EBV

Herpesviren II
Bettina Kempkes
Helmholtz Zentrum München (HMGU)
23.5. 2011
Herpesviren: Strukturmerkmale
4. Hüllmembran
mit Gykoproteinkomplexen (12-14 Proteine)
3.Tegument (HSV: 23 virale/49 zelluläre Proteine)
1. lineares Genom
DNA Doppelstrang
und
Coreproteine
2. Kapsid
(HSV: 8 virale Kapsid
und Kapsid-assoziierte Pr.)
Herpesviridae:
Gemeinsamkeiten
Biologische Merkmale
1. virale Enzyme :
DNA Metabolismus (Thymidinekinase; Thymidylatesynthase;
Ribonukleotidkinase)
DNA Synthese (DNA Polymerase, Helikase
Prozessierung von Proteinen)
2. Subzelluläre Kompartimentierung
Kern:
Virale DNA Replikation und Kapsid Assemblierung
Zytoplasma/ER:
Morphogenese des Virion
3. Virusproduktion
führt zum Tod der Zelle
4. Lebenslange Latenz
Zirkuläres Genom
Reaktivierung im natürlichen Wirt
("Das Virus verbleibt (persistiert) im Wirt.
Es gibt jedoch Phasen oder infizierte Zellpopulation,
in denen das Virus nicht mehr nachgewiesen werden
kann.")
8 humanpathogene Herpesviren
Herpes-Simplex Virus (HSV) 1+2
(HHV 1/2)
Varizella-Zoster Virus (VZV)
(HHV 3)
Epstein-Barr Virus (EBV)
(HHV 4)
Cytomegalovirus (CMV)
(HHV 5)
Humanes Herpesvirus 6 A/B
(HHV 6)
Humanes Herpesvirus 7
(HHV 7)
Kaposi Sarkom assoziiertes Herpesvirus (HHV 8)
Tierpathogene Herpesviren
(Auswahl)
•
Bovines Herpesvirus Typ1**
(α)
•
Bovines Herpesvirus Typ2
(α)
•
•
•
Bovines Herpesvirus Typ3
Equine Herpesvirus Typ 1
Porcine Herpesvirus *Typ1
(γ)
(α)
(α)
•
•
•
•
•
Feline Herpesvirus
Kanine Herpesvirus
Porcine Zytomegalovirus
Murine Zytomegalovirus
Galline Herpesvirus **(Typ1)
(α)
(α)
(β)
(β)
(α)
•
Galline Herpesvirus (Typ2)
(α)
infektiöse Rhinotracheitis/genitale
Manifestationen mit breiter Symptomatik
ulzerative Entzündung der Euter,
Übertragung u.a. durch Fliegen
bösartiges Katarrhalfieber
Aborte
Pseudorabiesvirus*/ Aujeszkysche Krankheit
Übertragung auf Hunde/Katzen und Rinder möglich
Katzenschnupfen
Welpensterben
Schäden des ZNS, hohe Mortalität
Wichtiges CMV Modell
infektiöse Laryngotracheitis mit hoher Morbidität und
Mortalitätund hohen wirtschaftlichen Verlusten
(Hühner/Enten/Schwäne)
Mareksche Krankheit mit hoher Morbidität und
Mortalitätund hohen wirtschaftlichen Verlusten
Infektion und Transformation von T-Lymphozyten
Virusintegration
* DIVA Impfstoffe
(differentiating between infection and vaccination)
** attenuierten Lebendimpfstoff
DNA Replikation im Zellkern
(Latenz oder Lytische Replikation)
RE
DE
E
TGNLYTISCHE REPLIKATION ?
LATENZ oder
Das virale Genom zirkularisiert.
LATENZ:
virus- und gewebespezifische eingeschränkte Genexpression
LYTISCHE REPLIKATION:
Kaskade
TGN der viralen Genexpression
immediate early: Transaktivatoren
(delayed) early: Enzyme für virale DNA Synthese
Lytische Replikation
late: Strukturproteine (Kapsid-, Tegument und Hüllproteine)
Prozessierung und Verpackung der linearen viralen Genome in
Kapside.
