RITA-Behandlung durchgeführt. Diese ergab eine signifikante Regulation
(p-Wert<0,05, >20 regulierte Gene je Signalweg) der Insulin-, TNFβ und MAPKSignaltransduktionswege (Tabelle 3.9).
62
Ergebnisse
Tabelle 3.9: Regulierte Signalwege in der p53-null Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5 nach
Behandlung mit RITA
Signifikant regulierte Signalwege nach RITA-Behandlung
Signalweg
Anzahl signifikant
p-Wert
Hs_Insulin_Signaling_
WP481_59178
Hs_TGF_beta_Signaling_Pathway_
WP366_47976
Hs_MAPK_signaling_
pathway_WP382_54211
regulierter Gene
1.55E-05
25
2.33E-06
22
3.58E-04
22
In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte die Aktivierung des JNKSignaltranduktionsweges für die Sensitivität von wtp53-exprimierdenden Zellen des
Multiplem Myeloms gegenüber RITA-Behandlung identifiziert werden (Saha et al.,
2012). Übereinstimend mit diesen Ergebnissen zeigte die Transkriptomanalyse der
p53-null-Linie
OVCAR5
eine
Aktiverung
Signaltransduktionsweges (Abbildung 3.15).
des
JNK-
und
p38-
Ergebnisse
63
Abbildung 3.15: Regulation des MAPK-Signaltransduktionswegs in der p53-null-Zelllinie
OVCAR5. Für die Transkriptomanalyse wurden die Zellen 8 h mit und ohne RITA inkubiert.
Die anschließende Microarrayanalyse erfolgte mittels GeneChip® Human Gene 2.0 ST
Arrays. Mittels Signalwegsanalyse (Single-Experiment-Analysis, p-Wert<0,05, >20 regulierte
Gene je Signalweg) konnte der MAPK-Signalweg als einer der am stärksten regulierten
Signaltransduktionswege nach RITA-Behandlung identifiziert werden. Signifikant regulierte
Gene wurden mit gelbem Hintergrund dargestellt.
64
Ergebnisse
3.2.6 Involvierung des JNK- und p38-MAP-Kinase-Signalweges in den RITAvermittelten Zelltod der p53-defekten Zelllinien OVCAR3 und OVCAR5
Der MAPK-Signalweg kann bekanntermaßen in den ERK- (extracellular-signalregulated kinases), JNK- (Jun amino-terminal kinases) und den p38- (stressactivated protein kinases) Signalweg untergliedert werden, wobei insbesondere JNK
und p38 Apoptose vermitteln können (Morrison, 2012). Auf Grund dessen wurde
weiterhin die Funktion von JNK und p38 für den RITA-induzierten Zelltod in der
mtp53-Zelllinie OVCAR3 und der p53-null-Linie OVCAR5 näher untersucht
(Abbildung 3.16).
Ergebnisse
65
Abbildung 3.16: Inhibition von JNK oder p38 reduziert den RITA-vermittelten Zelltod.
OVCAR3- und OVCAR5-Zellen wurden mit und ohne (A) dem JNK-Inhibitor SP600125 oder
(B) dem p38-Inhibitor III für 2 h vorinkubiert. Anschließend erfolgte die Inkubation mit und
ohne RITA für 3 h um die Phosphorylierung von c-Jun mittels Western-Blot-Analyse
nachzuweisen. Die Messung der Apoptoseinduktion erfolgte nach 24 h Behandlung mit und
ohne RITA mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung Färbung am Durchflusszytometer. Jeder Balken
repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede
wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*)
gekennzeichnet.
Die Inhibition sowohl von JNK als auch von p38 führte zu einer vollständigen
Hemmung der c-Jun-Phosphorylierung (Abbildung 3.16 A und B, 1. Zeile).
Gleichermaßen wurde auch die Induktion der RITA-vermittelten Apoptose durch die
Inhibition JNK und p38 signifikant vermindert (Abbildung 3.16 A und B, 2. und 3.
Zeile). Hierbei war zu beobachten, dass die Inhibition von JNK eine stärkere
Hemmung des RITA-vermittelten Zelltods zur Folge hatte als die Inhibition von p38.
Infolgedessen wurde die Rolle von JNK durch RNAi-Experimente genauer betrachtet
(Abbildung 3.17).
66
Ergebnisse
Abbildung 3.17: Der spezifische Knockdown von JNK1 führt zu einer Verminderung der
RITA-induzierten Apoptose. 1. Zeile: Überprüfung der Knockdown-Effizienz in (A) OVCAR3und (B) OVCAR5-Zellen sowie Detektion von p-c-Jun mittels Western-Blot-Analyse. 2. Zeile:
Differentielle Expression der 45 bona fide p53-Zielgene nach RITA-Behandlung. Nach 8 h
Inkubation mit und ohne RITA erfolgte die Isolation der RNA mit anschließender
Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen die log2 ΔΔCt-Werte der Kontrolle (xAchse) aufgetragen gegen die log2 ΔΔCt-Werte nach JNK1-Knockdown (y-Achse). Jeder
Punkt entspricht dem Mittelwert des p53-Zielgens aus drei unabhängigen Experimenten. 3.
Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden (A) OVCAR3- und (B) OVCAR5Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer
gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD.
Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und pWerte<0,05 mit (*) gekennzeichnet.
Interessanterweise
genügte
die
Reduktion
des
JNK1-Proteins,
um
die
Phosphorylierung von c-Jun sowie die Induktion von Zelltod zu reduzieren (Abbildung
3.17, 1. und 3 Zeile). Das Ausmaß der Verminderung des Zelltods war dabei
vergleichbar
mit
der
pharmakologischen
Inhibition
sowohl
in
der
mtp53-
exprimierenden Zelllinie OVCAR3 als auch in der p53-null-Ovarialkarzinom-Zelllinie
OVCAR5. Dies deutet auf eine dominante Rolle von JNK1 für den RITA-induzierten
Zelltod hin. Jedoch konnte durch den Knockdown von JNK1 keine Veränderung in
der Regulation der p53-Zielgene festgestellt werden (Abbildung 3.17, 2. Zeile). Die
Aktivierung von JNK führt bekanntermaßen zur Phosphorylierung und Aktivierung der
Transkriptionsfaktors AP-1, zu welchem die Jun-, FOS-, ATF- und MAFF-Proteine
zählen (Shaulian, 2010). Bemerkenswerterweise konnten ATF3 und FOS als die
Gene mit der höchsten Induktion in den RITA-sensitiven Zellen identifiziert werden
(Tabelle 3.4). Zudem zeigt c-Jun eine starke Phosphorylierung nach Behandlung mit
RITA sowohl im mtp53- als auch im p53-null-System (Abbildung 3.16 und 3.17).
Folglich wurde der Einfluss von ATF3, FOS und c-Jun auf den RITA-vermittelten
Zelltod näher betrachtet (Abbildung 3.18).
Ergebnisse
67
Abbildung 3.18: Im p53-defekten System ist der RITA-induzierte Zelltod nicht von ATF3,
FOS oder c-Jun abhängig. (A) Transfektion der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4 mit
ATF3-siRNA. Überprüfung der Effizienz des ATF3-Knockdowns mittels Western-BlotAnalyse. 16 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und
MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei
unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem,
gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. (B) FOS-Knockdown
in der mtp53-exprimierenden Linie OVCAR4 und der p53-null-Linie OVCAR5. Die
Überprüfung der Knockdown-Effizienz wurde mittels qPCR durchgeführt. Dargestellt wurde
die relative Expression von FOS aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante
Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05
mit (*) gekennzeichnet. 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit
TMRM (OVCAR4) oder AnnexinV-FITC/PI-Färbung (OVCAR5) gefärbt und MOMP bzw.
Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei
unabhängigen Experimenten ±SD. (C) c-Jun-Knockdown in der mtp53-exprimierenden Linie
OVCAR3 und der p53-null-Linie OVCAR5. Überprüfung der Effizienz des c-Jun-Knockdowns
mittels Western-Blot-Analyse. 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit
TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert
das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD.
68
Ergebnisse
Überraschenderweise konnte weder die Reduktion des ATF3-Proteins noch die von
FOS oder c-Jun den Zelltod nach RITA-Behandlung vermindern. Der Knockdown von
ATF3 führte zudem zu einer Steigerung der Sensitivität gegenüber RITA.
Demzufolge ist ein Einfluss von AP-1 auf den RITA-vermittelten Zelltod im p53defekten System unwahrscheinlich.
Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass durch die Behandlung mit RITA
Zelltod unabhängig vom p53-Status induziert werden kann. In wtp53-exprimierenden
Zellen führte RITA zu einer wtp53-abhängigen Induktion von Zelltod, wohingegen in
Systemen mit mtp53 oder mit p53-null Status der Zelltod unabhängig von mtp53, p63
oder p73 induziert werden konnte. In diesen Systemen kam es nach RITABehandlung
zu
einer
Aktivierung
der
Caspase-Kaskade
sowie
zu
einer
Depolarisation der mitochondrialen Membran in Abhängigkeit von BAX und BAK.
Zudem konnte durch RITA eine Herunterregulation der Bcl-2-Proteine Bcl-2, Bcl-xL
und Mcl-1 festgestellt werden. Dies unterstreicht die Wichtigkeit des Mitochondriums
für die RITA-vermittelte Apoptose. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die
Induktion der mitochondrialen Apoptose durch die Aktivierung des JNK- und p38Signaltransduktionswegs ausgelöst wird, wobei insbesondere ein Knockdown von
JNK1 zu einer signifikanten Verminderung der Apoptose führte. In p53-defekten
Systemen kann RITA demnach mitochondriale Apoptose durch eine Aktivierung von
JNK und p38 induzieren.
Ergebnisse
69
3.3 Mechanismen des Cisplatin-induzierten Zelltods im p53mutierten System
3.3.1
Die
Rolle
von
mtp53
für
die
Cisplatin-Sensitivität
der
mtp53-
exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4
Neben der überraschenden Induktion von Zelltod im p53-defekten System nach RITA
konnte auch nach Cisplatin-Behandlung eine Induktion von Zelltod in mtp53exprimierenden Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 3.1). Demzufolge wurde
weiterhin untersucht, welche Rolle mtp53 für den Cisplatin-induzierten Zelltod hat
(Abbildung 3.19).
Abbildung 3.19: Cisplatin kann unabhängig von mtp53 Zelltod induzieren. Für die RNAiExperimente wurden die mtp53-exprimierenden Zelllinien (A) OVCAR3 und (B) OVCAR4
verwendet. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienz des TP53-Knockdowns mittels Western-BlotAnalyse. 2. Zeile: Differentielle Expression der 45 bona fide p53-Zielgene nach CisplatinBehandlung. Nach 8 h Inkubation mit und ohne Cisplatin erfolgte die Isolation der RNA mit
70
Ergebnisse
anschließender Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen die log2 ΔΔCt-Werte der
Kontrolle (x-Achse) aufgetragen gegen die log2 ΔΔCt-Werte nach TP53 Knockdown (yAchse). Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert des p53-Zielgens aus drei unabhängigen
Experimenten. 3. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit
AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder
Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD.
Trotz des effizienten Knockdowns von TP53 (Abbildung 3.19, 1. Zeile) konnte keine
Veränderung in der Induktion der 45 bona fide p53-Zielgene (Mann-Whitney-Test,
Bonferoni-Holm korrigiert) nachgewiesen werden (Abbildung 3.19, 2. Zeile). Ebenso
wurde
der
Cisplatin-induzierte
Zellentod
in
beiden
mtp53-exprimierenden
Ovarialkarzinom-Zelllinien nicht vermindert.
Somit kann Cisplatin Zelltod auch unabhängig von mtp53 induzieren.
3.3.2 Die Rolle von p63 und p73 für die Cisplatin-Sensitivität der p53-defekten
Zelllinie OVCAR4
Auf Grund der ausbleibenden Reaktion der Zellen auf den Knockdown von mtp53
wurde im Folgenden der Einfluss von p63 und p73 auf den Cisplatin-vermittelten
Zelltod näher untersucht (Abbildung 3.20).
