„Stammzellen und Klonen“
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„Stammzellen und Klonen“ Prof. Dr. med. Lukas A. Huber (Biozentrum, Zellbiologie [email protected] ) & Prof. Dr.med. Dr.theol. Stephan P. Leher (Systematische Theologie, [email protected]) 8. – 12. Januar 2007, Hörsaal Histologie 2.Stock, täglich ab 12.00 Uhr Themen • Einführung in Stammzellen und Klonen • Reprogrammierung des Zellkerns • Patienten spezifische Stammzellen geklont – der Fall Hwang • Fallbeispiel • Risk-Assessment Stammzellen • Eine Stammzelle ist eine Art Ursprungszelle, die sich unbegrenzt vermehren und alle Zelltypen des Körpers bilden kann (zum Beispiel Muskelzelle, Nervenzelle, Blutzelle). • Diese Fähigkeit der Stammzellen bezeichnet man als Pluripotenz / Totipotenz. • Stammzellen finden sich in Embryonen, Föten und wurden bislang auch in 20 Organen des menschlichen Körpers nachgewiesen (zum Beispiel im Knochenmark). • Je nach Herkunftsort der Stammzellen unterschiedet man embryonale (aus dem Embryo), fetale (aus dem Fötus) und adulte (von Säuglingen, Kindern, Erwachsenen) Stammzellen. Totipotenz • Nach dem heutigen Wissensstand besitzt eine Zelle bis zum Acht-ZellenStadium, also drei Zellteilungen nach Befruchtung der Eizelle, Totipotenz. Mit diesen totipotenten Zellen darf in vielen Ländern der Erde nicht geforscht werden. Stammzelle teilen sich asymmetrisch Stammzelle Selbsterneuerung • Jede Tochterzelle kann entweder eine Stammzelle bleiben oder eine terminal differenzierte Zelle werden • Selbsterneuerung Terminal differenzierte Zelle • Tochterzellen initial sehr ähnlich • Umgebung beeinflusst Entwicklung • Anzahl der Zellen kann der biologischen Nische rasch angepasst werden Selbsterneuerung Asymmetrie durch Umgebung Stammzelle • Interne Asymmetrie • Determinante nur an eine Tochterzelle weitergegeben • Schon bei der Geburt der Zelle festgelegt Selbsterneuerung Asymmetrie der Teilung Stammzelle Intestinale Stammzellen Dermale Stammzellen Strategien zur Erhaltung des Gleichgewichtes zwischen Stammzellen und differenzierten Zellen Asymmetrische Teilung Symmetrische Teilung Kombination Symmetrische & Asymmetrische Teilung Je nach Bedarf können sich Stammzellen symmetrisch oder/und asymmetrisch teilen Symmetrisch innerhalb der Ebene der Zellschicht (Spindel!) Asymmetrisch ausserhalb der Ebene der Zellschicht (Spindel!) Während der Entwicklung expandieren symmetrische Zellteilungen den Stammzellpool Im gesunden, ausgewachsenen Organismus Asymmetrische Teilungen in der basalen Schicht im Epithel und Neuroepithel Verletzung: symmetrische Teilungen regenerieren Stammzellen, asymmetrische Teilungen regenerieren differenzierte Tochterzellen Asymmetrie der Teilung: Im Nervensystem Das kann auch bei der Krebsentstehung eine Rolle spielen Tumor: Gleichgewicht zwischen asymmetrischen und symmetrischen Teilungen gestört Defekt der symmetrische Teilungen hervorruft führt zur Tumorentstehung Defekt der asymmetrische Teilungen hervorruft führt zur Verminderung der Gewebewiederherstellung Stammzell-Nischen Stammzellpopulationen etablieren sich in Nischen Nischen sind anatomische Lokalisationen und schützen Stammzellen vor Depletierung & schützen den Organismus vor zu vielen Stammzellen Modelle der adulten Stammzell-Nische Differenzierte Tochterzelle Heterologe Zellen regulieren Nische Stammzelle Andere Zelle Extrazelluläre Matrix, Basalmembran und nicht zelluläre