Molekulardynamik-Simulationen für Reaktionen in Lösung und in

Bühl, Michael et al. | Molekulardynamik-Simulationen für Reaktionen in Lösung...
Tätigkeitsbericht 2006
Chemie
Molekulardynamik-Simulationen für Reaktionen in Lösung und in
Enzymen
Bühl, Michael; Thiel, Walter
Max-Planck-Institut für Kohlenforschung, Mülheim an der Ruhr
Abteilung - Theorie
Korrespondierender Autor
Bühl, Michael, E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Aktuelle Anwendungen molekulardynamischer Simulationen werden vorgestellt, die detaillierte
Einblicke in die Dynamik chemischer Prozesse liefern. Die Beispiele umfassen Struktur und Dynamik
von Vanadium- und Uran-Komplexen in wässriger Lösung sowie die Optimierung der Enantioselektivität einer Lipase-katalysierten Esterspaltung durch gerichtete Evolution.
Abstract
Recent applications of molecular dynamics simulations are presented, which afford detailed insights
into the dynamics of chemical processes. Examples comprise structure and dynamics of vanadium and
uranium complexes in aqueous solution, as well as the enantioselectivity of a lipase-catalyzed saponification, optimized by directed evolution.
Einleitung
Das virtuelle Labor, in dem alle chemischen Reaktionen vorausberechnet werden können, ist ein lange
gehegter Traum der theoretischen Chemie. Mit den modernen Methoden der Quantenchemie ist es
heute möglich, Strukturen und Eigenschaften kleiner und mittelgroßer Moleküle in der Gasphase mit
beachtlicher Genauigkeit zu berechnen und vorherzusagen, manchmal sogar zuverlässiger als mittels
Experimenten. Dies gilt auch für die Triebkraft chemischer Reaktionen zwischen diesen Molekülen.
Diese Rechnungen werden meist für ausgewählte Punkte auf der Potenzial-Hyperfläche, d.h. für statische Moleküle durchgeführt.
Fragen nach dem genauen Verlauf chemischer Reaktionen in komplexen Gemischen sind mit solchen
statischen Rechnungen allerdings kaum verlässlich zu beantworten. Dies gilt insbesondere für Umsetzungen in kondensierter Phase, wenn zusätzlich zu den Wechselwirkungen der eigentlichen Reaktionspartner noch jene mit oder innerhalb der Umgebung einzubeziehen sind, z. B. die Solvatation durch
ein polares Lösungsmittel wie etwa Wasser oder die Dynamik des Peptidstrangs um das aktive Zentrum eines Enzyms. Naturgemäß hängen Effekte dieser Art stark von der Temperatur, d.h. der thermischen Bewegung der einzelnen Teilchen ab.
Diese Bewegungen lassen sich mit molekulardynamischen (MD-) Simulationen verfolgen, bei denen
die zeitlichen Veränderungen eines Systems, ausgelöst durch die instantan auftretenden Kräfte zwischen den Atomen, explizit verfolgt werden. Auf diese Weise werden nicht nur einzelne Punkte auf der
© 2006 Max-Planck-Gesellschaft
www.mpg.de
Tätigkeitsbericht 2006
Bühl, Michael et al. | Molekulardynamik-Simulationen für Reaktionen in Lösung...
Energie-Hyperfläche erfasst, sondern alle relevanten Gebiete einschließlich der Reaktionspfade, die
schlussendlich zu chemischen Umsätzen führen. Im Folgenden werden einige Anwendungen derartiger
Simulationen exemplarisch beleuchtet.