Herpesviren
Antivirale Therapie
• Chemotherapie
• (Zytokinbehandlung)
• Adoptive Immuntherapie
Latente oder lytische DNA Replikation
oriLyt
oriLyt
TR
TR
Latente Replikation
(zell. DNA Polymerase)
oriP
oriP
TR
oriP
oriP
oriP
TR
TR
TR
Lytische Replikation
virale DNA Polymerase
und virale Kofaktoren
TR
TR
TR
oriLyt
Azyklische Nukleosidanaloga
(Azyklische Zucker)
Acycloguanosin
Famiciclovir (Pro-Drug)*
Ganciclovir
Birivudin
Cidovir
Analogon
virale Thymidinkinase**
Guanosin
+
Guanosin
+
Guanosin
virale
Uracil
+
Monophosphat Cytosin
zelluläre Kinase
zelluläre Kinase
+
* verbesserte Bioverfügbarkeit
** Entwicklung
von Resistenzen
Reduktion oder Verlust der
Thymidinkinase
oder
Verlust der
Substratspezifität für
Azyklische
Nukleosidanaloga
Molekulare Virologie 3. Auflage Modrow et al.
Principles of Virology 3. Auflage Flint et al.
Chemotherapie
• Nucleosidanaloga
Beispiel:
Acycloguanosin
ACG
Gertrude Elion
Nobelpreis 1988
Nicht-nucleosidische Hemmstoffe
Pyrophosphatanalog: Foscarnet
bindet an die Pyrophosphatbindestelle der viralen DNA Polymerase
Forscarnet
Phosphoameisensäure
Resistenzen: Aminosäureaustausche in der viralen DNA Polymerase
Molekulare Virologie 3. Auflage Modrow et al.
Nucleosidanalogon
Trifluridin
Trifluormethylthymidin: Substrat der viralen DNA Polymerase
Störungen der helicalen DNA Struktur nach Einbau Direkte Blockade der Polymerisation
(Kinase ?)
Fomivirsen:Antisense-Oligonucleotid zur spezifischen Blockade der
Expression von "immediate early genes" des CMV
phosphorothioate 5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3'
CMV retinitis: intraocular injection in a concentration of 6.6 mg/mL
ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept.
1996, p. 2004–2011 Vol. 40, No. 9
Inhibition of Human Cytomegalovirus Immediate-Early Gene
Expression by an Antisense Oligonucleotide
Complementary
to Immediate-Early RNA
KEVIN P. et al.
HSV-1 Latenz
Latenz: Virale Proteine werden nicht exprimiert.
Epigenetische Modifikationen des Genoms verhindern die Expression lytischer Gene
und entziehen die infizierten Zellen der Immunkontrolle durch Virus-spezifische B- und T-Zellen.
Epithelzelle:
Replikation
Nervenzelle:
Latenz (LAT RNA Expression)
Reaktivierung
Virale Mimikry und virale Piraterie
• Mimikry (Funktionelle Konvergenz/Analoge)
– CD40/LMP1
– B-Zellrezeptor/ LMP2A
– Notch-Signaltransduktion/EBNA-2
• Piraterie (Homologe)
– "primordial genes or domains" ( evolutionär alt z. Bsp
aus Bakteriophagen)
– Wirtsgene oder Domänen aus Wirtsgenen (häufig
fehlen Introns/ retrovirale Übertragung?)
(Beispiele:
virale IRFs aus KSHV
virales Interleukin 10)
Immune Evasion der Herpesviren
"Immunsystem-Umgehungsstrategien"
Angriffsmöglichkeiten:
•
Angeborenes Immunsystem
- Effektorzellen (Makrophagen, Monozyten, Dendriten,
Granulozyten, Natürliche Killerzellen)
- Zellautonome Syteme
Interferone (α,β) und Zytokine
•
Adaptive Immunsystem
- Humorale Immunantwort
B-Zellen
- Zellvermittelte Immunantwort
Antigenpräsentation
T-Zellen
(γ-Interferone)
Lymphozyten
Humorale Immunantwort
B-Zelle
Zellvermittelte (restringierte) Immunantwort
T-Helferzelle - MHC I
T-Killerzelle – MHC II
EBV infiziert und immortalisiert primäre B-Zellen in vitro
Proliferative Latenz (Latenz III)
LMP-2B p
LMP-2A p
Cp
EBNA-3A/B/C
LMP-2A/B
LMP-1
EBV Nuclear Antigen
Latent Membrane Protein
EBNA-2
EBNA-LP
EBV
EBNA-2
C BF1 (C-promoter binding)
S u(H) (Suppressor of hairless)
L ag-1 (C.elegans)
EBNA-1
EBNA-3
C
B
RBP-Jk/RBP-J/Jk/RBP
(recombination signal binding protein kappa)
A
CSL/CBF1
Die B-Zelle: Aktivierung und Differenzierung
Activation of naive B cells
by antigen
Germinal center reaction
Memory B cell
Plasma cell
EBV:
Latente Transkriptionsprogramme
Latent reservoir in vivo: memory B cells
"Latency in vivo"
Lytic reactivation in plasma cells
EBV associated
diseases
of B cell origin
Type III:
EBNA-1
EBNA-2,-3A,-3B,-3C,LP
LMP-1,LMP2A/B
Type III:
Post-Transplant-Lmphoma
AIDS ass. B cell Lymphoma
Infectious Mononucleosis
Type II:
EBNA-1
LMP-1, LMP2A/B
Type II:
Hodgkin's disease
Type I
EBNA-1
Type I:
Burkitt's lymphoma
Type 0
The CSL protein CBF1
Corepressor
RHR-C
CBF1
C/GTGGGAA
ubiqitously expressed
RHR-N
ßC4
highly conserved in evolution
tissue differentiation and development
sequence specific DNA binding factor
recruits co-repressor activity
Beta-trefoil (BTD)
CSL structure: Kovall et al., 2004
The Notchpathway:
CSL/CBF1 signalling
in cells infected with γ-herpesviruses
Coactivator
Notch
CBF1
Notch
Corepressor
C/GTGGGAA
C/GTGGGAA
Notch/CBF1 signalling
MAM-L1
CBF1
Coactivator
EBNA-2
CBF1
?