Komponeneten regulieren Nische Matrix Basalmembran Inputs für Stammzellfunktion in der Nische • • • • • • • Anatomische Architektur Physische Interaktion der Zellmembran mit Kontaktproteinen an Nachbarzellen oder Matrix Signalinteraktionen mit Nische oder Tochterzellen Parakrine Signale Endokrine Signale Neuronaler Input Metabolische Produkte der Gewebeaktivität Nischenbeteiligung an der Tumorentstehung • A--normale Interaktionen und Okkupanz der Nische • B--Stammzelle fehlt in der Nische, andere Zellen übernehmen • C--Falsche Nischen Signale treiben Zellen in Proliferation oder Verlust der Differenezierung Die Stammzellnische könnte therapeutisch genützt werden • • • • • Hämtatopoetische Stammzellen sitzen im Knochenmark in ihrer Nische und in der unmittelbaren Nähe des Knochens Medikamente und Hormone die den Knochen- und Mineralstoffwechsel beeinflussen könnten indirekt die Stammzellnische beeinflussen z.B.: Parathyroidales Hormon (PTH) stimuliert Rezeptor auf Osteoblasten, Hämtatopoetische Stammzellen besitzen keinen Rezeptor dafür! Trotzdem: Stimulation der Produktion von Hämtatopoetischen Stammzellen Daher: indirekter therapeutischer Effekt über pharmakologische Beeinflussung der Stammzellnische! Komplexe Regelkreise der Stammzellfunktionalität Stammzellen und Altern • Regeneration im Alter generell vermindert • Ist Altern der Stammzellen dafür verantwortlich oder die Stammzellfunktionen vermindert, weil die Gewebeumgebung gealtert ist? • Das hat auch für degenerative Erkrankungen Bedeutung. Gewebe Heterogenität und Stammzellen Funktionalität für Regeneration und Homeostase • Effekte des Alterns der Stammzellen auf den Phänotyp eines alternden Gewebes korreliert mit dem Ausmaß mit dem Stammzellen an der normalen Homeostase und Reparatur eines bestimmten Gewebes beteiligt sind! Altern der Stammzellen Funktionalität kann sich auf verschiedenen Ebenen abspielen Chronologisches und Replikatives Altern von Stammzellen • • Somatische Zellen haben ein limitiertes replikatives Potential! Genomische Instabilität, Telomeren werden verkürzt, Mutationen akkumulieren • Je nach Herkunftsort der Stammzellen unterschiedet man embryonale (aus dem Embryo), fetale (aus dem Fötus) und adulte (von Säuglingen, Kindern, Erwachsenen) Stammzellen. Adulte Stammzellen • Sie werden durch eine Biopsie aus dem gewünschten Gewebe gewonnen. • Je nach Gewebetyp gestaltet sich diese Entnahme einfacher oder schwieriger. – z.B. die hämatopoetischen Stammzellen können entweder aus dem Knochenmark entfernt oder direkt aus dem Blut gefiltert werden. Adulte Stammzellen... • Die Häufigkeit von Stammzellen im entnommenen Gewebe ist sehr klein was eine Vermehrung in Kulturen notwendig macht. • Diese spezialisierten Zellen kommen bei Kindern häufiger Vorkommen als bei Erwachsenen. Adulte Stammzellen... • Eine weitere Schwierigkeit besteht in der Unterscheidung zwischen den Stammzellen und den normalen Gewebezellen. Bis jetzt wurde jedoch noch kein molekularer Marker identifiziert der dieses Problem löst. Was unterscheidet embryonale von adulten Stammzellen? • Adulte Stammzellen haben nach dem gegenwärtigen Forschungsstand gegenüber fetalen und embryonalen Stammzellen ein reduziertes Entwicklungspotential. • Im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen ist ihre Vermehrbarkeit limitiert und ihre Lebensdauer somit begrenzt. Was unterscheidet embryonale von adulten