Strukturen von Übergangsmetall-Komplexen in Lösung
Gemäß ihrer Bedeutung in der präparativen Chemie und der Biochemie sind Übergangsmetall-Komplexe Gegenstand intensiver theoretischer Untersuchungen. Die oftmals komplizierte elektronische
Struktur dieser Verbindungen erfordert eine genaue, d.h. quantenchemische Beschreibung. Gegenwärtig sind mit entsprechenden Methoden nur relativ kurze MD-Simulationszeiten in der Größenordnung
weniger Picosekunden möglich. In günstigen Fällen lassen sich aber bereits in solch kurzen Zeitfenstern spontane Prozesse beobachten, die wertvolle Schlüsse auf die Zusammensetzung und Struktur der
realen Lösungen zulassen. Ein Beispiel hierfür sind Komplexe zwischen Vanadat(V) und Dipeptiden,
die als Modellverbindungen für die Wechselwirkung zwischen diesem Metallfragment und Proteinen
dienen. Obwohl experimentell gut untersucht, sind die Strukturen dieser Komplexe unter physiologischen Bedingungen, d.h. in wässriger Lösung bei pH 7, nicht gesichert. Ausgehend von einer plausiblen, neutralen Startstruktur mit sechsfacher Koordination um das Vanadium, verliert der prototypische
Vanadat-Glycylglycin-Komplex während einer MD-Simulation in Wasser zunächst einen H2O-Liganden und dann ein Proton (siehe Kreis bzw. Pfeil in Abb. 1) an das umgebende Solvens. Diese raschen
und spontanen Ereignisse zeigen, dass derartige Vanadat-Dipeptid-Komplexe als anionische, fünffach
koordinierte Spezies zu formulieren sind.
Abb. 1: Startkonfiguration (oben) und Endpunkt (unten) einer Dichtefunktional-basierten MD-Simulation des
Komplexes zwischen Vanadat und Glycylglycin. Man beachte die Dissoziation eines H2O-Liganden (Kreis) und
den Transfer eines Protons (Pfeil). Gesamtdauer der Simulation: ca. 5 ps.
Urheber: Max-Planck-Institut für Kohlenforschung / Michael Bühl
Derartig rasche Prozesse lassen sich in MD-Simulationen gewöhnlich nur beobachten, wenn sehr
niedrige Barrieren zu überwinden sind. Für deutlich aktivierte Prozesse lassen sich auf MD-Basis freie
Energie-Profile entlang vordefinierter Reaktions-Koordinaten berechnen, z. B. mittels thermodynamischer Integration. Dies erlaubt quantitative Aussagen über die Zusammensetzung von Lösungen oder
die Triebkräfte und Barrieren chemischer Prozesse darin.
www.mpg.de
© 2006 Max-Planck-Gesellschaft
Bühl, Michael et al. | Molekulardynamik-Simulationen für Reaktionen in Lösung...
Tätigkeitsbericht 2006
Als Beispiel sei hier die Koordinationsgeometrie des Uranyl(VI)-Ions in wässriger Lösung genannt,
das u.a. bei der Aufarbeitung radioaktiver Abfälle auftritt. Röntgenbeugungs-Experimente an solchen
wässrigen Lösungen liefern mitunter widersprüchliche Ergebnisse und lassen neben der im Festkörper
gewöhnlich gefundenen Fünffach- auch eine Vierfach-Koordination der Wasserliganden um die lineare
UO22+-Einheit möglich erscheinen. MD-basierte Simulationen für die Entfernung eines H2O-Liganden
aus der ersten Koordinations-Sphäre und anschließende thermodynamische Integration zeigen aber
deutlich, dass – selbst wenn diese Vierfach-Koordination in der Gasphase möglich wäre – im dynamischen Ensemble der Lösung die herkömmliche Fünffach-Koordination klar dominiert (Abb. 2).
Abb. 2: Reaktionsprofil der Helmholtzschen freien Energie für die Dissoziation eines H2O-Liganden in
[UO2(H2O)5]2+; blau: Gasphase, rot: wässrige Lösung.
