Synthese der α-Ketosäure von Uracil Polyoxin C

Verena Schenk
Synthese der α-Ketosäure von Uracil Polyoxin C
DIPLOMARBEIT
zur Erlangung des akademischen Grades
einer Diplom-Ingenieurin
der Studienrichtung Technische Chemie
erreicht an der
Technischen Universität Graz
Dipl.-Ing. Dr.techn. Assoc.Prof. Tanja Wrodnigg
Institut für Organische Chemie
Technische Universität Graz
2010
Meinen Eltern
Deutsche Fassung:
Beschluss der Curricula-Kommission für Bachelor-, Master- und Diplomstudien vom 10.11.2008
Genehmigung des Senates am 1.12.2008
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG
Ich erkläre an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst, andere als die
angegebenen Quellen/Hilfsmittel nicht benutzt, und die den benutzten Quellen wörtlich und
inhaltlich entnommene Stellen als solche kenntlich gemacht habe.
Graz, am ……………………………
………………………………………………..
(Unterschrift)
Englische Fassung:
STATUTORY DECLARATION
I declare that I have authored this thesis independently, that I have not used other than the
declared sources / resources, and that I have explicitly marked all material which has been
quoted either literally or by content from the used sources.
……………………………
date
………………………………………………..
(signature)
Danksagung
In erster Linie möchte ich Frau Professor Tanja Wrodnigg und Herrn Professor
Arnold Stütz für die Aufnahme in die Glyco-Group, in der ich sehr viel lernen konnte
und ein tolle Zeit verbracht habe, danken. Weiters danke ich ihnen für die jahrelange
Unterstützung. Sie standen mir jeder Zeit bei chemischen Fragen mit Rat und Tat zur
Seite, kümmerten sich aber auch um meine gelegentlichen Motivationstiefs während
der Diplomarbeit, wenn wieder von vorne begonnen werden musste. Ganz
besonders dankbar bin ich Frau Professor Tanja Wrodnigg für die großartige
Betreuung.
Ich möchte mich auch herzlich bei den anderen Mitgliedern der Glyco Group,
Katharina Gallas, Uwe Groß, Gerit Pototschnigg, Florian Adanitsch, Georg Schitter,
Martin Thonhofer und Patrick Kosmos, für die gute Zusammenarbeit und
gegenseitige Unterstützung bedanken. Besonderer Dank kommt hier meiner
Laborkollegin und Freundin Kathi zu, die mich immer wieder geduldig zur
Weiterarbeit ermunterte und mit der ich trotz einiger „chemischer“ Rückschläge sehr
viel Spaß im Labor hatte.
Weiters danke ich allen Mitarbeitern des Instituts für Organische Chemie unter der
Leitung von Professor Rolf Breinbauer für die schöne Zeit und besonders Carina
Illaszewicz-Trattner und Professor Jörg Weber für die Aufnahme der NMR-Spektren,
und Dipl.-Ing. Harald Stecher für analytische Hilfestellungen.
Herrn Professor Peter Macheroux danke ich für die Themenstellung und die
Finanzierung und Dipl. Ing. Alexandra Binter für die hilfreichen Diskussionen.
Vor allem möchte ich mich bei meiner Familie bedanken, bei meinen Eltern für die
finanzielle und moralische Unterstützung sowie ihre Liebe und Geduld und bei
Alexander und Dorith für die anregenden Gespräche, ihre Freundschaft und
Unterstützung.
Abstract
Nikkomycins belong to the group of peptidyl nucleosides and have been isolated
from Streptomyces tendae strains. These structures are known as potent competitive
inhibitors of chitin synthase, a key enzyme in the chitin biosynthesis pathway of fungi
and insects. Chitin synthases are absent in mammals and therefore are attractive
targets for potential antibiotics1.
Genomic approaches as well as the elucidation of biosynthetic pathways of natural
antibiotics accelerate the progress of designing potential antibacterial agents. In the
case of nikkomycins, however, only a few steps of their biosynthesis have been
identified thus far2, 3.
In this Diploma thesis the synthesis of the 5’-oxo derivative of uracil polyoxin C will be
developed. This α-keto acid will be employed for the elucidation of the role of
aminotransferase NikK.
1
Cohen, E. Ann. Rev. Entomol. 1987, 32, 71-93.
Lauer, B.; Süssmuth, R.; Kaiser, D.; Jung, G.; Bormann, C. J. Antibiot. 2000, 53, 385-392.
3
Ginj, C.; Rüegger, H.; Amrhein, N.; Macheroux, P. ChemBioChem 2005, 6, 1974-1976.
2
Kurzfassung
Nikkomycine werden von Streptomyces tendae und Streptomyces ansochromogenes
produziert und zählen zu den Peptidnukleosiden. Diese Strukturen sind starke
Inhibitoren von Chitinsynthase, einem Schlüsselenzym bei der Chitinbiosynthese von
Pilzen und Insekten. Die Chitinsynthase kommt in Säugetieren nicht vor und bietet
deshalb eine gute Angriffsposition für mögliche Antibiotika1.
Für
die
Synthese
neuer
antibakterieller
Reagenzien
ist
es
wichtig,
den
Biosyntheseweg der natürlichen Antibiotika zu kennen, allerdings sind im Fall der
Nikkomycine bis jetzt nur wenige Details der Biosynthese aufgeklärt2, 3.