Ergebnisse
71
Abbildung 3.20: Cisplatin kann unabhängig von p63 und p73 Zelltod in der Linie OVCAR4
induzieren. (A) Knockdown von TP63. Links: Überprüfung der Effizienz des TP63Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin
wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder
Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante
Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05
mit (*) gekennzeichnet. Rechts: Knockdown von TP63 mittels ON-TARGET siRNAs. Die
Überprüfung der Knockdown-Effizienz wurde mittels qPCR durchgeführt. Dargestellt wurde
die relative Expression von TP63 aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante
Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05
mit (*) gekennzeichnet. (B) Knockdown von TP73. Überprüfung der Effizienz des TP73Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin
wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder
Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD.
Durch den effizienten Knockdown von TP63 konnte der Cisplatin-induzierte Zelltod
signifikant reduziert werden (Abbildung 3.20 A, Links). Auf Grund der sehr geringen
Expression
von
p63
auf
Proteinebene
wurde
das
siRNA-Experiment
mit
ON-TARGET siRNAs wiederholt, um potentielle off-target-Effekte auszuschließen.
Hierbei konnten drei von vier verschiedenen siRNAs (Tabelle 2.5) eine signifikante
Reduktion von TP63 herbeiführen (Abbildung 3.20 A, Rechts). Jedoch konnte die
zuvor beobachtete Hemmung des durch Cisplatin induzierten Zelltods nicht mehr
beobachtet werden. Daraus konnte geschlossen werden, dass die zuvor beobachtete
Verminderung des Zelltods auf einen off-target-Effekt der siRNA zurückzuführen war.
Weiterhin wurde der Einfluss von p73 auf den Cisplatin-induzierten Zelltod
untersucht. Trotz des effizienten Knockdowns von TP73 konnte keine Hemmung des
Zelltods nach Cisplatin-Behandlung in der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4
festgestellt werden (Abbildung 3.20 B).
Mtp53 kann mit p63 und p73 interagieren und deren Funktionen beeinflussen
(Melino, 2011; Zawacka-Pankau et al., 2010). Um dies auszuschließen, wurde ein
dreifacher Knockdown von TP53, TP63 und TP73 durchgeführt (Abbildung 3.21).
72
Ergebnisse
Abbildung 3.21: Cisplatin kann unabhängig von mtp53, p63 und p73 Zelltod in der Zelllinie
OVCAR4 induzieren. (A) Die Überprüfung der Knockdown-Effizienz wurde mittels qPCR
durchgeführt. Dargestellt wurde die relative Expression von TP53, TP63 und TP73 aus drei
unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem,
gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. (B) 48 h nach
Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im
Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei
unabhängigen Experimenten ±SD.
Die Überprüfung der Knockdown-Effizienz ergab eine signifikante RNA-Reduktion
sowohl von TP53 als auch von TP63 und TP73 (Abbildung 3.21 A). Dennoch konnte
keine Hemmung des durch Cisplatin induzierten Zelltods nachgewiesen werden
(Abbildung 3.21 B).
Somit kann Cisplatin auch unabhängig von mtp53, p63 und p73 Zelltod induzieren.
3.3.3 Induktion von mitochondrialer Apoptose durch Cisplatin in den p53defekten Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4
Auf Grund der unabhängig von mtp53, p63 und p73 erfolgten Induktion von Zelltod in
der Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR4 wurde im Weiteren untersucht, inwiefern die
Aktivierung der Caspase-Kaskade eine zentrale Rolle für den Zelltod spielt
(Abbildung 3.22).
Ergebnisse
73
Abbildung 3.22: Induktion eines Caspase-abhängigen Zelltods nach Cisplatin-Behandlung.
(A) OVCAR3- und (B) OVCAR4-Zellen wurden mit und ohne pan-Caspase Inhibitor
z-VAD-FMK 2 h vorinkubiert. Anschließend erfolgte die Inkubation mit und ohne Cisplatin
für 48 h. Die Färbung der Zellen erfolgte mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung am
Durchflusszytometer. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen
Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test
berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet.
Durch den pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-FMK konnte der Zelltod nach CisplatinBehandlung in beiden Ovarialkarzinom-Zelllinien mit mtp53 nahezu vollständig
inhibiert werden (Abbildung 3.22). Die Aktivierung von Caspasen ist somit notwendig
um durch Cisplatin Zelltod zu induzieren.
Anschließend wurde näher untersucht inwiefern die porenbildenden mitochondrialen
Effektorproteine BAX und BAK einen Einfluss auf den Cisplatin-vermittelten Zelltod
im mtp53-exprimierenden System haben (Abbildung 3.23).
74
Ergebnisse
Abbildung 3.23: Induktion von MOMP durch Cisplatin Behandlung in der mtp53
Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR4. Abhängigkeit der durch Cisplatin induzierten
mitochondrialen Permeabilisation von (A) BAX (B) BAK und (C) BAX und BAK.
1. Zeile: Überprüfung der Effizienz der Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 2. Zeile:
48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und
MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei
unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem,
gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mittels (*) gekennzeichnet.
Die Überprüfung der Effizienz des BAX, BAK und BAX/BAK Knockdowns ergab eine
deutliche Reduktion der Expression dieser pro-apoptotischen Effektoren auf
Proteinebene (Abbildung 3.23, 1. Zeile). Durch die siRNA-vermittelte Depletion von
BAK konnte der Cisplatin-induzierte Zelltod partiell reduziert werden (Abbildung
3.23 B). Hingegen wurde durch den Doppelknockdown von BAX und BAK eine
nahezu vollständige Inhibition des Zelltods beobachtet (Abbildung 3.23 C).
Somit induzierte Cisplatin die Aktivierung von Caspasen und eine von BAX- und
BAK-abhängige Depolarisation der mitochondrialen Membran.
3.3.4 Die Rolle der pro-apoptotischen BH3-only-Proteine für die CisplatinSensitivität der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4
Mit Hilfe der Genexpressionsanalyse der 45 bona fide p53-Zielgene konnte NOXA
(PMAIP1) als eines der am stärksten regulierten pro-apoptotischen Gene in der
Gruppe der mtp53-exprimierenden Zellen identifiziert werden (Tabelle 3.4). Inwiefern
die Induktion der pro-apoptotischen BH3-only-Proteine wichtig ist für die Cisplatin
vermittelte Apoptose, wurde im Folgenden untersucht (Abbildung 3.24).
Ergebnisse
75
Abbildung 3.24: NOXA und PUMA sind wichtige Komponenten bei der Cisplatin-induzierten
Apoptose in der mtp53-Linie OVCAR4. Links: Überprüfung der Effizienz der Knockdowns
mittels Western-Blot-Analyse. Rechts: 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden
die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken
repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede
wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mittels (*)
gekennzeichnet.
Die Behandlung der mtp53-exprimierenden Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR4 mit
Cisplatin führte zu einer Induktion von NOXA und PUMA auf Proteinebene
(Abbildung 3.24, Links). Weder BIM, BID noch BAD wurde durch Cisplatin induziert.
Der effiziente Knockdown der pro-apoptotischen BH3-only-Proteine (Abbildung 3.24,
Links) führte ausschließlich im Falle von NOXA und PUMA zu einer Verminderung
der Cisplatin-vermittelten Apoptose (Abbildung 3.24, Rechts).
Auf Grund dessen konnten BAX und BAK sowie NOXA und PUMA als wichtige
Vermittler der Cisplatin-induzierten Apoptose identifiziert werden.
3.3.5 Die konstitutiven Level der Bcl-2-Proteine als prädiktive Marker in der
Zelllinienauswahl
Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die konstitutiv hohen Level des proapoptotischen
BH3-only-Proteins
NOXA
in
embryonalen
Keimzelltumoren
entscheidend für die hohe Sensitivität dieser wtp53-exprimierenden Tumore
gegenüber Cisplatin sind (Gutekunst et al., 2013). Auf Grund dessen wurde zunächst
die konstitutive Expression der pro-apoptotischen Proteine BAK, BAX, BAD, BID,
BIM, PUMA und NOXA sowie die der anti-apoptotischen Proteine Mcl-1, Bcl-w, Bcl-2
und Bcl-xL in der Zelllinienauswahl sowie in PBMNCs untersucht (Abbildung 3.25).
76
Ergebnisse
Abbildung 3.25: Konstitutive Expression der pro-apoptotischen Proteine BAK, BAX, BAD,
BID, BIM, PUMA und NOXA sowie die der anti-apoptotischen Proteine Mcl-1, Bcl-w, Bcl-2
und Bcl-xL in der Zelllinienauswahl. Analyse der Proteinexpression aus Proteinlysaten von
unbehandelten Proben der Zelllinien sowie von PBMNCs.
Für die mathematische Auswertung der Proteinexpressionsdaten erfolgte die
densitometrische Auswertung der Western-Blots mit anschließender Normierung auf
das Referenzprotein GAPDH. Die normierten Daten wurden nachfolgend zur
Berechnung des Verhältnisses aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen
herangezogen. Abschließend erfolgte die Korrelation dieser Werte mit den Daten der
Induktion von Zelltod nach Cisplatin und RITA (Abbildung 3.26).
Ergebnisse
77
Abbildung 3.26: Signifikante Korrelation des Verhältnisses aus pro- und anti-apoptotischen
Bcl-2-Proteinen. Mit Hilfe der densitometrischen Auswertung der Western-Blot-Analyse
wurde das Verhältnis aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen berechnet und
anschließend mit der Induktion von Zelltod nach (A) Cisplatin (1. Zeile: gesamte
Zelllinienauswahl, 2. Zeile: Zelllinien mit mtp53) und (B) RITA korreliert (Pearson-Korrelation
mit 95% Konfidenzintervall, p-Werte<0,05, r-Werte>0,5). Jeder Punkt steht stellvertretend für
eine Zelllinie.
Die Korrelation der Proteinlevel mit dem induzierten Zelltod nach Cisplatin ergab
einen signifikanten Zusammenhang (Abbildung 3.26 A, 1. Zeile). Somit ist das
konstitutive Verhältnis der Expressionen der pro- und anti-apoptotischen Bcl-2Proteine entscheidend für die Cisplatin-Sensitivität innerhalb der Zelllinienauswahl.
Ein derartiger Zusammenhang konnte für die Behandlung mit RITA nicht festgestellt
werden (Abbildung 3.26 B).
Im Weiteren wurde untersucht, inwiefern das Verhältnis der Bcl-2-Proteine in mtp53exprimierenden Zelllinien mit der Induktion von Zelltod nach Cisplatin korreliert.
Dabei konnte eine Korrelation mit höherer Signifikanz im Vergleich zur Betrachtung
der gesamten Zelllinienauswahl nachgewiesen werden (Abbildung 3.26 A, 2. Zeile).
Dies lässt auf einen starken Einfluss der Bcl-2-Proteine für die Cisplatin-Sensitivität
von Zellen mit mtp53 schließen.
78
Ergebnisse
Für die Identifikation von prädiktiven Markern für die Cisplatin-Sensitivität wurde im
Folgenden die Anzahl der am Verhältnis beteiligter Bcl-2-Proteine sukzessive
reduziert (Abbildung 3.27).
Abbildung 3.27: Reduktion der am Verhältnis beteiligten Bcl-2-Proteine zur Bestimmung der
im Minimum notwendigen Komponenten für eine Korrelation. Mit Hilfe der densitometrischen
Auswertung der Western-Blot-Analyse wurde das Verhältnis aus pro- und anti-apoptotischen
Bcl-2-Proteinen berechnet und anschließend die Anzahl der am Verhältnis beteiligten
Proteine, (A) der pro-apoptotischen, (B) der anti-apoptotischen reduziert. Die Berechnung
der Korrelation erfolgte durch eine Pearson-Korrelation mit 95% Konfidenzintervall (pWerte<0,05, r-Werte>0,5). Jeder Punkt steht stellvertretend für eine Zelllinie.
Die sukzessive Elimination von pro-apoptotischen Proteinen aus dem Verhältnis
führte zur Identifikation von NOXA und BIM als Faktoren, welche für eine signifikante
Korrelation nötig sind (Abbildung 3.27 A, Oben). Die Limitierung auf Zelllinien, welche
mtp53 exprimieren, verstärkte diesen Effekt (Abbildung 3.27 A, Unten).