Urheber: Max-Planck-Institut für Kohlenforschung / Michael Bühl
Die Dissoziation eines Liganden ist der einfachste Elementarschritt in der Palette der möglichen (auch
katalytischen) Reaktionen von Metall-Komplexen. Die Möglichkeit, derartige Prozesse nun mit quantenchemischen Methoden unter realistischen Bedingungen simulieren, quantifizieren und vorhersagen
zu können, eröffnet eine Fülle neuer Anwendungen in den Bereichen der metallorganischen, anorganischen und bioanorganischen Chemie und lässt viele neue, spannende Einblicke in die Abläufe chemischer Reaktionen auf atomarer und molekularer Ebene erwarten.
MD-Simulationen enzymatischer Reaktionen
Die gerichtete Evolution von Enzymen wird in unserem Institut in der Abteilung für Synthetische Organische Chemie seit einigen Jahren experimentell untersucht. Beispielsweise werden Lipasen durch
iterative Mutagenese so verändert, dass sie die Esterspaltung für bestimmte Substrate mit verbesserter
Enantioselektivität durchführen. Dabei wird Evolution im Labor betrieben: in jeder Iteration werden
durch zufällige Mutationen typischerweise einige tausend Varianten erzeugt, für jedes dieser synthetischen Enzyme wird das Substrat der Esterspaltung unterworfen, die Produkte werden dann in einem
Hochdurchsatz-Screening auf Enantioselektivität getestet, und nur die „besten“ Varianten werden in
der nächsten Generation analog weiter verarbeitet. Dieser „darwinistische“ Prozess optimiert das Enzym für eine bestimmte Aufgabe, ohne dass man den zugrunde liegenden Mechanismus kennt.
Diese „blinde“ Vorgehensweise ist aus praktischer Sicht erfolgreich, aber als Chemiker möchte man
natürlich die Gründe wissen. Wieso funktionieren manche mutierten Varianten besser? Was kann man
daraus hinsichtlich Struktur und Mechanismus lernen? Im Folgenden wird anhand eines konkreten
Beispiels gezeigt, wie MD-Simulationen zur Beantwortung dieser Fragen beitragen können.
© 2006 Max-Planck-Gesellschaft
www.mpg.de
Tätigkeitsbericht 2006
Bühl, Michael et al. | Molekulardynamik-Simulationen für Reaktionen in Lösung...
Abb. 3: Experimentell untersuchte Reaktion.
Urheber: Max-Planck-Institut für Kohlenforschung / Walter Thiel
Experimentell wird die in Abbildung 3 dargestellte Reaktion untersucht, bei der ein racemisches
Gemisch des Substrats (rac-1) durch Wasser unter Katalyse durch eine Lipase in ein Enantiomerengemisch der beiden entsprechenden Säuren gespalten wird. Die beiden Produkte, (S)-2 und (R)-2, verhalten sich wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere), je nachdem ob die Methylgruppe (CH3) nach oben
oder nach unten steht; analoges gilt für die beiden Formen des Substrats. In dem anfangs vorliegenden
racemischen Gemisch sind die beiden Enantiomere in gleicher Menge vorhanden. Wenn die Reaktion
nun wegen der Katalyse durch die Lipase für eines der beiden Enantiomere schneller abläuft, wird dieses bevorzugt – im Überschuss – gebildet, und man spricht von Enantioselektivität. Mit der natürlich
vorkommenden Lipase aus Pseudomonas aeruginosa reagieren beide Enantiomere fast gleich schnell,
mit einem Faktor 1,1 zugunsten von (S)-2. Durch gerichtete Evolution kann dieser Faktor auf etwa 50
gesteigert werden, was einem (S)-Enantiomerenüberschuss von 98% entspricht. Das „beste“ Enzym
weist gegenüber dem Wildtyp sechs Mutationen auf.
Abb. 4: Schematische Struktur einer durch gerichtete Evolution hergestellten Lipase mit dem Substrat im aktiven
Zentrum. Hervorgehoben sind die Mutationen vom Wildtyp, die eine dramatische Steigerung der Enantioselektivität bewirken.