In
dieser
Diplomarbeit
soll
ein
Syntheseweg
für
die
α-Ketosäure
von
Uracil Polyoxin C erarbeitet werden. Diese α-Ketosäure wird zur Aufklärung der Rolle
von NikK, einer Aminotransferase, bei der Nikkomycin-Biosynthese eingesetzt
werden.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis _____________________________________________ 8
1 Einleitung ______________________________________________________ 9
1.1 Kohlenhydrate ________________________________________________ 9
1.2 Nukleobasen ________________________________________________ 10
1.3 Nukleotide __________________________________________________ 11
1.4 Nukleoside __________________________________________________ 12
1.5 Nukleosid-Antibiotika __________________________________________ 13
1.6 Polyoxine ___________________________________________________ 14
1.7 Nikkomycine_________________________________________________ 21
2 Problemstellung ________________________________________________ 27
3 Durchführung und Diskussion ____________________________________ 29
4 Zusammenfassung______________________________________________ 40
5 Experimenteller Teil _____________________________________________ 42
5.1 Analytik ____________________________________________________ 42
5.2 Darstellung der Produkte _______________________________________ 44
5.2.1 2’,3’-O-Isopropylidenuridin (2) ________________________________ 44
5.2.2 5’-Oxa-2’,3’-O- isopropylidenuridin (3)__________________________ 44
5.2.3 5’-O-t-Butyldimethylsilyl-6’-cyano-2’,3’-O-isopropylidenuridin (19) ____ 45
5.2.4 6’-Oxa-5’-O-t-butyldimethylsilyl-2’,3’-O-isopropylidenuridin (20) ______ 47
5.2.5 6’-Carboxy-5’-O-t-butyldimethylsilyl-2’,3’-O-isopropylidenuridin (21) ___ 48
5.2.6 6’-Carboxy-5’-hydroxy-2’,3’-O-isopropylidenuridin (22) _____________ 49
5.2.7 6’-Carboxy-5’-oxo-2’,3’-O-isopropylidenuridin (6) _________________ 50
5.2.8 6’-Carboxy-5’-oxouridin (12) _________________________________ 51
6 NMR-Spektren__________________________________________________ 52
7 Publikationsliste ________________________________________________ 59
8 Curriculum vitae ________________________________________________ 60
7
Abkürzungen
Abkürzungsverzeichnis
abs.
absolut
[α]D20
spezifischer Drehwert
AZT
Azidothymidin (Zidovudin)
Bu4NF
Tetrabutylammoniumfluorid
DC
Dünnschichtchromatographie
DIBAl
Diisobutylaluminiumhydrid
DMAP
4-(Dimethylamino)-pyridin
DMF
Dimethylformamid
DMP
Dess-Martin-Periodinan
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EE
Essigester
eq
Äquivalent
Et3N
Triethylamin
HIV
human immunodeficiency virus
HMPA
Hexamethylphosphoramid
HPLC
High performance liquid chromatography
HSV
Herpes simplex Virus
LM
Laufmittel
NMR
Kern-Magnet-Resonanz
NRTI
Nukleosidische Reverse-Transkriptase-Inhibitoren
p-mtrityl-Cl
para-Methoxytritylchlorid
pTSA
para-Toluolsulfonsäure
Pyr.
Pyridin
RNA
Ribonukleinsäure
TBDMS-Cl
tert-Butyldimetylsilylchlorid
t-BuOH
tert-Butanol
THF
Tetrahydrofuran
TMSCN
Trimethylsilylcyanid
UDP-GlcNAc
Uridindiphosphat-N-acetylglucosamin
UMP
Uridinmonophosphat
UPOC
Uracil Polyoxin C
8
Einleitung
1 Einleitung
1.1 Kohlenhydrate
Der Begriff Kohlenhydrate bedeutet in seiner ursprünglichen Form „Hydrate des
Kohlenstoffs“, da man dachte, dass alle Saccharide aus den Elementen C, O und H
mit der Bruttoformel Cn(H2O)m aufgebaut sind, wie beispielsweise D-Glucose. Jedoch
trifft diese Formel auf die meisten heute als Kohlenhydrat bezeichneten
Verbindungen nicht zu, da auch andere Heteroatome, wie Stickstoff oder Schwefel,
und mehrere funktionelle Gruppen enthalten sein können. Im Allgemeinen versteht
man unter Kohlenhydraten Polyhydroxyaldehyde (Aldosen) oder Polyhydroxyketone
(Ketosen) mit, üblicherweise, drei bis neun Kohlenstoffatomen.
Kohlenhydrate stellen die wohl größte Gruppe von Naturprodukten neben DNA,
Proteinen und Lipiden dar, und kommen als Monosaccharide, Disaccharide,
Oligosaccharide und Polysaccharide vor. Nach Anzahl ihrer Kohlenstoffatome
werden Monosaccharide als Triosen (C3), Tetrosen (C4), Pentosen (C5), Hexosen
(C6), Heptosen (C7), etc. bezeichnet. Sie stellen die Bausteine von Oligo- und
Polysacchariden dar, und werden über eine glykosidische Bindung miteinander
verknüpft.
1
2
3
Abbildung 1: Bekannte Vertreter von Kohlenhydraten: D-Glucose (1), Cellulose (2),
Chitin (3).
Neben Lipiden und Eiweiß bilden Kohlenhydrate den Hauptbestandteil der
menschlichen Nahrung und spielen eine wichtige Rolle als Energielieferant. Der
Großteil der Biomasse besteht aus Kohlenhydraten, denn jährlich werden von
Pflanzen, Algen und verschiedenen Bakteriengruppen Milliarden Tonnen durch
Photosynthese produziert. Dabei handelt es sich um einen biochemischen Vorgang,
9
Einleitung
bei dem zuerst Lichtenergie in chemische Energie umgewandelt wird. Dies geschieht
mittels lichtabsorbierender Farbstoffe (Chlorophyllen). Die daraus entstehende
chemische Energie wird dann zur Fixierung von Kohlenstoffdioxid genutzt. Dieser
Schritt wird „Calvin Cycle“ genannt. Kohlendioxid und Wasser werden reduziert und
ergeben so Kohlenhydrate und Sauerstoff.
Neben ihrer Funktion als Energiequelle spielen Kohlenhydrate auch noch eine große
Rolle als Gerüstsubstanzen von Pflanzen (Cellulose) und Insekten (Chitin), siehe
Abbildung 1. Außerdem sind sie an vielen biologischen Prozessen, wie der
Zellerkennung
und
der
Zell-Zell-Kommunikation,
beteiligt
und
sind
die
Strukturerkennung der Blutgruppendeterminanten.
