Veraenderungen der DNA
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Veränderungen der DNA Dezember 2009 Elmar Schiebel, ZMBH Gen: Nukleotidsequenz, die benötigt wird, um ein Protein oder eine RNA herzustellen: codierende Sequenz, regulatorische Sequenzen und Introns eingeschlossen. Genom: die gesamte genetische Information eines Organismus Locus: der Ort eines Gens im Genom Allel: eine bestimmte Version eines Gens Genotyp: der Genotyp oder das Erbbild eines Organismus repräsentiert seine exakte genetische Ausstattung, also den individuellen Satz von Genen, den er im Zellkern in sich trägt Phänotyp: ein Erscheinungsbild (Eigenschaft) eines Organismus Wildtyp: normalerweise vorkommendes Allel eines Gens; Phänotyp des Organismus so wie er sich natürlicherweise darstellt Mutante: ein vom Wildtyp aufgrund einer Mutation (genetischen Veränderung) verschiedener „Organismus“ Arten von Mutationen Genom-Mutationen z.B. Trisomien Chromosomen-Mutationen z.B. Translokation eines Gens: Reorganisation eines Chromosomes, so dass ein Fragment von Chromosom A mit Chromosom B fusioniert wird: z.B. Philladelphia Chromosom. Deletion Insertion Inversion: Eine chromosomale Änderung bei der ein DNA Abschnitt um 180º relativ zu dem restlichen DNA gedreht und dann inseriert wird. Intragenische Mutation z.B. Nukleotid-Austausch, Leseraster-Mutationen Down Syndrom: Chromosom 21 ist mit 47 x 106 Nukleotiden das kleinste menschliche Chromosom. Es repäsentiert ungefähr 1.5% der gesamten menschlichen DNA. Arten von Mutationen Genom-Mutationen z.B. Trisomien Chromosomen-Mutationen Translokation eines Gens: Reorganisation eines Chromosomes, so dass ein Fragment von Chromosom A mit Chromosom B fusioniert wird: z.B. Philladelphia Chromosom. Deletion Insertion Inversion: Eine chromosomale Änderung bei der ein DNA Abschnitt um 180º relativ zu dem restlichen DNA gedreht und dann inseriert wird. Intragenische Mutationen z.B. Nukleotid-Austausch, Leseraster-Mutationen Chromosomale Translokationen können zu Krankheiten führen. Chromosomale Translokationen können zu Krankheiten führen: Philadelphia Chromosom Die chronische myeloische Leukämie (CML) ist ein Krebs des Immunsystems. Die Teilung der weissen Blutkörper gerät ausser Kontrolle. Die Ursache von CML ist eine Translokation zwischen Chromosom 9 und 22 welche zum Philadelphia Chromosom führt. Durch die Translokation entsteht eine Genfusion und deren Expression zu einem chimeren Protein: BCR-ABL. BCR Chrom. 22 Chrom. 9 ABL Philadelphia Chrom. BCR-ABL Fusionsprotein (verursacht CML) extra langes Chrom. 9 Arten der Mutation Genom-Mutationen z.B. Trisomien Chromosomen-Mutationen z.B. Translokation eines Gens: Reorganisation eines Chromosomes, so dass ein Fragment von Chromosom A mit Chromosom B fusioniert wird: z.B. Philladelphia Chromosom. Deletion Insertion Inversion: Eine chromosomale Änderung bei der ein DNA Abschnitt um 180º relativ zu dem restlichen DNA gedreht und dann inseriert wird. Intragenische Mutationen z.B. Nukleotid-Austausch, Leseraster-Mutationen Nukleotid-Austausch Austausch eines einzelnen Nukleotids gegen ein anderes. Je nachdem, wie das entsprechende Codon betroffen ist, kann die Relevanz für das codierte Protein völlig unterschiedlich sein. -> neutrale Mutation -> veränderte Aminosäure -> frühzeitiges StopCodon Knippers, Abb. 9.1 Der "universelle" genetische Code: 61 Tripletts (Codons) codieren für insgesamt 20 Aminosäuren Startcodon: AUG (in