Urheber: Max-Planck-Institut für Kohlenforschung / Walter Thiel
Um dies theoretisch zu verstehen, braucht man einige grundlegende strukturelle und mechanistische Informationen. Die Kristallstruktur des Wildtyps mit einem Inhibitor ist experimentell bekannt,
und man weiß daher, wo die sechs Mutationen in dem „besten“ Enzym auftreten (Abb. 4): Überraschenderweise ist nur eine Mutation direkt am aktiven Zentrum in der Nähe des Substrats lokalisiert
(L162G), zwei weitere sind etwas weiter entfernt (S155M, S53P), und die drei restlichen liegen in
großer Entfernung an der Oberfläche des Enzyms. Der prinzipielle Mechanismus der Esterspaltung ist
ebenfalls bekannt (Abb. 5): der anfangs gebildete Michaelis-Komplex reagiert über ein tetraedrisches
Intermediat zu einem Acylenzym unter Freisetzung des Alkohols (R2OH), und die analoge Rückreak-
www.mpg.de
© 2006 Max-Planck-Gesellschaft
Bühl, Michael et al. | Molekulardynamik-Simulationen für Reaktionen in Lösung...
Tätigkeitsbericht 2006
tion mit Wasser liefert die Säure (R1COOH). Aufgrund von Untersuchungen an Modellsystemen ist
allgemein akzeptiert, dass das tetraedrische Intermediat dem Übergangszustand für den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Reaktion strukturell und energetisch sehr ähnlich ist. Deshalb kann man
aus dem Vergleich solcher Intermediate in erster Näherung auf relative Geschwindigkeiten schließen.
Abb. 5: Mechanismus der Esterhydrolyse durch Lipasen.
Urheber: Max-Planck-Institut für Kohlenforschung / Walter Thiel
Aufgrund dieser Vorkenntnisse kann man bei der Modellierung der experimentellen Befunde wie folgt
vorgehen. Man ersetzt zunächst in der bekannten Kristallstruktur des Wildtyps den Inhibitor durch das
tetraedrische Intermediat, zum einen in der (S)-Form und zum anderen in der (R)-Form. Bei dem Einpassen der beiden Enantiomere in die Bindungstasche stellt man fest, dass die Methylgruppe (CH3 in
Schema 1) im (S)-Fall günstiger positioniert werden kann, weil sie im (R)-Fall in das aktive Zentrum
hineinragt und dort eine gewisse sterische Hinderung erzeugt. Allerdings ist dieser Effekt im Wildtyp
nur wenig ausgeprägt.
Der nächste Schritt der Modellierung ist konzeptionell von zentraler Bedeutung. Der Wildtyp des
Enzyms wird im Computer mutiert, indem die Koordinaten der betreffenden Aminosäuren geeignet
ersetzt werden. Um die hierdurch verursachten Änderungen systematisch zu studieren, wird nicht nur
die „beste“ Sechsfach-Mutante (Abb. 4) erzeugt, sondern auch alle entsprechenden Einfach-Mutanten
sowie ausgewählte Zweifach- und Dreifach-Mutanten. Die so gewonnenen Geometrien für die tetraedrischen Intermediate sind natürlich nicht optimal und werden daher in einer MD-Simulation relaxiert
(etwa 1 ns, sowohl für die (S)-Form als auch für die (R)-Form). Auf diese Weise werden die strukturellen Auswirkungen von Mutationen auf dem Computer nachgestellt. Da das tetraedrische Intermediat
ein Minimum auf der Potenzialfläche ist, können die MD-Simulationen sehr effizient mit klassischen
Kraftfeldern erfolgen (nach Kalibrierung der Parameter auf quantenchemischer Basis).
Abb. 6: Sterische Änderungen in der Umgebung des tetraedrischen Intermediats, ausgelöst durch die zwei Mutationen, die nach den Berechnungen für die Enantioselektivität entscheidend sind.