Zu der Familie der Kohlenhydrate zählen außer den heterocyclischen Fünf- und
Sechsringen beispielsweise auch Aldite, Aldarsäuren, N-Glykoside, C-Glykoside,
Aldonsäuren, Aldonolactone, Uronsäuren, Inositole, Iminozucker, Carbazucker und
Glykoside4.
1.2 Nukleobasen
Nukleinbasen sind Bestandteile der Nukleotide und Nukleoside. Man unterscheidet
die Pyrimidin-Derivate (Uracil, Thymin und Cytosin), die als Grundgerüst einen
Pyrimidinring besitzen, und die Purin-Derivate (Adenin und Guanin), hier ist der
Grundstoff Purin. Die in der DNA vorkommenden Nukleobasen Adenin (A), Guanin
(G), Thymin (T) und Cytosin (C) werden auch DNA-Basen genannt. Adenin (A),
Guanin (G), Uracil (U) und Cytosin (C) werden, da sie in der RNA vorkommen, auch
als RNA-Basen bezeichnet.
Zu den Nukleobasen zählen noch viele andere Basen, wie Xanthin und Hypoxanthin,
doch bauen diese nicht die DNA oder RNA auf5. In Abbildung 2 sieht man die
häufigsten Nukleobasen.
4
Lindhorst, T. K. Essentials of Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Wiley-VCH, Weinheim,
2007.
10
Einleitung
Abbildung 2: Struktur der Nukleobasen.
1.3 Nukleotide
Nukleotide sind die monomeren Einheiten, die Grundbausteine, aus denen die
Nukleinsäuren aufgebaut werden. Nukleotide besitzen drei charakteristische
Bestandteile, eine Nukleobase, eine Pentose und eine Phosphorsäure. In
Abbildung 3 ist der Aufbau von Nukleotiden schematisch dargestellt. Im Falle der
DNA ist der Zucker die 2-Desoxy-D-ribose und bei der RNA handelt es sich um die
D-Ribose. Nach der Pentoseeinheit benannt, spricht man bei der DNA von
Desoxyribonukleotiden und bei der RNA von Ribonukleotiden. Die Nukleotide
unterscheiden sich weiters durch die stickstoffhaltigen Basen Adenin, Guanin,
Cytosin, Thymin (nur in DNA) und Uracil (nur in RNA), den sogenannten
Nukleobasen. Diese sind mit dem Zucker über eine N-Glykosidbindung verbunden.
Zusätzlich ist die Pentose bei Nukleotiden mit ein bis drei Phosphatgruppen
verestert. Sie kommen also als Monophosphate, Diphosphate und Triphosphate vor.
Die Nukleotide dienen zur Codierung der DNA und der RNA. Die kleinste
Informationseinheit, das Codon, setzt sich aus drei miteinander verknüpften
Nukleotiden zusammen5.
5
Lehninger, A. Biochemie, Verlag Chemie, Weinheim, New York, 1977, 249-268.
11
Einleitung
Abbildung 3: Aufbau der Nukleotide.
1.4 Nukleoside
Nukleoside sind ähnlich aufgebaut wie Nukleotide, nur fehlt ihnen der Phosphatrest.
Sie setzen sich also aus einer Pentose, entweder 2-Desoxy-D-ribose bei der DNA
oder D-Ribose bei der RNA, und einer Nukleobase, Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin
und Uracil, zusammen. Wieder unterscheidet man Desoxyribonukleoside (DNA) und
Ribonukleoside (RNA)5. In Abbildung 4 sind Cytidin und Desoxycytidin als Beispiele
für Nukleoside dargestellt. Nukleoside spielen beispielsweise eine große Rolle als
Antibiotika6.
NH2
NH2
NH2
N
N
HO
CH2
N
O
H
H
O
Cytosin
O
HO
CH2
N
OH
Cytidin
O
O
H
H
H
OH
N
N
H
H
H
H
OH
H
Desoxycytidin
Abbildung 4: Aufbau der Nukleoside anhand des Beispiels mit Cytosin als Base.
6
Isono, K. The Journal of Antibiotics 1988, 41 (12), 1711-1739.
12
Einleitung
1.5 Nukleosid-Antibiotika
Nukleosid-Antibiotika werden als sekundäre Stoffwechselprodukte von einigen
Mikroorganismen produziert. Sie kommen in vielen Strukturvarianten vor und sind
meist sehr komplexe Moleküle mit weitreichenden biologischen Aktivitäten. Sie
wirken unter anderem als Antimykotika, Herbizide, Viruzide, Insektizide und
Antitumormittel, können aber auch gegen Trypanosomen-Erkrankungen eingesetzt
werden und zeigen immunstimulierende, sowie immunsupressive Eigenschaften.
Viele Nukleoside und Nukleotide spielen eine wichtige Rolle bei der Veränderung von
grundlegenden
zellulären
Stoffwechselwegen.
Aufgrund
dessen
stellen
die
Synthesen von Nukleinsäuren, Proteinen, Glycanen und Glycoproteinen die
Angriffspunkte von Nukleosid-Antibiotika dar. Die Nukleosid-Antibiotka besitzen
großes Potential zur Regulierung der Zelldifferenzierung und des Zellwachstums.