EBV:
Herpesviral
protein
?
Corepressor
?
CBF1
?
C/GTGGGAA
EBNA-3A/C
?
CBF1
C/GTGGGAA
Herpesviral CBF1 signalling
KSHV:
vIRF/RTA/LANA
CBF1
C/GTGGGAA
Das virale Protein LMP2A aus EBV und der B-Zellrezeptor Komplex
rekrutieren die Kinasen Lyn und Syk über ITAM Motive
Abberante Konstitutive Aktivierung
Ligand-vermittelte Aktivierung
Thorley-Lawson 2001
Kanonischer und alternativer NFkB Signalweg werden in Tumoren häufig dereguliert
Jost und Ruland 2007
Das virale Protein LMP1 des EBV und der Ligand-aktivierte CD40 Rezeptor
aktivieren ähnliche Signalwege und in der Folge kommt es
auch zur Aktivierung der Transkription ähnlicher Zielgene im Kern
Ligand-vermittelte Aktivierung
Abberante Konstitutive Aktivierung
AS1
LMP1
CD40
Plasmamembran
AS 193
AS187
AS 24
NH2
verschiedene Adaptoren
aus der TRAF Familie
Zytoplasma
Kanonischer NFkB Signalweg
p65
Alternativer NFkB Signalweg
p50
RelB
FOS
Jun
AP-1 aktivierte Gene
Kern
p52
MAP- Kinase Signalweg
ATF2
Elk-1
verändert aus Cornelia Hömig (Dissertation)
Adoptive Immuntherapie:
Zellbasierte Krebstherapie am Beispiel EBV assoziierter Erkrankungen
(Post-Transplantlymphome, Morbus Hodgkin)
Vor der Transplantation: Patient oder Knochenmarksspender (EBV pos.)
ex vivo:
Peripheres Blut
+
B-Zelle
*
** *
*
EBV
Expansion EBV
infizierter B-Zellen in vitro
T-Zelle
Nach der Transplantation:
Ko-Kultur mit T-Zellen
Expansion EBV
spezifischer T-Zellen
Das latente KSHV Genom
Latente Gene: LANA1, v-Cyclin, v-FLIP, Kaposin, miRNAs (vIRF3)
virale Piraterie lytischer und latenter Gene
Reaktive Entzündung oder neoplastische Veränderung
Zelluläre Heterogenität des Kaposi Sarkoms (Spindelzellen und zelluläres Infiltrat)
Hämatoxylin und Eosin
vGPCR
K1
K15
vIL-6
Die Spindelzelle
Lytischer oder abortiv lytischer
Lebenszyklus
Parakrine Stimulation
der latent infizierten Nachbarzelle
Angiogenese
Entzündungsmediatoren
KSHV Proteine
LANA
Latenter
Lebenszyklus
vCyclin
Inhibition von p53 abh. Apoptose
Zellzyklusregulation
LANA
vCyclin
Cyclin abhängige Kinasen (CDKs) werden von Cyclinen aktiviert und von
spezifischen Inhibitoren (CKIs) kontrolliert.
Das Retinoblastoma Protein (Rb) inhibiert die Aktivierung von E2Fregulierten Genen im hypo-phosporyliertem Zustand.
Die Rb Phosphorylierung führt zur Auflösung des Rb/E2-F Komplexes.
Der Transkriptionsfaktor E2-F aktiviert die Transkription.
cyclin
cdk
P
P
Rb
Rb
E2-F
AN.
