Charakterisierung der Wechselwirkung von Selen mit dem

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Thema:
CHARAKTERISIERUNG DER
WECHSELWIRKUNG VON SELEN MIT DEM
BAKTERIUM AZOSPIRILLUM BRASILENSE
MASTERARBEIT
Zur Erlangung des akademischen Grades
MASTER OF SCIENCE
Studiengang Biotechnologie und Angewandte Ökologie
vorgelegt von:
Anika Maffert
geboren am 01.03.1989 in Herzberg/Elster
eingereicht am:
30.09.2013
Erstgutachter:
Prof. Dr. rer. nat. habil. Thomas Wiegert
Fakultät Mathematik/Naturwissenschaften
Hochschule Zittau/Görlitz
Zweitgutachter: Dr. rer. nat. Manja Vogel
Institut für Ressourcenökologie
Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf e.V.
Zusammenfassung
I.
S e i t e | II
ZUSAMMENFASSUNG
Das Bakterium Azospirillum brasilense gehört zur Gruppe der Plant growth-promoting
rhizobacteria (PGPR) (Kloepper et al. 1991), da es die Fähigkeit besitzt das Wachstum zu
fördern und infolge dessen den Ertrag bestimmter Pflanzen zu erhöhen. Ein natürliches
Habitat der Bakterien ist der Boden. Insbesondere lagert es sich an der Wurzeloberfläche
von Nutzpflanzen, wie beispielsweise Mais, Weizen und Reis, an. Dabei geht das
Bakterium A. brasilense mit den Pflanzen eine symbiotische Bindung ein.
Das Spurenelement Selen (Se), welches in vielen Böden, Gesteinen und Gewässern
vorkommt, ist essentiell für viele Organsimen. Zu beachten ist, dass die Aufnahme von
Selen in höheren Konzentrationen toxisch und im Gegensatz dazu die Aufnahme von nur
geringen Mengen zu einem Selendefizit führen kann. Aufgrund der Toxizität sind die
wasserlöslichen Oxyanionen Selenit (SeO32-) und Selenat (SeO42-) von besonderem
ökologischen Interesse. Aus der Literatur ist bekannt, dass einige Bakterienstämme die
Fähigkeit besitzen Selenit und Selenat zu weniger toxischem elementaren Selen (Se(0)) zu
reduzieren. Dieses elementare Selen bildet extra- oder intrazelluläre Nanopartikel aus.
In
der
vorliegenden
Arbeit
wurde
die
Wechselwirkung
des
Bakteriums
Azospirillum brasilense mit den wasserlöslichen Oxidationsstufen des Selens (Se(IV) und
Se(VI)) unter aeroben Bedingungen untersucht. Dabei wurde die mikrobielle Reduktion
von Selenit durch das Bakterium beobachtet, die Auswirkung der Variation der
Selenitkonzentrationen untersucht und entstandene Se(0)-Nanopartikel charakterisiert. Die
in der Arbeit untersuchten Aspekte, gaben Aufschlüsse über die Toleranzen des
Bakteriums A. brasilense gegenüber Selenat und Selenit. Es wurde gezeigt, dass nur das
Oxyanion Selenit toxisch auf das Bakterium wirkt. Das Selenat wurde während des
Kultivierungszeitraumes nicht in den Metabolismus des Bakteriums aufgenommen.
Durch die Variation der Selenitkonzentrationen von 1 mM bis 5 mM im Medium wurde
herausgefunden, dass A. brasilense Konzentrationen bis 2,5 mM toleriert. Bei einer
Selenitkonzentration von 5 mM konnte nicht eindeutig bestimmt werden, in wie weit das
Bakterium diese Konzentration verträgt.
Zusammenfassung
S e i t e | III
Die Ergebnisse der Hydrid-Generation Atomabsorptionsspektrometrie (HG-AAS) und der
Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Hochfrequenzplasma (ICP-MS) verdeutlichten die zeitliche Abnahme der Selenitkonzentration im Medium und der damit
verbundenen Umsetzung von Selenit zu Se(0)-Nanopartikeln. Die vollständige Umsetzung
des Selenits aus dem Medium erfolgte ca. sieben Tage nach Beginn der Kultivierung bei
einer Selenitkonzentration von 1 mM.
Bei der Kultivierung des Bakteriums in Gegenwart von Selenit konnte festgestellt werden,
dass die Bakterien Nanopartikel produzierten. Diese wurden mittels Lichtmikroskopie und
Rasterelektronenmikroskopie (REM) visualisiert und konnten mittels energiedispersiver
Analyse der Röntgenstrahlung (EDX) als Selen-Schwefel-Gemisch identifiziert werden.
Dabei konnte gezeigt werden, dass die Nanopartikel außerhalb der Bakterienzelle
lokalisiert sind. Mittels Dynamischer Lichtstreuung (DLS) wurde die Partikelgrößenverteilung und der damit verbundene durchschnittliche hydrodynamische Partikeldurchmesser von etwa 400 nm bestimmt. Durch die Zetapotentialmessung wurde ermittelt, dass
die Partikel eine stark negativ-geladene Oberfläche besitzen und somit die Tendenz
aufweisen keine Agglomerate zu bilden, da die Partikel sich aufgrund der Ladung
abstoßen. Die Struktur dieser Selennanopartikel wurde mit Hilfe der Raman-Spektroskopie
untersucht.
Dabei
wurden
Selenketten,
Se8-Ringstrukturen
und
Selen-Schwefel-
Valenzschwingungen ermittelt. Durch Inkubieren der Nanopartikelsuspension bei
unterschiedlichen Temperaturen im Bereich von 35 °C bis 250 °C wurde die Thermostabilität analysiert. Bis 35 °C konnte kein signifikanter Unterschied zur unbehandelten
Probe mittels UV/Vis-Spektroskopie und DLS beobachtet werden. Ab 50 °C agglomerierten die Partikel, sodass eine instabile Suspension entstand. Je höher die
Temperaturen stiegen, desto weniger blieb von den Nanopartikeln erhalten. Bei einer
Inkubation bei 250 °C konnten keine Partikel mehr nachgewiesen werden.
Diese Arbeit liefert einen wesentlichen Beitrag für die Aufklärung der Wechselwirkungen
zwischen Mikroorganismen und giftigen Substanzen. Die Umwandlung toxischer Stoffe,
wie beispielsweise Selenit, durch A. brasilense zu weniger toxischen elementaren Selen,
kann für die Wasseraufbereitung oder für die Regenerierung von selenbelasteten Böden
von Nutzen sein. Die Nanopartikel könnten in Industrie (Photovoltaik) und in der Medizin
(Pharmakotherapie) Anwendung finden.
Inhaltsverzeichnis
II.
S e i t e | IV
INHALTSVERZEICHNIS
I.
ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................... II
II. INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................... IV
III. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................... VI
IV. ABBILDUNGSVERZEICHNIS .....................................................................................VIII
V. TABELLENVERZEICHNIS ............................................................................................ XI
1
EINLEITUNG ................................................................................................................. 1
2
THEORETISCHE GRUNDLAGEN ................................................................................... 3
2.1 Das Bakterium Azospirillum brasilense ............................................................... 3
2.2 Selen ........................................................................................................................ 4
2.2.1
Allgemeines ................................................................................................... 4
2.2.2
Vorkommen ................................................................................................... 5
2.2.3
Verwendung ................................................................................................... 6
3
MATERIAL UND METHODEN ....................................................................................... 7
3.1 Chemikalien ........................................................................................................... 7
3.2 Bakterienstamm..................................................................................................... 8
3.3 Kulturmedien und Lösungen ............................................................................... 8
3.3.1
Azo-Medium zur Kultivierung von Azospirillum brasilense......................... 8
3.3.1.1 Stammlösung für das Azo-Medium ................................................... 9
3.3.1.2 Spurenelementlösung (10-fach) ......................................................... 9
3.3.2
Reagenzien für die Proteinbestimmung ......................................................... 9
3.3.2.1 Lösung A .......................................................................................... 10
3.3.2.2 Lösung B .......................................................................................... 10
3.3.3
Salzlösung zur Isolierung der Nanopartikel ................................................. 10
3.4 Zellaufschlusspuffer/Lagerungspuffer .............................................................. 11
3.4.1
Kaliumphosphatpuffer (0,1 M) .................................................................... 11
3.4.2
PBS-Puffer ................................................................................................... 11
3.4.3
Lysispuffer ................................................................................................... 11
3.5 Methoden .............................................................................................................. 12
3.5.1
Erhaltung der Stammkultur .......................................................................... 12
3.5.2
Kultivierung von A. brasilense .................................................................... 12
3.5.3
Chemische Reduktion von Selenit und Selenat ........................................... 13
3.5.4
Mikrobielle Reduktion von Selenit und Selenat .......................................... 13
3.5.5
Lichtmikroskopie ......................................................................................... 14
3.5.6
Zellaufschluss mittels basischer Verseifung ................................................ 14
3.5.7
Proteinbestimmung ...................................................................................... 14
3.5.8
Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) ........... 16
3.5.9
Hydrid-Generation (Hydridtechnik) Atomabsorptionsspektrometrie
(HG-AAS) .................................................................................................... 16
3.5.10 Isolierung der Nanopartikel ......................................................................... 17
3.5.11 UV/Vis-Spektroskopie ................................................................................. 18
3.5.12 Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit der energiedispersiven
Röntgenspektroskopie (REM-EDX) ............................................................ 18
3.5.13 Transmissionselektronenmikroskop in Kombination mit der
energiedispersiven Röntgenspektroskopie (TEM-EDX) ............................. 20
3.5.14 Bestimmung des Zetapotentials ................................................................... 20
3.5.15 Dynamische Lichtstreuung (DLS) ............................................................... 22
Inhaltsverzeichnis
4
5
6
7
8
9
Seite |V
3.5.16 Raman-Spektroskopie der Nanopartikel ...................................................... 23
3.5.17 Thermostabilitätstest .................................................................................... 23
3.5.18 Bestimmung des Totalen organischen Kohlenstoffgehalts (TOC) .............. 24
ERGEBNISSE ............................................................................................................... 26
4.1 Wachstumskurve von A. brasilense ................................................................... 26
4.2 Reduktion von Selenat und Selenit durch das Bakterium A. brasilense ........ 28
4.2.1
Wachstumsverlauf in Gegenwart von Selen ................................................ 30
4.2.2
Messung der Selenit- und Selenatkonzentration .......................................... 33
4.2.3
Einfluss der Konzentration auf die mikrobielle Reduktion von Selenit
und das Wachstum von A. brasilense .......................................................... 36
4.2.4
Wachstumsverlauf des Bakteriums A. brasilense bei unterschiedlichen
Selenitkonzentrationen ................................................................................. 37
4.2.5
Messung der unterschiedlichen Selenitkonzentrationen .............................. 40
4.3 Charakterisierung der Nanopartikel ................................................................. 41
4.3.1
Farbgebung Nanopartikelsuspension nach der Isolierung ........................... 41
4.3.2
Elektronenmikroskopie in Kombination mit der energiedispersiven
Röntgenspektroskopie (EDX) ...................................................................... 44
4.3.3
Bestimmung der Oberflächenladung durch Zetapotentialmessungen ......... 48
4.3.4
Dynamische Lichtstreuung .......................................................................... 49
4.3.5
Raman-Spektroskopie .................................................................................. 54
4.3.6
Thermostabilitätstest .................................................................................... 55
4.3.6.1 UV/Vis-Spektroskopie ..................................................................... 56
4.3.6.2 Dynamische Lichtstreuung............................................................... 58
4.3.6.3 Bestimmung des TOC-Gehaltes ....................................................... 60
DISKUSSION ................................................................................................................ 62
5.1 Reduktion von Selenit/Selenat ............................................................................ 62
5.2 Charakterisierung der Nanopartikel ................................................................. 65
AUSBLICK................................................................................................................... 70
LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................................... 72
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG ............................................................................... 76
DANKSAGUNG ............................................................................................................ 77
Abkürzungsverzeichnis
III.
S e i t e | VI
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
°C
Grad Celsius
A. brasilense
Azospirillum brasilense
Azo-Medium
Medium für Azospirillum brasilense
BCA
Bicinchoninic Acid
BSA
Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin)
c
Konzentration
Cu
Kupfer
d.nm
Durchmesser in nm
DLS
Dynamische Lichtstreuung
DSMZ
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
EDX
Energy Dispersive X-Ray (Energiedispersive Analyse der
Röntgenstrahlung)
g
Fallbeschleunigung
HG-AAS
Hydrid-Generation Atomabsorptionsspektrometrie
ICP-MS
Inductive Coupled Plasma Mass Spectrometry
(Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem
Hochfrequenzplasma)
K
Kontrolle
konz.
konzentriert(e)
min.
Minute(n)
MW
Mittelwert
m/z
Verhältnis Masse zu Ladung
N
Atomanzahl im Molekül
OD
Optische Dichte
pH
Negativ dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenkonzentration
PBS
Phosphate Buffered Saline (Phosphatgepufferte Salzlösung)
pI
Isoelektrischer Punkt
REM
Rasterelektronenmikroskopie
RT
Raumtemperatur
S
Schwefel
Se
Selen
Abkürzungsverzeichnis
S e i t e | VII
Se(0)
Selen mit der Oxidationsstufe 0
Se(-II)
Selen mit der Oxidationsstufe -2
Se(IV)
Selen mit der Oxidationsstufe 4
Se(VI)
Selen mit der Oxidationsstufe 6
St.Abw.
Standardabweichung
t
Zeit
td
Verdopplungszeit
TEM
Transmissionselektronenmikroskopie
TOC
Total Organic Carbon (Totaler organischer Kohlenstoff)
TRIS
Trishydroxymethylaminomethan
UV
Ultraviolett (ultravioletter Spektralbereich)
µ
Wachstumsrate
VE-Wasser
vollentsalztes Wasser
Vis
Visible (sichtbarer Spektralbereich)
x0
OD-Wert am Anfang der exponentiellen Phase
xt
OD-Wert am Ende der exponentiellen Phase
Abbildungsverzeichnis
IV.
S e i t e | VIII
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1:
Reduktion von Selenat zu Selenit und elementaren Selen ........................ 2
Abbildung 2:
Bakterium A. brasilense auf festem Nährmedium ................................... 3
Abbildung 3:
Mikroskopische Aufnahme von A. brasilense .......................................... 3
Abbildung 4:
Farbgebung nach 1 h Inkubation ............................................................. 15
Abbildung 5:
BSA-Eichkurve zur Proteinbestimmung mit dem BCA-Reagenz .......... 15
Abbildung 6:
Typische Kurve nach Auftragen des Zetapotentials gegen den pH-Wert
(Malvern Instruments 2007) .................................................................... 22
Abbildung 7:
Stahlautoklav mit eingesetzten Teflonbecher ......................................... 24
Abbildung 8:
Bestimmungsformen des Kohlenstoffs ................................................... 25
Abbildung 9:
Logarithmische Darstellung der Wachstumskurve von A. brasilense .... 26
Abbildung 10:
Farbverlauf der Kontrolle ........................................................................ 28
Abbildung 11:
Farbverlauf der Selenatkultur .................................................................. 28
Abbildung 12:
Farbverlauf der Selenitkultur .................................................................. 28
Abbildung 13:
Farbliche Entwicklung der Kontroll-, Selenat- und Selenitkultur nach
sieben Tagen Kultivierung ...................................................................... 29
Abbildung 14:
Mikroskopische Aufnahme von A. brasilense im Kontrollmedium
(ohne Nanopartikel) ................................................................................ 30
Abbildung 15:
Mikroskopische Aufnahme von A. brasilense mit Nanopartikeln im
Selenatansatz (ohne Nanopartikel) .......................................................... 30
Abbildung 16:
Mikroskopische Aufnahme von A. brasilense mit Nanopartikeln im
Selenitansatz ............................................................................................ 30
Abbildung 17:
Hellfeldaufnahme der Nanopartikel in der Selenitkultur ........................ 30
Abbildung 18:
Logarithmische Darstellung der OD-Werte der Kontroll-, Selenit- und
Selenatkultur ........................................................................................... 31
Abbildung 19:
Darstellung der Gesamtzellproteinkonzentration der Kontroll-, Selenitund Selenatkultur .................................................................................... 32
Abbildung 20:
Vergleich der Messungen der Selenitkonzentrationen der HG-AAS und
der ICP-MS ............................................................................................. 34
Abbildung 21:
Zeitlicher Verlauf der Selenkonzentration im Selenit- und
Selenatansatz ........................................................................................... 35
Abbildung 22:
Zeitlicher Verlauf der Selenat- und Selenitintensität und den daraus
resultierenden Selennanopartikelanteil ................................................... 36
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 23:
S e i t e | IX
Farbentwicklung nach sieben Tagen bei unterschiedlichen
Selenitkonzentrationen ............................................................................ 37
Abbildung 24:
Wachstumskurven der Kontrollkultur und den Ansätzen mit
unterschiedlichen Selenitkonzentrationen ............................................... 37
Abbildung 25:
Zeitlicher Verlauf der Gesamtzellproteinkonzentration der
Kontrollkultur und den Ansätzen mit unterschiedlichen
Selenitkonzentrationen ............................................................................ 39
Abbildung 26:
Zeitlicher Verlauf der Gesamtselenkonzentration der unterschiedlichen
Selenitkonzentrationen ............................................................................ 40
Abbildung 27:
Suspension der isolierten Nanopartikel (1 mM-Selenitansatz
(Ansatz 1)) ............................................................................................... 42
Abbildung 28:
Suspension der isolierten Nanopartikel (1 mM-Selenitansatz
(Ansatz 2)) ............................................................................................... 42
Abbildung 29:
Suspension der isolierten Nanopartikel (2,5 mM-Selenitansatz) ............ 42
Abbildung 30:
Suspension der isolierten Nanopartikel (5 mM-Selenitansatz) ............... 42
Abbildung 31:
Chemischen Reduktion von Selenit (Bildung von rotem Niederschlag) 43
Abbildung 32:
Chemische Reduktion von Selenat (kein Niederschlag) ......................... 43
Abbildung 33:
UV/Vis Spektren des chemisch reduzierten Selenits .............................. 43
Abbildung 34:
A. brasilense mit Nanopartikeln aus dem Selenitansatz (Methode ohne
Fixierung) ................................................................................................ 44
Abbildung 35:
Nanopartikel aus dem Selenitansatz (Methode ohne Fixierung) ............ 44
Abbildung 36:
A. brasilense mit Nanopartikeln aus dem Selenitansatz (Fixierung mit
Glutaraldehyd) ......................................................................................... 45
Abbildung 37:
EDX-Spektrum der Nanopartikel ............................................................ 45
Abbildung 38:
Bakterien ohne Nanopartikel aus dem Selenatansatz (Fixierung mit
Glutaraldehyd)......................................................................................... 46
Abbildung 39:
EDX-Spektrum aus dem Selenatansatz ................................................... 46
Abbildung 40:
TEM-Aufnahme der Nanopartikel .......................................................... 47
Abbildung 41:
EDX-Spektrum der Nanopartikel ............................................................ 47
Abbildung 42:
EDX-Spektrum der von Nanopartikel umgebenden Substanz ................ 48
Abbildung 43:
Zetapotentiale aller Nanopartikelsuspensionen der Selenitansätze mit
Mittelwert aller Zetapotentialmessungen mit Standardabweichung ....... 48
Abbildung 44:
Partikelgrößenverteilung der 1 mM-Selenitansätze ................................ 49
Abbildung 45:
Autokorrelationsfunktion ........................................................................ 51
Abbildungsverzeichnis
Seite |X
Abbildung 46:
Durchschnittliche Partikelgrößen der 1 mM-Selenitansätze ................... 52
Abbildung 47:
Durchschnittliche Partikelgrößen der 2,5 mM-Selenitansätze ................ 52
Abbildung 48:
Partikelgrößenverteilung der Nanopartikel bei unterschiedlichen
Selenitkonzentrationen ............................................................................ 53
Abbildung 49:
Darstellung der durchschnittlichen Partikelgröße aller 1 mMSelenitkulturen und Ermittlung des durchschnittlichen Durchmessers .. 54
Abbildung 50:
Raman-Spektrum der Nanopartikelsuspension ....................................... 55
Abbildung 51:
Aufnahme der Ausgangslösung und der bei unterschiedlich hohen
Temperaturen inkubierten Nanopartikelsuspension ................................ 56
Abbildung 52:
UV/Vis-Spektren der Nanopartikelsuspension bei unterschiedlichen
Inkubationstemperaturen ......................................................................... 57
Abbildung 53:
UV/Vis-Spektren der Nanopartikelsuspension bei einer Inkubation von
100 °C und 250 °C .................................................................................. 58
Abbildung 54:
Partikelgrößenverteilung der Ausgangslösung und der Proben, die bei
35 °C, 50 °C und 100 °C inkubiert wurden............................................. 59
Abbildung 55:
Grafische Darstellung des TOC-Gehaltes der Nanopartikelsuspension vor
und nach der Inkubation bei unterschiedlichen Temperaturen ............... 60
Tabellenverzeichnis
V.