Wichtige Vertreter der Nukleosid-Antibiotika sind Polyoxine (siehe Kapitel 1.6) sowie
Nikkomycine
(Kapitel
1.7),
beide
gehören
zu
der
Gruppe
der
6
Peptidnukleosidantibiotika . Wichtig zu erwähnen sind hier auch die nukleosidischen
Reverse-Transkriptase-Inhibitoren (NRTI), das sind Nukleosid-Analoga, die als
Virostatika wirken. Sie inhibieren die Reverse Transkriptase von Retroviren. Dieses
Enzym ist dafür verantwortlich, dass das virale RNA-Genom in DNA umgeschrieben
wird. In Abbildung 5 sind Zidovudin (Azidothymidin, AZT), Lamivudin (3TC) und
Didanosin (ddl) als Beispiele für NRTIs, die sich bei der Behandlung von HIV (human
immunodeficiency
virus)
bewährt
haben,
dargestellt7.
AZT
war
der
erste
Nukleosidinhibitor, bei dem anti-HIV-Aktivität entdeckt wurde8.
Außerdem
zeigt
Abbildung
5
die
Struktur
von
Puromycin,
einem
Nukleosidantibiotikum, das von Streptomyces alboniger9 produziert wird und eine
weitreichende
antibakterielle
Aktivität
aufweist.
Puromycin
hemmt
die
6
Proteinbiosynthese, ist allerdings gegenüber Tieren hoch toxisch . Ferner ist Aciclovir
abgebildet, der Wirkstoff von Zovirax. Zovirax ist wohl eines der bekanntesten
Virostatika und wird als Arzneimittel gegen HSV (Herpes simplex Virus) eingesetzt10.
7
Cihlar, T.; Ray, A. S. Antiviral Research 2010, 85, 39-58.
Mitsuya, H.; Weinhold, K. J.; Furman, P. A.; St. Clair, M. H.; Lehrman, S. N.; Gallo, R. C.; Bolognesi,
D.; Barry, D. W.; Broder, S. National Academy of Sciences of the United States of America 1985, 82
(20), 7096-7100.
9
Vara, J.; Perez-Gonzalez, J. A.; Jimenez, A. Biochemistry 1985, 24, 8074-8081.
10
Champness, J. N.; Bennett, M. S.; Wien, F.; Visse, R.; Summers, W. C.; Herdewijn, P.; de Clercq,
E.; Ostrowski, T.; Jarvest, R. L.; Sanderson, M. R. Proteins: Structure, Function, and Genetics
1998, 32 (3), 350-361.
8
13
Einleitung
Abbildung 5: Vertreter von Nukleosid-Analoga mit antibiotischer und antiviraler
Wirkung.
1.6 Polyoxine
Der Polyoxinkomplex wurde von Isono et al. bei einem Screening-Verfahren, um ein
geeignetes Antibiotikum gegen den phytopathogenen Pilz Pellicularia filamentosa f.
sasakii zu finden, entdeckt11. Dieser Pilz ist der Verursacher der Blattscheidendürre
von Reis. Die Polyoxine werden von Streptomyces cacaoi var. asoensis Stämmen
produziert und zeigen ein hohes Potential als landwirtschaftliche Fungizide. Polyoxin
N wird von Streptomyces piomogenes produziert. Bisher sind viele verschiedene
Polyoxine und Neopolyoxine bekannt. Die Polyoxine A, B, D, E, F, G, H, J, K, L, M
und N sowie die Neopolyoxine A, B und C zeigen alle biologische Aktiviät gegen
phytopathogene Pilze (siehe Abbildung 7), die einzigen Ausnahmen sind die
Polyoxine C und I (Abbildung 8), ihnen fehlt jegliche biologische Aktivität6, 11, 12.
Die biologisch aktiven Polyoxine inhibieren competitiv die Chitinsynthase, ein Enzym,
das für die Biosynthese von Chitin in der Zellwand der Pilze zuständig ist, und stören
11
12
Isono, K.; Asahi, K.; Suzuki, S. J. Am. Chem. Soc. 1969, 91 (26), 7490-7505.
Isono, K.; Suzuki, S. Tetrahedron Letters 1968, 2, 203-208.
14
Einleitung
so die Intaktheit der Pilzzellen, was zum Tod der Pathogene führt. Weder Pflanzen
noch Säugetiere produzieren Chitin, weshalb Polyoxine für sie potentiell ungiftig sind,
und sich zur Bekämpfung von Pilzinfektionen eignen13.
Die Biosynthese von Chitin wird durch Chitinsynthase katalysiert und geht von
N-Acetylglucosamin (UDP-GlcNAc) aus. Polyoxine und Nikkomycine „mimen“
UDP-GlcNAc als dessen Strukturanaloga und inhibieren so die Chitinbiosynthese14.
In Abbildung 6 sind UDP-GlcNAc mit Nikkomycin Z und Polyoxin D als Beispiele für
ähnliche Strukturen dargestellt.
Abbildung 6: N-Acetylglucosamin (UDP-GlcNAc) und seine Strukturanaloga
Polyoxin D und Nikkomycin Z.
13
14
Cesario, C.; Miller, M. J. J. Org. Chem. 2009, 74, 5730-5733.
Obi, K.; Uda, J.; Iwase, K.; Sugimoto, O.; Ebisu, H.; Matsuda, A. Bioorg. Med.Chem. Lett. 2000, 10,
1451-1454.
15
Einleitung
Polyoxin
R1
R2
O
R3
R1
A
CH2OH
O
B
D
E
CH2OH
COOH
COOH
F
COOH
G
CH2OH
H
CH3
J
CH3
K
H
L
M
H
H
NH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
H
R3
COR 2
O
H 2N
O
N
O
N
H
OH
OH
OH
O
NH 2
HO
OH
Polyoxine
H
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
H
O
R
NH
HO
N
CH3
O
NH
HO
COOH
O
N
O
N
CH3
O
O
N
H
OH
NH 2
COOH
N
O
N
H
HO
Neopolyoxin A R=CHO
Neopolyoxin B R=COOH
OH
OH
NH2
HO
OH
Neopolyoxin C
Abbildung 7: Strukturen der biologisch aktiven Polyoxine und Neopolyoxine
(übernommen von Referenz 6).
Abbildung 8: Strukturen von Polyoxin C und I (übernommen von Referenz 11).