Bakterien sehr selten GUG) Stop: UGA, UAA, UAG Leseraster-Mutation Insertion oder Deletion von ein oder zwei Nukleotiden. Diese Art der Mutation führt zu einer Verschiebung des Leserasters und hat damit fast immer drastischen Konsequenzen für die Proteinsequenz. Knippers, Abb. 9.3 Mutationen in Mehrzellern Somatische Mutationen und Keimbahn-Mutationen haben unterschiedliche Konsequenzen. In vielen Fällen verursachen somatische Mutationen zwar den Tod der betroffenen Zelle, dies kann aber oft durch andere Zellen ausgeglichen werden. Werden allerdings sogenannte Proto-Onkogene getroffen, kann es zur TumorEntwicklung kommen. Die Nachkommen sind von somatischen Mutationen nicht betroffen. Keimbahn-Mutationen betreffen die Nachkommen des Organismus, in dem sich die Mutation ereignet. Monogenetische Erbkrankheiten gehen auf einzelne Mutationen in einem Gen zurück. Mutationen können sich dominant oder rezessiv auswirken. Diese Klassifizierung fragt, ob der Phänotyp im heterozygoten Zustand (eine Kopie normal, eine mutiert) der Mutante oder dem Wildtyp entspricht. Die basale (spontane) Mutationsrate in Bakterien- und Eukaryonten-Genomen ist vergleichbar: typischerweise ein Austausch alle 109 - 1010 Nukleotid-Paare pro Generation. Hefe: 12 Mb Menschliches Genom: 3000 Mb (0.3-3 Mutationen) Was sind die Ursachen von Mutationen? Zunächst ist es wichtig, zwischen spontanen und induzierten Mutationen zu unterscheiden. Spontane Mutationen reflektieren die Chemie der DNA im chemischen Milieu der Zelle und die Eigenschaften des Replikations-Apparats (Falscheinbauten) sowie des DNA-Reparatur-Apparats -- also der mit der Erhaltung des Genoms befassten Enzyme. Induzierte Mutationen werden durch chemische Substanzen oder durch Strahlung (UV, Radioaktivität) hervorgerufen. Diese Prozesse sind von großer medizinischer Bedeutung und spielen für genetische Experimente eine wichtige Rolle. Spontane Mutationen 1. Mutationen, die während der DNA Replikation auftreten 2. Induziert durch die chemische Eigenschaften der Basen Wie werden Falscheinbauten bei der DNA-Replikation verhindert? -- Zuverlässigkeit oder fidelity der Replikation 1. Grundprinzip ist die Energetik der Basenpaarung selbst, die „richtigen“ Paarungen den Vorzug gibt (Thermodynamik der Basenpaarung). Allerdings können selten auch andere Basenpaarungen auftreten, die dann zum Falscheinbau führen. 2. In der DNA-Polymerase findet zwischen dem Binden der neuen Base und der Knüpfung der kovalenten Bindung eine Konformationsänderung statt. Die dafür nötige Zeit macht es wahrscheinlich, dass ein „falsches“ Nukleotid sich wieder aus dem aktiven Zentrum löst. Man bezeichnet diesen Mechanismus auch als „kinetisches Korrekturlesen“. 3. Die DNA-Synthese kann nur mit einem perfekt gepaarten Primer ablaufen. Eine 3‘-5‘-Exonuklease-Aktivität der Polymerase entfernt falsch gepaarte Basen am Ende des neu synthetisierten Stranges. Ungewöhnliche Basenpaare als Ursache für Falscheinbauten an der Replikationsgabel. Knippers, Abb. 9.6 Korrekturlesefunktion der DNA-Polymerase. Das Enzym hat zwei aktive Zentren. Kettenverlängerung in 5‘-3‘ Richtung bedarf eines perfekt passenden 3‘-Endes am Primer (P Stelle). Liegt ein solches nicht vor, baut die 3‘5‘ Nukleaseaktivität des zweiten aktiven Zentrums „E“ das nicht paarende Nukleotid wieder ab. 3’-5’ Nucleaseaktivität Und was passiert, wenn doch mal ein falsches Nukleotid eingebaut wird? Zusätzlich zu der direkt in die DNA-Polymerase eingebaute Korrekturlesefunktion gibt es noch spezialisierte DNA-ReparaturSysteme in der Zelle. z.B. können Falschpaarungen, so genannte mismatches, durch ein postreplikatives Reparatursystem beseitigt werden. Mismatch-Reparatur Die Gene dieses Reparaturweges wurden bei der Untersuchung von E.coli Mutanten gefunden, die extrem hohe Mutationsraten aufweisen (Mutator-Mutanten = Mut). Die drei wesentlichen Schritte des MismatchRepairs sind: 1. Erkennung der falschen Basenpaarung im Doppelstrang. 