Die Rolle des p53-Status für die Sensitivität von Tumoren
Werbung
Die Rolle des p53-Status für die Sensitivität von Tumoren gegenüber unterschiedlichen p53 Aktivatoren Überarbeitete Version 2017 Von der Fakultät für Energie-, Verfahrens-, und Biotechnik der Universität Stuttgart zur Erlangung der Würde eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Abhandlung vorgelegt von Andrea Weilbacher aus Krumbach (Schwaben) Hauptberichter: Prof. Dr. Peter Scheurich Mitberichter: Prof. Dr. Walter E. Aulitzky Tag der mündlichen Prüfung: 02. Juni 2014 Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für klinische Pharmakologie und Universität Tübingen und Institut für Zellbiologie und Immunologie der Universität Stuttgart 2014 Die vorliegende Dissertation wurde am Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für klinische Pharmakologie Stuttgart unter der Anleitung von Prof. Dr. Walter E. Aulitzky angefertigt. Gefördert wurde die Promotion durch ein Stipendium der Robert Bosch Stiftung. Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig und ohne fremde Hilfe bzw. unerlaubte Hilfsmittel angefertigt, andere als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe. Stuttgart, den 03.06.2014 Andrea Weilbacher Danksagung V Danksagung Meinen tiefsten Dank möchte ich Herrn Prof. Dr. Walter E. Aulitzky für die Möglichkeit, meine Dissertation in seiner Arbeitsgruppe am Dr. Margarete FischerBosch-Institut für klinische Pharmakologie anfertigen zu dürfen, aussprechen. Seine Unterstützung und seine Ratschläge in zahlreichen Diskussionen haben maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Herrn Prof Dr. Peter Scheurich danke ich für die Bereitschaft, die Betreuung der Dissertation von Seiten der Universität zu übernehmen. Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Heiko van der Kuip. Ohne seine unermüdliche Hilfs- und Diskussionsbereitschaft und seine Fähigkeiten als geduldigen Mentor wäre diese Dissertation nicht möglich gewesen. Meinen Kollegen Dr. Matthias Gutekunst, Dr. Michael Dengler, Dr. Jens Schmid, Kerstin Willecke, Lea Schaaf, Dr. Meng Dong, Tabea Lieberich und Constanze Mezger danke ich für deren Hilfe sowie für zahlreiche Diskussionen und die angenehme Arbeitsatmosphäre während meiner Dissertation. Weiterhin möchte ich mich bei allen Kollegen des Instituts herzlich für deren stetige Hilfe und für die schöne Zeit am IKP bedanken. Zudem möchte ich mich bei Herrn Dr. Thomas Mürdter und der Abteilung für Analytische Chemie und Synthese für die Durchführung der GC/MS-Analyse zur Prüfung der chemischen Identität von RITA bedanken. Abschließend möchte ich mich in besonderer Weise bei meinen Eltern und bei Andreas Bonk bedanken, die mich sowohl während meines Studiums als auch während der Anfertigung dieser Arbeit immer unterstützt und mich begleitet haben. Danke! Inhaltsverzeichnis VII Inhaltsverzeichnis Danksagung .............................................................................................................. V Inhaltsverzeichnis .................................................................................................. VII Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... XI Zusammenfassung ................................................................................................. XV Summary ............................................................................................................... XVII 1. Einleitung .............................................................................................................. 1 1.1 Der Transkriptionsfaktor p53 ............................................................................ 1 1.1.1 Wildtyp p53 ................................................................................................. 3 1.1.2 Mutiertes p53 .............................................................................................. 4 1.2 Die Funktion von p53 bei der Induktion von Zelltod ......................................... 6 1.2.1 p53-abhängige Apoptose ........................................................................... 6 1.2.2 Therapeutische Ansätze zur Aktivierung von p53....................................... 7 1.3 Die Bcl-2-Proteinfamilie..................................................................................... 9 1.4 Ziele der Arbeit ................................................................................................ 11 2. Material und Methoden....................................................................................... 12 2.1 Zellkulturtechnik .............................................................................................. 12 2.1.1 Verwendete Zelllinien ............................................................................... 12 2.1.2 Kulturmedium, Zusätze und Kulturbedingungen ....................................... 12 2.1.3 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels Trypanblaufärbung .................... 14 2.1.4 Kryokonservierung und Rekultivierung ..................................................... 14 2.2 Kultur von primärem Zellmaterial .................................................................... 15 2.2.1 Isolation von PBMNCs .............................................................................. 15 2.2.2 Isolation Tumor-assoziierter Fibroblasten ................................................. 16 2.3 Reagenzien ..................................................................................................... 16 2.3.1 Induktion von genotoxischem Stress ........................................................ 16 2.3.2 Inhibiton der p53-Mdm2 Interaktion .......................................................... 17 2.3.3 Aktivierung von p53 .................................................................................. 17 2.3.4 Inhibition der Caspaseaktivität .................................................................. 17 2.3.5 Inhibition anti-apoptotischer Bcl-2-Proteine .............................................. 18 2.3.6 Inhibition des MAPK-Signaltransduktionsweges ...................................... 18 2.3.7 Inhibition des Proteasoms ........................................................................ 18 VIII Inhaltsverzeichnis 2.4 Zellanalyse mit Hilfe des Durchflusszytometers (FACS) ................................. 19 2.4.1 Nachweis von Zelltod mittels AnnexinV-FITC/PI-Färbung ........................ 19 2.4.2 Nachweis von Zelltod mittels TMRM-Färbung .......................................... 20 2.4.3 Zellzyklusanalyse mittels BrdU-Proliferationsassay.................................. 20 2.5 High-throughput qPCR mit Hilfe des BioMarkTM-HD-Systems ........................ 22 2.5.1 Generierung von RNA .............................................................................. 22 2.5.2 Spektrometrische Quantifizierung von RNA ............................................. 22 2.5.3 cDNA Synthese ........................................................................................ 23 2.5.4 qPCR mit dem BioMarkTM-HD-System ..................................................... 23 2.6 Microarrayanalyse ........................................................................................... 26 2.7 Bestimmung des p53-Status der Zelllinien durch Sequenzierung ................... 27 2.8 RNA Interferenz .............................................................................................. 28 2.9 Proteinanalyse ................................................................................................ 31 2.9.1 Herstellung eines Gesamtproteinlysats .................................................... 31 2.9.2 SDS-Page zur Auftrennung der Proteine .................................................. 32 2.9.3 Western-Blot ............................................................................................. 32 3. Ergebnisse .......................................................................................................... 36 3.1 Charakterisierung einer Zelllinienauswahl....................................................... 36 3.1.1 Bestimmung des p53-Status .................................................................... 36 3.1.2 Induktion von Zelltod und Zellzyklusarrest nach Nutlin-3, RITA und Cisplatin............................................................................................................. 37 3.1.3 Induktion von p53-Zielgenen durch Nutlin-3, RITA und Cisplatin ............. 40 3.1.4 Die Rolle von wtp53 für die Nutlin-3-, RITA- und Cisplatin-Sensitivität ..... 48 3.2 Mechanismen des RITA-induzierten Zelltods im p53-mutierten System ......... 49 3.2.1 Die Rolle von mtp53 für die RITA-Sensitivität der mtp53-exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 ...................................................................... 51 3.2.2 Die Rolle von p63 und p73 für die RITA-Sensitivität der p53-defekten Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5 ..................................................... 52 3.2.3 Induktion von mitochondrialer Apoptose durch RITA in den p53-defekten Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5 ..................................................... 55 3.2.4 Beteiligung der Bcl-2-Proteinfamilie am RITA-vermittelten Zelltod in den p53-defekten Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5 ............................... 57 3.2.5 Identifikation von Signalwegen, welche den RITA-induzierten Zelltod vermitteln können .............................................................................................. 59 Inhaltsverzeichnis IX 3.2.6 Involvierung des JNK- und p38-MAP-Kinase-Signalweges in den RITAvermittelten Zelltod der p53-defekten Zelllinien OVCAR3 und OVCAR5 ........... 64 3.3 Mechanismen des Cisplatin-induzierten Zelltods im p53-mutierten System ... 69 3.3.1 Die Rolle von mtp53 für die Cisplatin-Sensitivität der mtp53exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 ............................................ 69 3.3.2 Die Rolle von p63 und p73 für die Cisplatin-Sensitivität der p53-defekten Zelllinie OVCAR4 .............................................................................................. 70 3.3.3 Induktion von mitochondrialer Apoptose durch Cisplatin in den p53defekten Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 ....................................................... 72 3.3.4 Die Rolle der pro-apoptotischen BH3-only-Proteine für die CisplatinSensitivität der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4 ................................. 74 3.3.5 Die konstitutiven Level der Bcl-2-Proteine als prädiktive Marker in der Zelllinienauswahl ............................................................................................... 75 3.3.6 Modulation von NOXA und Bcl-w zur Sensitivierung von Zellen mit geringer Cisplatin-Sensitivität .......................................................................................... 79 4. Diskussion .......................................................................................................... 83 4.1 Reaktion von Zellen mit unterschiedlichem p53-Status auf die Behandlung mit Nutlin-3, RITA und Cisplatin .................................................................................. 84 4.2 RITA und Cisplatin können unabhängig von der p53-Superfamilie Apoptose induzieren ............................................................................................................. 89 4.2.1 RITA und Cisplatin können im p53-defekten System unabhängig von der p53-Superfamilie Zelltod induzieren .................................................................. 89 4.2.2 RITA und Cisplatin können Zelltod im p53-defekten System durch die Induktion von mitochondrialer Apoptose induzieren .......................................... 93 4.3 RITA kann durch die Aktivierung von JNK und p38 Zelltod im p53-defekten System induzieren ................................................................................................ 97 4.4 Fazit und Ausblick ......................................................................................... 100 Literaturverzeichnis ............................................................................................. 103 Publikationen ........................................................................................................ 121 Lebenslauf............................................................................................................. 124 Abkürzungsverzeichnis XI Abkürzungsverzeichnis A Ampere ALL Akute lymphatische Leukämie AML Akute myeloische Leukämie APS Ammoniumpersulfat BH3 Bcl-2 homology domain 3 BrdU 2-Bromo-5-desoxyuridin BSA bovine serum albumin bzw. beziehungsweise °C Grad Celsius cDNA complementary DNA ChIP Chromatin Immunpräzipritation C-terminal Carboxy-terminal DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FACS fluorescence activated cell sorter FC fold change FCS Fötales Kälberserum FITC Fluoreszein-Isothiocyanat FSC forward scatter g Gramm GC/MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie GOF gain-of-function HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1piperazineethanesulfonic acid HRP horse radish peroxidase IgG Immunglobulin G kDA kilo Dalton l Liter LMTA low melting temperature agarose XII Abkürzungsverzeichnis LOF loss-of-heterozygisity m Milli- M Molar (mol/l) MCL Mantelzelllymphom min Minute MOMP mitochondrial outer membrane permeabilization mt mutiert n Nano- NMR Kernspinresonanzspektroskopie N-terminal Amino-terminal ODXXX optische Dichte bei XXX nm μ Mikro- p phosphoryliert PBMNC peripheral blood mononuclear cell PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction PHA-L Phytohämagglutinin-L PI Propidiumiodid qPCR quantitative real time polymerase chain reaction RE response element RING really interesting new gene RMA Robust Multi-array Average RNA Ribonukleinsäure RNAi RNA Interferenz ROS Reaktive Sauerstoffsspezies rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) RT Raumtemperatur SCID schwere kombinierte Immundefizienz Ser Serin SD Standardabweichung SDS Sodiumdodecylsulfat Abkürzungsverzeichnis XIII SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese sec Sekunden siRNA small interfering RNA SSC side scatter STA specific target amplification TAD Tranaktivierungsdomäne TBST tris buffered saline plus Tween TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin TMRM Tetramethylrhodaminmethylester Perchlorat TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan u.a. unter anderem V Volt v/v Volumen/Volumen w/v Masse/Volumen wt Wildtyp z.B. zum Beispiel Zusammenfassung XV Zusammenfassung Die tumorsuppressiven Eigenschaften von p53 gelten als zentral bei der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Auf Grund dessen spielt p53 eine Schlüsselrolle bei der Reaktion auf genomischen Stress welcher unter anderem durch klassische Chemotherapeutika, wie beispielsweise Cisplatin, induziert wird. In der vorliegenden Studie wurde die Rolle des p53-Status für die Sensitivität gegenüber p53-aktivierenden Substanzen untersucht. Hierfür wurde eine Auswahl von Zelllinien aus verschiedenen Entitäten und mit unterschiedlichen p53-Genotypen sowie Tumor-assoziierte Fibroblasten aus der humanen Lunge und PBMNCs von gesunden Donoren verwendet. Als p53-Aktivatoren wurden neben dem klassischen DNA-modifizierenden Molekül Cisplatin die direkten Aktivatoren von p53, Nutlin-3 und RITA eingesetzt. Die Behandlung mit Nutlin-3 führte selektiv in wtp53exprimierenden Zellen zu einem G1-Arrest. Dieser trat auch in primären, nichtmalignen Zellen auf. Nutlin-3 agiert somit selektiv in wtp53-exprimierenden Zellen, nicht aber tumorselektiv. Die wtp53-selektive Wirkungsweise konnte weder nach Cisplatin- noch nach RITA-Behandlung nachgewiesen werden. Beide Substanzen induzierten Zelltod auch in mtp53-Systemen oder im Falle von RITA auch in der p53-null-Zelllinie OVCAR5. Der durch Cisplatin und RITA induzierte Zelltod in der wtp53-exprimierenden Zelllinie NTERA-2D1 konnte auf die Aktivierung von wtp53 zurückgeführt werden. Hingegen war der in den mtp53-exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 induzierte Zelltod im Falle einer Behandlung mit Cisplatin oder RITA unabhängig von mtp53. Zudem führte die siRNA-vermittelte Depletion von p63 und p73 zu keiner Verminderung des Zelltods. Cisplatin und RITA können somit unabhängig von der p53-Superfamilie Zelltod in p53-defekten Systemen induzieren. Dieser war für beide Substanzen auf die Aktivierung der mitochondrialen Effektoren BAX und BAK zurückzuführen. Die Induktion von Zelltod nach Cisplatin-Behandlung konnte weiterhin auf die Aktivierung der pro- apoptotischen Bcl-2-Proteine NOXA und PUMA zurückgeführt werden. Die Analyse der konstitutiven Expression der Bcl-2-Proteine in der gesamten Zelllinienauswahl zeigte eine signifikante Korrelation des Verhältnisses aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen gegenüber der Cisplatin-Sensitivität. NOXA und Bcl-w wurden in diesem Ansatz als prädiktive Marker der Cisplatin-Sensitivität innerhalb der XVI Zusammenfassung Zellauswahl identifiziert. Die Kombinationsbehandlung von Cisplatin mit dem BH3mimetic ABT-737 führte zu einer Sensitivierung von Cisplatin-insensitiven Zellen. Im Falle der Behandlung mit RITA konnte keine Korrelation zwischen dem Verhältnis aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen und dem durch RITA induzierten Zelltod festgestellt werden. Jedoch erwies sich die Herunterregulation von antiapoptotischen Bcl-2-Proteinen nach RITA-Behandlung als wichtig für die Induktion von Apoptose. Infolgedessen führte die Kombinationsbehandlung von RITA mit ABT737 zu einer Verstärkung des RITA-induzierten Zelltods in RITA-sensitiven Zellen. RITA-insensitive Zellen blieben dabei unbeeinflusst. Weiterhin konnte der durch RITA vermittelte Zelltod in p53-defekten Systemen auf die Aktivierung des JNK- und p38-Signaltransduktionsweges zurückgeführt werden. Insbesondere JNK1 erwies sich als entscheidend für die Induktion von Apoptose nach RITA-Behandlung. Im Vergleich der drei Substanzen zeigte sich überraschenderweise eine größere Ähnlichkeit von RITA zu Cisplatin als zu Nutlin-3. Cisplatin, als klassischer über DNA-Schädigung wirkender p53-Aktivator, führte zur Induktion von Zelltod in Zelllinien welche nahezu alle auch sensitiv gegenüber der Behandlung mit RITA waren. Potentiell könnte somit auch RITA über DNA-Schädigungen Zelltod induzieren. Intrazellulär führen jedoch beide Substanzen zu unterschiedlichen Effekten. Während Cisplatin zu einer Hochregulation von pro-apoptotischen BH3only-Proteinen führt, induziert die Behandlung mit RITA eine Reduktion antiapoptotischer Bcl-2-Proteine. Im Falle von Cisplatin konnte die Proteinkonzentration von NOXA und Bcl-w als Marker für die Sensitivität innerhalb der Zellauswahl identifiziert werden. RITA hingegen induzierte Zelltod nur in einer bestimmten Gruppe von Zellen, weshalb der Transport von RITA ein potentieller Marker für die RITA-Sensitivität darstellen könnte. Zusammenfassend konnte in der verwendeten Zellauswahl sowohl nach Nutlin-3-, als auch nach Cisplatin- oder RITA-Behandlung ein Einfluss von wtp53 für die Sensitivität nachgewiesen werden. Allerdings konnten durch Cisplatin und RITA auch Effekte unabhängig von p53 vermittelt werden. Interessanterweise führte die Behandlung mit RITA zu einer von der p53-Superfamilie und von der Aktivierung des JNK-Signaltransduktionsweges unabhängigen Regulation von p53-Zielgenen. Dementsprechend können im p53-defekten System p53-Zielgene sowie typische p53-Funktionen durch die Aktivierung p53-unabhängiger Signalwege vermittelt werden. Summary XVII Summary The tumor suppressive functions of p53 are central for maintaining genomic stability. Due to this, p53 is a key player in the cellular response to genomic stress which is induced by classical chemotherapeutical agents such as Cisplatin. In this study the role of the p53 status for sensitivity towards p53 activating substances was investigated. Therefore, a panel of cell lines from different entities which includes all p53 genotypes was used. Additionally, tumor associated fibroblasts from lung cancer patients and PBMNCs from healthy donors were included in the study. As p53 activators the DNA modifying agent Cisplatin and the direct activators of p53 Nutlin-3 and RITA were used. Treatment with Nutlin-3 led to a selective activation of a G1 arrest in wtp53 expressing cells. This arrest was also observed in fibroblasts and PBMNCs. Consequently, Nutlin-3 acts selectively in cells carrying wtp53 but without being tumor selective. This wtp53 selective mode of action was not observed after Cisplatin or RITA treatment. Both agents induced cell death also in cells harboring mtp53. Furthermore, RITA treatment led to the induction of cell death in the p53-null cell line OVCAR5. As expected, the induced cell death after Cisplatin and RITA treatment in the wtp53 expressing cell line NTERA-2D1 was due to the activation of wtp53. In contrast, cell death induction after Cisplatin or RITA treatment in the mtp53expressing cell lines OVCAR3 and OVCAR4 was not affected by silencing mtp53. Additionally, silencing of p63 and p73 did not reduce apoptosis after Cisplatin or RITA treatment. Thus, Cisplatin and RITA can act independently of the p53 superfamily in p53 defective systems. However, the induction of cell death after Cisplatin or RITA treatment in cells harboring defective p53 was due to the activation of the mitochondrial effector proteins BAX and BAK. Furthermore, the pro-apoptotic Bcl-2 proteins NOXA and PUMA were identified as mediators of cell death after Cisplatin treatment. Analyzing the constitutive expression of pro- and anti-apoptotic Bcl-2 proteins in the cell line panel a significant correlation between the ratio of proand anti-apoptotic proteins and the induced cell death after Cisplatin treatment was observed. Thereby, NOXA and Bcl-w could be identified a predictive markers for XVIII Summary Cisplatin sensitivity in this cell line panel. Treatment of Cisplatin insensitive cells with Cisplatin and the BH3-mimetic ABT-737 lead to a sensitization these cells. A correlation between the constitutive expression of pro- and anti-apoptotic Bcl-2 family proteins and the induced cell death after RITA treatment was not observed. However, the down-regulation of anti-apoptotic Bcl-2 proteins after RITA treatment could be identified as an important step for induction of apoptosis. Therefore, treatment of RITA sensitive cells with RITA and ABT-737 led to a pronounced induction of cell death. RITA insensitive cells were not affected by this combinational treatment. Furthermore, the activation of the JNK and p38 signal transduction pathway in p53 defective cells could be identified as crucial for RITA mediated cell death. Especially JNK1 was essential to allow apoptosis development. Interestingly, the comparison of the three agents revealed that RITA exhibits a higher similarity to Cisplatin than to Nutlin-3. Cisplatin, which activates p53 via DNA-damage response mechanisms, induced cell death in cell lines which are almost all sensitive to RITA, too. This leads to the hypothesis that RITA might mediate cell death via induction of DNA damage. However, if so, RITA and Cisplatin seem to induce different DNA damage response mechanisms. While Cisplatin induces up-regulation of pro-apoptotic BH3-only proteins, treatment with RITA led to the down-regulation of anti-apoptotic Bcl-2 proteins. In the case of Cisplatin, the protein levels of NOXA and PUMA were found to be predictive for sensitivity in the cell line panel. However, RITA induced cell death was limited to a specific group of cell lines. This indicates that differential RITA concentrations due to differential RITA transport might be responsible for this observation. Therefore, specific RITA transporters might serve as potential markers for RITA sensitivity. In conclusion, this study demonstrates that wtp53 can mediate the sensitivity towards Nutlin-3, Cisplatin and RITA treatment. However, in contrast to Nutlin-3, Cisplatin and RITA can also act independently of p53. Interestingly, p53 target genes were found to be regulated after RITA treatment independently of the p53 superfamily and the activation of the JNK signaling pathway. Accordingly, p53 target genes and typical functions of p53 can be mediated by the activation of p53 independent signaling pathways. Einleitung 1 1. Einleitung 1.1 Der Transkriptionsfaktor p53 Das Protein p53 wurde 1979 erstmals durch mehrere unabhängige Arbeitsgruppen simultan beschrieben (DeLeo et al., 1979; Kress et al., 1979; Lane and Crawford, 1979; Linzer and Levine, 1979; Melero et al., 1979; Smith et al., 1979). Die Namensgebung erfolgte durch die damals falsch kalkulierte molekulare Masse von 53 kDa. Durch die Anwesenheit einer Prolin-reichen Region innerhalb des Proteins kam es zu einem verzögerten Laufverhalten in der SDS-Gelelektrophorese, worauf die Fehlkalkulation zurückzuführen war. Die korrekte molekulare Masse von p53 beträgt 43,7 kDa (Levine and Oren, 2009). Ursprünglich wurde p53 fälschlicherweise als Onkogen klassifiziert (Eliyahu et al., 1984, 1985; Jenkins et al., 1984; Parada et al., 1984; Wolf et al., 1984). In humanen kolorektalen Tumoren konnte jedoch gezeigt werden, dass durch Mutationen und Deletionen im TP53 Gen beide Wildtyp-TP53-Allele inaktiviert wurden (Baker et al., 1989). Weiterhin führte die Überexpression von wtp53 zu einer Repression der transformierenden Eigenschaften von MYC und HRAS (Eliyahu et al., 1989; Finlay et al., 1989). Transgene Trp53-/- Mäuse entwickelten zudem Tumore in sehr frühen Lebensphasen (Harvey et al., 1993; Kemp et al., 1993). Durch diese Daten konnte p53 als typischer Tumorsuppressor klassifiziert werden. Chromosomal ist das Protein an Position 17p13.1 lokalisiert und umfasst 20 kb genomischer DNA, die in 11 Exons und 10 Introns untergliedert sind (Lamb and Crawford, 1986). Das durch die Translation resultierende Polypeptid beinhaltet 393 Aminosäuren und kann in fünf Domänen untergliedert werden. Der N-Terminus von p53 gliedert sich in zwei Transaktivierungsdomänen (TAD1 und TAD2). Beide Transaktivierungsdomänen vermitteln die Transkription von p53-Zielgenen. Dabei unterscheidet sich die Aktivität der Aktivierungsdomänen dahingehend, dass TAD1 vorwiegend die Transkription von Genen des Zellzyklus, TAD2 die Aktivierung von pro-apoptotischen Genen steuert (Zhu et al., 2000). Die zentrale Domäne des p53Proteins bildet die DNA-Bindedomäne, welche die Aminosäuren 93-292 umfasst und durch die Bindung an p53-response elements (RE) die Transaktivierung von p53- 2 Einleitung Zielgenen steuert (Viadiu, 2008). Auf die DNA-Bindedomäne folgt die Tetramerisierungsdomäne. Diese ermöglicht es, p53 zu dimerisieren, um mit einem weiteren p53-Dimer zum aktiven Tetramer zu aggregieren (Kitayner et al., 2006). Innerhalb dieser Domäne konnte zudem ein nukleäres Exportsignal identifiziert werden (Stommel et al., 1999). C-terminal befindet sich eine regulatorische Domäne, welche die spezifische Bindung der DNA-Bindedomäne an die DNA inhibieren kann. Zudem wurden innerhalb des C-Terminus drei nukleäre Lokalisationssequenzen identifiziert (Shaulsky et al., 1990). Funktionell konnten p53 zahlreiche Aktivitäten, wie die Modifikation von Chromatin, die Involvierung in Reparaturprozesse, die Assoziierung mit Proteinen, welche für die genomische Stabilität wichtig sind, und die Aktivität als zytoplasmatisches proapoptotisches Protein zugeschrieben werden (Aylon and Oren, 2011; Helton and Chen, 2007). Die zentrale Funktion von p53 ist jedoch die eines Transkriptionsfaktors. Dabei reguliert p53 verschiedenste biologische Prozesse, wie Apoptose, Zellzyklus, DNA-Metabolismus, Energiemetabolismus, Seneszenz, Immunantwort, Zelldifferenzierung, Motilität und Migration, Angiogenese und die Kommunikation zwischen Zellen (Menendez et al., 2009). Ohne zellulären Stress wird die Aktivität von p53 durch ständige proteasomale Degradation minimiert. Dies wird vornehmlich durch Mdm2, einer E3-Ubiquitin-Ligase, vermittelt. Mdm2 besitzt C-terminal eine RING-Finger Domäne, welche die Oligomerisierung des Moleküls ermöglicht und dessen E3-Ligase-Aktivität initiiert (Marine and Lozano, 2010). Daneben kann Mdm2 durch die N-Terminale Bindung an p53 dessen Interaktion mit der Transkriptionsmaschinerie unterbinden (Thut et al., 1997). Die Aktivierung von p53 erfolgt durch verschiedene zelluläre Stressoren, wie DNA-Schäden, Hypoxie, oxidativer Stress, metabolischer Stress sowie die Aktvierung von Onkogenen (Levine and Oren, 2009). Als strukturell und funktionell homologe Proteine zu p53 wurden die Transkriptionsfaktoren p63 und p73 identifiziert (Jost et al., 1997; Kaghad et al., 1997; Yang et al., 1998) und zusammen mit p53 als p53-Superfamilie deklariert. p63 und p73 bilden, ebenso wie p53, Oligomere und transaktivieren oder transrepremieren typische p53-Zielgene, welche Zellzyklusarrest (CDKN1A, MDM2), Seneszenz (CDK1, CCNB1) oder Apoptose (BAX) induzieren (Dötsch et al., 2010; Jung et al., 2001; Su et al., 2013). Jedoch zeigte sich im Gegensatz zu p53, dass p63 und p73 auch zentral während des Entwicklungsprozesses sind (Zawacka- Einleitung 3 Pankau et al., 2010). Mutationen von p63 und p73 treten in Tumoren nur sporadisch auf (Hagiwara et al., 1999; Melino et al., 2002; Sunahara et al., 1999). Eine fehlende Expression von p73 konnte in Neuroblastomen nachgewiesen werden (Ichimiya et al., 1999). Im Gegensatz dazu konnten Mutationen von p53 in etwa 50% aller Tumorerkrankungen nachgewiesen werden (Murray-Zmijewski et al., 2008). 1.1.1 Wildtyp p53 In seiner Wildtypform agiert p53 (wtp53) als zentraler Tumorsuppressor. Die tumorsuppressiven Eigenschaften werden vorwiegend durch die Regulation von zahlreichen p53-Zielgenen vermittelt. Die Aktivierung von p53-Zielgenen erfolgt durch die sequenzspezifische Bindung an REs, welche charakteristischerweise aus zwei Decameren (RRRCWWGYYY…n…RRRCWWGYYY; R: Purin, Y: Pyrimidin, W: Adenin oder Thymin) bestehen. Diese werden durch einen Abstand von n=0-13 Basenpaaren getrennt (Menendez et al., 2009). Durch genomweite Ansätze sowie durch ChIP basierte Bindungsstudien konnten zahlreiche Gene identifiziert werden, welche von wtp53 gebunden werden, ohne dass der Konsensussequenz des REs exakt entsprochen wird (Hearnes et al., 2005; Smeenk et al., 2008; Wei et al., 2006). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass wtp53 auch im nicht-aktivierten Zustand unter normalen zellulären Bedingungen an die DNA bindet (Shaked et al., 2008). Neben der transkriptionellen Aktivierung von Zielgenen konnte wtp53 auch als Repressor verschiedener zellzykusregulierender Gene identifiziert werden (Böhlig and Rother, 2011). Entscheidend für die zellulären Effekte der wtp53-Aktivierung sind das Ausmaß des induzierten Stresses, der genetische Hintergrund der Zellen, der Zelltyp sowie die Interaktion mit verschiedensten Signalwegen (Meek, 2009). Auf Grund dessen ist die Proteinkonzentration, die zelluläre Lokalisation, posttranslationale Modifikationen und das Vorhandensein bestimmter Kofaktoren entscheidend für die Funktion und Regulation von wtp53 (Murray-Zmijewski et al., 2008). Insbesondere spielen hierbei posttranslationale Modifikationen, wie Phosphorylierung, Ubiquitinierung, Acetylierung, Methylierung, Sumoylierung und Neddylierung eine entscheidende Rolle (Kruse and Gu, 2009). Als initialer Schritt der p53-Stabilisierung gilt die Phosphorylierung von p53. Insbesondere die N-terminale Phosphorylierungen an Ser15 und Ser20 durch ATM, ATR, DNA-PK, Chk1 und Chk2 werden dabei als zentral betrachtet (Kruse and Gu, 2009). Hierbei kommt es zur Dissoziation von 4 Einleitung wtp53 und Mdm2, wodurch wtp53 stabilisiert wird. Dies hat eine Verlängerung der geringen Halbwertszeit des wtp53-Proteins zur Folge. 