Unter Beibehaltung von NOXA und BIM im Zähler des Verhältnisses erfolgte die
stufenweise Reduktion von anti-apoptotischen Proteinen aus dem Verhältnis. Hierbei
waren Bcl-w und Bcl-xL essentiell für eine signifikante Korrelation (Abbildung 3.27 B,
Oben). Wiederum führte die selektive Betrachtung der mtp53-exprimierenden
Zelllinien zu einer Erhöhung der Korrelation (Abbildung 3.27, Unten).
Ergebnisse
79
Bei der Betrachtung der einzelnen Komponenten des Verhältnisses NOXA, BIM und
Bcl-w, Bcl-xL genügte NOXA oder Bcl-w allein, um eine signifikante Korrelation zu
erhalten (Abbildung 3.28).
Abbildung 3.28: Signifikante Korrelation des Verhältnisses von NOXA und Bcl-w mit dem
Cisplatin-induzierten Zelltod. Mit Hilfe der densitometrischen Auswertung der Western-BlotAnalyse wurde das Expressionsniveau von (A) NOXA und (B) Bcl-w bestimmt und mit dem
Cisplatin-induzierten Zelltod korreliert (Pearson-Korrelation mit 95% Konfidenzintervall, pWerte<0,05, r-Werte>0,5). Jeder Punkt steht stellvertretend für eine Zelllinie.
Somit konnte gezeigt werden, dass die konstitutiven Level an NOXA oder Bcl-w
ausreichen, um die Sensitivität von Zellen gegenüber Cisplatin innerhalb der
Zelllinienauswahl vorherzusagen (Abbildung 3.28). Hohe Level an NOXA oder
niedrige Level an Bcl-w scheinen damit sensitive Zellen gegenüber Cisplatin zu
„primen“.
3.3.6 Modulation von NOXA und Bcl-w zur Sensitivierung von Zellen mit
geringer Cisplatin-Sensitivität
Das pro-apoptotische BH3-only-Protein NOXA konnte als prädiktiver Marker für den
Cisplatin-vermittelten
Zelltod
identifiziert
werden.
Eine
pharmakologische
Akkumulation von NOXA kann durch den Proteasomeninhbitor Bortezomib induziert
werden (Qin et al., 2005). Im Folgenden wurde versucht in der mtp53exprimierenden, Cisplatin-insensitiven Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR8, NOXA
durch Bortezomib zu akkumulieren (Abbildung 3.29).
80
Ergebnisse
Abbildung 3.29: Die durch Bortezomib induzierte Akkumulation von NOXA führt zu einer
NOXA-abhängigen Induktion von Apoptose. OVCAR8-Zellen wurden 2 h vor Inkubation mit
und ohne Cisplatin mit und ohne Bortezomib vorinkubiert. 1. Zeile: Überprüfung der
Effizienzen der Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 2. Zeile: 24 h nach Inkubation mit
und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod
im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei
unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem,
gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mittels (*) gekennzeichnet.
Die Behandlung mit Bortezomib führte zu einer deutlichen Induktion von NOXA,
welche durch die Kombinationsbehandlung mit Cisplatin noch verstärkt werden
konnte (Abbildung 3.29, 1. Zeile). Durch die Kombination von Bortezomib und
Cisplatin kam es zu einer deutlichen Induktion von Zelltod, welcher durch den
Knockdown von NOXA signifikant reduziert werden konnte (Abbildung 3.29, 2. Zeile).
Folglich kann die pharmakologische Modulation von NOXA Zelltod in Zellen mit
geringer Cisplatin-Sensitivität vermitteln.
Neben NOXA konnte das anti-apoptotische Bcl-2-Protein Bcl-w als prädiktiver Marker
der Cisplatin-Sensitivität identifiziert werden. Die Modulation von Bcl-w zur Erhöhung
der Sensitivität gegenüber Cisplatin war Gegenstand der folgenden Untersuchungen
(Abbildung 3.30).
Ergebnisse
81
Abbildung 3.30: Sowohl der Knockdown, als auch die pharmakologische Modulation von
Bcl-w führt zu einer signifikanten Induktion von Apoptose in nicht Cisplatin-sensitiven Zellen.
(A) Knockdown von Bcl-w in der Cisplatin-insensitiven Zelllinie OVCAR8. 1. Zeile:
Überprüfung der Effizienz der Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 2. Zeile: 48 h nach
Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt
und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus
drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels
zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. (B) 2 h
vor Inkubation mit und ohne Cisplatin erfolgte die Vorinkubation mit ABT-737. 48 h nach
Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt
und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus
drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels
zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet.
Durch den effizienten Knockdown von Bcl-w in der mtp53-exprimierenden Linie
OVCAR8 (Abbildung 3.30 A, 1. Zeile) konnte durch die Behandlung mit Cisplatin eine
signifikante Induktion von Zelltod herbeigeführt werden (Abbildung 3.30 A,
82
Ergebnisse
2. Zeile). Das BH3-mimetic ABT-737 bindet bevorzugt an Bcl-2, Bcl-xL und Bcl-w und
führt
dadurch
zu
einer
Verschiebung
des
zellulären
Gleichgewichts
aus
pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Familienproteinen (Oltersdorf et al., 2005). Die
Kombinationsbehandlung von ABT-737 mit Cisplatin führte zu einer signifikanten
Induktion von Apoptose in den beiden Cisplatin-insensitiven OvarialkarzinomZelllinien OVCAR8 und SKOV3 (Abbildung 3.30 B).
Somit konnte durch die vorangegangenen Untersuchungen festgestellt werden, dass
neben den wtp53-abhängigen Effekten Cisplatin auch p53-unabhängig Zelltod
induzieren kann. Dabei hatte zudem weder p63 noch p73 einen Einfluss auf die
Induktion von Apoptose. Der Cisplatin vermittelte Zelltod konnte auf die Aktivierung
der Caspase-Kaskade sowie auf die mitochondriale Depolarisation, in Abhängigkeit
von den porenbildenden Bcl-2-Proteinen BAX und BAK, zurückgeführt werden.
Zudem wurden die BH3-only-Proteine NOXA und PUMA als Vermittler der CisplatinSensitivität identifiziert. Bei der Untersuchung der konstitutiven Level der proapoptotischen Bcl-2-Proteine BAK, BAX, BAD, BID, BIM, PUMA und NOXA sowie
die der anti-apoptotischen Bcl-2-Proteine Mcl-1, Bcl-w, Bcl-2 und Bcl-xL in der
Zelllinienauswahl sowie in PBMNCs konnten NOXA und Bcl-w als prädiktive Marker
der Cisplatin-Sensitivität ermittelt werden. Die pharmakologische Modulation von
NOXA durch Bortezomib sowie die Modulation von Bcl-w durch RNAi oder ABT-737
führte zu einer Sensitivierung von Zellen mit geringer Cisplatin-Sensitivität. Dies
eröffnet die potentielle Möglichkeit Cisplatin refraktäre Tumore durch effektive
Kombinationsbehandlungen zu therapieren.
Diskussion
83
4. Diskussion
Mehr als drei Jahrzehnte nach der Entdeckung von TP53 im Jahre 1979 sind immer
noch zahlreiche Fragen bezüglich der detaillierten Funktion des Tumorsuppressors
ungeklärt. Zudem konnte in den letzten Jahren gezeigt werden, dass mtp53 zur
Tumorprogression nicht nur durch den Verlust der tumorsuppressiven Eigenschaften,
sondern auch durch den Zugewinn neuer, spezifischer mtp53-Funktionen („gain-offunction“) beiträgt (Goldstein et al., 2011).
In humanen Tumoren ist p53 in ca. 50% aller Fälle mutiert. Als typisches Beispiel für
p53-mutierte Tumore gelten hochgradig seröse Ovarialkarzinome, welche eine
Mutationsrate von nahezu 100% aufweisen (Rivlin et al., 2011). Behandelt werden
diese Tumore mittels platin-basierter Chemotherapie. Interessanterweise sprechen
diese Tumore initial trotz der hohen p53-Mutationsrate sehr gut auf die Platin-haltige
Therapie an. Therapie-refraktäre Tumore treten jedoch in 25% alle Fälle innerhalb
von vier Monaten auf (Cancer Genome Atlas Research Network, 2011). Im
Gegensatz
zu
den
serösen
Ovarialkarzinomen
liegt
p53
in
testikulären
Keimzelltumoren nahezu immer in der Wildtyp-Form vor (Heimdal et al., 1993; Peng
et al., 1993). Selbst im metastasierten Zustand können diese Tumore durch
Cisplatin-basierte Chemotherapie meist vollständig geheilt werden (Bosl and Motzer,
1997;
Einhorn,
2002).
In
vielen
anderen
Neoplasien
wie
beispielsweise
Lungentumore, welche p53-Mutationen in 50% aller Fälle aufweisen, zeigt Cisplatin
nur eine eingeschränkte Wirksamkeit (Cortinovis et al., 2008). Somit werden
verschiedenste Tumorentitäten mit unterschiedlichem p53-Status mit ähnlichen
Therapieschemata, aber sehr unterschiedlichen Erfolgsraten behandelt. Inwieweit
der p53-Status für die Sensitivität von Tumorzellen gegenüber DNA-schädigenden
Agenzien wie beispielsweise Cisplatin entscheidend ist, ist bislang nur unvollständig
geklärt. Unbestritten ist allerdings, dass die Platin-haltige Therapie mit erheblichen
Nebenwirkungen wie Nephrotoxizität, Neurotoxizität und Ototoxizität verbunden ist
(Galluzzi et al., 2012).
In den letzten Jahren wurden Substanzen
entwickelt, welche eine hohe
tumorspezifische Toxizität aufweisen, ohne dabei die zytotoxischen Eigenschaften
klassischer Chemotherapeutika zu vermitteln. Insbesondere die Entwicklung von
Molekülen, welche den in einer Vielzahl von Tumoren veränderten p53-
84
Diskussion
Signaltransduktionsweg reaktivieren, war in diesem Zusammenhang von Interesse.
Eine dieser p53-reaktivierenden Substanzen ist Nutlin-3. Das cis-Imidazolanalogon
bindet Mdm2, wodurch die Akkumulation von p53 und Mdm2 induziert wird (Vassilev
et al., 2004). Durch die Behandlung mit Nutlin-3 wird in proliferierenden Zellen ein
G1- und G2-Arrests induziert, wohingegen in wtp53-exprimierenden Tumorzellen
Apoptose ausgelöst wird (Tovar et al., 2006). Neben Nutlin-3 wurde das ThiophenDerivat RITA, welches sowohl wtp53 als auch mtp53 reaktivieren soll, identifiziert
(Issaeva et al., 2004; Zhao et al., 2010a). Im Gegensatz zu Nutlin-3 führt die
Behandlung mit RITA zu einer Reduktion von Mdm2 bei gleichzeitiger Stabilisierung
von p53, was eine tumorselektive Apoptose auslöst (Goldstein et al., 2011).
In der vorliegenden Arbeit sollte nun untersucht werden, inwiefern der p53-Status
eine Rolle in der zellulären Reaktion auf die Behandlung mit Nutlin-3, RITA und
Cisplatin spielt. Hierzu wurde eine geeignete Zellauswahl verwendet.
4.1 Reaktion von Zellen mit unterschiedlichem p53-Status auf die
Behandlung mit Nutlin-3, RITA und Cisplatin
Um die Effekte von Nutlin-3, RITA und Cisplatin vergleichen zu können, wurden
Zelllinien ausgewählt, die aus unterschiedlichen Tumorentitäten stammen und wtp53
oder mtp53 exprimieren oder den p53-null-Status aufweisen (Tabelle 3.1). Weiterhin
wurden Tumor-assoziierte Fibroblasten aus der humanen Lunge und PBMNCs von
gesunden Donoren in die Zellauswahl mit einbezogen, um die Tumorlinien mit
primären, nichtmalignen Zellen vergleichen zu können.
Für die Charakterisierung der Zelllinienauswahl wurde der Zelltod, der Zellzyklus und
die Regulation von p53-Zielgenen nach Nutlin-3, RITA und Cisplatin-Behandlung
näher untersucht. Die transkriptionelle Aktivität von p53 wurde mit Hilfe eines
Hochdurchsatzverfahrens bestimmt, welches die Messung von 48 Genen in 48
Proben simultan ermöglicht. Die Auswahl von 45 bona fide p53-Zielgenen erfolgte
hinsichtlich der durch die Gene regulierten zellulären Effekte, wobei insbesondere
Gene der Apoptose und des Zellzyklus berücksichtigt wurden (Riley et al., 2008; Wei
et al., 2006) (Tabelle 2.2).