16
Einleitung
Die Biosynthese der Polyoxine ist bereits geklärt6 (Abbildung 9), so wird das
Nukleosidgerüst durch Kondensation von Uridin (wahrscheinlich durch den
5’-Aldehyd) und Phosphoenolpyruvat gebildet15. Anschließend folgt die Bildung des
Alloseuronsäurenukleosids unter Verlust zweier C-Atome. Um die Methyl-,
Hydroxymethyl- oder Carboxylgruppe zu erhalten, wird das C-3 von L-Serin in die
Position
5
von
Uracil
über
verschiedene
Reaktionswege
mittels
Thymidylatsynthetase eingeführt. L-Glutaminsäure und L-Isoleucin gelten als
Precursor
der
Aminosäurenseitenketten,
Polyoximsäure.
5-Fluoropolyoxine
Carbamoylpolyoxamsäure
werden
allerdings
durch
und
Zugabe
von
5-Fluorouracil gebildet16.
NH2
HOH2CCHCOOH
NH2
CH3
CHCHCOOH
C2H5
Serin
Isoleucin
CH3
NH2
CHCOOH
COOH
NH
H3CHC
Glycin
HOOC
COOH
PEP P OC
COOH O
O C
NH
CH2
N
CHOH
O
O
CH2
O
NH
CHO N
O
Uridin
O
HO
OH
O
O
R
OH
O
OH
HOOC O
N
H2N CH
O
O
N
NH
HOOC
NH
N
O
A
OH
HO
O
OH
CH2OCNH2
COOH
H2N CH
CH2
O
R
HOOC
NH
N
OH
O
O
O
Polyoxine
P OCNH2
OH
O
CH2
COOH
COOH
H2N CH
CH2
COOH
H2N CH
CH2
COOH
H2N CH
CH OH
C
CH2
CH2
CH2OH
CH2OCNH2
O
HO CH
CH2OCNH2
O
Glutamat
OH
Octosylsäure
Abbildung
NH
C
O CHNCH O N
H2NCH
CHOH
B HOCH HO OH
O
HO
O
R
9:
R=H, CH3, CH2OH, COOH
Schematische
Darstellung
der
Biosynthese
von
Polyoxinen
(übernommen von Referenz 6).
15
Isono, K.; Hirasawa, K.; Sato, T.; Funayama, S.; Suzuki, S. J. Am. Chem. Soc. 1978, 100 (12),
3937-3939.
16
Isono, K.; Crain, P. F.; Odiorne, T. J.; McCloskey, J. A.; Suhadolnik, R. J. J. Am. Chem. Soc. 1973,
95 (17), 5788-5789.
17
O
Einleitung
Polyoxin C (Abbildung 8) ist das kleinste Molekül unter der Familie der Polyoxine und
stellt eine Schlüsselverbindung zur Strukturaufklärung der anderen Polyoxine dar, da
es durch Hydrolyse der Polyoxine A, B, G und I gewonnen wird, so wie man durch
Hydrolyse der Polyoxine D, E und F die korrespondierende Säure, Polyoxin C Säure
erhält12.
Eine
Uracil
Reihe
von
Polyoxin
Chemikern
C
(UPOC)
hat
sich mittlerweile
befasst.
Abbildung
10
mit
der Synthese
zeigt
von
literaturbekannte
Synthesewege, die zu UPOC führen.
Abbildung
10:
Ausgewählte
Synthesewege
für
UPOC
aus
der
Literatur
(übernommen von Referenz 17).
18
Einleitung
Weg A beschreibt die Synthese von UPOC über eine modifizierte Streckersynthese
zwischen dem isopropylidengeschützten Aldehyd (I) und TMSCN und einer
Aminosäure
in
Gegenwart
von
BF317.
Diese
Synthese
wurde
von
Fiandor et al. 1987 veröffentlicht18. Durch Hydrolyse der Nitrilgruppe von II wird
UPOC erhalten.
Die Arbeitsgruppe um Barrett19, Variante B, zeigt die nukleophile Addition
Kaliumtrimethylsilonat
an
das
Nitroalken,
welches
schließlich
zum
(S)-α-Hydroxythioester (IV) führt und nach weiteren sechs Stufen zu UPOC. Diese
Synthese ist deutlich länger als die vorige, besitzt aber eine wesentlich höhere
Stereoselektivität17.
Evina und Guillerm20 (Weg C) behandeln V mit AD-mix-α, dieser besitzt eine hohe
Stereoselektivität, und überführen VI in ein O-2,5'-Cyclonukleosid. Nach Zugabe von
NaN3 in HMPA und weiteren vier Stufen erhalten sie Uracil Polyoxin C mit einer
Ausbeute von nur 6%17.
Der Syntheseweg nach Akita et al.21 (D) beschreibt die nukleophile Addition von
Vinylmagnesium
an
IX.
Jedoch
erfordert
dieser
Syntheseweg
mit
α-L-Talofuranosyluronsäure als Intermediat sehr viele Schritte mit schlechter
Diastereoselektivität17.
Weg E entwickelt von der Arbeitsgruppe von Finney22 ähnelt der vorigen Synthese
von Akita. XII wird mittels eines Zinkacetylid stereospezifisch in XIII überführt. Nach
weiteren 4 Stufen wird wieder das Azid als Vorstufe für UPOC erhalten17.
Die oben angeführten Synthesen wurden von Plant, Thompson und Williams
ausgewählt, um zu zeigen, dass mit zunehmender Stereoselektivität meist mehr
Syntheseschritte erforderlich sind. Plant et al.17 haben außerdem eine kürzere, aber
dennoch stereoselektive Synthese entwickelt (Abbildung 11).
17
Plant, A.; Thompson, P.; Williams, D. M. J. Org. Chem. 2008, 73, 3714-3724.
Fiandor, J.; García-López, M. T.; De las Heras, F. G.; Méndez-Castrillón, P. P. Synthesis 1987, 978981.