1.1.2 Mutiertes p53 In einer Vielzahl von Tumoren kommt es zu einer Veränderung der Funktion von p53. TP53-Mutationen konnten als genetische Grundlage für das Li-Fraumeni-Syndrom identifiziert werden, welches durch das Risiko verschiedenartige Tumore in unterschiedlichen Altersklassen zu entwickeln charakterisiert ist (Rivlin et al., 2011). Die Mutationsrate in verschiedenen Tumoren schwankt zwischen 10% (z.B. hämatopoetische Tumore) und nahezu 100% (z.B. hochgradig seröse Ovarialkarzinome) (Rivlin et al., 2011). Insbesondere monoallelische missenseMutationen (74% aller Mutationen) sind dabei von entscheidender Bedeutung (Brosh and Rotter, 2009). Genomisch lokalisiert sind die Mutationen vorwiegend in der DNABindedomäne, wobei ca. 30% an den Positionen R175, G245, R248, R249, R273 und R282 auftreten (Cho et al., 1994). Dabei unterbinden Mutationen an den Positionen R248 und R273 die sequenzspezifische DNA-Bindung. Die Mutationen an den Positionen R175, G245, R249 und R282 führen zu einer Veränderung der Faltung des p53-Proteins (Cho et al., 1994). In der heterozygoten Situation, in welcher sowohl ein wtp53-Allel als auch ein p53-mutiertes (mtp53) Allel vorliegt, antagonisiert mtp53 die Funktionen von wtp53 in einer dominant-negativen Art und Weise (Viadiu, 2008). Jedoch ist der heterozygote Phänotyp meist transient, da häufig während der Tumorentwicklung Deletionen oder Mutationen im wtp53-Allel auftreten (loss of heterozygosity) (Rivlin et al., 2011). Neben dem Verlust der typischen p53-Funktionen durch Mutationen (loss-of-function-Phänotyp) ist es weiterhin möglich, dass mtp53 neue onkogene Eigenschaften erwirbt (gain-offunction-Phänotyp) (Goldstein et al., 2011). Dazu gehören eine gesteigerte Proliferationsrate, Reduktion von Apoptose sowie Chemoresistenzmechanismen (Brosh and Rotter, 2009; Sigal and Rotter, 2000). Diese gain-of-function (GOF)Mechanismen können zum einen durch ein verändertes DNA-Bindemuster vermittelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass mtp53 DNA binden kann, jedoch war die Bindung an gängige p53-RE deutlich reduziert (Ludwig et al., 1996; Thukral et al., 1995). Mit Hilfe von Microarrayanalysen wurde das Transkriptom verschiedener p53Mutanten untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass das Spektrum der Einleitung 5 transaktivierten Gene unterschiedlicher p53-Mutationen teilweise, jedoch nicht vollständig überlappt (Weisz et al., 2007). Somit können verschiedene Mutationen distinkte GOFs aufweisen. Neben der direkten Bindung an die DNA kann mtp53 an Transkriptionsfaktoren binden und deren Funktion modulieren. SP1, ETS1, TopBP1 und NF-Y werden sowohl von wtp53 als auch von mtp53 gebunden, jedoch induziert mtp53 die Aktivität der Transkriptionsfaktoren, wohingegen wtp53 diese repremiert (Di Agostino et al., 2006; Bargonetti et al., 1997; Chicas et al., 2000; Hwang et al., 2011; Kim and Deppert, 2003; Liu et al., 2011; Sampath et al., 2001; Torgeman et al., 2001). Dies lässt auf eine Rekrutierung unterschiedlicher Kofaktoren durch wtp53 und mtp53 schließen. Zudem wird auch der Promotor des Vitamin D-Rezeptors verstärkt durch mtp53 gebunden. Die Behandlung mit Vitamin D3, welche in wtp53exprimierenden Zellen pro-apoptotisch ist, führte in mtp53-exprimierenden Zellen zum Überleben (Stambolsky et al., 2010). Weiterhin wurde gezeigt, dass die p53Mutanten p53R248W und p53R273H Mre11 binden und dadurch die Bindung des Mre11Rad51-NBS1-Komplexes an DNA-Doppelstrangbrüche unterbunden wird (Song et al., 2007). Somit wird die durch ATM vermittelte Antwort auf DNA- Doppelstrangbrüche inhibiert. Neben den aktivierenden Interaktionen kann mtp53 auch inhibitorisch auf Transkriptionsfaktoren wirken. Hierbei ist insbesondere der Effekt auf p63 und p73 zu erwähnen. Mtp53 bildet Heterodimere mit p63 und p73, wodurch die Bindung an die DNA und die Transaktivierung spezifischer p63/p73-Zielgene unterbunden wird (Girardini et al., 2011; Liu et al., 2011). Kürzlich konnte jedoch gezeigt werden, dass Komplexe aus mtp53 und p63 häufig an DNA-Abschnitte gebunden sind, welche sich von den gängigen p63-RE unterscheiden (Martynova et al., 2012). Weiterhin ist die Bildung eines stabilen Komplexes aus mtp53 und p73 stark durch den single nucleotide polymorphism (SNP) an Position 72 von p53 beeinflusst (Marin et al., 2000). P53-Mutanten, welche ein Arginin an Position 72 exprimieren, bilden stabilere Heterodimere mit p73 als solche, die ein Prolin an Position 72 exprimieren. Dementsprechend zeigen p53-Mutanten mit einem Prolin an Position 72 höhere Apoptoseraten auf Cisplatin, Etoposid, Taxol und Doxorubicin (Bergamaschi et al., 2003). Ferner wurde kürzlich gezeigt, dass mtp53 prionenartige Strukturen bildet, welche die Bindung und Inhibition von p63 und p73 beeinflussen (Ano Bom et al., 2012; Xu et al., 2011). Weiterhin wird die Stärke der Interaktion von mtp53 mit p63 und p73 durch die Art der p53-Mutation geprägt. Strukturelle p53-Mutanten binden 6 Einleitung mit einer höheren Affinität an p63/p73 als Mutanten, die in ihrer DNA-Bindedomäne Mutationen aufweisen (Muller and Vousden, 2013). Jedoch können beide Arten von p53-Mutationen die Invasivität und Metastasierung von Tumoren erhöhen sowie vor Apoptose schützen (Muller and Vousden, 2013). Im Gegensatz hierzu wurde gezeigt, dass p53-Mutanten, welche eine Deletion der Prolin-reichen Region aufweisen, defizient bei der Induktion von Zellzyklusarrest sind, jedoch weiterhin die Fähigkeit besitzen effizient Apoptose zu induzieren (Toledo et al., 2006). 1.2 Die Funktion von p53 bei der Induktion von Zelltod 1.2.1 p53-abhängige Apoptose Die Fähigkeit von p53 Zellproliferation durch Inhibition des Zellzyklus sowie die Induktion von Apoptose zu inhibieren beschreibt die zentrale Funktion von p53 als Tumorsuppressor. Neben der Induktion von Apoptose ist p53 auch an der Regulation von Zelltod durch Nekrose, Seneszenz und Autophagie beteiligt (Vaseva et al., 2012; Zuckerman et al., 2009). Der Tumorsuppressor p53 spielt insbesondere bei der transkriptionellen Regulation verschiedener Faktoren entscheidende Rolle. aus Nach extrinsischer einem und intrinsischer apoptotischen Stimulus Apoptose kommt es eine zur transkriptionellen Aktivierung von pro-apopototischen Genen, wie NOXA (PMAIP1), PUMA (BBC3), BID, BAX, APAF1 und Fas (Riley et al., 2008; Wei et al., 2006). Ebenso induziert p53 die transkriptionelle Repression von anti-apoptotischen Genen, wie zum Beispiel von Bcl-2 (Wu et al., 2001). Neben den transkriptionsabhängigen Funktionen von p53 kann p53 auch transkriptionsunabhängig Apoptose induzieren. Der nukleäre Export von p53 erfolgt mittels Monoubiquitinierung durch geringe Level an Mdm2 (Lenos and Jochemsen, 2011). Anschließend erfolgt die Bindung von zytosolischem p53 an die Ubiquitin-spezifische Protease HAUSP, welche p53 deubiquitiniert und damit p53 vor dem Mdm2-abhängigen Abbau schützt (Marchenko et al., 2007). Zytoplasmatisches p53 interagiert mit den anti-apoptotischen Proteinen Bcl-2 und Bcl-xL, was die Freisetzung von pro-apoptotischen BH3-only Proteinen zur Folge hat (Mihara et al., 2003). Zudem interagiert zytoplasmatisches p53 direkt mit BAK und induziert dessen Freisetzung von Mcl-1 (Leu et al., 2004). Ebenso konnte eine direkte Aktivierung von BAX nachgewiesen werden (Chipuk et al., 2004). In vivo Einleitung 7 Versuche zeigten, dass in einem ersten Schritt nach einem apoptotischen Stimulus zytoplasmatisches p53 akkumuliert, woraufhin in einem zweiten Schritt p53 in den Nukleus transloziert und durch die Hochregulation von PUMA einen transkriptionsabhängigen Zelltod induziert (Erster et al., 2004). Somit ist es möglich, dass sowohl die transkriptionsabhängigen sowie die transkriptionsunabhängigen Funktionen von p53 nötig sind, um effizient Apoptose zu induzieren (Vousden and Prives, 2009). 1.2.2 Therapeutische Ansätze zur Aktivierung von p53 Mutationen im TP53 Gen treten in circa 50% aller Tumorerkrankungen auf. Die andere Hälfte der Tumore exprimiert wtp53, dessen Funktion jedoch kompromittiert ist. Mechanismen, welche zur Deregulation der wtp53-Aktivität führen, sind die Überexpression von Mdm2 und MdmX oder die Deletion bzw. die epigenetische Inaktivierung des Mdm2 Inhibitors ARF (Brown et al., 2009). Auf Grund dessen stellt die Reaktivierung von p53 eine therapeutische Option dar. Eine der am besten charakterisierten Substanzen, welche den p53-Mdm2-Komplex inhibieren, ist das cis-Imidazolanalogon Nutlin-3 (Vassilev et al., 2004). Nutlin-3 bindet kompetitiv mit p53 an Mdm2. In nichtmalignem Gewebe ist die Aktivität von Nutlin-3 mit der Induktion von Zellzyklusarrest assoziiert (Tovar et al., 2006; Vassilev et al., 2004). In Tumorzellen überwiegt die Induktion von Apoptose und Seneszenz (Cheok et al., 2011). In präklinischen Studien mit AML- und Neuroblastomzellen konnte gezeigt werden, dass die Induktion von Apoptose selektiv in Zellen mit wtp53 auftritt (Kojima et al., 2005; Van Maerken et al., 2009). Eine Toxizität gegenüber BLymphozyten, PBMNCs und hämatopoetischen Vorläuferzellen konnte nicht beobachtet werden (Secchiero et al., 2006). In klinischen Studien (Phase I) konnte das Nutlin-3a Derivat RG7112 die Zellproliferation in Mdm2-überexprimiereden Liposarkomen reduzieren (Ray-Coquard et al., 2012). Neben RG7112 befindet sich auch der Mdm2 Antagonist JNJ-26854165 in klinischen Studien der Phase I. Dieser induziert eine wtp53- und E2F1-abhängige Apoptose in Zellen der AML und ALL (Kojima et al., 2010). Mit Hilfe der Kristallstruktur des p53-Mdm2-Komplexes wurden die Spirooxidole MI-43, MI-63, MI-219 und MI-319 identifiziert (Ding et al., 2005, 2006; Mohammad et al., 2009; Shangary et al., 2008a; Sosin et al., 2012). Diese ahmen die Bindestellen 8 Einleitung von p53 nach und binden selektiv an Mdm2. Ähnlich Nutlin-3a führte die Behandlung mit den Spirooxidolen zu einer Akkumulation von wtp53 sowie zur Induktion von Apoptose in Tumorzellen, nicht aber in Normalgewebe (Canner et al., 2009; Mohammad et al., 2009; Shangary et al., 2008a, 2008b). Ein weiterer Inhibitor der p53-Mdm2-Interaktion ist TDP665759, welcher in Kombination mit Doxorubicin Tumore in vivo sensitiviert (Koblish et al., 2006). Zudem wurde der p53-MdmX-Inhibitor SJ-172550 identifiziert, welcher additive zytotoxische Effekte in Kombination mit Nutlin-3a zeigte (Reed et al., 2010). Jedoch zeigt dieser Inhibitor eine hohe Aktivität gegenüber Thiolresten, wodurch der Inhibitor aus der weiteren Entwicklung ausgeschlossen wurde (Wade et al., 2013). Ein weiteres Molekül, welches die p53-Mdm2-Interaktion inhibiert, ist das ThiophenDerivat RITA (reactivation of p53 and induction of tumor cell apoptosis, NSC652287). Im Gegensatz zu den bisher genannten Inhibitoren bindet RITA direkt an p53, wodurch eine Aktivierung von wtp53 induziert wird (Issaeva et al., 2004). Im Vergleich zu einer Behandlung mit Nutlin-3 führt die RITA-induzierte Aktivierung von wtp53 vorwiegend zur Induktion von pro-apoptotischen Genen (Enge et al., 2009). Zudem konnte kürzlich gezeigt werden, dass Mdm2-Inhibitor-resistente Tumorzellen durch eine Behandlung mit RITA sensitiviert werden können (Jones et al., 2012). Dabei handelte es sich um mtp53 exprimierende Lymphomzellen. Neben der wtp53 aktivierenden Eigenschaften von RITA wurde kürzlich die Fähigkeit zur Reaktivierung von mtp53 nachgewiesen (Zhao et al., 2010a). CP-31398 zeigte ähnliche tumorsuppressive Eigenschaften, wobei eine thermodynamische Stabilisierung des mtp53 Proteins durch die Substanz postuliert wurde (Foster et al., 1999). Weiterhin konnte die selektiv in mtp53-exprimierenden Zellen wirksame Substanz RETRA identifiziert werden (Kravchenko et al., 2008). RETRA unterbindet die Interaktion von mtp53 mit p73, wodurch eine p73-abhängig Apoptose induziert wurde (Kravchenko et al., 2008). Als einzige mtp53 reaktivierende Substanz in der klinischen Phase (Phase I) ist PRIMA-1 (APR-246). PRIMA-1 restauriert die transkriptionelle Aktivität von mtp53 und induziert Apoptose in Abhängigkeit von mtp53 (Bykov et al., 2002). Dabei zeigte die Substanz keine toxischen Effekte auf Normalgewebe. Zentral sowohl bei der Aktivierung von wtp53 als auch bei der Reaktivierung von mtp53 ist die Induktion von Apoptose über das Mitochondrium. Einleitung 9 1.3 Die Bcl-2-Proteinfamilie Funktionell gruppieren sich die Mitglieder der Bcl-2-Familie in anti- und proapoptotische Proteine. Durch Struktur- und Sequenzanalysen konnten bisher sechs humane anti-apoptotische Bcl-2-Proteine, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, Bcl-B und A1, identifiziert werden (Czabotar et al., 2013). Diese interagieren direkt mit den proapoptotischen Proteinen und inhibieren deren Funktion. Pro-apoptotische Familienmitglieder untergliedern sich in Effektoren und BH3-only-Proteine. BAX und BAK, die pro-apoptotischen Effektoren, können durch Oligomerisierung Poren bilden, wodurch die Permeabilisierung der äußeren mitochondrialen Membran sowie die Aktivierung von Caspasen induziert wird (Westphal et al., 2014). Die BH3-only Proteine NOXA, PUMA, BIM, BID, BAD, BMF, HRK und BIK binden über die BH3-Domäne, eine amphiphatische α-Helix, in die hydrophobe Bindetasche der antiapoptotischen Bcl-2-Proteine (Sattler et al., 1997). Ungeachtet der strukturellen Ähnlichkeiten der BH3-only-Proteine existieren Bindungspräferenzen der BH3-onlyProteine an anti-apoptotische Bcl-2-Proteine. BIM, BID und PUMA können hierbei an alle anti-apoptotischen Proteine binden, wobei zudem eine direkte Interaktion mit BAX und BAK beschrieben wurde (Elkholi et al., 2011). Im Gegensatz hierzu bindet NOXA präferentiell an Mcl-1, BAD an Bcl-2 und Bcl-xL (Ghiotto et al., 2010). Daraus ergeben sich komplexe Interaktionen zwischen den pro- und antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitgliedern, welche die Aktivierung von BAX und BAK und damit die Induktion von mitochondrialer Apoptose regulieren. Um diese Prozesse zu beschreiben, wurden verschiedene Modelle der Aktivierung von BAX und BAK postuliert. Im „direct activation“-Modell werden die BH3-only-Proteine in Aktivatoren (tBID, BIM, PUMA) und Sensibilisatoren (z.B. NOXA, BAD) unterteilt (Letai et al., 2002). Die Aktivatoren binden dabei sowohl an Effektoren als auch an antiapoptotischen Bcl-2-Proteine. Sensibilisatoren binden spezifisch an anti-apoptotische Proteine, wodurch die Aktivatoren freigesetzt werden und anschließend BAX und BAK aktivieren können (Shamas-Din et al., 2011). Im Gegensatz hierzu können im „indirect activation“-Modell BAX und BAK nicht direkt von BH3-only-Proteinen aktiviert werden. Nach einem apoptotischen Stimulus erfolgt die Aktivierung der BH3-only-Proteine sowohl auf transkriptioneller als auch auf posttranslationaler Ebene. Diese binden anschließend an die in einem Komplex mit BAX und BAK befindlichen anti-apoptotischen Bcl-2-Proteine. BAX und BAK werden 10 Einleitung dadurch freigesetzt und induzieren MOMP. Die Induktion von Apoptose erfolgt somit ausschließlich durch die Inhibition der anti-apoptotischen Bcl-2-Proteine durch BH3only-Proteine (Strasser et al., 2011). Nach heutiger Ansicht führt ein apoptotischer Stimulus meist zu einer Kombination der „direct activation“ und „indirect activation“ Modelle. Dies führte zur Postulation des „unified“ Modells (Llambi et al., 2011). Hierbei binden die anti-apoptotischen Proteine nicht nur an die Aktivatoren der BH3-only-Proteine, sondern auch an die Effektoren BAX und BAK. In gesunden Zellen befinden sich BAX (zytosolisch) und BAK (mitochondrial) in einem inaktiven Zustand, wobei keine anti-apoptotischen Bcl-2-Proteine gebunden sind. Nach einem apoptotischen Stimulus erfolgt die Bildung und Aktivierung von BH3-only-Proteinen, welche die anti-apoptotischen Proteine mit hoher Affinität binden und zudem zur direkten Aktivierung von BAX und BAK führen (Llambi et al., 2011). Einleitung 11 1.4 Ziele der Arbeit Der Erfolg einer Tumortherapie hängt entscheidend von der Sensitivität der Tumorzellen gegenüber dem Therapeutikum ab. Cisplatin, eine klassische DNAschädigende Substanz, zeigt in verschiedenen Tumoren unterschiedliche Wirksamkeiten. Testikulären Keimzelltumoren zeichnen sich durch eine hohe Sensitivität gegenüber dem Chemotherapeutikum aus. Hingegen zeigen Ovarialkarzinome eine initial hohe Sensitivität gegenüber Cisplatin, an welche häufig eine vollständige Cisplatin-Resistenz anschließt. Die Tumore unterscheiden sich fundamental in ihrem p53-Status, da testikuläre Keimzelltumore vorwiegend wtp53, Ovarialkarzinome überwiegend mtp53 exprimieren. Zudem führt die Aktivierung von p53 in beiden Tumorarten zu unterschiedlichen Effekten. Wtp53 gilt als zentrale Vermittler der Chemosensitivität in Keimzelltumoren. In hochgradig serösen Ovarialkarzinomen zeigt sich eine initial hohe Sensitivität gegenüber Cisplatin. Nach einigen Monaten platin-basierter Chemotherapie treten jedoch vermehrt Resistenzen auf. Bisher ist unklar, welche Rolle der p53-Status für die Sensitivität gegenüber der Aktivierung von p53 hat. In der vorliegenden Arbeit wurde Cisplatin als typischer p53Aktivator nach DNA-Schädigung verwendet um die Rolle des p53-Status näher zu untersuchen. Um eine direkte Aktivierung von p53 zu induzieren wurden zudem die Inhibitoren der p53-Mdm2-Interaktion Nutlin-3 und RITA in die Studie miteinbezogen. Im Einzelnen wurden folgende Fragestellungen bearbeitet: Wie unterscheidet sich die Sensitivität von Tumorzellen mit unterschiedlichem p53-Status sowie von Tumor-assoziierten Fibroblasten aus der humanen Lunge und PBMNCs von gesunden Donoren gegenüber den p53-Aktivatoren Nutlin, RITA und Cisplatin? Welche typischen p53-Zielgene werden durch Nutlin, RITA und CisplatinBehandlung in der Zelllinienauswahl aktiviert? Inwiefern unterscheiden sich hier Zelllinien mit wtp53 von denen mit defektem p53? Korreliert die Regulation der p53-Zielgene mit dem p53-Status oder mit der Sensitivität gegenüber Nutlin-3-, RITA- oder Cisplatin-Behandlung? Welche Mechanismen führen zur Sensitivierung der Zellen gegenüber Nutlin-3, RITA und Cisplatin in Abhängigkeit vom p53-Status? 12 Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Zellkulturtechnik 2.1.1 Verwendete Zelllinien Für diese Arbeit wurde mit Tumorzelllinien aus verschiedenen Entitäten gearbeitet, welche in Tabelle 2.1 aufgelistet sind. Tabelle 2.1: Verwendete Tumorzellinien Zelllinie Entität NTERA-2D1 Herkunft embryonales LGC Standards Hodenkarzinom embryonales Dr. T. Müller, Hodenkarzinom Universität Halle A549 Bronchialkarzinom ATCC H460 Bronchialkarzinom ATCC H23 Bronchialkarzinom ATCC Calu-1 Bronchialkarzinom ATCC A2780 Ovarialkarzinom NCI-60 IGROV1 Ovarialkarzinom NCI-60 OVCAR3 Ovarialkarzinom NCI-60 OVCAR4 Ovarialkarzinom NCI-60 OVCAR5 Ovarialkarzinom NCI-60 OVCAR8 Ovarialkarzinom NCI-60 SKOV3 Ovarialkarzinom NCI-60 TOV-112D Ovarialkarzinom ATCC 2102EP 2.1.2 Kulturmedium, Zusätze und Kulturbedingungen Für die Kultivierung der Zelllinien, ausgenommen der Ovarialkarzinomlinie TOV-112D, wurde RPMI1640-Medium verwendet, welches mit 10% FCS (v/v) supplementiert wurde. Weiterhin wurde ein Gemisch aus verschiedenen Zusatzstoffen, welche nachfolgend aufgelistet sind, dem Medium zugesetzt. Material und Methoden RPMI1640-Medium 13 Biochrom AG, Berlin Zusatzstoffe à 500 ml RPMI-Medium: 10 % (v/v) FCS (fetales Kälberserum) Gibco, Karlsruhe 0,1 g/l Penicillin/Streptomycin (je 10000 Units) Gibco, Karlsruhe 1 mM Natriumpyruvat Gibco, Karlsruhe 2 mM L-Glutamin Biochrom AG, Berlin 3 ml 100 x nicht- essentielle Aminosäuren Biochrom AG, Berlin 0,05 mM 2-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt 10 mM HEPES (2-(4-Hydroxyethyl)-1- Merck, Darmstadt piperazinyl)ethanolsulfonsäure), pH 7,4 0,13 mM L-Asparagin Serva, Heidelberg Die Ovarialkarzinomlinie TOV-112D wurde in einer 1:1-Mischung der Medien MCDB105 und Medium199 kultiviert. Das MCDB105 Medium wurde zuvor mit 1,5 g/l NaHCO3 und das Medium 199 mit 2,2 g/l NaHCO3 supplementiert. Abschließend wurde der Medienmischung 15% FCS zugefügt. MCDB Medium Tebu-Bio, Offenbach Medium 199 Biochrom AG, Berlin Die Kultivierung der Zellen erfolgte bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2 im CO2-Inkubator. Die regelmäßige Passagierung der Zellen sowie deren Kultivierung für Versuche wurden unter der Sterilbank durchgeführt. Zur Passagierung der Zellen wurde das vorhandene Medium verworfen und mit 1xPBS nachgespült. Die adhärenten Zellen wurden durch Trypsin/EDTA abgelöst. Die Reaktion des Trypsins wurde durch Zugabe des entsprechenden Mediums gestoppt. Nach einem Zentrifugationsschritt (RT, 1400 rpm, 5 min) wurden die Zellen in einer definierten Menge an Medium aufgenommen und die Lebendzellzahl bestimmt. 14 Material und Methoden CO2-Inkubator Heraeus, Hanau Sterilbank LaminAir HB2472 Corning, USA Sterile Pipetten Corning, USA 50 ml Polypropylenröhrchen, FALCON Becton Dickinson, USA Trypsin/EDTA Gibco, Karlsruhe PBS Biochrom AG, Berlin 2.1.3 Bestimmung der Lebendzellzahl mittels Trypanblaufärbung Trypanblau ist ein anionischer Diazofarbstoff, welcher nur in toten Zellen akkumuliert. Lebende Zellen bleiben ungefärbt. Für die Bestimmung der Lebendzellzahl wurde Trypanblau (1:10 in PBS) und die Zellsuspension im Verhältnis 1:10 vermischt und die Anzahl der vitalen Zellen mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer unter dem Hellfeldmikroskop bestimmt. Zellzahl Anzahl ausgezählter Großquadrate = Zellzahl x Vedünnungsfaktor x 10 4 = ml Trypanblau 0,5% (w/v) Biochrom AG, Berlin Neubauer-Zählkammer Roth, Karlsruhe Hellfeldmikroskop Zeiss, Jena 2.1.4 Kryokonservierung und Rekultivierung Um genetische Veränderungen durch Selektionsprozesse innerhalb der Zellkultur zu vermeiden, wurden die Zelllinien in Abständen von vier Monaten neu in Kultur genommen. Für die Kryokonservierung wurde eine definierte Zellmenge in 1 ml FCS mit 10% DMSO resuspendiert und das gesamte Volumen in ein Kryo-Röhrchen überführt. Dieses wurde in eine mit 99,9% Isopropanol befüllte Einfrierbox gestellt und für 24 h bei -80°C tiefgefroren. Anschließend wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff dauerkonserviert. Material und Methoden 15 Die Rekultivierung erfolgte, indem dauerkonservierte Zellen im Wasserbad bei 37°C angetaut und in ein steriles 50 ml Polypropylen Röhrchen überführt wurden. Die Zellen wurden anschließend in RPMI-Medium aufgenommen und bei RT, 1400 rpm für 5 min zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in entsprechendem Medium resuspendiert und die Zellsuspension zur Kultivierung in Zellkulturflaschen überführt. DMSO Sigma-Aldrich, Taufkirchen 5100 Cryo 1°C Einfrierbox ‚Mr. Frosty‘ Nalgene Nunc International 1,8 ml Cryo Tube TM Nalgene Nunc International 2.2 Kultur von primärem Zellmaterial 2.2.1 Isolation von PBMNCs Die Isolation von peripherial blood mononuclear cells (PBMNCs) erfolgte durch eine Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation aus Vollblut. Dabei bildet sich ein Zellsediment aus Erythrozyten und Granulozyten, ein Überstand aus Plasma und Thrombozyten und eine Interphase, welche die PBMNCs enthält. Rechtlich abgedeckt wurde die Verwendung von PBMNCs durch ein Ethikvotum (#035-06-f). Für die Isolation wurde EDTA-Blut 1:1 mit 1xPBS verdünnt. 25 ml Ficoll wurden nun mit 25 ml Blut/PBS vorsichtig überschichtet. Anschließend erfolgte die Zentrifugation mit niedrigster Beschleunigung und ohne Bremse (RT, 300 rpm, 25 min). Die Interphase wurde in ein neues Gefäß überführt und erneut zentrifugiert (RT, 1400 rpm, 5 min). Abschließend wurde das Zellpellet in 1xPBS aufgenommen und die Zellzahl bestimmt. Für die Versuche wurden 1·106 Zellen/ml ausgesät. Die Stimulation der PBMNCs erfolgte durch Phytohämagglutinin-L (PHA-L) in einer Konzentration von 2,5 µg/ml. EDTA-S-Monovette® K3E (9 ml) Sarstedt, Nümbrecht BIOCOLL Separating Solution (Ficoll) Biochrom AG, Berlin Phytohämaaglutinin-L Roche, Mannheim 16 Material und Methoden 2.2.2 Isolation Tumor-assoziierter Fibroblasten Für die Isolation von Tumor-assoziierten Fibroblasten wurde frisches Lungentumorgewebe verwendet. Rechtlich abgedeckt wurde die Verwendung von frischem Tumormaterial durch ein Ethikvotum (#159/2011BO2) und eine Einverständniserklärung der Patienten. Nach der mechanischen Zerkleinerung des Gewebes wurde dieses enzymatisch verdaut, wofür Cell Rinse-Puffer (120 mmol/L NaCl, 5,6 mmol/L Glucose, 2,5 mmol/L MgCl2 x 6H20, 5,4 mmol/L KCl, 1mmol/L NaH2PO4, 20 mmol/L HEPES, pH 7,2), supplementiert mit Kollagenase (167 U/ml) und DNase (250 U/ml), zugesetzt wurde. Nach 90 minütiger Inkubation bei 37°C wurde das Gewebe über ein Zellsieb mit einer Porengröße von 70 μm filtriert, um die Zellen zu vereinzeln. Anschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert (RT, 1400 rpm, 5 min), das Zellpellet in RPMI1640 Medium mit 10% FCS aufgenommen und zur Kultivierung in Zellkulturflaschen überführt. Die Kultivierung erfolge bei 37°C und 5% CO2. Um sicherzustellen, dass nur adhärierte Zellen weiterkultiviert werden, wurde das Medium nach 24 h abgesaugt, die Zellen mit 1x PBS gewaschen und frisches Medium zugegeben. Nach der Expansion der Fibroblasten erfolgte die Dauerkonservierung der Zellen in flüssigem Stickstoff. Nach dem Auftauprozess wurden die Fibroblasten erneut expandiert und in Passage 6 mit Cisplatin, Nutlin-3 oder RITA behandelt. MgCl2 Sigma-Aldrich, Taufkirchen NaH2PO4 Sigma-Aldrich, Taufkirchen DNase (250 U/ml) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Kollagenase (167 U/ml) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Protease (0,25 mg/ml) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Cell Strainer 70 μm Becton Dickinson, USA 2.3 Reagenzien 2.3.1 Induktion von genotoxischem Stress Genotoxischer Stress wurde auf die Zellen durch die Zugabe von Cisplatin (cis-Diammindichloridoplatin(II)) ausgeübt. Cisplatin führt in seiner aktiven Form zur Quervernetzung des DNA-Doppelstrangs, wodurch die Replikation und Transkription Material und Methoden 17 gehemmt wird. Die Behandlung der Zellen erfolgte mit einer Cisplatinkonzentration von 10 µM. Cisplatin 1mg/ml Apotheke Robert-Bosch-Krankenhaus, Stuttgart 2.3.2 Inhibiton der p53-Mdm2 Interaktion Nutlin-3, ein cis-Imidazol-Analogon, bindet an Mdm2 und unterbindet so die Interaktion von Mdm2 mit p53 (Vassilev et al., 2004). Dadurch kommt zur Stabilisierung von p53. Nutlin-3 wurde in einer Konzentration von 10 µM eingesetzt. Nutlin- 3 Sigma-Aldrich, Taufkirchen 2.3.3 Aktivierung von p53 Die direkte Induktion von p53 erfolgte durch RITA (2,5-bis(5-Hydroxymethyl-2thienyl)Furan). RITA bindet an den N-Terminus von p53, wodurch eine Konformationsänderung ausgelöst wird. Diese verhindert die Interaktion mit Mdm2 (Issaeva et al., 2004). RITA wurde in einer Konzentration von 1 µM eingesetzt. RITA Biozol, Eching 2.3.4 Inhibition der Caspaseaktivität Caspasen sind Cysteinproteasen, welche durch die Induktion von Apoptose aktiviert werden. Die Hemmung dieser Proteasen erfolgte mit dem pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-FMK (Carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]-fluoromethylketone). Dieser bindet irreversibel an das katalytische Zentrum der Proteasen. Der Inhibitor wurde in einer Konzentration von 50 µM eingesetzt. z-VAD-FMK Bachem, Bubendorf (CH) 18 Material und Methoden 2.3.5 Inhibition anti-apoptotischer Bcl-2-Proteine ABT-737 ist ein zellpermeables Nitrophenylsulfonylbenzamid, welches die antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie, Bcl-2, Bcl-xL und Bcl-w, hochaffin binden kann (Oltersdorf et al., 2005). ABT-737 wurde in einer Konzentration von 1 µM eingesetzt. ABT-737 ChemieTek, USA 2.3.6 Inhibition des MAPK-Signaltransduktionsweges Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) können prinzipiell in drei Untergruppen, ERKs (extracellular-signal-regulated kinases), JNKs (Jun amino-terminal kinases), und p38 MAPKs (stress-activated protein kinases) unterteilt werden (Morrison, 2012). Insbesondere JNK und p38 besitzen pro-apoptotische Funktionen. Die Inhibition von JNK erfolgte durch SP600125, die von p38 durch den p38-MAPKinase-Inhibitor III. SP600125 wurde in einer Konzentration von 5 µM eingesetzt, der p38-MAP-Kinase-Inhibitor III in einer Konzentration von 1 µM. p38-MAP-Kinase-Inhibitor III SP600125 Calbiochem, USA Sigma-Aldrich, Taufkirchen 2.3.7 Inhibition des Proteasoms Bortezomib ist ein borsäurehaltiges Dipeptid, welches an das 26S Proteasom bindet und dieses in seiner Aktivität hemmt. Dadurch werden p53 sowie andere Proteine, welche proteasomal degradiert werden, akkumuliert. Bortezomib wurde in einer Konzentration von 20 nM eingesetzt. Bortezomib Toronto Research Chemicals (TRC), Kanada Material und Methoden 19 2.4 Zellanalyse mit Hilfe des Durchflusszytometers (FACS) Das für diese Arbeit verwendete Durchflusszytometer detektiert das Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FSC), das Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSC) und vier verschiedene Fluoreszenzspektralbereiche (FL 1-4). Fluorescence Activated Cell Analyzer ‚FACSCalibur‘ Becton Dickinson, USA Laser: luftgekühlter Argon-Ionen Laser: 488 nm roter Diodenlaser: 635 nm Detektoren/Filter: 530 nm (Kurzpassfilter) 585 nm (Kurzpassfilter) 661 nm (Kurzpassfilter) 670 nm (Langpassfilter) Software: CELLQuestTM Pro Software Becton Dickinson, USA 2.4.1 Nachweis von Zelltod mittels AnnexinV-FITC/PI-Färbung Während des apoptotischen Prozesses kommt es zu charakteristischen Veränderungen innerhalb der Zellen, wie zum Verlust der Membransymmetrie, welche schon in frühen apoptotischen Stadien auftritt. Dabei wird das Phospholipid Phosphatidylserin von der inneren auf die äußere Membranseite transloziert. AnnexinV, ein 35-36 kDa großes, Ca2+-abhängiges Phospholipidbindeprotein, hat eine hohe Affinität zu Phosphatidylserin. Durch die Konjugation von FluoreszeinIsothiocyanat (FITC) an AnnexinV wird die Bindung des Proteins an Phosphatidylserin messbar. In späten apoptotischen Stadien oder in nekrotischen Zellen kommt es zu einem Verlust der Membranintegrität. Um diese Phänomene von frühen apoptotischen Stadien zu differenzieren wird neben AnnexinV-FITC, Propidiumiodid (PI) zur Färbung eingesetzt. Zellen mit intakter Membran schließen PI aus, wohingegen der Verlust der Membranintegrität zur Aufnahme von PI führt. PI interkaliert in die Nukleinsäuren der Zelle und färbt spät-apoptotische oder nekrotische Zellen an. 20 Material und Methoden Für die Versuche wurden die Zellen durch Trypsinieren geerntet und pelletiert (5 min, 1400 rpm, RT). Nach sukzessiven Waschschritten in PBS und Annexin-Bindepuffer (ABP; 0,1 M HEPES/NaOH pH7,4, 1,4 M NaCl, 25 mM CaCl2) wurde das Zellpellet in 100 µl AnnexinV-FITC-Färbelösung (5% (v/v) AnnexinV-FITC, 2,5% (v/v) PI-Lösung (Stammlösung 50 µg/ml), 92,5% (v/v) ABP) aufgenommen und für 10 min im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden 400 µl ABP zugegeben und die Zellen im FACS analysiert. AnnexinV-FITC BD PharMingen, USA Propidiumiodid Stammlösung (1 mg/ml) Sigma-Aldrich, Taufkirchen 2.4.2 Nachweis von Zelltod mittels TMRM-Färbung TMRM (Tetramethylrhodaminmethylester Perchlorat) ist ein anionischer, membranpermeabler Farbstoff, durch welchen Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials nachgewiesen werden können. Der Farbstoff akkumuliert an der positiv geladenen, äußeren mitochondrialen Membran intakter Zellen. Durch die Induktion von Zelltod Membranpotentials, kommt wodurch es zu einem Verlust des mitochondrialen TMRM nicht mehr akkumulieren kann (Elmore et al., 2004). Für die Färbung wurden die Zellen trypsiniert, pelletiert und anschließend mit 50 nM TMRM in 500 µl 1x PBS für 20 min bei 37°C inkubiert. Die Messung erfolgte am Durchflusszytometer. TMRM (Tetramethylrhodaminmethylester Perchlorat) Molecular Probes, USA 2.4.3 Zellzyklusanalyse mittels BrdU-Proliferationsassay Mit Hilfe der Messung des DNA-Gehalts ist es möglich, die einzelnen Zellzyklusstadien zu analysieren. Durch den Farbstoff Propidiumiodid, welcher sich in doppelsträngige Nukleinsäuren einlagert, kann der DNA-Gehalt einer Zelle bestimmt werden. Apoptotische Zellen verlieren Teile der DNA-Fragmente und inkorporieren auf Grund dessen weniger PI. Dieser Zustand wird auch als SubG1 bezeichnet. Material und Methoden 21 Um neben dem DNA-Gehalt auch die Synthese von DNA nachweisen zu können, wurden die Zellen 45 min vor der Ernte mit BrdU versetzt. BrdU ist ein Uridinderivat, welches während der S-Phase anstelle von Thymidin in die DNA eingebaut werden kann. Der Einbau von BrdU wurde durch die Zugabe eines Fluorochrom-markierten anti-BrdU-Antikörpers nachgewiesen. Die SubG1-Phase enthält die Zellen, die BrdU negativ sind und weniger als 2N DNA besitzen. In der Chromosomensatz G1-Phase besitzen befinden aber BrdU sich Zellen, negativ sind, die da einen sie einfachen keine DNA synthetisieren. In der S-Phase findet die Replikation des Chromosomensatzes statt. Auf Grund dessen wird BrdU in den neu gebildeten DNA Doppelstrang eingebaut. Zellen in der S-Phase sind dementsprechend BrdU positiv und haben einen DNA Gehalt der zwischen 2N und 4N liegt. Zellen mit einem doppelten Chromosomensatz befinden sich in der G2-Phase. Sie sind BrdU negativ, da die DNA-Synthese abgeschlossen ist und die Zellen in die Mitosephase eintreten können. Für den Versuch wurden die Zellen nach der Inkubationszeit mit BrdU durch Trypsinieren geerntet, zentrifugiert (5 min, 1400 rpm, RT) und das Pellet mit 1 ml -20°C kaltem 70% (v/v) Ethanol über Nacht fixiert. Nach erneutem Pelletieren (5 min, 900 rpm, RT) der Zellen wurden diese zur Denaturierung mit 1 ml 2N HCl für 30 min inkubiert, erneut zentrifugiert und mit 0,1 M Boraxlösung neutralisiert. Anschließend folgten mehrere Waschschritte mit einer PBS/BSA/Tween-Lösung (1% (v/v) BSA, 0,5% (v/v) Tween). Daraufhin wurde das Zellpellet mit dem Anti-BrdUAntikörper für 30 min bei 4°C inkubiert. Der Sekundärantikörper, welcher mit FITC markiert ist, wurde nach einem erneuten Waschschritt für 30 min bei 4°C zu den Zellen gegeben. Nach einem weiteren Waschschritt in Glucose/PBS wurden die Zellen in PI-Färbelösung (5% (v/v) PI-Lösung (Stammlösung 1mg/ml), 1% RNase A (Stammlösung 100 mg/ml), 95% (v/v) PBS) aufgenommen. Die darin enthaltene RNase A dient zum Verdau der RNA und verhindert so deren störende Färbung. Nach einer Inkubationszeit von 10 min wurden die Zellen am FACS vermessen. 