Urheber: Max-Planck-Institut für Kohlenforschung / Walter Thiel
Die strukturellen Änderungen im Laufe der MD-Simulationen sind im Allgemeinen bei der (S)-Form
und der (R)-Form des tetraedrischen Intermediats verschieden. Aus Platzgründen wird hier nur ein Fall
behandelt (Abb. 6). Wird im Wildtyp an der Position 162 die Aminosäure Leucin durch Glycin ersetzt,
verschwindet die Isobutyl-Seitenkette, sodass am aktiven Zentrum mehr Platz geschaffen wird. In
© 2006 Max-Planck-Gesellschaft
www.mpg.de
Tätigkeitsbericht 2006
Bühl, Michael et al. | Molekulardynamik-Simulationen für Reaktionen in Lösung...
diesen Leerraum könnte das benachbarte Histidin (His83) hineinwandern, welches jedoch im Wildtyp
über eine Wasserstoffbrücke zu einem Serin (Ser53) fixiert ist. Entfernt man diese Brücke durch eine
zweite Mutation S53P (Ersatz des Serins durch Prolin), so wird His83 beweglich. Die MD-Simulationen für diese Doppelmutante zeigen, dass His83 in der sterisch ungehinderten (S)-Form dann in
der Tat in das aktive Zentrum hineinwandert und eine zusätzliche Wasserstoffbrücke zum Oxyanion
ausbildet. Dies wird für die (R)-Form nicht beobachtet, weil dort die Methylgruppe des Substrats im
Wege steht. Die differentielle Stabilisierung der (S)-Form durch eine neue Wasserstoffbrücke im tetraedrischen Intermediat – und damit in der Nähe des Übergangszustands – beschleunigt deren Reaktion
relativ zur (R)-Form stark und führt daher zu erhöhter Enantioselektivität.
Aufgrund der MD-Simulationen kann man somit einen kooperativen Mechanismus postulieren,
welcher plausibel erklärt, warum die beiden Mutationen L162G und S53P in der „besten“ Sechsfach-Mutante eine erhöhte Enantioselektivität bewirken. Eine genauere Analyse zeigt, dass dies der
dominierende Effekt sein sollte und dass zumindest die drei Mutationen an der Oberfläche für die
Enantioselektivitaet unerheblich sein sollten. Dies führt zu der Vorhersage, dass die Dreifach-Mutante
(L162G, S53P, S155M) und vermutlich sogar die Zweifach-Mutante (L162G, S53P) genauso enantioselektiv sein sollten wie die „beste“ Sechsfach-Mutante. Diese beiden einfacheren Mutanten sind in den
ursprünglichen Experimenten nicht identifiziert worden, was daran liegen kann, dass die „darwinistische“ Suche im ungeheuer großen Sequenzraum des Proteins nicht bis zu ihnen vorgedrungen ist. Die
vorhergesagten Zweifach- und Dreifach-Mutanten sind mittlerweile gezielt synthetisiert worden, und
sie zeigen in der Tat eine ebenso hohe Enantioselektivität wie die vorher „beste“ Sechsfach-Mutante.
Zusammenfassung und Ausblick
MD-Simulationen sind von zunehmender Bedeutung in der theoretischen Chemie, weil sie detaillierte
Einblicke in die Dynamik chemischer Prozesse vermitteln. Die hier vorgestellten Beispiele aus zwei
ganz unterschiedlichen Gebieten betreffen die Struktur und Dynamik von Übergangsmetall-Komplexen in wässriger Lösung sowie die Optimierung der Enantioselektivität einer enzymatischen Reaktion
durch gerichtete Evolution. In beiden Fällen liefern die MD-Simulationen strukturelle und mechanistische Informationen, die dem Verständnis experimenteller Befunde dienen und darüber hinaus neue
Experimente zur Überprüfung der theoretischen Vorhersagen induzieren (Bocola, Bühl, Otte, Reetz,
Thiel, in Zusammenarbeit mit G. Wipff (Strasbourg) und K.-E. Jaeger (Jülich)).
www.mpg.de
© 2006 Max-Planck-Gesellschaft