19
Barrett, A. G. M.;Lebold, S. A. J. Org. Chem. 1990, 55, 3853-3857.
20
Evina, C. M.; Guillerm, G. Tetrahedron Letters 1996, 37, 163-166.
21
Akita, H.; Uchida, K.; Chen, C. Y.; Kato, K. Chem.Pharm. Bull. 1998, 46, 1034-1038.
22
More, J. D.; Finney, N. S. Synlett 2003, 1307-1310.
18
19
Einleitung
O
O
O
O O
XV
N
O
O
NH
t
Bu
O
t-BuS(O)NH2,
CuSO4, CH2Cl2
S
N
O
N
NH
O
O O
O
O
t
Bu
S
BF3-OEt2, CH2Cl2,
-78°C dann TMSCN
CN
N
H
N
O
NH
O
O O
XVIIa R , C5'-R, 77% Ausbeute, 97:3 dr
XVIa Rs, 88% Ausbeute XVIIb Ss , C5'-S, 70% Ausbeute, 94:3 dr
s
XVIb Ss, 87% Ausbeute
HCl/MeOH
O
CO2Me
NH
O N
XVIIIa C5'-S, 76% Ausbeute H2N
O
XVIIIb C5'-R, 76% Ausbeute
HO OH
XVIIIa
O
CO2Me
O N
H 2N
HO
NH
O
OH
XVIIIb
Abbildung 11: Effizienter stereoselektiver Syntheseweg für den Methylester von
Uracil Polyoxin C entwickelt von Plant et al. (übernommen von Referenz 17).
Bei dieser stereoselektiven Synthese wird der Aldehyd (XV) einmal mit (R)-(+)-tertButansulfinamid in trockenem CH2Cl2 mit Kupfersulfat und einmal mit (S)-(-)-tertButansulfinamid umgesetzt und anschließend die so erhaltenen Verbindungen XVIa
und XVIb mit BF3-OEt2 bei -78°C gefolgt von TMSCN behandelt, um XVIIa mit Rs,R
Konfiguration mit 77% Ausbeute und XVIIb mit Ss,S Konfiguration mit 70% Ausbeute
zu erhalten. Durch Zugabe von HCl in Methanol werden gleichzeitig der Methylester
von UPOC (XVIII) gebildet und die Isopropyliden-Schutzgruppe abgespalten.
20
Einleitung
1.7 Nikkomycine
Nikkomycine zählen wie Polyoxine zu den Nukleosid-Antibiotika. Sie wurden bereits
1970 in Japan entdeckt und nach der Stadt Nikko benannt. Nikkomycine werden von
einigen
Streptomyces
Arten,
den
Streptomyces
tendae
und
Streptomyces
ansochromogenes, produziert. Streptomyces gehören der Gattung der Actinobacteria
an, und sind vorwiegend im Boden zu finden. Die meisten medizinisch genutzten
Antibiotika werden von der Familie der Streptomycetaceae produziert.
Nikkomycine fungieren als starke Inhibitoren für die Chitinsynthase und weisen daher
insektizide, akarizide und fungizide Eigenschaften auf. Chitin kommt in den
Zellwänden der meisten Pilze sowie als Hauptbestandteil des Exoskeletts vieler
Invertebraten, wie Spinnen, Insekten, Krebstieren und anderen vor. Wegen der
Hemmung der Chitinsynthase kommt Nikkomycinen ein hohes antibiotisches
Potential zu. Ein möglicher Einsatzbereich für Nikkomycine ist die Behandlung von
Patienten, die aufgrund von Krebserkrankungen oder anderen Krankheiten, bei
denen das Immunsystem geschwächt, oder durch Einnahme von Immunsupressiva
herabgesetzt wird, anfälliger für Pilzerkrankungen sind23, 24.
Da immer häufiger Antibiotika-Resistenzen ausgebildet werden, ist es besonders
wichtig neue Antibiotika zu finden, aber auch bereits bekannte zu modifizieren, um so
die Verträglichkeit und Wirkungsweise zu verbessern und Nebenwirkungen
herabsetzen zu können25. Hierfür wäre es besonders hilfreich, besser über die
Nikkomycinbiosynthese Bescheid zu wissen, um so einen Anhaltspunkt für die
Entwicklung neuartiger Nikkomycine zu haben, die ihrerseits wieder wertvolle
Eigenschaften als potentielle Antibiotika aufweisen könnten3. Über zwanzig
biologisch aktive Nikkomycine wurden aus Streptomyces tendae Stämmen isoliert26.
In Abbildung 12 sind einige bereits bekannte Nikkomycine dargestellt.
23
Fiedler, H. P.; Schüz, T.; Decker, H. Clinical Dermatology 1993, 7, 325-52.
Binter, A. Presentation for Graduate Seminar 2008.
25
http://www.wissenschaft-online.de/abo/lexikon/bio/4027.
26
Schüz, T. C.; Fiedler, H.-P.; Zähner, H. The Journal of Antibiotics 1992, 45 (2), 199-206.
24
21
Einleitung
Nikko-
R1
mycin
R2
R3
Nikko-
R1
mycin
R2
R3
O
Z
HN
O
OH
Ox
OH
N
O
X
OH
Qz
Homo
HN
O
N
-Ser
O
J
HN
O
Glu
Qx
Glu
Px
Homo
-Ser
N
I
OH
O
Bz
HN
O
O
OH
Rz
N
Bx
HN
O
OH
HN
O
Glu
O
OH
Wz
N
Kx
N
Rx
O
Kz
Glu
HN
O
OH
OH
N
Wx
OH
O
Oz
HN
O
OH
N
Abbildung 12: Bekannte Nikkomycine (übernommen von Referenz 6).
22
Einleitung
Obwohl der strukturelle Aufbau der Nikkomycine bald nach ihrer Entdeckung geklärt
wurde, sind von der Biosynthese bis heute nur wenige Schritte bekannt und
erforscht3.