S e i t e | XI
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 1:
OD-Werte und die jeweiligen Zeiten am Anfang und Ende der
exponentiellen Phase, Wachstumsrate und Verdopplungszeit ................ 27
Tabelle 2:
Zeitpunkt und OD-Wert des Maximums der Kontroll-, Selenat- und
Selenitkultur ............................................................................................ 31
Tabelle 3:
Zeitpunkt und OD-Wert der Maxima der unterschiedlichen
Selenkonzentrationen .............................................................................. 38
Tabelle 4:
Zeitpunkt und Proteinkonzentration der Maxima der unterschiedlichen
Selenkonzentrationen .............................................................................. 39
Tabelle 5:
Vergleich der berechneten und mittels ICP-MS gemessenen
Selenitanfangskonzentrationen ............................................................... 40
Tabelle 6:
Durchschnittliche Partikeldurchmesser der verschiedenen Ansätze ....... 50
Tabelle 7:
Inkubationstemperaturen mit dazugehörigem durchschnittlich
gemessenem Durchmesser ...................................................................... 59
Einleitung
1
Seite |1
EINLEITUNG
Ein schwerwiegendes Problem für die Umwelt ist die Verschmutzung durch umweltschädigende Substanzen, welche immer mehr auf Aktivitäten der Menschen zurückzuführen ist. Die Quellen dafür sind meistens landwirtschaftlich oder industriell
verursachte Eintragspfade. Umweltbiologen und ökologische Risikobewerter beschäftigen
sich mit Schadstoffen, die eine hohe Gefährdung der Umwelt aufweisen, wobei häufig
Stoffe, wie Selen, vernachlässigt werden.
Doch gerade Selen weist ernste langfristige Risiken speziell für die aquatischen
Lebensräume und die damit verbundenen Nahrungspfade auf. Werden diese Lebensräume
mit Selen verschmutzt, so folgt daraus eine Anreicherung in allen mit dem Wasserkreislauf
verbundenen Organismen. Durch Aufnahme von Nahrung, wie zum Beispiel Pflanzen und
Tieren, die auf selenhaltigen Boden vorkommen, nimmt auch der menschliche Körper
unbewusst Selen zu sich. Eine erhöhte Selenkonzentration hat einen negativen Einfluss auf
die menschliche Gesundheit und auch auf die Landwirtschaft. Durch Aufnahme und
Bioakkumulation in den Organismen in den verschiedenen Nahrungsebenen ist ein
gezielter Eingriff für die Unterbrechung der Aufnahme von Selen nicht gewährleistet
(Lemly 2004).
Selen ist in der Natur Bestandteil eines biogeochemischen Zyklus, bei dem mit Hilfe von
mikrobiell ablaufenden Redoxreaktionen jede Oxidationsstufe des Selens erreicht werden
kann. Einige Bakterien nutzen während der Respiration des Kohlenstoffs Selenat und
Selenit als Elektronenakzeptor in ihrem Energiestoffwechsel. Dabei ist zwischen Bakterien
zu unterscheiden, die zum Einen anaerob und zum Anderen aerob die Oxyanionen
reduzieren (Fernández-Martínez 2009). Somit besitzen beispielsweise einige Bakterien die
Fähigkeit Selenat zu ungiftigen elementarem Selen zu reduzieren (Zhang et al. 2003).
Herbel et al. (2003) beschreiben, dass einige Bakterienstämme elementares Selen zu
Selenid reduzieren oder Selenid zu elementaren Selen oxidieren können. Andere wiederum
können elementares Selen oder Selenid zu Selenit oder Selenat oxidieren (Sarathchandra &
Watkinson 1981, Levanony & Bashan 1991, Dowdle & Oremland 1998).
Bis zum heutigen Tage sind 16 Spezies von Bakterien und Archaeen bekannt, bei denen
unter anaeroben Bedingungen organisches Material oder Wasserstoff oxidiert wird, um
Selenoxyanionen zu reduzieren (Stolz & Oremland 1999).
Einleitung
Seite |2
Eine Besonderheit einiger Bakterienstämme ist es, dass sie in der Lage sind, das giftige
Selenit oder Selenat in Form von Nanopartikeln umzusetzen. Dieser Prozess der Entgiftung
wird als Bioremediation bezeichnet, bei dem Bakterien zur Sanierung des kontaminierten
Bodens oder selenhaltiger Gewässer beitragen können. Es beschreibt die durch
Organismen generierte biologische Umwandlung, um kontaminierte biologische Systeme
zu sanieren (Frankenberger & Arshad 2001). Die Nanopartikel können sich je nach
Bakterienstamm entweder innerhalb oder außerhalb der Zellwand anlagern (Oremland et
al. 2004).
In der vorliegenden Arbeit wird das Bakterium Azospirillum brasilense auf dessen
Fähigkeit untersucht, die toxischen Selenoxyanionen Selenat und Selenit zum weniger
toxischen elementaren Selen zu reduzieren (Abbildung 1). In der Publikation von
Tugarova et al. (2013) wird beschrieben, dass das Bakterium A. brasilense unter aeroben
Bedingungen Selenit zu elementaren Selen unter Bildung von Nanopartikeln reduzieren
kann. Aufbauend auf diesen Aspekt wird in dieser Arbeit untersucht, inwiefern eine
Reduktion von Selenat durch das Bakterium A. brasilense stattfindet. Des Weiteren wird
die Selentoleranz der Bakterien analysiert, indem unterschiedliche Konzentrationen an
Selenit eingesetzt werden. Durch eine Vielzahl angewendeter Methodik werden die von
den Zellen isolierten Nanopartikel charakterisiert.
Lösliches Se
(toxisch)
SeO42-
Unlösliches Se
(weniger toxisch)
Se0
SeO32-
(Selenat)
(Selenit)
Mikrobielle
Reduktion durch
A.brasliense
(Elementares Selen)
Mikrobielle
Reduktion durch
A.brasliense
Charakterisierung der
Nanopartikel:
• Zetapotential
• Dynamische
Lichtstreuung
• Thermostabilität
• UV/Vis-Spektroskopie
• Totale Kohlenstoffgehalt
Abbildung 1: Reduktion von Selenat zu Selenit und elementaren Selen
Theoretische Grundlagen
2
Seite |3
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
2.1
DAS BAKTERIUM AZOSPIRILLUM BRASILENSE
Die Bakterien der Gattung Azospirillum (Abbildung 2 und Abbildung 3) gehören zu der
phylogenetischen Gruppe der α-Proteobacteria, sind gram-negativ und zählen zu den Plant
growth-promoting rhizobacteria (PGPR) (Kloepper et al. 1991), da die Bakterien die
Fähigkeit besitzen das Wachstum und den Ertrag von Pflanzen zu fördern. Dies geschieht
durch die Ausscheidung von Phytohormonen (z.B. Indolessigsäure) durch das Bakterium
und bewirkt bei Pflanzen eine morphologische Veränderung der Wurzeloberfläche, in dem
mehr Wurzelhaare gebildet werden. Es kommt zu einer Vergrößerung der Oberfläche,
welche zu einer besseren Aufnahme von Nährstoffen und Wasser aus dem Boden führt und
schließlich ein erhöhtes Streckwachstum verursacht (Bloemberg & Lugtenberg 2001). In
Folge dessen kann es zu einer Steigerung der Ertragsausbeute von 5 bis 30 % kommen.
Aufgrund dieser Ertragssteigerung setzt der Mensch in der Landwirtschaft Azospirillen als
Bestandteil in ökologischen Düngern ein (Okon & Labanderagonzalez 1994).
Abbildung 2: Bakterium A. brasilense auf
festem Nährmedium
Abbildung 3: Mikroskopische Aufnahme von
A. brasilense
Bakterien der Gattung Azospirillum, insbesondere A. brasilense, gehören zu der am
meisten studierten Rhizobakterien und sind dafür bekannt Symbiose mit höheren Pflanzen
einzugehen (Bashan & de-Bashan 2010). A. brasilense gilt als fakultativ endophytisches
Bakterium, da es auch außerhalb der Wurzel leben kann. Einige Bakterienstämme dieser
Gattung konnten von Pflanzenwurzeln aus gemäßigten bis subtropischen Gegenden isoliert
werden (Rothballer et al. 2003).
Theoretische Grundlagen
Seite |4
Dabei ist besonders A. brasilense von großer Bedeutung, da das Bakterium vermehrt an
den Wurzeln von Nutzpflanzen, wie Mais (Gafny et al. 1986), Weizen (Bashan et al.
1986), Reis (Murty & Ladha 1987), Tomaten, Pfeffer, Baumwolle und Sojabohnen
(Bashan et al. 1991, Levanony & Bashan 1991), vorkommt.
Eine weitere wichtige Charakteristik der Rhizobakterien ist es, dass sie die Fähigkeit
besitzen atmosphärischen Stickstoff zu binden. Dies spielt jedoch eine untergeordnete
Rolle bei Azospirillum brasilense (Patriquin et al. 1983).
2.2
SELEN
2.2.1
Allgemeines
Selen wurde als neues Element im Jahre 1817 von Jöns Jacob Berzelius entdeckt. Bei dem
Versuch Schwefel aus einem schwefelhaltigen Felsen zu isolieren, entstand eine
ungewöhnliche Rotfärbung. Berzelius benannte den Stoff „Selenium“, abgeleitet von der
griechischen Mondgöttin Selene, in Anlehnung an das schon früher entdeckte Tellur
(„Erde“) (Berzelius 1817, Berzelius 1818, Lide 1994).
Selen ist ein Nichtmetall mit der Ordnungszahl 34 und einer relativen Atommasse von
78,96 u. Selen ist chemisch verwandt mit anderen Stoffen der 16. Gruppe. Diese Gruppe
der Chalkogene enthält neben Selen auch Sauerstoff, Schwefel, Tellur und Polonium. In
der Natur sind vier verschiedene Oxidationsstufen vorzufinden: (-II), (0), (IV) und (VI).
Dabei liegen Selenit (SO32-) und Selenat (SO42-) als lösliche Oxyanionen (AxOyz−) vor. Die
Oxyanionen zeigen eine erhöhte Löslichkeit und Mobilität mit steigendem pH-Wert, im
Gegensatz zu Metallen, die ein entgegengesetztes Verhalten zeigen (Chapman et al. 2010).
Neben diesen anorganischen Formen des Selens gibt es auch nicht-flüchtige Selenide
(Se (–II)), wie zum Beispiel Selenocystein (21. Aminosäure), die am meisten
vorkommende Selenspezies im mensch-lichen Körper (Fernández-Martínez 2009). Das
Auftreten der verschiedenen Spezies des Selens leitet sich von den physikalischchemischen Eigenschaften ab. Die Oxyanionen Selenit und Selenat kommen vorwiegend
in wässrigen Lösungen oder in belüfteten basischen Böden vor. Im Gegensatz dazu finden
sich unlöslichen Selenide und das elementare Selen meist in minder belüfteten sauren
Böden vor, welche reich an organischem Material sind.
Theoretische Grundlagen
Seite |5
Selen besitzt sowohl einen toxischen als auch einen nützlichen Charakter. Dabei ist die
Konzentrationsspanne zwischen Selenmangel (< 40 µg/Tag) und einer Selenvergiftung
(> 400 µg/Tag) sehr gering (Levander & Burk 2006). Ein Selendefizit steht in Verbindung
mit Leber,- Muskel- und Herzerkrankungen. Somit stellt das Spurenelement Selen in der
Ernährung einen essentiellen Nährstoff, aber auch ein Gift dar (Schwarz & Foltz 1957).
2.2.2
Vorkommen
Sowohl in Steinen, verschiedenen Böden, als auch in Wasser und Luft kommt Selen vor
und gilt somit als weitverbreitete Komponente. Der Umweltqualitätsstandard für die
Wasserqualität besagt, dass ≤ 0,01 mg/l Selen enthalten sein dürfen. Im Gegensatz dazu
befindet sich in Industrieabwässern ein Selengehalt von ≤ 0,1 mg/l (McNeal &
Balistrieri 1989, Soda 2009). Weitere anthropogene Quellen des Seleneintrags in die
Atmosphäre sind die Kohle- und Erdölverbrennung, aber auch während der Extraktion und
Verarbeitung verschiedener Elemente (Kupfer, Zink, Uran, etc.) entsteht Selen (FernándezMartínez 2009). Erhöhte Selenwerte im Boden wurden in den Ländern China (Wang &
Gao 2001), Indien (Dhillon & Dhillon 2003), Irland (Seby et al. 1997) und den USA
(Presser 1994) festgestellt. Durch die zunehmende Verwendung von Selen in den
industriellen und medizinischen Bereichen gelangt es in das Abwassersystem und somit in
dem gesamten Wasserkreislauf. Dies stellt einen weiteren Eintragspfad von Selen in die
Umwelt dar.
Die primäre natürliche Selenquelle stellt die Verwitterung von Gesteinen dar, insbesondere
tonhaltige Gesteine, die eine höhere Konzentration an Selen enthalten. Ein weiterer
Eintragspfad ergibt sich durch vulkanische Aktivitäten, bei dem Selen in die Atmosphäre
freigegeben wird (McNeal & Balistrieri 1989).
Im Pflanzenreich kommt Selen besonders in Pflanzen, beispielsweise im Knoblauch vor,
bei den es als Se-Methylselenocystein vorliegt. Pflanzen nehmen Selen in Abhängigkeit
vom Selengehalt des Standortes des Organismus auf. Wenige Pflanzen, beispielsweise der
Gattung Astragalus, besitzen sogar die Fähigkeit Selen zu akkumulieren, weshalb sie auch
als „Selen-Hyperakkumulatoren“ bezeichnet werden (Virupaks & Shrift 1965).
Theoretische Grundlagen
2.2.3
Seite |6
Verwendung
Selen ist von großem Interesse für die Photovoltaikindustrie aufgrund der halbleitenden
Eigenschaften bei Raumtemperatur (RT) und der ausgeprägten Photoleitung. Folge dessen
kommt Selen als hochreine Chemikalie bei der Entwicklung von Solarzellen zum Einsatz
(Kausch & Matschullat 2005, Neukirchen 2009).
Aufgrund der unterschiedlichen Farbgebung von Selen wird es in der Glasindustrie zum
Färben von Fenstergläsern und zum Entfärben des Grüntons von Flaschenglas verwendet
(Kausch & Matschullat 2005).
Neue Studien belegen, dass sich Selennanopartikel positiv in der Pharmakotherapie
auswirken. Von der Verwendung von sogenannten „Subnanopartikeln“ (0,4 – 1 nm) wurde
viel in medizinischen Bereichen berichtet. So rufen diese Anti-Tumor-Effekte hervor
(Miyagi et al. 2003), werden als Anti-Leukämie-Mittel (Sieber 2003) oder als Antioxidans
(Gao et al. 2002) verwendet.
Material und Methoden
3
3.1
1.
1.
Seite |7
MATERIAL UND METHODEN
CHEMIKALIEN
Stoff
Hersteller; Lot.-Nr.
Agar (Difco™)
BD; 2363441
Ammoniumsulfat (NH4)2SO4
Merck; A0080411044
Biotin (C10H16N2O3S)
Sigma; 019K1769
Bovine Serum Albumin (BSA)
Merck; K2881118645
Calciumchlorid-Dihydrat
Merck; A862982745
(CaCl2 · 2 H2O)
Eisen(II)-Sulfat-Heptahydrat (FeSO4 · 7 H2O)
Merck; TA886265046
D-(+)-Glucose, wasserfrei (C6H12O6)
Roth; 290158205
Glutaraldehyd (C5H8O2)
Serva; PO90341
Hefeextrakt
BD; 0344732
Hydroxylamin-Hydrochlorid (NH4OCl)
Merck; S22427741
Kaliumchlorid (KCl)
Roth; 071167621
di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4)
Merck; A880404803
Kalium-dihydrogenphosphat (KH2PO4)
Calbiochem; B32851
Kupfersulfat-Heptahydrat (CuSO4 · 5 H2O)
Merck; A866453618
Magnesiumsulfat-Heptahydrat (MgSO4 · 7 H2O)
Merck; A972786844
Mangan(II)-Sulfat-Monohydrat (MnSO4 · H2O)
Merck; 3837841634
Natriumcarbonat, wasserfrei (Na2CO3)
Roth; 042178778
Natriumchlorid (NaCl)
Roth; 202186415
Natriumhydrogenphosphat (NaHCO3)
Roth; 192185982
Natriumhyrdogenphosphat-Dihydrat (NaHCO3 · 2 H2O)
Roth; 44837953
Natriumhydroxid (NaOH)
Merck; B0160998743
di-Natrium-Molybdat-Dihydrat (Na2MoO4 · 2 H2O)
Merck; A854221520
Natriumtartrat-Dihydrat (C₄H₄Na₂O₆ · 2H₂O)
Aldrich; 06619TH-259
Trishydroxymethylaminomethan (TRIS) (C4H11NO3)
Roth; 172182199
Salzsäure (HCl)
Roth; 211867465
Natriumselenit (Na2SeO3)
Applichem; 1Y008059
Natriumselenat (Na2SeO4)
Sigma; 13555558
Material und Methoden
3.2
Seite |8
BAKTERIENSTAMM
Für diese Arbeit wurde der Bakterienstamm Azospirillum brasilense (DSMZ 1843)
verwendet.
3.3
KULTURMEDIEN UND LÖSUNGEN
Alle unter sterilen Bedingungen stattfindenden Arbeiten wurden an der Sterilbank Heraeus
Instruments des Typs „Hera Safe“ durchgeführt. Die für die Kulturmedien oder anderen
Lösungen abzuwiegenden Mengen wurden entweder an der Feinwaage „LA 129 S“ der
Firma Sartorius oder an der Waage (ab 1 g) der Firma Kern (Typ 510) abgewogen. Für das
Einstellen der pH-Werte wurde das pH-Meter der Firma WTW des Typs pH 540, MultiCal
verwendet. Mit Hilfe verschiedener Konzentrationen einer verdünnten Natriumhydroxidlösung (0,01 M; 0,1 M; 1 M; 10 M) und einer verdünnten Salzsäure (0,01 M; 0,1 M; 1 M;
10 M) wurde der gewünschte pH-Wert eingestellt.
3.3.1
Azo-Medium zur Kultivierung von Azospirillum brasilense
Das Medium für das Bakterium A. brasilense wird nach der Vorschrift der Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) (DSMZ 2007) hergestellt.
Dieses Medium ist speziell auf das verwendete Bakterium abgestimmt und wird in der
vorliegenden Arbeit weitergehend als Azo-Medium bezeichnet.
