Biochemie – Tutorium 9
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Biochemie – Tutorium 9 RNA, Transkription IMPP-Gegenstandskatalog 3 Genetik 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 Nukleinsäuren Molekulare Struktur, Konformationen und Funktionen der Desoxyribonukleinsäure (DNA); Exon, Intron Molekulare Strukturen und Funktionen der Ribonukleinsäure (RNA) Genetischer Code 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 Umsetzung genetischer Information Transkription der DNA Prozessieren der RNA Translation Regulation der Proteinbiosynthese 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 Weitergabe und Verteilung genetischer Information Replikation der DNA Zellzyklus, Mitose, Meiose Meiotische Systeme, Kernphasenwechsel, Generationswechsel Plasmatische Vererbung Parasexuelle (parameiotische) Systeme, Phagen, Plasmide, Resistenzfaktoren 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4 Veränderungen der genetischen Information Somatische Mutationen, Mutationen der Keimbahn Mutationstypen, Genom-, Chromosomen- und Punktmutationen, Ames-Test Mutagene Faktoren und transponierbare genetische Elemente Umordnung der Gene (Anikörperbildung) 3.5 3.5.1 3.5.2 Grundlagen der Molekularbiologie Techniken der Molekularbiologie Klonierung und Überexpression von Genen Aufbau der RNA • RNA ist analog zur DNA ein Polymer aus einzelnen Nukleotidmonomeren, die über Phosphorsäurediesterbindungen kettenförmig verknüpft sind. • Es gibt jedoch charakteristische Unterschiede zwischen RNA und DNA RNA vs. DNA • RNA enthält als Zucker Ribose anstelle von Desoxyribose (DNA). • RNA enthält die Pyrimidinbase Uracil anstelle von Thymin. • RNA-Moleküle sind vergleichsweise kurze Polymere, da sie jeweils Transkripte eines einzelnen Gens darstellen. • RNA-Moleküle liegen immer als Einzelstränge vor. Es können allerdings innerhalb der Einzelstränge durch komplementäre Basenpaarung Doppelstrangbereiche existieren. RNA-Klassen • Es existieren verschiedene Spezies der RNA mit jeweils differenzierten Funktionen. • Prinzipiell kann man codierende und nicht codierende RNAs unterscheiden. • Die nichtcodierenden RNAs können zusätzlich anhand ihrer Funktion dem strukturell/katalytischen Typ oder dem regulatorischen Typ zugeordnet werden. Codierende RNA • Die sog. mRNA (messenger-RNA) dienen als Matrizen für die Proteinbiosynthese. Sie stellen Negativkopien eines DNA-Abschnitts dar, der die Syntheseinformation für ein bestimmtes Protein enthält. • codierende Nukleotidsequenz der DNA kann auf dem einen oder dem anderen Strang liegen (jeder der beiden Stränge kann in bestimmten Abschnitten codogen und in anderen Abschnitten nicht-codogen sein) → beide Stränge enthalten codierende Sequenzen • Die Synthese von mRNA erfolgt im Zuge der Transkription als Teil der Proteinbiosynthese und unterscheidet sich bei Eukaryoten und Prokaryoten zum Teil erheblich. Nicht-codierende RNA mit strukturell/katalytischen Funktionen • Diese RNA-Klasse ist die umfangreichste, sie besteht aus folgenden RNA-Spezies: – tRNA (transfer-RNA) – rRNA (ribosomale RNA) – snRNA (small nuclear RNA) – snoRNA (small nucleolar RNA) – SRP (signal-recognition Particle-RNA) – Ribonuclease P-RNA – Telomerase-RNA tRNA (transfer-RNA) • Die tRNA dient als Adaptermolekül bei der Proteinbiosynthese. Aufgrund von intramolekularer Hybridisierung liegt sie in einer Kleeblattstruktur vor. • Jedes tRNA-Molekül verfügt über eine spezifische Basensequenz, die aus drei Basen (Triplett, sog. Anticodon) besteht. • Das Anticodon hat ein komplementäres Triplett auf der mRNA, mit dem es sich im Zuge der Proteinbiosynthese paart. • Außerdem besitzen alle tRNA-Moleküle ein terminales Ende mit der Basensequenz CCA. • Dieses terminale Ende bindet eine bestimmte Aminosäure. • Das Enzym Aminoacyl-Transferase erkennt ein tRNA-Molekül mit einem