22 Material und Methoden BrdU Sigma-Aldrich, Steinheim Anti-BrdU- Antikörper GAM-FITC Sekundärantikörper Becton Dickinson, USA Dianova, Hamburg Tween 20 Merck, Darmstadt Ethanol Merck, Darmstadt Glucose Sigma-Aldrich, Steinheim Propidiumiodid Sigma-Aldrich, Steinheim RNase A Qiagen, Hilden 2.5 High-throughput qPCR mit Hilfe des BioMarkTM-HD-Systems 2.5.1 Generierung von RNA Zur Generierung von RNA wurden die Zellen trypsiniert, pelletiert (4°C, 1400 rpm, 5 min) und anschließend mit dem mirVana miRNA Isolation Kit nach Angaben des Herstellers aufgereinigt. mirVana miRNA Isolation Kit Ambion, USA 2.5.2 Spektrometrische Quantifizierung von RNA Die Quantifizierung der isolierten Ribonukleinsäuren erfolgte durch Messung der Absorption im ultravioletten Spektralbereich. Zur Konzentrationsbestimmung wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. Eine OD von 1 entsprach hier einer Konzentration von 40 µg/ml RNA. Zudem konnte durch eine zusätzliche Messung der Absorption bei 280 nm die Reinheit des Isolats bestimmt werden. Befand sich der Wert des Quotienten aus OD260 und OD280 im Bereich 1,8 bis 2, so war das Isolat von ausreichend hoher Reinheit. Niedrigere Werte weisen auf Protein- oder Phenolkontaminationen hin. Höhere Werte hingegen zeugen von einem hohen Anteil an denaturierter DNA. NanoDrop Spectrophotometer Peqlab ND-100 Biotechnologie GmbH, Erlangen Material und Methoden 23 2.5.3 cDNA Synthese Die isolierte RNA wurde mit Hilfe des RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit in DNA überschrieben. Als Primer wurden Oligo(dT) Primer verwendet. Von jeder RNAIsolation wurde 250ng RNA eingesetzt. RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas, USA Mastercycler Gradient Eppendorf, Hamburg 2.5.4 qPCR mit dem BioMarkTM-HD-System Die Genexpressionsanalyse erfolgte durch das BioMarkTM-HD-System, welches die Möglichkeit bietet, entweder 48 Gene und 48 Proben oder 96 Gene und 96 Proben simultan zu messen. Um eine spezifische Anreicherung der Gene zu erreichen, wurde zunächst eine specific target amplification (STA) durchgeführt, wofür ein Gemisch der verwendeten TaqMan® Gene Expression Assays hergestellt wurde. Die verwendeten Assays für das 48x48 System sind in Tabelle 2.2 aufgelistet. Tabelle 2.2: Verwendete TaqMan® Gene Expression Assays im 48x48 Format Genname Assay Nummer Genname Assay Nummer 1 ABCB1 Hs01067802_m1 24 HGF Hs00300159_m1 2 AIFM2 Hs01097300_m1 25 hTERT Hs00972656_m1 3 APAF1 Hs00559441_m1 26 IER3 Hs00174674_m1 4 ATF3 Hs00231069_m1 27 IGFBP3 Hs00426287_m1 5 BAX Hs00180269_m1 28 LRDD Hs00388035_m1 6 BBC3 Hs00248075_m1 29 Mdm2 Hs00234753_m1 7 Bcl-2 Hs00608023_m1 30 Mdm4 Hs00159092_m1 8 Bcl-xl Hs00236329_m1 31 Met Hs01565584_m1 9 BID Hs00609632_m1 32 P53AIP1 Hs00986095_m1 10 BTG2 Hs00198887_m1 33 PCNA Hs00696862_m1 11 CD95 Hs00531110_m1 34 PMAIP1 Hs00560402_m1 12 CDC25C Hs00156411_m1 35 RB1 Hs01078066_m1 13 CDK1 Hs00938777_m1 36 TBP Hs00427620_m1 14 CDKN1A Hs00355782_m1 37 TNFRSF10A Hs00269492_m1 15 CGNG1 Hs00171112_m1 38 TNFRSF10B Hs00366278_m1 24 Material und Methoden 16 c-myc Hs00905030_m1 39 TNFRSF10C Hs00182570_m1 17 Cyclin B1 Hs01030097_m1 40 TNFRSF10D Hs00388742_m1 18 CyclinA Hs00996788_m1 41 TP53 Hs01034249_m1 19 CyclinK Hs00171095_m1 42 TP53i3 Hs00153280_m1 20 EGFR Hs01076078_m1 43 TP53INP1 Hs01003820_m1 21 FasL Hs00181225_m1 44 TP63 Hs00978340_m1 22 Fos Hs00170630_m1 45 TP73 Hs01056230_m1 23 GADD45α Hs00169255_m1 46 ZMAT3 Hs00536976_m1 Für das 96x96 Format wurden die in Tabelle 2.3 aufgelisteten TaqMan® Gene Expression Assays verwendet. Tabelle 2.3: Verwendete TaqMan® Gene Expression Assays im 96x96 Format Genname Assay Nummer Genname Assay Nummer 1 ALOX12 Hs00911144_m1 48 HSP90AA1 Hs00743767_sH 2 ATF2 Hs01095345_m1 49 HSPA4 Hs00382884_m1 3 ATF4 Hs00909569_g1 50 HSPA5 Hs99999174_m1 4 ATF6 Hs00232586_m1 51 HSPB2 Hs00155436_m1 5 ATG12 Hs00740818_m1 52 Jun Hs99999141_s1 6 ATG5 Hs00355492_m1 53 JunD Hs04187679_s1 7 ATG7 Hs00197348_m1 54 KLF6 Hs00810569_m1 8 ATM Hs00175892_m1 55 MAFF Hs00544822_m1 9 ATR Hs00169878_m1 56 MAPK8 Hs00177083_m1 10 BAD Hs00188930_m1 57 Mcl1 Hs01050896_m1 11 BAK Hs00940250_g1 58 MLH1 Hs00179866_m1 12 BCL2A1 Hs00187845_m1 59 MSH2 Hs00954125_m1 13 Bcl2L13 Hs00209787_m1 60 NLRP2 Hs00215284_m1 14 Bcl2L14 Hs00373302_m1 61 NOS2A Hs01075523_m1 15 Bcl2L2 Hs00187848_m1 62 NQO1 Hs00168547_m1 16 BECN1 Hs01011599_m1 63 Oas1 Hs00973635_m1 17 BIK Hs00154189_m1 64 P2RY13 Hs01090437_g1 18 BIRC2 Hs01112284_m1 65 PARP1 Hs00242302_m1 19 BLM Hs00172060_m1 66 PLA2G6 Hs00185926_m1 20 BMF Hs00372937_m1 67 PPP1R15A Hs00169585_m1 21 BNIP3 Hs00969289_m1 68 PRDX1 Hs00602020_mH 22 BRCA1 Hs01556185_m1 69 PVR Hs00197846_m1 23 CDKN1B Hs00153277_m1 70 RAD51 Hs00947968_m1 Material und Methoden 25 24 CFLAR Hs01116281_m1 71 RIPK1 Hs00169407_m1 25 CHEK1 Hs00967506_m1 72 RPA1 Hs00161419_m1 26 Cyr61 Hs00155479_m1 73 RPRM Hs04189060_s1 27 DDB2 Hs03044953_m1 74 RRM2B Hs00968430_m1 28 DDIT3 Hs01090850_m1 75 Senp2 Hs00989699_m1 29 DNAJC3 Hs00534489_m1 76 SESN1 Hs00902787_m1 30 DUSP1 Hs00610256_g1 77 SFN Hs00968567_s1 31 EDEM1 Hs00976004_m1 78 SHISA5 Hs00429977_m1 32 EDEM2 Hs01076556_m1 79 SIRT1 Hs01009005_m1 33 EGR1 Hs00152928_m1 80 SOD1 Hs00916176_m1 34 EPHB1 Hs00174725_m1 81 SOD2 Hs00167309_m1 35 ETS1 Hs00428293_m1 82 SQSTM1 Hs00177654_m1 36 FANCA Hs01116661_m1 83 SUMO1 Hs02339311_g1 37 FANCD2 Hs00395700_m1 84 TBP Hs00427620_m1 38 FANCG Hs00184947_m1 85 TRAF1 Hs01090169_m1 39 FANCM Hs00326216_m1 86 TRAF2 Hs00184192_m1 40 FEN1 Hs01099393_g1 87 TXN Hs00828652_m1 41 FOSL1 Hs04187685_m1 88 XBP1(S) Hs03929085_g1 42 FTH1 Hs01000476_g1 89 XBP1(U) Hs02856596_m1 43 GRB2 Hs01074929_m1 90 XIAP Hs00745222_s1 44 GSTP1 Hs00168310_m1 91 XPC Hs01104213_m1 45 HIF1A Hs00153153_m1 92 XRCC1 Hs00959834_m1 46 HMOX1 Hs01110250_m1 93 XRCC3 Hs00193725_m1 47 HRK Hs01388767_g1 94 Zfp36 Hs00185658_m1 Anschließend wurde jede cDNA mit einem Anteil der vereinigten TaqMan ® Gene Expression Assays und mit einem Anteil TaqMan PreAmp Master Mix (2x) versetzt. Folgendes PCR-Programm wurde für die Amplifikationsreaktion verwendet: 10 min bei 95°C 14 Zyklen: 15 sec 95°C 4 min 60°C Abschließend wurde die Genexpressionsanalyse mittels BioMarkTM-HD-System nach Anleitung des Herstellers ausgeführt. Die Auswertung der Daten erfolgte, indem zunächst die ΔΔCt-Werte aus Kontrolle und Behandlung berechnet wurden. Als Referenzgen wurde das TATA box binding 26 Material und Methoden protein (TBP) verwendet. Anschließend Genespring-12.5-GX-PA-Software wurde durchgeführt, eine Clusteranalyse wobei das mittels Euklidische Ähnlichkeitsmaß verwendet wurde, welches mit einem Complete-Linkage-Verfahren kombiniert wurde. 20x TaqMan® Gene Expression Assays ® TaqMan PreAmp Master Mix (2x) Applied Biosystems, USA Applied Biosystems, USA 2x Assay Loading Reagent Fluidigm, USA 20x GE Sample Loading Reagent Fluidigm, USA ® TaqMan Universal PCR Master Mix (2x) TM 48.48 Dynamic Array Applied Biosystems, USA IFC Fluidigm, USA 96.96 Dynamic ArrayTM IFC Fluidigm, USA IFC Controller MX Fluidigm, USA IFC Controller HX Fluidigm, USA BioMarkTM-HD-System Fluidigm, USA Genespring 12.5-GX-PA Software Agilent Technologies, USA 2.6 Microarrayanalyse Zur Bestimmung der globalen Genexpression wurde eine Microarrayanalyse mittels GeneChip® Human Gene 2.0 ST Arrays durchgeführt. In drei unabhängigen Experimenten wurden dafür OVCAR5 Zellen für 8 h Stunden mit RITA behandelt und anschließend die RNA isoliert. Die Integrität der RNA wurde mittels RNA 6000 Nano Kit überprüft. Die darauffolgende Durchführung des Microarrays erfolgte nach Angaben des Herstellers. Für die Datenauswertung wurden die Signalintensitäten mit Hilfe der Genespring 12.5-GX-PA-Software RMA normalisiert. Signifikante Unterschiede wurden mittels gepaartem t-Test bestimmt und eine Signalwegsanalyse durchgeführt. Material und Methoden 27 RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies, USA 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, USA GeneChip® Human Gene 2.0 ST Array (6 Arrays) WT Expression Kit (10 reactions) Affymetrix, USA Ambion, USA WT Terminal Labeling and Controls Kit (10 reactions) Affymetrix, USA GeneChip® Hybridization Wash and Stain Kit (30 reactions) Affymetrix, USA GeneChip® Fluidics Station 450Dx Affymetrix, USA ® Affymetrix, USA ® GeneChip Hybridization Oven 645 Affymetrix, USA GeneChip® Command Console® Software (AGCC) Affymetrix, USA GeneChip Scanner 2.7 Bestimmung des p53-Status der Zelllinien durch Sequenzierung Für die Sequenzierung der TP53-Exons 4, 5, 6, 7, 8, 8-9 und 10 wurde zunächst aus synthetisierter cDNA das TP53 Gen amplifiziert. Folgendes Primerpaar wurde dafür verwendet: p53 – sense: 5’- GTG ACA CGC TTC CCT GGA T -3’ p53 – antisense: 5’- CCA CAA CAA AAC ACC AGT GC -3’ Nach der elektrophoretischen Separation wurde das PCR-Fragment mittels QIAquick Gel Extraction Kit aufgereinigt. Die Didesoxysequenzierreaktion erfolgte mit dem BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Beide Kits wurden nach Angaben des Herstellers verwendet. Folgendes PCR Programm wurde hierfür verwendet: 2 min bei 95°C 40 Zyklen: 30 sec bei 94°C 30 sec bei 60°C 30 sec bei 72 °C 10 min bei 72°C Anschließend erfolgte die Aufreinigung der Sequenzierreaktion mit Hilfe des BigDye®XTerminatorTM Purification Kit nach Angaben des Herstellers. 28 Material und Methoden Die Generierung der Daten erfolgte mittels 3500Dx-Genetic-Anaylzer und der GeneMapper-v4.1-Software. Abschließend erfolgte die Analyse der Sequenz durch die Software Chromas Lite 2.01. QIAquick Gel Extraction Kit Quiagen, Hilden ® Applied Biosystems, USA ® BigDye XTerminatorTM Purification Kit Applied Biosystems, USA 3500Dx Genetic Anaylzer Applied Biosystems, USA GeneMapper v4.1 Software Applied Biosystems, USA BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Chromas Lite 2.01 Technelysium Pty. Ltd., Australien 2.8 RNA Interferenz Um den Einfluss einzelner Faktoren auf die Induktion von Zelltod nach Cisplatinoder RITA-Behandlung zu untersuchen, wurden die Zellen liposomal mit siRNAs transfiziert. Dafür wurden die Zellen zunächst in geringer Dichte ausgesät. Eine Mischung aus vier siRNAs gegen ein Zielgen wurde anschließend in einem bestimmten Verhältnis, optimiert für jede Zelllinie, in Opti-MEM I Reduced Serum Medium verdünnt. Die Zelllinien OVCAR3, -4, -5 wurden mit einer siRNAEndkonzentration von 20 nM, NTERA-2D1 mit einer Endkonzentration von 15 nM transfiziert. Die verwendeten siRNAs sowie deren Sequenzen sind in Tabelle 2.4 aufgeführt. Material und Methoden 29 Tabelle 2.4: Sequenzen der verwendeten siRNAs Genname TP53 TP63 TP73 BAX BAK BID BAD PMAIP1 (NOXA) BBC3 (PUMA) ATF3 FOS JUN MAPK8 (JNK1) Gensequenz GAGGUUGGCUCUGACUGUA GCACAGAGGAAGAGAAUCU GAAGAAACCACUGGAUGGA GCUUCGAGAUGUUCCGAGA CAUCAUGUCUGGACUAUUU CAAACAAGAUUGAGAUUAG GCACACAGACAAAUGAAUU CGACAGUCUUGUACAAUUU GCAAGCAGCCCAUCAAGGA GAGACGAGGACAAGUACUA CUGCAGAACCUGACCAUUG GGCCAUGCCUGUUUACAAG ACAUGUUUUCUGACGGCAA CAUUGGACUUCCUCCGGGA CUGAGCAGAUCAUGAAGAC GAACUGAUCAGAACCAUCA CAACCGACGCUAUGACUCA GCUUCGUGGUCGACUUCAU CGACAUCAACCGACGCUAU CAGAGAAUGCCUAUGAGUA GCACCUACGUGAGGAGCUU GCCAGAAGCUACUGCGAUG GAGUAAGGGCACUGACGGA UGCAAUACAUACCACGCUA GCAACGCAGAUGCGGCAAA CAGAGUUUGAGCCGAGUGA GUGACGAGUUUGUGGACUC GUUCCAGAUCCCAGAGUUU GCAAGAACGCUCAACCGAG CUGGAAGUCGAGUGUGCUA AAUCUGAUAUCCAAACUCU AAACUGAACUUCCGGCAGA CGGACGACCUCAACGCACA CCGAGAUGGAGCCCAAUUA CCUGGAGGGUCCUGUACAA GGCGGAGACAAGAGGAGCA GCGACGAGAAAGAAAUAAG AGACGGAGUGCCUGCAGAA CACUGGUGUUUGAGGAUUU GGUUUGCCAUCCAGAACAA GGGAUAGCCUCUCUUACUA GAACAGUUAUCUCCAGAAG GGAGACAGACCAACUAGAA AGACCGAGCCCUUUGAUGA UGGAAACGACCUUCUAUGA UAACGCAGCAGUUGCAAAC GAGCGGACCUUAUGGCUAC AAGUCAUGAACCACGUUAA AGGAAUAGUAUGCGCAGCU ACAGAGAGCUAGUUCUUAU GAACCAAGAAUGGAGUUAU GAUGACGCCUUAUGUAGUG Bcl-w unbekannte Sequenz BIM unbekannte Sequenz control siRNA UAGCGACUAAACACAUCAA Mit Ausnahme der siRNAs von BIM und Bcl-w, welche von Santa Cruz verwendet wurden, wurden sämtliche anderen siRNAs von Dharmacon bezogen. Zudem wurden die siRNAs von BIM und Bcl-w in einer Endkonzentration von 30 nM eingesetzt. 30 Material und Methoden Als liposomales Transfektionsreagenz wurde für die Zelllinien OVCAR3, -4, und -5, DharmaFECT1 verwendet. NTERA-2D1 Zellen wurden mit DharmaFECT3 transfiziert. Das Transfektionsreagenz wurde im Verhältnis 1:25 mit Opti-MEM I Reduced Serum Medium verdünnt. Nach der Inkubation (5 min, RT) wurden die verdünnten siRNAs im Verhätnis 1:1 mit verdünntem DharmaFECT versetzt. Nach einer weiteren Inkubationszeit (20 min, RT) wurde die Transfektionslösung im Verhältnis 1:10 mit Zellkulturmedium verdünnt. Anschließend erfolgte eine sechsstündige Inkubation der Zellen mit Transfektionslösung, an welche ein Mediumwechsel folgte. Um eine effiziente Reduktion des relevanten Proteins zu erreichen, wurden sämtliche Experimente 48h nach der Transfektion durchgeführt. Im Falle von p63 wurde zudem eine Transfektion mit ON-TARGETplus siRNAs ausgeführt. Diese speziell modifizierten siRNAs besitzen eine geringere off-target Aktivität. Die Sequenzen dieser siRNAs sind in Tabelle 2.5 aufgelistet. Tabelle 2.5: Sequenzen der p63 ON-TARGETplus siRNAs Genname ON-TARGETplus Set of 4 Upgrade sip63 J-003330-12 ON-TARGETplus Set of 4 Upgrade sip63 J-003330-13 ON-TARGETplus Set of 4 Upgrade sip63 J-003330-14 ON-TARGETplus Set of 4 Upgrade sip63 J-003330-15 Gensequenz UCUAUCAGAUUGAGCAUUA GCACACAGACAAAUGAAUU CGACAGUCUUGUACAAUUU GAUGAACUGUUAUACUUAC Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco, Karlsruhe DharmaFECT1 Dharmacon, UK DharmaFECT3 Dharmacon, UK Material und Methoden 31 2.9 Proteinanalyse 2.9.1 Herstellung eines Gesamtproteinlysats Zur Proteinextraktion wurden die adhärenten Zellen trypsiniert und pelletiert (4°C, 1400 rpm, 5 min). Die Zellpellets wurden mit 1 ml kaltem 1xPBS gewaschen, der Überstand abgesaugt und die Zellpellets in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Das gefrorene Pellet wurde in Lysepuffer (50 mM Tris, 250 mM NaCl, 0,1% Triton X100, 5 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert und sowohl Protease- als auch Phosphataseinhibitoren zugesetzt. Für einen vollständigen Zellaufschluss wurden die Zellpellets sonifiziert (50 Zyklen, 20 sec) und anschließend abzentrifugiert (4°C, 13000 rpm, 15 min). Die Überstände wurden zur Proteinbestimmung verwendet und das Pellet verworfen. Die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des Bradford-Assays durchgeführt, um im weiteren Versuchsverlauf identische Proteinmengen einsetzen zu können. Dafür wurden jeweils 800 µl H2O, 200 µl Bradfordreagenz und 1 µl Probenüberstand vermischt. Zur Erstellung einer Standardkurve wurde eine BSA-Verdünnungsreihe angefertigt. Die optischen Dichten der Ansätze wurden anschließend am Photometer bei 595 nm gemessen. Identische Probenmengen wurden daraufhin mit 1xLämmli-Puffer (62,5 mM Tris/HCl, 20% (v/v), Glycerol, 5% (v/v) β-Mercaptoethanol, 2% (w/v) SDS, 1% Bromphenolblau, pH 6,8) versetzt und für 5 min bei 95°C aufgekocht. TRIS EDTA Triton X-100 NaCl PhosphoSTOP (phosphatase Roth, Karlsruhe Sigma-Aldrich, Steinheim Fluka Chemie AG, Buchs (CH) Merck, Darmstadt Roche, Mannheim inhibitor cocktail tablets) protease inhibitor cocktail tablets Ultraschall Homogenisator Sonopuls HD200 Roche, Mannheim Bandelin Elektronik, Berlin MS72 Mikrospitze aus Titan advanced protein assay reagent (5x) Cytoskeleton Inc., USA BSA Sigma-Aldrich, Steinheim Novaspec II Visible Spectrophotometer GE Healthcare, München Glycerol Bromphenolblau Meck, Darmstadt Sigma-Aldrich, Steinheim 32 Material und Methoden 2.9.2 SDS-Page zur Auftrennung der Proteine Die Auftrennung der Proteine erfolgte bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nach Molekulargewicht. Für die Gelelektrophorese wurden Gele bestehend aus Acrylamid, 1,5 mM Tris-Puffer pH 8,8 und SDS hergestellt. Durch unterschiedliche Acrylamidkonzentrationen wurde die Dichte der Gele variiert. Hochprozentige Acrylamidgele wurden verwendet um Proteine mit niedrigem Molekulargewicht zu trennen. Proteine mit hohem Molekulargewicht wurden mit Gelen niedriger Acrylamidkonzentration getrennt. Sehr kleine Proteine mit einem Molekulargewicht <10 kDa wurden mit Hilfe von Gradientengelen (5-20% Acrylamid) separiert. Nach der Polymerisierung des Gels wurde neben den Proben weiterhin ein Marker zur Größenidentifikation der Proteine aufgetragen. Die Proteinauftrennung erfolgte in Elektrophoresekammern, welche mit Elektrophoresepuffer (25 mM Tris-Base, 0,2 M Glycin, 1% SDS) gefüllt wurden. Die Elektrophorese wurde bei konstanten 6 mA über Nacht durchgeführt. Ammoniumpersulfat (APS) TEMED Bio-Rad, München Roth, Karlsruhe 30% Acrylamid/Bis-Lösung (37, 5:1) Bio-Rad, München Vertikal-Elektrophoresekammer, Protean® II xi Cell‘ Bio-Rad, München Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) Cell Signaling, USA 2.9.3 Western-Blot Die Übertragung der mit Hilfe der SDS-Page aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran erfolgte durch eine Trans-Blot®-Semi-Dry-Transferkammer. Auf diese wurden drei Lagen Filterpapier gelegt und anschließend die in Transferpuffer (0,025 M Tris-HCl, 0,192 M Glycin, 20% (v/v) Methanol, 1% (w/v) SDS) vorinkubierte Membran sowie das Acrylamidgel luftblasenfrei aufgebracht. Auf das Acrylamidgel wurden wiederum drei Lagen Filterpapier aufgelegt. Der Blot erfolgte bei konstanten 15 V für 1,5 h. Anschließend wurde die Membran kurz in 1xTBST (400 g NaCl, 10 g KCl, 150 g Tris-Base, pH 7,4; ad. 5000 ml Aqua dest.) gewaschen und danach für 1 h in 5% Magermilch gelegt. Durch die Inkubation der Membran in Magermilch wird die Bindung der später eingesetzten Antikörper an unspezifische Bindestellen unterbunden. Nach der Inkubationszeit folgten drei weitere Waschschritte in TBST, an deren Anschluss die Behandlung der Membran Material und Methoden 33 mit dem Primärantikörper erfolgte. Der jeweilige Primärantikörper (siehe Tabelle 2.6) wurde nach Angaben des Herstellers entweder in 5% (w/v) BSA in 1xTBST, Western Blocking Reagent (1:20 in 1xTBS) oder 5%iger Magermilch verwendet und bei 4°C über Nacht inkubiert. Tabelle 2.6: Eingesetzte Primärantikörper Antikörper Spezies Firma Verdünnung ATF3 Kaninchen Santa Cruz, USA 1:500 BAD Kaninchen Cell Signaling, USA 1:500 BAK Kaninchen Cell Signaling, USA 1:500 BAX Kaninchen Cell Signaling, USA 1:1000 Bcl-2 Kaninchen Cell Signaling, USA 1:1000 Bcl-xL Kaninchen Cell Signaling, USA 1:1000 BID Kaninchen Cell Signaling, USA 1:1000 BIM Kaninchen Cell Signaling, USA 1:500 Bcl-w Kaninchen Cell Signaling, USA 1:500 JNK1 Maus Cell Signaling, USA 1:1000 p-c-Jun (Ser73) Kaninchen Upstate, USA 1:1000 Mcl-1 Kaninchen Cell Signaling, USA 1:500 NOXA Maus Calbiochem, USA 1:500 Maus Santa Cruz, USA 1:4000 p63 (4A4) Maus Santa Cruz, USA p73 Kaninchen Abcam, UK 1:1000 PUMA Kaninchen Cell Signaling, USA 1:500 p53 (DO-1 und Pab181) Nach der Inkubation wurde die Membran vier mal 15 min in 1xTBST gewaschen und anschließend mit einem Peroxidase (POD)-gekoppelten Sekundärantikörper (siehe Tabelle 2.7) behandelt. Die Inkubation mit dem Sekundärantikörper erfolgte bei RT für 1 h. 34 Material und Methoden Tabelle 2.7: Eingesetzte konjugierte Sekundärantikörper Antikörper Spezies Firma Verdünnung anti-KaninchenIgG-HRP anti-Maus-IgG-HRP Ziege Cell Signaling, USA 1:2000 Ziege Cell Signaling, USA 1:2000 Anschließend wurde erneut vier mal 15 min mit 1xTBST gewaschen. Die Detektion der gebundenen Antikörper erfolgte über eine Chemilumineszenz-Reaktion, bei der das „SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate“ nach Anleitung des Herstellers verwendet wurde. Das Signal wurde detektiert, indem die Membran gegen einen speziellen Röntgenfilm exponiert wurde, dessen anschließende Entwicklung die Signale erkennbar machte. Die densitometrische Auswertung erfolgte über die Software AIDA (advanced image data analyzer), Version 2.31. Um die Beladung des Gels überprüfen zu können, wurde die Membran von den Primär- und Sekundärantikörpern befreit, indem eine Behandlung mit SDS-β-Mercaptoethanol-Stripping-Lösung bei 52°C für 20 min (62,5 mM Tris-HCl, 2% (w/v) SDS, 100 mM β-Mercaptoethanol; pH 6,7) durchgeführt wurde. Anschließend wurde erneut mit 1xTBST gewaschen und mit 5% Magermilch geblockt. Die Membran konnte nun mit den Primärantikörper, welcher das Haushaltsgen GAPDH (Glycerinalgehyd 3-phosphat Dehydrogenase) detektiert, inkubiert werden. Abschließend erfolgte die Inkubation mit dem Sekundärantikörper (Tabelle 2.8). Tabelle 2.8: Primar- und Sekundärantikörper zur Detektion von GAPDH Antikörper Spezies Firma Verdünnung GAPDH Kaninchen Cell Signaling, USA 1:5000 anti-KaninchenIgG-HRP Ziege Cell Signaling, USA 1:2000 Material und Methoden 35 Magermilchpulver Fluka, Buchs (CH) KCl Merck, Darmstadt Methanol Merck, Darmstadt PVDF Membran Trans-Blot® Semi-Dry Transfer Cell Filterpapier ‚Gel-Blotting Papier‘ ‚Western Blocking Reagent‘ Autoradiographie Kassette ‚Lumi-Film‘, Chemiluminescent Boehringer Mannheim, Mannheim Bio-Rad, München Schleicher & Schuell, Dassel Roche, Mannheim Amersham Biosciences, Freiburg Roche, Mannheim Detection Film ‚SuperSignal® West Dura Extended Pierce Biotechnology, USA Duration Substrate‘ ‚LAS-1000‘, Luminescent imager Medical Systems, USA Analyzer with Fujifilm electronically cooled CCD camera System Advanced image data analyzer Raytest, Straubenhardt (AIDA 2.31) Entwicklungsmaschine, Curix60 AGFA, Düsseldorf 36 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Charakterisierung einer Zelllinienauswahl 3.1.1 Bestimmung des p53-Status Für diese Arbeit wurde eine Gruppe von Zelllinien aus verschiedenen Entitäten (embryonales Hodenkarzinom, Bronchialkarzinom, Ovarialkarzinom) ausgewählt und zunächst hinsichtlich ihres p53-Status charakterisiert (Tabelle 3.1). Tabelle 3.1: p53-Status der Zelllinienauswahl Zelllinie Entität p53-Status NTERA-2D1 embryonales Hodenkarzinom wt 2102EP embryonales Hodenkarzinom wt A549 Bronchialkarzinom wt H460 Bronchialkarzinom wt H23 Bronchialkarzinom M246I (heterozygot) Calu-1 Bronchialkarzinom Deletion (p53-null, STOPP-Codon) A2780 Ovarialkarzinom wt IGROV1 Ovarialkarzinom Y126C (heterozygot) OVCAR3 Ovarialkarzinom R248Q OVCAR4 Ovarialkarzinom L130V OVCAR5 Ovarialkarzinom Insertion (p53-null, STOPP-Codon) OVCAR8 Ovarialkarzinom Deletion SKOV3 Ovarialkarzinom Deletion (p53-null, STOPP-Codon) TOV-112D Ovarialkarzinom R175H Dabei konnte in 5 Zelllinien wtp53, in 6 Zelllinien mtp53 und in 4 Zelllinien der p53-null-Status festgestellt werden. Neben den Zelllinien wurden für die nachfolgenden Untersuchungen zudem Tumor-assoziierte Fibroblasten aus der humanen Lunge, welche charakteristischerweise p53 in der Wildtyp-Form aufweisen (Schmid et al., 2012; Qiu et al., 2008) und PBMNCs von gesunden Probanden verwendet. Ergebnisse 37 3.1.2 Induktion von Zelltod und Zellzyklusarrest nach Nutlin-3, RITA und Cisplatin Der Einfluss der p53-Aktivatoren Nutlin-3, RITA und Cisplatin auf den Zelltod und den Zellzyklusarrest wurde in Abhängigkeit des p53-Status mit Hilfe der zuvor beschriebenen Zellauswahl untersucht (Abbildung 3.1). 38 Ergebnisse Abbildung 3.1: Induktion von Zelltod und Zellzyklusarrest 48h nach (A) Nutlin-3-, (B) RITAund (C) Cisplatin-Behandlung. wtp53 exprimierende Zellen sind in schwarz, mtp53 exprimierende Zellen in blau und p53-null Zellen in grau dargestellt. Zellen mit heterozygotem Phänotyp sind durch ein blau-schwarzes Muster gekennzeichnet. 1. Zeile: Im Gegensatz zu Nutlin-3 konnte nach RITA und Cisplatin-Behandlung Zelltod auch in p53 mutierten oder im Falle von RITA auch in p53-null Zellen, nachgewiesen werden. Die Messung des Zelltods erfolgte durch eine AnnexinV-FITC/PI-Färbung-Färbung am Durchflusszytometer. Dargestellt wurde die prozentuale Induktion AnnexinV-FITC/PIFärbung positiver Zellen nach Behandlung. Die Werte entsprechen den Mittelwerten aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. 2.-5. Zeile: Im Gegensatz zu dem Nutlin-3 induzierten G1Arrest in wtp53-Zellen wurde durch RITA kein Zellzyklusarrest, durch Cisplatin ein SPhasenarrest unabhängig vom p53-Status induziert. Die Zellzyklusmessung erfolgte durch einen Behandlungspuls mit BrdU und einer Färbung mit anti-BrdU-Antikörper sowie PI am Durchflusszytometer. Dargestellt sind die prozentualen Unterschiede in SubG1-, G1-, S- und G2-Phase nach Behandlung. Die Werte entsprechen den Mittelwerten aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Übereinstimmend mit vorangegangenen Studien (Tovar et al., 2006) führte die Behandlung mit Nutlin-3 ausschließlich in Zellen mit wtp53 zu einer Reaktion. Zelltod wurde in der embryonalen Hodenkarzinomlinie NTERA-2D1 und der Bronchialkarzinomlinie H460 ausgelöst (Abbildung 3.1 A, 1. Grafik). Für die Zelllinie NTERA-2D1 konnte kürzlich eine besondere Sensitivität gegenüber der Aktivierung von p53 nachgewiesen werden (Gutekunst et al., 2011). Auf Ebene des Zellzyklus führte Nutlin-3 zu einem G1-Arrest, welcher in allen wtp53-exprimierenden Zelllinien, außer der hypersensitiven NTERA-2D1 Linie auftrat (Abbildung 3.1 A, 2.-5. Grafik). Zudem konnte ein G1-Arrest sowohl in Fibroblasten als auch in PBMNCs nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu konnte durch die Behandlung mit RITA keine Veränderung im aktiven Zellzyklus festgestellt werden (Abbildung 3.1 B, 3.-5. Grafik). Jedoch wurde durch RITA in 7 von 11 Tumorzelllinien Zelltod induziert (Abbildung 3.1 B, 1. und 2. Grafik). Auffallend dabei war die Induktion von Zelltod nicht nur in wtp53 und mtp53-Zellen, sondern auch in der p53-null-Linie OVCAR5. Zudem konnte festgestellt werden, dass die Zellen klar in zwei Gruppen hinsichtlich ihrer Sensitivität trennbar waren; sensitive Zellen mit einer Induktion von Zelltod von mehr als 60% nach 48 h und wenig sensitive Zellen mit einer Induktion von weniger als 15% Zelltod nach 48 h. Beachtenswert ist hierbei der insensitive Phänotyp von Fibroblasten und PBMNCs. Im Falle von Cisplatin konnte ein kontinuierliches Spektrum an Sensitivitäten innerhalb der Zelllinienauswahl festgestellt werden (Abbildung 3.1 C, 1. Graphik). Dabei wurde Zelltod sowohl in Zellen mit wtp53 als auch in Zellen mit mtp53 induziert. Gemäß früheren Studien (Bugarcić et al., 2008) zeigten auch PBMNCs von gesunden Probanden eine hohe Sensitivität gegenüber Cisplatin. Auf Ergebnisse 39 Zellzyklusebene konnte ein S-Phasenarrest beobachtet werden, welcher unabhängig vom p53-Status und unabhängig von der Sensitivität der Zellen gegenüber Cisplatin induziert wurde (Abbildung 3.1 C 2.-5. Grafik). Somit kommt es innerhalb der Zelllinienauswahl zu unterschiedlichen Reaktionen auf die Substanzen (Tabelle 3.2). Tabelle 3.2: Zelllinien welche eine Reaktion gegenüber Nutlin-3, RITA oder Cisplatin zeigen Reaktion auf Nutlin-3: Zelllinie Induktion G1-Arrest, bzw. Hypersensitivität NTERA-2D1 + (hypersensitiv) Reaktion auf RITA: Zelltod Reaktion auf Cisplatin: Zelltod + + 2102EP + + + A549 + - - H460 + + + H23 - - + Calu-1 - - - A2780 + - - IGROV1 + + - OVCAR3 - + + OVCAR4 - + + OVCAR5 - + - OVCAR8 - - - SKOV3 - - - TOV-112D - - + PBMNC + - + Fibroblasten + - - Zusammenfassend konnte ein selektiver Effekt auf wtp53 exprimierende Zellen nach Nutlin-3-Behandlungen nachgewiesen werden. Im Falle einer Behandlung mit Cisplatin oder RITA traten auch Effekte in mtp53-Zellen, im Falle von RITA sogar in p53-null Zellen auf. 40 Ergebnisse 3.1.3 Induktion von p53-Zielgenen durch Nutlin-3, RITA und Cisplatin Um die Aktivität von p53 als Transkriptionsfaktor näher zu untersuchen, wurde die Expression von 45 bona fide p53-Zielgenen (Tabelle 2.2) in einem Hochdurchsatzverfahren gemessen (Riley et al., 2008; Wei et al., 2006). Die Behandlung mit Nutlin-3 führte zu einer Regulation von Zielgenen vorwiegend in Zellen mit wtp53, weshalb das Clusterverfahren eine Gruppierung hinsichtlich des p53-Status ergab (Abbildung 3.2). Abbildung 3.2: Induktion von bona fide p53-Zielgenen, insbesondere in Zellen mit wtp53. Für die Genexpressionsanalyse wurden die Zellen 8 h mit und ohne Nutlin-3 inkubiert, die RNA isoliert, cDNA synthetisiert und eine spezifische Anreicherung der Zielgene durchgeführt. Die Messung erfolgte mit Hilfe des BioMark TM-HD-Systems. Nach der Berechnung der ΔΔCt-Werte wurde eine Clusteranalyse nach Euklidischem Gleichheitsmaß mit anschließendem Complete-Linkage-Verfahren durchgeführt. Die Clusterbildung erfolgte sowohl hinsichtlich der Zellen als auch hinsichtlich der Gene. Der Farbverlauf beschreibt die Mittelwerte der log2 ΔΔCt-Werte aus drei unabhängigen Experimenten. Ergebnisse 41 Die nähere Betrachtung der zwei Gruppen ergab 19 Gene, welche selektiv in Zellen mit wtp53 reguliert wurden (Benjamini-Hochberg korrigierter gepaarter t-Test p<0,05, FC>2; Tabelle 3.3). Tabelle 3.3: Signifikant regulierte p53-Zielgene nach Behandlung mit Nutlin-3 Hochregulierte Gene nach Nutlin-3-Behandlung (p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2) Cluster wtp53 Genname FC CDKN1A 10.209 BTG2 9.81 TNFRSF10C 7.02 TP53INP1 6.78 PUMA (BBC3) 6.45 TP53i3 5.77 GADD45A 4.61 FAS (CD95) 4.54 ZMAT3 3.85 LRDD 3.58 TNFRSF10A 3.29 TNFRSF10B 3.26 TNFRSF10D 2.94 ATF3 2.94 IER3 2.88 Mdm2 2.59 PMAIP1 2.33 CGNG1 2.29 BAX 2.18 Cluster mtp53 p-Wert 4.63E-07 2.17E-06 9.64E-05 1.53E-05 3.94E-05 0.000935 3.08E-05 2.53E-05 6.20E-05 5.42E-06 0.000148 8.61E-06 0.000111 0.000148 0.000153 4.05E-08 0.000212 2.14E-05 0.000131 Beachtenswert hierbei war die ausschließliche Hochregulation von Genen in Zellen mit wtp53. Signifikant herunterregulierte Gene konnten nicht identifiziert werden. Ebenso konnte in der Gruppe der Zellen mit mtp53 kein signifikant reguliertes Gen ermittelt werden. Übereinstimmend mit vorangegangenen Studien (Enge et al., 2009; Tovar et al., 2006) und der vorwiegenden Induktion eines G1-Arrests in Zellen mit wtp53 wurden durch Nutlin-3 überwiegend zellzyklusassoziierte Gene reguliert. Im Gegensatz hierzu konnte nach RITA-Behandlung eine differentielle Regulation von p53-Zielgenen vornehmlich in RITA-sensitiven Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 3.3). 