Stammzellen? • Ihr unbestreitbarer Vorteil liegt darin, dass sie dem Patienten entnommen werden können. • Dadurch gibt es später keine Abstoßungsreaktionen. • Ethische Probleme treten bei der Gewinnung von adulten Stammzellen nicht auf. Gewinnung aus abgetriebenen Foeten • Stammzellen können auch aus fünf- bis neunwöchigen abgetriebenen Föten gewonnen werden. • Die fetalen Stammzellen sind Vorläufer der Ei- bzw. Samenzellen. Man bezeichnet sie daher als primordiale Keimzellen, die im Labor zu embryonalen Keimzellen weiterentwickelt werden. • Sie sind pluripotent • Sie werden nach induziertem oder spontanem Abort aus fünf- bis neunwöchigen Föten isoliert und unter Kulturbedingungen (in-vitro) zu embryonalen Keimzellen (EG-Zellen) weiterentwickelt. • Trotz ihrer Anlage auf Bildung eines neuen Organismus, sind sie keine unmittelbaren Derivate der befruchteten Eizelle mehr, sondern Differenzierungsprodukte des implantierten Embryos. Gewinnung von Stammzellen Problematik bei der Gewinnung embryonaler Stammzellen • Sowohl beim Klonen als auch bei der Gewinnung von Stammzellen aus "überzähligen Embryonen" werden die verwendeten Embryonen zerstört. • Daher sind diese Methoden zB in Deutschland durch das Embryonen-schutzgesetz verboten. • Nur die Erzeugung embryonaler Stammzellen aus abgetrieben Föten ist unter bestimmten Voraussetzungen erlaubt. Beginn des Lebens – in Gesetzen unterschiedlich definiert • In Großbritannien dürfen Forscher und Ärzte schon seit zwei Jahrzehnten im Labor mit bis zu wenige Tage alten menschlichen Embryonen arbeiten – bis zu jenem Zeitpunkt, an dem sich der Keimling natürlicherweise in die Gebärmutter eingenistet hätte. • Dies gilt auf der Insel als Beginn menschlichen Lebens. Beginn des Lebens – in Gesetzen unterschiedlich definiert • Das deutsche Embryonenschutzgesetz von 1991 hingegen sieht den Beginn im Verschmelzen der Kerne von Ei- und Samenzelle – und verbietet daher die Forschung an Embryonen. Embryonale Stammzellen • Embryonale Stammzellen werden aus dem Inneren von wenige Tage alten Embryonen entnommen. Zur Zeit gibt es drei Möglichkeiten, embryonale Stammzellen zu gewinnen: – 1. Aus Embryonen, die bei einer künstlichen Befruchtung entstehen – 2. Aus abgetriebenen Föten – 3. Durch "therapeutisches Klonen" (Zellkerntransfer) Gewinnung aus Embryonen • Nach einer in vitro Fertilisation, entsteht eine Zelle, die sich in rascher Folge teilt. Bis zum Acht-Zell-Stadium verfügen die Zellen über die so genannte Totipotenz. • Aus diesem Zellverband entwickelt sich dann die Blastozyste, aus deren innerer Zellmasse am vierten Entwicklungstag die pluripotenten embryonalen Stammzellen für die Forschung gewonnen werden können. Woher kommen die ES Zellen? Blastozyst Gewinnung von Stammzellen Menschliche Stammzellkolonie Kultivierung aus Blastozysten Problematik bei der Gewinnung embryonaler Stammzellen • Sowohl beim Klonen als auch bei der Gewinnung von Stammzellen aus "überzähligen Embryonen" werden die verwendeten Embryonen zerstört. • Daher sind diese Methoden zB in Deutschland durch das Embryonen-Schutzgesetz verboten. • Nur die Erzeugung embryonaler Stammzellen aus abgetrieben Föten ist unter bestimmten Voraussetzungen erlaubt. Stammzellenbehandlung bei neurologischen Erkrankungen Stammzellentransplantation nach ischämischen Infarkt im Hirngewebe • • • • • • Humane fetale neuronale Stammzellen Wurden mit GFP markiert Transplantiert