bestimmten Anticodon und verbindet es unter ATPVerbrauch mit der jeweils zugehörigen Aminosäure. rRNA (ribosomale RNA) • Die rRNA ist am Aufbau der Ribosomen beteiligt und wirken zusätzlich bei der Proteinbiosynthese katalytisch bei der Knüpfung der Peptidbindung. • Die Sekundärstruktur der rRNA ist sehr komplex. (keine Kleeblattstruktur) snRNA (small nuclear RNA) • Die snRNA ist am Aufbau der sog. Spleißosomen beteiligt und wirken bei der Prozessierung der mRNA mit. • Die restlichen nichtcodierenden RNA-Klassen mit strukturell/katalytischen Funktionen werden zur Modifikation von RNA, den intrazellulären Proteintransport oder auch als Bestandteile von Enzymen benötigt. Nicht-codierende RNA mit regulatorischen Funktionen • Diese Klasse der RNA-Moleküle sind am der Regulation des mRNA-Abbaus, der Genexpression und der Chromosomeninaktivierung beteiligt. • Zu dieser Gruppe gehören – miRNA (Mikro-RNA) – siRNA (small interfering RNA) – Xist-RNA Proteinbiosynthese Prokaryoten vs. Eukaryoten • Die Proteinbiosynthese unterscheidet sich hinsichtlich der Komplexität deutlich bei Pround Eukaryoten. • Im Folgenden wird die Proteinbiosynthese der Eukaryoten besprochen. Transkription • Unter Transkription versteht man die Synthese der Kopie eines Gens auf der DNA in Form eines einzelsträngigen RNA-Moleküls. • Dabei dient ein Strang der DNA als Matrize für die RNA-Synthese (codogener Strang, Matrizenstrang, Minusstrang) • Die Basensequenz des des zum Matrizenstrang komplementären DNA-Strangs wird als Plusstrang oder Nicht-Matrizenstrang bezeichnet. • Die für die Transkription verantwortlichen Enzyme sind DNA-abhängige RNAPolymerasen. • Der Reaktionsmechanismus aller RNAPolymerasen entspricht dem der DNAPolymerasen. –> Die Verlängerung erfolgt in 5´->3´-Richtung • RNA-Polymerasen benötigen keinen Primer (siehe Replikation) • Im Zellkern befinden sich die drei RNAPolymerasen I-III, die jeweils unterschiedliche RNA-Klassen synthetisieren: – RNA-Polymerase I (im Nucleolus) rRNA – RNA-Polymerase II (im Kernplasma) mRNA und snRNA – RNA-Polymerase III (im Kernplasma) tRNA • Die Transkription wird analog zur Replikation in drei Stadien eingeteilt: – Inititation – Elongation – Termination Einschub: Aufbau eines Gens • Transkribierende Gene benötigen zusätzlich zur codierenden Sequenz noch ein sog. Promotorregion. Diese enthält Sequenzen, die als Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren dienen. • Die jeweiligen Sequenzen sind von Gen zu Gen nicht vollständig identisch, jedoch weitestgehend homolog. Promotor • basalen Promotorelemente (z.B. TATA-Box) – Sequenzen, die bis etwa 40 Basen vor Transkriptionsstartpunkt angeordnet sind. – Binden sog. Allgemeine Transkriptionsfaktoren – Funktion: korrekte Positionierung der RNA-Polymerase • Distale Promotorelemente (z.B. CAAT-Box) – Sequenzen, die bis etwa 120 Basen vor Transkriptionsstartpunkt angeordnet sind. – Binden spezifische Transkriptionsfaktoren, die über Effizienz der Transkription entscheiden ( regulatorische Transkriptionsfaktoren) Enhancer/Silencer • Bestimmte Sequenzelemente, die bis zu 1000 Basen vom Transkriptionsstartpunkt entfernt lokalisiert sind binden v.a. ligandenaktivierbare Transkriptionsfaktoren, die die Transkriptionsrate steigern (Enhancer) oder reduzieren (Silencer) können. • Bsp.: Steroidhormonrezeptoren. Initiationsphase der Transkription • Zuerst bindet das TATA-Box binding Protein (TBP) an die TATA-Box. Die Bindung induziert eine lokale Verbiegung der DNA, welche zur Trennung der beiden Einzelstränge führt. • TBP ist eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors TFIID. • Anschließend wird durch Anlagerung weiterer Transkriptionsfaktoren, der RNA-Polymerase II und dem aus 20 Untereinheiten bestehenden Mediatorkomplexes der sog. Initiationskomplex gebildet. Elongationsphase der Transkription • Der