AUS
E2-F
Gene des
S-Phaseneintritt
v-cyclin wird in latent mit KSHV
infizierten Zellen exprimiert.
CKIs der INK Genfamilie
p15
p16
p18
p19
Boshoff und Weiss, 2002
KSHV Blockade der A) Induktion der Immunantwort
B) Interferon Wirkung
(Expression antiviraler Proteine)
Plasmamembran
KSHV Proteine
Kern
Interferon Regulatory Factor (IRF)
Coscoy 2007
Anti-apoptotische Proteine
des KSHV:
vBCL-2 blockiert BAX/BAC vermittelten Cytochrom C Ausstrom
vFLIP aktiviert NF-kB Signaltransduktion
vIAP blockiert die Aktivierung der Effektor-Kaspasen
P. Krammer et al., 2007
Immune Evasion CMV
Antigenprozessierung und Antigenpräsentation im Komplex mit MHC Klasse I Proteinen
hCMV
Proteasom
T-Killerzelle
Transporters Associated
with Antigen Processing
(TAP)
T-Zellrezeptor
CD8
MHC Klasse I
ER
Virusinfizierte
Zielzelle
MHC Klasse I
Peptid-beladen
Reddehase (2002)
Zelllyse
a) US6 blockiert TAP-vermittelten Transport von Peptiden ins ER (Early und Late)
b) US3: MHC Klasse I Moleküle werden im ER zurückgehalten (Immediate Early)
c) US11: US2: Rücktransport von MHC Klasse I und Degradation im Zytoplasma
(Early)
MCMV: Antigenprozessierung und Antigenpräsentation durch MHC Klasse I Moleküle
a) m04 (E/L) eskortiert nicht funktionelle/modifizierte MHC Klasse I Moleküle
an die Plasmamembran
b) m06 (E): lysosomale Degradation von MHC Klasse I und Antigen
c) m152 (E): Retention von Antigen beladenen MHC Klasse I Molekülen im ER
mCMV
T-Killerzelle
T-Zellrezeptor
CD8
MHC Klasse I
Natürliche
Killerzelle
Killer
Inhibitorischer
Rezeptor (KIR)
MHC Klasse I
Virusinfizierte
Zielzelle
Zelllyse
Virusinfizierte
Zielzelle
Proteasom
ER
GOLGI
Blockade der Zelllyse
Reddehase (2002)
Herpesvirus Saimiri (HVS)
Saimiri sciureus
•
γ2-Herpesvirus, apathogen im natürlichen Wirt, Übertragung durch
Speichel, lebenslange Persistenz
•
HVS kann aus dem peripheren Blut infizierter Tiere durch Kokultur
gewonnen werden
•
Akute T-Zelllymphome in anderen Affenspezies (Tamarin,
Krallenaffen)
•
Langzeitproliferation humaner T Zellen
Herpesvirus Saimiri (HVS)
Transformations-assoziierte Membranproteine des HVS regulieren
NF-kB, MAPK, STAT, Lck Signalwege
Saimiri sciureus
Murine γ-Herpesvirus 68 (MHV68)
ein Tiermodell für γ-Herpesviren (EBV und KSHV)
• natürlicher Wirt: Waldmaus und Rötelmaus
• Übertragung: Experimentell durch
Tröpfcheninfektion (intranasal) in
Labormausstämmen
• Infektiöse Mononukleose und Splenomegalie
• Lebenslange Latenz in B-Zellen
• Anerkanntes Modell für Etablierung von Latenz
aber als Tumormodell umstritten
Zeitverlauf der MHV 68 Infektion und der Virus-spezifischen
Immunantwort
A
Virus-Titer
Lytisches Virus
Latentes Virus
Zeit nach Infektion
CD8+ T-Zellen
B
Vβ4+CD8+
CD8+
Splenomegalie,
Antikörper
Zeit nach Infektion
C
Polyklonale
Antikörper
Virusspezifische
Antikörper
Splenomegalie
Zeit nach Infektion
Herpesviren Vorlesung
•
•
•
•
Principles in Virology Hrsg. Flint, Enquist, Racaniello, Skalka (2009)
Medizinische Virologie Hrsg. Doer, Gerlich (2010)
Molekulare Virologie Hrsg. Modrow, Falke,Truyen,Schätzl 3. Auflage (2010)
Fields Virology Hrsg. Knipe, Howley Band 2 (2007)
•
Zahlreiche Folien aus: Virologie Vorlesung LMU (Medizinische Fakultät)
Bettina Kempkes
Hämotologikum
Helmholtz Zentrum München
Marchioninistr. 25
81377 München (Großhadern)
[email protected]