Die Behandlung mit Nutlin-3 führte ausschließlich in den wtp53-exprimierenden
Tumorzelllinien NTERA-2D1 und H460 zu Zelltod (Abbildung 3.1 A). In allen anderen
Diskussion
85
wtp53-exprimierenden Tumorzellen sowie in Fibroblasten und PBMNCs wurde ein
G1-Arrest induziert. Ein G1-Arrest konnte auch in der Linie H460 nachgewiesen
werden, wohingegen NTERA-2D1 Zellen nahezu vollständig in die SubG1-Phase
übergingen. Durch die siRNA-vermittelte Depletion von wtp53 konnte der Nutlin-3induzierte Zelltod in NTERA-2D1 Zellen vollständig unterbunden werden (Abbildung
3.5 A). Übereinstimmend mit diesem Ergebnis wurde in einer früheren Studie die
hohe Sensitivität der embryonalen Hodenkarzinom-Zelllinie NTERA-2D1 gegenüber
Nutlin-3-Behandlung auf eine besonders hohe Empfindlichkeit dieser Zellen
gegenüber der Aktivierung von wtp53 zurückgeführt (Gutekunst et al., 2011).
Ursprünglich wurde postuliert, dass Nutlin-3 in wtp53-exprimierenden Tumorzellen
Apoptose induziert, wohingegen in nichtmalignen Zellen ein Zellzyklusarrest in der
G1- und G2-Phase auftritt (Tovar et al., 2006; Vassilev et al., 2004). In der hier
untersuchten Zellauswahl konnte in wtp53-exprimierenden Zellen jedoch vorwiegend
ein Zellzyklusarrest beobachtet werden, der nicht auf die nichtmalignen Zellen
beschränkt war, sondern auch in Tumorzellen auftrat. Dies stimmt mit einer Reihe
früherer Studien überein die ebenso belegen, dass eine Vielzahl an Tumorzellen aus
unterschiedlichen Entitäten mit wtp53 auf die Behandlung mit Nutlin-3 durch
Induktion von Zellzyklusarrest reagieren (Enge et al., 2009; Tovar et al., 2006).
Entsprechend führt die Behandlung mit Nutlin-3 zu einer vorwiegenden Regulation
von zellzyklusassoziierten p53-Zielgenen (Enge et al., 2009). In der vorliegenden
Studie konnte dies durch die Untersuchung der 45 bona fide p53-Zielgene bestätigt
werden (Abbildung 3.2). Insbesondere CDKN1A (p21) zeigte eine signifikante
Regulation in der Gruppe der wtp53-exprimierenden Zellen (Tabelle 3.2). P21 gilt als
Schlüsselprotein bei der Induktion eines p53-abhängigen G1-Arrests (Waldman et
al., 1995) und wurde schon in früheren Studien als Mediator des Zellzyklusarrests
nach Nutlin-3-Behandlung identifiziert (Tovar et al., 2006; Vassilev et al., 2004).
Neben der Induktion eines Zellzyklusarrests kann Nutlin-3 auch zur Induktion von
Apoptose in verschiedenen Tumorzelllinien, wie beispielsweise SJSA-1 und MHM
führen (Tovar et al., 2006).
Die Behandlung mit Nutlin-3 scheint somit abhängig von der intrinsischen Sensitivität
von Zellen gegenüber der Aktivierung von wtp53 Zellzyklusarrest oder Apoptose zu
induzieren.
Durch eine Behandlung mit RITA konnten zwei klar differenzierbare Phänotypen
identifiziert werden (Abbildung 3.1 B, 1. Grafik). Eine Gruppe zeigte eine verstärkte
86
Diskussion
Apoptose nach RITA-Behandlung (>60% apoptotische Zellen), wohingegen die
andere Gruppe eine sehr geringe Reaktion (<15% apoptotische Zellen) auf das p53reaktivierende Molekül zeigte. Innerhalb der Gruppe der RITA-sensitiven Zellen
befanden sich sowohl Zellen, welche wtp53 und mtp53 exprimieren, als auch die
Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5, welche eine p53-Deletion aufweist. Eine
Auswirkung der RITA-Behandlung auf den Zellzyklus konnte
in der hier
verwendeten Zellauswahl nicht beobachtet werden (Abbildung 3.1 B, 2.-4. Grafik).
Interessanterweise wurde durch Zhao et al. vorwiegend in p53-defekten Zellen ein
G2-Arrest nach RITA-Behandlung beschrieben und zwar nicht nur in Zellen, die
mtp53 exprimieren, sondern auch in den p53-null-Linien HCT116TP53-/-, H1299 und
Akata (Zhao et al., 2010a), was auf RITA-vermittelte Effekte unabhängig von p53
hindeutet.
Eine mögliche Abhängigkeit der Reaktion nach RITA-Behandlung von wtp53 konnte
in der vorliegenden Arbeit durch die siRNA-vermittelte Depletion von wtp53 in der
embryonalen Hodenkarzinomlinie NTERA-2D1 nachgewiesen werden (Abbildung 3.5
B). Dies entspricht den bisherigen Studien, welche RITA als wtp53-reaktivierendes
Molekül beschreiben (Burmakin et al., 2013; Enge et al., 2009; Grinkevich et al.,
2009; Hedström et al., 2009; Issaeva et al., 2004; Rinaldo et al., 2009; Spinnler et al.,
2011; Zhao et al., 2010b). Im Vergleich der beiden p53-reaktivierenden Substanzen
Nutlin-3 und RITA zeigten sich fundamentale Unterschiede. Die Behandlung mit
Nutlin-3 führte zu einem Zellzyklusarrest welcher selektiv in wtp53-exprimierenden
Zellen auftrat. Hingegen zeigte die Behandlung mit RITA überwiegend proapoptotische Effekte welche nicht auf wtp53-exprimierende Zellen beschränkt waren.
Dies führt zu dem Schluss, dass die Freisetzung von wtp53 aus dem Mdm2-p53
Komplex je nach aktivierender Substanz zu unterschiedlichen, p53-abhängigen
Effekten führt. Der molekulare Mechanismus dieser unterschiedlichen Reaktionen
konnte kürzlich geklärt werden. Die Bindung von RITA an wtp53 führt zur Freisetzung
des aktiven Mdm2 Proteins. Dieses induziert die proteasomale Degradation von p21
und hnRNP-K, welche beide für die Induktion von Zellzyklusarrest essentiell sind
(Enge et al., 2009). Zudem wird Mdm2 selbst herunterreguliert, wodurch HIPK2
aktiviert wird, welches p53 an Ser46 phosphoryliert und damit die Induktion von
Apoptose fördert (Rinaldo et al., 2009). Die Bindung von Nutlin-3 an Mdm2 hingegen
stabilisiert Mdm2 und führt zur Degradation von HIPK2 (Rinaldo et al., 2009).
Außerdem wird weder p21, noch hnRNP-K durch Nutlin-3 gebundenes Mdm2
Diskussion
87
proteasomal degradiert (Enge et al., 2009). In Abwesenheit von HIPK2 interagiert
wtp53 mit hnRNP-K, wodurch p21 und damit Zellzyklusarrest induziert wird (Rinaldo
et al., 2009).
Neben der Fähigkeit zur Reaktivierung von wtp53 konnte gezeigt werden, dass die
Bindung von RITA an mtp53 einen Teil der wtp53-Funktionen wiederherstellen kann
und Zelltod in Abhängigkeit von mtp53 vermittelt wird (Zhao et al., 2010a).
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden, dass eine
Behandlung mit RITA zur Induktion von p53-Zielgenen und zur Induktion von Zelltod
sowohl p53-abhängig als auch p53-unabhängig führen kann.
Interessanterweise zeigten Fibroblasten und PBMNCs keine Reaktion auf die
Behandlung mit RITA. Tatsächlich wurde schon in früheren Studien eine geringe
Empfindlichkeit von nichtmalignen Zellen gegenüber RITA nachgewiesen (Issaeva et
al., 2004; Saha et al., 2010). Ähnliches wurde auch bei der intraperitonealen
Administration von RITA in SCID-Mäusen beobachtet. Dabei kam es zu keinem
Gewichtsverlust der Mäuse, weshalb eine systemische Toxizität der Substanz wenig
wahrscheinlich ist (Burmakin et al., 2013).
Bemerkenswert bei der Behandlung mit RITA war das Auftreten von zwei klar
differenzierbaren
Phänotypen,
RITA-sensitive
und
-insensitive
Zellen
(Abbildung 3.1 B, 1. Grafik). Eine ähnliche Gruppierung wurde auch innerhalb der
Tumorzelllinien des National Cancer Institutes (NCI) nachgewiesen (Rivera et al.,
1999). In Nierenkarzinom-Zelllinien wurde gezeigt, dass RITA-sensitive Zelllinien
RITA intrazellulär akkumulieren können, wohingegen in RITA-resistenten Zellen nur
geringe RITA-Konzentrationen nachweisbar waren (Rivera et al., 1999). Die selektive
Akkumulation von RITA könnte somit eine Determinante für das Ansprechen auf
RITA-Behandlung sein. Bislang unbekannt ist, welcher Transporter für den Transport
von RITA verantwortlich ist. Da zelluläre Transportvorgänge in Tumorzellen oft
dereguliert
sind,
könnten
unterschiedlich
exprimierte
Aufnahme-
und
Effluxtransporter potentielle Marker für die Sensitivität gegenüber RITA-Behandlung
darstellen. So weisen beispielsweise proliferierende Tumorzellen häufig eine
Überexpression von Nährstofftransportern auf, um den erhöhten Bedarf an
Nährstoffen zu decken (Ganapathy et al., 2009). Ein potentieller Kandidat für den
Import von RITA könnte der Glucosetransporters 3 (GLUT3, SLC2A3) sein. Dieser
wird in hohem Maße in Tumorzellen, jedoch nur in geringem Maße in nichtmalignen
Zellen
exprimiert
(Yamamoto
et
al.,
1990).
Zusammenfassend
könnten
88
Diskussion
unterschiedlich exprimierte Aufnahme- oder Effluxtransporter potentielle Marker für
die RITA-Sensitivität darstellen, welche sowohl p53-abhängig als auch p53unabhängig vermittelt werden kann.
Neben den p53-reaktivierenden Substanzen wurde der Effekt des klassischen
genotoxischen Agens Cisplatin auf die Zelllinienauswahl näher untersucht. Im Falle
der
Behandlung
mit
Cisplatin
zeigte
sich
ein
kontinuierliches
Spektrum
an Sensitivitäten unabhängig vom p53-Status (Abbildung 3.1 C, 1. Grafik). Ein
Einfluss von wtp53 auf die Cisplatin-vermittelte Induktion von Zelltod in wtp53exprimierenden Zellen wurde durch den Knockdown von wtp53 in der Zelllinie
NTERA-2D1 gezeigt, welcher eine vollständige Inhibition des Zelltods zur Folge hatte
(Abbildung 3.5 C). Im Gegensatz zur Behandlung mit RITA wurde durch CisplatinBehandlung Apoptose in PBMNCs induziert. Zudem konnte die Induktion eines
S-Phasenarrests nachgewiesen werden, welcher unabhängig von der Sensitivität
gegenüber Cisplatin sowie unabhängig vom p53-Status war (Abbildung 3.1 C, 2.-4.
Grafik). Möglicherweise ist der in der Zelllinienauswahl auftretende S-Phasenarrest
auf die Aktivierung des Fanconi-Anaemia-Signaltransduktionsweges zurückzuführen.
So konnten mehrere Arbeitsgruppen belegen, dass ein S-Phasenarrests nach
Cisplatin-Behandlung unabhängig von p53 durch die Aktivierung des FanconiAnaemia-Signaltransduktionsweges eingeleitet werden kann (Deans and West,
2011; Sala-Trepat et al., 2000).
Die Analyse der Regulation der p53-Zielgene ergab hier, ähnlich wie nach einer
Behandlung mit Nutlin-3, eine Gruppierung nach p53-Status (Abbildung 3.4). Jedoch
zeigte sich auch in der Gruppe der mtp53-exprimierenden, Cisplatin-sensitiven Zellen
eine deutliche Regulation von p53-Zielgenen, wobei hier insbesondere PMAIP1
(NOXA) reguliert wurde (Tabelle 3.6). Kürzlich wurde gezeigt, dass NOXA
unabhängig von p53 Apoptose in Ovarialkarzinom-Zelllinien induzieren kann, indem
die BAX/SMAC-Achse alteriert wird (Lin et al., 2012).