Von der Struktur her können Nikkomycine zu den Peptidnukleosiden gezählt werden.
Sie
setzen
sich
aus
Hydroxypyridylhomothreonin
zwei
und
der
ungewöhnlichen
Aminosäuren,
Aminohexuronsäure,
zusammen.
dem
Die
Aminohexuronsäure ist zusätzlich mit Uracil oder 4-Formyl-4-imidazolin-2-on
N-glykosidisch verknüpft3, siehe Abbildung 13.
Hydroxypyridylhomothreonin
Aminohexuronsäure
Abbildung 13: Grundstruktur der Nikkomycine (übernommen von Referenz 3).
Die Reaktionsschritte, die bei der Biosynthese der Aminohexuronsäure ablaufen,
sind bislang annähernd unerforscht. Macheroux und Arbeitsgruppe konnten zeigen,
dass
der
erste
Schritt
die
Einführung einer Enolpyruvat-Gruppe
bei
der
Hydroxygruppe am C-3 von UMP ist (Abbildung 14). Das Protein, das diese
Übertragung katalysiert, wird NikO genannt. Gefunden wurde es, indem das
Nikkomycin Biosynthese-Operon isoliert wurde, und die einzelnen Proteine später in
E.coli exprimiert wurden3.
23
Einleitung
Abbildung 14: NikO als Enolpyruvyl transferase.
Auf dem Operon befinden sich viele weitere Gene, von denen ausgegangen werden
kann, dass die entsprechenden Proteine für die Synthese der Aminohexuronsäure
von Bedeutung sind (siehe Abbildung 15)24.
NikL
NikM
NikK
NikJ
NikI
NikN
Abbildung 15: Gemeinsam mit NikO wurden sechs weitere Gene transkribiert, die
die Proteine NikI, NikJ, NikK, NikL, NikM und NikN kodieren.
Noch nicht geklärt ist allerdings, in welcher Reihenfolge sie in die Synthese
eingreifen, daher ist es notwendig die Substrate, die von den jeweiligen
Proteinen/Enzymen umgesetzt werden, zu finden.
Darum werden derzeit die Wirkungsweise der Proteine und ihre mögliche Funktion in
der Nikkomycin-Biosynthese erforscht. Durch Sequenzähnlichkeiten zu anderen
Proteinen können Rückschlüsse auf die möglichen Funktionsweisen gezogen
werden. Bei NikI, NikM und NikN ist bis jetzt noch unklar, welche Rollen sie in der
24
Einleitung
Synthese übernehmen24. Schüz et al. haben gezeigt, dass die Bildung der
Aminohexuronsäure über ein bicyclisches Intermediat abläuft26 (siehe Abbildung 16).
Abbildung
16:
Bicyclisches
Nikkomycin-Intermediat
mit
Uracil
als
Base
(übernommen von Referenz 26).
NikL zeigt eine große Ähnlichkeit zu Tyrosinphosphatasen und katalysiert
möglicherweise eine Dephosphorylierungsreaktion (Abbildung 17)24.
Abbildung 17: Mögliche Funktion von NikL.
NikJ ähnelt S-Adenosylmethionin und Eisen-Schwefel-Oxidoreduktasen, aufgrund
dessen katalysiert es vielleicht Redoxreaktionen oder radikalische Umlagerungen
(Abbildung 18)24.
25
Einleitung
H
N
O
HO
5'
6'
7' O
O
O
O
N
OH
H
N
O
NikJ?
Oxidation an C-5' HO
(und C-6'?)
COO
5'
6'
7' O
O
O
N
OH
COO
Abbildung 18: Mögliche Funktion von NikJ.
NikK weist große Ähnlichkeiten zu Histidinolphosphat-Aminotransferasen auf,
weshalb davon ausgegangen wird, dass das Protein für die Einführung der
Aminogruppe in die Aminohexuronsäure verantwortlich ist. Als mögliches Substrat
wird die α-Ketosäure von Uracil Polyoxin C angenommen (Abbildung 19)24.
Abbildung 19: Mögliche Funktion von NikK.
26
Problemstellung
2 Problemstellung
Obwohl die Struktur der Nikkomycine bekannt ist, bleibt ihre Biosynthese bis heute
weitestgehend ungeklärt. Nikkomycine bestehen aus Hydroxypyridylhomothreonin
mit einem Aminohexuronsäure-Rest (siehe Abbildung 20)3.
Aminohexuronsäure
Abbildung 20: Struktur der Nikkomycine.
Mit Hilfe des Nikkomycin Operons wurden die für die Synthese verantwortlichen
Enzyme identifiziert, und aufgrund von Aminosäuresequenzähnlichkeiten wird auf
deren mögliche Funktion in der Biosynthese rückgeschlossen. Die Arbeitsgruppe von
Macheroux veröffentlichte, dass das Enzym NikO als Enolpyruvyltransferase die
Darstellung von 3’-Enolpyruvyl-UMP katalysiert3. Nun wird versucht, die Substrate für
die weiteren Enzyme NikI, NikJ, NikK, NikL, NikM und NikN zu finden, um so deren
Aufgaben in der Aminohexuronsäurebildung bestimmen, und den Mechanismus
aufklären zu können (siehe Abbildung 21).
27
Problemstellung
NikK
Abbildung 21: NikI, NikJ, NikK, NikL, NikM, NikN katalysieren die Biosynthese von
Uracil Polyoxin C.
NikK weist eine hohe Aminotransferase-Aktivität auf, daher wird angenommen, dass
mit Hilfe dieses Proteins eine Aminogruppe anstelle einer Ketogruppe eingeführt
wird, siehe Abbildung 2224.
Das Ziel dieser Diplomarbeit ist es, die korrespondierende α-Ketosäure von
Uracil Polyoxin C zu synthetisieren, welche für die Aufklärung von NikK als
Aminotransferase Verwendung finden wird (siehe Abbildung 22).