Stammlösung
950 ml
Spurenelementlösung (10-fach konzentriert)
1 ml
Na-Malat-Lösung (20%-ig)
25 ml
Glucose-Lösung (20%-ig)
25 ml
Biotin
500 µl
pH 7,1
Für das Medium wurde ein Volumen von 1 l angesetzt. Dazu wurde zunächst die
Stammlösung (Kapitel 3.3.1.1) hergestellt und nach vollständigem Lösen der Substanzen
in vollentsalztem Wasser (VE-Wasser) bei 121 °C 30 Minuten autoklaviert (Hiclave™,
HV-25).
Material und Methoden
Seite |9
Nach Abkühlen der Stammlösung wurde die sterile Spurenelementlösung mit dem sterilen
Biotin zu dem Medium gegeben. Die Natrium-Malat-Lösung und die Glucose-Lösung
wurden sterilfiltriert und zu dem Medium hinzugeführt.
3.3.1.1 Stammlösung für das Azo-Medium
Die Stammlösung für das Azo-Medium (Kapitel 3.3.1) setzt sich wie folgt zusammen.
CaCl2 · 2 H2O
0,02 g
Hefeextrakt
0,05 g
K2HPO4
0,25 g
MgSO4 · 7 H2O
0,20 g
NaCl
0,10 g
(NH4)2SO4
1,00 g
VE-H2O
950 ml
3.3.1.2 Spurenelementlösung (10-fach)
Die Spurenelementlösung (10-fach) für das Azo-Medium wurde aus folgenden Substanzen
zusammengesetzt:
FeSO · 7 H2O
0,1 g
MnSO · H2O
0,02 g
Na2MoO4 · 2 H2O
0,01 g
VE-H2O
ad 10 ml
4
4
3.3.2
Reagenzien für die Proteinbestimmung
Für die Proteinbestimmung wurde die Lösung C erst kurz vor der Anwendung frisch
hergestellt. Diese Lösung wurde in einem Verhältnis von 50:1 aus den Lösungen A und
Lösung B angesetzt.
Material und Methoden
S e i t e | 10
3.3.2.1 Lösung A
BCA
1g
Na2CO3
1,49 g
C4H4Na2O6 · 2 H2O
0,19 g
NaOH
0,4 g
NaHCO3
0,96 g
VE-H2O
50 ml
pH 11,25 mit 5 N NaOH
VE-H2O
ad 100 ml
CuSO4 · 5 H2O
1g
VE-H2O
25 ml
3.3.2.2 Lösung B
3.3.3
Salzlösung zur Isolierung der Nanopartikel
NaCl
17,5 g
KCl
0,74 g
MgSO4 · 7 H2O
12,3 g
TRIS
0,15 g
VE-H2O
ad 1000 ml
pH 7,5
Material und Methoden
S e i t e | 11
3.4
ZELLAUFSCHLUSSPUFFER/LAGERUNGSPUFFER
3.4.1
Kaliumphosphatpuffer (0,1 M)
Kaliumphosphat-Lösung (mono-Kalium-Salz) 16 ml
KH2PO4
2,72 g
VE-H2O
100 ml
Kaliumphosphat-Lösung (di-Kalium-Salz)
K2HPO4
3,48 g
VE-H2O
100 ml
VE-H2O
84 ml
100 ml
pH 7,5
3.4.2
PBS-Puffer
NaCl
0,8 g
KCl
0,02 g
NaHCO3 · 2 H2O
0,18 g
KH2PO4
0,024 g
VE-H2O
ad 100 ml
pH 7,4
3.4.3
Lysispuffer
NaCl
9g
NaOH
12 g
VE-H2O
ad 1000 ml
Material und Methoden
3.5
METHODEN
3.5.1
Erhaltung der Stammkultur
S e i t e | 12
Die Stammkultur von A. brasilense wurde auf einem festen Nährboden, bestehend aus
Azo-Medium (Kapitel 3.3.1) mit 1,5 % Agar, kultiviert. Zur Erhaltung dieser, wurde
einmal monatlich 1 bis 2 cm der Kultur mit einer sterilen Impföse aufgenommen und auf
eine frische Kulturplatte ausgestrichen. Die Kulturplatte wurde anschließend bei
Raumtemperatur gelagert.
3.5.2
Kultivierung von A. brasilense
Um eine Vorkultur des Bakteriums A. brasilense herzustellen wurden 1 bis 2 cm der
Kultur mit einer sterilen Impföse von dem festen Nährboden aufgenommen und in einem
mit 30 ml flüssigen Azo-Medium befüllten Erlenmeyerkolben überführt. Die Inkubation
erfolgte über Nacht im Wärmeraum bei 30 °C auf dem Schüttler der Firma Sartorius (Typ
Certomat MO II) mit 100 Umdrehungen pro Minute (rpm).
Die Kultivierung von A. brasilense erfolgte in Erlenmeyerkolben mit 100 ml Azo-Medium
ebenfalls bei 30 °C, 100 rpm unter aeroben Bedingungen. Der Wachstumsverlauf der
Zellkultur wurde durch Messung der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von
600 nm mittels Photometer der Firma Pharmacia Biotech (Typ: Ultrospec 1000) verfolgt.
Die Berechnung der Wachstumskonstanten (μ) in der exponentiellen Phase des Wachstums
erfolgt nach Formel 1 (F. 1) und die der Verdopplungszeit der Zellmasse (td) nach der
Formel 2 (F. 2).
F. 1
F. 2
Material und Methoden
3.5.3
S e i t e | 13
Chemische Reduktion von Selenit und Selenat
Um Selenat bzw. Selenit chemisch zu reduzieren wurden 100 µl einer 100 mM-Selenitund 100 µl einer 100 mM-Selenatlösung in je ein Reaktionsgefäß gegeben und mit je
600 µl VE-Wasser verdünnt.
Anschließend wurden je 200 µl Hydroxylamin (100 mM) hinzu pipettiert. Das durch die
chemische Reduzierung entstandene elementare Selen wird mit dem mikrobiell reduzierten
verglichen. Dabei wird auf Farbe und Form der Partikel und Absorption, welches mit Hilfe
der UV/Vis-Spektroskopie (Kapitel 3.5.11) untersucht wird, eingegangen.
3.5.4
Mikrobielle Reduktion von Selenit und Selenat
Zur Untersuchung der mikrobiellen Reduktion von Selenat und Selenit durch A. brasilense
erfolgte die Kultivierung der Zellen mit Selen, wie in Kapitel 3.5.2 beschrieben. Die
Ansätze wurden aus der Vorkultur so angeimpft, bis sich eine OD600nm von 0,25 einstellt.
Je nach zu untersuchender Selenat- (1 mM) oder Selenitkonzentration (1 mM bis 5 mM)
wurde ein entsprechendes Volumen aus den 100 mM-Stammlösungen in das Kulturmedium überführt.
Insgesamt gab es je 2 Ansätze mit Selenat und je 2 mit Selenit. Zusätzlich wurden 3
Kontrollansätze mitgeführt:
Kontrolle 1:
Medium + Bakterien
Kontrolle 2:
Medium + Selenit
Kontrolle 3:
Medium + Selenat
Die Probenentnahme (zweimal täglich) erstreckte sich über einen Zeitraum von 7 bis
10 Tagen. Der Wachstumsverlauf während der Kultivierung wurde durch Messung der
Optischen Dichte bei 600 nm, sowie der Bestimmung des Gesamtproteingehalts verfolgt.
Außerdem wurde der pH-Wert im Medium zu den Probezeitpunkten gemessen. Der
Selengehalt wurde mittels ICP-MS (Kapitel 3.5.8) und HG-AAS (Kapitel 3.5.9) ermittelt.
Dabei wurden 5 ml der jeweiligen Kultur abgenommen und bei 10.000 x g für 10 min
zentrifugiert. Jeweils 2 ml des Überstandes wurden auf zwei Reaktionsgefäße aufgeteilt.
Die Probe, die für die Messung mittels ICP-MS bestimmt war, wurde mit 20 µl
konzentrierter Salpetersäure versetzt. Die andere Probe wurde weiterverwendet für die
HG-AAS. Die Lagerung bis zur Messung erfolgte im Tiefkühlschrank.
Material und Methoden
3.5.5
S e i t e | 14
Lichtmikroskopie
Für die optische Untersuchung wurde das Lichtmikroskop Olympus (BX 61) mit einer
1000-fachen Vergrößerung verwendet. Hierbei wurden die Bakterien mittels Phasenkontrastaufnahme untersucht, während die Nanopartikel im Hellfeld sichtbar gemacht
wurden.
3.5.6
Zellaufschluss mittels basischer Verseifung
Eine weitere Kontrolle des Zellwachstums ist die Ermittlung der Gesamtzellproteinkonzentration. Dafür müssen die Zellen der entnommen Proben zunächst mittels
basischer Verseifung aufgeschlossen werden.
Dazu wurden die Zellen durch Zentrifugation 10 min bei 10.000 x g (Centrifuge 5804 R,
Eppendorf) vom Medium getrennt. Das Zellpellet wurde mit 500 µl Lysispuffer
(Kapitel 3.4.3) resuspendiert (Scientific Industries, Vortex-Genie 2), für 10 min im
Heizblock bei 90 °C inkubiert und erneut zentrifugiert. Vom Überstand wurde 50 µl
entnommen und im Anschluss die Proteinkonzentration durch das Bicinchoninic Acid
(BCA) Protein Assay (Kapitel 3.5.7) bestimmt.
3.5.7
Proteinbestimmung
Für die Proteinbestimmung wurde das Prinzip des Bicinchoninic Acid (BCA) Protein
Assays verwendet, welches auf der Bildung eines Kupfer2+-Proteinkomplexes unter
basischen Bedingungen beruht (Biuret-Reaktion). Nachdem sich der Komplex gebildet hat,
kommt es zur Reduktion von Cu2+ zu Cu+. Durch die anschließende Chelatbildung von
zwei Molekülen BCA mit einem Cu+-Ion verfärbt sich die Lösung blau-violett
(Abbildung 4). Die Konzentration des gebildeten Farbstoffes wurde durch Messung der
Absorption bei 562 nm mit dem Plattenreader µQuant der Firma Bio-Tek Instruments, inc.
gemessen. Die Höhe der Reduktion des Kupfers ist dabei proportional zu der Menge an
Protein (Smith et al. 1985).
Material und Methoden
S e i t e | 15
Abbildung 4: Farbgebung nach 1 h Inkubation
Nachdem jeweils 50 µl des Überstandes der Probe entnommen wurde (Kapitel 3.5.6),
konnten 950 µl der Reagenz C (Kapitel 3.3.2) hinzugegeben werden. Als Blank- bzw.
Referenzlösung wurden bei jeder Messung Lysispuffer und Rinderserumalbumin
(1 mg/ml) in einem Konzentrationsbereich von 100 bis 800 µg/ml mitgeführt. Die Proben
wurden für eine Stunde bei RT inkubiert und für die Messung (Doppelbestimmung) der
Absorption im Plattenreader jeweils 200 µl in ein Well der Mikrotiterplatte (Greiner,
bio-one-PS Microplate) überführt. Anhand der Eichgerade (Abbildung 5) wurde die
Proteinkonzentration ermittelt.
1150
BSA-Konzentration [µg/ml]
950
y = 3884,5x - 912,9
R² = 0,9972
750
550
350
150
-50
0,22
0,27
0,32
Eichgerade
0,37
OD562nm
0,42
0,47
Linear (Eichgerade)
Abbildung 5: BSA-Eichkurve zur Proteinbestimmung mit dem BCA-Reagenz
Material und Methoden
3.5.8
S e i t e | 16
Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS)
Die Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS, inductivelycoupled-plasma massspectrometry) ist ein Verfahren der Spurenelementanalytik, bei dem
der Gesamtgehalt an Selen in den Proben ermittelt wird.
Die flüssigen Proben werden über ein Zerstäubersystem als feine Tropfen in das induktiv
gekoppelte Argonplasma überführt und bei einer Temperatur von ca. 5000 °C ionisiert.
Dieses Plasma wird durch einen hochfrequenten Strom in ionisiertem Argon induziert. Die
geladenen Molekülfraktionen werden beschleunigt und über ein Linsensystem in das
Hochvakuum des Massenspektrometers überführt. Die Ionenoptik fokussiert den
Ionenstrahl, der in einem Magnetfeld, dem Quadrupol-Massenspektrometer, eingebracht ist
und die Moleküle abhängig von ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis auftrennt. Dem
entsprechend erfolgt eine Einteilung der Probemoleküle nach Molekülmasse. Die Ionen
werden mit Hilfe eines ladungssensitiven Detektors analysiert. Da jedes Element
mindestens ein Isotop aufweist und dessen Masse bei keinem natürlichen Isotop eines
anderen Elements auftritt, ist die Masse eine charakteristische Eigenschaft der Elemente
(Schmidt & Gebel 2000, Less et al. 2008).
Die Messung der Proben wurde an dem Institut für Ressourcenökologie mit dem Gerät der
Firma Perkin Elmer des Typs SCIEX Elan 9000 durch Frau Aline Ritter durchgeführt.
3.5.9
Hydrid-Generation (Hydridtechnik) Atomabsorptionsspektrometrie
(HG-AAS)
Mit Hilfe der Hydridtechnik können Metalle analysiert werden, die flüchtige Hydride
bilden, wozu Arsen, Bismuth, Antimon, Eisen und auch Selen zählen. Bevor die Probe
analysiert werden kann, muss sie in ionogener Form vorliegen. Um dies zu realisieren,
wurde die Probe chemisch vorbehandelt durch Verdünnung mit 3 %-iger Salzsäure, welche
auch gleichzeitig zum Verdünnen der Kalibrierlösung verwendet wurde. Diese Salzsäure
dient als Trägerlösung. Als Reduktionsmittel dient ein Gemisch aus 0,2 %-igem Natriumbortetrahydrid und 0,05 %-iger Natriumhydroxidlösung in Wasser.
Zuerst wurde der Selenstandard (10 µg/ml) 1:100 verdünnt und je 10 µl, 50 µl, 100 µl,
150 µl und 200 µl entnommen und jeweils auf 10 ml mit 3 %-iger Salzsäure aufgefüllt.
Material und Methoden
S e i t e | 17
Anschließend wurden die Proben präpariert, indem sie 1:10.000 mit 3 %-iger Salzsäure
verdünnt wurden. Nachdem die Zugabe des Reduktionsmittels erfolgte, reagiert es mit der
Säure und setzte Wasserstoff frei. Dieser Wasserstoff reduziert die Metallionen zum
gasförmigen Hydrid. Der Inertgasstrom aus Argon spült das Hydrid in die bis ca. 1000 °C
aufheizbare Quarzküvette, in der Selen chemisch zersetzt wird. Bei der Hydridtechnik ist
darauf zu achten, dass Störsubstanzen und Begleitstoff als gasförmiges Hydrid mit Hilfe
von Argon abgetrennt werden.
Die Atomabsorptionsspektrometrie wurde am Institut für Ressourcenökologie des HZDRs
mit dem „Atomic Absorption Spektrometer 4100“ der Firma Perkin Elmer durch die
Mitarbeiterin Aline Ritter durchgeführt.
3.5.10 Isolierung der Nanopartikel
Zur Isolierung der Se(0)-Nanopartikel wurde eine modifizierte Methode nach Oremland
(Oremland et al. 2004) verwendet.
Von den Kulturansätzen, bei denen mikroskopisch Nanopartikel sichtbar waren, wurden
jeweils 40 ml entnommen und in ein 50 ml Polypropylen-Röhrchen gegeben. Diese
Zellsuspension wurde mittels Ultraschallfinger (Branson, Digital Sonifier W-250 D) bei
50 %-iger Intensität zwei Minuten homogenisiert. Anschließend wurde die Probe
30 Minuten (Eppendorf, Centrifuge 5804 R) bei 1500 x g zentrifugiert. Nach dem
Zentrifugieren folgten drei Waschschritte, bei denen der Überstand verworfen wurde und
das Pellet jeweils mit 0,5 M Natriumchloridlösung, 0,5 M Saccharoselösung und einer
Salzlösung (Kapitel 3.3.3) gewaschen und anschließend nach jedem Schritt erneut mit dem
Ultraschallfinger behandelt und zentrifugiert wurde. Nach der Zentrifugation wurden
35 ml, der mit Eiweißlysozym versetzten Salzlösung, hinzugegeben und bei Raumtemperatur 19 h inkubiert.
Am folgenden Tag wurden die lysierten Zellen erneut mit dem Ultraschallfinger behandelt
und bei 9000 x g für 15 min zentrifugiert. Die Trennung der Selennanopartikel von den
Zellen bzw. Zellbestandteilen erfolgte durch weitere 4 Waschschritte (Salzlösung (Kapitel
3.3.3), 0,25 M NaOH, 0,1 M NaOH und 10 mM Na2HPO4) bei denen der Überstand
verworfen wurde und das Pellet jeweils mit der entsprechenden Lösung resuspendiert
wurde.
Material und Methoden
S e i t e | 18
Nach jedem dieser Waschschritte erfolgte eine Behandlung mit dem Ultraschallfinger, eine
Inkubation von 1,5 h und die Zenrifugation. Die gereinigten Nanopartikel wurden in VEWasser resuspendiert.
3.5.11 UV/Vis-Spektroskopie
Die UV/Vis-Spektroskopie beruht auf dem Prinzip, dass Elektronen in einem Molekül
durch elektromagnetische Strahlung auf höhere, im Grundzustand des Moleküls, nicht
besetzte Energieniveaus angehoben werden. Dabei wird die elektromagnetische Strahlung
absorbiert und im Wellenbereich des ultravioletten Lichts (UV-Bereich,
400 nm) oder im Bereich des sichtbaren Lichts (Vis-Bereich,
=170 bis
=400 nm bis 800 nm)
gemessen (Hädener & Kaufmann 2006, Less et al. 2008).
Bei der UV/Vis-Spektroskopie wird die Absorption der UV- oder der Vis-Strahlung durch
einem in Lösung vorliegenden Analyten bestimmt. Dabei wird die Probe mit
polychromatischen Licht beleuchtet, welches transmittiert und schließlich spektral
aufgespalten wird. Die Absorption berechnet sich dann aus der Differenz zwischen den
Werten der Referenz (in diesem Fall VE-Wasser) und der Probe.
Die UV/Vis–Spektren wurden mit Hilfe des Spektrometers des Typs Lambda 750 der
Firma Perkin Elmer unter Verwendung von Quarzküvetten mit Schichtdicke 1 cm
aufgenommen.
3.5.12 Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit der
energiedispersiven Röntgenspektroskopie (REM-EDX)
Mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie kann eine plastische dreidimensionale
Darstellung von Oberflächen sichtbar gemacht werden. Das Prinzip dieser Art der
Mikroskopie beruht darauf, dass ein Elektronenstrahl auf die zu untersuchende Probe
fokussiert wird, der durch Wechselwirkung mit der Probe sogenannte sekundäre
Elektronen an der Oberfläche des Präparates erzeugt. Dabei geben Löcher und Spalten
weniger sekundäre Elektronen ab und erscheinen dunkel. Runde Erhebungen hingegen
geben mehr sekundäre Elektronen ab und wirken dem entsprechend heller (Raven et al.
2000).
Material und Methoden
S e i t e | 19
Von den Zellkulturen in denen lichtmikroskopisch Nanopartikel sichtbar waren, wurden
zweimal je 1 ml entnommen und bei 10.000 x g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und mit dem Pellet wurde weitergearbeitet.