Die Behandlung mit Cisplatin führt somit zu einer p53-abhängigen Regulation von
p53-Zielgenen, wobei Zelltod sowohl p53-abhängig als auch p53-unabhängig
induziert werden kann.
Zusammenfassend führte die Behandlung mit Nutlin-3 ausschließlich in wtp53exprimierenden Zelllinien vorwiegend zu Zellzyklusarrest, welcher mit der Induktion
von CDKN1A (p21) einherging. Innerhalb der Zelllinienauswahl konnte durch die
Diskussion
89
Behandlung mit RITA oder Cisplatin Apoptose sowohl abhängig als auch unabhängig
vom p53-Status induziert werden. Interessanterweise zeigten primäre, nichtmaligne
Zellen ausschließlich auf die Behandlung mit RITA keine Reaktion. Somit könnte
RITA als potentiell tumorselektive Substanz eine Option darstellen, Tumore mit
unterschiedlichem p53-Status zu therapieren.
4.2 RITA und Cisplatin können
unabhängig
von der
p53-
Superfamilie Apoptose induzieren
Der Tumorsuppressor p53 spielt eine entscheidende Rolle bei der Integration
verschiedener Signale und vermittelt die zelluläre Antwort auf verschiedene Stimuli,
wie DNA-Schäden und onkogenen Stress. In einer Vielzahl von Tumoren ist die
Funktion von p53 entweder durch Mutationen oder durch Defekte in p53regulierenden
Signalwegen
kompromittiert.
Die
Identifikation
der
zur
p53-
Superfamilie gehörigen Proteine p63 und p73 führte zu der Annahme, dass die drei
Gene überlappende Funktionen in humanen Tumoren aufweisen (Melino et al., 2003;
Yang and McKeon, 2000). Im Gegensatz zu p53 treten Mutationen in p63 oder p73
nur sporadisch auf, weshalb p63 und p73 potentiell Funktionen von p53 übernehmen
können (Hagiwara et al., 1999; Melino et al., 2002; Sunahara et al., 1999).
Insbesondere
die
Homologien
in
der
DNA-Bindedomäne
und
der
Oligomerisierungsdomäne deuten auf die Regulation einer gemeinsamen Gruppe
von Genen hin (Deyoung and Ellisen, 2007).
4.2.1 RITA und Cisplatin können im p53-defekten System unabhängig von der
p53-Superfamilie Zelltod induzieren
In der vorliegenden Studie konnte die Sensitivität von der wtp53-exprimierenden
Zelllinie NTERA-2D1 nach Nutlin-3-, RITA- und Cisplatin-Behandlung auf die
Aktivierung von wtp53 zurückgeführt werden. Jedoch konnte Zelltod nach RITA- und
Cisplatin-Behandlung auch in Systemen mit defektem p53 nachgewiesen werden.
Somit stellte sich die Frage, inwiefern mtp53 oder p63 bzw. p73 den Zelltod in den
p53-defekten Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5 vermitteln. Der Knockdown
von mtp53 in den hier untersuchten Zelllinien hatte keinen Einfluss auf die Induktion
90
Diskussion
von Zelltod nach RITA- (Abbildung 3.7) oder Cisplatin-Behandlung (Abbildung 3.19).
Ebenso hatte die siRNA-vermittelte Depletion von mtp53 keinen Einfluss auf die
Regulation
der
p53-Zielgene
nach
RITA-
oder
Cisplatin-Behandlung.
Bekanntermaßen kann es zu Interaktionen zwischen mtp53 und p63 oder p73
kommen (Li and Prives, 2007; Melino, 2011). Jedoch hatte weder der Knockdown
von p63 noch der von p73 einen Einfluss auf den Zelltod nach RITA(Abbildung 3.8 und 3.9 A und B) oder Cisplatin-Behandlung (Abbildung 3.20). Auch
der Doppelknockdown von p63 und p73 in der p53-null Ovarialkarzinomlinie
OVCAR5 führte zu keiner Hemmung des Zelltods nach RITA-Behandlung (Abbildung
3.9 C). Ebenso unbeeinflusst blieben die durch RITA differentiell regulierten p53Zielgene. Ähnliches ergab sich durch den Dreifachknockdown von mtp53, p63 und
p73 in der Zelllinie OVCAR4 nach Cisplatin-Behandlung (Abbildung 3.21). Somit
scheinen sowohl RITA als auch Cisplatin Effekte unabhängig von der p53Superfamilie vermitteln zu können.
Im Falle von RITA wird eine mögliche Wirkung unabhängig von der p53-RITAInteraktion durch die Induktion von Apoptose in der p53-null-Ovarialkarzinom-Zelllinie
OVCAR5 unterstrichen (Abbildung 3.1 B, 1. Grafik). Ein RITA-vermittelter Zelltod
wurde auch von Di Conza und Mitarbeiter in der p53-null-Ewig-Sarkom-Zelllinie
Sk-N-MC beschrieben (Di Conza et al., 2012). Somit gibt es offensichtlich Effekte
von RITA, die von einer direkten p53-RITA-Interaktion unabhängig sind.
Ursprünglich wurde RITA in einem Drug-Screening Verfahren identifiziert, in
welchem spezifisch nach p53-interagierenden Substanzen gesucht wurde (Issaeva
et al., 2004). Hierfür wurde die wtp53-exprimierende Zelllinie HCT116TP53+/+ und die
p53-null-Linie HCT116TP53-/- verwendet (Issaeva et al., 2004). Beide Zelllinien
wurden mit der Substanzbibliothek des National Cancer Institutes behandelt und die
Inhibition der Proliferation mittels WST-1-Assay gemessen (Issaeva et al., 2004).
RITA (NSC652287) führte hierbei selektiv in der wt53-exprimierenden Linie
HCT116TP53+/+ zur Inhibition der Proliferation (Issaeva et al., 2004). Die direkte
Interaktion von RITA mit wtp53 wurde anschließend
mittels Fluoreszenz-
Korrelations-Spektroskopie nachgewiesen (Issaeva et al., 2004). Auf Grund dieser
Ergebnisse wurde die Bindung von RITA an wtp53 als zentral für die anti-proliferative
Aktivität von RITA betrachtet. Das in dieser Studie verwendete Verfahren schließt
jedoch nicht aus, dass RITA neben p53 auch andere zelluläre Mechanismen
Diskussion
91
beeinflusst und Zelltod abhängig vom zellulären Hintergrund, aber unabhängig von
p53, induziert. Interessanterweise konnte auch eine direkte Interaktion von RITA mit
p53 in nachfolgenden Untersuchungen der p53-RITA-Interaktion mittels NMR und
computerbasierten Docking-Studien nicht reproduziert werden (Espinoza-Fonseca,
2005; Krajewski et al., 2005).
Mögliche Mechanismen, wie RITA unabhängig von der direkten Interaktion mit p53
wirken kann, wurden von mehreren Arbeitsgruppen beschrieben. So konnte gezeigt
werden, dass eine Behandlung mit RITA die Phosphorylierung von H2AX induziert,
wodurch eine DNA-Schadensantwort ausgelöst wird (Ahmed et al., 2011; Yang et al.,
2009a, 2009b). Weiterhin führt die Behandlung mit RITA zu DNA-DNA- sowie zu
DNA-Protein-Quervernetzungen
welche
mit
der
Induktion
von
Zelltod
in
Nierenkarzinom-Zelllinien korrelieren (Nieves-Neira et al., 1999). Zudem wurde eine
direkte Bindung von RITA an die Thioredoxinreduktase 1 (TrxR1) nachgewiesen,
wodurch ROS induziert wurden (Hedström et al., 2009). Somit ist es möglich, dass
RITA in der hier verwendeten Zelllinienauswahl Zelltod, sowie die Induktion von p53Zielgenen unabhängig von mtp53 vermittelt.
Interessanterweise scheint es aber durchaus mtp53-exprimierende Tumorzelllinien
zu geben, bei denen der RITA-vermittelte Zelltod zumindest teilweise von mtp53
abhängig ist. So kann der Zelltod nach RITA-Behandlung durch die siRNA-vermittelte
Depletion von p53R273H in der epidermoiden Karzinomzelllinie A431 partiell reduziert
werden (Zhao et al., 2010a). In den in der vorliegenden Arbeit verwendeten
Ovarialkarzinom-Zelllinien OVCAR3 (p53R248Q) und OVCAR4 (p53L130V) führte der
Knockdown von mtp53 hingegen zu keiner Hemmung des RITA-induzierten Zelltods
(Abbildung 3.7). In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte gezeigt werden, dass
die Behandlung mit RITA eine Aktivierung des JNK-Signaltransduktionswegs mit
anschließender Aktivierung von wtp53 zur Folge hat (Saha et al., 2012). Aktiviertes
wtp53 verstärkt nun in einem positiven feedback-loop die Aktivität von JNK (Saha et
al., 2012). Eine zentrale Kinase im JNK-Signaltransduktionsweg ist MAP2K3. Gurtner
et al. konnten zeigen, dass die p53-Mutanten p53R273H, p53R175H und p53R280K die
Expression des MAP2K3 Proteins induzieren (Gurtner et al., 2010). Die in der Studie
von Zhao et al. verwendete Zelllinie A431, weist die p53-Mutation p53R273H auf (Zhao
et al., 2010a), welche MAP2K3 induzierten kann. Somit könnte die verstärkte
Aktivierung des JNK-Signaltransduktionsweges durch mtp53 in dieser Linie die
partielle Abhängigkeit des Zelltods von mtp53 erklären. Interessanterweise weisen
92
Diskussion
die RITA-sensitiven, mtp53-exprimierenden Zellen, in der vorliegenden Arbeit andere
Mutationen (OVCAR3: p53R248Q, OVCAR4: p53L130V) auf. Durch eine mtp53unabhängige Aktivierung des JNK-Signaltransudktionsweges ist es möglich, dass
diese Zellen auch unabhängig von mtp53 durch RITA-Behandlung Zelltod induzieren
können.
Tatsächlich wurde bereits durch mehrere Arbeitsgruppen beschrieben, dass
unterschiedliche p53-Mutationen zu unterschiedlichen Phänotypen führen können.
Die p53-Mutante p53R248Q, nicht aber p53R248W, erhöht die Invasivität der
Lungenkarzinom-Zelllinie H1299 (Yoshikawa et al., 2010). Weiterhin wurde gezeigt,
dass Zellen welche p53R175H exprimieren ein erhöhte Metastasierungsrate aufweisen
(Liu et al., 2000), wohingegen in Tumorzellen mit p53R175P Zellzyklusarrest induziert
wird (Rowan et al., 1996). Zudem wurde bei Brustkrebspatienten eine signifikante
Korrelation zwischen einer schlechten Prognose und dem Auftreten von der
missense-Mutation p53R248W und Mutationen im Codon 179 nachgewiesen (Olivier et
al., 2006). Ähnlich den unterschiedlichen Phänotypen, welche durch unterschiedliche
p53-Mutationen vermittelt werden, könnte eine Behandlung mit RITA in Zellen mit
unterschiedlichen p53-Mutationen zu mtp53-abhängigen oder mtp53-unabhängigen
Effekten führen.
Ähnlich wie nach der Behandlung mit RITA, konnte auch der Zelltod nach CisplatinBehandlung nicht durch einen Knockdown von mtp53 in den OvarialkarzinomZelllinien OVCAR3 und OVCAR4 reduziert werden. Dementsprechend konnte auch
in Nierenkarzinom- und Osteosarkom-Zelllinien eine p53-unabhängige Induktion von
Apoptose nach Cisplatin-Behandlung nachgewiesen werden (Cummings and
Schnellmann, 2002; Woessmann et al., 2002). Interessanterweise interagiert nur ein
keiner Anteil des intrazellulären Cisplatins mit der chromosomalen DNA, wodurch die
Inhibition der Replikation nur einen Teil der durch Cisplatin vermittelten Reaktionen
darstellen könnte (Eastman, 1990). Dies bestätigte sich durch eine Studie mit
entkernten humanen Zellen, in welchen Cisplatin Zelltod induzierte, der unabhängig
von DNA-Schäden und unabhängig vom p53-Status war (Mandic et al., 2003). Durch
die elektrophilen Eigenschaften des aktiven Cisplatin-Moleküls kommt es neben der
Interaktion mit der DNA auch zu Cisplatin-Protein-Interaktionen (Karasawa et al.,
2013). Beispielsweise bindet Cisplatin bevorzugt an einen spannungsabhängigenAnionenkanal in der mitochondrialen Membran, wodurch es zur Freisetzung von
Diskussion
93
Cytochrom C kommt und p53-unabhängig Apoptose induziert wird (Yang et al.,
2006).