42 Ergebnisse Abbildung 3.3: Regulation von bona fide p53-Zielgenen, insbesondere in RITA-sensitiven Zellen. Für die Genexpressionsanalyse wurden die Zellen 8 h mit und ohne RITA inkubiert, die RNA isoliert, cDNA synthetisiert und eine spezifische Anreicherung der Zielgene durchgeführt. Die Messung erfolgte mit Hilfe des BioMarkTM-HD-Systems. Nach der Berechnung der ΔΔCt-Werte wurde eine Clusteranalyse nach Euklidischem Gleichheitsmaß mit anschließendem Complete-Linkage-Verfahren durchgeführt. Die Clusterbildung erfolgte sowohl hinsichtlich der Zellen als auch hinsichtlich der Gene. Der Farbverlauf beschreibt die Mittelwerte der log2 ΔΔCt-Werte aus drei unabhängigen Experimenten. Statistische Untersuchungen ergaben 10 hochregulierte und 3 herunterregulierte Gene in der Gruppe der RITA-sensitiven Zellen (Benjamini-Hochberg korrigierter gepaarter t-Test p<0,05, FC>2; Tabelle 3.4). Ergebnisse 43 Tabelle 3.4: Signifikant regulierte p53-Zielgene nach Behandlung mit RITA; Gruppierung nach Sensitivität Hochregulierte Gene nach RITA-Behandlung (p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2) Cluster RITA sensitiv Genname FC p-Wert ATF3 11.94 7.23E-05 Fos 5.89 0.001036 PMAIP1 5.28 4.85E-05 GADD45A 4.48 0.000194 BTG2 3.48 0.005894 CDKN1A 3.42 0.001063 IER3 2.99 0.001798 PUMA (BBC3) 2.87 0.041790 TNFRSF10D 2.27 0.000470 TNFRSF10C 2.18 0.004000 Cluster RITA insensitiv Genname FC p-Wert ATF3 2.09 0.003002 Herunterregulierte Gene nach RITA-Behandlung (p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2) Cluster RITA sensitiv Genname FC p-Wert Bcl-2 2.67 0.000927 APAF1 2.28 0.000683 TP63 2.22 0.026636 Cluster RITA insensitiv In Zellen mit einem geringen Ansprechen auf RITA konnte nur 1 Gen (ATF3) identifiziert werden, welches durch RITA reguliert wurde. Dies wurde im Vergleich zu RITA-sensitiven Zellen jedoch deutlich geringer induziert. Grundsätzlich führte die Behandlung mit RITA zu einer vorwiegenden Regulation pro-apoptotischer Gene. Weiterhin ist zu beachten, dass sowohl Fibroblasten als auch PBMNCs in die Gruppe der RITA-insensitiven Zellen einzuordnen waren und demnach nur eine geringe Regulation der p53-Zielgene aufwiesen. Da RITA klassischerweise als p53-Aktivator gilt (Issaeva et al., 2004), wurde im Weiteren eine Gruppierung der Zellen hinsichtlich des p53-Status vorgenommen und eine statistische Analyse durchgeführt (Benjamini-Hochberg korrigierter gepaarter tTest p<0,05, FC>2; Tabelle 3.5). 44 Ergebnisse Tabelle 3.5: Signifikant regulierte p53-Zielgene nach Behandlung mit RITA; Gruppierung nach p53-Status Hochregulierte Gene nach RITA-Behandlung (p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2) wtp53 FC 3.10587 2.28310 Genname GADD45α PMAIP1 p-Wert 0.038970 0.026160 Genname ATF3 PMAIP GADD45α mtp53 FC 5.20536 3.03143 2.39495 p-Wert 0.001266 0.004366 0.000862 Im Vergleich zur Gruppierung nach der Sensitivität führte die Gruppierung nach p53Status zu einer deutlich geringeren Anzahl an regulierten Genen (Tabelle 3.5). In wtp53-Zellen wurden 2 Gene, in Zellen mit mtp53 3 Gene hochreguliert. Eine Herunterregulation von Genen konnte nicht beobachtet werden. Dies lässt auf p53 unabhängige Effekte von RITA schießen. Im Vergleich zu Nutlin-3 und RITA wurde auch die differentielle Regulation der 45 bona fide p53-Zielgene (Abbildung 3.4). nach einer Behandlung mit Cisplatin untersucht Ergebnisse 45 Abbildung 3.4: Regulation von bona fide p53-Zielgenen, insbesondere in Zellen mit wtp53 nachzuweisen. Jedoch sind auch differentielle Effekte im mtp53-System zu beobachten. Für die Genexpressionsanalyse wurden die Zellen 8 h mit und ohne Cisplatin inkubiert, die RNA isoliert, cDNA synthetisiert und eine spezifische Anreicherung der Zielgene durchgeführt. Die Messung erfolgte mit Hilfe des BioMarkTM-HD-Systems. Nach der Berechnung der ΔΔCtWerte wurde eine Clusteranalyse nach Euklidischem Gleichheitsmaß mit anschließendem Complete-Linkage-Verfahren durchgeführt. Die Clusterbildung erfolgte sowohl hinsichtlich der Zellen als auch hinsichtlich der Gene. Der Farbverlauf beschreibt die Mittelwerte der log2 ΔΔCt-Werte aus drei unabhängigen Experimenten. Ähnlich der Behandlung mit Nutlin-3 konnte nach der Clusteranalyse eine Gruppierung nach p53-Status festgestellt werden. Im Gegensatz zu einer Behandlung mit Nutlin-3 konnten jedoch auch in Zellen mit mtp53 eine differentielle Expression von p53-Zielgenen nachgewiesen werden (Tabelle 3.6). 46 Ergebnisse Tabelle 3.6: Signifikant regulierte p53-Zielgene nach Behandlung mit Cisplatin; Gruppierung nach p53-Status Hochregulierte Gene nach Cisplatin-Behandlung (p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2) Cluster wtp53 Genname FC BTG2 4.75 CDKN1A 4.14 PUMA (BBC3) 3.99 TP53INP1 3.18 GADD45A 2.84 ATF3 2.60 TNFRSF10C 2.59 IER3 2.39 PMAIP1 2.06 TNFRSF10D 2.05 FAS (CD95) 2.04 p-Wert 0.000527 0.000972 0.000864 0.000864 0.000481 1.77E-05 0.003696 0.009076 0.001510 0.001496 0.005565 Cluster mtp53 Genname FC ATF3 2.65 BTG2 2.31 PMAIP1 2.08 p-Wert 0.005582 0.000968 0.007430 Herunterregulierte Gene nach Cisplatin-Behandlung (p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2) Genname Bcl-2 TP63 In der Cluster wtp53 FC -2.85 -2.08 wtp53-exprimierenden p-Wert 0.002104 0.024143 Gruppe Cluster mtp53 Genname FC Bcl-2 -2.53 TP63 -2.45 wurden 11 hochregulierte p-Wert 0.011143 0.015093 und 2 herunterregulierte Gene identifiziert. Zudem wurden in Zellen mit mtp53 3 Gene hoch- und 2 Gene herunterreguliert. Bemerkenswert hierbei ist, dass alle Gene, welche signifikant in Zellen mit mtp53 reguliert wurden, auch in der Gruppe mit wtp53 auftraten. Da sich im Falle von Cisplatin das Clustering der Zellen von der Sensitivität der Zellen gegenüber Cisplatin unterscheidet, wurde eine weitere statistische Analyse nach einer Gruppierung hinsichtlich der Sensitivität durchgeführt (BenjaminiHochberg korrigierter gepaarter t-Test p<0,05, FC>2; Tabelle 3.7). Ergebnisse 47 Tabelle 3.7: Signifikant regulierte p53-Zielgene nach Behandlung mit Cisplatin; Gruppierung nach Cisplatin-Sensitivität Hochregulierte Gene nach Cisplatin-Behandlung (p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2) Cisplatin sensitiv Genname FC BTG2 3.47 CDKN1A 3.41 ATF3 3.22 GADD45A 2.92 TNFRSF10C 2.77 PUMA (BBC3) 2.73 TP53INP1 2.49 PMAIP1 2.26 TNFRSF10D 2.09 Bcl-2 0.36 p-Wert 0.008151 0.008151 0.003816 0.003816 0.004415 0.039024 0.039024 0.010417 0.004415 0.017155 Cisplatin insensitiv Genname FC p-Wert BTG2 3.19 0.000469 CDKN1A 2.43 0.004010 ATF3 2.23 0.000186 PUMA (BBC3) 2.19 0.007183 Herunterregulierte Gene nach Cisplatin-Behandlung (p-Wert<0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2) Genname TP63 Cisplatin sensitiv FC -2.51 p-Wert 0.010417 Cisplatin insensitiv Genname FC p-Wert Bcl-2 -2.58 0.0015717 Ähnlich wie im Falle der Gruppierung nach p53-Status wurden in der Gruppe der Cisplatin-sensitiven Zellen 10 Gene hoch- und 1 Gen herunterreguliert (Tabele 3.7). Zudem wurden in der Gruppe der Cisplatin-insensitiven Zellen 4 Gene hoch- und 1 Gen herunterreguliert. Somit konnte durch die Analyse von 45 bona fide p53-Zielgenen ein selektiver Effekt von Nutlin-3 auf wtp53 exprimierende Zellen nachgewiesen werden. Eine Behandlung mit Cisplatin führte auf transkriptioneller Ebene vorwiegend in Zellen mit wtp53 zu signifikanten Effekten. Jedoch wurde auch in Systemen mit mtp53 eine differentielle Expression von p53-Zielgenen beobachtet. Im Gegensatz hierzu konnte durch RITA kein dominanter Effekt auf Zellen mit wtp53 beobachtet werden. Die differentielle Regulation von p53-Zielgenen erfolgte vorwiegend in RITA-sensitiven Zellen, was auch durch das Clustering dargestellt ist. Auf die Separation in RITAsensitive und RITA-insensitive Zellen hatte weder die Entität noch der p53-Status einen Einfluss. 48 Ergebnisse 3.1.4 Die Rolle von wtp53 für die Nutlin-3-, RITA- und Cisplatin-Sensitivität Bekanntermaßen gelten Nutlin-3, RITA und Cisplatin als Aktivatoren von wtp53 (Blagosklonny, 2002; Issaeva et al., 2004; Vassilev et al., 2004). In der untersuchten Zelllinienauswahl konnte insbesondere für Nutlin-3 und Cisplatin ein Einfluss von wtp53 hinsichtlich der Reaktion auf die Behandlung festgestellt werden. Weiterhin wurden wtp53-Zellen mit einer hohen Sensitivität gegenüber RITA identifiziert. Um den Einfluss von wtp53 auf die Sensitivität gegenüber Nutlin-3, RITA und Cisplatin zu untersuchen, wurden beispielhaft in der wtp53-exprimierenden Zelllinie NTERA-2D1 RNAi-Experimente durchgeführt (Abbildung 3.5). Abbildung 3.5: Die siRNA-vermittelte Depletion von wtp53 führt zu einer Verminderung des Zelltods sowohl nach (A) Nutlin-3-, (B) RITA- und (C) Cisplatin-Behandlung in NTERA-2D1. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienz des Knockdowns mittels Western-Blot. 2. Zeile: Differentielle Expression der 45 bona fide p53-Zielgene nach Nutlin-3-, RITA- und CisplatinBehandlung. Nach 8 h Inkubation mit und ohne Nutlin-3, RITA oder Cisplatin erfolgte die Isolation der RNA mit anschließender Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen die log2 ΔΔCt-Werte der Kontrolle (x-Achse) aufgetragen gegen die log2 ΔΔCt-Werte nach TP53-Knockdown (y-Achse). Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert des p53-Zielgens aus drei unabhängigen Experimenten. 3. Zeile: 48 h nach Inkubation wurden die Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. Ergebnisse 49 Wie in Abbildung 3.5, 1. Zeile gezeigt wird, war der Knockdown von TP53 sowohl im unbehandelten als auch im behandelten Fall effizient. Bei der Betrachtung der differentiellen Expression der p53-Zielgene hatte die Reduktion des p53-Proteins eine verringerte Induktion der Gene nach Nutlin-3-, RITA- und Cisplatin-Behandlung zur Folge (Abbildung 3.2, 2. Zeile). Dies war insbesondere nach Nutlin-3- und Cisplatin-Behandlung zu beobachten. Weiterhin konnte durch den Knockdown von TP53 der induzierte Zelltod durch Nutlin-3, RITA und Cisplatin nahezu vollständig verhindert werden (Abbildung 3.2, 3. Zeile). Infolgedessen konnte die wichtige Funktion von wtp53 auf die Sensitivität gegenüber bekannten p53-Aktivatoren bestätigt werden. 3.2 Mechanismen des RITA-induzierten Zelltods im p53-mutierten System Dem Thiophen-Derivat RITA (reactivation of p53 and induction of tumor cell apoptosis) konnten in zahlreichen Studien wtp53-reaktivierende Eigenschaften nachgewiesen werden (Enge et al., 2009; Grinkevich et al., 2009; Hedström et al., 2009; Issaeva et al., 2004; Li et al., 2011; Roh et al., 2012; Saha et al., 2010, 2012; Spinnler et al., 2011; Wang and Yan, 2011). Zudem zeigte der Inhibitor der p53Mdm2-Interaktion die Fähigkeit zur Reaktivierung von mtp53 (Burmakin et al., 2013; Zhao et al., 2010a). Bei der Charakterisierung der Zelllinienauswahl konnte ein hohe Sensitivität der p53-null-Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5 gegenüber RITA-Behandlung festgestellt werden. Auf Grund dieses überraschenden Ergebnisses wurde zunächst die chemische Identität von RITA überprüft. Dafür wurde RITA von zwei Herstellern bezogen und die chemische Zusammensetzung mittels (durchgeführt von Dr. T. Mürdter) analysiert (Abbildung 3.6). GC/MS-Analyse 50 Ergebnisse Abbildung 3.6: Bestätigung der chemischen Identität von RITA. RITA bezogen von zwei verschiedenen Herstellern wurde durch BSTFA bei 60°C für 30 min derivatisiert. Die Proben wurden auf einer DB-5 Kapillarsäule mit einem linearen Temperaturgradienten von 80°C - 280°C in 30 min mittels GC (7890A, Agilent Technologies, Germany) separiert. Das Bis(trimethylsilyl)-Derivat von RITA wurde mit Hilfe einer massenspektrometrischen Analyse (5975C Agilent Technologies, Germany) detektiert. Sowohl die Retentionszeiten (Abbildung 3.6 A) als auch das positive Spektrum der Elektronenstoßionisation (Abbildung 3.6 B) waren in beiden Proben identisch. Zudem entsprachen die erhaltenen Daten einem bereits publizierten Spektrum (Phillip et al., 2002). Die chemische Identität von RITA konnte damit eindeutig bestätigt werden. Ergebnisse 51 3.2.1 Die Rolle von mtp53 für die RITA-Sensitivität der mtp53-exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit RITA eine Reaktivierung von mtp53 zur Folge hat, wodurch ein p53-abhängiger Zelltod induziert wird (Zhao et al., 2010a). Auf Grund dessen wurde die Funktion von mtp53 auf den RITAinduzierten Zelltod in den mtp53-exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 näher untersucht (Abbildung 3.7). Abbildung 3.7: RITA kann unabhängig von mtp53 Zelltod induzieren. Für die RNAiExperimente wurden die mtp53-exprimierenden Zelllinien (A) OVCAR3 und (B) OVCAR4 verwendet. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienz des TP53-Knockdowns mittels Western-BlotAnalyse. 2. Zeile: Differentielle Expression der 45 bona fide p53-Zielgene nach RITABehandlung. Nach 8 h Inkubation mit und ohne RITA erfolgte die Isolation der RNA mit anschließender Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen die log2 ΔΔCt-Werte der Kontrolle (x-Achse) aufgetragen gegen die log2 ΔΔCt-Werte nach TP53 Knockdown (yAchse). Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert des p53-Zielgens aus drei unabhängigen Experimenten. 3. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. 52 Ergebnisse Die Überprüfung der Knockdown-Effizienz ergab eine effektive Reduktion des p53Proteins sowohl unbehandelt also auch nach RITA-Behandlung (Abbildung 3.7, 1. Zeile). Jedoch führte die Reduktion des p53-Proteins nicht zu einer signifikant veränderten Regulation (Mann-Whitney-Test, Bonferoni-Holm korrigiert) der p53Zielgene (Abbildung 3.7, 2. Zeile). Bemerkenswert dabei war das Ausbleiben einer Regulation von einer Gruppe von Genen (p21 (CDKN1A), NOXA (PMAIP1), PUMA (BBC3), GADD45α, c-MYC, BCL-2), welche in mehreren Studien als Gene identifiziert wurden, die durch RITA p53-abhängig reguliert werden (Burmakin et al., 2013; Enge et al., 2009; Grinkevich et al., 2009; Zhao et al., 2010a, 2010b). Eine Ausnahme bildete dabei TP63, welches in der Linie OVCAR3 herunterreguliert wurde (Abbildung 3.7 A, 2.Zeile). Zudem konnte der RITA vermittelte Zelltod durch den Knockdown von TP53 nicht reduziert werden (Abbildung 3.7, 3. Zeile). Auf Grundlage dieser Ergebnisse konnte geschlossen werden, dass RITA neben den bekannten wtp53-abhängigen Effekten in Zellen mit mtp53 auch Zelltod unabhängig von p53 induzieren kann. 3.2.2 Die Rolle von p63 und p73 für die RITA-Sensitivität der p53-defekten Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5 Neben p53 beinhaltet die p53-Superfamilie auch die Transkriptionsfaktoren p63 und p73. Da die amino-terminale Transaktivierungsdomäne, die DNA-Bindedomäne und die carboxy-terminale Oligomerisierungsdomäne von p53, p63 und p73 hoch konserviert sind (Dötsch et al., 2010) und die Zielgene teilweise überlappen (Collavin et al., 2010; Li and Prives, 2007), wurde der Einfluss von p63 und p73 auf den RITAvermittelten Zelltod näher betrachtet (Abbildung 3.8). Ergebnisse 53 Abbildung 3.8: RITA kann unabhängig von p63 und p73 Zelltod induzieren. Für die Knockdown-Experimente wurde die mtp53-exprimierende Zelllinie OVCAR4 verwendet. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienz des (A) TP63- und (B) TP73-Knockdowns mittels WesternBlot-Analyse. 2. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Die Effizienz des Knockdowns von TP63 und TP73 konnte durch Western-BlotAnalyse nachgewiesen werden (Abbildung 3.8, 1. Zeile). Jedoch führte weder der Knockdown von TP63 noch der von TP73 zu einer Abnahme des Zelltods nach RITA-Behandlung (Abbildung 3.8, 2. Zeile). Um einen Einfluss von mtp53 auf p63 und p73 (Melino, 2011; Zawacka-Pankau et al., 2010) ausschließen zu können, wurde weiterhin ein simultaner Knockdown von TP63 und TP73 in der p53-null-Linie OVCAR5 durchgeführt (Abbildung 3.9). 54 Ergebnisse Abbildung 3.9: RITA kann Zelltod unabhängig von (A) p63, (B) p73 und (C) p63+p73 in der p53-null-Linie OVCAR5 induzieren. 1. Zeile: Die Überprüfung der Knockdown-Effizienz wurde mittels qPCR durchgeführt. Dargestellt wurde die relative Expression von TP63 und TP73 aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. 2. Zeile: Differentielle Expression der 45 bona fide p53-Zielgene nach RITA-Behandlung. Nach 8 h Inkubation mit und ohne RITA erfolgte die Isolation der RNA mit anschließender Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen die log2 ΔΔCt-Werte der Kontrolle (xAchse) aufgetragen gegen die log2 ΔΔCt-Werte nach TP63-, TP73- oder TP63+TP73Knockdown (y-Achse). Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert des p53-Zielgens aus drei unabhängigen Experimenten. 3. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Wie in Abbildung 3.9, 1. Zeile gezeigt wird, war der Knockdown sowohl von p63 als auch von p73 effektiv. Übereinstimmend mit den Ergebnissen aus der mtp53exprimierenden Linie OVCAR4 (Abbildung 3.8) konnte auch in der p53-null-Zelllinie OVCAR5 weder durch TP63 noch durch TP73-Knockdown, ein Effekt auf die Expression der p53-Zielgene oder auf die Induktion von Zelltod festgestellt werden (Abbildung 3.9 A und B). Zudem zeigte auch der simultane Knockdown von TP63 und TP73 keinen Effekt auf die Genexpression oder den Zelltod (Abbildung 3.9 C). Daraus kann geschlossen werden, dass RITA unabhängig von p53, p63 und p73 Zelltod induzieren kann. Ergebnisse 55 3.2.3 Induktion von mitochondrialer Apoptose durch RITA in den p53-defekten Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5 In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte die Induktion eines Caspaseabhängigen Zelltods in Zelllinien des Multiplen Myeloms nach RITA-Behandlung nachgewiesen werden (Saha et al., 2010). Auf Grund dessen wurde im Weiteren untersucht, inwieweit die Aktivierung von Caspasen für den Zelltod in RITAsensitiven Zellen mit mtp53- oder p53-null-Status notwendig ist (Abbildung 3.10). Abbildung 3.10: Induktion eines Caspase-abhängigen Zelltods nach RITA-Behandlung. (A) OVCAR3- und (B) OVCAR5-Zellen wurden mit und ohne dem pan-Caspase Inhibitor z-VAD-FMK 2 h vorinkubiert. Anschließend erfolgte die Inkubation mit und ohne RITA für 48 h. Die Färbung der Zellen erfolgte mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung am Durchflusszytometer. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. Die Inhibition der Caspase-Kaskade mit z-VAD-FMK führte zu einer vollständigen Hemmung des Zelltods nach RITA-Behandlung (Abbildung 3.10 A und B). Da die Aktivierung der Caspase-Kaskade häufig zur Depolarisation der mitochondrialen Membran führt, wurde im Folgenden untersucht, welchen Einfluss die pro-apoptotischen, mitochondrialen Effektoren BAX und BAK auf den RITAinduzierten Zelltod in mtp53- oder p53-null-Zellen haben (Abbildung 3.11). 56 Ergebnisse Abbildung 3.11: Induktion von MOMP durch RITA Behandlung. (A) Abhängigkeit der durch RITA induzierten mitochondrialen Permeabilisation von den porenbildenen Effektorproteinen BAX und BAK in der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienz der Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 2. Zeile: 48 h nach Behandlung mit und ohne RITA wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und pWerte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. (B) Abhängigkeit der durch RITA induzierten mitochondrialen Permeabilisation von den porenbildenen Effektorproteinen BAX und BAK in der p53-null-Linie OVCAR5. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienz der Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 2. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. Ergebnisse 57 Die Effektivität des BAX und BAK Knockdowns konnte mittels Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden (Abbildung 3.11 A und B, 1. Zeile). Die simultane Depletion von BAX und BAK führte in beiden Ovarialkarzinom-Zelllinien zu einer vollständigen Hemmung des Zelltods. Im Falle der p53-null-Linie konnte durch einen alleinigen Knockdown von BAK der Zelltod partiell gehemmt werden (Abbildung 3.11 B, 2. Zeile Mitte). Anhand der vorliegenden Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass RITA im mtp53und p53-null-System Zelltod durch die Aktivierung der Caspase-Kaskade sowie durch die Depolarisation der mitochondrialen Membran in Abhängigkeit von BAX und BAK auslösen kann. 3.2.4 Beteiligung der Bcl-2-Proteinfamilie am RITA-vermittelten Zelltod in den p53-defekten Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5 Bei der Analyse der 45 bona fide p53-Zielgene konnten in der Gruppe der RITAsensitiven Zellen NOXA (PMAIP1) und PUMA (BBC3) als mit am stärksten hochregulierte Gene identifiziert werden (Tabelle 3.4). Auf Grund dessen wurde die Rolle der pro-apoptotischen BH3-only-Proteine NOXA, PUMA, BIM, BID und BAD näher betrachtet. Abbildung 3.12: RITA kann unabhängig von NOXA, PUMA, BIM, BID und BAD Apoptose in der mtp53-Linie OVCAR4 induzieren. Links: Überprüfung der Effizienz der Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. Rechts: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. 58 Ergebnisse Wie Abbildung 3.12 links zeigt, war der Knockdown der BH3-only-Proteine effizient. Trotz der deutlichen Reduktion der jeweiligen Proteinexpression hatte dies keinen Einfluss auf das Überleben der mtp53-exprimierenden Zellen (Abbildung 3.12, rechts). Neben NOXA und PUMA wurde bei der Analyse der p53-Zielgene auch das antiapoptotische Gen BCL-2 signifikant herunterreguliert (Tabelle 3.4). Auf Grund dessen wurde die Regulation von Bcl-2 auf Proteinebene in der mtp53-Linie OVCAR4 und der p53-null-Linie OVCAR5 näher untersucht (Abbildung 3.13). Ergebnisse 59 Abbildung 3.13: RITA induziert die Herunterregulation anti-apoptotischer Bcl-2-Proteine. (A) Western-Blot-Experimente zeigen die Proteinlevel der anti-apoptotischen Bcl-2-Proteine Bcl2, Bcl-xL, Bcl-w und Mcl-1 nach Inkubation der Ovarialkarzinom-Zelllinien OVCAR4 und OVCAR5 mit und ohne RITA nach 8 h Behandlung. (B) ABT-737, ein BH3-mimetic, wirkt synergistisch mit RITA in RITA-sensitiven Zellen. RITA-sensitive (1. Zeile) und RITAinsensitive Zellen (2. Zeile) wurden mit ABT-737 2 h vor RITA-Behandlung vorinkubiert. Nach 16 h (OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5) oder 24 h (OVCAR8, SKOV3, PBMNC) wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und die Depolarisierung der mitochondrialen Membran im Durchflusszytomer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mittels (*) gekennzeichnet. Das anti-apoptotische Protein Bcl-2 wurde in der Linie OVCAR4 auch auf Proteinebene durch RITA herunterreguliert (Abbildung 3.13 A). Da das Bcl-2-Protein in der p53-null-Zelllinie OVCAR5 nicht detektierbar war, wurden zudem die antiapoptotischen Proteine Bcl-xL, Bcl-w und Mcl-1 näher betrachtet. Eine Behandlung mit RITA führte hierbei zu einer Reduktion des Proteinlevels von Mcl-1 in beiden Zelllinien. Bcl-xL wurde in der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4 reduziert. Daraus ergab sich die Reduktion von mindestens einem anti-apoptotischen Bcl-2Proteinfamilienmitglied nach einer Behandlung mit RITA. Durch die synergistische Wirkung des BH3-mimetics ABT-737 mit RITA in RITAsensitiven Zelllinien konnte die wichtige Rolle der anti-apoptotischen Faktoren der Bcl-2-Proteinfamilie bestätigt werden (Abbildung 3.13 B, 1. Zeile). Interessanterweise konnte eine Induktion von Zelltod nach ABT-737 und RITA-Behandlung in RITAinsensitiven Zellen nicht nachgewiesen werden (Abbildung 3.13 B, 2. Zeile). 3.2.5 Identifikation von Signalwegen, welche den RITA-induzierten Zelltod vermitteln können Bisher konnte geklärt werden, dass der RITA-induzierte Zelltod in mtp53exprimierenden Zellen oder in p53-null-Zellen unabhängig von der p53-Superfamilie vermittelt werden kann. Weiterhin wurde die zentrale Rolle der mitochondrialen Effektorproteine BAX und BAK sowie die Herunterregulation von anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinfamilienmitgliedern bei der RITA induzieren Apoptose im p53-defekten System nachgewiesen. Für die Identifikation von Signalwegen, welche den RITA-induzierten Zelltod in Zellen mit defektem p53 vermitteln, wurde die Genexpression von Genen zentraler Signaltransduktionswege (Apoptose, Autophagie, DNA-Reparatur, Nekrose, ERStress, MAPK-Kaskade, NF-κB, oxidativer Stress) (Ferreiro et al., 2010; Hakem, 60 Ergebnisse 2008; Han et al., 2011; van Loo et al., 2002; Oeckinghaus et al., 2011; Ray et al., 2012; Rosenfeldt and Ryan, 2011; Samali et al., 2010) in einem Hochdurchsatzverfahren gemessen. (Tabelle 2.3). Für die Genexpressionsanalyse wurden die Ovarialkarzinom-Zelllinien OVCAR3, -4, -5, -8, A2780, SKOV3, TOV-112D und IGROV1 verwendet (Abbildung 3.14). Ergebnisse 61 Abbildung 3.14: Regulation von 94 Genen zentraler zellulärer Signaltransduktionswege in Ovarialkarzinom-Zelllinien nach RITA-Behandlung. Für die Genexpressionsanalyse wurden die Zellen 8 h mit und ohne RITA inkubiert, die RNA isoliert, cDNA synthetisiert und eine spezifische Anreicherung der Zielgene durchgeführt. Die Messung erfolgte mit Hilfe des BioMarkTM-HD-Systems. Nach der Berechnung der ΔΔCt-Werte wurde eine Clusteranalyse nach Euklidischem Gleichheitsmaß mit anschließendem Complete-Linkage-Verfahren durchgeführt. Die Clusterbildung erfolgte sowohl hinsichtlich der Zellen als auch hinsichtlich der Gene. Der Farbverlauf beschreibt die Mittelwerte der log2 ΔΔCt-Werte aus drei unabhängigen Experimenten. Wie schon bei der Analyse der p53-Zielgene (Abbildung 3.3), ergab auch die Untersuchung der 94 Gene zentraler Signaltransduktionswege eine Gliederung in RITA-sensitive und RITA-insensitive Zellen (Abbildung 3.14). Statistische Untersuchungen ergaben in der Gruppe der RITA-sensitiven Zellen ein signifikant hochreguliertes Gen und 3 herunterregulierte Gene (Benjamini-Hochberg korrigierter gepaarter t-Test p<0,05, FC>2; Tabelle 3.8). Tabelle 3.8: Signifikant regulierte Gene zentraler Signaltransduktionswege nach Behandlung mit RITA Hochregulierte Gene nach RITA-Behandlung (p-Wert <0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2) Genname DDIT3 RITA sensitiv FC 3.23 RITA insensitiv p-Wert 0.004585 Herunterregulierte Gene nach RITA-Behandlung (p-Wert <0.05 Benjamini-Hochberg korrigiert, FC>2) Genname ATM FANCM BLM RITA sensitiv FC -2.37 -2.13 -2.10 RITA insensitiv p-Wert 0.021588 0.019861 0.004585 Bemerkenswert hierbei ist die durch RITA induzierte Herunterregulation von Genen, welche für wichtige DNA-Reparaturproteine kodieren. Neben der Expressionsanalyse von Regulatoren zentraler Signaltranduktionswege wurde eine Transkriptomanalyse der p53-null-Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5 nach RITA-Behandlung durchgeführt. Diese ergab eine signifikante Regulation (p-Wert<0,05, >20 regulierte Gene je Signalweg) der Insulin-, TNFβ und MAPKSignaltransduktionswege (Tabelle 3.9). 62 Ergebnisse Tabelle 3.9: Regulierte Signalwege in der p53-null Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5 nach Behandlung mit RITA Signifikant regulierte Signalwege nach RITA-Behandlung Signalweg Anzahl signifikant p-Wert Hs_Insulin_Signaling_ WP481_59178 Hs_TGF_beta_Signaling_Pathway_ WP366_47976 Hs_MAPK_signaling_ pathway_WP382_54211 regulierter Gene 1.55E-05 25 2.33E-06 22 3.58E-04 22 In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte die Aktivierung des JNKSignaltranduktionsweges für die Sensitivität von wtp53-exprimierdenden Zellen des Multiplem Myeloms gegenüber RITA-Behandlung identifiziert werden (Saha et al., 2012). Übereinstimend mit diesen Ergebnissen zeigte die Transkriptomanalyse der p53-null-Linie OVCAR5 eine Aktiverung Signaltransduktionsweges (Abbildung 3.15). des JNK- und p38- Ergebnisse 63 Abbildung 3.15: Regulation des MAPK-Signaltransduktionswegs in der p53-null-Zelllinie OVCAR5. Für die Transkriptomanalyse wurden die Zellen 8 h mit und ohne RITA inkubiert. Die anschließende Microarrayanalyse erfolgte mittels GeneChip® Human Gene 2.0 ST Arrays. Mittels Signalwegsanalyse (Single-Experiment-Analysis, p-Wert<0,05, >20 regulierte Gene je Signalweg) konnte der MAPK-Signalweg als einer der am stärksten regulierten Signaltransduktionswege nach RITA-Behandlung identifiziert werden. Signifikant regulierte Gene wurden mit gelbem Hintergrund dargestellt. 64 Ergebnisse 3.2.6 Involvierung des JNK- und p38-MAP-Kinase-Signalweges in den RITAvermittelten Zelltod der p53-defekten Zelllinien OVCAR3 und OVCAR5 Der MAPK-Signalweg kann bekanntermaßen in den ERK- (extracellular-signalregulated kinases), JNK- (Jun amino-terminal kinases) und den p38- (stressactivated protein kinases) Signalweg untergliedert werden, wobei insbesondere JNK und p38 Apoptose vermitteln können (Morrison, 2012). Auf Grund dessen wurde weiterhin die Funktion von JNK und p38 für den RITA-induzierten Zelltod in der mtp53-Zelllinie OVCAR3 und der p53-null-Linie OVCAR5 näher untersucht (Abbildung 3.16). Ergebnisse 65 Abbildung 3.16: Inhibition von JNK oder p38 reduziert den RITA-vermittelten Zelltod. OVCAR3- und OVCAR5-Zellen wurden mit und ohne (A) dem JNK-Inhibitor SP600125 oder (B) dem p38-Inhibitor III für 2 h vorinkubiert. Anschließend erfolgte die Inkubation mit und ohne RITA für 3 h um die Phosphorylierung von c-Jun mittels Western-Blot-Analyse nachzuweisen. Die Messung der Apoptoseinduktion erfolgte nach 24 h Behandlung mit und ohne RITA mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung Färbung am Durchflusszytometer. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. Die Inhibition sowohl von JNK als auch von p38 führte zu einer vollständigen Hemmung der c-Jun-Phosphorylierung (Abbildung 3.16 A und B, 1. Zeile). Gleichermaßen wurde auch die Induktion der RITA-vermittelten Apoptose durch die Inhibition JNK und p38 signifikant vermindert (Abbildung 3.16 A und B, 2. und 3. Zeile). Hierbei war zu beobachten, dass die Inhibition von JNK eine stärkere Hemmung des RITA-vermittelten Zelltods zur Folge hatte als die Inhibition von p38. Infolgedessen wurde die Rolle von JNK durch RNAi-Experimente genauer betrachtet (Abbildung 3.17). 66 Ergebnisse Abbildung 3.17: Der spezifische Knockdown von JNK1 führt zu einer Verminderung der RITA-induzierten Apoptose. 1. Zeile: Überprüfung der Knockdown-Effizienz in (A) OVCAR3und (B) OVCAR5-Zellen sowie Detektion von p-c-Jun mittels Western-Blot-Analyse. 