Die Probenpräparation erfolgte nach zwei unterschiedlichen Methoden. Dabei wurde zum
Einen mit Glutaraldehyd gearbeitet, wo durch Vernetzung der Proteine Zellstrukturen
fixiert wurden. Somit lassen sich die Zellen besser abbilden. Zum Anderen verwendete
man eine Methode ohne Glutaraldehyd, da hierbei ein „Verkleben“ der Zellen vermieden
wird und somit eine gute Darstellung der Nanopartikel erhält.
Bei der ersten Methode wurde das Pellet zweimal mit PBS (Phosphatgepufferte
Salzlösung) gewaschen, zentrifugiert und der Überstand verworfen. Danach folgte die
Fixierung in 1,5 ml 2 % Glutaraldehyd in PBS für 1 h. Nach dem Zentrifugieren, wird es
erneut zweimal mit Reinstwasser gewaschen, zentrifugiert, der Überstand verworfen und in
1,5 ml Reinstwasser resuspendiert und im Ultraschallbad für 3 min behandelt.
Bei der zweiten Methode wurde auf das Waschen mit PBS und die Fixierung mit
Glutaraldehyd verzichtet. Die Waschschritte mit Reinstwasser wurden in gleicher Weise
durchgeführt wie bei der 1. Methode.
Zum Aufbringen der Proben wurden Siliziumplättchen (0,5 x 0,5 cm) mit Hilfe von
Leitsilber, dem Methylisobutylketon, auf einem Stiftprobenteller fixiert. Danach wurden
10 µl der jeweiligen Probe auf das Plättchen gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur
getrocknet.
Zusätzlich zum REM wurde eine energiedispersive Röntgenspektroskopiemessung (EDX)
durchgeführt, welche eine Identifizierung der Elementzusammensetzung erlaubt. Dabei
wurde die Probe mit Elektronen beschossen, wodurch die Probenatome angeregt werden.
Die Elektronen der inneren Schalen werden auf ein höheres Energieniveau angehoben. Die
bei dem Zurückfallen der Elektronen in den Grundzustand entstandene Energiedifferenz
tritt in Form von Röntgenstrahlung auf. Diese ist charakteristisch für Elemente.
Die REM-EDX-Untersuchungen wurden vom Institut für Ionenstrahlphysik des HZDRs
mit dem Mikroskop „REM Zeiss EVO 50“ durch die Mitarbeiterin Elfi Christalle
durchgeführt.
Material und Methoden
S e i t e | 20
3.5.13 Transmissionselektronenmikroskop in Kombination mit der
energiedispersiven Röntgenspektroskopie (TEM-EDX)
Das Prinzip des Transmissionselektronenmikroskops beruht auf einem ähnlichen Prinzip
wie des Lichtmikroskops, jedoch wird statt einer Lichtquelle eine Strahlungsquelle
verwendet, die das Objekt mit schnellen Elektronenstrahlen durchstrahlt. Aus der
Strahlungsquelle, einer beheizten Feldemissionskathode, treten Elektronen aus, die durch
Anlegen einer Beschleunigungsspannung ihre kinetische Energie erhalten. Während ein
Teil der Elektronen ohne Beeinflussung durch die Probe hindurch tritt, kommt ein anderer
Teil in Wechselwirkung mit dem Kern der Probenatome. Die Elektronenstrahlen, die das
Objekt passieren, hinterlassen auf einem darunter liegenden Fluoreszenzschirm
Kontrastspuren. Dabei erscheinen „elektronentransparente Gebiete“ hell, „elektronendichte
Gebiete entgegen dunkel.
Bei biologischen Proben liegt die Auflösung bei 2 nm und ist damit 100 mal besser als bei
einem Lichtmikroskop (Raven et al. 2000)
Zur Probenpräparation wurden 5 µl einer Nanopartikelsuspension (resuspendiert in
VE-Wasser) auf ein Kupfernetz pipettiert, welches mit einem Formvar/Kohle-Film
beschichtet war.
Zusätzlich zur Bildgebung wurde die Elementzusammensetzung mittels EDX bestimmt
(Kapitel 3.5.12). Die TEM-EDX-Untersuchung wurde durch Herrn Dr. René Hübner
(Institut für Ionenstrahlphysik des HZDRs) an dem Gerät der Firma FEI des Typs „Titan
80-300“ durchgeführt.
3.5.14 Bestimmung des Zetapotentials
Das Zetapotential gibt Informationen über die physikalische Stabilität von Dispersionen
und bestimmt die Wechselwirkung von dispergierten Partikeln mit Substanzen aus dem
Dispersionsmedium.
Jedes Teilchen ist von einer flüssigen Schicht umgeben, die aus zwei Phasen besteht. Zum
Einen eine innere Region, die Sternschicht und zum Anderen eine äußere, diffuse Schicht.
Bei der Sternschicht sind die Ionen stark gebunden, wo hingegen die Ionen bei der diffusen
Schicht weniger fest gebunden sind. Aufgrund der elektrophoretischen Bewegung der
Material und Methoden
S e i t e | 21
Teilchen und den dabei entstehenden Reibungskräften kommt es zum Abstreifen der
diffusen Schicht.
Dadurch kommt es zur Entfernung der Gegenionen, womit das Teilchen seine Neutralität
verliert und nun in einem geladenen Zustand vorliegt und sich zur entgegengesetzt
geladenen Elektrode bewegt. Durch Messen der Partikelgeschwindigkeit kann die
Nettoladung des Partikels und die Abhängigkeit seines Oberflächenpotenzials zur
umgebenden Phase berechnet werden. Diese Nettoladung wird als Zetapotential gemessen.
Wenn alle Teilchen in der Suspension ein großes negatives oder positives Zetapotential
besitzen, dann neigen sie dazu, sich gegenseitig abzustoßen, in Folge dessen kommt es
nicht zum Ausflocken.
Das Zetapotential ist abhängig vom pH-Wert. Daher stellt der pH-Wert einen wichtigen
Faktor bei der Bestimmung des Zetapotentials dar. Je basischer die Suspension, desto eher
neigt das Partikel dazu eine negative Ladung anzunehmen. Durch Zugabe der Säure wurde
erreicht, dass ein Punkt erreicht wird, an dem die negative Ladung neutralisiert ist. Die
Konzentrationsverhältnisse, bei denen das Zetapotential null ist, bezeichnet man als
isoelektrischen Punkt. Um diese Abhängigkeit darzustellen wurde die Nanopartikelsuspension 1:100 mit einer 0,1 M NaCl-Lösung verdünnt. Anschließend erfolgte die
Einstellung der pH-Werte in dem Bereich 1 bis 7. Um eine statistische Sicherheit zu
erzielen, wurden 10 Messungen pro pH-Wert gemessen. Daraus wurde ein Mittelwert mit
der jeweiligen Standardabweichung berechnet. Beim Auftragen des Zetapotentials gegen
den pH-Wert entsteht eine Kurve, vergleichbar mit Abbildung 6.
Die Zetapotential-Messungen wurden am Zetasizer der Firma Malvern Instruments (Typ:
Nano-ZS) mit der Kapillarzelle „TDS 1060“ ebenfalls von der Firma Malvern Instruments
gemessen.
Material und Methoden
S e i t e | 22
60
Zetapotential (mV)
40
20
0
-20
-40
IEP
-60
2
4
6
8
10
12
pH
Abbildung 6: Typische Kurve nach Auftragen des Zetapotentials
gegen den pH-Wert (Malvern Instruments 2007)
3.5.15 Dynamische Lichtstreuung (DLS)
Um die Partikelgröße zu identifizieren bzw. eine Partikelgrößenverteilung aufzustellen
wurde die Methode der dynamischen Lichtstreuung (DLS) verwendet, welche auch häufig
als Photonenkorrelationsspektroskopie (Photon Correlation Spectroscopy, PCS) bezeichnet
wird. Bei der dynamischen Lichtstreuung wird das Streulicht eines Lasers an einer
suspendierten Probe analysiert. Durch die Bewegung der Teilchen im Lichtstrahl kommt es
bei der Intensität des Lichtes zu Fluktuationen. Mit Hilfe dieser Fluktuation kann der
Diffusionskoeffizient der Teilchen, welcher Aufschluss über den hydrodynamischen
Radius bzw. den Stokes-Teilchendurchmesser gibt. Das heißt, es wird der Durchmesser
einer hypothetischen Kugel gemessen, die mit der gleichen Geschwindigkeit wie das zu
analysierende Partikel diffundiert. Je größer ein Teilchen ist, desto langsamer bewegt es
sich und desto kleiner ist sein Diffusionskoeffizient. Das gemessene Signal bei der
Fluktuation zeigt ein charakteristisches Rauschverhalten, aus dessen zeitlichen Verlauf die
Bewegungsgeschwindigkeit des Teilchens ermittelt werden kann. Dies wird in einer
Autokorrelationsfunktion der Intensität dargestellt.
In einem gewissen Zeitintervall werden Bilder von dieser Bewegung aufgenommen, womit
die Geschwindigkeit des Partikels und die damit verbundene Größe berechnet werden
konnte (Pingoud & Urbank 1997).
Material und Methoden
S e i t e | 23
3.5.16 Raman-Spektroskopie der Nanopartikel
Die Raman-Spektroskopie ist eine Methode um die Molekülschwingungen und -rotationen
eines Stoffes zu analysieren. Durch Bestrahlen der Flüssigkeit mit monochromatischem
Licht (z.B. Argon-Laser) mit einer Wellenlänge von 488 nm kommt es zu einer
Durchstrahlung der Probe. Nur ein geringer Teil des Lichtes wird ungerichtet gestreut. Ein
noch geringerer Anteil des eingestrahlten Lichtes tritt ebenfalls in alle Richtungen aus,
besitzt jedoch eine Frequenzverteilung. Diese entsteht durch Absorption und Reemission,
welche mit Schwingungsanregung oder -löschung verbunden sind. Mit Hilfe eines
photoelektronischen Detektors kann die spektral zerlegte Streustrahlung gemessen werden.
Als Folge der Wechselwirkung zwischen Materie und elektromagnetischer Strahlung folgt
somit der Raman-Effekt. Das Raman-Spektrum ist ein Emissions-Spektrum (Hesse et al.
2005). Bei der Raman-Spektroskopie wird in einem Wellenzahlbereich von 0 cm-1 bis
8000 cm-1 gemessen.
Nachdem 3 µl der Nanopartikelsuspension auf den Quarzobjektträger aufgetragen wurde,
konnte das Raman-Spektrum mit Hilfe der Mitarbeiterin Sophia Kostudis des HelmholtzInstituts Freiberg für Ressourcentechnologie des HZDR mit dem Gerät RFS100/S der
Firma Bruker aufgenommen werden.
3.5.17 Thermostabilitätstest
Bei diesem Testverfahren wurde die Thermostabilität der isolierten Nanopartikel
untersucht. Um vergleichende Aussagen treffen zu können, wurde vor und nach dem
Erhitzen ein UV/Vis-Spektrum (Kapitel 3.5.11) aufgenommen und die Partikelgrößenverteilung mittels dynamischer Lichtstreuung (Kapitel 3.5.15) untersucht. Des Weiteren
wurde der TOC-Gehalt der Nanopartikel bestimmt (Kapitel 3.5.18).
Für dieses Testverfahren wurde ein Edelstahlautoklav verwendet, in dem ein Teflonbecher
eingesetzt ist (Abbildung 7). Nach Zugabe von 5 ml Nanopartikelsuspension (Nanopartikel
in VE-Wasser) wurde der Autoklav mittels Schraubdeckel fest verschlossen, so dass keine
Flüssigkeit verloren gehen kann. Anschließend wurde der Stahlautoklav bei 50 °C, 100 °C
und 250 °C für 24 h im Muffelofen erhitzt und die Proben nach dem Abkühlen erneut mit
den oben genannten Methoden untersucht. Die Temperierung für 24 h bei 35 °C wurde
mittels eines temperierten Wasserbades realisiert.
Material und Methoden
S e i t e | 24
Abbildung 7: Stahlautoklav mit eingesetzten Teflonbecher
3.5.18 Bestimmung des Totalen organischen Kohlenstoffgehalts (TOC)
Zur Bestimmung des Kohlenstoffgehalts (TC-Total Carbon) werden sogenannte Summenparameter verwendet. Darunter zählen der gesamte anorganische Kohlenstoffgehalt
(TIC - Total Inorganic Carbon) und der gesamte organische Kohlenstoffgehalt
(TOC - Total Organic Carbon). Dabei wurde beim TOC zwischen dem Anteil an gelösten
organischen Kohlenstoff (DOC -Dissolved Organic Carbon), dem partikulären organischen
Kohlenstoff (POC - Particulate Organic Carbon) und dem flüchtigen organisch
gebundenen Kohlenstoff (VOC - Volatile Organic Carbon) unterschieden (Abbildung 8).
Der DOC-, POC- und VOC-Wert spielen jedoch eine untergeordnete Rolle, da nur der
gesamte organische Kohlenstoff betrachtet wird.
Die Bestimmung des TOC-Gehaltes, der in VE-Wasser suspendierten Nanopartikel, soll
Aufschluss über das Vorhandensein organischer Substanzen liefern.
Material und Methoden
S e i t e | 25
TC
(Gesamtkohlenstoff)
TIC
(Gesamter anorganischer
Kohlenstoff)
TOC
(Gesamter organischer
Kohlenstoff)
DOC
(Gelöster organischer
Kohlenstoff)
POC
(Partikulärer organischer
Kohlenstoff)
VOC
(Organisch gebundener
Kohlenstoff)
Abbildung 8: Bestimmungsformen des Kohlenstoffs
Der TOC-Gehalt wird mit Hilfe des Differenzverfahrens bestimmt. Dabei wird zunächst
die Gesamtheit aller Kohlenstoffverbindungen (TC) gemessen und anschließend den Anteil
an anorganischer Kohlenstoffverbindungen (TIC) ermittelt. Den TOC-Gehalt erhält man
durch Subtraktion des TICs vom TC.
Die TOC-Untersuchungen wurden vom Institut für Ressourcenökologie mit dem „multi
N/C 2100 S“ der Firma Analytik Jena
durchgeführt.
durch die Mitarbeiterin Carola Eckardt
Ergebnisse
4
4.1
S e i t e | 26
ERGEBNISSE
WACHSTUMSKURVE VON A. BRASILENSE
Durch Aufnehmen der Wachstumskurve des Bakteriums A. brasilense wird das Wachstum
und die Vermehrung der Zellkultur beobachtet. Dabei wird das Wachstumsverhalten unter
normalen Wachstumsbedingungen charakterisiert. Somit kann später, bei Einwirkung von
Stressfaktoren, ein Vergleich zum Wachstumsverhalten gezogen werden. Da die Anzahl
der Bakterien durch Zellteilung ansteigt, kommt es zu einer Trübung der Kultur, welche
mittels Messung der Optischen Dichte bei 600 nm erfasst und quantitativ bestimmt werden
kann. In Abbildung 9 ist eine repräsentative Wachstumskurve unter aeroben Bedingungen
dargestellt.
10
0
5
10
15
Stationäre
Phase
0
Übergangsphase
0
Exponentielle
Phase
1
lag-Phase
Logarithmischer
OD600nm-Wert
Bestimmung
von µ und td
20
25
Zeit (h)
30
35
40
45
50
Bakterienkultur
Abbildung 9: Logarithmische Darstellung der Wachstumskurve von A. brasilense
Am Anfang der Kultivierung ist eine geringe lag-Phase bis 2 h erkennbar. Diese
Anlaufphase wird von den Bakterien benötigt, um ihren Stoffwechsel an die veränderten
Umgebungsbedingungen anzupassen.
In dem Zeitraum 2 bis 10 h ist ein exponentielles Wachstum der Zellen zu erkennen, wobei
hier eine Teilung der Bakterienzellen in gleichen Zeitabständen stattfindet. Nach der
Ergebnisse
S e i t e | 27
exponentiellen Phase folgt eine Übergangsphase, bevor die stationäre Phase bei 23,5 h
beginnt. In der stationären Phase bleibt der Biomassegehalt konstant. Anhand der Werte
der exponentiellen Phase der Wachstumskurve kann die Wachstumsrate µ und die
Verdopplungszeit td berechnet werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Bis zu einem Zeitpunkt von ca. 30 h ist ein stetiges Wachstum zu erkennen und erreicht
hier das Maximum mit einer Optischen Dichte von etwa 3,4.
Tabelle 1: OD-Werte und die jeweiligen Zeiten am Anfang und Ende der exponentiellen Phase,
Wachstumsrate und Verdopplungszeit
Parameter
Bakterienkultur
x0
0,110
xt
0,810
t
9,67 h
t0
2,00 h
µ
0,26 h-1
td
2,67 h
Im folgenden Kapitel wird der Einfluss der Selenoxyanionen auf das Bakterium
A. brasilense untersucht. Dazu wurde eine Anzahl von Methoden verwendet, um das
Wachstumsverhalten in Gegenwart von Selenit und Selenat zu beschreiben und die
Veränderungen der Selenkonzentrationen im Medium zu verdeutlichen. Mit Hilfe des
Lichtmikroskops wurden Bakterien und Nanopartikel sichtbar gemacht. Zur besseren
Charakterisierung, der durch mikrobielle Reduktion von Selenit gebildeten Nanopartikel,
wurden diese, wie in Kapitel 3.5.10 beschrieben, von den Bakterienzellen isoliert. Bei den
Nanopartikeln wurden die Partikelgrößenverteilung, die Oberflächenladung und die
Thermostabilität untersucht. Dazu wurde die Oberflächenladung durch das Zetapotential
bestimmt, die Größenverteilung durch die dynamische Lichtstreuung gemessen, und die
Thermostabilität der Nanopartikelsuspension nach Erhitzen mittels UV/Vis und
TOC-Messung näher beschrieben.
Ergebnisse
4.2
S e i t e | 28
REDUKTION VON SELENAT UND SELENIT DURCH DAS BAKTERIUM
A. BRASILENSE
Bei diesem Versuch wurde das Bakterium A. brasilense auf dessen Fähigkeit Selenit und
Selenat zu elementarem Selen zu reduzieren, untersucht. Um den Einfluss der toxischen
Selenoxyanionen auf das Wachstum von A. brasilense verfolgen zu können, wurden die
optische Dichte bei 600 nm, die Gesamtzellproteinkonzentration sowie der pH-Wert
gemessen. Um den zeitlichen Verlauf der Selenit- und Selenatkonzentration und den
daraus resultierenden produzierten Anteil an elementarem Selen zu ermitteln, wurden
ICP-MS- und HG-AAS-Messungen durchgeführt. Weitere Untersuchungen fanden mittels
Lichtmikroskopie statt.
Während der Kultivierung gab es farbliche Auffälligkeiten zwischen den Selenit-, Selenatund Kontrollansätzen, dessen farbliche Verläufe in Abbildung 10, Abbildung 11 und
Abbildung 12 zusammenfassend dargestellt sind.
Kontrolle
Selenat
Selenit
1.Tag
6.Tag
7.Tag
Abbildung 10: Farbverlauf
der Kontrolle
Abbildung 11: Farbverlauf
der Selenatkultur
Abbildung 12: Farbverlauf
der Selenitkultur
Zusätzlich zu der normalen Kontrolle, in der lediglich die Bakterien ohne Zusatz von
Selenit oder Selenat enthalten waren, wurden zwei weitere Kontrollen angesetzt, die
lediglichSelenat
aus Medium und Selenit oder Selenat bestanden. Diese Kulturen blieben während
der gesamten Kultivierung klar und farblos.
Ergebnisse
S e i t e | 29
Am Ende der Kultivierung mit Bakterien wurden diese Unterschiede in der farblichen
Entwicklung gut sichtbar (Abbildung 13).