4.2.2 RITA und Cisplatin können Zelltod im p53-defekten System durch die
Induktion von mitochondrialer Apoptose induzieren
Die Abhängigkeit des durch RITA und Cisplatin induzierten Zelltods in p53-defekten
Zelllinien konnte auf die Aktivierung von Caspasen zurückgeführt werden (Abbildung
3.10 und Abbildung 3.22). Übereinstimmend mit diesem Ergebnis, wurde bereits
mehrfach die Aktivierung von Caspasen als Grundlage des RITA- und Cisplatinvermittelten Zelltods in wtp53 und mtp53-exprimierenden Zellen nachgewiesen
(Gutekunst et al., 2011; Jiang et al., 2009; Saha et al., 2010; Zhao et al., 2010a,
2010b). In der vorliegenden Arbeit führte zudem die siRNA-vermittelte Depletion der
pro-apoptotischen Effektorproteine BAX und BAK zu einer vollständigen Inhibition
der durch RITA (Abbildung 3.11) oder Cisplatin induzierten (Abbildung 3.23)
Apoptose. Dies deutet auf die Aktivierung des intrinsischen Apoptoseweges sowohl
nach RITA- als auch nach Cisplatin-Behandlung hin. Neben der Wichtigkeit der
intrinsischen Apoptose wird auch eine Aktivierung der extrinsischen Signalkaskade
mittels Caspase8-Inhibitor beschrieben (Paul et al., 2012; Saha et al., 2010). Die
Interaktion des extrinsischen mit dem intrinsischen Signalweg erfolgt durch die
Caspase8-vermittelte Proteolyse des pro-apoptotischen Bcl-2-Proteins BID. Die
trunkierte Form tBID induziert ihrerseits die Freisetzung von Cytochrom C aus der
mitochondrialen Membran und stellt damit die Verbindung zwischen extrinsischer
und intrinsischer Signaltransduktion dar (Tait and Green, 2010). Würde eine
Behandlung mit RITA oder Cisplatin zu einer Aktivierung der extrinsischen
Signalkaskade in OVCAR4 oder OVCAR5 Zellen führen, würde die siRNA-vermittelte
Depletion von BAX und BAK nur eine partielle Inhibition der Apoptose zur Folge
haben. Da es jedoch zu einer vollständigen Hemmung des Zelltods nach RITA- und
Cisplatin-Behandlung kommt, ist nicht von einer Aktivierung der extrinsischen
Signalkaskade auszugehen.
Als zentrale Regulatoren der mitochondrialen Apoptose gelten die Proteine der Bcl-2Familie. Sowohl in RITA- als auch in Cisplatin-sensitiven Zelllinien zeigte sich bei der
Analyse der p53-Zielgene eine signifikante Regulation der pro-apoptotischen BH3only-Gene BBC3 (PUMA) und PMAIP1 (NOXA) (Tabelle 3.4 und 3.6). Der
94
Diskussion
Knockdown dieser Gene zeigte jedoch keinen Effekt auf den RITA-induzierten
Zelltod in der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4 (Abbildung 3.12). Auch die
siRNA-vermittelte Depletion anderer prominenter BH3-only-Proteine konnte den
RITA-vermittelten Zelltod nicht verringern. Zudem zeigten weder NOXA noch PUMA
oder andere BH3-only-Proteine eine Hochregulation auf Proteinebene. Auf Grund
dessen scheinen die hier untersuchten pro-apoptotischen BH3-only-Proteine keine
Rolle für den RITA-induzierten Zelltod zu spielen. Neben der signifikanten Regulation
der pro-apoptotischen Gene zeigte sich auch eine starke Herunterregulation des antiapoptotischen Gens Bcl-2 (Tabelle 3.4). Diese Regulation wurde bereits in wtp53exprimierenden Zellen nachgewiesen (Grinkevich et al., 2009). Auf Proteinebene
konnte die Herunterregulation von Bcl-2 in der Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR4
bestätigt werden (Abbildung 3.13 A). Übereinstimmend mit früheren Studien in
wtp53- und mtp53-exprimierenden Zelllinien (Burmakin et al., 2013; Grinkevich et al.,
2009; Saha et al., 2010, 2012; Zhao et al., 2010a) führte eine Behandlung mit RITA
auch zu einer Herunterregulation des Mcl-1 Proteins in den OvarialkarzinomZelllinien OVCAR4 und OVCAR5 (Abbildung 3.13 A). Zudem wurde Bcl-xL in der
Zelllinie OVCAR4 herunterreguliert. Somit erfolgt nach RITA-Behandlung die
Herunterregulation von mindestens einem anti-apoptotischen Bcl-2-Protein. Obwohl
auf Proteinebene keine Hochregulation von pro-apoptotischen BH3-only-Proteinen
auftritt
(Abbildung
3.12),
kommt
es
deshalb
zu
einer
Verschiebung
des
Gleichgewichts aus pro- und anti-apoptotischen Proteinen zu Gunsten der proapoptotischen. Jedoch führte die siRNA-vermittelte Depletion von NOXA nicht zu
einer Inhibition der RITA-vermittelten Apoptose in der Ovarialkarzinom-Zelllinie
OVCAR4 (Abbildung 3.12). In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde postuliert,
dass BAX und BAK durch anti-apoptotische Bcl-2-Proteine gebunden werden und
dadurch MOMP inhibiert wird (Willis et al., 2007). Die Bindung pro-apoptotischer
BH3-only-Proteine an die anti-apoptotischen Familienmitglieder führt zur Freisetzung
von BAX und BAX, wodurch Cytochrom C freigesetzt wird (Willis et al., 2007). Da die
Behandlung mit RITA zu einer Herunterregulation anti-apoptotischer Bcl-2-Proteine
führt, kann es somit zu einer Freisetzung von BAX und BAK mit anschließender
Freisetzung von Cytochrom C kommen, ohne dass pro-apoptotische BH3-onlyProteine involviert werden. Zudem ist es möglich, dass der Knockdown eines
einzelnen BH3-only-Proteins ungenügend ist, um die Inhibition von BAX und BAK
durch anti-apoptotische Bcl-2-Proteine zu unterbinden. Dementsprechend wurde in
Diskussion
95
einer früheren Studie gezeigt, dass ein Doppelknockdown von PUMA und NOXA, zu
einer partiellen Hemmung der durch RITA vermittelten Apoptose führte (Enge et al.,
2009).
Die Wichtigkeit des Verhältnisses Mcl-1:NOXA wurde durch den synergistischen
Effekt von ABT-737 in RITA-sensitiven, p53-defekten Zellen, bestätigt (Abbildung
3.13 B). Die Sensitivität von Zellen gegenüber ABT-737 wird durch das Proteinlevel
von Mcl-1 bestimmt (van Delft et al., 2006; Konopleva et al., 2006; Tromp et al.,
2012; Yecies et al., 2010). Da nach RITA-Behandlung Mcl-1 reduziert und das
Proteinlevel von NOXA unbeeinflusst bleibt, könnte dies die Hypersensitivität
gegenüber Kombinationsbehandlung mit ABT-737 erklären.
Interessanterweise konnte der synergistische Effekt ausschließlich in RITAsensitiven Zellen beobachtet werden. In Tumorzelllinien mit geringer RITASensitivität sowie in PBMNCs zeigte die Kombinationsbehandlung mit ABT-737
keinen verstärkten Zelltod. Dies deutet erneut darauf hin, dass die intrazelluläre
Konzentration von RITA in RITA-insensitiven Zellen möglicherweise nicht ausreicht,
um einen Koeffekt mit ABT-737 auslösen zu können. Wie bereits erwähnt, könnte ein
vermehrter Import oder reduzierter Efflux von RITA in RITA-sensitiven Zellen, eine
mögliche Determinante für das Ansprechen auf RITA und damit für den
synergistischen Effekt mit ABT-737 sein.
Im Gegensatz zur Behandlung mit RITA kommt es nach Cisplatin-Behandlung durch
den Knockdown von PMAIP1 (NOXA) und BBC3 (PUMA) zu einer signifikanten
Hemmung des Zelltods in der mtp53-exprimierenden Ovarialkarzinom-Zelllinie
OVCAR4 (Abbildung 3.24). Zudem führte die Behandlung mit Cisplatin in Cisplatinsensitiven Zellen zu einer Induktion von PMAIP1 (NOXA) und BBC3 (PUMA) sowohl
auf Gen-, als auch auf Proteinebene. Im Falle einer Behandlung mit RITA zeigte sich
eine Induktion von PMAIP1 (NOXA) und BBC3 (PUMA) nur auf Genebene, nicht
aber auf Proteinebene, weshalb der Knockdown von PMAIP1 (NOXA) und BBC3
(PUMA) keinen Einfluss auf die Induktion von Zelltod haben könnte.
Bei der Betrachtung der konstitutiven Level der Bcl-2-Proteine innerhalb der
Zelllinienauswahl erwies sich das Verhältnis aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2Proteinen als prädiktiv für das Ansprechen auf Cisplatin (Abbildung 3.26). Für eine
Behandlung mit RITA konnte eine derartige Korrelation nicht nachgewiesen werden
(Abbildung 3.26 B). Die konstitutiven Proteinlevel von NOXA und Bcl-w konnten als
96
Diskussion
prädiktiv für das Ansprechen auf Cisplatin innerhalb der Zellauswahl identifiziert
werden (Abbildung 3.28).
Die wichtige Rolle der konstitutiven Proteinlevel der Bcl-2-Proteinfamilie für das
Ansprechen auf Chemotherapie wurde kürzlich in mehreren Studien gezeigt (Ni
Chonghaile et al., 2011; Vo et al., 2012). Hierbei bestimmt die zelluläre Ausstattung
mit anti-apoptotischen Proteinen den apoptotischen Schwellenwert der Zellen, was
als mitochondrial-priming bezeichnet wird (Ni Chonghaile et al., 2011). Die Inhibition
der anti-apoptotischen Proteine in diesen Zellen führt zur BAX/BAK Oligomerisierung
sowie zur Freisetzung von Cytochrom C (Certo et al., 2006).
Interessanterweise wurden in der vorliegenden Arbeit NOXA und Bcl-w als prädiktiv
für die Cisplatin-Sensitivität identifiziert. Die Modulation dieser Proteine könnte eine
Möglichkeit darstellen, Cisplatin-insensitive Zellen in einen geprimten Zustand zu
überführen, um anschließend durch die Gabe von Cisplatin Apoptose zu induzieren.
Kürzlich wurde gezeigt, dass der Proteasomeninhibitor Bortezomib zu einer
Akkumulation von NOXA führt (Dengler et al., 2014; Pérez-Galán et al., 2006).
Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen konnte in der Cisplatin-insensitiven
Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR8 NOXA durch Behandlung mit Bortezomib
akkumuliert werden (Abbildung 3.29). Die Behandlung mit Bortezomib alleine führte
nicht
zur
Induktion
von
Zelltod.