2. Zeile: Differentielle Expression der 45 bona fide p53-Zielgene nach RITA-Behandlung. Nach 8 h Inkubation mit und ohne RITA erfolgte die Isolation der RNA mit anschließender Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen die log2 ΔΔCt-Werte der Kontrolle (xAchse) aufgetragen gegen die log2 ΔΔCt-Werte nach JNK1-Knockdown (y-Achse). Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert des p53-Zielgens aus drei unabhängigen Experimenten. 3. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden (A) OVCAR3- und (B) OVCAR5Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und pWerte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. Interessanterweise genügte die Reduktion des JNK1-Proteins, um die Phosphorylierung von c-Jun sowie die Induktion von Zelltod zu reduzieren (Abbildung 3.17, 1. und 3 Zeile). Das Ausmaß der Verminderung des Zelltods war dabei vergleichbar mit der pharmakologischen Inhibition sowohl in der mtp53- exprimierenden Zelllinie OVCAR3 als auch in der p53-null-Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5. Dies deutet auf eine dominante Rolle von JNK1 für den RITA-induzierten Zelltod hin. Jedoch konnte durch den Knockdown von JNK1 keine Veränderung in der Regulation der p53-Zielgene festgestellt werden (Abbildung 3.17, 2. Zeile). Die Aktivierung von JNK führt bekanntermaßen zur Phosphorylierung und Aktivierung der Transkriptionsfaktors AP-1, zu welchem die Jun-, FOS-, ATF- und MAFF-Proteine zählen (Shaulian, 2010). Bemerkenswerterweise konnten ATF3 und FOS als die Gene mit der höchsten Induktion in den RITA-sensitiven Zellen identifiziert werden (Tabelle 3.4). Zudem zeigt c-Jun eine starke Phosphorylierung nach Behandlung mit RITA sowohl im mtp53- als auch im p53-null-System (Abbildung 3.16 und 3.17). Folglich wurde der Einfluss von ATF3, FOS und c-Jun auf den RITA-vermittelten Zelltod näher betrachtet (Abbildung 3.18). Ergebnisse 67 Abbildung 3.18: Im p53-defekten System ist der RITA-induzierte Zelltod nicht von ATF3, FOS oder c-Jun abhängig. (A) Transfektion der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4 mit ATF3-siRNA. Überprüfung der Effizienz des ATF3-Knockdowns mittels Western-BlotAnalyse. 16 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. (B) FOS-Knockdown in der mtp53-exprimierenden Linie OVCAR4 und der p53-null-Linie OVCAR5. Die Überprüfung der Knockdown-Effizienz wurde mittels qPCR durchgeführt. Dargestellt wurde die relative Expression von FOS aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit TMRM (OVCAR4) oder AnnexinV-FITC/PI-Färbung (OVCAR5) gefärbt und MOMP bzw. Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. (C) c-Jun-Knockdown in der mtp53-exprimierenden Linie OVCAR3 und der p53-null-Linie OVCAR5. Überprüfung der Effizienz des c-Jun-Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 48 h nach Inkubation mit und ohne RITA wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. 68 Ergebnisse Überraschenderweise konnte weder die Reduktion des ATF3-Proteins noch die von FOS oder c-Jun den Zelltod nach RITA-Behandlung vermindern. Der Knockdown von ATF3 führte zudem zu einer Steigerung der Sensitivität gegenüber RITA. Demzufolge ist ein Einfluss von AP-1 auf den RITA-vermittelten Zelltod im p53defekten System unwahrscheinlich. Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass durch die Behandlung mit RITA Zelltod unabhängig vom p53-Status induziert werden kann. In wtp53-exprimierenden Zellen führte RITA zu einer wtp53-abhängigen Induktion von Zelltod, wohingegen in Systemen mit mtp53 oder mit p53-null Status der Zelltod unabhängig von mtp53, p63 oder p73 induziert werden konnte. In diesen Systemen kam es nach RITABehandlung zu einer Aktivierung der Caspase-Kaskade sowie zu einer Depolarisation der mitochondrialen Membran in Abhängigkeit von BAX und BAK. Zudem konnte durch RITA eine Herunterregulation der Bcl-2-Proteine Bcl-2, Bcl-xL und Mcl-1 festgestellt werden. Dies unterstreicht die Wichtigkeit des Mitochondriums für die RITA-vermittelte Apoptose. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die Induktion der mitochondrialen Apoptose durch die Aktivierung des JNK- und p38Signaltransduktionswegs ausgelöst wird, wobei insbesondere ein Knockdown von JNK1 zu einer signifikanten Verminderung der Apoptose führte. In p53-defekten Systemen kann RITA demnach mitochondriale Apoptose durch eine Aktivierung von JNK und p38 induzieren. Ergebnisse 69 3.3 Mechanismen des Cisplatin-induzierten Zelltods im p53mutierten System 3.3.1 Die Rolle von mtp53 für die Cisplatin-Sensitivität der mtp53- exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 Neben der überraschenden Induktion von Zelltod im p53-defekten System nach RITA konnte auch nach Cisplatin-Behandlung eine Induktion von Zelltod in mtp53exprimierenden Zellen nachgewiesen werden (Abbildung 3.1). Demzufolge wurde weiterhin untersucht, welche Rolle mtp53 für den Cisplatin-induzierten Zelltod hat (Abbildung 3.19). Abbildung 3.19: Cisplatin kann unabhängig von mtp53 Zelltod induzieren. Für die RNAiExperimente wurden die mtp53-exprimierenden Zelllinien (A) OVCAR3 und (B) OVCAR4 verwendet. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienz des TP53-Knockdowns mittels Western-BlotAnalyse. 2. Zeile: Differentielle Expression der 45 bona fide p53-Zielgene nach CisplatinBehandlung. Nach 8 h Inkubation mit und ohne Cisplatin erfolgte die Isolation der RNA mit 70 Ergebnisse anschließender Genexpressionsanalyse. Die Diagramme zeigen die log2 ΔΔCt-Werte der Kontrolle (x-Achse) aufgetragen gegen die log2 ΔΔCt-Werte nach TP53 Knockdown (yAchse). Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert des p53-Zielgens aus drei unabhängigen Experimenten. 3. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Trotz des effizienten Knockdowns von TP53 (Abbildung 3.19, 1. Zeile) konnte keine Veränderung in der Induktion der 45 bona fide p53-Zielgene (Mann-Whitney-Test, Bonferoni-Holm korrigiert) nachgewiesen werden (Abbildung 3.19, 2. Zeile). Ebenso wurde der Cisplatin-induzierte Zellentod in beiden mtp53-exprimierenden Ovarialkarzinom-Zelllinien nicht vermindert. Somit kann Cisplatin Zelltod auch unabhängig von mtp53 induzieren. 3.3.2 Die Rolle von p63 und p73 für die Cisplatin-Sensitivität der p53-defekten Zelllinie OVCAR4 Auf Grund der ausbleibenden Reaktion der Zellen auf den Knockdown von mtp53 wurde im Folgenden der Einfluss von p63 und p73 auf den Cisplatin-vermittelten Zelltod näher untersucht (Abbildung 3.20). Ergebnisse 71 Abbildung 3.20: Cisplatin kann unabhängig von p63 und p73 Zelltod in der Linie OVCAR4 induzieren. (A) Knockdown von TP63. Links: Überprüfung der Effizienz des TP63Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. Rechts: Knockdown von TP63 mittels ON-TARGET siRNAs. Die Überprüfung der Knockdown-Effizienz wurde mittels qPCR durchgeführt. Dargestellt wurde die relative Expression von TP63 aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. (B) Knockdown von TP73. Überprüfung der Effizienz des TP73Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Durch den effizienten Knockdown von TP63 konnte der Cisplatin-induzierte Zelltod signifikant reduziert werden (Abbildung 3.20 A, Links). Auf Grund der sehr geringen Expression von p63 auf Proteinebene wurde das siRNA-Experiment mit ON-TARGET siRNAs wiederholt, um potentielle off-target-Effekte auszuschließen. Hierbei konnten drei von vier verschiedenen siRNAs (Tabelle 2.5) eine signifikante Reduktion von TP63 herbeiführen (Abbildung 3.20 A, Rechts). Jedoch konnte die zuvor beobachtete Hemmung des durch Cisplatin induzierten Zelltods nicht mehr beobachtet werden. Daraus konnte geschlossen werden, dass die zuvor beobachtete Verminderung des Zelltods auf einen off-target-Effekt der siRNA zurückzuführen war. Weiterhin wurde der Einfluss von p73 auf den Cisplatin-induzierten Zelltod untersucht. Trotz des effizienten Knockdowns von TP73 konnte keine Hemmung des Zelltods nach Cisplatin-Behandlung in der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4 festgestellt werden (Abbildung 3.20 B). Mtp53 kann mit p63 und p73 interagieren und deren Funktionen beeinflussen (Melino, 2011; Zawacka-Pankau et al., 2010). Um dies auszuschließen, wurde ein dreifacher Knockdown von TP53, TP63 und TP73 durchgeführt (Abbildung 3.21). 72 Ergebnisse Abbildung 3.21: Cisplatin kann unabhängig von mtp53, p63 und p73 Zelltod in der Zelllinie OVCAR4 induzieren. (A) Die Überprüfung der Knockdown-Effizienz wurde mittels qPCR durchgeführt. Dargestellt wurde die relative Expression von TP53, TP63 und TP73 aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. (B) 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Die Überprüfung der Knockdown-Effizienz ergab eine signifikante RNA-Reduktion sowohl von TP53 als auch von TP63 und TP73 (Abbildung 3.21 A). Dennoch konnte keine Hemmung des durch Cisplatin induzierten Zelltods nachgewiesen werden (Abbildung 3.21 B). Somit kann Cisplatin auch unabhängig von mtp53, p63 und p73 Zelltod induzieren. 3.3.3 Induktion von mitochondrialer Apoptose durch Cisplatin in den p53defekten Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 Auf Grund der unabhängig von mtp53, p63 und p73 erfolgten Induktion von Zelltod in der Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR4 wurde im Weiteren untersucht, inwiefern die Aktivierung der Caspase-Kaskade eine zentrale Rolle für den Zelltod spielt (Abbildung 3.22). Ergebnisse 73 Abbildung 3.22: Induktion eines Caspase-abhängigen Zelltods nach Cisplatin-Behandlung. (A) OVCAR3- und (B) OVCAR4-Zellen wurden mit und ohne pan-Caspase Inhibitor z-VAD-FMK 2 h vorinkubiert. Anschließend erfolgte die Inkubation mit und ohne Cisplatin für 48 h. Die Färbung der Zellen erfolgte mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung am Durchflusszytometer. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. Durch den pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-FMK konnte der Zelltod nach CisplatinBehandlung in beiden Ovarialkarzinom-Zelllinien mit mtp53 nahezu vollständig inhibiert werden (Abbildung 3.22). Die Aktivierung von Caspasen ist somit notwendig um durch Cisplatin Zelltod zu induzieren. Anschließend wurde näher untersucht inwiefern die porenbildenden mitochondrialen Effektorproteine BAX und BAK einen Einfluss auf den Cisplatin-vermittelten Zelltod im mtp53-exprimierenden System haben (Abbildung 3.23). 74 Ergebnisse Abbildung 3.23: Induktion von MOMP durch Cisplatin Behandlung in der mtp53 Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR4. Abhängigkeit der durch Cisplatin induzierten mitochondrialen Permeabilisation von (A) BAX (B) BAK und (C) BAX und BAK. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienz der Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 2. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mittels (*) gekennzeichnet. Die Überprüfung der Effizienz des BAX, BAK und BAX/BAK Knockdowns ergab eine deutliche Reduktion der Expression dieser pro-apoptotischen Effektoren auf Proteinebene (Abbildung 3.23, 1. Zeile). Durch die siRNA-vermittelte Depletion von BAK konnte der Cisplatin-induzierte Zelltod partiell reduziert werden (Abbildung 3.23 B). Hingegen wurde durch den Doppelknockdown von BAX und BAK eine nahezu vollständige Inhibition des Zelltods beobachtet (Abbildung 3.23 C). Somit induzierte Cisplatin die Aktivierung von Caspasen und eine von BAX- und BAK-abhängige Depolarisation der mitochondrialen Membran. 3.3.4 Die Rolle der pro-apoptotischen BH3-only-Proteine für die CisplatinSensitivität der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4 Mit Hilfe der Genexpressionsanalyse der 45 bona fide p53-Zielgene konnte NOXA (PMAIP1) als eines der am stärksten regulierten pro-apoptotischen Gene in der Gruppe der mtp53-exprimierenden Zellen identifiziert werden (Tabelle 3.4). Inwiefern die Induktion der pro-apoptotischen BH3-only-Proteine wichtig ist für die Cisplatin vermittelte Apoptose, wurde im Folgenden untersucht (Abbildung 3.24). Ergebnisse 75 Abbildung 3.24: NOXA und PUMA sind wichtige Komponenten bei der Cisplatin-induzierten Apoptose in der mtp53-Linie OVCAR4. Links: Überprüfung der Effizienz der Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. Rechts: 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit TMRM gefärbt und MOMP im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mittels (*) gekennzeichnet. Die Behandlung der mtp53-exprimierenden Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR4 mit Cisplatin führte zu einer Induktion von NOXA und PUMA auf Proteinebene (Abbildung 3.24, Links). Weder BIM, BID noch BAD wurde durch Cisplatin induziert. Der effiziente Knockdown der pro-apoptotischen BH3-only-Proteine (Abbildung 3.24, Links) führte ausschließlich im Falle von NOXA und PUMA zu einer Verminderung der Cisplatin-vermittelten Apoptose (Abbildung 3.24, Rechts). Auf Grund dessen konnten BAX und BAK sowie NOXA und PUMA als wichtige Vermittler der Cisplatin-induzierten Apoptose identifiziert werden. 3.3.5 Die konstitutiven Level der Bcl-2-Proteine als prädiktive Marker in der Zelllinienauswahl Kürzlich konnte gezeigt werden, dass die konstitutiv hohen Level des proapoptotischen BH3-only-Proteins NOXA in embryonalen Keimzelltumoren entscheidend für die hohe Sensitivität dieser wtp53-exprimierenden Tumore gegenüber Cisplatin sind (Gutekunst et al., 2013). Auf Grund dessen wurde zunächst die konstitutive Expression der pro-apoptotischen Proteine BAK, BAX, BAD, BID, BIM, PUMA und NOXA sowie die der anti-apoptotischen Proteine Mcl-1, Bcl-w, Bcl-2 und Bcl-xL in der Zelllinienauswahl sowie in PBMNCs untersucht (Abbildung 3.25). 76 Ergebnisse Abbildung 3.25: Konstitutive Expression der pro-apoptotischen Proteine BAK, BAX, BAD, BID, BIM, PUMA und NOXA sowie die der anti-apoptotischen Proteine Mcl-1, Bcl-w, Bcl-2 und Bcl-xL in der Zelllinienauswahl. Analyse der Proteinexpression aus Proteinlysaten von unbehandelten Proben der Zelllinien sowie von PBMNCs. Für die mathematische Auswertung der Proteinexpressionsdaten erfolgte die densitometrische Auswertung der Western-Blots mit anschließender Normierung auf das Referenzprotein GAPDH. Die normierten Daten wurden nachfolgend zur Berechnung des Verhältnisses aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen herangezogen. Abschließend erfolgte die Korrelation dieser Werte mit den Daten der Induktion von Zelltod nach Cisplatin und RITA (Abbildung 3.26). Ergebnisse 77 Abbildung 3.26: Signifikante Korrelation des Verhältnisses aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen. Mit Hilfe der densitometrischen Auswertung der Western-Blot-Analyse wurde das Verhältnis aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen berechnet und anschließend mit der Induktion von Zelltod nach (A) Cisplatin (1. Zeile: gesamte Zelllinienauswahl, 2. Zeile: Zelllinien mit mtp53) und (B) RITA korreliert (Pearson-Korrelation mit 95% Konfidenzintervall, p-Werte<0,05, r-Werte>0,5). Jeder Punkt steht stellvertretend für eine Zelllinie. Die Korrelation der Proteinlevel mit dem induzierten Zelltod nach Cisplatin ergab einen signifikanten Zusammenhang (Abbildung 3.26 A, 1. Zeile). Somit ist das konstitutive Verhältnis der Expressionen der pro- und anti-apoptotischen Bcl-2Proteine entscheidend für die Cisplatin-Sensitivität innerhalb der Zelllinienauswahl. Ein derartiger Zusammenhang konnte für die Behandlung mit RITA nicht festgestellt werden (Abbildung 3.26 B). Im Weiteren wurde untersucht, inwiefern das Verhältnis der Bcl-2-Proteine in mtp53exprimierenden Zelllinien mit der Induktion von Zelltod nach Cisplatin korreliert. Dabei konnte eine Korrelation mit höherer Signifikanz im Vergleich zur Betrachtung der gesamten Zelllinienauswahl nachgewiesen werden (Abbildung 3.26 A, 2. Zeile). Dies lässt auf einen starken Einfluss der Bcl-2-Proteine für die Cisplatin-Sensitivität von Zellen mit mtp53 schließen. 78 Ergebnisse Für die Identifikation von prädiktiven Markern für die Cisplatin-Sensitivität wurde im Folgenden die Anzahl der am Verhältnis beteiligter Bcl-2-Proteine sukzessive reduziert (Abbildung 3.27). Abbildung 3.27: Reduktion der am Verhältnis beteiligten Bcl-2-Proteine zur Bestimmung der im Minimum notwendigen Komponenten für eine Korrelation. Mit Hilfe der densitometrischen Auswertung der Western-Blot-Analyse wurde das Verhältnis aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen berechnet und anschließend die Anzahl der am Verhältnis beteiligten Proteine, (A) der pro-apoptotischen, (B) der anti-apoptotischen reduziert. Die Berechnung der Korrelation erfolgte durch eine Pearson-Korrelation mit 95% Konfidenzintervall (pWerte<0,05, r-Werte>0,5). Jeder Punkt steht stellvertretend für eine Zelllinie. Die sukzessive Elimination von pro-apoptotischen Proteinen aus dem Verhältnis führte zur Identifikation von NOXA und BIM als Faktoren, welche für eine signifikante Korrelation nötig sind (Abbildung 3.27 A, Oben). Die Limitierung auf Zelllinien, welche mtp53 exprimieren, verstärkte diesen Effekt (Abbildung 3.27 A, Unten). Unter Beibehaltung von NOXA und BIM im Zähler des Verhältnisses erfolgte die stufenweise Reduktion von anti-apoptotischen Proteinen aus dem Verhältnis. Hierbei waren Bcl-w und Bcl-xL essentiell für eine signifikante Korrelation (Abbildung 3.27 B, Oben). Wiederum führte die selektive Betrachtung der mtp53-exprimierenden Zelllinien zu einer Erhöhung der Korrelation (Abbildung 3.27, Unten). Ergebnisse 79 Bei der Betrachtung der einzelnen Komponenten des Verhältnisses NOXA, BIM und Bcl-w, Bcl-xL genügte NOXA oder Bcl-w allein, um eine signifikante Korrelation zu erhalten (Abbildung 3.28). Abbildung 3.28: Signifikante Korrelation des Verhältnisses von NOXA und Bcl-w mit dem Cisplatin-induzierten Zelltod. Mit Hilfe der densitometrischen Auswertung der Western-BlotAnalyse wurde das Expressionsniveau von (A) NOXA und (B) Bcl-w bestimmt und mit dem Cisplatin-induzierten Zelltod korreliert (Pearson-Korrelation mit 95% Konfidenzintervall, pWerte<0,05, r-Werte>0,5). Jeder Punkt steht stellvertretend für eine Zelllinie. Somit konnte gezeigt werden, dass die konstitutiven Level an NOXA oder Bcl-w ausreichen, um die Sensitivität von Zellen gegenüber Cisplatin innerhalb der Zelllinienauswahl vorherzusagen (Abbildung 3.28). Hohe Level an NOXA oder niedrige Level an Bcl-w scheinen damit sensitive Zellen gegenüber Cisplatin zu „primen“. 3.3.6 Modulation von NOXA und Bcl-w zur Sensitivierung von Zellen mit geringer Cisplatin-Sensitivität Das pro-apoptotische BH3-only-Protein NOXA konnte als prädiktiver Marker für den Cisplatin-vermittelten Zelltod identifiziert werden. Eine pharmakologische Akkumulation von NOXA kann durch den Proteasomeninhbitor Bortezomib induziert werden (Qin et al., 2005). Im Folgenden wurde versucht in der mtp53exprimierenden, Cisplatin-insensitiven Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR8, NOXA durch Bortezomib zu akkumulieren (Abbildung 3.29). 80 Ergebnisse Abbildung 3.29: Die durch Bortezomib induzierte Akkumulation von NOXA führt zu einer NOXA-abhängigen Induktion von Apoptose. OVCAR8-Zellen wurden 2 h vor Inkubation mit und ohne Cisplatin mit und ohne Bortezomib vorinkubiert. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienzen der Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 2. Zeile: 24 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mittels (*) gekennzeichnet. Die Behandlung mit Bortezomib führte zu einer deutlichen Induktion von NOXA, welche durch die Kombinationsbehandlung mit Cisplatin noch verstärkt werden konnte (Abbildung 3.29, 1. Zeile). Durch die Kombination von Bortezomib und Cisplatin kam es zu einer deutlichen Induktion von Zelltod, welcher durch den Knockdown von NOXA signifikant reduziert werden konnte (Abbildung 3.29, 2. Zeile). Folglich kann die pharmakologische Modulation von NOXA Zelltod in Zellen mit geringer Cisplatin-Sensitivität vermitteln. Neben NOXA konnte das anti-apoptotische Bcl-2-Protein Bcl-w als prädiktiver Marker der Cisplatin-Sensitivität identifiziert werden. Die Modulation von Bcl-w zur Erhöhung der Sensitivität gegenüber Cisplatin war Gegenstand der folgenden Untersuchungen (Abbildung 3.30). Ergebnisse 81 Abbildung 3.30: Sowohl der Knockdown, als auch die pharmakologische Modulation von Bcl-w führt zu einer signifikanten Induktion von Apoptose in nicht Cisplatin-sensitiven Zellen. (A) Knockdown von Bcl-w in der Cisplatin-insensitiven Zelllinie OVCAR8. 1. Zeile: Überprüfung der Effizienz der Knockdowns mittels Western-Blot-Analyse. 2. Zeile: 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. (B) 2 h vor Inkubation mit und ohne Cisplatin erfolgte die Vorinkubation mit ABT-737. 48 h nach Inkubation mit und ohne Cisplatin wurden die Zellen mit AnnexinV-FITC/PI-Färbung gefärbt und der Zelltod im Durchflusszytometer gemessen. Jeder Balken repräsentiert das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten ±SD. Signifikante Unterschiede wurden mittels zweiseitigem, gepaartem t-Test berechnet und p-Werte<0,05 mit (*) gekennzeichnet. Durch den effizienten Knockdown von Bcl-w in der mtp53-exprimierenden Linie OVCAR8 (Abbildung 3.30 A, 1. Zeile) konnte durch die Behandlung mit Cisplatin eine signifikante Induktion von Zelltod herbeigeführt werden (Abbildung 3.30 A, 82 Ergebnisse 2. Zeile). Das BH3-mimetic ABT-737 bindet bevorzugt an Bcl-2, Bcl-xL und Bcl-w und führt dadurch zu einer Verschiebung des zellulären Gleichgewichts aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2-Familienproteinen (Oltersdorf et al., 2005). Die Kombinationsbehandlung von ABT-737 mit Cisplatin führte zu einer signifikanten Induktion von Apoptose in den beiden Cisplatin-insensitiven OvarialkarzinomZelllinien OVCAR8 und SKOV3 (Abbildung 3.30 B). Somit konnte durch die vorangegangenen Untersuchungen festgestellt werden, dass neben den wtp53-abhängigen Effekten Cisplatin auch p53-unabhängig Zelltod induzieren kann. Dabei hatte zudem weder p63 noch p73 einen Einfluss auf die Induktion von Apoptose. Der Cisplatin vermittelte Zelltod konnte auf die Aktivierung der Caspase-Kaskade sowie auf die mitochondriale Depolarisation, in Abhängigkeit von den porenbildenden Bcl-2-Proteinen BAX und BAK, zurückgeführt werden. Zudem wurden die BH3-only-Proteine NOXA und PUMA als Vermittler der CisplatinSensitivität identifiziert. Bei der Untersuchung der konstitutiven Level der proapoptotischen Bcl-2-Proteine BAK, BAX, BAD, BID, BIM, PUMA und NOXA sowie die der anti-apoptotischen Bcl-2-Proteine Mcl-1, Bcl-w, Bcl-2 und Bcl-xL in der Zelllinienauswahl sowie in PBMNCs konnten NOXA und Bcl-w als prädiktive Marker der Cisplatin-Sensitivität ermittelt werden. Die pharmakologische Modulation von NOXA durch Bortezomib sowie die Modulation von Bcl-w durch RNAi oder ABT-737 führte zu einer Sensitivierung von Zellen mit geringer Cisplatin-Sensitivität. Dies eröffnet die potentielle Möglichkeit Cisplatin refraktäre Tumore durch effektive Kombinationsbehandlungen zu therapieren. Diskussion 83 4. Diskussion Mehr als drei Jahrzehnte nach der Entdeckung von TP53 im Jahre 1979 sind immer noch zahlreiche Fragen bezüglich der detaillierten Funktion des Tumorsuppressors ungeklärt. Zudem konnte in den letzten Jahren gezeigt werden, dass mtp53 zur Tumorprogression nicht nur durch den Verlust der tumorsuppressiven Eigenschaften, sondern auch durch den Zugewinn neuer, spezifischer mtp53-Funktionen („gain-offunction“) beiträgt (Goldstein et al., 2011). In humanen Tumoren ist p53 in ca. 50% aller Fälle mutiert. Als typisches Beispiel für p53-mutierte Tumore gelten hochgradig seröse Ovarialkarzinome, welche eine Mutationsrate von nahezu 100% aufweisen (Rivlin et al., 2011). Behandelt werden diese Tumore mittels platin-basierter Chemotherapie. Interessanterweise sprechen diese Tumore initial trotz der hohen p53-Mutationsrate sehr gut auf die Platin-haltige Therapie an. Therapie-refraktäre Tumore treten jedoch in 25% alle Fälle innerhalb von vier Monaten auf (Cancer Genome Atlas Research Network, 2011). Im Gegensatz zu den serösen Ovarialkarzinomen liegt p53 in testikulären Keimzelltumoren nahezu immer in der Wildtyp-Form vor (Heimdal et al., 1993; Peng et al., 1993). Selbst im metastasierten Zustand können diese Tumore durch Cisplatin-basierte Chemotherapie meist vollständig geheilt werden (Bosl and Motzer, 1997; Einhorn, 2002). In vielen anderen Neoplasien wie beispielsweise Lungentumore, welche p53-Mutationen in 50% aller Fälle aufweisen, zeigt Cisplatin nur eine eingeschränkte Wirksamkeit (Cortinovis et al., 2008). Somit werden verschiedenste Tumorentitäten mit unterschiedlichem p53-Status mit ähnlichen Therapieschemata, aber sehr unterschiedlichen Erfolgsraten behandelt. Inwieweit der p53-Status für die Sensitivität von Tumorzellen gegenüber DNA-schädigenden Agenzien wie beispielsweise Cisplatin entscheidend ist, ist bislang nur unvollständig geklärt. Unbestritten ist allerdings, dass die Platin-haltige Therapie mit erheblichen Nebenwirkungen wie Nephrotoxizität, Neurotoxizität und Ototoxizität verbunden ist (Galluzzi et al., 2012). In den letzten Jahren wurden Substanzen entwickelt, welche eine hohe tumorspezifische Toxizität aufweisen, ohne dabei die zytotoxischen Eigenschaften klassischer Chemotherapeutika zu vermitteln. Insbesondere die Entwicklung von Molekülen, welche den in einer Vielzahl von Tumoren veränderten p53- 84 Diskussion Signaltransduktionsweg reaktivieren, war in diesem Zusammenhang von Interesse. Eine dieser p53-reaktivierenden Substanzen ist Nutlin-3. Das cis-Imidazolanalogon bindet Mdm2, wodurch die Akkumulation von p53 und Mdm2 induziert wird (Vassilev et al., 2004). Durch die Behandlung mit Nutlin-3 wird in proliferierenden Zellen ein G1- und G2-Arrests induziert, wohingegen in wtp53-exprimierenden Tumorzellen Apoptose ausgelöst wird (Tovar et al., 2006). Neben Nutlin-3 wurde das ThiophenDerivat RITA, welches sowohl wtp53 als auch mtp53 reaktivieren soll, identifiziert (Issaeva et al., 2004; Zhao et al., 2010a). Im Gegensatz zu Nutlin-3 führt die Behandlung mit RITA zu einer Reduktion von Mdm2 bei gleichzeitiger Stabilisierung von p53, was eine tumorselektive Apoptose auslöst (Goldstein et al., 2011). In der vorliegenden Arbeit sollte nun untersucht werden, inwiefern der p53-Status eine Rolle in der zellulären Reaktion auf die Behandlung mit Nutlin-3, RITA und Cisplatin spielt. Hierzu wurde eine geeignete Zellauswahl verwendet. 4.1 Reaktion von Zellen mit unterschiedlichem p53-Status auf die Behandlung mit Nutlin-3, RITA und Cisplatin Um die Effekte von Nutlin-3, RITA und Cisplatin vergleichen zu können, wurden Zelllinien ausgewählt, die aus unterschiedlichen Tumorentitäten stammen und wtp53 oder mtp53 exprimieren oder den p53-null-Status aufweisen (Tabelle 3.1). Weiterhin wurden Tumor-assoziierte Fibroblasten aus der humanen Lunge und PBMNCs von gesunden Donoren in die Zellauswahl mit einbezogen, um die Tumorlinien mit primären, nichtmalignen Zellen vergleichen zu können. Für die Charakterisierung der Zelllinienauswahl wurde der Zelltod, der Zellzyklus und die Regulation von p53-Zielgenen nach Nutlin-3, RITA und Cisplatin-Behandlung näher untersucht. Die transkriptionelle Aktivität von p53 wurde mit Hilfe eines Hochdurchsatzverfahrens bestimmt, welches die Messung von 48 Genen in 48 Proben simultan ermöglicht. Die Auswahl von 45 bona fide p53-Zielgenen erfolgte hinsichtlich der durch die Gene regulierten zellulären Effekte, wobei insbesondere Gene der Apoptose und des Zellzyklus berücksichtigt wurden (Riley et al., 2008; Wei et al., 2006) (Tabelle 2.2). Die Behandlung mit Nutlin-3 führte ausschließlich in den wtp53-exprimierenden Tumorzelllinien NTERA-2D1 und H460 zu Zelltod (Abbildung 3.1 A). In allen anderen Diskussion 85 wtp53-exprimierenden Tumorzellen sowie in Fibroblasten und PBMNCs wurde ein G1-Arrest induziert. Ein G1-Arrest konnte auch in der Linie H460 nachgewiesen werden, wohingegen NTERA-2D1 Zellen nahezu vollständig in die SubG1-Phase übergingen. Durch die siRNA-vermittelte Depletion von wtp53 konnte der Nutlin-3induzierte Zelltod in NTERA-2D1 Zellen vollständig unterbunden werden (Abbildung 3.5 A). Übereinstimmend mit diesem Ergebnis wurde in einer früheren Studie die hohe Sensitivität der embryonalen Hodenkarzinom-Zelllinie NTERA-2D1 gegenüber Nutlin-3-Behandlung auf eine besonders hohe Empfindlichkeit dieser Zellen gegenüber der Aktivierung von wtp53 zurückgeführt (Gutekunst et al., 2011). Ursprünglich wurde postuliert, dass Nutlin-3 in wtp53-exprimierenden Tumorzellen Apoptose induziert, wohingegen in nichtmalignen Zellen ein Zellzyklusarrest in der G1- und G2-Phase auftritt (Tovar et al., 2006; Vassilev et al., 2004). In der hier untersuchten Zellauswahl konnte in wtp53-exprimierenden Zellen jedoch vorwiegend ein Zellzyklusarrest beobachtet werden, der nicht auf die nichtmalignen Zellen beschränkt war, sondern auch in Tumorzellen auftrat. Dies stimmt mit einer Reihe früherer Studien überein die ebenso belegen, dass eine Vielzahl an Tumorzellen aus unterschiedlichen Entitäten mit wtp53 auf die Behandlung mit Nutlin-3 durch Induktion von Zellzyklusarrest reagieren (Enge et al., 2009; Tovar et al., 2006). Entsprechend führt die Behandlung mit Nutlin-3 zu einer vorwiegenden Regulation von zellzyklusassoziierten p53-Zielgenen (Enge et al., 2009). In der vorliegenden Studie konnte dies durch die Untersuchung der 45 bona fide p53-Zielgene bestätigt werden (Abbildung 3.2). Insbesondere CDKN1A (p21) zeigte eine signifikante Regulation in der Gruppe der wtp53-exprimierenden Zellen (Tabelle 3.2). P21 gilt als Schlüsselprotein bei der Induktion eines p53-abhängigen G1-Arrests (Waldman et al., 1995) und wurde schon in früheren Studien als Mediator des Zellzyklusarrests nach Nutlin-3-Behandlung identifiziert (Tovar et al., 2006; Vassilev et al., 2004). Neben der Induktion eines Zellzyklusarrests kann Nutlin-3 auch zur Induktion von Apoptose in verschiedenen Tumorzelllinien, wie beispielsweise SJSA-1 und MHM führen (Tovar et al., 2006). Die Behandlung mit Nutlin-3 scheint somit abhängig von der intrinsischen Sensitivität von Zellen gegenüber der Aktivierung von wtp53 Zellzyklusarrest oder Apoptose zu induzieren. Durch eine Behandlung mit RITA konnten zwei klar differenzierbare Phänotypen identifiziert werden (Abbildung 3.1 B, 1. Grafik). Eine Gruppe zeigte eine verstärkte 86 Diskussion Apoptose nach RITA-Behandlung (>60% apoptotische Zellen), wohingegen die andere Gruppe eine sehr geringe Reaktion (<15% apoptotische Zellen) auf das p53reaktivierende Molekül zeigte. Innerhalb der Gruppe der RITA-sensitiven Zellen befanden sich sowohl Zellen, welche wtp53 und mtp53 exprimieren, als auch die Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5, welche eine p53-Deletion aufweist. Eine Auswirkung der RITA-Behandlung auf den Zellzyklus konnte in der hier verwendeten Zellauswahl nicht beobachtet werden (Abbildung 3.1 B, 2.