Medium
+
Bakerien
Medium
+
Se(IV)
Kontrollen
Medium
+
Se(VI)
Selenitansätze
Selenatansätze
Abbildung 13: Farbliche Entwicklung der Kontroll-, Selenat- und Selenitkultur nach sieben Tagen
Kultivierung
Es ist zu erkennen, dass die Farbverläufe bei der Kontrollkultur und bei dem SelenatAnsatz identisch sind. Nach Zugabe des Selenats bleibt die Selenatkultur weiß und trüb.
Erst am 2. Tag beginnen beide Kulturen leicht orange-rot zu werden. Am Ende des
Versuches ist bei beiden eine kaminrote Färbung wahrzunehmen. Unterschiede in der
Farbentwicklung sind bei der Selenitkultur (Abbildung 12) zu beobachten. Schon kurze
Zeit (10 min) nach Zugabe des Selenits ist ein Farbumschlag zu orange-rot erkennbar. Am
6. Tag nimmt die Selenitkultur einen intensiven dunklen Orangeton an. Diese Farbe
verändert sich bis zum 7. Tag insofern, dass diese in einen orange-roten Farbton übergeht.
Die Bakterien wurden mit Hilfe der Lichtmikroskopie auf die Morphologie der Zellen mit
und ohne Selen analysiert. Aufgrund der Farbänderung wurden die Veränderungen einer
möglichen Bildung von Nanopartikeln während der Kultivierung verfolgt.
Beim Betrachten der Kulturen wurden sowohl in Selenit- und Selenatkulturen, als auch in
der Kontrollkultur Bakterien gut sichtbar. Dabei wurde kein Unterschied zwischen den
Selenit-, Selenat- und Kontrollkulturen bezüglich der Zellform und -größe der Bakterien
festgestellt. Bei der Phasenkontrastaufnahme (Abbildung 14, Abbildung 15 und
Abbildung 16) konnten die Nanopartikel nur bei den Selenitansätzen festgestellt werden.
Bei den Selenitansätzen wurden sphärische Partikel wahrgenommen, die laut Literatur,
aufgrund der Färbung der Kultur, Selennanopartikel sein könnten (Oremland et al. 2004).
Mittels Hellfeldaufnahme wurden diese Partikel hervorgehoben (Abbildung 17). In den
Aufnahmen der Kontrolle (Abbildung 14) und der Selenatkultur (Abbildung 15) kann
ausschließlich das Vorhandensein der Bakterien beobachtet werden.
Ergebnisse
S e i t e | 30
Abbildung 14: Mikroskopische Aufnahme von
A. brasilense im Kontrollmedium (ohne
Nanopartikel)
Abbildung 15: Mikroskopische Aufnahme von
A. brasilense mit Nanopartikeln im
Selenatansatz (ohne Nanopartikel)
Abbildung 16: Mikroskopische Aufnahme von
A. brasilense mit Nanopartikeln im
Selenitansatz
Abbildung 17: Hellfeldaufnahme der
Nanopartikel in der Selenitkultur
4.2.1
Wachstumsverlauf in Gegenwart von Selen
Die Wachstumskurven von A. brasilense in Gegenwart von Selenat und Selenit sind in
Abbildung 18 dargestellt. Dabei wurden jeweils 2 Kulturen mit 1 mM Selenit und mit
1 mM Selenat versetzt und eine Kontrolle mitgeführt. In der Darstellung wird sichtbar,
dass die Bakterienkulturen mit Selenat einen identischen Wachstumsverlauf zeigen, wie
die Kontrollkultur.
Ergebnisse
S e i t e | 31
OD 600nm (logarithmisch)
25
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Zeit (d)
Selenit (Ansatz 1)
Selenat (Ansatz 1)
Selenit (Ansatz 2)
Selenat (Ansatz 2)
Kontrolle
Abbildung 18: Logarithmische Darstellung der OD-Werte der Kontroll-, Selenit- und Selenatkultur
Die OD-Werte der Kontrollkultur und der Kulturen mit Selenat steigen stetig bis zum
Beenden des Versuchs nach sieben Tagen. Nach Überwinden der Anlaufphase gehen diese
in die exponentielle Phase über, in der die Kulturen ähnliche Wachstumsraten besitzen.
Beim Betrachten des Verlaufs der OD-Werte der Selenitansätze ist zu erkennen, dass nach
einer geringen Wachstumsphase bis 4 h eine lange lag-Phase im Zeitraum von vier
Stunden bis drei Tagen folgt. Anschließend beginnt die exponentielle Phase, welche bis
zum Versuchsende andauert.
Tabelle 2 zeigt die Mittelwerte (MW) des maximalen OD-Wertes zu dem entsprechenden
Zeitpunkt. Dabei wird sichtbar, dass alle Ansätze ähnliche Maxima aufweisen. Die
Kulturen mit Selen erreichen das Maximum nach 6,5 Tagen mit einer OD von 4,3 bei dem
Selenatansatz und 4,7 bei dem Selenitansatz. Die Kontrolle weist 12 h zuvor ein Maximum
bei 4,7 auf.
Tabelle 2: Zeitpunkt und OD-Wert des Maximums der Kontroll-, Selenat- und Selenitkultur
Kontrolle
Selenat
Selenit
Zeit
Zeit
Ansatz 1
Ansatz 2
(d)
(d)
5,85
5,85
6,85
5,85
6,85
MW der
Zeit (d)
5,85
6,35
6,35
ODODWert
Wert
Ansatz 1 Ansatz 2
4,69
3,80
4,72
5,17
4,14
MW
ODWert
4,7
4,3
4,7
Ergebnisse
S e i t e | 32
Die optische Dichte bei 600 nm erfasst sowohl die Absorption durch Bakterienzellen als
auch die gebildeten Nanopartikel. Dies kann zu einer Überschätzung der Zelldichte in den
Selenitkulturen führen. Um zusätzliche Informationen über das Zellwachstum zu erlangen,
wurde der Gesamtzellproteingehalt bestimmt. In der Abbildung 19 ist der nichtlogarithmische Verlauf der Gesamtzellproteinkonzentration gegenüber der Zeit dargestellt.
Beim Vergleich der Selenit- und Selenatansätze wird sichtbar, dass die Bakterienkulturen
mit 1 mM Selenat im zeitlichen Verlauf eine ähnliche Proteinkonzentration aufweisen wie
die Kontrollkultur. Die Verläufe der Proteinkonzentration zeigen Gemeinsamkeiten mit
den OD-Werten in Abbildung 18. Große Unterschiede werden bei den Selenitansätzen
sichtbar, die erst nach einer längeren lag-Phase einen Anstieg in der Gesamtzellproteinkonzentration und somit in der Zelldichte zeigen. Die Selenitansätze weisen im
Vergleich zu der Selenat- und Kontrollkultur eine höhere Proteinkonzentration auf und
dem entsprechend auch eine höhere Zellzahl.
2480
Proteinkonzentration [µg/ml]
1980
1480
980
480
-20
0
20
40
Selenit (Ansatz 1)
Selenit (Ansatz 2)
60
80
100
Zeit (h)
Selenat (Ansatz 1)
Selenat (Ansatz 2)
120
140
160
180
Kontrolle
Abbildung 19: Darstellung der Gesamtzellproteinkonzentration der Kontroll-, Selenit- und
Selenatkultur
Die Proteinkonzentration der Kontrollkultur steigt ab der ersten Messung bis 147 h
(sechs Tage) auf eine Konzentration von 868 µg/ml an und nimmt von diesem Zeitpunkt
an ab.
Ergebnisse
S e i t e | 33
Der erste Selenatansatz weist im gesamten Verlauf eine niedrigere Proteinkonzentration als
Ansatz 2 auf. Aufgrund der geringen Unterschiede und des gleichen Verlaufes der
Proteinkonzentration werden die folgenden Konzentrationen als Durchschnittswert aus
beiden Ansätzen angegeben. Der Anfangswert beider Selenatansätze von durchschnittlich
157 µg/ml liegt höher als bei der Kontrollkultur. Von da an nimmt die Konzentration bis
68,5 h einen Wert von durchschnittlich 762 µg/ml an. Die Gesamtzellproteinkonzentrationen der beiden 1 mM-Selenitansätze bleiben bis 74,5 h konstant mit einem
Wert von 167 µg/ml. Ab diesem Zeitpunkt weisen die Kulturen eine unterschiedliche
Proteinkonzentration auf. Der erste Selenitansatz zeigt eine erhöhte Gesamtzellproteinkonzentration (bei sechs Tagen eine Proteinkonzentration von 2348 µg/ml). Die
zweite 1 mM-Selenitkultur beginnt ab 140,5 h zu steigen bis auf eine Proteinkonzentration
von 967 µg/ml bis zum Beenden der Versuchsreihe.
Weitere Untersuchungen wurden durch Messen des pH-Wertes während des gesamten
Versuches durchgeführt. Dabei wurde ein Zusammenhang zwischen dem Zellwachstum
und dem pH-Wert sichtbar. Mit steigendem pH-Wert erhöhten sich die OD600nm-Werte und
die gemessene Gesamtzellproteinkonzentration.
Die Kontroll- und Selenatkultur begannen bei einem pH-Wert von 7,6 ± 0,2, welcher
innerhalb von 74,5 h auf 8,6 ± 0,2 anstieg. Bei den Selenitansätzen startete der pH-Wert
bei 7,8 und erreichte nach 52 h sein Maximum bei 8,7. Die gemessenen erhöhten
pH-Werte korrelieren mit den Werten der optischen Dichte und spiegeln somit ebenfalls
den Wachstumsverlauf der Kulturen wieder.
4.2.2
Messung der Selenit- und Selenatkonzentration
Der Einfluss des Wachstums von A. brasilense auf den Selenat- und Selenitgehalt in den
Zellkulturen wurde mit Hilfe der ICP-MS und HG-AAS bestimmt. Dabei kann mittels der
HG-AAS ausschließlich der Selenitgehalt bestimmt werden, weshalb keine Proben der
Selenatkultivierung gemessen wurden. Aus Abbildung 20 geht hervor, dass die
Konzentration an Selenit im Laufe der Kultivierung von A. brasilense abnimmt. Dabei
werden die Ergebnisse der HG-AAS und ICP-MS der Proben der Selenitansätze
gegenübergestellt.
Ergebnisse
S e i t e | 34
90
80
Konzentration [mg/l]
70
60
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Zeit (d)
Selenit (1) (HG-AAS)
Selenit (1) (ICP-MS)
Selenit (2) (HG-AAS)
Selenit (2) (ICP-MS)
Abbildung 20: Vergleich der Messungen der Selenitkonzentrationen der HG-AAS und der ICP-MS
Die HG-AAS-Ergebnisse verdeutlichen, dass am Anfang beim ersten Selenitansatz eine
Konzentration von 81,5 mg/l und beim zweiten eine von 80 mg/l im Überstand aufzufinden
ist. Dies entspricht in etwa 100 % der theoretisch eingesetzten Selenit-konzentration. Bei
beiden Selenitansätzen ist ab dem 3. Tag eine Abnahme der Selenitkonzentration zu
verzeichnen, sodass man nach sieben Tagen bei dem ersten Selenitansatz einen Wert 0,3
mg/l und bei dem zweiten Ansatz eine Endkonzentration von 4 mg/l erhält. Dies entspricht
einer Abnahme des Selenits im Überstand nahe 100 %.
Zur Überprüfung, dass Selenit von Bakterien umgesetzt wurde, wurde eine weitere
Kontrolle angesetzt, die ebenfalls eine Woche untersucht wurde. Diese Kontrolle (ohne
Zusatz von Bakterien), besteht lediglich aus Selenit und Medium. Während des
Messungszeitraumes wurde eine konstante Selenitkonzentration im Medium gemessen.
Somit ist eine Oxidation oder Reduktion des Selenits ausschließlich durch Bakterien
möglich.
Vergleicht man die Ergebnisse der Selenitansätze der HG-AAS mit denen der ICP-MS, so
kann festgestellt werden, dass die Werte fast identisch sind. Damit wird bestätigt, dass die
in der ICP-MS gemessene Selenkonzentration der theoretischen Selenitkonzentration
entspricht. Am Ende des 2. Tages und am Anfang des 3. Tages wurden bei der HG-AAS
Werte gemessen, die nicht zu erklären sind. Diese Fehlwerte können nun durch
Bestätigung der Selenkonzentration bei der ICP-MS vernachlässigt werden.
In Abbildung 21 ist die zeitliche Änderung der Gesamtselenkonzentration des Überstandes
der Bakterienkultur dargestellt.
Ergebnisse
S e i t e | 35
Die berechnete Selenkonzentration im Überstand am Anfang des Versuchsansatzes beträgt
79 mg/l. Die Werte der Selenatansätze liegen über diesem berechneten Wert und haben im
Durchschnitt eine Selenkonzentration von 85 mg/l. Diese Konzentration bleibt bei beiden
Selenatansätzen über den gesamten Messzeitraum relativ konstant. Lediglich bei den
Selenitansätzen sind Unterschiede in Bezug auf die berechnete Selenkonzentration und den
Selenatansätzen zu verzeichnen. Im Durchschnitt beginnen beide Ansätze mit einer
Konzentration von 77 mg/l, die drei Tage gehalten wird. Ab diesem Zeitpunkt beginnt die
Selenkonzentration abzunehmen. Dabei verläuft die Abnahme des Selens aus dem
Überstand beim 1. Selenitansatz, schneller als beim 2. Ansatz. Ein extremer Abfall der
Selenkonzentration wurde beim 2. Ansatz ab dem 6. Tag gemessen. Am Ende der
Messreihe wurde beim 1.Selenitansatz eine Abnahme des Selens von 97,4 % und beim
zweiten von 93,9 % verzeichnet.
100
90
Konzentration [mg/l]
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Zeit (d)
Selenitansatz (1)
Selenatansatz (1)
Selenitansatz (2)
Selenatansatz (2)
Konzentration 1 mM
Abbildung 21: Zeitlicher Verlauf der Selenkonzentration im Selenit- und Selenatansatz
Aufgrund dessen, dass bei der Messung mittels HG-AAS ausschließlich die
Selenitkonzentration und bei der ICP-MS der Gesamtselengehalt bestimmt wurde, kann
daraus die Se(0)-Konzentration in Form von Nanopartikeln berechnet werden. Dieser
Zusammenhang wird in Abbildung 22 dargestellt.
Ergebnisse
S e i t e | 36
In der Darstellung wurde der Mittelwert aus beiden Selenat- und der Selenitansätzen der
ICP-MS-Messung, aufgrund ihres ähnlichen Verlaufes, verwendet.
Nach ungefähr drei Tagen, beginnen die Bakterien das Selenit aus dem Überstand zu
reduzieren und die Nanopartikel zu produzieren. Dies stimmt sehr gut mit den
lichtmikroskopischen Beobachtung (Kapitel 4.2) überein. Diese Nanopartikel bestehen
vermutlich aus elementarem Selen. Nach etwa sieben Tagen entstand ein prozentualer
Prozentualer Anteil des Se-Gehalts
(%)
Anteil von 95,6 % der Se(0)-Nanopartikel durch Reduktion des Selenits aus dem Medium.
120
100
80
60
40
20
0
0
1
-20
MW Selenat (ICP-MS)
2
3
4
5
6
7
Zeit (d)
MW Selenit (ICP-MS)
Nanopartikel
Abbildung 22: Zeitlicher Verlauf der Selenat- und Selenitintensität und den daraus resultierenden
Selennanopartikelanteil
4.2.3
Einfluss der Konzentration auf die mikrobielle Reduktion von Selenit
und das Wachstum von A. brasilense
Wie in Kapitel 4.2 beschrieben, besitzt das Bakterium A. brasilense die Fähigkeit Selenit
zu elementaren Se(0) zu reduzieren. Da in bisherigen Versuchen ausschließlich mit
1 mM-Selenitansätzen gearbeitet wurde, wurde in einem weiteren Versuch die Toleranz
des Bakteriums gegenüber unterschiedlich hohen Selenitkonzentrationen (1 mM, 2,5 mM
und 5 mM) untersucht. In Abbildung 23 sind die Kulturen mit unterschiedlichen
Selenitkonzentrationen nach sieben Tagen dargestellt. Das Wachstumsverhalten wurde
mittels OD600nm und der Gesamtzellproteinkonzentration (OD562nm) bestimmt.
Ergebnisse
S e i t e | 37
Mögliche Änderungen der Selenkonzentrationen wurden durch die ICP-MS und HG-AAS
untersucht.
Kontrolle
1 mM-Selenitsätze
2,5 mM-Selenitansätze
5 mM-Selenitansätze
Abbildung 23: Farbentwicklung nach sieben Tagen bei unterschiedlichen Selenitkonzentrationen
4.2.4
Wachstumsverlauf des Bakteriums A. brasilense bei unterschiedlichen
Selenitkonzentrationen
Das
Wachstum
der
Bakterien
in
den
unterschiedlich
hoch
konzentrierten
Selenitkonzentrationen (1 mM, 2,5 mM und 5 mM) wurde mittels Photometer bei einer
Wellenlänge 600 nm verfolgt. Die zeitlich aufgenommenen Wachstumskurven sind in
Abbildung 24 dargestellt.
Logarithmischer OD600nm-Wert
20
1
0
0
2
Kontrolle
4
1 mM MW
Zeit (d)
2,5 mM MW
6
8
5 mM (Ansatz 1)
10
5 mM (Ansatz 2)
Abbildung 24: Wachstumskurven der Kontrollkultur und den Ansätzen mit unterschiedlichen
Selenitkonzentrationen
Die Kontrollkultur (Bakterienkultur ohne Selenit) zeigt das bekannte Wachstumsverhalten.
Am 5. Tag wird bei der Kontrolle ein OD600-Maximum von 5 gemessen, welches bis zum
Beenden des Versuches konstant bleibt.
Ergebnisse
S e i t e | 38
Da die beiden Ansätze der 1 mM- und 2,5 mM-Selenitkonzentration einen ähnlichen
Verlauf aufwiesen, wurden diese Wachstumskurven gemittelt. Bei den beiden
5 mM-Selenitansätzen gab es große Unterschiede bezüglich des Wachstumsverhaltens,
weshalb auf eine Mittelung der Werte verzichtet wird. Dies gilt ebenfalls für die Kurven
zur Bestimmung der Gesamtzellproteinkonzentration in Abhängigkeit von der Zeit.
Im Gegensatz zu der Kontrollkultur gibt es bei allen Selenitansätzen eine lag-Phase von
drei Tagen. Ab dem 3. Tag beginnen die Bakterien, mit Ausnahme des zweiten
5 mM-Selenitansatzes, mit dem Wachstum.
Beim Betrachten der Maxima der Kurven (Tabelle 3) wurde ermittelt, dass im
Durchschnitt die Bakterien im 1 mM-Ansatz schneller wachsen und zwischen dem 6. und
7. Tag ein Maximum von durchschnittlich 3,1 (OD600nm) erreichen. Mit steigender
Selenitkonzentration wird das Maximum zu einem späteren Zeitpunkt mit einem
geringeren OD-Wert erreicht. So wurde bei einer Konzentration von 2,5 mM bei 10 Tagen
ein durchschnittlicher OD-Wert von 2,9 und bei der 5 mM-Selenitkonzentration ebenfalls
bei 10 Tagen eine Optische Dichte von 1,10.
Tabelle 3: Zeitpunkt und OD-Wert der Maxima der unterschiedlichen Selenkonzentrationen
Selenitkonzentration
Kontrolle
1 mM
2,5 mM
5 mM
Zeit
Ansatz 1
(d)
Zeit
Ansatz 2
(d)
4,91
6,17
9,97
9,97
6,91
9,97
9,97
MW
der Zeit
(d)
4,9
6,5
10
10
ODODWert
Wert
Ansatz
Ansatz
1
2
3,30
4,08
2,07
2,70
3,17
2,06
0,14
MW
ODWert
3,3
3,1
2,9
1,1
In Abbildung 25 wurden der zeitliche Verlauf der Gesamtzellproteinkonzentration bei
unterschiedlich hohen Selenitkonzentrationen gegenübergestellt. Die Maxima der
verschiedenen Ansätze und deren Proteinkonzentration wurden in Tabelle 4 angegeben.