2. Abbau des falsch synthetisierten Stranges. 3. DNA-Synthese (Reparatur). Knippers, Abb. 9.7 Schritte der Reparatur von Basenpaar-Mismatches 1. MutS-ATP bindet an das falsche Basenpaar. 2. ATP Hydrolyse erlaubt die Bindung von MutL, das MutH rekrutiert. 3. MutS und MutL aktivieren die Endonukleaseaktivität von MutH. 4. MutH schneidet den nicht-methylierten DNA Strang. 5. Die DNA-Helicase II (UvrD) und Exonukleasen (ExoVII oder Exo I) entfernen die Einzelstrang-DNA im Bereich der Mutation. 6. DNA-Polymerase III füllt die Lücke auf. Die DNA Ligase schliesst die Lücke. Das mismatch repair-System ist in Eukaryonten konserviert. Wie wird der neu synthetisierte, falsche Strang erkannt? E. coli: der neue Strang ist noch nicht methyliert. Eukaryonten: Wahrscheinlich werden die Enden wachsender DNAStränge erkannt, vermutlich vermitteln durch das dort vorhandene Einzelstrang-Bindeprotein RPA. Hier jedoch: drei Homologe MutS, die Heterodimere ausbilden. DNA-Polymerase delta füllt die Lücke auf. Hereditäres nicht-polypöses Colonkarzinom (HNPCC) = Lynch-Syndrom. Gezeigt sind drei häufig betroffene Gene und die Art der prädisponierenden Mutationen. MSH = MutS Homolog MLH = MutL Homolog autosomal vererbte dominate Mutationen des Mismatch Reparatursystems, welche in vielen Fällen zu einer Krebserkrankung führen. Mutationen in MSH2, MLH1 oder MSH6 sind für 2-3% der jährlichen Darmkrebsfälle verantwortlich. Sind MSH2, MLH1 und MSH6 Protoonkogene oder Tumorsuppressoren? 30% 60% 7-10% Knockout-Mäuse ohne bestimmte Mismatch-Reparatur-Gene sind Modellorganismen für menschliche Krebserkrankungen Beispiel: Erhöhte Sterblichkeit in einer Population von MSH6-Knockout-Mäusen (MutS homolog 6). Im dargestellten Fall dominant oder rezessiv? Zuverlässigkeit oder fidelity der Replikation: 1. Fehlerrate: Fehler pro X korr. Nukleotid-Paare pro Generation Thermodynamik der Basenpaarung Der Unterschied der freien Energie zwischen korrekten (G-C und A-T) Basenpaarungen und falschen (z.B. G-T) erlaubt den Einbau der Basen mit einem Fehler von in 1/100 Fällen. 2. Selektion der Base durch die Polymerase Kinetisches Proofreading durch die DNA-Polymerase. Übergang von einer inaktive in eine aktive Konformation hängt vom Einbau der richtigen Base ab. 10-2 Beitrag 102 10-5 105 3. Proofreading der DNA Polymerase 3’-5’ Exonukleaseaktivität. 10-7 4. Post-Replikation Mismatch Reparatur: MutS, H, L, .. Mutationen, die zu einer Verformung der DNA führen, einschliesslich fehlerhafte Basenpaarungen werden entfernt. 