in Ratten nach experimentell induziertem Hirnschlag Überleben mindestens 1 Monat Differenzieren Werden morphologisch Neuronen ähnlich Differenzierung embryonaler Stammzellen in verschiedene Herzzellen • • Transkriptionsfaktoren früher Stammzellen erhalten pluripotenz Danach werden diese durch Transkriptionsfaktoren abgelöst, die für Differenzierung verantwortlich sind Potential von postnatalen kardialen Vorläuferzellen • • • • • Kardiale Vorläuferzellen Ersetzen laufend apoptotische Zellen im Herzgewebe Kleine Zellen die noch keine kardialen Marker tragen Selbsterneuerung durchlaufen Und proliferieren können Können adulte mesenchymale Stammzellen defekte Herzen heilen? Humane Stammzelltherapie genetisch bedingter Hämatologischer Erkrankungen • Länder mit Humaner Large-Scale Stammzelltherapie Stammzellen durch Therapeutisches Klonen • Der Begriff Klonen bezeichnet allgemein die künstliche Herstellung einer genetisch identischen Kopie eines Lebewesens durch Fortpflanzungstechnik. „Therapeutisch“ • „Therapeutisch“ heißt dieses Klonen, weil es nur dem Zweck einer Behandlung dient. Das Einpflanzen eines solchen Embryos in die Gebärmutter einer Frau – also eine Entwicklung hin zum menschlichen Klon – bleibt verboten. Durch "therapeutisches Klonen" • Ungeschlechtliche Fortpflanzung durch Zellkerntransfer in eine enukleierte Eizelle • Technik am geklonten Schaf "Dolly" etabliert • Das hochdifferenzierte genetische Programm eines Körperzellkerns kann offensichtlich nach der Überführung in das Eizellplasma eine weitgehende Reprogrammierung erfahren. • Hierbei entsteht eine neue totipotente Zelle, die sich analog einer befruchteten Eizelle zur Blastozyste entwickeln kann. Therapeutisches Klonen….. • Diese Methode eröffnet die Möglichkeit, aus einer somatischen Zelle eines Patienten und einer enukleierten Eizelle, ES-Zellen mit dem Genom des Patienten zu erhalten. • Aus diesen individualspezifischen Stammzellen liessen sich gesunde Zellen und Gewebe erhalten, die bei der Übertragung auf den Patienten keine immunologischen Probleme hervorrufen. Zellkerntransfer in eine enukleierte Eizelle Reprogrammierung des Nukleus Epigenetic Acetylierung Methylierung Imprinting Epigenetik • Modifikation der DNA Sequenz, Methylierung • Histonproteine, die an DANN gebunden sind können auch modifiziert werden, Methylierung und Acetylierung • Diese Modifikationen bewirken an und abschalten von Genen, die für Differenzierung und Entwicklung benötigt werden Epigenetik • Diese epigenetischen Veränderungen bewirken keine Veränderung des genetischen Codes • Sind robust und vererbbar • Bewirken, dass adulte Zellen ihre Eigenschaften im Organisms erhalten können • Müssen ausgelöscht und neu gesetzt werden während der Reprogrammierung des Zellkerns Acetylierung und DeAcetylierung von Histonen Methylierung Methylierung Acetylierung IMPRINTING Reprogramierung ist dasProblem nach Zellkerntransfer • Niedrige Effizienz • Mechanismen weitgehend unbekannt • Vielleicht habe Oozyten einige Faktoren zum Auslöschen des epigenetischen Codes nicht oder nur unzureichend • Sind komplexe Zellen mit sterteotypen Entwicklungsprogramm • Somatische Zellkerne haben Schwierigketen sich anzupassen Verwendung embryonaler Stammzellen • Fusionieren von embryonalen Stammzellen mit somatischen Zellen Heterokaryon ? • Es ist 2005 gelungen humane embryonale Stammzellen mit Fibroblasten zu fusionieren und diese