Apoptose
wurde
erst
durch
die
Kombinationsbehandlung von Bortezomib mit Cisplatin induziert. Somit überführt die
Behandlung mit Bortezomib die Zellen in einen „geprimten“ Zustand, in welchem
Apoptose durch Zugabe von Cisplatin induziert werden kann. Ähnliches konnte durch
die Inhibition von Bcl-w erreicht werden. Das anti-apoptotische Bcl-2-Protein Bcl-w
wurde schon frühzeitig als wichtiger Mediator von Apoptose nach der Behandlung mit
DNA-schädigenden Agenzien identifiziert (Pritchard et al., 2000). Der Knockdown
von Bcl-w in Cisplatin-insensitiven Zellen führte zu einer signifikanten Induktion von
Zelltod nach Cisplatin-Behandlung (Abbildung 3.30 A). Zudem konnten die Cisplatininsensitiven
Ovarialkarzinom-Zelllinien
OVCAR8
und
SKOV3
durch
die
Kombinationsbehandlung von Cisplatin mit ABT-737 sensitiviert werden (Abbildung
3.30 B). Ähnlich der Akkumulation von NOXA überführte die Reduktion oder
Inhibition von Bcl-w die Cisplatin-insensitiven Zellen in einen „geprimten“ Zustand, in
welchem nun Apoptose durch die Gabe von Cisplatin induziert werden konnte.
Kürzlich wurde gezeigt, dass neben der Hemmung der anti-apoptotischen Proteine
Bcl-w, Bcl-2 und Bcl-xL die Behandlung mit ABT-737 auch eine Modulation der
Diskussion
97
Mcl1/NOXA-Achse in Ovarialkarzinom-Zelllinien zur Folge hat (Simonin et al., 2013).
Dies war auf die Reduktion von Mcl-1 und die Akkumulation von NOXA
zurückzuführen, wodurch sich das Mcl-1:NOXA Verhältnis zu Gunsten des proapoptotischen Proteins verschiebt (Simonin et al., 2013). ABT-737 ist damit eine
Substanz, welche Zellen in einen „geprimten“ Zustand überführen kann.
Zusammenfassend konnten NOXA und Bcl-w als zentrale Determinanten der
Cisplatin-Sensitivität innerhalb der Zelllinienauswahl identifiziert werden. Die
pharmakologische Modulation dieser Komponenten durch Proteasomeninhibitoren
oder
BH3-mimetics,
könnte
die
Behandlung
Cisplatin-refraktärer
Tumore
ermöglichen.
4.3 RITA kann durch die Aktivierung von JNK und p38 Zelltod im
p53-defekten System induzieren
In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass RITA neben den bekannten p53abhängigen Effekten (Burmakin et al., 2013; Enge et al., 2009; Grinkevich et al.,
2009; Hedström et al., 2009; Issaeva et al., 2004; Rinaldo et al., 2009; Spinnler et al.,
2011; Zhao et al., 2010a, 2010b) auch unabhängig von p53 Signalwege aktivieren
kann, welche zu Apoptose führen. Ungeklärt war jedoch, welche Signalwege durch
RITA-Behandlung in p53-defekten Systemen aktiviert werden. Um beteiligte Wege zu
identifizieren, wurde eine genomweite Transkriptionsanalyse in der RITA-sensitiven
p53-null-Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5 durchgeführt. Hierbei konnte unter
anderem
die
RITA-Behandlung
Aktivierung
des
nachgewiesen
MAP-Kinase-Signaltransduktionswegs
werden
(Abbildung
3.14).
Der
nach
MAPK-
Signaltransduktionsweg wird in drei Untergruppen, den ERKs (extracellular-signalregulated kinases), JNKs (Jun amino-terminal kinases), und p38 MAPKs (stressactivated protein kinases) unterteilt (Kyriakis and Avruch, 2001; Weston and Davis,
2002). Bei der Induktion von Apoptose spielen vorwiegend JNK und p38 eine
zentrale Rolle (Wagner and Nebreda, 2009). Die Aktivierung von JNK und p38 erfolgt
durch eine Vielzahl von apoptotischen Stimuli, wie ROS (Lee et al., 2002; Shen and
Liu, 2006), UV- und ionisierende Strahlung (Adler et al., 1995; Hara et al., 1998;
Kumar et al., 2004; Shimizu et al., 1999), Cisplatin (Mansouri et al., 2003; SánchezPerez et al., 1998) und ER-Stress (Lee et al., 2011; Wang and Ron, 1996). Kürzlich
98
Diskussion
wurde in Zelllinien des Multiplen Myeloms gezeigt, dass auch RITA JNK aktivieren
und dadurch einen wtp53-abhängigen Zelltod induzieren kann (Saha et al., 2012). Da
in der p53-null-Linie OVCAR5 die Aktivierung des MAPK-Signaltransduktionsweges
nachgewiesen wurde, könnte JNK auch in p53-defekten Systemen eine wichtige
Rolle bei der RITA-vermittelten Induktion von Apoptose spielen. Tatsächlich konnte
durch die pharmakologische Inhibition von JNK und p38 (Abbildung 3.16) sowie
durch Knockdown von JNK1 (Abbildung 3.17) die Wichtigkeit dieser MAP-Kinasen für
die Induktion von Apoptose im p53-defekten System nachgewiesen werden. Welche
übergeordneten Signalwege die Aktivierung von JNK und p38 zur Folge haben ist
bisher nicht geklärt. Wie bereits erwähnt, kann es durch eine Behandlung mit RITA
zur Induktion von DNA-Schäden kommen. Neben diesen potentiell DNAschädigenden Eigenschaften von RITA (de Lange et al., 2012; Nieves-Neira et al.,
1999; Yang et al., 2009a, 2009b) konnte in der vorliegenden Arbeit die
Herunterregulation von wichtigen Reparaturgenen in
RITA-sensitiven Zellen
beobachtet werden (Abbildung 3.14, Tabelle 3.8). Dass die Induktion von DNASchäden sowie kompromittierte DNA-Reparaturmechanismen zur Aktivierung von
JNK und p38 führen, ist bekannt. So führt beispielsweise UV-Strahlung zu einer von
DNA-Schädigung abhängigen JNK-Aktivierung (Hamdi et al., 2005).
Nach Behandlung mit RITA kommt es in den hier untersuchten Zelllinien durch die
Aktivierung von JNK und p38 zur Phosphorylierung von c-Jun in mtp53- und p53null-Zellen (Abbildung 3.16 und 3.17). Die Mitglieder der Jun-, Fos-, ATF- und
MAFF-Proteinfamilien
bilden
die
Hauptkomponenten
des
dimeren
AP-1-
Transkriptionsfaktorkomplexes (Eferl and Wagner, 2003). Insbesondere die durch
JNK vermittelte Phosphorylierung von c-Jun führt zu einer Verstärkung der
transkriptionellen Aktivität des AP-1 Komplexes (Hibi et al., 1993). Neben der
Phosphorylierung von c-Jun konnte die transkriptionelle Induktion von Fos und ATF3
nach RITA-Behandlung nachgewiesen werden (Tabelle 3.4). Jedoch konnte die
durch RITA induzierte Apoptose durch die siRNA-vermittelte Depletion von ATF3,
FOS oder c-Jun nicht gehemmt werden (Abbildung 3.18). Der Knockdown von ATF3
führte im Gegenteil zu einer Verstärkung der RITA-vermittelten Apoptose (Abbildung
3.18 A). Eine ähnlich protektive Rolle von ATF3 für die Induktion von Apoptose
wurde in kardialen Myozyten nachgewiesen (Nobori et al., 2002). Die siRNAvermittelte Depletion von JNK, einem zentralen Aktivator von AP-1 und weiteren
Transkriptionsfaktoren wie beispielsweise c-Myc (Noguchi et al., 1999), veränderte
Diskussion
99
das Ansprechen der Zellen auf RITA-Behandlung, nicht aber die Regulation der p53Zielgene. Somit scheint die transkriptionelle Regulation dieser Gene nicht für den
RITA-vermittelten Zelltod bestimmend zu sein. Neben der Aktivierung von
Transkriptionsfaktoren wie AP-1 und p53 durch Phosphorylierung können JNK und
p38 auch ans Mitochondrium translozieren und dort direkt pro- und anti-apoptotische
Bcl-2-Proteine modulieren (Wagner and Nebreda, 2009). Beispielsweise kann JNK
durch die Aktivierung des TNFα-Signalweges die Capase8-unabhängige Spaltung
von BID zu jBID (21 kDa) vermitteln (Deng et al., 2003). Dieses transloziert zum
Mitochondrium, wodurch präferentiell Smac/DIABLO freigesetzt wird, welches
seinerseits den TRAF2-cIAP1 Komplex trennt und Apoptose induziert wird (Deng et
al., 2003). Weiterhin wurde BAD als Substrat von JNK und p38 identifiziert (Donovan
et al., 2002; Grethe and Pörn-Ares, 2006). Die Phosphorylierung von BAD führt zur
Inhibition der Interaktion mit 14-3-3 Proteinen, wodurch anti-apoptotische Bcl-2Proteine antagonisiert werden und Zelltod vermitteln wird (Wang et al., 2007). In den
hier untersuchten Zelllinien konnte eine Beteiligung von BID oder BAD bei der RITAinduzierten Apoptose mittels siRNA-vermittelter Knockdownexperimente nicht
nachgewiesen werden (Abbildung 3.12). Die Aktivierung von BID und BAD erfolgt
durch posttranslationale Modifikationen. Diese Regulationsmechanismen können
auch bei sehr geringen Konzentrationen des Zielproteins große Effekte hervorrufen.
Möglicherweise ist somit die unvollständige siRNA-vermittelte Depletion dieser BH3only-Proteine unzureichend um pro-apoptotische Effekte zu inhibieren. Neben der
Phosphorylierung von pro-apoptotischen Bcl-2-Proteinen wurde gezeigt, dass Bcl-2
und Bcl-xL sowohl durch JNK als auch durch p38 phosphoryliert werden, wodurch
deren anti-apoptotische Aktivität supprimiert wird (Basu and Haldar, 2003; De Chiara
et al., 2006; Grethe et al., 2004; Srivastava et al., 1999; Yamamoto et al., 1999). Im
Falle von Bcl-xL wurde zudem die Initiation der Degradation durch die p38abhängige Phosphorylierung nachgewiesen (Grethe et al., 2004)
In den in der vorliegenden Studie untersuchten p53-defekten Zelllinien kam es durch
die Behandlung mit RITA zu einer Herunterregulation anti-apoptotischer Bcl-2Proteine (Abbildung 3.13). Somit könnte die Aktivierung von JNK und p38 zur
Phosphorylierung von Bcl-2 oder Bcl-xL führen, wodurch Apoptose unabhängig von
p53 und unabhängig von der transkriptionellen Aktivität von AP-1 induziert wird.
100
Diskussion
4.4 Fazit und Ausblick
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des p53-Status für die Sensitivität von
Zellen nach der Aktivierung von p53 durch das DNA-schädigende Agens Cisplatin
sowie durch die spezifischen p53-Aktivatoren Nutlin-3 und RITA näher untersucht.
Hierfür wurden Zelllinien aus verschiedenen Entitäten mit unterschiedlichem p53Status sowie Tumor-assoziierte Fibroblasten aus der humanen Lunge und PBMNCs
von gesunden Donoren verwendet.
Die Aktivierung von p53 durch Nutlin-3 führte selektiv in wtp53-exprimierenden Zellen
zur Induktion eines G1-Arrests, beziehungsweise zu Zelltod in der Zelllinie
NTERA-2D1. Die Induktion von Zelltod konnte auf die Aktivierung von wtp53
zurückgeführt werden. In Zelllinien, welche einen G1-Arrest induzierten, kam es zu
einer signifikanten Hochregulation von CDKN1A (p21), einem typischen Mediator des
Zellzyklusarrests. Neben den Effekten in Tumorzellen, wurde durch Nutlin-3 auch in
Fibroblasten und PBMNCs ein G1-Arrest induziert. Nutlin-3 führt somit selektiv in
wtp53-exprimierenden Zellen zu Effekten, ist dabei aber nicht tumorselektiv.
Durch die Behandlung mit Cisplatin wurde nicht nur in wtp53-exprimierenden
Tumorzellen, sondern auch in Zellen mit mutiertem p53 sowie in PBMNCs Zelltod
induziert. Die durch Cisplatin-Behandlung induzierte mitochondriale Apoptose in den
Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 war jedoch unabhängig von mtp53 sowie von p63
und p73. Die Genexpressionsanalyse von p53-Zielgenen zeigte nach CisplatinBehandlung eine Gruppierung nach p53-Status. Jedoch wurden auch in der Gruppe
der mtp53-exprimierenden, Cisplatin-sensitiven Zellen, mehrere Gene signifikant
reguliert. Darunter befand sich das pro-apoptotische BH3-only-Gen PMAIP1 (NOXA),
welches zusammen mit BBC3 (PUMA) zentral bei der Induktion von Zelltod in der
mtp53-exprimierenden
Ovarialkarzinom-Zelllinie
OVCAR4
nach
Cisplatin-
Behandlung war. Die Analyse der konstitutiven Proteinexpression von pro- und antiapoptotischen Bcl-2-Proteinen in der gesamten Zelllinienauswahl zeigte, dass NOXA
und Bcl-w prädiktiv für das Ansprechen von Cisplatin in der Zelllinienauswahl sind.