Ergebnisse
S e i t e | 39
2400
Konzentration [µg/ml]
1900
1400
900
400
-100
0
2
Kontrolle
4
1 mM-Selenitansatz
Zeit (d)
2,5 mM-Selenitansatz
6
8
10
5 mM Selenit (Ansatz 1)
5 mM Selenit (Ansatz 2)
Abbildung 25: Zeitlicher Verlauf der Gesamtzellproteinkonzentration der Kontrollkultur und den
Ansätzen mit unterschiedlichen Selenitkonzentrationen
Tabelle 4: Zeitpunkt und Proteinkonzentration der Maxima der unterschiedlichen
Selenkonzentrationen
Zeit Ansatz
1 (d)
4,91
Kontrolle
1 mM
2,5 mM
5 mM
Zeit
Ansatz 2
(d)
6,91
9,97
9,97
6,91
9,97
9,97
MW der
Zeit (d)
4,9
6,9
10
10
c
Ansatz 1
[µg/ml]
c
Ansatz 2
[µg/ml]
1030,4
1775,6
918,0
0
706,3
1082,5
704,4
MW
c
[µg/ml]
1030
1241
1000
321
Die Kontrollkultur startet mit einer Gesamtzellproteinkonzentration von 31 µg/ml und
erhöht sich kontinuierlich bis diese am 5. Tag ein Maximum bei 1030 µg/ml erreicht
Danach nimmt die Konzentration bis auf einen Wert von 788 g/ml am 10. Tag ab.
Die 1 mM-Selenitkulturen beginnen am 5. Tag mit der Erhöhung der Proteinkonzentration,
die bis zum 7. Tag ansteigt. Hierbei wird eine Gesamtzellproteinkonzentration von
1241 µg/ml erreicht. Bei den 2,5 mM-Ansätzen ist die lag-Phase nach ca. 3-4 Tagen
beendet. Von da an steigt die Proteinkonzentration bis zum 10. Tag auf einen Wert von
1000 g/ml an. Die Verläufe der Gesamtzellproteinkonzentrationen der 5 mM-Selenitkulturen unterscheiden sich wesentlich im Verlauf. Während der eine 5 mM-Ansatz vom
3. bis zum 7. Tag ansteigt und dort sein Maximum erreicht, ist bei dem anderen
5 mM-Ansatz keine Zunahme der Proteinkonzentration zuerkennen.
Ergebnisse
S e i t e | 40
Daraus ist zu schlussfolgern, dass keine wachstumsfähigen Bakterien mehr im Medium
enthalten sind. Aufgrund dessen wurde für weitere Untersuchungen nur mit dem zweiten
5 mM-Selenitansatz gearbeitet.
4.2.5
Messung der unterschiedlichen Selenitkonzentrationen
Um die Selenitkonzentrationen während der gesamten Kultivierung analysieren zu können
wurde zum Einen der Selenitgehalt mittels HG-AAS und zum Anderen der Gesamtselengehalt mit Hilfe der ICP-MS gemessen. Wie in Kapitel 4.2.2 gezeigt werden konnte,
entspricht der gemessene Gesamtselengehalt dem der mittels HG-AAS ermittelte
Selenitgehalt. Daher wird auf die Darstellung der HG-AAS-Ergebnisse verzichtet.
Tabelle 5 zeigt die mittels ICP-MS gemessenen Anfangskonzentrationen der unterschiedlichen Selenitkonzentrationen im Vergleich zu den theoretischen Selenitkonzentrationen. Diese stimmen bei allen Selenitkonzentrationen annähernd überein. In
Abbildung 26 sind die Messergebnisse der ICP-MS dargestellt.
Tabelle 5: Vergleich der berechneten und mittels ICP-MS gemessenen Selenitanfangskonzentrationen
Berechnete Konzentration [mg/l] Gemessene Anfangskonzentration [mg/l]
1 mM
79,0
70,8
2,5 mM
197,4
199,5
5 mM
394,8
404,0
450
Selen-Konzentration [mg/l]
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
2
4
-50
1 mM
Konzentration 1 mM
6
Zeit (d)
2,5 mM
Konzentration 2,5 mM
8
5 mM
Konzentration 5 mM
Abbildung 26: Zeitlicher Verlauf der Gesamtselenkonzentration der unterschiedlichen
Selenitkonzentrationen
10
Ergebnisse
S e i t e | 41
Bei dem 1 mM-Selenitansatz wurde am Anfang ein Durchschnittswert von 71 mg/l
ermittelt. Diese Konzentration bleibt bei beiden Ansätzen bis zum 3. Tag konstant.
Zwischen dem 3. und 5. Tag beginnt die Abnahme der Gesamtselenkonzentration, welche
bis zum 7. Tag auf einen durchschnittlichen Wert von 34 mg/l sinkt. Dies entspricht einer
Verringerung von 52 %. Von diesem Zeitpunkt an bleibt die Konzentration konstant. Bei
den 2,5 mM-Selenitansätzen bleiben die Konzentration bei beiden Ansätzen bis zum 7. Tag
konstant. Von da an sinkt die Gesamtselenkonzentration und verringert die Konzentration
um durchschnittlich 23,4 %. Bei dem 5 mM-Selenitansatz wurde ein Anfangswert von
404 mg/l gemessen, welcher über den gesamten Messungszeitraum relativ konstant blieb.
Die Ergebnisse zeigen, dass mit steigender Selenitkonzentration die Reduzierung des
Selenits aus dem Medium verzögert wird und ein vollständiger Umsatz im untersuchten
Zeitraum somit nicht beobachtet werden konnte.
4.3
CHARAKTERISIERUNG DER NANOPARTIKEL
4.3.1
Farbgebung Nanopartikelsuspension nach der Isolierung
Nach der Isolierung der Nanopartikel entsteht nach Zugabe von VE-Wasser eine kaminrote
Suspension (Abbildung 27). Wenn es große Unterschiede im Wachstumsverhalten und
dem damit verbundenen Fortschritt der Selenitreduktion gab, wie zum Beispiel beim ersten
und zweiten Ansatz der 1 mM-Selenitkultur, spiegelte sich das auch in den isolierten
Suspensionen wieder.
Die Ergebnisse der HG-AAS sowie der ICP-MS lieferten Aussagen darüber, dass bei dem
ersten 1 mM-Selenitansatz eine schnellere Abnahme des Selenits aus dem Überstand und
damit eine erhöhte Bildung von Nanopartikel zu beobachten war (Kapitel 4.2.2). Dies
wurde auch nach der Isolierung sichtbar. Der zweite 1 mM-Selenitansatz zeigt gegenüber
dem 2. Ansatz eine schwach rote Farbe, was auf eine geringe Anzahl an Nanopartikel
zurückzuführen ist.
Die Farbgebung und die Messwerte bei den 2,5 mM-Selenitansätzen (Abbildung 29)
ähnelten sich sehr mit dem ersten 1 mM-Selenitansatz.
Ergebnisse
S e i t e | 42
Ein ähnlicher Farbton wie bei dem 5 mM-Ansatz (Abbildung 30) ist bei dem 2. Ansatz der
1 mM-Selenitkultur (Abbildung 28) zu sehen, welcher ebenfalls aufgrund der Vorversuche
zwar ein Bakterienwachstum und eine Zunahme des Proteingehaltes aufwies, jedoch laut
HG-AAS und ICP-MS der Selengehalt nicht signifikant abnahm und nur eine geringe
Anzahl an Nanopartikeln produziert wurde.
Abbildung 27: Suspension der isolierten
Nanopartikel (1 mM-Selenitansatz (Ansatz 1))
Abbildung 28: Suspension der isolierten
Nanopartikel (1 mM-Selenitansatz (Ansatz 2))
Abbildung 29: Suspension der isolierten
Nanopartikel (2,5 mM-Selenitansatz)
Abbildung 30: Suspension der isolierten
Nanopartikel (5 mM-Selenitansatz)
Zum Vergleich der mikrobiell erzeugten Nanopartikel wurde auch chemisch reduziertes
Se(0) hergestellt. Die dafür eingesetzte Selenitlösung zeigt sofort nach Zugabe des
Reduktionsmittels Hydroxylamin eine Rotfärbung und nimmt nach circa fünf Minuten eine
intensivere Rotfärbung an. Nach circa 20 Minuten fällt ein roter Niederschlag aus, es
bilden sich rote Flocken am Boden des Reaktionsgefäßes und der Überstand wird klar
(Abbildung 31). Diese instabile Lösung ist ein weiterer Unterschied zu den durch
Bakterien reduzierten Nanopartikeln, die eine stabile Suspension mit den enthaltenen
Nanopartikeln aufweisen. Bei der Selenatlösung sind auch nach über 100 Tagen keine
farblichen Änderungen zu erkennen. Somit fand keine Reduktion zu Selenit oder
elementaren Selen unter den gewählten Versuchsbedingungen statt (Abbildung 32).
Ergebnisse
S e i t e | 43
Abbildung 31: Chemischen Reduktion von
Selenit (Bildung von rotem Niederschlag)
Abbildung 32: Chemische Reduktion von
Selenat (kein Niederschlag)
Nach einigen Monaten schlug der Niederschlag von rot zu grau um, welches mit der
Oxidation des Selens zu begründen ist. Des Weiteren waren kleinere Partikel zu erkennen,
als bei dem Niederschlag der frisch hergestellten chemischen Reduktion. Mittels UV/Vis
wurde zum Einen der Unterschied zwischen einer neuen chemischen Reduktion und einer
älteren dargestellt und zum Anderen wurde die mikrobielle mit der chemischen Reduktion
verglichen.
Die UV/Vis-Spektren sind in der Abbildung 33 dargestellt. Hierbei ist deutlich bei beiden
Proben ein Peak bei 567 nm zu erkennen, der jedoch bei der neuen chemischen Reduktion
stärker ausgeprägt ist.
neu
alt
Absorption
0,05
0,00
500
550
600
650
Wellenlänge (nm)
Abbildung 33: UV/Vis Spektren des chemisch reduzierten Selenits
Ergebnisse
4.3.2
S e i t e | 44
Elektronenmikroskopie in Kombination mit der energiedispersiven
Röntgenspektroskopie (EDX)
Die bei der Lichtmikroskopie wahrgenommenen Nanopartikel der Selenitkultur werden
mittels Elektronenmikroskopie erneut untersucht. Zum Einen wird dabei REM verwendet,
um die dreidimensionale Struktur der Bakterien und der Nanopartikel darzustellen. Mittels
TEM-Aufnahmen konnten ebenfalls Aussagen über Form, Größe und Lokalisation der
Nanopartikel getroffen werden. Mittels EDX konnte zusätzlich ermittelt werden, aus
welchen Elementen die Nanopartikel bestehen.
Die Bilder der Rasterelektronenmikroskopie zeigen Bakterien mit Nanopartikeln der
Selenitansätze, die schon bei der Lichtmikroskopie beobachtet wurden (Abbildung 34 und
Abbildung 35). Zur besseren Darstellung der Bakterien wurden teilweise einige Proben mit
Glutaraldehyd fixiert (Abbildung 36).
Abbildung 34: A. brasilense mit Nanopartikeln
aus dem Selenitansatz (Methode ohne
Fixierung)
Abbildung 35: Nanopartikel aus dem
Selenitansatz (Methode ohne Fixierung)
Bei der Untersuchung der Nanopartikel der Selenitkultur mittels energiedispersiver
Röntgenspektroskopie wurde bestätigt, dass die Partikel aus Selen bestehen. Der
Hauptpeak im EDX-Spektrum (Abbildung 37), bei einer Energie von 1,4 keV, ist dem
Selen zuzuordnen. Der Peak bei 0,5 keV zeigt das Vorhandensein von Sauerstoff und der
Peak bei 1,75 keV entspricht Silizium.
Ergebnisse
S e i t e | 45
Diese beiden Stoffe wurden detektiert, da die Proben auf einem Plättchen aus Siliziumdioxid fixiert wurden. Des Weiteren gibt es ein Schwefelsignal bei einer Energie von
2,3 keV.
Energie (keV)
Abbildung 36: A. brasilense mit Nanopartikeln
aus dem Selenitansatz (Fixierung mit
Glutaraldehyd)
Abbildung 37: EDX-Spektrum der
Nanopartikel
Vergleicht man die REM-Bilder der Selenitansätze mit denen der Selenatansätze, so wird
sichtbar, dass in den Selenatansätzen ausschließlich die Bakterien und keine Nanopartikel
(Abbildung 38) zu erkennen sind. Durch das EDX-Spektrum (Abbildung 39) wird
bestätigt, dass die Ablagerungen neben den Bakterienzellen im Selenatansatz kein
partikuläres Selen enthalten. Das Auftreten von Sauerstoff und Silizium ist durch den
Träger zu begründen.
Ergebnisse
S e i t e | 46
Energie (keV)
Abbildung 38: Bakterien ohne Nanopartikel
aus dem Selenatansatz (Fixierung mit
Glutaraldehyd)
Abbildung 39: EDX-Spektrum aus dem
Selenatansatz
Vergleicht man die beiden angewendeten Methoden untereinander (Abbildung 34 und
Abbildung 36), ist zu erkennen, dass wenn die Bakterien mit Glutaraldehyd fixiert wurden,
es zu einer besseren Visualisierung führt. Wird der Fokus jedoch auf die Nanopartikel
gelegt, dann empfiehlt sich die Methode ohne Glutaraldehyd, da hierbei die Nanopartikel
besser dargestellt werden können.
Auf dem TEM-Bild (Abbildung 40) sind sphärische Nanopartikel mit einem Durchmesser
von 400 nm zu erkennen. Der von den Nanopartikeln umgebene graue „Schatten“ und die
Nanopartikel wurden ebenfalls durch EDX analysiert.
Ergebnisse
S e i t e | 47
Abbildung 40: TEM-Aufnahme der Nanopartikel
Dabei wurde bestätigt (Abbildung 41), dass die Nanopartikel größtenteils aus Selen (Peak
bei 1,4 keV, 11,5 keV und 12,5 keV) und Schwefel (Peak bei 2,3 keV) bestehen. Neben
Selen und Schwefel wurden mittels EDX auch Kohlenstoff, Sauerstoff, Silizium und
Kupfer detektiert, welche durch die Probenpräparation auf einem Kupfernetzchen mit
einem Kohle/Formvarfilm erklärbar sind. Die Selen-Peaks wurden mit Hilfe der Literatur
bestätigt (Oremland et al. 2004).
Se
Se
Abbildung 41: EDX-Spektrum der Nanopartikel
Bei der Untersuchung des grauen „Schleiers“ mittels TEM-EDX (Abbildung 42) wurden
Stoffe wie Silizium, Sauerstoff, Chlor, Natrium und Magnesium identifiziert. Diese Stoffe
sind Rückstände aus der Isolierung.
Ergebnisse
S e i t e | 48
Abbildung 42: EDX-Spektrum der von Nanopartikel umgebenden Substanz
4.3.3
Bestimmung der Oberflächenladung durch Zetapotentialmessungen
Durch Messen des Zetapotentials in Abhängigkeit von dem pH-Wert in dem Bereich
1 bis 7 konnten die Oberflächenladung und der isoelektrische Punkt der Selennanopartikeln ermittelt werden.
In Abbildung 43 werden vier Messungen dargestellt, die von zwei unterschiedlichen
Ansätzen stammen. Zusätzlich wurde aus allen Messungen der Mittelwert gebildet. Diese
Kurve ist ebenfalls mit der jeweiligen Standardabweichung (Std.Abw.) im Diagramm
dargestellt.
pH-Wert
0
-2 0
1
2
3
4
5
6
7
8
Zeta-Potential (mV)
-4
-6
-8
-10
-12
-14
-16
-18
-20
Ansatz 2 vom 1. Exp. (1:30)
Ansatz 2 vom 1. Exp. (1:100)
MW Zeta-Potential
Ansatz 1 vom 2. Exp (1:30)
Ansatz 2 vom 2. Exp (1:100)
Abbildung 43: Zetapotentiale aller Nanopartikelsuspensionen der Selenitansätze mit Mittelwert aller
Zetapotentialmessungen mit Standardabweichung
Ergebnisse
S e i t e | 49
Alle Kurven besitzen in dem untersuchten pH-Wertbereich ein negatives Zetapotential. Bei
pH 1 liegt das Zetapotential in dem Bereich von -0,6 bis -6,3 mV. Mit steigendem pH-Wert
verschiebt sich das Oberflächenpotential immer mehr ins Negative. So wurde bei einem
pH-Wert von 7 ein Zetapotential in dem Bereich von -15 bis -18 mV gemessen. Da bei
keinem pH-Wert ein positives Zetapotential auftrat, konnte kein isoelektrischer Punkt mit
einem Zetapotential von Null bestimmt werden.
4.3.4
Dynamische Lichtstreuung
Durch das Messen der dynamischen Lichtstreuung der Nanopartikelsuspension wurden der
Durchmesser der Selennanopartikel und die dazugehörige Partikelgrößenverteilung
ermittelt. Das Auftragen der Partikelgröße nach ihrem prozentualen Anteil ist in der
Abbildung 44 dargestellt.
Dabei wurden zwei 1 mM-Selenitkulturen verwendet, bei dem sich die Ansätze farblich
unterschieden, um zu untersuchen, inwiefern die Farbänderung in Beziehung zu der
Partikelgröße steht.
20
18
16
Ansatz 1
Ansatz 2
Intensität (%)
14
12
10
8
6
4
2
0
200
300
400
500
600
700
Log. Partikelgrößenverteilung (d.nm)
Abbildung 44: Partikelgrößenverteilung der 1 mM-Selenitansätze
800
Ergebnisse
S e i t e | 50
Die orangefarbene Kultur besitzt Nanopartikel mit einem hydrodynamischen Durchmesser
in dem Bereich von 220 nm bis 825 nm. Der größte prozentuale Anteil ist bei einer
Partikelgröße von 396 nm mit 18,1 % zu finden. Bei der rot-orangenen Kultur ist das
Maximum der Partikelgröße ebenfalls bei 396 nm mit einer Intensität von 19,4 %. Die
Partikelgrößenverteilung dieses Ansatzes liegt im Bereich von 220 nm und 712 nm.
Die berechneten Durchschnittswerte der Partikelgrößen der beiden Ansätze sind in der
Tabelle 6 zusammengefasst.
Tabelle 6: Durchschnittliche Partikeldurchmesser der verschiedenen Ansätze
Selenitansatz
Durchschnittlicher Durchmesser (nm)
1
443
2
407
Der orangene Ansatz besitzt im Durchschnitt größere Partikel mit einem Durchmesser von
443 nm. Der rot-orangene Ansatz hat mit 407 nm einen geringeren durchschnittlichen
Partikeldurchmesser.
Zwar befinden sich im 2. Ansatz mehr kleinere Partikel, jedoch sind die Unterschiede zu
gering um die Aussage zu bestätigen, dass die Partikelgrößenverteilung mit der Farbgebung der Kulturen zusammenhängt.
Neben der Partikelgrößenverteilung lässt sich aus den Messwerten der DLS zusätzlich eine
Autokorrelationsfunktion (Abbildung 45) aus den gemessenen Werten darstellen.
Ergebnisse
S e i t e | 51
1,0
Korrelationskoeffizient
Ansatz 1
Ansatz 2
0,5
0,0
0,1
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
Verzögerungszeit [µs]
Abbildung 45: Autokorrelationsfunktion
Mit Hilfe der Autokorrelationsfunktion können Probleme, beispielsweise zu kleine oder zu
große Partikel oder eine kontaminierte Probe identifiziert und interpretiert werden. Der
Verlauf der Funktion der beiden Ansätze zeigt eine typische Kurve, die repräsentativ für
große Partikel ist. Diese liegen mit einem Durchmesser von durchschnittlich 420 nm noch
im messbaren Bereich zwischen 3 nm und 3 µm. Somit stellt diese Größe kein Problem für
die Messung dar.