Zellkerne damit pluripotent zu machen Reprogrammierung durch Fusion mit embryonalen Stammezllen Differenzierungs- und Klonierungs-Effizienz • Zellkernprogrammierung induziert durch Kulturbedingungen Epigenetische Zellkernprogrammierung Geschichte Klonieren: KernTransfer • 1952 – Briggs und King klonieren Kaulquappen • 1996 – Erstes Säugetier aus adulten Zellen geklont - Dolly, • 1998 – Mäuse • 1998 – Kühe • 2000 – Schweine Das Dolly Prinzip Der erste Säugetierklon aus einer adulten Zelle • Es gelang ihnen, die Zellzyklen der adulten Spenderzelle und der Eizelle, die deren Erbsubstanz aufnehmen sollte, zu synchronisieren. Um dies zu erreichten, muss die Spenderzelle in ein spezielles Ruhestadium, die sogenannte "GO-Phase" gebracht werden. Die Phasen des Zellzyklus im Eukaryonten M Phase (Mitose) (Kern- und Zellteilung) G2 Phase (Reperatur-und Vorbereitungsphase) G1 Phase (Wachstumsphase) Eukaryontischer Zellzyklus S Phase (DNS-Synthesephase) Anm: G0,1,2 = Gap (englisch Pause) G0 Phase (Ruhephase) …..zu welchem Preis? • In der Praxis brauchten Wilmot und Cambell fast 300 Anläufe, um mit dieser Methode einen Embryo zu produzieren, der nicht nach den ersten Zellteilungen sofort wieder abstarb. Dolly allerdings hielt durch. Sie wurde nach einigen Tagen im Reagenzglas in die Gebärmutter einer Schafs-Leihmutter eingepflanzt und ganz normal ausgetragen und geboren. • Rein äußerlich ein Schaf wie alle anderen, war das neugeborene Lamm dennoch eine weltweite Sensation: Dolly war die exakte genetische Kopie des Schafs, aus dessen Euterzelle sie entstand ein Klon. Somatischer Zellkerntransfer in Menschen: Parthenogenese 1 2 3 4 5 6 7 8 Erste Teilungen nach ca 24 h ..am 4. oder 5. Tag …..dieser Schritt ist bis jetzt nur in Tieren möglich Humanes – Reproduktives Klonen • 2001 – Erste klonierte humane Embryonen (nur bis 6 Zellen Stadium) Advanced Cell Technology (USA) • 2004* – Erster humaner Blastozyt geklont und daraus eine Zellinie etabliert (Korea) *Hwang, W.S., et al. 2004. Evidence of a Pluripotent Human Embryonic Stem Cell Line Derived from a Cloned Blastocyst. Science 303: 1669-1674. Geklonte ES Zellen differenzieren in verschiedene Gewebe Neural Bone Retinal Cartilage Epithelial Vorsicht! • Fusionseffizienz sehr gering • Produktive Hybride müssen durch Selektion gewonnen werden • Dauert bis zu 10 Tage, schwierig frühe Stadien zu untersuchen! • Derzeit ist es nicht möglich die Chromosomen der Stammzellen vorher zu entfernen---Einfluss? • Faktoren immer noch unbekannt, obwohl die HistonDemethylase LSD1 gefunden wurde, die involviert ist (Leet et al., Nature 2005) • Suche nach ähnlichen Molekülen ! Stammzellen und Gentherapy Nabelschnurblut? • Zum Zeitpunkt der Geburt befinden sich zudem Stammzellen im kindlichen Blutkreislauf. Diese können nach der Geburt aus Nabelschnur und Plazenta gewonnen werden. Deshalb heißen sie Nabelschnurblut-Stammzellen. • Bislang sind vor allem die blutbildenden (hämatopoetischen)Stammzellen im Nabelschnurblut von Interesse. Therapie • Nabelschnurblut-Stammzellen können prinzipiell bei allen Erkrankungen eingesetzt werden, bei denen bislang erwachsene (adulte) Stammzellen verwendet werden. • Nabelschnurblut-Stammzellen sind weltweit rund zweitausendmal eingesetzt worden - ein Viertel der Empfänger waren Erwachsene. Expansion in Kultur Reifung, Differenzierung / in vivo Stammzellen und Gentherapy http://stemcells.nih.gov/