-4. Grafik). Interessanterweise wurde durch Zhao et al. vorwiegend in p53-defekten Zellen ein G2-Arrest nach RITA-Behandlung beschrieben und zwar nicht nur in Zellen, die mtp53 exprimieren, sondern auch in den p53-null-Linien HCT116TP53-/-, H1299 und Akata (Zhao et al., 2010a), was auf RITA-vermittelte Effekte unabhängig von p53 hindeutet. Eine mögliche Abhängigkeit der Reaktion nach RITA-Behandlung von wtp53 konnte in der vorliegenden Arbeit durch die siRNA-vermittelte Depletion von wtp53 in der embryonalen Hodenkarzinomlinie NTERA-2D1 nachgewiesen werden (Abbildung 3.5 B). Dies entspricht den bisherigen Studien, welche RITA als wtp53-reaktivierendes Molekül beschreiben (Burmakin et al., 2013; Enge et al., 2009; Grinkevich et al., 2009; Hedström et al., 2009; Issaeva et al., 2004; Rinaldo et al., 2009; Spinnler et al., 2011; Zhao et al., 2010b). Im Vergleich der beiden p53-reaktivierenden Substanzen Nutlin-3 und RITA zeigten sich fundamentale Unterschiede. Die Behandlung mit Nutlin-3 führte zu einem Zellzyklusarrest welcher selektiv in wtp53-exprimierenden Zellen auftrat. Hingegen zeigte die Behandlung mit RITA überwiegend proapoptotische Effekte welche nicht auf wtp53-exprimierende Zellen beschränkt waren. Dies führt zu dem Schluss, dass die Freisetzung von wtp53 aus dem Mdm2-p53 Komplex je nach aktivierender Substanz zu unterschiedlichen, p53-abhängigen Effekten führt. Der molekulare Mechanismus dieser unterschiedlichen Reaktionen konnte kürzlich geklärt werden. Die Bindung von RITA an wtp53 führt zur Freisetzung des aktiven Mdm2 Proteins. Dieses induziert die proteasomale Degradation von p21 und hnRNP-K, welche beide für die Induktion von Zellzyklusarrest essentiell sind (Enge et al., 2009). Zudem wird Mdm2 selbst herunterreguliert, wodurch HIPK2 aktiviert wird, welches p53 an Ser46 phosphoryliert und damit die Induktion von Apoptose fördert (Rinaldo et al., 2009). Die Bindung von Nutlin-3 an Mdm2 hingegen stabilisiert Mdm2 und führt zur Degradation von HIPK2 (Rinaldo et al., 2009). Außerdem wird weder p21, noch hnRNP-K durch Nutlin-3 gebundenes Mdm2 Diskussion 87 proteasomal degradiert (Enge et al., 2009). In Abwesenheit von HIPK2 interagiert wtp53 mit hnRNP-K, wodurch p21 und damit Zellzyklusarrest induziert wird (Rinaldo et al., 2009). Neben der Fähigkeit zur Reaktivierung von wtp53 konnte gezeigt werden, dass die Bindung von RITA an mtp53 einen Teil der wtp53-Funktionen wiederherstellen kann und Zelltod in Abhängigkeit von mtp53 vermittelt wird (Zhao et al., 2010a). Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden, dass eine Behandlung mit RITA zur Induktion von p53-Zielgenen und zur Induktion von Zelltod sowohl p53-abhängig als auch p53-unabhängig führen kann. Interessanterweise zeigten Fibroblasten und PBMNCs keine Reaktion auf die Behandlung mit RITA. Tatsächlich wurde schon in früheren Studien eine geringe Empfindlichkeit von nichtmalignen Zellen gegenüber RITA nachgewiesen (Issaeva et al., 2004; Saha et al., 2010). Ähnliches wurde auch bei der intraperitonealen Administration von RITA in SCID-Mäusen beobachtet. Dabei kam es zu keinem Gewichtsverlust der Mäuse, weshalb eine systemische Toxizität der Substanz wenig wahrscheinlich ist (Burmakin et al., 2013). Bemerkenswert bei der Behandlung mit RITA war das Auftreten von zwei klar differenzierbaren Phänotypen, RITA-sensitive und -insensitive Zellen (Abbildung 3.1 B, 1. Grafik). Eine ähnliche Gruppierung wurde auch innerhalb der Tumorzelllinien des National Cancer Institutes (NCI) nachgewiesen (Rivera et al., 1999). In Nierenkarzinom-Zelllinien wurde gezeigt, dass RITA-sensitive Zelllinien RITA intrazellulär akkumulieren können, wohingegen in RITA-resistenten Zellen nur geringe RITA-Konzentrationen nachweisbar waren (Rivera et al., 1999). Die selektive Akkumulation von RITA könnte somit eine Determinante für das Ansprechen auf RITA-Behandlung sein. Bislang unbekannt ist, welcher Transporter für den Transport von RITA verantwortlich ist. Da zelluläre Transportvorgänge in Tumorzellen oft dereguliert sind, könnten unterschiedlich exprimierte Aufnahme- und Effluxtransporter potentielle Marker für die Sensitivität gegenüber RITA-Behandlung darstellen. So weisen beispielsweise proliferierende Tumorzellen häufig eine Überexpression von Nährstofftransportern auf, um den erhöhten Bedarf an Nährstoffen zu decken (Ganapathy et al., 2009). Ein potentieller Kandidat für den Import von RITA könnte der Glucosetransporters 3 (GLUT3, SLC2A3) sein. Dieser wird in hohem Maße in Tumorzellen, jedoch nur in geringem Maße in nichtmalignen Zellen exprimiert (Yamamoto et al., 1990). Zusammenfassend könnten 88 Diskussion unterschiedlich exprimierte Aufnahme- oder Effluxtransporter potentielle Marker für die RITA-Sensitivität darstellen, welche sowohl p53-abhängig als auch p53unabhängig vermittelt werden kann. Neben den p53-reaktivierenden Substanzen wurde der Effekt des klassischen genotoxischen Agens Cisplatin auf die Zelllinienauswahl näher untersucht. Im Falle der Behandlung mit Cisplatin zeigte sich ein kontinuierliches Spektrum an Sensitivitäten unabhängig vom p53-Status (Abbildung 3.1 C, 1. Grafik). Ein Einfluss von wtp53 auf die Cisplatin-vermittelte Induktion von Zelltod in wtp53exprimierenden Zellen wurde durch den Knockdown von wtp53 in der Zelllinie NTERA-2D1 gezeigt, welcher eine vollständige Inhibition des Zelltods zur Folge hatte (Abbildung 3.5 C). Im Gegensatz zur Behandlung mit RITA wurde durch CisplatinBehandlung Apoptose in PBMNCs induziert. Zudem konnte die Induktion eines S-Phasenarrests nachgewiesen werden, welcher unabhängig von der Sensitivität gegenüber Cisplatin sowie unabhängig vom p53-Status war (Abbildung 3.1 C, 2.-4. Grafik). Möglicherweise ist der in der Zelllinienauswahl auftretende S-Phasenarrest auf die Aktivierung des Fanconi-Anaemia-Signaltransduktionsweges zurückzuführen. So konnten mehrere Arbeitsgruppen belegen, dass ein S-Phasenarrests nach Cisplatin-Behandlung unabhängig von p53 durch die Aktivierung des FanconiAnaemia-Signaltransduktionsweges eingeleitet werden kann (Deans and West, 2011; Sala-Trepat et al., 2000). Die Analyse der Regulation der p53-Zielgene ergab hier, ähnlich wie nach einer Behandlung mit Nutlin-3, eine Gruppierung nach p53-Status (Abbildung 3.4). Jedoch zeigte sich auch in der Gruppe der mtp53-exprimierenden, Cisplatin-sensitiven Zellen eine deutliche Regulation von p53-Zielgenen, wobei hier insbesondere PMAIP1 (NOXA) reguliert wurde (Tabelle 3.6). Kürzlich wurde gezeigt, dass NOXA unabhängig von p53 Apoptose in Ovarialkarzinom-Zelllinien induzieren kann, indem die BAX/SMAC-Achse alteriert wird (Lin et al., 2012). Die Behandlung mit Cisplatin führt somit zu einer p53-abhängigen Regulation von p53-Zielgenen, wobei Zelltod sowohl p53-abhängig als auch p53-unabhängig induziert werden kann. Zusammenfassend führte die Behandlung mit Nutlin-3 ausschließlich in wtp53exprimierenden Zelllinien vorwiegend zu Zellzyklusarrest, welcher mit der Induktion von CDKN1A (p21) einherging. Innerhalb der Zelllinienauswahl konnte durch die Diskussion 89 Behandlung mit RITA oder Cisplatin Apoptose sowohl abhängig als auch unabhängig vom p53-Status induziert werden. Interessanterweise zeigten primäre, nichtmaligne Zellen ausschließlich auf die Behandlung mit RITA keine Reaktion. Somit könnte RITA als potentiell tumorselektive Substanz eine Option darstellen, Tumore mit unterschiedlichem p53-Status zu therapieren. 4.2 RITA und Cisplatin können unabhängig von der p53- Superfamilie Apoptose induzieren Der Tumorsuppressor p53 spielt eine entscheidende Rolle bei der Integration verschiedener Signale und vermittelt die zelluläre Antwort auf verschiedene Stimuli, wie DNA-Schäden und onkogenen Stress. In einer Vielzahl von Tumoren ist die Funktion von p53 entweder durch Mutationen oder durch Defekte in p53regulierenden Signalwegen kompromittiert. Die Identifikation der zur p53- Superfamilie gehörigen Proteine p63 und p73 führte zu der Annahme, dass die drei Gene überlappende Funktionen in humanen Tumoren aufweisen (Melino et al., 2003; Yang and McKeon, 2000). Im Gegensatz zu p53 treten Mutationen in p63 oder p73 nur sporadisch auf, weshalb p63 und p73 potentiell Funktionen von p53 übernehmen können (Hagiwara et al., 1999; Melino et al., 2002; Sunahara et al., 1999). Insbesondere die Homologien in der DNA-Bindedomäne und der Oligomerisierungsdomäne deuten auf die Regulation einer gemeinsamen Gruppe von Genen hin (Deyoung and Ellisen, 2007). 4.2.1 RITA und Cisplatin können im p53-defekten System unabhängig von der p53-Superfamilie Zelltod induzieren In der vorliegenden Studie konnte die Sensitivität von der wtp53-exprimierenden Zelllinie NTERA-2D1 nach Nutlin-3-, RITA- und Cisplatin-Behandlung auf die Aktivierung von wtp53 zurückgeführt werden. Jedoch konnte Zelltod nach RITA- und Cisplatin-Behandlung auch in Systemen mit defektem p53 nachgewiesen werden. Somit stellte sich die Frage, inwiefern mtp53 oder p63 bzw. p73 den Zelltod in den p53-defekten Zelllinien OVCAR3, OVCAR4 und OVCAR5 vermitteln. Der Knockdown von mtp53 in den hier untersuchten Zelllinien hatte keinen Einfluss auf die Induktion 90 Diskussion von Zelltod nach RITA- (Abbildung 3.7) oder Cisplatin-Behandlung (Abbildung 3.19). Ebenso hatte die siRNA-vermittelte Depletion von mtp53 keinen Einfluss auf die Regulation der p53-Zielgene nach RITA- oder Cisplatin-Behandlung. Bekanntermaßen kann es zu Interaktionen zwischen mtp53 und p63 oder p73 kommen (Li and Prives, 2007; Melino, 2011). Jedoch hatte weder der Knockdown von p63 noch der von p73 einen Einfluss auf den Zelltod nach RITA(Abbildung 3.8 und 3.9 A und B) oder Cisplatin-Behandlung (Abbildung 3.20). Auch der Doppelknockdown von p63 und p73 in der p53-null Ovarialkarzinomlinie OVCAR5 führte zu keiner Hemmung des Zelltods nach RITA-Behandlung (Abbildung 3.9 C). Ebenso unbeeinflusst blieben die durch RITA differentiell regulierten p53Zielgene. Ähnliches ergab sich durch den Dreifachknockdown von mtp53, p63 und p73 in der Zelllinie OVCAR4 nach Cisplatin-Behandlung (Abbildung 3.21). Somit scheinen sowohl RITA als auch Cisplatin Effekte unabhängig von der p53Superfamilie vermitteln zu können. Im Falle von RITA wird eine mögliche Wirkung unabhängig von der p53-RITAInteraktion durch die Induktion von Apoptose in der p53-null-Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5 unterstrichen (Abbildung 3.1 B, 1. Grafik). Ein RITA-vermittelter Zelltod wurde auch von Di Conza und Mitarbeiter in der p53-null-Ewig-Sarkom-Zelllinie Sk-N-MC beschrieben (Di Conza et al., 2012). Somit gibt es offensichtlich Effekte von RITA, die von einer direkten p53-RITA-Interaktion unabhängig sind. Ursprünglich wurde RITA in einem Drug-Screening Verfahren identifiziert, in welchem spezifisch nach p53-interagierenden Substanzen gesucht wurde (Issaeva et al., 2004). Hierfür wurde die wtp53-exprimierende Zelllinie HCT116TP53+/+ und die p53-null-Linie HCT116TP53-/- verwendet (Issaeva et al., 2004). Beide Zelllinien wurden mit der Substanzbibliothek des National Cancer Institutes behandelt und die Inhibition der Proliferation mittels WST-1-Assay gemessen (Issaeva et al., 2004). RITA (NSC652287) führte hierbei selektiv in der wt53-exprimierenden Linie HCT116TP53+/+ zur Inhibition der Proliferation (Issaeva et al., 2004). Die direkte Interaktion von RITA mit wtp53 wurde anschließend mittels Fluoreszenz- Korrelations-Spektroskopie nachgewiesen (Issaeva et al., 2004). Auf Grund dieser Ergebnisse wurde die Bindung von RITA an wtp53 als zentral für die anti-proliferative Aktivität von RITA betrachtet. Das in dieser Studie verwendete Verfahren schließt jedoch nicht aus, dass RITA neben p53 auch andere zelluläre Mechanismen Diskussion 91 beeinflusst und Zelltod abhängig vom zellulären Hintergrund, aber unabhängig von p53, induziert. Interessanterweise konnte auch eine direkte Interaktion von RITA mit p53 in nachfolgenden Untersuchungen der p53-RITA-Interaktion mittels NMR und computerbasierten Docking-Studien nicht reproduziert werden (Espinoza-Fonseca, 2005; Krajewski et al., 2005). Mögliche Mechanismen, wie RITA unabhängig von der direkten Interaktion mit p53 wirken kann, wurden von mehreren Arbeitsgruppen beschrieben. So konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit RITA die Phosphorylierung von H2AX induziert, wodurch eine DNA-Schadensantwort ausgelöst wird (Ahmed et al., 2011; Yang et al., 2009a, 2009b). Weiterhin führt die Behandlung mit RITA zu DNA-DNA- sowie zu DNA-Protein-Quervernetzungen welche mit der Induktion von Zelltod in Nierenkarzinom-Zelllinien korrelieren (Nieves-Neira et al., 1999). Zudem wurde eine direkte Bindung von RITA an die Thioredoxinreduktase 1 (TrxR1) nachgewiesen, wodurch ROS induziert wurden (Hedström et al., 2009). Somit ist es möglich, dass RITA in der hier verwendeten Zelllinienauswahl Zelltod, sowie die Induktion von p53Zielgenen unabhängig von mtp53 vermittelt. Interessanterweise scheint es aber durchaus mtp53-exprimierende Tumorzelllinien zu geben, bei denen der RITA-vermittelte Zelltod zumindest teilweise von mtp53 abhängig ist. So kann der Zelltod nach RITA-Behandlung durch die siRNA-vermittelte Depletion von p53R273H in der epidermoiden Karzinomzelllinie A431 partiell reduziert werden (Zhao et al., 2010a). In den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Ovarialkarzinom-Zelllinien OVCAR3 (p53R248Q) und OVCAR4 (p53L130V) führte der Knockdown von mtp53 hingegen zu keiner Hemmung des RITA-induzierten Zelltods (Abbildung 3.7). In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit RITA eine Aktivierung des JNK-Signaltransduktionswegs mit anschließender Aktivierung von wtp53 zur Folge hat (Saha et al., 2012). Aktiviertes wtp53 verstärkt nun in einem positiven feedback-loop die Aktivität von JNK (Saha et al., 2012). Eine zentrale Kinase im JNK-Signaltransduktionsweg ist MAP2K3. Gurtner et al. konnten zeigen, dass die p53-Mutanten p53R273H, p53R175H und p53R280K die Expression des MAP2K3 Proteins induzieren (Gurtner et al., 2010). Die in der Studie von Zhao et al. verwendete Zelllinie A431, weist die p53-Mutation p53R273H auf (Zhao et al., 2010a), welche MAP2K3 induzierten kann. Somit könnte die verstärkte Aktivierung des JNK-Signaltransduktionsweges durch mtp53 in dieser Linie die partielle Abhängigkeit des Zelltods von mtp53 erklären. Interessanterweise weisen 92 Diskussion die RITA-sensitiven, mtp53-exprimierenden Zellen, in der vorliegenden Arbeit andere Mutationen (OVCAR3: p53R248Q, OVCAR4: p53L130V) auf. Durch eine mtp53unabhängige Aktivierung des JNK-Signaltransudktionsweges ist es möglich, dass diese Zellen auch unabhängig von mtp53 durch RITA-Behandlung Zelltod induzieren können. Tatsächlich wurde bereits durch mehrere Arbeitsgruppen beschrieben, dass unterschiedliche p53-Mutationen zu unterschiedlichen Phänotypen führen können. Die p53-Mutante p53R248Q, nicht aber p53R248W, erhöht die Invasivität der Lungenkarzinom-Zelllinie H1299 (Yoshikawa et al., 2010). Weiterhin wurde gezeigt, dass Zellen welche p53R175H exprimieren ein erhöhte Metastasierungsrate aufweisen (Liu et al., 2000), wohingegen in Tumorzellen mit p53R175P Zellzyklusarrest induziert wird (Rowan et al., 1996). Zudem wurde bei Brustkrebspatienten eine signifikante Korrelation zwischen einer schlechten Prognose und dem Auftreten von der missense-Mutation p53R248W und Mutationen im Codon 179 nachgewiesen (Olivier et al., 2006). Ähnlich den unterschiedlichen Phänotypen, welche durch unterschiedliche p53-Mutationen vermittelt werden, könnte eine Behandlung mit RITA in Zellen mit unterschiedlichen p53-Mutationen zu mtp53-abhängigen oder mtp53-unabhängigen Effekten führen. Ähnlich wie nach der Behandlung mit RITA, konnte auch der Zelltod nach CisplatinBehandlung nicht durch einen Knockdown von mtp53 in den OvarialkarzinomZelllinien OVCAR3 und OVCAR4 reduziert werden. Dementsprechend konnte auch in Nierenkarzinom- und Osteosarkom-Zelllinien eine p53-unabhängige Induktion von Apoptose nach Cisplatin-Behandlung nachgewiesen werden (Cummings and Schnellmann, 2002; Woessmann et al., 2002). Interessanterweise interagiert nur ein keiner Anteil des intrazellulären Cisplatins mit der chromosomalen DNA, wodurch die Inhibition der Replikation nur einen Teil der durch Cisplatin vermittelten Reaktionen darstellen könnte (Eastman, 1990). Dies bestätigte sich durch eine Studie mit entkernten humanen Zellen, in welchen Cisplatin Zelltod induzierte, der unabhängig von DNA-Schäden und unabhängig vom p53-Status war (Mandic et al., 2003). Durch die elektrophilen Eigenschaften des aktiven Cisplatin-Moleküls kommt es neben der Interaktion mit der DNA auch zu Cisplatin-Protein-Interaktionen (Karasawa et al., 2013). Beispielsweise bindet Cisplatin bevorzugt an einen spannungsabhängigenAnionenkanal in der mitochondrialen Membran, wodurch es zur Freisetzung von Diskussion 93 Cytochrom C kommt und p53-unabhängig Apoptose induziert wird (Yang et al., 2006). 4.2.2 RITA und Cisplatin können Zelltod im p53-defekten System durch die Induktion von mitochondrialer Apoptose induzieren Die Abhängigkeit des durch RITA und Cisplatin induzierten Zelltods in p53-defekten Zelllinien konnte auf die Aktivierung von Caspasen zurückgeführt werden (Abbildung 3.10 und Abbildung 3.22). Übereinstimmend mit diesem Ergebnis, wurde bereits mehrfach die Aktivierung von Caspasen als Grundlage des RITA- und Cisplatinvermittelten Zelltods in wtp53 und mtp53-exprimierenden Zellen nachgewiesen (Gutekunst et al., 2011; Jiang et al., 2009; Saha et al., 2010; Zhao et al., 2010a, 2010b). In der vorliegenden Arbeit führte zudem die siRNA-vermittelte Depletion der pro-apoptotischen Effektorproteine BAX und BAK zu einer vollständigen Inhibition der durch RITA (Abbildung 3.11) oder Cisplatin induzierten (Abbildung 3.23) Apoptose. Dies deutet auf die Aktivierung des intrinsischen Apoptoseweges sowohl nach RITA- als auch nach Cisplatin-Behandlung hin. Neben der Wichtigkeit der intrinsischen Apoptose wird auch eine Aktivierung der extrinsischen Signalkaskade mittels Caspase8-Inhibitor beschrieben (Paul et al., 2012; Saha et al., 2010). Die Interaktion des extrinsischen mit dem intrinsischen Signalweg erfolgt durch die Caspase8-vermittelte Proteolyse des pro-apoptotischen Bcl-2-Proteins BID. Die trunkierte Form tBID induziert ihrerseits die Freisetzung von Cytochrom C aus der mitochondrialen Membran und stellt damit die Verbindung zwischen extrinsischer und intrinsischer Signaltransduktion dar (Tait and Green, 2010). Würde eine Behandlung mit RITA oder Cisplatin zu einer Aktivierung der extrinsischen Signalkaskade in OVCAR4 oder OVCAR5 Zellen führen, würde die siRNA-vermittelte Depletion von BAX und BAK nur eine partielle Inhibition der Apoptose zur Folge haben. Da es jedoch zu einer vollständigen Hemmung des Zelltods nach RITA- und Cisplatin-Behandlung kommt, ist nicht von einer Aktivierung der extrinsischen Signalkaskade auszugehen. Als zentrale Regulatoren der mitochondrialen Apoptose gelten die Proteine der Bcl-2Familie. Sowohl in RITA- als auch in Cisplatin-sensitiven Zelllinien zeigte sich bei der Analyse der p53-Zielgene eine signifikante Regulation der pro-apoptotischen BH3only-Gene BBC3 (PUMA) und PMAIP1 (NOXA) (Tabelle 3.4 und 3.6). Der 94 Diskussion Knockdown dieser Gene zeigte jedoch keinen Effekt auf den RITA-induzierten Zelltod in der mtp53-exprimierenden Zelllinie OVCAR4 (Abbildung 3.12). Auch die siRNA-vermittelte Depletion anderer prominenter BH3-only-Proteine konnte den RITA-vermittelten Zelltod nicht verringern. Zudem zeigten weder NOXA noch PUMA oder andere BH3-only-Proteine eine Hochregulation auf Proteinebene. Auf Grund dessen scheinen die hier untersuchten pro-apoptotischen BH3-only-Proteine keine Rolle für den RITA-induzierten Zelltod zu spielen. Neben der signifikanten Regulation der pro-apoptotischen Gene zeigte sich auch eine starke Herunterregulation des antiapoptotischen Gens Bcl-2 (Tabelle 3.4). Diese Regulation wurde bereits in wtp53exprimierenden Zellen nachgewiesen (Grinkevich et al., 2009). Auf Proteinebene konnte die Herunterregulation von Bcl-2 in der Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR4 bestätigt werden (Abbildung 3.13 A). Übereinstimmend mit früheren Studien in wtp53- und mtp53-exprimierenden Zelllinien (Burmakin et al., 2013; Grinkevich et al., 2009; Saha et al., 2010, 2012; Zhao et al., 2010a) führte eine Behandlung mit RITA auch zu einer Herunterregulation des Mcl-1 Proteins in den OvarialkarzinomZelllinien OVCAR4 und OVCAR5 (Abbildung 3.13 A). Zudem wurde Bcl-xL in der Zelllinie OVCAR4 herunterreguliert. Somit erfolgt nach RITA-Behandlung die Herunterregulation von mindestens einem anti-apoptotischen Bcl-2-Protein. Obwohl auf Proteinebene keine Hochregulation von pro-apoptotischen BH3-only-Proteinen auftritt (Abbildung 3.12), kommt es deshalb zu einer Verschiebung des Gleichgewichts aus pro- und anti-apoptotischen Proteinen zu Gunsten der proapoptotischen. Jedoch führte die siRNA-vermittelte Depletion von NOXA nicht zu einer Inhibition der RITA-vermittelten Apoptose in der Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR4 (Abbildung 3.12). In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde postuliert, dass BAX und BAK durch anti-apoptotische Bcl-2-Proteine gebunden werden und dadurch MOMP inhibiert wird (Willis et al., 2007). Die Bindung pro-apoptotischer BH3-only-Proteine an die anti-apoptotischen Familienmitglieder führt zur Freisetzung von BAX und BAX, wodurch Cytochrom C freigesetzt wird (Willis et al., 2007). Da die Behandlung mit RITA zu einer Herunterregulation anti-apoptotischer Bcl-2-Proteine führt, kann es somit zu einer Freisetzung von BAX und BAK mit anschließender Freisetzung von Cytochrom C kommen, ohne dass pro-apoptotische BH3-onlyProteine involviert werden. Zudem ist es möglich, dass der Knockdown eines einzelnen BH3-only-Proteins ungenügend ist, um die Inhibition von BAX und BAK durch anti-apoptotische Bcl-2-Proteine zu unterbinden. Dementsprechend wurde in Diskussion 95 einer früheren Studie gezeigt, dass ein Doppelknockdown von PUMA und NOXA, zu einer partiellen Hemmung der durch RITA vermittelten Apoptose führte (Enge et al., 2009). Die Wichtigkeit des Verhältnisses Mcl-1:NOXA wurde durch den synergistischen Effekt von ABT-737 in RITA-sensitiven, p53-defekten Zellen, bestätigt (Abbildung 3.13 B). Die Sensitivität von Zellen gegenüber ABT-737 wird durch das Proteinlevel von Mcl-1 bestimmt (van Delft et al., 2006; Konopleva et al., 2006; Tromp et al., 2012; Yecies et al., 2010). Da nach RITA-Behandlung Mcl-1 reduziert und das Proteinlevel von NOXA unbeeinflusst bleibt, könnte dies die Hypersensitivität gegenüber Kombinationsbehandlung mit ABT-737 erklären. Interessanterweise konnte der synergistische Effekt ausschließlich in RITAsensitiven Zellen beobachtet werden. In Tumorzelllinien mit geringer RITASensitivität sowie in PBMNCs zeigte die Kombinationsbehandlung mit ABT-737 keinen verstärkten Zelltod. Dies deutet erneut darauf hin, dass die intrazelluläre Konzentration von RITA in RITA-insensitiven Zellen möglicherweise nicht ausreicht, um einen Koeffekt mit ABT-737 auslösen zu können. Wie bereits erwähnt, könnte ein vermehrter Import oder reduzierter Efflux von RITA in RITA-sensitiven Zellen, eine mögliche Determinante für das Ansprechen auf RITA und damit für den synergistischen Effekt mit ABT-737 sein. Im Gegensatz zur Behandlung mit RITA kommt es nach Cisplatin-Behandlung durch den Knockdown von PMAIP1 (NOXA) und BBC3 (PUMA) zu einer signifikanten Hemmung des Zelltods in der mtp53-exprimierenden Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR4 (Abbildung 3.24). Zudem führte die Behandlung mit Cisplatin in Cisplatinsensitiven Zellen zu einer Induktion von PMAIP1 (NOXA) und BBC3 (PUMA) sowohl auf Gen-, als auch auf Proteinebene. Im Falle einer Behandlung mit RITA zeigte sich eine Induktion von PMAIP1 (NOXA) und BBC3 (PUMA) nur auf Genebene, nicht aber auf Proteinebene, weshalb der Knockdown von PMAIP1 (NOXA) und BBC3 (PUMA) keinen Einfluss auf die Induktion von Zelltod haben könnte. Bei der Betrachtung der konstitutiven Level der Bcl-2-Proteine innerhalb der Zelllinienauswahl erwies sich das Verhältnis aus pro- und anti-apoptotischen Bcl-2Proteinen als prädiktiv für das Ansprechen auf Cisplatin (Abbildung 3.26). Für eine Behandlung mit RITA konnte eine derartige Korrelation nicht nachgewiesen werden (Abbildung 3.26 B). Die konstitutiven Proteinlevel von NOXA und Bcl-w konnten als 96 Diskussion prädiktiv für das Ansprechen auf Cisplatin innerhalb der Zellauswahl identifiziert werden (Abbildung 3.28). Die wichtige Rolle der konstitutiven Proteinlevel der Bcl-2-Proteinfamilie für das Ansprechen auf Chemotherapie wurde kürzlich in mehreren Studien gezeigt (Ni Chonghaile et al., 2011; Vo et al., 2012). Hierbei bestimmt die zelluläre Ausstattung mit anti-apoptotischen Proteinen den apoptotischen Schwellenwert der Zellen, was als mitochondrial-priming bezeichnet wird (Ni Chonghaile et al., 2011). Die Inhibition der anti-apoptotischen Proteine in diesen Zellen führt zur BAX/BAK Oligomerisierung sowie zur Freisetzung von Cytochrom C (Certo et al., 2006). Interessanterweise wurden in der vorliegenden Arbeit NOXA und Bcl-w als prädiktiv für die Cisplatin-Sensitivität identifiziert. Die Modulation dieser Proteine könnte eine Möglichkeit darstellen, Cisplatin-insensitive Zellen in einen geprimten Zustand zu überführen, um anschließend durch die Gabe von Cisplatin Apoptose zu induzieren. Kürzlich wurde gezeigt, dass der Proteasomeninhibitor Bortezomib zu einer Akkumulation von NOXA führt (Dengler et al., 2014; Pérez-Galán et al., 2006). Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen konnte in der Cisplatin-insensitiven Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR8 NOXA durch Behandlung mit Bortezomib akkumuliert werden (Abbildung 3.29). Die Behandlung mit Bortezomib alleine führte nicht zur Induktion von Zelltod. Apoptose wurde erst durch die Kombinationsbehandlung von Bortezomib mit Cisplatin induziert. Somit überführt die Behandlung mit Bortezomib die Zellen in einen „geprimten“ Zustand, in welchem Apoptose durch Zugabe von Cisplatin induziert werden kann. Ähnliches konnte durch die Inhibition von Bcl-w erreicht werden. Das anti-apoptotische Bcl-2-Protein Bcl-w wurde schon frühzeitig als wichtiger Mediator von Apoptose nach der Behandlung mit DNA-schädigenden Agenzien identifiziert (Pritchard et al., 2000). Der Knockdown von Bcl-w in Cisplatin-insensitiven Zellen führte zu einer signifikanten Induktion von Zelltod nach Cisplatin-Behandlung (Abbildung 3.30 A). Zudem konnten die Cisplatininsensitiven Ovarialkarzinom-Zelllinien OVCAR8 und SKOV3 durch die Kombinationsbehandlung von Cisplatin mit ABT-737 sensitiviert werden (Abbildung 3.30 B). Ähnlich der Akkumulation von NOXA überführte die Reduktion oder Inhibition von Bcl-w die Cisplatin-insensitiven Zellen in einen „geprimten“ Zustand, in welchem nun Apoptose durch die Gabe von Cisplatin induziert werden konnte. Kürzlich wurde gezeigt, dass neben der Hemmung der anti-apoptotischen Proteine Bcl-w, Bcl-2 und Bcl-xL die Behandlung mit ABT-737 auch eine Modulation der Diskussion 97 Mcl1/NOXA-Achse in Ovarialkarzinom-Zelllinien zur Folge hat (Simonin et al., 2013). Dies war auf die Reduktion von Mcl-1 und die Akkumulation von NOXA zurückzuführen, wodurch sich das Mcl-1:NOXA Verhältnis zu Gunsten des proapoptotischen Proteins verschiebt (Simonin et al., 2013). ABT-737 ist damit eine Substanz, welche Zellen in einen „geprimten“ Zustand überführen kann. Zusammenfassend konnten NOXA und Bcl-w als zentrale Determinanten der Cisplatin-Sensitivität innerhalb der Zelllinienauswahl identifiziert werden. Die pharmakologische Modulation dieser Komponenten durch Proteasomeninhibitoren oder BH3-mimetics, könnte die Behandlung Cisplatin-refraktärer Tumore ermöglichen. 