Dies eröffnete die Möglichkeit, diese Faktoren in Cisplatin-insensitiven Zellen zu
modulieren, um Zelltod zu induzieren. So führte die Akkumulation von NOXA durch
Bortezomib in der mtp53-exprimierenden Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR8 zu einer
Sensitivierung gegenüber Cisplatin. Weiterhin konnte durch die Inhibition von Bcl-w
durch RNAi sowie durch die Behandlung mit dem BH3-mimetic ABT-737 eine
Diskussion
101
Sensitivierung der Ovarialkarzinom-Zelllinien OVCAR8 und SKOV3 gegenüber
Cisplatin induziert werden. Zur Validierung von NOXA und Bcl-w als prädiktiven
Marker der Cisplatin-Sensitivität sollte in weiterführenden, retrospektiven Studien
deren Proteinlevel in einem geeigneten Patientenkollektiv näher untersucht werden.
Die Behandlung mit RITA führte in RITA-sensitiven Zellen unabhängig vom p53Status zur Induktion von mitochondrialer Apoptose. Eine Regulation von p53Zielgenen erfolgte selektiv in RITA-sensitiven Zellen. Grundsätzlich konnten die
Zellen sehr klar in zwei Gruppen, RITA-sensitiv und RITA-insensitiv, untergliedert
werden. Diese Untergliederung war vollständig unabhängig vom p53-Status. Die
Induktion von Apoptose in der wtp53-exprimierenden Linie NTERA-2D1 konnte auf
die Aktivierung von wtp53 zurückgeführt werden. Dagegen war die in den mtp53exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 induzierte Apoptose unabhängig
von mtp53. Zudem wurde in der p53-null-Linie OVCAR5 eine Induktion von Zelltod
nach RITA-Behandlung festgestellt. Dieser war unabhängig von p63 und p73. Somit
kann RITA auch unabhängig von der p53-Superfamilie Zelltod induzieren. Die
Induktion von mitochondrialer Apoptose in p53-defekten Zellen konnte auf die
Aktivierung des JNK- und p38-Signaltransduktionswegs zurückgeführt werden.
Interessanterweise konnte in einer früheren Arbeit eine Abhängigkeit der RITA
vermittelten Apoptose von mtp53 festgestellt werden (Zhao et al., 2010a). Die in
dieser Arbeit verwendete Zelllinie weist eine p53-Mutation auf, von welcher gezeigt
wurde, dass sie die MAP-Kinase MAP2K3 induzieren kann (Gurtner et al., 2010).
Dadurch könnte eine Verbindung zwischen der Aktivierung von JNK und mtp53
bestehen. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zelllinien wiesen distinkte p53Mutationen auf, wodurch die Aktivierung von JNK auch unabhängig von mtp53
erfolgen
kann.
Durch
die
Verwendung
einer
p53-null-Zelllinie
in
welche
unterschiedliche p53-Mutanten stabil transfiziert werden, könnten p53-Mutationen
identifiziert werden welche mtp53-abhängig RITA-vermittelte Apoptose induzieren
können.
Neben der zentralen Rolle von JNK und p38 konnte die RITA-vermittelte Apoptose
auch auf die mitochondrialen Effektoren BAX und BAK, zurückgeführt werden.
Zudem führte die Behandlung mit RITA zu einer Herunterregulation der antiapoptotischen Bcl-2-Proteine Mcl-1, Bcl-2 und Bcl-xL. Die Kombinationsbehandlung
mit
dem
BH3-mimetic
ABT-737
verstärkte
den
RITA-induzierten
Zelltod.
Bemerkenswert hierbei war, dass der synergistische Effekt ausschließlich in RITA-
102
Diskussion
sensitiven Zellen beobachtet werden konnte. RITA-insensitive Zellen, zu welchen
auch PBMNCs gehörten, konnten durch die Kombinationsbehandlung nicht
sensitiviert werden. Diese deutliche Abgrenzung in RITA-sensitive und RITAinsensitive Zellen deutete auf einen unterschiedlichen Transport von RITA in die
Tumorzellen hin. Möglicherweise spielen hochexprimierte Aufnahmetransporter oder
gering-exprimierte Effluxtransporter eine zentrale Rolle bei der intrazellulären
Akkumulation von RITA. In weiterführenden Experimenten könnte in geeigneten
Modell-Systemen, welche spezifisch in einem Transporter depletiert oder einen
Transporter spezifisch überexprimieren, der Transport von radioaktiv-markiertem
RITA näher untersucht werden. Hierbei identifizierte RITA-Transporter könnten
potentielle Marker für das Ansprechen auf RITA-Behandlung sein. In RITA-sensitiven
Tumoren könnte zudem durch eine Kombinationsbehandlung mit ABT-737 verstärkt
Apoptose induziert werden und damit sowohl wtp53- als auch mtp53- oder p53-nullTumore effektiver therapiert werden.
Zusammenfassend konnte in der in dieser Studie verwendeten Zellauswahl ein
Einfluss von p53 auf die Sensitivität gegenüber Nutlin-3-, Cisplatin- und RITABehandlung nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich, dass Cisplatin und RITA
auch unabhängig von p53, Effekte in p53-defizienten Zellen vermitteln können. Dabei
führte insbesondere die Behandlung mit RITA zu einer Regulation der p53-Zielgene
in RITA-sensitiven Zellen, unabhängig von der p53-Superfamilie und unabhängig von
der Aktivierung des JNK-Signaltransduktionsweges. Somit können p53-Zielgene
auch im p53-defekten System transaktiviert werden und typische p53-Funktionen
über andere Signalwege vermittelt werden.
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Publikationen
121
Publikationen
Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in:
Originalarbeiten
Weilbacher A, Gutekunst M, Oren M, Aulitzky WE, van der Kuip H.
„RITA can induce cell death in p53 defective cells independently of p53 function via
activation of JNK/SAPK and p38.”
Cell Death and Disease, Feb 2014 (under revision)
Vorträge
Weilbacher A, Gutekunst M, Dengler MA, van der Kuip H, Aulitzky WE.
„Role of constitutive levels of Bcl-2 family proteins for cisplatin sensitivity.“
Onkologie 2013;36(suppl 7):1-307 [V926]
Weilbacher A, Gutekunst M, Oren M, Aulitzky WE, van der Kuip H.
„Differential effect of the p53 inducers Nutlin-3 and RITA on cell lines with different
p53-Status.“
Onkologie 2012;35(suppl 6):1-259 [V652]
Weilbacher A, Aulitzky WE, van der Kuip H.
„Gene expression profiling of p53 targets using the BioMark HD System.”
Fluidigm European Roadshow, Hannover 2011
Weitere Originalarbeiten
Dengler MA, Weilbacher A, Gutekunst M, Staiger AM, Vöhringer, Horn H., Ott G.,
Aulitzky WE, van der Kuip H.
„Discrepant NOXA (PMAIP1) transcript and NOXA protein levels: a potential Achilles´
heel in mantle cell lymphoma.”
Cell Death and Disease 2014 Jan 23;5:e1013
122
Publikationen
Gutekunst M, Mueller T, Weilbacher A, Dengler MA, Bedke J, Kruck S, Oren M,
Aulitzky WE, van der Kuip H.
„Cisplatin hypersensitivity of testicular germ cell tumors is determined by high
constitutive noxa levels mediated by oct-4.”
Cancer Research 2013 Mar 1;73(5):1460-9
Gutekunst M, Oren M, Weilbacher A, Dengler MA, Markwardt C, Thomale J, Aulitzky
WE, van der Kuip H.
„p53 hypersensitivity is the predominant mechanism of the unique responsiveness of
testicular germ cell tumor (TGCT) cells to cisplatin.”
PLoS One 2011 Apr 21;6(4):e19198
Weitere Veröffentlichungen
Dengler MA, Weilbacher A, Gutekunst M, Staiger AM, Horn H, Ott G, van der Kuip H,
Aulitzky WE.
„The Phenotype High Noxa mRNA/Low NOXA Protein Levels Constitutes a Critical
Achilles Heel Of Mantle Cell Lymphoma (MCL) Cells.”
Blood 2013 122:644, 55Th ASH Annual Meeting and Exposition, New Orleans, 2013
Dengler MA, Weilbacher A, Gutekunst M, Staiger AM, Horn H, Ott G, van der Kuip H,
Aulitzky WE.
„High NOXA (PMAIP1) transcript levels combined with a short-lived NOXA protein
primes mantle cell lymphoma (MCL) cells for death by inhibition of the ubiquitin
proteasome system.“
Proceedings of the 104rd Annual Meeting of the American Association of Cancer
Research; 2013 April 6-10; Washington, District of Columbia. Philadelphia
(PA):AACR, 2013. Abstract no. 1717
Gutekunst M, Müller T, Weilbacher A, Dengler MA, Oren M, Aulitzky WE, van der
Kuip H.
„Testicular germ cell tumors are hypersensitive to p53 activation based on their
Oct-4/NOXA-mediated cellular context rather than on differential p53 activity.”
Proceedings of the 104rd Annual Meeting of the American Association of Cancer
Research; 2013 April 6-10; Washington, District of Columbia. Philadelphia
(PA):AACR, 2013. Abstract no. 1721
Gutekunst M, Müller T, Weilbacher A, Dengler MA, Bedke J, Kruck S, van der
Kuip H, WE Aulitzky.
„Oct-4-dependent high constitutive Noxa determines p53-mediated Cisplatin
hypersensitivity in testicular germ cell tumors.”
Onkologie 2012;35(Suppl.6): 183
Publikationen
123
Gutekunst M, Mueller T, Weilbacher A, Dengler MA, Kruck S, Bedke J, Aulitzky WE,
van der Kuip H.
„OCT-3/4 expression is associated with high levels of the pro-apoptotic BH3 only
protein NOXA in testicular germ cell tumors (TGCTs).”
Proceedings of the 103rd Annual Meeting of the American Association for Cancer
Research; 2012 Mar 31-Apr 4; Chicago, Illinois. Philadelphia (PA): AACR; 2012.
Abstract no. 2002
Gutekunst M, Oren M, Weilbacher A, Dengler MA, Aulitzky WE, van der Kuip H.
„High expression levels of NOXA are important for p53-mediated hypersensitivity in
testicular germ cell tumor (TGCT) cells.”
Proceedings of the 102nd Annual Meeting of the American Association for Cancer
Research; 2011 Apr 2-6; Orlando, Florida. Philadelphia (PA): AACR; 2011. Abstract
no. 4693
Lebenslauf
124
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name:
Andrea Weilbacher
Geburtsdatum:
29.04.1985
Geburtsort:
Krumbach (Schwaben), Bayern
Anschrift:
Hauptstraße 131
70563 Stuttgart-Vaihingen
Studium und Schulausbilung
05/2011 – 04/2014
Dissertation am Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut
für Klinische Pharmakologie, Stuttgart
Qualifikation: Dr. rer.nat
Prof. Dr. Walter E. Aulitzky, Robert-Bosch-Krankenhaus,
Stuttgart
Prof. Dr. Peter Scheurich, Institut für Zellbiologie und
Immunologie, Universität Stuttgart
„Die Rolle des p53-Status für die Sensitivität von Tumoren
gegenüber unterschiedlichen p53 Aktivatoren“
10/2006 – 04/2011
Studium der Technischen Biologie, Universität
Stuttgart
Qualifikation: Diplom-Biologin (t.o.)
Schwerpunkte: Immunologie, Technische Biochemie
Diplomarbeit am Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für
Klinische Pharmakologie, Stuttgart, bei Dr. Oliver Burk
„Aktivität von Coregulatoren am -7,8 kb Enhancer des
MDR1-Gens“
09/1995 – 06/2004
Abitur am Simpert - Kraemer - Gymnasium Krumbach
Mathematisch - naturwissenschaftlicher Zweig
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