10-10 103 Spontane Mutationen 1. Mutationen, die während der DNA Replikation auftreten 2. Induziert durch chemische Eigenschaften der Basen Von der Replikation einmal abgesehen, ereignen sich an der DNA mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit chemische Veränderungen (spontan oder induziert). Dank spezieller Reparatursysteme wird eine solche Veränderung nur in 1:1000 Fällen als Mutation „fixiert“. Führt jede Mutation zu einem Phänotyp ? Hydrolytische Depurinierung (9000 Ereignisse pro Tag pro Zelle) (ApurinStellen) und Deaminierung (400 mal pro Tag pro Zelle) sind spontane Prozesse, zwar selten aber häufig genug, um das Genom zu destabilisieren, wenn keine Reparatur stattfindet. Apyrimidin-Stellen entstehen indirekt durch Deaminierung von Cytosin Resten zu Uracil und deren Entfernung durch Uracil-DNAGlykosylase, welche falschgepaarte UracilReste durch Lösen der glykosidischen Bindung entfernt. Apurin- oder Apyrimidin-Stellen (APStellen) sind Punkte im Doppelstrang, wo der Basenanteil des Nukleotids fehlt. Knippers, Abb. 9.8 9000x 400x 10x AP-Stellen und Konsequenzen Gegenüber einer informationslosen Stelle im Matrizenstrang wird bevorzugt ein AdeninNukleotid eingebaut. Also: Replikation von AP-Stellen ohne Reparatur führt zu Punktmutationen: neutral, missense, nonsense! Punktmutation Mutation Keine Mutation Wie können AP-Stellen repariert werden? Knippers, Abb. 9.9 3’-OH Reparatur von AP-Stellen durch Basen-ExzisionsReparatur (BER). 1. Basen können auch oxidativ geschädigt werden. Diese werden 2. wiederum von Glykosylasen erkannt und können auf demselben Wege repariert werden. 5‘-Desoxyribose-P 3. dPRase = Desoxyribophodiesterase 4. DNA-Polymerase ß III 5. Knippers, Abb. 9.10 „Hotspots“ sind Stellen im Genom, an denen viel öfter als an anderen Stellen Punktmutationen auftreten. Die molekularen Grundlagen von Hotspots sind nicht immer gut verstanden. Aussnahmen sind jedoch solche Hotspots an CpGDinukleotiden. Diese sind häufig methyliert und werden in TpG oder CpA Basenpaare umgewandelt. Warum ? Knippers, Abb. 9.15 In Säugetierzellen liegt ein Teil der DNA methyliert vor (die Methylierung spielt eine Rolle im Rahmen der Regulation der Genexpression). An methylierten Cytosinen kann es zu einer hydrolytischen Deaminierung kommen, was die Base in ein Thymin umwandelt. Thymin wird als normaler Baustein der DNA nicht von den DNA-Gykosylasen des Reparatursystems erkannt. Diese Veränderung wird deshalb nicht repariert und wird so in der Regel als Mutation fixiert indem an der Stelle eines normalen CG-Basenpaars ein TAPaar erscheint. Die basale Mutationsrate in Bakterien- und Eukaryonten-Genomen ist vergleichbar: typischerweise ein Austausch alle 109 - 1010 Nukleotid-Paare pro Generation. Das haploide Genom des Mensch hat 3 x 109 Basenpaare -- ist die Rate nicht zu hoch? Induzierte Mutationen Der Ames-Test wird eingesetzt, um die Mutagenizität einer Substanz zu messen. Man verwendet einen Histidin-auxotrophen Stamm des Bakteriums Salmonella, der zusätzlich defekt in der DNA-Reparatur ist. Die Zellen werden mit einem Leberextrakt auf einer Platte aus Medium ohne Histidin ausplattiert. Die zu testende Substanz wird in Form einer getränkten Filterscheibe auf die Platte aufgebracht. Man vergleicht die spontane Reversion mit der Reversion in Gegenwart der Substanz. Revertanten, die durch Mutagenese indziert wurden. Filter mit Substanz Unter Reversion versteht man die Wiederherstellung des ursprünglichen Phänotyps (Histidin-Prototrophie). Ames-Test zur Messung der Mutagenizität einer Substanz Es gibt unterschiedliche Testerstämme: Leserahmenmutation, Punktmutation. Induzierte Mutationen können z.B. durch polyzyklische Kohlenwasserstoffe entstehen. Diese werden durch den Stoffwechsel in der Leber aktiviert und modifizieren dann Basen in der DNA. Knippers, Abb. 9.20 Polycyclische Kohlenwasserstoffe