4.3 RITA kann durch die Aktivierung von JNK und p38 Zelltod im p53-defekten System induzieren In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass RITA neben den bekannten p53abhängigen Effekten (Burmakin et al., 2013; Enge et al., 2009; Grinkevich et al., 2009; Hedström et al., 2009; Issaeva et al., 2004; Rinaldo et al., 2009; Spinnler et al., 2011; Zhao et al., 2010a, 2010b) auch unabhängig von p53 Signalwege aktivieren kann, welche zu Apoptose führen. Ungeklärt war jedoch, welche Signalwege durch RITA-Behandlung in p53-defekten Systemen aktiviert werden. Um beteiligte Wege zu identifizieren, wurde eine genomweite Transkriptionsanalyse in der RITA-sensitiven p53-null-Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR5 durchgeführt. Hierbei konnte unter anderem die RITA-Behandlung Aktivierung des nachgewiesen MAP-Kinase-Signaltransduktionswegs werden (Abbildung 3.14). Der nach MAPK- Signaltransduktionsweg wird in drei Untergruppen, den ERKs (extracellular-signalregulated kinases), JNKs (Jun amino-terminal kinases), und p38 MAPKs (stressactivated protein kinases) unterteilt (Kyriakis and Avruch, 2001; Weston and Davis, 2002). Bei der Induktion von Apoptose spielen vorwiegend JNK und p38 eine zentrale Rolle (Wagner and Nebreda, 2009). Die Aktivierung von JNK und p38 erfolgt durch eine Vielzahl von apoptotischen Stimuli, wie ROS (Lee et al., 2002; Shen and Liu, 2006), UV- und ionisierende Strahlung (Adler et al., 1995; Hara et al., 1998; Kumar et al., 2004; Shimizu et al., 1999), Cisplatin (Mansouri et al., 2003; SánchezPerez et al., 1998) und ER-Stress (Lee et al., 2011; Wang and Ron, 1996). Kürzlich 98 Diskussion wurde in Zelllinien des Multiplen Myeloms gezeigt, dass auch RITA JNK aktivieren und dadurch einen wtp53-abhängigen Zelltod induzieren kann (Saha et al., 2012). Da in der p53-null-Linie OVCAR5 die Aktivierung des MAPK-Signaltransduktionsweges nachgewiesen wurde, könnte JNK auch in p53-defekten Systemen eine wichtige Rolle bei der RITA-vermittelten Induktion von Apoptose spielen. Tatsächlich konnte durch die pharmakologische Inhibition von JNK und p38 (Abbildung 3.16) sowie durch Knockdown von JNK1 (Abbildung 3.17) die Wichtigkeit dieser MAP-Kinasen für die Induktion von Apoptose im p53-defekten System nachgewiesen werden. Welche übergeordneten Signalwege die Aktivierung von JNK und p38 zur Folge haben ist bisher nicht geklärt. Wie bereits erwähnt, kann es durch eine Behandlung mit RITA zur Induktion von DNA-Schäden kommen. Neben diesen potentiell DNAschädigenden Eigenschaften von RITA (de Lange et al., 2012; Nieves-Neira et al., 1999; Yang et al., 2009a, 2009b) konnte in der vorliegenden Arbeit die Herunterregulation von wichtigen Reparaturgenen in RITA-sensitiven Zellen beobachtet werden (Abbildung 3.14, Tabelle 3.8). Dass die Induktion von DNASchäden sowie kompromittierte DNA-Reparaturmechanismen zur Aktivierung von JNK und p38 führen, ist bekannt. So führt beispielsweise UV-Strahlung zu einer von DNA-Schädigung abhängigen JNK-Aktivierung (Hamdi et al., 2005). Nach Behandlung mit RITA kommt es in den hier untersuchten Zelllinien durch die Aktivierung von JNK und p38 zur Phosphorylierung von c-Jun in mtp53- und p53null-Zellen (Abbildung 3.16 und 3.17). Die Mitglieder der Jun-, Fos-, ATF- und MAFF-Proteinfamilien bilden die Hauptkomponenten des dimeren AP-1- Transkriptionsfaktorkomplexes (Eferl and Wagner, 2003). Insbesondere die durch JNK vermittelte Phosphorylierung von c-Jun führt zu einer Verstärkung der transkriptionellen Aktivität des AP-1 Komplexes (Hibi et al., 1993). Neben der Phosphorylierung von c-Jun konnte die transkriptionelle Induktion von Fos und ATF3 nach RITA-Behandlung nachgewiesen werden (Tabelle 3.4). Jedoch konnte die durch RITA induzierte Apoptose durch die siRNA-vermittelte Depletion von ATF3, FOS oder c-Jun nicht gehemmt werden (Abbildung 3.18). Der Knockdown von ATF3 führte im Gegenteil zu einer Verstärkung der RITA-vermittelten Apoptose (Abbildung 3.18 A). Eine ähnlich protektive Rolle von ATF3 für die Induktion von Apoptose wurde in kardialen Myozyten nachgewiesen (Nobori et al., 2002). Die siRNAvermittelte Depletion von JNK, einem zentralen Aktivator von AP-1 und weiteren Transkriptionsfaktoren wie beispielsweise c-Myc (Noguchi et al., 1999), veränderte Diskussion 99 das Ansprechen der Zellen auf RITA-Behandlung, nicht aber die Regulation der p53Zielgene. Somit scheint die transkriptionelle Regulation dieser Gene nicht für den RITA-vermittelten Zelltod bestimmend zu sein. Neben der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie AP-1 und p53 durch Phosphorylierung können JNK und p38 auch ans Mitochondrium translozieren und dort direkt pro- und anti-apoptotische Bcl-2-Proteine modulieren (Wagner and Nebreda, 2009). Beispielsweise kann JNK durch die Aktivierung des TNFα-Signalweges die Capase8-unabhängige Spaltung von BID zu jBID (21 kDa) vermitteln (Deng et al., 2003). Dieses transloziert zum Mitochondrium, wodurch präferentiell Smac/DIABLO freigesetzt wird, welches seinerseits den TRAF2-cIAP1 Komplex trennt und Apoptose induziert wird (Deng et al., 2003). Weiterhin wurde BAD als Substrat von JNK und p38 identifiziert (Donovan et al., 2002; Grethe and Pörn-Ares, 2006). Die Phosphorylierung von BAD führt zur Inhibition der Interaktion mit 14-3-3 Proteinen, wodurch anti-apoptotische Bcl-2Proteine antagonisiert werden und Zelltod vermitteln wird (Wang et al., 2007). In den hier untersuchten Zelllinien konnte eine Beteiligung von BID oder BAD bei der RITAinduzierten Apoptose mittels siRNA-vermittelter Knockdownexperimente nicht nachgewiesen werden (Abbildung 3.12). Die Aktivierung von BID und BAD erfolgt durch posttranslationale Modifikationen. Diese Regulationsmechanismen können auch bei sehr geringen Konzentrationen des Zielproteins große Effekte hervorrufen. Möglicherweise ist somit die unvollständige siRNA-vermittelte Depletion dieser BH3only-Proteine unzureichend um pro-apoptotische Effekte zu inhibieren. Neben der Phosphorylierung von pro-apoptotischen Bcl-2-Proteinen wurde gezeigt, dass Bcl-2 und Bcl-xL sowohl durch JNK als auch durch p38 phosphoryliert werden, wodurch deren anti-apoptotische Aktivität supprimiert wird (Basu and Haldar, 2003; De Chiara et al., 2006; Grethe et al., 2004; Srivastava et al., 1999; Yamamoto et al., 1999). Im Falle von Bcl-xL wurde zudem die Initiation der Degradation durch die p38abhängige Phosphorylierung nachgewiesen (Grethe et al., 2004) In den in der vorliegenden Studie untersuchten p53-defekten Zelllinien kam es durch die Behandlung mit RITA zu einer Herunterregulation anti-apoptotischer Bcl-2Proteine (Abbildung 3.13). Somit könnte die Aktivierung von JNK und p38 zur Phosphorylierung von Bcl-2 oder Bcl-xL führen, wodurch Apoptose unabhängig von p53 und unabhängig von der transkriptionellen Aktivität von AP-1 induziert wird. 100 Diskussion 4.4 Fazit und Ausblick In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des p53-Status für die Sensitivität von Zellen nach der Aktivierung von p53 durch das DNA-schädigende Agens Cisplatin sowie durch die spezifischen p53-Aktivatoren Nutlin-3 und RITA näher untersucht. Hierfür wurden Zelllinien aus verschiedenen Entitäten mit unterschiedlichem p53Status sowie Tumor-assoziierte Fibroblasten aus der humanen Lunge und PBMNCs von gesunden Donoren verwendet. Die Aktivierung von p53 durch Nutlin-3 führte selektiv in wtp53-exprimierenden Zellen zur Induktion eines G1-Arrests, beziehungsweise zu Zelltod in der Zelllinie NTERA-2D1. Die Induktion von Zelltod konnte auf die Aktivierung von wtp53 zurückgeführt werden. In Zelllinien, welche einen G1-Arrest induzierten, kam es zu einer signifikanten Hochregulation von CDKN1A (p21), einem typischen Mediator des Zellzyklusarrests. Neben den Effekten in Tumorzellen, wurde durch Nutlin-3 auch in Fibroblasten und PBMNCs ein G1-Arrest induziert. Nutlin-3 führt somit selektiv in wtp53-exprimierenden Zellen zu Effekten, ist dabei aber nicht tumorselektiv. Durch die Behandlung mit Cisplatin wurde nicht nur in wtp53-exprimierenden Tumorzellen, sondern auch in Zellen mit mutiertem p53 sowie in PBMNCs Zelltod induziert. Die durch Cisplatin-Behandlung induzierte mitochondriale Apoptose in den Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 war jedoch unabhängig von mtp53 sowie von p63 und p73. Die Genexpressionsanalyse von p53-Zielgenen zeigte nach CisplatinBehandlung eine Gruppierung nach p53-Status. Jedoch wurden auch in der Gruppe der mtp53-exprimierenden, Cisplatin-sensitiven Zellen, mehrere Gene signifikant reguliert. Darunter befand sich das pro-apoptotische BH3-only-Gen PMAIP1 (NOXA), welches zusammen mit BBC3 (PUMA) zentral bei der Induktion von Zelltod in der mtp53-exprimierenden Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR4 nach Cisplatin- Behandlung war. Die Analyse der konstitutiven Proteinexpression von pro- und antiapoptotischen Bcl-2-Proteinen in der gesamten Zelllinienauswahl zeigte, dass NOXA und Bcl-w prädiktiv für das Ansprechen von Cisplatin in der Zelllinienauswahl sind. Dies eröffnete die Möglichkeit, diese Faktoren in Cisplatin-insensitiven Zellen zu modulieren, um Zelltod zu induzieren. So führte die Akkumulation von NOXA durch Bortezomib in der mtp53-exprimierenden Ovarialkarzinom-Zelllinie OVCAR8 zu einer Sensitivierung gegenüber Cisplatin. Weiterhin konnte durch die Inhibition von Bcl-w durch RNAi sowie durch die Behandlung mit dem BH3-mimetic ABT-737 eine Diskussion 101 Sensitivierung der Ovarialkarzinom-Zelllinien OVCAR8 und SKOV3 gegenüber Cisplatin induziert werden. Zur Validierung von NOXA und Bcl-w als prädiktiven Marker der Cisplatin-Sensitivität sollte in weiterführenden, retrospektiven Studien deren Proteinlevel in einem geeigneten Patientenkollektiv näher untersucht werden. Die Behandlung mit RITA führte in RITA-sensitiven Zellen unabhängig vom p53Status zur Induktion von mitochondrialer Apoptose. Eine Regulation von p53Zielgenen erfolgte selektiv in RITA-sensitiven Zellen. Grundsätzlich konnten die Zellen sehr klar in zwei Gruppen, RITA-sensitiv und RITA-insensitiv, untergliedert werden. Diese Untergliederung war vollständig unabhängig vom p53-Status. Die Induktion von Apoptose in der wtp53-exprimierenden Linie NTERA-2D1 konnte auf die Aktivierung von wtp53 zurückgeführt werden. Dagegen war die in den mtp53exprimierenden Zelllinien OVCAR3 und OVCAR4 induzierte Apoptose unabhängig von mtp53. Zudem wurde in der p53-null-Linie OVCAR5 eine Induktion von Zelltod nach RITA-Behandlung festgestellt. Dieser war unabhängig von p63 und p73. Somit kann RITA auch unabhängig von der p53-Superfamilie Zelltod induzieren. Die Induktion von mitochondrialer Apoptose in p53-defekten Zellen konnte auf die Aktivierung des JNK- und p38-Signaltransduktionswegs zurückgeführt werden. Interessanterweise konnte in einer früheren Arbeit eine Abhängigkeit der RITA vermittelten Apoptose von mtp53 festgestellt werden (Zhao et al., 2010a). Die in dieser Arbeit verwendete Zelllinie weist eine p53-Mutation auf, von welcher gezeigt wurde, dass sie die MAP-Kinase MAP2K3 induzieren kann (Gurtner et al., 2010). Dadurch könnte eine Verbindung zwischen der Aktivierung von JNK und mtp53 bestehen. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zelllinien wiesen distinkte p53Mutationen auf, wodurch die Aktivierung von JNK auch unabhängig von mtp53 erfolgen kann. Durch die Verwendung einer p53-null-Zelllinie in welche unterschiedliche p53-Mutanten stabil transfiziert werden, könnten p53-Mutationen identifiziert werden welche mtp53-abhängig RITA-vermittelte Apoptose induzieren können. Neben der zentralen Rolle von JNK und p38 konnte die RITA-vermittelte Apoptose auch auf die mitochondrialen Effektoren BAX und BAK, zurückgeführt werden. Zudem führte die Behandlung mit RITA zu einer Herunterregulation der antiapoptotischen Bcl-2-Proteine Mcl-1, Bcl-2 und Bcl-xL. Die Kombinationsbehandlung mit dem BH3-mimetic ABT-737 verstärkte den RITA-induzierten Zelltod. Bemerkenswert hierbei war, dass der synergistische Effekt ausschließlich in RITA- 102 Diskussion sensitiven Zellen beobachtet werden konnte. RITA-insensitive Zellen, zu welchen auch PBMNCs gehörten, konnten durch die Kombinationsbehandlung nicht sensitiviert werden. Diese deutliche Abgrenzung in RITA-sensitive und RITAinsensitive Zellen deutete auf einen unterschiedlichen Transport von RITA in die Tumorzellen hin. Möglicherweise spielen hochexprimierte Aufnahmetransporter oder gering-exprimierte Effluxtransporter eine zentrale Rolle bei der intrazellulären Akkumulation von RITA. In weiterführenden Experimenten könnte in geeigneten Modell-Systemen, welche spezifisch in einem Transporter depletiert oder einen Transporter spezifisch überexprimieren, der Transport von radioaktiv-markiertem RITA näher untersucht werden. Hierbei identifizierte RITA-Transporter könnten potentielle Marker für das Ansprechen auf RITA-Behandlung sein. In RITA-sensitiven Tumoren könnte zudem durch eine Kombinationsbehandlung mit ABT-737 verstärkt Apoptose induziert werden und damit sowohl wtp53- als auch mtp53- oder p53-nullTumore effektiver therapiert werden. Zusammenfassend konnte in der in dieser Studie verwendeten Zellauswahl ein Einfluss von p53 auf die Sensitivität gegenüber Nutlin-3-, Cisplatin- und RITABehandlung nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich, dass Cisplatin und RITA auch unabhängig von p53, Effekte in p53-defizienten Zellen vermitteln können. Dabei führte insbesondere die Behandlung mit RITA zu einer Regulation der p53-Zielgene in RITA-sensitiven Zellen, unabhängig von der p53-Superfamilie und unabhängig von der Aktivierung des JNK-Signaltransduktionsweges. Somit können p53-Zielgene auch im p53-defekten System transaktiviert werden und typische p53-Funktionen über andere Signalwege vermittelt werden. Literaturverzeichnis 103 Literaturverzeichnis Adler, V., Schaffer, A., Kim, J., Dolan, L., and Ronai, Z. (1995). UV irradiation and heat shock mediate JNK activation via alternate pathways. J. Biol. Chem. 270, 26071–26077. Di Agostino, S., Strano, S., Emiliozzi, V., Zerbini, V., Mottolese, M., Sacchi, A., Blandino, G., and Piaggio, G. (2006). Gain of function of mutant p53: the mutant p53/NF-Y protein complex reveals an aberrant transcriptional mechanism of cell cycle regulation. Cancer Cell 10, 191–202. Ahmed, A., Yang, J., Maya-Mendoza, A., Jackson, D.A., and Ashcroft, M. (2011). Pharmacological activation of a novel p53-dependent S-phase checkpoint involving CHK-1. Cell Death Dis. 2, e160. Aylon, Y., and Oren, M. (2011). p53: guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5, 315–323. Baker, S.J., Fearon, E.R., Nigro, J.M., Hamilton, S.R., Preisinger, A.C., Jessup, J.M., vanTuinen, P., Ledbetter, D.H., Barker, D.F., Nakamura, Y., et al. (1989). Chromosome 17 deletions and p53 gene mutations in colorectal carcinomas. Science 244, 217–221. Bargonetti, J., Chicas, A., White, D., and Prives, C. (1997). p53 represses Sp1 DNA binding and HIV-LTR directed transcription. Cell. Mol. Biol. Noisy--Gd. Fr. 43, 935– 949. Basu, A., and Haldar, S. (2003). Identification of a novel Bcl-xL phosphorylation site regulating the sensitivity of taxol- or 2-methoxyestradiol-induced apoptosis. FEBS Lett. 538, 41–47. Bergamaschi, D., Gasco, M., Hiller, L., Sullivan, A., Syed, N., Trigiante, G., Yulug, I., Merlano, M., Numico, G., Comino, A., et al. (2003). p53 polymorphism influences response in cancer chemotherapy via modulation of p73-dependent apoptosis. Cancer Cell 3, 387–402. Blagosklonny, M.V. (2002). P53: An ubiquitous target of anticancer drugs. Int. J. Cancer 98, 161–166. Böhlig, L., and Rother, K. (2011). One function--multiple mechanisms: the manifold activities of p53 as a transcriptional repressor. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 464916. Ano Bom, A.P.D., Rangel, L.P., Costa, D.C.F., de Oliveira, G.A.P., Sanches, D., Braga, C.A., Gava, L.M., Ramos, C.H.I., Cepeda, A.O.T., Stumbo, A.C., et al. (2012). Mutant p53 aggregates into prion-like amyloid oligomers and fibrils: implications for cancer. J. Biol. Chem. 287, 28152–28162. Bosl, G.J., and Motzer, R.J. (1997). Testicular germ-cell cancer. N. Engl. J. Med. 337, 242–253. 104 Literaturverzeichnis Brosh, R., and Rotter, V. (2009). When mutants gain new powers: news from the mutant p53 field. Nat. Rev. Cancer 9, 701–713. Brown, C.J., Lain, S., Verma, C.S., Fersht, A.R., and Lane, D.P. (2009). Awakening guardian angels: drugging the p53 pathway. Nat. Rev. Cancer 9, 862–873. Bugarcić, Z.D., Petrović, B., Bugarcić, Z.M., Janković, S.M., Janković, S.V., Lukić, G., Novaković, M., Kostović, V., Popović, S., Djurdjević, P., et al. (2008). Effects of cisplatin and other Pt(II) complexes on spontaneous motility of isolated human oviduct. Toxicol. Vitro Int. J. Publ. Assoc. BIBRA 22, 1878–1882. Burmakin, M., Shi, Y., Hedström, E., Kogner, P., and Selivanova, G. (2013). Dual targeting of wild type and mutant p53 by small molecule RITA results in the inhibition of N-Myc and key survival oncogenes and kills neuroblastoma cells in vivo and in vitro. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. Bykov, V.J.N., Issaeva, N., Shilov, A., Hultcrantz, M., Pugacheva, E., Chumakov, P., Bergman, J., Wiman, K.G., and Selivanova, G. (2002). Restoration of the tumor suppressor function to mutant p53 by a low-molecular-weight compound. Nat. Med. 8, 282–288. Cancer Genome Atlas Research Network (2011). Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature 474, 609–615. Canner, J.A., Sobo, M., Ball, S., Hutzen, B., DeAngelis, S., Willis, W., Studebaker, A.W., Ding, K., Wang, S., Yang, D., et al. (2009). MI-63: a novel small-molecule inhibitor targets MDM2 and induces apoptosis in embryonal and alveolar rhabdomyosarcoma cells with wild-type p53. Br. J. Cancer 101, 774–781. Certo, M., Del Gaizo Moore, V., Nishino, M., Wei, G., Korsmeyer, S., Armstrong, S.A., and Letai, A. (2006). Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell 9, 351–365. Cheok, C.F., Verma, C.S., Baselga, J., and Lane, D.P. (2011). Translating p53 into the clinic. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 25–37. De Chiara, G., Marcocci, M.E., Torcia, M., Lucibello, M., Rosini, P., Bonini, P., Higashimoto, Y., Damonte, G., Armirotti, A., Amodei, S., et al. (2006). Bcl-2 Phosphorylation by p38 MAPK: identification of target sites and biologic consequences. J. Biol. Chem. 281, 21353–21361. Chicas, A., Molina, P., and Bargonetti, J. (2000). Mutant p53 forms a complex with Sp1 on HIV-LTR DNA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 279, 383–390. Chipuk, J.E., Kuwana, T., Bouchier-Hayes, L., Droin, N.M., Newmeyer, D.D., Schuler, M., and Green, D.R. (2004). Direct activation of Bax by p53 mediates mitochondrial membrane permeabilization and apoptosis. Science 303, 1010–1014. Cho, Y., Gorina, S., Jeffrey, P.D., and Pavletich, N.P. (1994). Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations. Science 265, 346–355. Literaturverzeichnis 105 Collavin, L., Lunardi, A., and Del Sal, G. (2010). p53-family proteins and their regulators: hubs and spokes in tumor suppression. Cell Death Differ. 17, 901–911. Di Conza, G., Buttarelli, M., Monti, O., Pellegrino, M., Mancini, F., Pontecorvi, A., Scotlandi, K., and Moretti, F. (2012). IGF-1R/MDM2 relationship confers enhanced sensitivity to RITA in Ewing sarcoma cells. Mol. Cancer Ther. 11, 1247–1256. Cortinovis, D., Bidoli, P., Zilembo, N., Fusi, A., and Bajetta, E. (2008). Oxaliplatin doublets in non-small cell lung cancer: a literature review. Lung Cancer Amst. Neth. 60, 325–331. Cummings, B.S., and Schnellmann, R.G. (2002). Cisplatin-Induced Renal Cell Apoptosis: Caspase 3-Dependent and -Independent Pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8–17. Czabotar, P.E., Lessene, G., Strasser, A., and Adams, J.M. (2013). Control of apoptosis by the BCL-2 protein family: implications for physiology and therapy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 49–63. Deans, A.J., and West, S.C. (2011). DNA interstrand crosslink repair and cancer. Nat. Rev. Cancer 11, 467–480. DeLeo, A.B., Jay, G., Appella, E., Dubois, G.C., Law, L.W., and Old, L.J. (1979). Detection of a transformation-related antigen in chemically induced sarcomas and other transformed cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76, 2420–2424. Van Delft, M.F., Wei, A.H., Mason, K.D., Vandenberg, C.J., Chen, L., Czabotar, P.E., Willis, S.N., Scott, C.L., Day, C.L., Cory, S., et al. (2006). The BH3 mimetic ABT-737 targets selective Bcl-2 proteins and efficiently induces apoptosis via Bak/Bax if Mcl-1 is neutralized. Cancer Cell 10, 389–399. Deng, Y., Ren, X., Yang, L., Lin, Y., and Wu, X. (2003). A JNK-Dependent Pathway Is Required for TNFα-Induced Apoptosis. Cell 115, 61–70. Dengler, M.A., Weilbacher, A., Gutekunst, M., Staiger, A.M., Vöhringer, M.C., Horn, H., Ott, G., Aulitzky, W.E., and van der Kuip, H. (2014). Discrepant NOXA (PMAIP1) transcript and NOXA protein levels: a potential Achilles’ heel in mantle cell lymphoma. Cell Death Dis. 5, e1013. Deyoung, M.P., and Ellisen, L.W. (2007). p63 and p73 in human cancer: defining the network. Oncogene 26, 5169–5183. Ding, K., Lu, Y., Nikolovska-Coleska, Z., Qiu, S., Ding, Y., Gao, W., Stuckey, J., Krajewski, K., Roller, P.P., Tomita, Y., et al. (2005). Structure-based design of potent non-peptide MDM2 inhibitors. J. Am. Chem. Soc. 127, 10130–10131. Ding, K., Lu, Y., Nikolovska-Coleska, Z., Wang, G., Qiu, S., Shangary, S., Gao, W., Qin, D., Stuckey, J., Krajewski, K., et al. (2006). Structure-based design of spirooxindoles as potent, specific small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 interaction. J. Med. Chem. 49, 3432–3435. 106 Literaturverzeichnis Donovan, N., Becker, E.B.E., Konishi, Y., and Bonni, A. (2002). JNK Phosphorylation and Activation of BAD Couples the Stress-activated Signaling Pathway to the Cell Death Machinery. J. Biol. Chem. 277, 40944–40949. Dötsch, V., Bernassola, F., Coutandin, D., Candi, E., and Melino, G. (2010). p63 and p73, the ancestors of p53. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a004887. Eastman, A. (1990). Activation of programmed cell death by anticancer agents: cisplatin as a model system. Cancer Cells Cold Spring Harb. N 1989 2, 275–280. Eferl, R., and Wagner, E.F. (2003). AP-1: a double-edged sword in tumorigenesis. Nat. Rev. Cancer 3, 859–868. Einhorn, L.H. (2002). Curing metastatic testicular cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4592–4595. Eliyahu, D., Raz, A., Gruss, P., Givol, D., and Oren, M. (1984). Participation of p53 cellular tumour antigen in transformation of normal embryonic cells. Nature 312, 646– 649. Eliyahu, D., Michalovitz, D., and Oren, M. (1985). Overproduction of p53 antigen makes established cells highly tumorigenic. Nature 316, 158–160. Eliyahu, D., Michalovitz, D., Eliyahu, S., Pinhasi-Kimhi, O., and Oren, M. (1989). Wild-type p53 can inhibit oncogene-mediated focus formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 8763–8767. Elkholi, R., Floros, K.V., and Chipuk, J.E. (2011). The Role of BH3-Only Proteins in Tumor Cell Development, Signaling, and Treatment. Genes Cancer 2, 523–537. Elmore, S.P., Nishimura, Y., Qian, T., Herman, B., and Lemasters, J.J. (2004). Discrimination of depolarized from polarized mitochondria by confocal fluorescence resonance energy transfer. Arch. Biochem. Biophys. 422, 145–152. Enge, M., Bao, W., Hedström, E., Jackson, S.P., Moumen, A., and Selivanova, G. (2009). MDM2-dependent downregulation of p21 and hnRNP K provides a switch between apoptosis and growth arrest induced by pharmacologically activated p53. Cancer Cell 15, 171–183. Erster, S., Mihara, M., Kim, R.H., Petrenko, O., and Moll, U.M. (2004). In vivo mitochondrial p53 translocation triggers a rapid first wave of cell death in response to DNA damage that can precede p53 target gene activation. Mol. Cell. Biol. 24, 6728– 6741. Espinoza-Fonseca, L.M. (2005). Targeting MDM2 by the small molecule RITA: towards the development of new multi-target drugs against cancer. Theor. Biol. Med. Model. 2, 38. Ferreiro, I., Joaquin, M., Islam, A., Gomez-Lopez, G., Barragan, M., Lombardía, L., Domínguez, O., Pisano, D.G., Lopez-Bigas, N., Nebreda, A.R., et al. (2010). Whole genome analysis of p38 SAPK-mediated gene expression upon stress. BMC Genomics 11, 144. Literaturverzeichnis 107 Finlay, C.A., Hinds, P.W., and Levine, A.J. (1989). The p53 proto-oncogene can act as a suppressor of transformation. Cell 57, 1083–1093. Foster, B.A., Coffey, H.A., Morin, M.J., and Rastinejad, F. (1999). Pharmacological rescue of mutant p53 conformation and function. Science 286, 2507–2510. Galluzzi, L., Senovilla, L., Vitale, I., Michels, J., Martins, I., Kepp, O., Castedo, M., and Kroemer, G. (2012). Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene 31, 1869–1883. Ganapathy, V., Thangaraju, M., and Prasad, P.D. (2009). Nutrient transporters in cancer: relevance to Warburg hypothesis and beyond. Pharmacol. Ther. 121, 29–40. Ghiotto, F., Fais, F., and Bruno, S. (2010). BH3-only proteins: the death-puppeteer’s wires. Cytom. Part J. Int. Soc. Anal. Cytol. 77, 11–21. Girardini, J.E., Napoli, M., Piazza, S., Rustighi, A., Marotta, C., Radaelli, E., Capaci, V., Jordan, L., Quinlan, P., Thompson, A., et al. (2011). A Pin1/mutant p53 axis promotes aggressiveness in breast cancer. Cancer Cell 20, 79–91. Goldstein, I., Marcel, V., Olivier, M., Oren, M., Rotter, V., and Hainaut, P. (2011). Understanding wild-type and mutant p53 activities in human cancer: new landmarks on the way to targeted therapies. Cancer Gene Ther. 18, 2–11. Grethe, S., and Pörn-Ares, M.I. (2006). p38 MAPK regulates phosphorylation of Bad via PP2A-dependent suppression of the MEK1/2-ERK1/2 survival pathway in TNF-α induced endothelial apoptosis. Cell. Signal. 18, 531–540. Grethe, S., Ares, M.P.S., Andersson, T., and Pörn-Ares, M.I. (2004). p38 MAPK mediates TNF-induced apoptosis in endothelial cells via phosphorylation and downregulation of Bcl-x(L). Exp. Cell Res. 298, 632–642. Grinkevich, V.V., Nikulenkov, F., Shi, Y., Enge, M., Bao, W., Maljukova, A., Gluch, A., Kel, A., Sangfelt, O., and Selivanova, G. (2009). Ablation of key oncogenic pathways by RITA-reactivated p53 is required for efficient apoptosis. Cancer Cell 15, 441–453. Gurtner, A., Starace, G., Norelli, G., Piaggio, G., Sacchi, A., and Bossi, G. (2010). Mutant p53-induced up-regulation of mitogen-activated protein kinase kinase 3 contributes to gain of function. J. Biol. Chem. 285, 14160–14169. Gutekunst, M., Oren, M., Weilbacher, A., Dengler, M.A., Markwardt, C., Thomale, J., Aulitzky, W.E., and van der Kuip, H. (2011). p53 hypersensitivity is the predominant mechanism of the unique responsiveness of testicular germ cell tumor (TGCT) cells to cisplatin. PloS One 6, e19198. Gutekunst, M., Mueller, T., Weilbacher, A., Dengler, M.A., Bedke, J., Kruck, S., Oren, M., Aulitzky, W.E., and van der Kuip, H. (2013). Cisplatin hypersensitivity of testicular germ cell tumors is determined by high constitutive Noxa levels mediated by Oct-4. Cancer Res. 73, 1460–1469. Hagiwara, K., McMenamin, M.G., Miura, K., and Harris, C.C. (1999). Mutational analysis of the p63/p73L/p51/p40/CUSP/KET gene in human cancer cell lines using intronic primers. Cancer Res. 59, 4165–4169. 108 Literaturverzeichnis Hakem, R. (2008). DNA-damage repair; the good, the bad, and the ugly. EMBO J. 27, 589–605. Hamdi, M., Kool, J., Cornelissen-Steijger, P., Carlotti, F., Popeijus, H.E., van der Burgt, C., Janssen, J.M., Yasui, A., Hoeben, R.C., Terleth, C., et al. (2005). DNA damage in transcribed genes induces apoptosis via the JNK pathway and the JNKphosphatase MKP-1. Oncogene 24, 7135–7144. Han, J., Zhong, C.-Q., and Zhang, D.-W. (2011). Programmed necrosis: backup to and competitor with apoptosis in the immune system. Nat. Immunol. 12, 1143–1149. Hara, T., Namba, H., Yang, T.T., Nagayama, Y., Fukata, S., Kuma, K., Ishikawa, N., Ito, K., and Yamashita, S. (1998). Ionizing radiation activates c-Jun NH2-terminal kinase (JNK/SAPK) via a PKC-dependent pathway in human thyroid cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244, 41–44. Harvey, M., McArthur, M.J., Montgomery, C.A., Jr, Butel, J.S., Bradley, A., and Donehower, L.A. (1993). Spontaneous and carcinogen-induced tumorigenesis in p53-deficient mice. Nat. Genet. 5, 225–229. Hearnes, J.M., Mays, D.J., Schavolt, K.L., Tang, L., Jiang, X., and Pietenpol, J.A. (2005). Chromatin immunoprecipitation-based screen to identify functional genomic binding sites for sequence-specific transactivators. Mol. Cell. Biol. 25, 10148–10158. Hedström, E., Eriksson, S., Zawacka-Pankau, J., Arnér, E.S.J., and Selivanova, G. (2009). p53-dependent inhibition of TrxR1 contributes to the tumor-specific induction of apoptosis by RITA. Cell Cycle Georget. Tex 8, 3576–3583. Heimdal, K., Lothe, R.A., Lystad, S., Holm, R., Fosså, S.D., and Børresen, A.L. (1993). No germline TP53 mutations detected in familial and bilateral testicular cancer. Genes. Chromosomes Cancer 6, 92–97. Helton, E.S., and Chen, X. (2007). p53 modulation of the DNA damage response. J. Cell. Biochem. 100, 883–896. Hibi, M., Lin, A., Smeal, T., Minden, A., and Karin, M. (1993). Identification of an oncoprotein- and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain. Genes Dev. 7, 2135–2148. Hwang, C.-I., Matoso, A., Corney, D.C., Flesken-Nikitin, A., Körner, S., Wang, W., Boccaccio, C., Thorgeirsson, S.S., Comoglio, P.M., Hermeking, H., et al. (2011). Wild-type p53 controls cell motility and invasion by dual regulation of MET expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 14240–14245. Ichimiya, S., Nimura, Y., Kageyama, H., Takada, N., Sunahara, M., Shishikura, T., Nakamura, Y., Sakiyama, S., Seki, N., Ohira, M., et al. (1999). p73 at chromosome 1p36.3 is lost in advanced stage neuroblastoma but its mutation is infrequent. Oncogene 18, 1061–1066. Issaeva, N., Bozko, P., Enge, M., Protopopova, M., Verhoef, L.G.G.C., Masucci, M., Pramanik, A., and Selivanova, G. (2004). Small molecule RITA binds to p53, blocks p53-HDM-2 interaction and activates p53 function in tumors. Nat. Med. 10, 1321– 1328. Literaturverzeichnis 109 Jenkins, J.R., Rudge, K., and Currie, G.A. (1984). Cellular immortalization by a cDNA clone encoding the transformation-associated phosphoprotein p53. Nature 312, 651– 654. Jiang, M., Wang, C.-Y., Huang, S., Yang, T., and Dong, Z. (2009). Cisplatin-induced apoptosis in p53-deficient renal cells via the intrinsic mitochondrial pathway. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296, F983–993. Jones, R.J., Bjorklund, C.C., Baladandayuthapani, V., Kuhn, D.J., and Orlowski, R.Z. (2012). Drug resistance to inhibitors of the human double minute-2 E3 ligase is mediated by point mutations of p53, but can be overcome with the p53 targeting agent RITA. Mol. Cancer Ther. 11, 2243–2253. Jost, C.A., Marin, M.C., and Kaelin, W.G., Jr (1997). p73 is a simian [correction of human] p53-related protein that can induce apoptosis. Nature 389, 191–194. Jung, M.S., Yun, J., Chae, H.D., Kim, J.M., Kim, S.C., Choi, T.S., and Shin, D.Y. (2001). p53 and its homologues, p63 and p73, induce a replicative senescence through inactivation of NF-Y transcription factor. Oncogene 20, 5818–5825. Kaghad, M., Bonnet, H., Yang, A., Creancier, L., Biscan, J.C., Valent, A., Minty, A., Chalon, P., Lelias, J.M., Dumont, X., et al. (1997). Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36, a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers. Cell 90, 809–819. Karasawa, T., Sibrian-Vazquez, M., Strongin, R.M., and Steyger, P.S. (2013). Identification of cisplatin-binding proteins using agarose conjugates of platinum compounds. PloS One 8, e66220. Kemp, C.J., Donehower, L.A., Bradley, A., and Balmain, A. (1993). Reduction of p53 gene dosage does not increase initiation or promotion but enhances malignant progression of chemically induced skin tumors. Cell 74, 813–822. Kim, E., and Deppert, W. (2003). The complex interactions of p53 with target DNA: we learn as we go. Biochem. Cell Biol. Biochim. Biol. Cell. 81, 141–150. Kitayner, M., Rozenberg, H., Kessler, N., Rabinovich, D., Shaulov, L., Haran, T.E., and Shakked, Z. (2006). Structural basis of DNA recognition by p53 tetramers. Mol. Cell 22, 741–753. Koblish, H.K., Zhao, S., Franks, C.F., Donatelli, R.R., Tominovich, R.M., LaFrance, L.V., Leonard, K.A., Gushue, J.M., Parks, D.J., Calvo, R.R., et al. (2006). Benzodiazepinedione inhibitors of the Hdm2:p53 complex suppress human tumor cell proliferation in vitro and sensitize tumors to doxorubicin in vivo. Mol. Cancer Ther. 5, 160–169. Kojima, K., Konopleva, M., Samudio, I.J., Shikami, M., Cabreira-Hansen, M., McQueen, T., Ruvolo, V., Tsao, T., Zeng, Z., Vassilev, L.T., et al. (2005). MDM2 antagonists induce p53-dependent apoptosis in AML: implications for leukemia therapy. Blood 106, 3150–3159. 110 Literaturverzeichnis Kojima, K., Burks, J.K., Arts, J., and Andreeff, M. (2010). The novel tryptamine derivative JNJ-26854165 induces wild-type p53- and E2F1-mediated apoptosis in acute myeloid and lymphoid leukemias. Mol. Cancer Ther. 9, 2545–2557. Konopleva, M., Contractor, R., Tsao, T., Samudio, I., Ruvolo, P.P., Kitada, S., Deng, X., Zhai, D., Shi, Y.-X., Sneed, T., et al. (2006). Mechanisms of apoptosis sensitivity and resistance to the BH3 mimetic ABT-737 in acute myeloid leukemia. Cancer Cell 10, 375–388. Krajewski, M., Ozdowy, P., D’Silva, L., Rothweiler, U., and Holak, T.A. (2005). NMR indicates that the small molecule RITA does not block p53-MDM2 binding in vitro. Nat. Med. 11, 1135–1136; author reply 1136–1137. Kravchenko, J.E., Ilyinskaya, G.V., Komarov, P.G., Agapova, L.S., Kochetkov, D.V., Strom, E., Frolova, E.I., Kovriga, I., Gudkov, A.V., Feinstein, E., et al. (2008). Smallmolecule RETRA suppresses mutant p53-bearing cancer cells through a p73dependent salvage pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 6302–6307. Kress, M., May, E., Cassingena, R., and May, P. (1979). Simian virus 40-transformed cells express new species of proteins precipitable by anti-simian virus 40 tumor serum. J. Virol. 31, 472–483. Kruse, J.-P., and Gu, W. (2009). Modes of p53 regulation. Cell 137, 609–622. Kumar, P., Miller, A.I., and Polverini, P.J. (2004). p38 MAPK mediates gammairradiation-induced endothelial cell apoptosis, and vascular endothelial growth factor protects endothelial cells through the phosphoinositide 3-kinase-Akt-Bcl-2 pathway. J. Biol. Chem. 279, 43352–43360. Kyriakis, J.M., and Avruch, J. (2001). Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation. Physiol. Rev. 81, 807–869. Lamb, P., and Crawford, L. (1986). Characterization of the human p53 gene. Mol. Cell. Biol. 6, 1379–1385. Lane, D.P., and Crawford, L.V. (1979). T antigen is bound to a host protein in SV40transformed cells. Nature 278, 261–263. De Lange, J., Verlaan-de Vries, M., Teunisse, A.F.A.S., and Jochemsen, A.G. (2012). Chk2 mediates RITA-induced apoptosis. Cell Death Differ. 19, 980–989. Lee, H., Park, M.-T., Choi, B.-H., Oh, E.-T., Song, M.-J., Lee, J., Kim, C., Lim, B.U., and Park, H.J. (2011). Endoplasmic reticulum stress-induced JNK activation is a critical event leading to mitochondria-mediated cell death caused by β-lapachone treatment. PloS One 6, e21533. Lee, M.-W., Park, S.C., Yang, Y.G., Yim, S.O., Chae, H.S., Bach, J.-H., Lee, H.J., Kim, K.Y., Lee, W.B., and Kim, S.S. (2002). The involvement of reactive oxygen species (ROS) and p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase in TRAIL/Apo2Linduced apoptosis. FEBS Lett. 512, 313–318. Literaturverzeichnis 111 Lenos, K., and Jochemsen, A.G. (2011). Functions of MDMX in the modulation of the p53-response. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 876173. Letai, A., Bassik, M.C., Walensky, L.D., Sorcinelli, M.D., Weiler, S., and Korsmeyer, S.J. (2002). Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics. Cancer Cell 2, 183–192. Leu, J.I.