Weitere genetische Schalter

Weitere genetische Schalter
Gen-Regulation mit Feedback produziert einen Schalter
„Robuste“ vs. „ultrasensitive“
Schalter
Einfaches Netzwerk mit positiver
Rückkopplung
Ohne Hysterese:
Ultrasensitiver Schalter, rauschinduziertes
Schalten
Mit Hysterese:
Robust gegen Rauschen (Konzentration
von A bleibt gering, falls anfängliche
Konzentration gering)
Robuste Schalter / Bedeutung der Hysterese
Einfaches Netzwerk mit positiver Rückkopplung
memory-less switch
bistable switch
Hysterese
Ohne Hysterese:
Ultrasensitiver Schalter,
rauschinduziertes Schalten
Mit Hysterese:
Robust gegen Rauschen (Konzentration
von A bleibt gering, falls anfängliche
Konzentration gering)
Bistabiles Verhalten
positive feedback loops lead to bistable switches
from: Kaern et al. Nature Review 2005
Bistable genetic Switches
Protein A = key regulator
active when present as a multimer.
multimerization => nonlinear dynamics of
the system
production of A, f(ap)
described by Hill-type function.
deactivation rate,
described by a linear-type function, f(ad)
Eigenschaften des Lac Netzwerkes
Die Induktion der lac synthese
ist ein Alles-Oder-Nichts Prozess
Die Eigenschaft des genetischen
Zustandes kann vererbt werden
Novick & Weiner 1957
Der Lactose Abbauweg
eine hierarchische Betrachtung
Molekulare Wechselwirkungen
Zelluläres Netzwerk
Heterogenität in der Populationsdynamik
Zeitliches Verhalten des lac-Operon Schalters
Hohe InduktorKonzentration:
[β-galactosidase]
[β-galactosidase]
Niedrige InduktorKonzentration:
Verschiedene Farben Verschiedene Zellen
=> Nicht alle Zellen schalten gleichzeitig!
Durchgezogene Linie: Mittel über 2000 Zellen
Rote dots: Experiment (Novik, Wiener, PNAS 1957)
[β-galactosidase]
time (generations)
time (generations)
Vilar, J.M.G et al, J.Cell Biol. 2003
Gen-Regulation mit Feedback:
lac-Operon
IPTG, TMG
LacI
Modell für lac Netzwerk
Glukose
Konz.
konstant
GFP: Reportermolekül, Abbildung durch
Fluoreszenz-Mikroskopie
=> je höher das Fluoreszenz-Signal desto
mehr LacZ,Y wird exprimiert
Experimenteller Nachweis eines Schalters mit
Hysterese
Anfang: nicht induziert
Bistabiler Bereich (grau)
Nach Induktion 2 Populationen:
induzierte Population grün, nicht
induzierte Population weiß
Pfeil zeigt den Anfangs-Zustand Zustand der
Bakterien hängt vom Ausgangs-Zustand ab!
=> Schalter mit Hysterese
Ozbudak et al, Nature 2004
Modell für lac Netzwerk
dy
1
#y
=$
!y
dt
1 + R R0
dx
#x
= "y ! x
dt
R
1
=
RT 1 + (x x0 )n
steady state:
2
1 + (!y )
y =#
2
" + (!y )
x: intracellular TMG concentration
y: concentration of LacY (permease) (measured
in GFP fluorescence units)
R: concentration of active LacI (repressor)
RT: total concentration LacI
n: Hill coefficient (LacI is tetrameric, but 1
TMG is sufficient to interfere with LacI activity)
n!2
α: maximal activity level (if all repressors were
inactive)
β: transport rate, TMG uptake rate per LacY
! = 1 + RT R 0 : repression factor
R0: half saturation concentration
x0: half saturation concentration
τx, τy: time constants
Ozbudak et al, Nature 2004
Phasendiagramm
• große ρ: diskontinuierlicher Übergang vom
nicht-induzierten zum induzierten Zustand
entspricht Phasenübergang 1. Ordnung,
thermisches Rauschen wird durch
chemisches Rauschen ersetzt
• kleine ρ: kontinuierlicher Übergang vom
nicht-induzierten zum induzierten Zustand
entspricht Phasenübergang 2. Ordnung
α: maximal activity level (if all repressors
were inactive)
β: transport rate, TMG uptake rate per LacY
! = 1 + RT R 0 : repression factor
• in Wild Typ Bakterien wurden nur
diskontinuierliche Übergange beobachtet
=> Konstruktion einer Mutante
Ozbudak et al, Nature 2004
Phasendiagramm
Erniedrige ρ unter Wild Typ Niveau!
Mutante mit zusätzlichen
Bindungsstellen für LacI Repressor (b:4,
c:25) => Reduktion der effektiven LacI
(Repressor) Konzentration => Reduktion
von ρ
Fig c: Kontinuierlicher Übergang vom
nicht-induzierten zum induzierten
Zustand!, kein Schalter
(entspricht einem Phasenübergang
2. Ordnung)
[TMG]
(Inducer)
Fluorescence Intensity, [LacY]
Die Dynamik des Schaltverhaltens: Vergleich von Experiment
und stochastischer Simulation (rot)
Rauschen in SignaltransduktionsNetzwerken ist optimiert
Messung der zeitlichen Fluktuationen
des chemotaktischen Netzwerks von E.coli
Korobkova et al. Nature 2004
Das cheA-cheY Signal-Netzwerk
Aus genetischen Untersuchungen sind vier
cytoplasmatische Proteine CheA, CheW, CheY
und CheZ bekannt, die die chemotaktischen
Rezeptoren mit dem Geißelmotor verbinden.