im Steinkohleteer, Zigarettenrauch, usw. werden z.B. in Leberzellen in wirksame Agenzien überführt, die dann die Basen in den DNA-Bausteinen verändern können. Die Auslösung von Mutationen beruht hauptsächlich auf zwei Mechanismen: 1. Die glykosidische Bindung zwischen den modifizierten Basen und der Desoxyribose wird labiler als normalerweise. Dementsprechend erfolgen häufige hydrolytische Depurinierungen mit einer vermehrten Erzeugung von AP-Stellen, die bei der Replikation der DNA zu Adenin-Nukleotiden überführt werden. 2. Die DNA-Replikation wird durch die unförmigen Modifikationen blockiert. Die Reparatur dieser Defekte kann zu Mutationen führen. Hierzu ein Beispiel. DNA-Schäden induziert durch ultraviolettes Licht: 85% - Thymin-Dimere können durch UV-Bestrahlung entstehen. Seltener (10%) sind TCPhotoprodukte. In jedem Fall kommt es zu einer Verzerrung der DNA Struktur und zu Problemen bei der Transkription und Replikation. Es entsteht ein Cyclobutanring ! Knippers, Abb. 9.21 Unförmige Basenmodifikationen durch polyzyklische Kohlenwasserstoffe und die Bildung von Thymin-Dimeren durch UV haben gemeinsam, dass der DNADoppelstrang signifikant verzerrt wird. Solche Veränderungen werden von einem speziellen Reparatursystem erkannt, das Reparatur nach dem Mechanismus der Nukleotid-Exzision (unterschiedlich zu Basen-ExzisionsReparatur) betreibt. Knippers, Abb. 9.22 Nukleotid-Exzisions-Reparatur von UVSchäden bei Bakterien: (1, 2) Ein Komplex aus den Proteinen UvrA und UvrB erkennt den zu reparierenden Bereich z.B. ein ThyminDimer. (3) ATP Hydrolyse führt zur Freisetzung von UvrA. UvrB markiert den geschädigten DNA-Bereich. (4) Dann wird der problematische Strang durch eine Endonuklease (UvrC) geschnitten: Der UvrBC Komplex schneidet die DNA 5‘-wärts und 3‘wärts vom DNA-Schaden. (5) Der Einzelstrang wird dann durch eine Helikase (UvrD) abgetrennt. (6) Die eigentliche Korrektur beinhaltet wieder DNA-Polymerisation und Ligation. Knippers, Abb. 9.23 Eukaryonten Zuvor haben wir gesehen, dass Defekte der Mismatch Reparatur mit der Krankheit “Hereditäres nicht-polypöses Colonkarzinom (HNPCC) = LynchSyndrom“ assoziiert sind. Bei der Krankheit Xeroderma pigmentosum ist das Nukleotid-ExzisionsReparatur-System betroffen. Im einzelnen sind verschiedene Gene für die an diesem Reparatur-Weg beteiligten Proteine betroffen. Die Patienten sind extrem UV-empfindlich und bekommen meist früh in ihrem Leben Hautkrebs. Xeroderma pigmentosum UV-Licht verursacht DNA Schäden in Epidermiszellen. Es entstehen CyclobutanPyrimidin Dimere, die normalerweise über das das Nukleotid-Exzisions-ReparaturSystem repariert werden. Bei der vererbbaren Krankheit Xeroderma pigmentosum sind Gene des Nukleotid-Exzisions-Reparatur-System (NER) mutiert. Dies führt zur Reduktion oder zum Ausfall des NER. Die nicht-reparierten DNA-Schäden führen zu Mutationen, d.h. auch zu einer Veränderung von kodierenden Bereichen des Genoms. Mutationen in Tumor-Supressor-Genen (e.g. p53) oder Proto-Onkogenen führen dann zu Hautkrebs. Vergleich Basen-Exzision Reparatur mit Nucleotid-Exzision Reparatur Basen-Exzision Reparatur: Dieser Mechanismus ist verantwortlich für die Reparatur von endogenen DNA-Schäden, die durch Hydrolyse, Hydroxyl-Radikale oder Methylierung entstehen. Im Zentrum des Geschehens stehen das Ausschneiden der geschädigten Base durch eine Glykosylase und das Schliessen der so entstandenen AP-Stelle. Nur eine Base wird