-J., Dumont, P., Hafey, M., Murphy, M.E., and George, D.L. (2004). Mitochondrial p53 activates Bak and causes disruption of a Bak-Mcl1 complex. Nat. Cell Biol. 6, 443–450. Levine, A.J., and Oren, M. (2009). The first 30 years of p53: growing ever more complex. Nat. Rev. Cancer 9, 749–758. Li, Y., and Prives, C. (2007). Are interactions with p63 and p73 involved in mutant p53 gain of oncogenic function? Oncogene 26, 2220–2225. Li, H., Lakshmikanth, T., Garofalo, C., Enge, M., Spinnler, C., Anichini, A., Szekely, L., Kärre, K., Carbone, E., and Selivanova, G. (2011). Pharmacological activation of p53 triggers anticancer innate immune response through induction of ULBP2. Cell Cycle Georget. Tex 10, 3346–3358. Lin, C., Zhao, X., Li, L., Liu, H., Cao, K., Wan, Y., Liu, X., Nie, C., Liu, L., Tong, A., et al. (2012). NOXA-induced alterations in the Bax/Smac axis enhance sensitivity of ovarian cancer cells to cisplatin. PloS One 7, e36722. Linzer, D.I., and Levine, A.J. (1979). Characterization of a 54K dalton cellular SV40 tumor antigen present in SV40-transformed cells and uninfected embryonal carcinoma cells. Cell 17, 43–52. Liu, G., McDonnell, T.J., Montes de Oca Luna, R., Kapoor, M., Mims, B., El-Naggar, A.K., and Lozano, G. (2000). High metastatic potential in mice inheriting a targeted p53 missense mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4174–4179. Liu, K., Ling, S., and Lin, W.-C. (2011). TopBP1 mediates mutant p53 gain of function through NF-Y and p63/p73. Mol. Cell. Biol. 31, 4464–4481. Llambi, F., Moldoveanu, T., Tait, S.W.G., Bouchier-Hayes, L., Temirov, J., McCormick, L.L., Dillon, C.P., and Green, D.R. (2011). A unified model of mammalian BCL-2 protein family interactions at the mitochondria. Mol. Cell 44, 517– 531. Van Loo, G., Saelens, X., van Gurp, M., MacFarlane, M., Martin, S.J., and Vandenabeele, P. (2002). The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ. 9, 1031–1042. Ludwig, R.L., Bates, S., and Vousden, K.H. (1996). Differential activation of target cellular promoters by p53 mutants with impaired apoptotic function. Mol. Cell. Biol. 16, 4952–4960. 112 Literaturverzeichnis Van Maerken, T., Ferdinande, L., Taildeman, J., Lambertz, I., Yigit, N., Vercruysse, L., Rihani, A., Michaelis, M., Cinatl, J., Jr, Cuvelier, C.A., et al. (2009). Antitumor activity of the selective MDM2 antagonist nutlin-3 against chemoresistant neuroblastoma with wild-type p53. J. Natl. Cancer Inst. 101, 1562–1574. Mandic, A., Hansson, J., Linder, S., and Shoshan, M.C. (2003). Cisplatin induces endoplasmic reticulum stress and nucleus-independent apoptotic signaling. J. Biol. Chem. 278, 9100–9106. Mansouri, A., Ridgway, L.D., Korapati, A.L., Zhang, Q., Tian, L., Wang, Y., Siddik, Z.H., Mills, G.B., and Claret, F.X. (2003). Sustained Activation of JNK/p38 MAPK Pathways in Response to Cisplatin Leads to Fas Ligand Induction and Cell Death in Ovarian Carcinoma Cells. J. Biol. Chem. 278, 19245–19256. Marchenko, N.D., Wolff, S., Erster, S., Becker, K., and Moll, U.M. (2007). Monoubiquitylation promotes mitochondrial p53 translocation. EMBO J. 26, 923–934. Marin, M.C., Jost, C.A., Brooks, L.A., Irwin, M.S., O’Nions, J., Tidy, J.A., James, N., McGregor, J.M., Harwood, C.A., Yulug, I.G., et al. (2000). A common polymorphism acts as an intragenic modifier of mutant p53 behaviour. Nat. Genet. 25, 47–54. Marine, J.-C., and Lozano, G. (2010). Mdm2-mediated ubiquitylation: p53 and beyond. Cell Death Differ. 17, 93–102. Martynova, E., Pozzi, S., Basile, V., Dolfini, D., Zambelli, F., Imbriano, C., Pavesi, G., and Mantovani, R. (2012). Gain-of-function p53 mutants have widespread genomic locations partially overlapping with p63. Oncotarget 3, 132–143. Meek, D.W. (2009). Tumour suppression by p53: a role for the DNA damage response? Nat. Rev. Cancer 9, 714–723. Melero, J.A., Stitt, D.T., Mangel, W.F., and Carroll, R.B. (1979). Identification of new polypeptide species (48-55K) immunoprecipitable by antiserum to purified large T antigen and present in SV40-infected and -transformed cells. Virology 93, 466–480. Melino, G. (2011). p63 is a suppressor of tumorigenesis and metastasis interacting with mutant p53. Cell Death Differ. 18, 1487–1499. Melino, G., De Laurenzi, V., and Vousden, K.H. (2002). p73: Friend or foe in tumorigenesis. Nat. Rev. Cancer 2, 605–615. Melino, G., Lu, X., Gasco, M., Crook, T., and Knight, R.A. (2003). Functional regulation of p73 and p63: development and cancer. Trends Biochem. Sci. 28, 663– 670. Menendez, D., Inga, A., and Resnick, M.A. (2009). The expanding universe of p53 targets. Nat. Rev. Cancer 9, 724–737. Mihara, M., Erster, S., Zaika, A., Petrenko, O., Chittenden, T., Pancoska, P., and Moll, U.M. (2003). p53 has a direct apoptogenic role at the mitochondria. Mol. Cell 11, 577–590. Literaturverzeichnis 113 Mohammad, R.M., Wu, J., Azmi, A.S., Aboukameel, A., Sosin, A., Wu, S., Yang, D., Wang, S., and Al-Katib, A.M. (2009). An MDM2 antagonist (MI-319) restores p53 functions and increases the life span of orally treated follicular lymphoma bearing animals. Mol. Cancer 8, 115. Morrison, D.K. (2012). MAP kinase pathways. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4. Muller, P.A.J., and Vousden, K.H. (2013). p53 mutations in cancer. Nat. Cell Biol. 15, 2–8. Murray-Zmijewski, F., Slee, E.A., and Lu, X. (2008). A complex barcode underlies the heterogeneous response of p53 to stress. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 702–712. Ni Chonghaile, T., Sarosiek, K.A., Vo, T.-T., Ryan, J.A., Tammareddi, A., Moore, V.D.G., Deng, J., Anderson, K.C., Richardson, P., Tai, Y.-T., et al. (2011). Pretreatment mitochondrial priming correlates with clinical response to cytotoxic chemotherapy. Science 334, 1129–1133. Nieves-Neira, W., Rivera, M.I., Kohlhagen, G., Hursey, M.L., Pourquier, P., Sausville, E.A., and Pommier, Y. (1999). DNA protein cross-links produced by NSC 652287, a novel thiophene derivative active against human renal cancer cells. Mol. Pharmacol. 56, 478–484. Nobori, K., Ito, H., Tamamori-Adachi, M., Adachi, S., Ono, Y., Kawauchi, J., Kitajima, S., Marumo, F., and Isobe, M. (2002). ATF3 Inhibits Doxorubicin-induced Apoptosis in Cardiac Myocytes: A Novel Cardioprotective Role of ATF3. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 1387–1397. Noguchi, K., Kitanaka, C., Yamana, H., Kokubu, A., Mochizuki, T., and Kuchino, Y. (1999). Regulation of c-Myc through phosphorylation at Ser-62 and Ser-71 by c-Jun N-terminal kinase. J. Biol. Chem. 274, 32580–32587. Oeckinghaus, A., Hayden, M.S., and Ghosh, S. (2011). Crosstalk in NF-κB signaling pathways. Nat. Immunol. 12, 695–708. Olivier, M., Langer√∏d, A., Carrieri, P., Bergh, J., Klaar, S., Eyfjord, J., Theillet, C., Rodriguez, C., Lidereau, R., Bi√®che, I., et al. (2006). The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin. Cancer Res. 12, 1157–1167. Oltersdorf, T., Elmore, S.W., Shoemaker, A.R., Armstrong, R.C., Augeri, D.J., Belli, B.A., Bruncko, M., Deckwerth, T.L., Dinges, J., Hajduk, P.J., et al. (2005). An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours. Nature 435, 677–681. Parada, L.F., Land, H., Weinberg, R.A., Wolf, D., and Rotter, V. (1984). Cooperation between gene encoding p53 tumour antigen and ras in cellular transformation. Nature 312, 649–651. Paul, I., Chacko, A.D., Stasik, I., Busacca, S., Crawford, N., McCoy, F., McTavish, N., Wilson, B., Barr, M., O’Byrne, K.J., et al. (2012). Acquired differential regulation of caspase-8 in cisplatin-resistant non-small-cell lung cancer. Cell Death Dis. 3, e449. 114 Literaturverzeichnis Peng, H.Q., Hogg, D., Malkin, D., Bailey, D., Gallie, B.L., Bulbul, M., Jewett, M., Buchanan, J., and Goss, P.E. (1993). Mutations of the p53 gene do not occur in testis cancer. Cancer Res. 53, 3574–3578. Pérez-Galán, P., Roué, G., Villamor, N., Montserrat, E., Campo, E., and Colomer, D. (2006). The proteasome inhibitor bortezomib induces apoptosis in mantle-cell lymphoma through generation of ROS and Noxa activation independent of p53 status. Blood 107, 257–264. Phillip, L.R., Jorden, J.L., Rivera, M.I., Wolfe, T.L., Upadhyayb, K., and Stinson, S.F. (2002). Identification of the major metabolite of 2,5-bis(5-hydroxymethyl-2thienyl)furan (NSC 652287), an antitumor agent, in the S9 subcellular fraction of dog liver cells. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 767, 27–33. Pritchard, D.M., Print, C., O’Reilly, L., Adams, J.M., Potten, C.S., and Hickman, J.A. (2000). Bcl-w is an important determinant of damage-induced apoptosis in epithelia of small and large intestine. Oncogene 19, 3955–3959. Qin, J.-Z., Ziffra, J., Stennett, L., Bodner, B., Bonish, B.K., Chaturvedi, V., Bennett, F., Pollock, P.M., Trent, J.M., Hendrix, M.J.C., et al. (2005). Proteasome Inhibitors Trigger NOXA-Mediated Apoptosis in Melanoma and Myeloma Cells. Cancer Res. 65, 6282–6293. Qiu, W., Hu, M., Sridhar, A., Opeskin, K., Fox, S., Shipitsin, M., Trivett, M., Thompson, E.R., Ramakrishna, M., Gorringe, K.L., et al. (2008). No evidence of clonal somatic genetic alterations in cancer-associated fibroblasts from human breast and ovarian carcinomas. Nat. Genet. 40, 650–655. Ray, P.D., Huang, B.-W., and Tsuji, Y. (2012). Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell. Signal. 24, 981–990. Ray-Coquard, I., Blay, J.-Y., Italiano, A., Le Cesne, A., Penel, N., Zhi, J., Heil, F., Rueger, R., Graves, B., Ding, M., et al. (2012). Effect of the MDM2 antagonist RG7112 on the P53 pathway in patients with MDM2-amplified, well-differentiated or dedifferentiated liposarcoma: an exploratory proof-of-mechanism study. Lancet Oncol. 13, 1133–1140. Reed, D., Shen, Y., Shelat, A.A., Arnold, L.A., Ferreira, A.M., Zhu, F., Mills, N., Smithson, D.C., Regni, C.A., Bashford, D., et al. (2010). Identification and characterization of the first small molecule inhibitor of MDMX. J. Biol. Chem. 285, 10786–10796. Riley, T., Sontag, E., Chen, P., and Levine, A. (2008). Transcriptional control of human p53-regulated genes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 402–412. Rinaldo, C., Prodosmo, A., Siepi, F., Moncada, A., Sacchi, A., Selivanova, G., and Soddu, S. (2009). HIPK2 regulation by MDM2 determines tumor cell response to the p53-reactivating drugs nutlin-3 and RITA. Cancer Res. 69, 6241–6248. Rivera, M.I., Stinson, S.F., Vistica, D.T., Jorden, J.L., Kenney, S., and Sausville, E.A. (1999). Selective toxicity of the tricyclic thiophene NSC 652287 in renal carcinoma cell lines: differential accumulation and metabolism. Biochem. Pharmacol. 57, 1283– 1295. Literaturverzeichnis 115 Rivlin, N., Brosh, R., Oren, M., and Rotter, V. (2011). Mutations in the p53 Tumor Suppressor Gene. Genes Cancer 2, 466–474. Roh, J.-L., Ko, J.H., Moon, S.J., Ryu, C.H., Choi, J.Y., and Koch, W.M. (2012). The p53-reactivating small-molecule RITA enhances cisplatin-induced cytotoxicity and apoptosis in head and neck cancer. Cancer Lett. 325, 35–41. Rosenfeldt, M.T., and Ryan, K.M. (2011). The multiple roles of autophagy in cancer. Carcinogenesis 32, 955–963. Rowan, S., Ludwig, R.L., Haupt, Y., Bates, S., Lu, X., Oren, M., and Vousden, K.H. (1996). Specific loss of apoptotic but not cell-cycle arrest function in a human tumor derived p53 mutant. EMBO J. 15, 827–838. Saha, M.N., Jiang, H., Mukai, A., and Chang, H. (2010). RITA inhibits multiple myeloma cell growth through induction of p53-mediated caspase-dependent apoptosis and synergistically enhances nutlin-induced cytotoxic responses. Mol. Cancer Ther. 9, 3041–3051. Saha, M.N., Jiang, H., Yang, Y., Zhu, X., Wang, X., Schimmer, A.D., Qiu, L., and Chang, H. (2012). Targeting p53 via JNK pathway: a novel role of RITA for apoptotic signaling in multiple myeloma. PloS One 7, e30215. Sala-Trepat, M., Rouillard, D., Escarceller, M., Laquerbe, A., Moustacchi, E., and Papadopoulo, D. (2000). Arrest of S-phase progression is impaired in Fanconi anemia cells. Exp. Cell Res. 260, 208–215. Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S., and Gupta, S. (2010). Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int. J. Cell Biol. 2010, 830307. Sampath, J., Sun, D., Kidd, V.J., Grenet, J., Gandhi, A., Shapiro, L.H., Wang, Q., Zambetti, G.P., and Schuetz, J.D. (2001). Mutant p53 cooperates with ETS and selectively up-regulates human MDR1 not MRP1. J. Biol. Chem. 276, 39359–39367. Sánchez-Perez, I., Murguía, J.R., and Perona, R. (1998). Cisplatin induces a persistent activation of JNK that is related to cell death. Oncogene 16, 533–540. Sattler, M., Liang, H., Nettesheim, D., Meadows, R.P., Harlan, J.E., Eberstadt, M., Yoon, H.S., Shuker, S.B., Chang, B.S., Minn, A.J., et al. (1997). Structure of Bcl-xLBak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis. Science 275, 983–986. Schmid, J.O., Dong, M., Haubeiss, S., Friedel, G., Bode, S., Grabner, A., Ott, G., Mürdter, T.E., Oren, M., Aulitzky, W.E., et al. (2012). Cancer cells cue the p53 response of cancer-associated fibroblasts to cisplatin. Cancer Res. 72, 5824–5832. Secchiero, P., Barbarotto, E., Tiribelli, M., Zerbinati, C., di Iasio, M.G., Gonelli, A., Cavazzini, F., Campioni, D., Fanin, R., Cuneo, A., et al. (2006). Functional integrity of the p53-mediated apoptotic pathway induced by the nongenotoxic agent nutlin-3 in B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL). Blood 107, 4122–4129. 116 Literaturverzeichnis Shaked, H., Shiff, I., Kott-Gutkowski, M., Siegfried, Z., Haupt, Y., and Simon, I. (2008). Chromatin immunoprecipitation-on-chip reveals stress-dependent p53 occupancy in primary normal cells but not in established cell lines. Cancer Res. 68, 9671–9677. Shamas-Din, A., Brahmbhatt, H., Leber, B., and Andrews, D.W. (2011). BH3-only proteins: Orchestrators of apoptosis. Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Cell Res. 1813, 508–520. Shangary, S., Ding, K., Qiu, S., Nikolovska-Coleska, Z., Bauer, J.A., Liu, M., Wang, G., Lu, Y., McEachern, D., Bernard, D., et al. (2008a). Reactivation of p53 by a specific MDM2 antagonist (MI-43) leads to p21-mediated cell cycle arrest and selective cell death in colon cancer. Mol. Cancer Ther. 7, 1533–1542. Shangary, S., Qin, D., McEachern, D., Liu, M., Miller, R.S., Qiu, S., NikolovskaColeska, Z., Ding, K., Wang, G., Chen, J., et al. (2008b). Temporal activation of p53 by a specific MDM2 inhibitor is selectively toxic to tumors and leads to complete tumor growth inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 3933–3938. Shaulian, E. (2010). AP-1--The Jun proteins: Oncogenes or tumor suppressors in disguise? Cell. Signal. 22, 894–899. Shaulsky, G., Goldfinger, N., Ben-Ze’ev, A., and Rotter, V. (1990). Nuclear accumulation of p53 protein is mediated by several nuclear localization signals and plays a role in tumorigenesis. Mol. Cell. Biol. 10, 6565–6577. Shen, H.-M., and Liu, Z. (2006). JNK signaling pathway is a key modulator in cell death mediated by reactive oxygen and nitrogen species. Free Radic. Biol. Med. 40, 928–939. Shimizu, H., Banno, Y., Sumi, N., Naganawa, T., Kitajima, Y., and Nozawa, Y. (1999). Activation of p38 Mitogen-Activated Protein Kinase and Caspases in UVBInduced Apoptosis of Human Keratinocyte HaCaT Cells. J. Invest. Dermatol. 112, 769–774. Sigal, A., and Rotter, V. (2000). Oncogenic mutations of the p53 tumor suppressor: the demons of the guardian of the genome. Cancer Res. 60, 6788–6793. Simonin, K., N’Diaye, M., Lheureux, S., Loussouarn, C., Dutoit, S., Briand, M., Giffard, F., Brotin, E., Blanc-Fournier, C., and Poulain, L. (2013). Platinum compounds sensitize ovarian carcinoma cells to ABT-737 by modulation of the Mcl1/Noxa axis. Apoptosis Int. J. Program. Cell Death 18, 492–508. Smeenk, L., van Heeringen, S.J., Koeppel, M., van Driel, M.A., Bartels, S.J.J., Akkers, R.C., Denissov, S., Stunnenberg, H.G., and Lohrum, M. (2008). Characterization of genome-wide p53-binding sites upon stress response. Nucleic Acids Res. 36, 3639–3654. Smith, A.E., Smith, R., and Paucha, E. (1979). Characterization of different tumor antigens present in cells transformed by simian virus 40. Cell 18, 335–346. Song, H., Hollstein, M., and Xu, Y. (2007). p53 gain-of-function cancer mutants induce genetic instability by inactivating ATM. Nat. Cell Biol. 9, 573–580. Literaturverzeichnis 117 Sosin, A.M., Burger, A.M., Siddiqi, A., Abrams, J., Mohammad, R.M., and Al-Katib, A.M. (2012). HDM2 antagonist MI-219 (spiro-oxindole), but not Nutlin-3 (cisimidazoline), regulates p53 through enhanced HDM2 autoubiquitination and degradation in human malignant B-cell lymphomas. J. Hematol. Oncol.J Hematol Oncol 5, 57. Spinnler, C., Hedström, E., Li, H., de Lange, J., Nikulenkov, F., Teunisse, A.F.A.S., Verlaan-de Vries, M., Grinkevich, V., Jochemsen, A.G., and Selivanova, G. (2011). Abrogation of Wip1 expression by RITA-activated p53 potentiates apoptosis induction via activation of ATM and inhibition of HdmX. Cell Death Differ. 18, 1736– 1745. Srivastava, R.K., Mi, Q.S., Hardwick, J.M., and Longo, D.L. (1999). Deletion of the loop region of Bcl-2 completely blocks paclitaxel-induced apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 3775–3780. Stambolsky, P., Tabach, Y., Fontemaggi, G., Weisz, L., Maor-Aloni, R., Siegfried, Z., Sigfried, Z., Shiff, I., Kogan, I., Shay, M., et al. (2010). Modulation of the vitamin D3 response by cancer-associated mutant p53. Cancer Cell 17, 273–285. Stommel, J.M., Marchenko, N.D., Jimenez, G.S., Moll, U.M., Hope, T.J., and Wahl, G.M. (1999). A leucine-rich nuclear export signal in the p53 tetramerization domain: regulation of subcellular localization and p53 activity by NES masking. EMBO J. 18, 1660–1672. Strasser, A., Cory, S., and Adams, J.M. (2011). Deciphering the rules of programmed cell death to improve therapy of cancer and other diseases. EMBO J. 30, 3667–3683. Su, X., Chakravarti, D., and Flores, E.R. (2013). p63 steps into the limelight: crucial roles in the suppression of tumorigenesis and metastasis. Nat. Rev. Cancer 13, 136– 143. Sunahara, M., Shishikura, T., Takahashi, M., Todo, S., Yamamoto, N., Kimura, H., Kato, S., Ishioka, C., Ikawa, S., Ikawa, Y., et al. (1999). Mutational analysis of p51A/TAp63gamma, a p53 homolog, in non-small cell lung cancer and breast cancer. Oncogene 18, 3761–3765. Tait, S.W.G., and Green, D.R. (2010). Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 621–632. Thukral, S.K., Lu, Y., Blain, G.C., Harvey, T.S., and Jacobsen, V.L. (1995). Discrimination of DNA binding sites by mutant p53 proteins. Mol. Cell. Biol. 15, 5196– 5202. Thut, C.J., Goodrich, J.A., and Tjian, R. (1997). Repression of p53-mediated transcription by MDM2: a dual mechanism. Genes Dev. 11, 1974–1986. Toledo, F., Krummel, K.A., Lee, C.J., Liu, C.-W., Rodewald, L.-W., Tang, M., and Wahl, G.M. (2006). A mouse p53 mutant lacking the proline-rich domain rescues Mdm4 deficiency and provides insight into the Mdm2-Mdm4-p53 regulatory network. Cancer Cell 9, 273–285. 118 Literaturverzeichnis Torgeman, A., Mor-Vaknin, N., Zelin, E., Ben-Aroya, Z., Löchelt, M., Flügel, R.M., and Aboud, M. (2001). Sp1-p53 heterocomplex mediates activation of HTLV-I long terminal repeat by 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate that is antagonized by protein kinase C. Virology 281, 10–20. Tovar, C., Rosinski, J., Filipovic, Z., Higgins, B., Kolinsky, K., Hilton, H., Zhao, X., Vu, B.T., Qing, W., Packman, K., et al. (2006). Small-molecule MDM2 antagonists reveal aberrant p53 signaling in cancer: implications for therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 1888–1893. Tromp, J.M., Geest, C.R., Breij, E.C.W., Elias, J.A., van Laar, J., Luijks, D.M., Kater, A.P., Beaumont, T., van Oers, M.H.J., and Eldering, E. (2012). Tipping the Noxa/Mcl1 balance overcomes ABT-737 resistance in chronic lymphocytic leukemia. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 18, 487–498. Vaseva, A.V., Marchenko, N.D., Ji, K., Tsirka, S.E., Holzmann, S., and Moll, U.M. (2012). p53 opens the mitochondrial permeability transition pore to trigger necrosis. Cell 149, 1536–1548. Vassilev, L.T., Vu, B.T., Graves, B., Carvajal, D., Podlaski, F., Filipovic, Z., Kong, N., Kammlott, U., Lukacs, C., Klein, C., et al. (2004a). In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science 303, 844–848. Viadiu, H. (2008). Molecular architecture of tumor suppressor p53. Curr. Top. Med. Chem. 8, 1327–1334. Vo, T.-T., Ryan, J., Carrasco, R., Neuberg, D., Rossi, D.J., Stone, R.M., Deangelo, D.J., Frattini, M.G., and Letai, A. (2012). Relative mitochondrial priming of myeloblasts and normal HSCs determines chemotherapeutic success in AML. Cell 151, 344–355. Vousden, K.H., and Prives, C. (2009). Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell 137, 413–431. Wade, M., Li, Y.-C., and Wahl, G.M. (2013). MDM2, MDMX and p53 in oncogenesis and cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 13, 83–96. Wagner, E.F., and Nebreda, A.R. (2009). Signal integration by JNK and p38 MAPK pathways in cancer development. Nat. Rev. Cancer 9, 537–549. Waldman, T., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. (1995). p21 Is Necessary for the p53mediated G1 Arrest in Human Cancer Cells. Cancer Res. 55, 5187–5190. Wang, H., and Yan, C. (2011). A small-molecule p53 activator induces apoptosis through inhibiting MDMX expression in breast cancer cells. Neoplasia N. Y. N 13, 611–619. Wang, X.Z., and Ron, D. (1996). Stress-induced phosphorylation and activation of the transcription factor CHOP (GADD153) by p38 MAP Kinase. Science 272, 1347– 1349. Literaturverzeichnis 119 Wang, X.-T., Pei, D.-S., Xu, J., Guan, Q.-H., Sun, Y.-F., Liu, X.-M., and Zhang, G.-Y. (2007). Opposing effects of Bad phosphorylation at two distinct sites by Akt1 and JNK1/2 on ischemic brain injury. Cell. Signal. 19, 1844–1856. Wei, C.-L., Wu, Q., Vega, V.B., Chiu, K.P., Ng, P., Zhang, T., Shahab, A., Yong, H.C., Fu, Y., Weng, Z., et al. (2006). A global map of p53 transcription-factor binding sites in the human genome. Cell 124, 207–219. Weisz, L., Oren, M., and Rotter, V. (2007). Transcription regulation by mutant p53. Oncogene 26, 2202–2211. Weston, C.R., and Davis, R.J. (2002). The JNK signal transduction pathway. Curr. Opin. Genet. Dev. 12, 14–21. Westphal, D., Kluck, R.M., and Dewson, G. (2014). Building blocks of the apoptotic pore: how Bax and Bak are activated and oligomerize during apoptosis. Cell Death Differ. 21, 196–205. Willis, S.N., Fletcher, J.I., Kaufmann, T., van Delft, M.F., Chen, L., Czabotar, P.E., Ierino, H., Lee, E.F., Fairlie, W.D., Bouillet, P., et al. (2007). Apoptosis initiated when BH3 ligands engage multiple Bcl-2 homologs, not Bax or Bak. Science 315, 856– 859. Woessmann, W., Chen, X., and Borkhardt, A. (2002). Ras-mediated activation of ERK by cisplatin induces cell death independently of p53 in osteosarcoma and neuroblastoma cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 50, 397–404. Wolf, D., Harris, N., and Rotter, V. (1984). Reconstitution of p53 expression in a nonproducer Ab-MuLV-transformed cell line by transfection of a functional p53 gene. Cell 38, 119–126. Wu, Y., Mehew, J.W., Heckman, C.A., Arcinas, M., and Boxer, L.M. (2001). Negative regulation of bcl-2 expression by p53 in hematopoietic cells. Oncogene 20, 240–251. Xu, J., Reumers, J., Couceiro, J.R., De Smet, F., Gallardo, R., Rudyak, S., Cornelis, A., Rozenski, J., Zwolinska, A., Marine, J.-C., et al. (2011). Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat. Chem. Biol. 7, 285–295. Yamamoto, K., Ichijo, H., and Korsmeyer, S.J. (1999). BCL-2 is phosphorylated and inactivated by an ASK1/Jun N-terminal protein kinase pathway normally activated at G(2)/M. Mol. Cell. Biol. 19, 8469–8478. Yamamoto, T., Seino, Y., Fukumoto, H., Koh, G., Yano, H., Inagaki, N., Yamada, Y., Inoue, K., Manabe, T., and Imura, H. (1990). Over-expression of facilitative glucose transporter genes in human cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 223– 230. Yang, A., and McKeon, F. (2000). P63 and P73: P53 mimics, menaces and more. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 199–207. 120 Literaturverzeichnis Yang, A., Kaghad, M., Wang, Y., Gillett, E., Fleming, M.D., Dötsch, V., Andrews, N.C., Caput, D., and McKeon, F. (1998). p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities. Mol. Cell 2, 305–316. Yang, J., Ahmed, A., and Ashcroft, M. (2009a). Activation of a unique p53-dependent DNA damage response. Cell Cycle Georget. Tex 8, 1630–1632. Yang, J., Ahmed, A., Poon, E., Perusinghe, N., Brandon, A. de H., Box, G., Valenti, M., Eccles, S., Rouschop, K., Wouters, B., et al. (2009b). Small-Molecule Activation of p53 Blocks Hypoxia-Inducible Factor 1α and Vascular Endothelial Growth Factor Expression In Vivo and Leads to Tumor Cell Apoptosis in Normoxia and Hypoxia. Mol. Cell. Biol. 29, 2243–2253. Yang, Z., Schumaker, L.M., Egorin, M.J., Zuhowski, E.G., Guo, Z., and Cullen, K.J. (2006). Cisplatin preferentially binds mitochondrial DNA and voltage-dependent anion channel protein in the mitochondrial membrane of head and neck squamous cell carcinoma: possible role in apoptosis. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 12, 5817–5825. Yecies, D., Carlson, N.E., Deng, J., and Letai, A. (2010). Acquired resistance to ABT737 in lymphoma cells that up-regulate MCL-1 and BFL-1. Blood 115, 3304–3313. Yoshikawa, K., Hamada, J., Tada, M., Kameyama, T., Nakagawa, K., Suzuki, Y., Ikawa, M., Hassan, N.M.M., Kitagawa, Y., and Moriuchi, T. (2010). Mutant p53 R248Q but not R248W enhances in vitro invasiveness of human lung cancer NCIH1299 cells. Biomed. Res. Tokyo Jpn. 31, 401–411. Zawacka-Pankau, J., Kostecka, A., Sznarkowska, A., Hedström, E., and Kawiak, A. (2010). p73 tumor suppressor protein: a close relative of p53 not only in structure but also in anti-cancer approach? Cell Cycle Georget. Tex 9, 720–728. Zhao, C.Y., Grinkevich, V.V., Nikulenkov, F., Bao, W., and Selivanova, G. (2010a). Rescue of the apoptotic-inducing function of mutant p53 by small molecule RITA. Cell Cycle Georget. Tex 9, 1847–1855. Zhao, C.Y., Szekely, L., Bao, W., and Selivanova, G. (2010b). Rescue of p53 function by small-molecule RITA in cervical carcinoma by blocking E6-mediated degradation. Cancer Res. 70, 3372–3381. Zhu, J., Zhang, S., Jiang, J., and Chen, X. (2000). Definition of the p53 functional domains necessary for inducing apoptosis. J. Biol. Chem. 275, 39927–39934. Zuckerman, V., Wolyniec, K., Sionov, R.V., Haupt, S., and Haupt, Y. (2009). Tumour suppression by p53: the importance of apoptosis and cellular senescence. J. Pathol. 219, 3–15. Publikationen 121 Publikationen Wesentliche Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in: Originalarbeiten Weilbacher A, Gutekunst M, Oren M, Aulitzky WE, van der Kuip H. „RITA can induce cell death in p53 defective cells independently of p53 function via activation of JNK/SAPK and p38.” Cell Death and Disease, Feb 2014 (under revision) Vorträge Weilbacher A, Gutekunst M, Dengler MA, van der Kuip H, Aulitzky WE. „Role of constitutive levels of Bcl-2 family proteins for cisplatin sensitivity.“ Onkologie 2013;36(suppl 7):1-307 [V926] Weilbacher A, Gutekunst M, Oren M, Aulitzky WE, van der Kuip H. „Differential effect of the p53 inducers Nutlin-3 and RITA on cell lines with different p53-Status.“ Onkologie 2012;35(suppl 6):1-259 [V652] Weilbacher A, Aulitzky WE, van der Kuip H. „Gene expression profiling of p53 targets using the BioMark HD System.” Fluidigm European Roadshow, Hannover 2011 Weitere Originalarbeiten Dengler MA, Weilbacher A, Gutekunst M, Staiger AM, Vöhringer, Horn H., Ott G., Aulitzky WE, van der Kuip H. „Discrepant NOXA (PMAIP1) transcript and NOXA protein levels: a potential Achilles´ heel in mantle cell lymphoma.” Cell Death and Disease 2014 Jan 23;5:e1013 122 Publikationen Gutekunst M, Mueller T, Weilbacher A, Dengler MA, Bedke J, Kruck S, Oren M, Aulitzky WE, van der Kuip H. „Cisplatin hypersensitivity of testicular germ cell tumors is determined by high constitutive noxa levels mediated by oct-4.” Cancer Research 2013 Mar 1;73(5):1460-9 Gutekunst M, Oren M, Weilbacher A, Dengler MA, Markwardt C, Thomale J, Aulitzky WE, van der Kuip H. „p53 hypersensitivity is the predominant mechanism of the unique responsiveness of testicular germ cell tumor (TGCT) cells to cisplatin.” PLoS One 2011 Apr 21;6(4):e19198 Weitere Veröffentlichungen Dengler MA, Weilbacher A, Gutekunst M, Staiger AM, Horn H, Ott G, van der Kuip H, Aulitzky WE. „The Phenotype High Noxa mRNA/Low NOXA Protein Levels Constitutes a Critical Achilles Heel Of Mantle Cell Lymphoma (MCL) Cells.” Blood 2013 122:644, 55Th ASH Annual Meeting and Exposition, New Orleans, 2013 Dengler MA, Weilbacher A, Gutekunst M, Staiger AM, Horn H, Ott G, van der Kuip H, Aulitzky WE. „High NOXA (PMAIP1) transcript levels combined with a short-lived NOXA protein primes mantle cell lymphoma (MCL) cells for death by inhibition of the ubiquitin proteasome system.“ Proceedings of the 104rd Annual Meeting of the American Association of Cancer Research; 2013 April 6-10; Washington, District of Columbia. Philadelphia (PA):AACR, 2013. Abstract no. 1717 Gutekunst M, Müller T, Weilbacher A, Dengler MA, Oren M, Aulitzky WE, van der Kuip H. „Testicular germ cell tumors are hypersensitive to p53 activation based on their Oct-4/NOXA-mediated cellular context rather than on differential p53 activity.” Proceedings of the 104rd Annual Meeting of the American Association of Cancer Research; 2013 April 6-10; Washington, District of Columbia. Philadelphia (PA):AACR, 2013. Abstract no. 1721 Gutekunst M, Müller T, Weilbacher A, Dengler MA, Bedke J, Kruck S, van der Kuip H, WE Aulitzky. „Oct-4-dependent high constitutive Noxa determines p53-mediated Cisplatin hypersensitivity in testicular germ cell tumors.” Onkologie 2012;35(Suppl.6): 183 Publikationen 123 Gutekunst M, Mueller T, Weilbacher A, Dengler MA, Kruck S, Bedke J, Aulitzky WE, van der Kuip H. „OCT-3/4 expression is associated with high levels of the pro-apoptotic BH3 only protein NOXA in testicular germ cell tumors (TGCTs).” Proceedings of the 103rd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2012 Mar 31-Apr 4; Chicago, Illinois. Philadelphia (PA): AACR; 2012. Abstract no. 2002 Gutekunst M, Oren M, Weilbacher A, Dengler MA, Aulitzky WE, van der Kuip H. „High expression levels of NOXA are important for p53-mediated hypersensitivity in testicular germ cell tumor (TGCT) cells.” Proceedings of the 102nd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2011 Apr 2-6; Orlando, Florida. Philadelphia (PA): AACR; 2011. Abstract no. 4693 Lebenslauf 124 Lebenslauf Persönliche Daten Name: Andrea Weilbacher Geburtsdatum: 29.04.1985 Geburtsort: Krumbach (Schwaben), Bayern Anschrift: Hauptstraße 131 70563 Stuttgart-Vaihingen Studium und Schulausbilung 05/2011 – 04/2014 Dissertation am Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für Klinische Pharmakologie, Stuttgart Qualifikation: Dr. rer.nat Prof. Dr. Walter E. Aulitzky, Robert-Bosch-Krankenhaus, Stuttgart Prof. Dr. Peter Scheurich, Institut für Zellbiologie und Immunologie, Universität Stuttgart „Die Rolle des p53-Status für die Sensitivität von Tumoren gegenüber unterschiedlichen p53 Aktivatoren“ 10/2006 – 04/2011 Studium der Technischen Biologie, Universität Stuttgart Qualifikation: Diplom-Biologin (t.o.) Schwerpunkte: Immunologie, Technische Biochemie Diplomarbeit am Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für Klinische Pharmakologie, Stuttgart, bei Dr. Oliver Burk „Aktivität von Coregulatoren am -7,8 kb Enhancer des MDR1-Gens“ 09/1995 – 06/2004 Abitur am Simpert - Kraemer - Gymnasium Krumbach Mathematisch - naturwissenschaftlicher Zweig