Da verschiedene Ansätze mit unterschiedlichen Selenitkonzentrationen verwendet wurden
sind die Ergebnisse der 1 mM-Selenitkulturen in Abbildung 46 mit denen der
2,5 mM-Kulturen in Abbildung 47 zum Vergleich gegenübergestellt. Dafür wurde aus der
Partikelgrößenverteilung der Durchschnittswert der Partikelgröße der verschiedenen
Ansätze berechnet.
Durchschnittliche Partikelgröße (d.nm)
Ergebnisse
S e i t e | 52
1
2
3
4
5
600
Exp. 1; 1 mM
Exp. 2; 1 mM (1)
Exp. 2; 1 mM (2)
Exp. 3; 1 mM (1)
Exp. 3; 1 mM (2)
500
MW (443,2 d.nm)
400
300
200
100
0
1
2
3
4
5
Proben
Durchschnittliche Partikelgröße (d.nm)
Abbildung 46: Durchschnittliche Partikelgrößen der 1 mM-Selenitansätze
1
2
3
4
400
Exp. 3; 2,5 mM
Exp. 4; 2,5 mM (1)
Exp. 4; 2,5 mM (2)
Exp. 4; 2,5 mM (3)
MW (341,7 d.nm)
300
200
100
0
1
2
3
4
Proben
Abbildung 47: Durchschnittliche Partikelgrößen der 2,5 mM-Selenitansätze
Beim Vergleich der beiden Diagramme wird ersichtlich, dass bei einer höheren
Selenitkonzentration eine geringere Partikelgröße mit einem Durchschnitt von 341 nm zu
erkennen ist. Im Gegensatz dazu besitzen die 1 mM-Selenitkulturen einen durchschnittlichen Durchmesser von 443 nm.
Inwiefern die Höhe der Selenitkonzentration (Mittelwert beider 1 mM-Ansätze, 2,5 mMund 5 mM-Ansatz) in der Kultur mit der Partikelgröße der gebildeten Nanopartikel
zusammenhängt, wurde in Abbildung 48 dargestellt.
Ergebnisse
S e i t e | 53
Dabei wurde festgestellt, dass die 2,5 mM-Selenitkultur eine geringe Partikelgrößenverteilung besitzt als die anderen Konzentrationen. Die 2,5 mM-Selenitkultur weist die
meisten Nanopartikel mit der Größe 396 nm mit einem prozentualen Anteil von 30,5 %
auf. Die höchste Partikelgröße in einer Größenklasse von 459 nm mit einer Intensität von
22 % zeigt hingegen die 1 mM-Selenitkultur. Die Nanopartikel der 5 mM-Selenitkultur
besitzen den größten prozentualen Anteil mit 18 % bei einem Partikeldurchmesser von
396 nm.
1 mM
2,5 mM
5 mM
30
Intensität (%)
25
20
15
10
5
0
200
400
600
800
1000
Log. Partikelgrößenverteilung (d.nm)
Abbildung 48: Partikelgrößenverteilung der Nanopartikel bei unterschiedlichen
Selenitkonzentrationen
Werden alle mit dynamischer Lichtstreuung gemessenen Partikelgrößen verglichen
(Abbildung 49), so kommt man zu dem Ergebnis, dass die Nanopartikel eine Größe von
durchschnittlich 443 nm aufweisen, welche in dem Bereich von 301 nm bis 603 nm
variieren.
Ergebnisse
S e i t e | 54
Durchschnittliche Partikelgröße (d.nm)
600
500
MW (403,1 d.nm)
400
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Exp. 1; 1 mM
Exp. 2; 1 mM (1)
Exp. 2; 1 mM (2)
Exp. 3; 1 mM (1)
Exp. 3; 1 mM (2)
Exp. 3; 2,5 mM
Exp. 3; 5 mM (2)
Exp. 4; 2,5 mM (1)
Exp. 4; 2,5 mM (2)
Exp. 4; 2,5 mM (3)
300
200
100
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Proben
Abbildung 49: Darstellung der durchschnittlichen Partikelgröße aller 1 mM-Selenitkulturen und
Ermittlung des durchschnittlichen Durchmessers
4.3.5
Raman-Spektroskopie
Zur weiteren Charakterisierung der mikrobiell gebildeten Selennanopartikel wurden
Ramanspektren im Wellenzahlenbereich von 150 bis 450 cm-1 aufgenommen. In
Abbildung 50 werden die gemessen Spektren zweier Nanopartikelsuspensionen aus den
2,5 mM-Selenitansätzen verglichen. Dabei zeigen beide Proben ein identisches Spektrum,
womit die Reproduzierbarkeit bewiesen wird. Bei einer Raman-Verschiebung von
257 cm-1 besitzen beide Proben den ersten Peak. Dieser Peak wird, laut Literatur, einer
Selenkette oder einem Se8-Ring zugeordnet (Poborchii et al. 1997). Ein zweiter Peak wird
bei beiden Ansätzen bei 355 cm-1 sichtbar und entspricht laut Schmidt und Wilhelm (1970)
einer S-Se-Valenzschwingung.
Ergebnisse
S e i t e | 55
Probe 1
Probe 2
250
Raman-Intensität
200
150
100
50
0
200
250
300
350
400
450
-1
Raman-Verschiebung (cm )
Abbildung 50: Raman-Spektrum der Nanopartikelsuspension
4.3.6
Thermostabilitätstest
Bei der Charakterisierung der Nanopartikel wurde die Stabilität gegenüber höheren
Temperaturen untersucht. Dabei wurden die isolierten Nanopartikel nach 24-stündiger
Erwärmung im Temperaturbereich von 35 °C bis 250 °C mittels UV/Vis und dynamischer
Lichtstreuung analysiert.
In der Abbildung 51 wird die farbliche Änderung der Nanopartikelsuspensionen nach der
Erwärmung bei den jeweiligen Temperaturen deutlich. Dabei wird sichtbar, dass die bei
35 °C-inkubierte Probe ein intensiveres rot besitzt als die Ausgangslösung. Nachdem die
Probe bei 50 °C erhitzt wurde, ist zu beobachten, dass die Partikel, nicht wie gewohnt
homogen verteilt vorliegen, sondern sich Aggregate gebildet haben, die aufgrund des
Gewichtes schneller sedimentieren. Die 100 °C-Probe hat eine blass-rote Färbung, jedoch
ist am Boden feines rötliches Sediment erkennbar. Bei dieser Probe konnte außerdem im
Teflonbecher des Stahlautoklaven ein rotes Sediment beobachtet werden. Dies war bei den
anderen Temperaturen nicht der Fall. Die 250 °C-Probe stellt eine klare farblose
Flüssigkeit dar, die optisch keine Nanopartikel mehr enthält.
Ergebnisse
S e i t e | 56
Ausgangslösung
35 °C
50 °C
100 °C
250 °C
Abbildung 51: Aufnahme der Ausgangslösung und der bei unterschiedlich hohen Temperaturen
inkubierten Nanopartikelsuspension
4.3.6.1 UV/Vis-Spektroskopie
Zur weiteren Charakterisierung der Nanopartikelsuspensionen nach der Inkubation bei den
unterschiedlichen Temperaturen (35 °C, 50 °C, 100 °C, 250 °C) wurden Absorptionsspektren im Wellenlängenbereich von 200 bis 1200 nm aufgenommen. Durch Auftragen
der Absorption über die Wellenlänge entsteht das Absorptionsspektrum (Abbildung 52) der
Nanopartikelsuspension der Ausgangslösung vor und nach der Inkubation bei unterschiedlichen Temperaturen (35 °C, 50 °C, 100 °C, 250 °C).
Ergebnisse
S e i t e | 57
Ausgangslösung
35 °C
50 °C
100 °C
250 °C
1,0
0,8
Absorption
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
200
400
600
800
1000
1200
Wellenlänge (nm)
Abbildung 52: UV/Vis-Spektren der Nanopartikelsuspension bei unterschiedlichen
Inkubationstemperaturen
Die Absorptionsspektren der Partikelsuspensionen der Ausgangslösung und der bei 35 °C
inkubierten Probe zeigen keine signifikanten Unterschiede. Beide Spektren besitzen einen
Peak bei 600 nm und eine Schulter bei 780 nm. Diese Peaks können dem Element Selen
zugeordnet werden (Oremland et al. 2004). Bei der 50 °C-inkubierten Probe kommt es zu
einer Veränderung der Verhältnisse, wobei der Hauptpeak und die Schulter nun eine
Wellenlänge zwischen 600 nm und 800 nm aufweisen.
Die Lösung bei 100 °C und 250 °C weisen kaum eine Absorption auf. Ein vergrößerter
Ausschnitt der zweier UV/Vis-Spektren ist in Abbildung 53 dargestellt.
Ergebnisse
S e i t e | 58
100 °C
250 °C
Absorption
0,03
0,00
-0,03
600
800
Wellenlänge (nm)
Abbildung 53: UV/Vis-Spektren der Nanopartikelsuspension bei einer Inkubation von 100 °C und
250 °C
Hierbei ist zu sehen, dass bei der 100 °C Probe eine geringe Absorption von 0,02 bei
620 nm zu erkennen ist. Dies bestätigt die Beobachtung, dass bei dieser Probe nach der
Inkubation rotes Sediment im Teflonbecher aufzufinden und nach dem Resuspendieren
eine schwach rote Lösung zu erkennen war. Bei der 250 °C Probe wurde hingegen eine
klare Lösung wahrgenommen.
4.3.6.2 Dynamische Lichtstreuung
Mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung wurde nach der Inkubation der Nanopartikelsuspension der Einfluss von unterschiedlichen Temperaturen auf die Partikelgrößenverteilung (Abbildung 54) untersucht.
Ergebnisse
S e i t e | 59
Ausgangslösung
35 °C
50 °C
100 °C
35
30
Intensität (%)
25
20
15
10
5
0
1000
Log. Partikelgrößenverteilung (nm)
Abbildung 54: Partikelgrößenverteilung der Ausgangslösung und der Proben, die bei 35 °C, 50 °C und
100 °C inkubiert wurden
Mittels dieser Ergebnisse wurde aus der Partikelgrößenverteilung der jeweiligen Probe ein
Partikelgrößendurchschnitt bestimmt (Tabelle 7).
Tabelle 7: Inkubationstemperaturen mit dazugehörigem durchschnittlich gemessenem Durchmesser
Inkubationstemperatur
Durchmesser (nm)
Ausgangslösung (RT)
301,2
35 °C
370,1
50 °C
2329,5
100 °C
380,7
250 °C
-
Ergebnisse
S e i t e | 60
Dabei ist gut zu erkennen, dass die Ausgangslösung und die Proben, die bei 35 °C und bei
100 °C inkubiert wurden, einen ähnlichen Partikeldurchmesser besitzen. Bei der
250 °C-Probe konnte keine Partikelgrößenverteilung bestimmt werden. Dies war zu
vermuten, da die Nanopartikelsuspension nach der Inkubation keine rötliche Färbung mehr
besaßen, sondern eine farblose Flüssigkeit im Teflonbecher des Stahlautoklaven zurückblieb. Nach einer Wärmebehandlung bei 50 °C wiesen die Partikel mit 2329 nm einen fast
8-mal größeren Durchmesser als die Partikel in der Ausgangslösung auf.
4.3.6.3 Bestimmung des TOC-Gehaltes
Die Bestimmung des Kohlenstoffgehalts soll Aufschluss über das Vorhandensein
organischer Substanzen liefern. Die Ergebnisse sind in der Abbildung 55 grafisch
dargestellt.
TOC-Gehalt
30
28,4
25
15
Ausgangslösung
TOC [mg/l]
20
10
5
10,2
3,1
2,5
1,9
0
0
50
100
150
200
250
Temperatur (°C)
Abbildung 55: Grafische Darstellung des TOC-Gehaltes der Nanopartikelsuspension vor und nach der
Inkubation bei unterschiedlichen Temperaturen
Zunächst ist ein eindeutiger Trend, angefangen bei der Ausgangslösung (RT) bis zu den
höher temperierten Nanopartikelsuspensionen, zu erkennen. Die Ausgangslösung besitzt
einen Kohlenstoffgehalt von 1,9 mg/l. Danach ist eine Steigerung der Konzentration zu
Ergebnisse
S e i t e | 61
beobachten. Bei der Probe, die 24 h bei 35 °C erhitzt wurde, ist ein Wert von 2,5 mg/l
Kohlenstoff gemessen worden. Eine weitere Erhöhung der Konzentration ist auch bei der
50 °C-Probe zu erkennen. Eine Ausnahme mit 3,1 mg/l bildet die Probe, die bei 100 °C
erwärmt wurde, denn diese besitzt einen geringeren Kohlenstoffgehalt als die 50 °C-Probe.
Den höchsten Gehalt an TOC mit 28,4 mg/l besitzt die bei 250 °-inkubierte Probe. Je mehr
Nanopartikel durch die Inkubation zerstört wurden, desto höher ist auch der gemessene
TOC-Gehalt.
Diskussion
5
5.1
S e i t e | 62
DISKUSSION
REDUKTION VON SELENIT/SELENAT
In dieser Arbeit wurden signifikante Unterschiede zwischen den Wachstumskurven der
Selenit- und Selenatkulturen ersichtlich. Da die Wachstumskurven der Kontroll- und
Selenatkultur einen fast identischen Verlauf aufweisen, kann davon ausgegangen werden,
dass das Bakterium A. brasilense das im Medium enthaltene Selenat nicht in seinem
Stoffwechsel aufnimmt und Selenat somit nicht toxisch bei der eingesetzten
Selenatkonzentration von 1 mM auf seinen Metabolismus wirkt. Im Gegensatz dazu wirkt
sich Selenit bereits ab einer Konzentration von 1 mM negativ auf den Wachstumsverlauf
der A. brasilense-Kulturen aus. Sowohl der Verlauf der optischen Dichte, des Gesamtproteingehalts und auch des pH-Wertes spiegelten während der Kultivierung eine starke
Verlängerung der lag-phase im Zellwachstum wieder. Dies spricht für die hohe Toxizität
des löslichen Oxyanions Selenit. Nach der lag-Phase folgt ebenfalls bei den Selenitkulturen
eine Steigerung der Zelldichte, welches auf eine Anpassung der Bakterien an die
Kultivierungsbedingungen
zurückzuführen
ist.
Diese
Wachstumsverzögerung
der
Bakterien in Gegenwart von Selenit wurde bereits in der Literatur beschrieben (Sarret et al.
2005).
Es konnte durch die Ergebnisse der HG-AAS und der ICP-MS (Kapitel 4.2.2) gezeigt
werden, dass Selenit mikrobiell zu elementarem Selen reduziert wurde. Innerhalb von
sieben Tagen konnte das Bakterium A. brasilense 1 mM Selenit vollständig zu Selennanopartikel umwandeln. Dagegen konnte Selenat durch A. brasilense nicht reduziert
werden. Die Selenatkonzentration blieb während der gesamten Kultivierung konstant. Dies
bestätigt die Aussage, dass Selenat nicht in den Metabolismus des A. brasilense
aufgenommen wird.
Studien belegen, dass unterschiedliche Arten von Bakterien nach der Reduktion von
Selenit rote, amorphe Allotrope von Se(0) bilden (Kessi et al. 1999, Oremland et al. 2004).
Dabei konnte ein Zusammenhang zwischen der Farbintensität der suspendierten
Nanopartikel (Kapitel 4.3.1) und dem Selengehalt im Medium (Kapitel 4.2.5) hergestellt
werden. Die blass-rötlich gefärbten Suspensionen, zeigten bei der HG-AAS und bei der
ICP-MS eine geringere Abnahme des Selenits aus dem Medium und dementsprechend
auch eine geringere Bildung der Selennanopartikel.
Diskussion
S e i t e | 63
Dieser Zusammenhang kann auch mit dem Wachstumsverhalten und der Ermittlung der
Gesamtzellproteinkonzentration hergestellt werden.
Je schneller die lag-Phase überwunden wird, desto eher beginnen die Bakterien mit der
Reduktion des elementaren Selens. Da nur ein Ansatz bei den 5 mM-Kulturen
Bakterienwachstum aufwies, konnte hier schon vermutet werden, dass nur geringe Mengen
an Nanopartikel gebildet wurde. Dies spiegelt sich auch bei der blass-rosa Farbe der
isolierten suspendierten Nanopartikel wieder.
In Kapitel 4.2 wurde beschrieben, dass Auffälligkeiten in Bezug auf die Farbentwicklung
der Kulturen mit Selenit zu beobachten sind. Während der Kultivierung wurde eine
schwach rote Farbe der Selenitkulturen wahrgenommen, die bis zum Ende der
Kultivierung intensiver
wurde.
In anderen
Publikationen wurde während des
Kultivierungszeitraumes der Selenitansätze eine Bandbreite von verschiedenen Rottönen
angegeben. Dabei wurde ebenfalls bei A. brasilense, in Gegenwart von Selenit, eine
Veränderung der Kulturen, beobachtet. Dies äußerte sich in durch eine schwache
Rotfärbung, die sich bis zum Ende der Kultivierung ebenfalls intensivierte. Dieser Effekt
wurde bei Tugarova et al. (2012) bis zu einer Selenitkonzentration von 1 mM beschrieben.
Im Kapitel 4.2.3 wurde beschrieben, wie tolerant das Bakterium A. brasilense gegenüber
unterschiedlich hohen Selenitkonzentrationen ist. Dabei war eine Tendenz zu erkennen,
dass mit steigender Selenitkonzentration im Kulturmedium mehr Zeit benötigt wird, um
das Maximum der Zelldichte zu erreichen. Die maximale wachstumsinhibierende
Selenitkonzentration konnte nicht eindeutig bestimmt werden, da sich die 5 mM-Ansätze
untereinander sehr unterschieden. Tugarova et al. (2013) untersuchte die Wirkung von
höheren Selenitkonzentration auf A. brasilense. Bei der Kultivierung auf festem Medium
wurde eine Wachstumshemmung bei einer Selenitkonzentration von 10 mM festgestellt.
Bei der Charakterisierung der Wachstumsverläufe der Kulturen bei unterschiedlichen
Selenitkonzentrationen besitzen alle ein lag-Phase, die bis zum 3. Tag andauerte. Die
Ergebnisse der HG-AAS und der ICP-MS hingegen verdeutlichen, dass mit steigender
Selenitkonzentration im Kultivierungsmedium die Selenitabnahme und die damit
verbundene Nanopartikelbildung später einsetzt. Bei einer Konzentration von 1 mM
beginnt die Abnahme der Selenitkonzentration zwischen dem 3. und dem 6. Tag, hingegen
die Abnahme bei den 2,5 mM erst am 7. Tag beginnt.
Diskussion
S e i t e | 64
Die 5 mM-Selenitkultur, bei der ein Wachstum sichtbar wurde, zeigte innerhalb von 10
Tagen keine Reduzierung der Selenitkonzentration. Dabei war die Selenkonzentration zum
Schluss höher als am Anfang. Diese Erhöhung könnte dadurch zu begründen sein, dass
aufgrund der Kultivierung im Wärmeraum ein geringer Teil des Mediums verdampft und
das Selenit somit höher konzentriert ist.
Um eine eindeutige Aussage über die Höhe der Selenitkonzentration, die zum Hemmung
des Wachstums führt, machen zu können, sind weitere Versuche notwendig.