ersetzt. Nucleotid-Exzision Reparatur: Dieser Mechanismus tritt in Kraft, wenn DNA-Schäden zu grösseren Verzerrungen der DNA-Helix führen (polycyclische Kohlenwasserstoffe, UV). Dann erfolgt die Nucleotid-Exzision Reparatur, bei dem ein grösserer Einzelstrangbereiche (12 Nukleotide) ersetzt wird. Beide Mechanismen setzen unterschiedliche Enzyme ein. Reparatur von Doppelstrangbrüchen Auf 3000 Basenschäden kommen etwa 1000 Einzelstrangbrüche und 40 Doppelstrangbrüche. Die Reparatur von Einzelstrangbrüchen wird durch den intakten Partnerstrang geleitet, der als Matrize für die Neusynthese dient, ähnlich wie bei der Reparatursynthese nach einer Nucleotid-Exzision Reparatur. Warum sind Doppelstrangbrüche überhaupt interessant? Doppelstrangbrüche werden als Veränderungen von Chromosomenstrukturen sichtbar (Inversion; Translokationen, dizentrisches Chromosom). Doppelstrangbrüche haben demnach schwerwiegende Folgen für die Funktion und Struktur des menschlichen Genoms. Reparatur von Doppelstrangbrüchen erfolgt entweder über homologe Rekombination oder über End-zu-End-Verknüpfung. Die BRCA-1/2-Gene codieren für Proteine, die an der Reparatur durch homologe Rekombination beteiligt sind. Wenn sie mutiert sind, besteht eine erbliche Prädisposition für Brustkrebs. Exonucleasen und auch in Säugern! Ligase IV und XRCC4 Knippers, Abb. 9.27 Die Produkte von BRCA1 und BRCA2 (Tumor-Suppressor-Gene) interagieren mit und regulieren Rad51 (das menschliche Homologe zu RecA (kommt später noch)). BRCA2 reguliert die intrazelluläre Lokalisation und die DNA-Bindung von Rad51. Die Funktion von BRCA1 ist weniger verstanden. BRCA1 hat Funktionen in: DNA damage repair: interagiert mit Rad51, Ubiquitinierung, Regulation der Transkription und weitere Funktionen. Mutationen sind dominant. Eine BRCA Mutation (1 in 800 Personen) bedeutet, dass die betroffenen Person ein erhöhtes Risiko hat entweder Brust- oder Eierstockkrebs zu bekommen. Im Fall von BRCA-1 und BRCA-2 Mutationen: 36-85% der Träger entwickeln Brustkrebs und 16-60% Eierstockkrebs. Welche Möglichkeiten zur Früherkennung gibt es: Die BRCA1 und BRCA2 Gene sind je über 80,000 bp lang. Über 600 Mutationen sind in jedem Gen bekannt, die das Brustkrebsrisiko erhöhen können. Viele der Mutationen sind spezifisch für eine bestimmt Familie. Bestimmte Mutationen sind jedoch für eine Personengruppe spezifisch: z.B. Jüdische Bevölkerungsgruppe, Personengruppen in Island, Dänemark und den Niederlanden. Rekombination Austausch von DNA-Anteilen zwischen DNA-Doppelsträngen. 1. Allgemeine oder homologe Rekombination: Austausch von Abschnitten zwischen zwei DNA-Doppelsträngen gleicher oder ähnlicher Sequenz (z.B. als Reparaturmechanismus, im Verlauf der meiotischen Zellteilung als Mechanismus für genetische Diversität in einer Population, bei der Herstellung von „knock-out“-Mutanten in Modellorganismen wie Hefe oder Maus). 2. Integrative Rekombination: Einbau eines DNA-Moleküls in ein anderes (z.B. Transposition von beweglichen genetischen Elementen, Einbau eines Virusgenoms ins Wirtsgenom). Wesentliche Aspekte der homologen Rekombination: - räumliche Nähe der DNA (bedingt durch den synaptonemalen Komplex) - Strangbrüche - Basenpaarung mit dem homologen Partnerstrang - kovalente Verknüpfung der überkreuzten Stränge erzeugt die Holliday-Struktur - Bewegung der Überkreuzungsstruktur - Einzelstrangschnitte und Verknüpfung: (A) ausgetauschte Doppelstrangbereiche und „Heteroduplex“-Bereich (= Crossover) oder nur (B) „Heteroduplex“-Bereich. Heteroduplex kann mehrere 1000 bp betragen. Knippers, Abb. 8.9 (A) (B) Elektronenmikroskopische Darstellung der offenen Form der Holliday-Struktur. nur „Heteroduplex“ Bereich Holliday-Struktur: Die beiden verschiedenen, möglichen Ergebnisse der Auflösung hängen davon ab, in welcher isomeren Form die Holliday-Struktur im Moment der Auflösung vorliegt. Crossover Isomerisierung Der Name Isomer ist von Iso (ίσος, isos, griech.. = gleich) und meros (μέρος, griech. = Teil) abgeleitet. Isomere sind chemische Verbindungen der gleichen Summenformel, aber unterschiedlicher chemischer Struktur. Enzyme der Rekombination Beispiel E.coli Ursprünglich (1965 durch Clark und Margulies) wurden die Gene als E. coli Mutanten identifiziert, die Donor-DNA nicht in das Genom einbauen können. Die rekominationsdefekten Mutanten erhielten die Bezeichnung RecA, RecB, RecC, RecD usw. Erst später wurden die Gene und die Genprodukte identifiziert und die Eigenschaften der kodierten Proteine untersucht. Besonder interessant ist das RecA Protein, das an allen Rekombinationsvorgängen beteiligt ist. Die Rekombinationsaktivität sinkt ohne aktives RecA Protien auf Werte von 10-4-10-5 im Vergleich zu Wild-Typ E. coli Zellen. Das RecA-Protein (Rad51 ist das menschliche Homologe zu RecA ) RecA besteht aus 352 Amiosäure. In Gegenwart von ATP bindet das RecA Protein an einzelstängige DNA: ein RecA bedeckt 2 Nukleotide. Dann sucht das Protein nach kompl. Abschnitten im Doppelstrang-DNASubstrat und nimmt Kontakt mit homologer DNA auf. Das RecA Protein entwindet teilweise den homologen Teil der dsDNA, so dass sich die ersten Basenpaarungen zwischen dem ankommenden Einzelstrang und dem komplementären Strang der EmpfängerDNA ausbilden können. Im nächsten Schritt windet sich die Einzelstrang DNA um den Komplementärstrang im Empfänger-DNA Molekül, wobei sich eine normale Doppelhelix ausbildet. Dieser Prozess setzt sich fort, bis der gesamte Einzelstrang übertragen ist. RecA-ATP sitzt fest auf der DNA, aber für den Strangaustausches wird ATP Hydrolyse benötigt. RecA bildet Multimere aus. Das RecA Filament wickelt sich um die DNA Helix mit 6 Molekülen pro Umdrehung (12 Basenpaare). Das RecA-Protein und seine Homologe vermitteln die Basenpaarung zwischen einem DNA-Einzelstrang und der homologen Region auf einer DNADoppelhelix. Das RecA-Protein tauscht die Stränge unter ATP-Verbrauch aus. Erkennung der homologen Bereiche Start: RecA interagiert mit ssDNA und dann mit dsDNA Einzelstrang-Bereiche und das RecBCD-Enzym RecBCD besteht aus drei Untereinheiten der E.coli Gene RecB, C und D. Der Komplex hat mehrere Funktionen: - als Helikase entwindet es doppelsträngige DNA von den Enden her unter ATP Verbrauch. - als Exonuclease greift es DNA-Einzelstänge an. Proteine, die die Rekombination durchführen (Bsp. E. coli): In E. coli bereitet der RecBCD-Komplex das Rekombinationsereignis durch Entwinden des Doppelstrangs (Helicaseaktivität) und Exonuclease-Aktivität (erzeugen eines überhängenden Einzelstrangs) vor. Dann kann das RecA-Protein binden. Chi: cross over hot spot instigator: 1000 Chi Seq. im E.coli Genom. 1. Das RecBCD-Enzym entwindet einen DNA-Strang und stellt schließlich einen Einzelstrang-Zweig her, an den sich das RecA-Protein bindet. 