CheW: Hilfsfaktor
CheA : Proteinkinase
CheY : Response Regulator
CheZ : Phosphatase-activating Protein
CheR : Methyltransferase
CheB : Methylesterase
Reguliert durch den Rezeptor transferiert unter
CheA,eine Phosphorylierung auf das kleine
CheY Protein. CheY-p diffundiert zu den
Motorproteinen der Flagellen und induziert den
Übergang des Motors in die Taumelbewegung.
(CHeY-p = Ein/Ausschalter)
Variation der Adaption mit der CheR
Konzentration
Die Adaptionspräzession ist
unabhängig von CheR
Vollständige Adaption !
adaption
time
tumbling
frequency
Die interne Proteinkonzentration CheR wird in
einem Klon unter die
Kontrolle eines Lac
Operons gestellt und „von
aussen“ eingestellt.
Spektrale Analyse einer einfachen chemischen
Reaktion (Isomerisation)
Experiment
Simulation
CheY fluctuationen
rel. Variabilität
des Outputs
CheY
Quorum Sensing
Tintenfisch mit Scheinwerfer
Phänomen:
Tintenfisch (Euprymna scolopes) emittiert
nachts Licht
=> wird im Mondlicht nicht als Beute erkannt
Erklärung:
Lichtorgan des Tintenfisches sammelt
luminiszente Bakterien (Vibrio fischerei)
Frage:
Warum sind V. fischerei im Licht-Organ des
Tintenfischs luminszent, aber nicht
freischwimmend im Meer?
Quorum sensing
Bakterien teilen sich =>
exponentielles
Wachstum
OD: optische Dichte
K. Nelson,
Cell-Cell Signalling in Bacteria
Bakterien detektieren ihre eigene Zelldichte
=> Regulation der Expression von Luminiszenz-Genen
Molekulares Bild von QS
• Bakterien exportieren Oligopeptide (auch Pheromon, bakterielles Hormon, Autoinduktor)
• Mit steigender Zellkonzentration akkumuliert Oligopeptid
• Oligopeptid diffundiert durch Zellmembran, akkumuliert in der Zelle und reguliert GenExpression
Beobachtung:
Zwei unterschiedliche Populationen koexistieren
Kompetenz für DNA-Transformation in
B. subtilis bei hoher Zelldichte.
Kompetente Bakterien sind fluoreszenzmarkiert, d.h. mit Methoden der
Gentechnik, wird an ein Kompetenzgen
ein fluoreszentes Reporter-Protein
(Green Fluorescent Protein, GFP)
kloniert.
ComK-GFP
Nur 5-10% der Bakterien sind
kompetent.
⇒ Quorum sensing induziert einen
Alles-oder-Nichts Übergang oder legt
einen Schalter um
Haijema et al,
Mol.Microbiol.2001
Kompetenz
Kompetenz: lateinisch competere = zusammentreffen, ausreichen,
zu etwas fähig sein, zustehen
„die bei Individuen verfügbaren oder durch sie
erlernbaren kognitiven Fähigkeiten und Fertigkeiten,
um bestimmte Probleme zu lösen, sowie die damit
verbundenen motivational, volitional und sozialen
Bereitschaften und Fähigkeiten, um die
Problemlösungen in variablen Situationen erfolgreich
und verantwortungsvoll nutzen zu können.“
– F. E. Weinert
Aus biologischer Sicht:
Fähigkeit von Zellen, DNA aufzunehmen
und in ihre eigene Erbsubstanz zu integrieren
Kompetenz: Fähigkeit von Zellen, DNA aufzunehmen und
in ihre eigene Erbsubstanz zu integrieren
Freiwillig?
Nein: Meistens aber müssen die Zellen
vorbereitet, kompetent gemacht werden.
=> künstliche Kompetenz.
Wie?
Durch Kombination von Reizen:
Hitze, Kälte, Salze (Calziumphosphat), Strom
Manchmal!
Zellen sporenbildender Bakterien wie Bacillus subtilis
können unter bestimmten Umweltbedingungen DNA
aufnehmen.
=> natürliche Kompetenz
Warum nehmen Bakterien DNA auf?
•
Für mehr Vielfalt
•
Um einzigartig zu sein
•
Um Fähigkeiten zu erlangen, die die
anderen nicht haben
•
Um einen Vorteil zu erlangen
• Um zu überleben
Bakterien können durch
DNA Aufnahme z.B.
Antibiotikaresistenzen
erwerben, oder
Informationen um eine
neue Zuckerart abzubauen
Wann werden Bakterien kompetent?
competence
•
•
unter bestimmten
Umweltbedingungen
OD
600nm
Bacillus subtilis:
in einem ganz
bestimmtem
Lebensabschnitt:
der stationären Phase
Time
lag
exponentiell stationär
Wie nehmen Bacillen die DNA auf?
Molekulares
Modell der DNAAufnahme über
die Zellmembran
in
Bacillus subtilis
Dubnau:Rev Microbiol.
1999;53:217-44
Com = Abkürzung
für competence
Nat Rev Microbiol.
2004;2(3):241-9
Wie entscheiden sich Bakterien?
• Aktiv
• via quorum sensing
Quorum sensing: Die Fähigkeit von Bakterien
miteinander über Signal Moleküle (z.B. Pheromone)
zu kommunizieren und ihr Verhalten zu koordinieren.
Wie wird Kompetenz induziert?
ComX-
ComP
Pheromone
Histindinkinase
Membrane
ComS
Proteinaseinhibitor
ComS
ComX
Precursor
ComA
Transcriptionfactor
Pi
ComK
main
Transcriptionfactor
After Tortosa and Dubnau,
1999, Curr Opinion in
Microbiology, 2:588-592
Activation
of ~ 100
competence genes