Damit kann eindeutig ein Zusammenhang zwischen Wachstumsverhalten von A. brasilense
und Abnahme des Selenits im Medium und der damit verbundenen Bildung der
elementaren Selennanopartikel bewiesen werden. Je schneller sich die Bakterien in
Gegenwart von Selenit erholen, desto eher beginnt die Reduktion des Selenits zu
elementarem Selen.
Neben den mikrobiell erzeugten Nanopartikel wurden zum Vergleich Untersuchungen mit
chemisch reduziertem Selen durchgeführt. Bei dem Vergleich der UV/Vis-Spektren, wurde
beobachtet, dass die chemisch reduzierte Selenitlösung einen Peak bei 667 nm aufwies und
demnach einen Peak bei einer ähnlichen Wellenlänge besitzte wie die mikrobiell erzeugten
Nanopartikel. Somit kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei beiden um
elementares Selen handelt. Die geringe Verschiebung des Peaks könnte mit dem Schwefel
in Verbindung stehen, welches in mikrobiell erzeugten Partikeln nachzuweisen ist.
Durch das in der Arbeit verwendete Reduktionsmittel Hydroxylamin konnte ausschließlich
Selenit chemisch reduziert werden, welches durch Bildung eines roten Niederschlags zu
beobachten war (Kapitel 4.3.1). Dies deutet auf eine Reduktion von Selenit zu
elementarem Selen hin. Es entstand im Gegensatz zum mikrobiell erzeugten Nanopartikeln
keine stabile Suspension. Beim Selenat hingegen wurde optisch keine Veränderung
sichtbar. Diese Beobachtungen wurden in der Literatur ebenfalls mit anderen
reduzierenden Reagenzien beschrieben. Viele Publikationen beschreiben bei der
Verwendung verschiedenster Bakterien, dass bei der chemischen Reduktion mit
unterschiedlichen Reduktionsmitteln keine Selennanopartikel, sondern ein roter flockiger
Niederschlag entsteht (Bruggeman et al. 2005, Bruggeman et al. 2007, Scheinost & Charlet
2008).
Diskussion
S e i t e | 65
Selenit- und Selenat reduzierende Reagenzien, die in der Literatur beschrieben werden,
sind beispielsweise Hydrazin (Buckley 1976), Ascorbinsäure (Shaker 1996) und
Natriumascorbat (Mees et al. 1995).
5.2
CHARAKTERISIERUNG DER NANOPARTIKEL
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Bakterium A. brasilense die
Fähigkeit besitzt unter aeroben Bedingungen das giftige Selenit in das weniger gefährliche
elementare Selen in Form von Nanopartikeln umzusetzen.
Nachdem die Nanopartikel isoliert (Kapitel 3.5.10) und mit VE-Wasser resuspendiert
wurden, blieb eine kaminrote Lösung zurück, welche auf die Farbe der Nanopartikel
zurückzuführen ist. Die Nanopartikel wurden über mehrere Monate in VE-Wasser gelagert.
Dabei war zu beobachten, dass im Gegensatz zu den chemisch reduzierten Partikeln, eine
stabile Suspension entstand. In dieser Zeit lösten sich die Nanopartikel nicht in Wasser und
agglomerierten auch nicht. Diese Beobachtung wird durch Oremland et al. (2004) bestätigt.
Durch Lagerung der Nanopartikel in destilliertem Wasser über einen Zeitraum von
mehreren Monaten behielten diese die Struktur bei und können somit als stabil angesehen
werden.
Die unter dem Lichtmikroskop beobachteten Nanopartikel konnten, ebenfalls mittels REM
und TEM visualisiert und über EDX als ein Selen-Schwefel-Gemisch identifiziert werden.
Dabei lagen die Nanopartikel außerhalb der Zelle vor. Nur durch TEM-Dünnschnitte der
Bakterien kann eindeutig bestimmt werden, ob die Nanopartikel innerhalb und/oder
außerhalb
der
Bakterienzelle
vorkommen.
In
der
Veröffentlichung
von
Tugarova et al. (2013) wird ein Versuch mit ähnlichen Bedingungenbeschrieben. Die
Kultivierung des A. brasilense erfolgte sieben Tage bei aeroben Bedingungen und wurde
während des Versuches nicht geschüttelt. Die dabei entstandenen Partikel lagen
intrazellulär vor (Tugarova et al. 2013). Andere in der Literatur erwähnten Bakterien
besaßen ebenfalls die Fähigkeit Nanopartikel in Gegenwart von Selenit zu bilden waren
sowohl intrazellulär als auch extrazellular lokalisiert (Oremland et al. 2004)
Mittels EDX konnte ebenfalls gezeigt werden, dass der von Nanopartikel umgebene
„Schatten“, weitestgehend aus Spurenelementen besteht und dies auf Rückstände aus der
Isolierung der Nanopartikel zurückzuführen ist.
Diskussion
S e i t e | 66
Durch Bestimmen der Oberflächenladung (Kapitel 4.3.3) wurde bei einem pH-Wert von 7
ein Oberflächenpotential in dem Bereich -15 bis -18 mV gemessen. Während der
Bestimmung des Zetapotentials konnte in dem untersuchten pH-Bereich von 1 bis 7 kein
isoelektrischer Punkt ermittelt werden.
Diese starke Ladung der Partikel ist für die Stabilität und Ausbildung der
Nanopartikelsuspension notwendig, da sich gleichgeladene Partikel voneinander abstoßen
und nicht agglomerieren. Für Nanopartikel, die durch Bakterium Bacillus cereus gebildet
wurden, konnte eine Ladung von -46,86 mV bestimmt werden (Dhanjal & Cameotra
2010).
Mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung (Kapitel 4.3.4) wurde die Partikelgrößenverteilung ermittelt. Für die durch A. brasilense gebildeten Selennanopartikel
konnte daraus ein durchschnittlicher Partikeldurchmesser von 400 nm berechnet werden.
Dieser Wert stimmt mit der Ausmessung der isolierten Nanopartikel der TEM-Aufnahme
(Kapitel 4.3.2) überein. Bei den 1 mM-Selenitkulturen wurde häufig die Auffälligkeit
beobachtet, dass sich die Ansätze schon kurz nach Zugabe des Selenits sich farblich
unterscheiden. So färbten sich einige Ansätze orange und andere hingegen rot. Durch die
Analyse mittels DLS sollte untersucht werden, inwiefern ein Zusammenhang zwischen
Farbe und Partikelgröße bzw. deren Verteilung besteht. Die orangefarbene Kultur besaß
Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 443 nm, die rötliche hingegen
407 nm. Da die Unterschiede so gering sind, kann nicht eindeutig gesagt werden, ob eine
Abhängigkeit zwischen Partikelgröße und Färbung der Kultur besteht. Bei der Messung
der Optischen Dichte und der Bestimmung der Gesamtzellproteinkonzentration konnten
hingegen große Unterschiede festgestellt werden. Ansätze, die sich während der
Kultivierung orange färbten, wiesen ein starkes Wachstum auf (ODmax bei 4 bis 5) und eine
hohe Proteinkonzentration (cmax = 1780 µg/ml bis 2350 µg/ml) auf. Die rötlichen Kulturen
hingegen besaßen durchschnittlich eine OD von 3 und eine Gesamtzellproteinkonzentration von 800 µg/ml. Nach circa zwei Wochen im Wärmeraum konnte beobachtet werde,
dass sich die orangene Färbung der Kultur sich zu Rot änderte. Dieser Farbwechsel wird
auch von Lin und Wang (2005) beschrieben, wobei diese die Änderung von gelb zu rot als
einen Beweis für die Vergrößerung der Partikelgröße der Selennanopartikel angeben.
Diskussion
S e i t e | 67
Andere, in der Literatur angegebene, Bakterien produzieren in Gegenwart von Selenit
ebenfalls sphärische Partikel, bei denen von dem Pseudomonas sp. gebildeten Nanopartikeln ein Durchmesser von 400 nm und bei Bacillus sp. die Partikel mittels
REM-Aufnahme auf 200 bis 300 nm geschätzt wurden (Kashiwa et al. 2000, Hunter &
Manter 2009).
Bei dem Vergleich der durchschnittlichen Partikelgröße der unterschiedlich hohen
Selenitkonzentrationen ist eine Tendenz erkennbar. Je höher die Selenitkonzentration im
Medium, desto kleiner ist die durchschnittliche Partikelgröße. Jedoch sind die
Unterschiede so gering, dass nicht eindeutig bestimmt werden kann, dass die Partikelgröße
von der Höhe der Selenitkonzentration abhängig ist. Betrachtet man die Verteilung der
Partikel, so ist zu erkennen, dass sich die Partikel des 5 mM-Ansatzes in dem Bereich
190 bis 712 nm aufteilen, wo hingegen die Partikel des 1 mM-Ansatzes sich zwischen
295 und 1106 nm befinden. Dies kann mit Länge der lag-Phase zu begründen sein. Die
1 mM-Kulturen besitzen eine kürzere lag-Phase und beginnen dementsprechend eher mit
Wachstum als die anderen Kulturen. Somit haben die Bakterien bei einer geringeren
Selenitkonzentration mehr Zeit, um das Selenit aus dem Medium zu Nanopartikel zu
reduzieren, welches wiederrum Einfluss auf die Nanopartikelgröße hat.
Der in dieser Arbeit detektierten Peaks bei 257 cm-1 und 355 cm-1 werden auch in der
Literatur als Strukturen von Selen beschrieben. Die Raman-Verschiebung bei 257 cm-1
wird in Publikationen einer Selenkette und einem Se8-Ring zugeordnet (Poborchii et al.
1997).
Der
kleine
Peak
bei
355 cm-1
könnte
vor
dem
Hintergrund
der
TEM-EDX-Ergebnisse als Selen-Schwefelverbindung interpretiert werden. In Schmidt und
Wilhelm (1970) wird beschrieben, dass Banden, die um 360 cm-1 liegen, der S-Se-Valenzschwingung zugeordnet werden. Dies würde mit den Aussagen der EDX-Analyse
übereinstimmen, bei der die Nanopartikel als ein Selen-Schwefel-Gemisch identifiziert
wurden. In Oremland et al. (2004) wurden ebenfalls die Nanopartikel dreier Bakterienstämme beschrieben, die mittels Raman-Spektren charakterisiert wurden. Ein ähnliches
Spektrum, wie das in dieser Arbeit gemessene, besitzt einen Peak mit einer RamanVerschiebung von 240 cm-1 zeigen die Nanopartikel des Bakteriums. Die Nanopartikel des
Bakterienstamm S. shriftii wiesen Se8 strukturelle Einheiten auf. In Kohara et al. (1998)
wird die typische strukturelle Anordnung der Selen-Atome beschrieben. Diese liegt in
verschiedenen Oxidationsstufen als Ringe oder Ketten vor. Dabei variiert die molekulare
Zusammensetzung oder die Kettenlänge, beginnend von Se3 bis S12.
Diskussion
S e i t e | 68
Durch Inkubation der Nanopartikelsuspension bei unterschiedlich hohen Temperaturen
(Kapitel 4.3.6) wurde die Thermostabilität der Nanopartikel untersucht und anschließend
mittels dynamischer Lichtstreuung und UV/Vis charakterisiert.
Des Weiteren wurde der TOC-Gehalt der Lösungen gemessen. Schon nach dem Erhitzen
wurden bereits rein optische Unterschiede sichtbar (Abbildung 51), die sich auch in den
UV/Vis-Spektren zeigten.
Da die Spektren der Ausgangslösung identisch (Peak bei 600 nm) mit der bei 35 °C
inkubierten Probe sind, kann davon ausgegangen werden, dass hier keine Änderung in der
Atomanordnung zu verzeichnen ist. Bei einer Temperatur von 50 °C beginnen die Partikel
ihre Größe zu ändern oder zu agglomerieren, sodass die roten Nanopartikel nach einer
gewissen Zeit sedimentieren. Dies spiegelt sich auch bei der Messung der DLS wieder. Die
durchschnittliche Partikelgröße nimmt mit zunehmender Inkubationstemperatur zu. Eine
„Ausnahme“ bildet sich 50 °C-inkubierte Probe, bei dem ein hydrodynamischer
Durchmesser von 2330 nm gemessen. Dies ist ein 7-fach größerer Durchmesser als die
Partikel bei den anderen unterschiedlichen Inkubationstemperaturen.
Die UV/Vis Spektren der 100 °C- und 250 °C-Probe wiesen kaum eine Absorption auf.
Jedoch wurde bei der 100 °C-inkubierten Probe ein kleiner Peak bei 620 nm detektiert
werden. In Lin und Wang (2005) werden die Absorptionsspektren für eine Folge
verschiedener Größen der Selennanopartikel dargestellt. Die Partikel, die ebenfalls bei
einer Wellenlänge von 600 nm einen Peak aufwiesen, besitzen einen Partikeldurchmesser
von 182,8 ± 33,2 nm. Je größer die Partikel werden, desto mehr verschiebt sich der Peak in
höhere Wellenlängen. Das Absorptionsspektrum der isolierten Selennanopartikel des
Bakteriums Bacillus cereus unterstützt ebenfalls die Aussage, dass Selen bei einer
Wellenlänge von 600 nm aufzuweisen ist (Dhanjal & Cameotra 2010). Dieser Unterschied,
zwischen den in dieser Arbeit bestimmten Partikelgröße und deren Partikeldurchmesser,
könnte mit der von Dhanjal und Cameotra (2010) durchgeführten chemischen Reduktion
zu begründen sein.
Die TOC-Messungen der unterschiedlich temperierten Proben sollte Aufschluss über das
Vorhandensein organischer Substanzen liefern, welche an der Nanopartikelbildung
beteiligt sind. Dazu wurde der Gehalt an organisch gebundenen Kohlenstoff bestimmt.
Es kann gesagt werden, dass mit steigender Temperatur mehr organisch gebundener
Kohlenstoff vorhanden ist. Grund dafür könnte sein, dass mit steigender Temperatur
Diskussion
S e i t e | 69
zunehmend Nanopartikel zerstört werden und dementsprechend auch der TOC-Ghealt
erhöht wird. Die Ausnahme stellt die 100 °C-Probe dar, die einen geringeren TOC-Gehalt
aufwies. Ein Grund könnte das bei der Erhitzung gebildete rote Sediment sein, da dieses
mittels Pipette nicht resuspendieren und somit nicht aufgenommen werden konnte. Daher
fehlt ein gewisser Teil an Nanopartikel, der mittels TOC-Messung nicht mit erfasst werden
konnte.
Ausblick
6
S e i t e | 70
AUSBLICK
Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Aspekte gaben Aufschlüsse über die
Verträglichkeit von Selenat und Selenit gegenüber des Bakteriums A. brasilense. Die
Untersuchungen zeigten, dass nur das Oxyanion Selenit toxisch auf das Bakterium wirkt.
Durch Variation der Selenitkonzentration konnte unter gewählten Bedingungen und
Konzentrationen gezeigt werden, inwieweit das Bakterium A. brasilense in der Lage ist,
eine bestimmte Selenitkonzentration zu tolerieren, sodass es lebensfähig bleibt. Aufgrund
der Reduktion von Selenit zu elementaren Selen bildeten sich extrazellulär Nanopartikel,
die mit Hilfe verschiedener Methoden charakterisiert wurden. Die Erkenntnis, dass die
Nanopartikel bei einer 24-stündigen Inkubation bei 50 °C einen größeren Partikeldurchmesser annehmen kann für die Isolierung der Nanopartikel in großem Maßstab von
Nutzen sein. Diese könnten leichter mittels Sieb abgetrennt werden als kleinere Partikel.
Für die Betrachtung des Bakteriums in natürlicher Umgebung wären weitere
Untersuchungen von großem Interesse. Dabei könnte ermittelt werden, ob das Bakterium
in der Natur ebenfalls das Verhalten äußert Selenit zu reduzieren und Nanopartikel zu
bilden. Demnach könnte Wasserproben aus regionalen Flüssen oder Seen entnommen
werden und beispielsweise durch Zugabe von Selenit das Verhalten beobachtet werden.
Des Weiteren kann sowohl die Sorption von Selennanopartikel an Mineralen untersucht
werden als auch die Sorption von nuklearen Stoffen, beispielsweise Europium und Uran,
an Selennanopartikel und wäre somit für die Endlagerforschung von großem Interesse.
Auch die Sorption an Metallen, beispielsweise Kalzium, Magnesium und Eisen, könnte in
nachfolgenden Experimenten analysiert werden. Bei der Kultivierung des A. brasilense
wurden einige Auffälligkeiten bezüglich des aeroben Wachstums festgestellt, welche durch
weitere Experimente untersucht werden können. Die Bakterienkulturen, die bei der
Kultivierung, aufgrund der unterschiedlichen Größen der Erlenmeyerkolben, eine größere
Oberfläche und damit verbundenen größeren Kontakt mit Sauerstoff, besaßen, begannen
schneller mit der Produktion der Selennanopartikel. Diese Aerotaxis wird in einigen
Publikationen in Gegenwart einer geringen Sauerstoffkonzentration beschrieben (Barak et
al. 1982) und die Bakterien wandern zur optimalen Sauerstoffkonzentration (Zhulin et al.
1996).
Ausblick
S e i t e | 71
In einigen Publikationen wird davon berichtet, dass das Bakterium A. brasilense in der
Lage ist, das Phytohormon Indolessigsäure zu produzieren.
Inwieweit ein Zusammenhang zwischen der Produktion dieser Indolessigsäure und
Bildung der Nanopartikel besteht, könnte in weiterführenden Experimenten untersucht
werden.
Literaturverzeichnis
7
S e i t e | 72
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Eidesstattliche Erklärung
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EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG
Hiermit erkläre ich eidesstattlich, dass die vorliegende Masterarbeit ohne unzulässige Hilfe
Dritter und ohne Benutzung anderer als der von mir angegeben Hilfsmittel angefertigt
habe. Die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als
solche kenntlich gemacht.
Dresden, den 30.September 2013
Anika Maffert
Danksagung
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DANKSAGUNG
Als erstes möchte ich Herrn Prof. Dr. rer. nat. habil. Thomas Wiegert für die Betreuung
meiner Masterarbeit sowie sein Interesse am Fortgang der Arbeit danken.
Die vorliegende Masterarbeit wurde in der Abteilung Biogeochemie am Institut für
Ressourcenökologie des Helmholtz-Zentrums Dresden-Rossendorf e.V. angefertigt. An
dieser Stelle möchte ich mich bei allen Personen bedanken, die durch ihre tatkräftige
Unterstützung zum Entstehen dieser Arbeit beigetragen haben.
Dabei gilt mein ganz besonderer Dank meinen Betreuern Frau Dr. Manja Vogel,
Herr Dr. Robin Steudtner und Frau Dr. Carola Franzen, bei denen jederzeit die Tür für
mich offen stand, um Fragen zu beantworten und Probleme zu lösen. Außerdem danke ich
ihnen für die lehrreichen Gespräche, die anregenden Diskussionen, die fachliche
Kompetenz und die mitreißende „wissenschaftliche Neugier“ am zu bearbeitenden Thema.
Weiterhin möchte ich mich bei meinen Bürokolleginnen Julia Berger, Maria Berger,
Sandra Köppchen und Dorina Köpke für die vielen wissenschaftlichen und privaten
Diskussionen, die entspannte Arbeitsatmosphäre und die stete Hilfsbereitschaft aller
bedanken.
Des Weiteren möchte ich mich herzlich für die tatkräftige Hilfe beim Korrigieren der
grammatischen Fehler bei meinen Freundinnen Julia Berger und Maria Berger bedanken,
die sich bereit erklärt haben, meine Arbeit gegenzulesen.
Nicht zuletzt gilt mein besonderer und tiefer Dank meinen Eltern, meiner Oma und
meinem Freund, die mir immer bei Seite standen, mich unterstützten und immer ein
offenes Ohr für mich hatten.
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