2. Der RecA-beladene Einzelstrang nimmt den Kontakt mit der komplementären Nukleotid-Folge in einem homologen DNA-Molekül auf, wo dann Strangaustausch und Ausbildung der Holiday-Struktur erfolgen. Branch Migration und das RuvAB-Protein Das aktive RuvA-Protein ist ein Tetramer, das sich mit hoher Affinität an Holliday-Strukturen bindet, als Voraussetzung für die Anlagerung von RuvB, einem Hexamer. RuvB bildet ein Ring aus, in dessen Öffnung die Doppelstrang-DNA passt. Unter Verbrauch von ATP wird die DNA so gedreht, dass der Prozess der Branch Migration vorangetrieben wird. RuvB Auflösung der Holliday-Struktur durch RuvC RuvA und RuvB sind für das Wandern der Überkreuzungsstelle in E.coli wichtig. RuvC bindet mit hoher Affinität an die Holliday-Struktur und löst diese durch Schneiden von zwei Strängen auf. Nach Ligation liegen die neuen DNA-Doppelstränge vor (überkreuzt oder nicht). Reparatur eines Doppelstrangbruchs durch Homologe Rekombination 1. Strangbruch 2. RecBCD (Helicase und Exonuclease) erzeugt 3’ Einzelstrand DNA. 3. RecA: Strangaustausch und Ausbildung der Holiday-Struktur. 4. RuvAB: branch migration. 5. RuvC: bindet mit hoher Affinität an die Holliday-Struktur + Endonuclease. 6. Ligase - Rekomb. abgeschlossen. 1 2 3 4 5 6 Wie können Mutationen zur Entstehung von Krebs führen? Welches sind die Krebszellen? Eigenschaften von Krebszellen: - ignorieren Wachstumskontrolle vermeiden Selbstmord (Apoptose) sind genetisch instabil verlassen ihr Stammgewebe wachsen in fremden Geweben Die Entstehung eines Tumors ist ein Mikroevolutionsprozess, in dessen Verlauf die Zellen diese Eigenschaften aufgrund von mehreren Mutationsereignissen erwerben. Eine höhere Mutationsrate begünstigt diesen Prozess. Kategorien von Proteinen, die in mutierter Form zur Tumorentstehung beitragen können: - Wachstumsfaktoren (I) - Rezeptoren für Wachstumsfaktoren (II) - Proteine der Signaltransduktion (III) - Transkriptionsfaktoren (IV) - anti-Apoptose-Proteine (V) - Zellzyklus-Kontroll-Proteine (VI) - DNA-Reparatur-Enzyme (VII) Beachte, dass Kategorie (VII) das Auftreten von allen anderen Kategorien begünstigt!!! Ein Onkogen ist ein mutiertes Gen, das durch seine Überaktivität dazu beiträgt, dass eine Zelle sich in Richtung Tumorzelle entwickelt. Die normale Version eines solchen Gens bezeichnet man als Proto-Onkogen: Beispiel GTPase Ras Ein Tumor-Supressor-Gen ist ein Gen, dessen Verlust die Entwicklung der Zelle zur Tumorzelle begünstigt. Beispiel: p53. Onkogene sind dominant. Mutationen in Tumor-Supressor-Genen sind in der Regel rezessiv. Ras: kleine GTPase Zuerst gefunden bei: Harvey (das HRAS Oncogen) und Kirsten (KRAS) Sarcoma Virus: vRas Menschliches Protooncogen c-Ras: H-Ras, N-Ras and K-Ras Phosphat-Bindeloop Konstitutiv-aktives Ras (Oncogen) trägt dominante Mutationen und führt zur Krebsentstehung: 20-25% aller menschlichen Tumore haben ein mutiertes Ras Gen. Mutationen, die die GTP Hydrolyse verhindern: a) G12 im P loop - GAP funktioniert nicht mehr. Ras ist immer an. b) Q61: wichtig für die Hydrolyse von GTP zu GDP. Ras ist immer an. DxxG trägt zur GTP Bindung und Hydrolyse bei. p53 - Tumorsuppressor TP53 Gen auf Chromosom 17, 393 Aminosäuren 7 Domänen: a) N-terminal Transaktivationsdomäne b) AD2 - wichtig für die apoptotische Funktion c) DNA-Bindedomäne d) NLS e) Homodimerisierungsdomäne f) C-terminale Domäne - Regulation Mutationen, die zur Tumorentstehung beitragen, inaktivieren im allgemeinen die DNA-Bindedomäne. p21 WAF1/CIP1 (Cdk Inhibitor), GADD45, WIP1, mdm-2, PCNA, Cyclin D1, Cyclin G, TGFalpha und 14-3-3, .....