Übergang von der Initiations- zur Elongationsphase beginnt mit der Phosphorylierung der C-terminalen Domäne der RNA-Polymerase II durch Proteinkinasen. • Die Proteinkinasen sind an verschiedenen Transkriptionsfaktoren assoziiert. • Die Phosphorylierung führt zu Abdissoziation der Initiationsfaktoren und des Mediatorkomplexes. • Die Elongation der RNA verläuft analog zur Elongationsphase der Replikation in 5´-3´Richtung. Cotranskriptionale Modifiaktionen • Die von der RNA-Polymerase II primär hergestellten prä-mRNAs sind im Allg. noch nicht funktionsfähig. • Sie werden während der Transkription (cotranskriptional) durch umfangreiche Modifikationen in funktionstüchtige mRNAMoleküle umgewandelt. • Dieser Prozess wird auch als cotranskriptionelle Prozessierung bezeichnet. Cotranskriptionale Modifiaktionen • Bei der cotranskriptionalen Prozessierung handelt es sich um folgende drei Prozesse: – Anheftung einer 5´-Kappengruppe (Capping) – Spleißen (Splicing) – Poly-Adenylierung am 3´-Ende Capping • Funktionsfähige mRNA-Moleküle zeichnen sich durch eine sog. Cap-Struktur aus. Diese dient – dem Schutz vor Abbau durch Nucleasen – als Signal für Transport der mRNA durch Kernporen – Und der Erleichterung der Anlagerung der mRNA an das Ribosom im Zuge der Translation • Die Cap-Struktur bezeichnet ein methyliertes Guanosintriphosphat, welches über eine seltene 5´-5´-Phosphorsäurediesterbindung an das 5´Ende des mRNA-Moleküls geknüpft ist. Spleißen • Die meisten Gene der Eukaryoten enthalten neben codierenden Sequenzen (Exons) auch nichtcodierende Sequenzen (Introns). • Die Introns werden cotranskriptional durch Spleißen aus der prä-mRNA herausgeschnitten und die verbleibenden Enden anschließen basengenau miteinander verknüpft. • Die Entfernung der Introns erfolgt rein mechanistisch durch zweifache Umesterung. Dabei greift ein im Intron gelegenes essentielles Adeninnucleotid mit seiner´2´-OH-Gruppe die Phosphorsäurediesterbindung zwischen Exon 1 und Intron an. Dadurch entsteht im Intron eine sog. Lassostruktur. Die jetzt freie 3´-OH-Gruppe von Exon 1 greift im folgenden Schritt die Phosphorsäurediesterbindung am Übergang zwischen Intron und Exon 2 an. Als Folge wird das Intron mit seiner Lassostruktur freigesetzt und die beiden Exons verknüpft. • Prinzipiell ist für die Katalyse des Spleißens kein Enzym notwendig. Die RNA besitzt eine autokatalytische Aktivität. • Bei höheren Eukaryoten ist für das Spleißen der prä-mRNA allerdings ein komplexer Apparat , das sog. Spleißosom, notwendig. • Das Spleißosom ensteht durch Anlagerung von prä-mRNA und sog. snRNPs (small nuclear ribonucleoproteins), die charakteristischen ExonIntron-Sequenzen erkennen. • snRNPs sind Assoziate aus snRNA und Proteinen. • Alternatives Spleißen – Die Anwesenheit vieler Introns in der DNA ermöglicht es, das aus einer prä-mRNA verschiedene reife mRNAMoleküle und schlussendlich Proteine entstehen. Polyadenylierung • Der letzte cotranskriptionale Prozess führt zur Anheftung einer Sequenz aus 50 bis zu mehr als 200 Adenylresten, die als Poly-A-Ende bzw. Poly-A-Schwanz bezeichnet werden. Das Signal für die Anheftung ist eine spezifische Sequenz der naszierenden prä-mRNA (AAUAAA). • Die Polyadenylierung erfolgt folgendermaßen: – Spaltung der prä-mRNA hinter der Polyadenylierungssequenz durch eine spezifische Endonuklease – Anheftung von AMP-Resten aus ATP durch eine Polyadenylatpolymeras – Anheftung von Poly-A-Bindungsproteinen Termination der Transkription • Für die Termination der Transkription eukaryoter Gene sind eine Reihe von Proteinfaktoren verantwortlich. • Der Prozess ist noch weitestgehend unbekannt. • Häufig endet die Transkription erst mehr als tausend Basenpaare nach dem 3´-Ende des codierenden Bereichs. Reifes mRNA-Molekül • Das reife mRNA-Molekül verlässt den Kern anschließend durch eine Kernpore ins Cytosol.