Abbildung 22: Transfer der Aminogruppe mittels NikK.
28
Durchführung und Diskussion
3 Durchführung und Diskussion
Syntheseweg 1:
Für die Darstellung der α-Ketosäure von Uracil Polyoxin C (12) ausgehend von
Uridin (1) wird der in Abbildung 23 angegebene Syntheseplan 1 aufgestellt.
Abbildung 23: Syntheseplan 1.
29
Durchführung und Diskussion
Zuerst werden die cis-ständigen Hydroxygruppen an C-2 und C-3 von Uridin (1)
durch Einführung eines Isopropylidenacetals geschützt, um im folgenden Schritt
ausschließlich die Hydroxygruppe am C-5 regioselektiv oxidieren zu können. Die
Isopropylidenschutzgruppe wird mit trockenem Aceton in Anwesenheit von
konzentrierter Schwefelsäure als saurem Katalysator eingeführt27. Nachdem die
Reaktion für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt worden ist, wird sie
abgebrochen, obwohl die Kontrolle mittels DC noch keinen vollständigen Umsatz
zeigt, da es sonst durch die Säure zur Abspaltung des Uracils an der Anomere
kommen kann. Bei der Abspaltung verfärbt sich die zuvor farblose Lösung orange.
Die Reaktion wird durch Zugabe von Et3N gestoppt und das so erhaltene Produkt (2)
säulenchromatographisch gereinigt. Der frühe Abbruch der Reaktion zeigt keine
Auswirkung auf die Ausbeute (100%).
Der Aldehyd (3) wird mittels einer Dess-Martin-Oxidation gewonnen28. Hierfür wird
das geschützte Uridin (2) mit dem Dess-Martin-Periodinan (DMP) in trockenem
Methylenchlorid bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Reaktionszeit beträgt 2-3
Stunden. Die Aufarbeitung erfolgt nicht, wie in der Literatur angegeben, mit einer
gesättigten Thiosulfat-Lösung und einer gesättigten NatriumhydrogencarbonatLösung, da sich das Produkt sowohl in der wässrigen als auch in der organischen
Phase löst. Stattdessen wird die Reaktion durch Zugabe von festem Bicarbonat
neutralisiert,
welches
anschließend
wieder
abfiltriert
werden
kann.
Das
Produktgemisch wird säulenchromatographisch getrennt (65,5% Ausbeute).
Da das Dess-Martin-Reagenz sehr teuer ist, wird die Synthese des Aldehydes auch
mit einer Swern-Oxidation29 durchgeführt. Die Nachteile dieser Oxidationsmöglichkeit
sind allerdings, dass sich hier mehr Nebenprodukte bilden, die sich schwerer trennen
lassen, und die Durchführung aufgrund der Wasserempfindlichkeit und der
Reaktivität unter Schutzgas bei -78 °C erfolgen mus s. Weiters eignet sich das
Produkt nicht so gut für die Umsetzung in den Folgereaktionen, da sich auch hier,
laut Dünnschichtchromatographie, wieder mehr Nebenprodukte bilden, was zu
schlechteren Ausbeuten führt. Auffallend ist, dass diese beiden Oxidationsmethoden
laut NMR-Untersuchungen zu zwei unterschiedlichen Hauptprodukten führen. So
27
Bello, A. M.; Poduch, E.; Fujihashi, M.; Amani, M.; Li, Y.; Crandall, I.; Hui, R.; Lee, P. I.; Kain, K. C.;
Pai E. F.; Kotra, L. P. J. Med. Chem. 2007, 50 (5), 915-921.
28
Notz, W.; Hartel, C.; Waldscheck, B.; Schmidt, R. R. J. Org. Chem. 2001, 66, 4250-4260.
29
Nielsen, K. D.; Kirpekar, F.; Roepstorff, P.; Wengel, J. Bioorganic and Medicinal Chemistry 1995, 3
(11), 1493-1502.
30
Durchführung und Diskussion
erhält man bei der Dess-Martin-Oxidation nicht den gewünschten Aldehyden sondern
das korrespondierende Dihydrat, wohingegen die Swern-Oxidation den erwarteten
Aldehyden liefert, der jedoch nur schwer zu reinigen ist. Die Oxidation mit DMP führt
allerdings zu besseren Ausbeuten und das Vorliegen des Dihydrats anstelle des
Aldehyden hat keinen negativen Einfluss auf die Folgereaktion.
Aus diesen Gründen hat man sich für die zwar teure, aber für dieses System besser
geeignete, geruchsfreie Dess-Martin-Oxidation entschieden.
Im nächsten Schritt wird eine Kettenverlängerung an der Position C-5 nach einer
modifizierten Killiani-Fischer-Reaktion durchgeführt30. Verbindung 3 wird bei 0 °C mit
NaCN in destilliertem Wasser und Acetonitril umgesetzt. Nach vollständigem Umsatz
wird
das
Reaktionsgemisch
auf
85
°C
erhitzt,
um
das
Cyanhydrin
zur
entsprechenden α-Hydroxysäure (5) zu hydrolysieren. Es kommt beim Einengen der
Reaktionslösung im Aufarbeitungsschritt allerdings zu einer Rückreaktion und in
Folge zu einer Abspaltung der Isopropylidenschutzgruppe (Abbildung 24).
N
C
O
O
O
O
O
N
N
HO
85°C
H
O
O
OH
O
4
N
N
HO
H
O
O
O
5
Abbildung 24: Falscher Ansatz für die Säuregenerierung.
Ein neuer Syntheseplan mit einer anderen Schutzgruppentechnik wird ausgearbeitet
(siehe Abbildung 25).
30
Pratt, J. P.; Richtmyer, M. K. J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 6326-6328.
31
Durchführung und Diskussion
Syntheseweg 2:
Abbildung 25: Syntheseplan 2.
Wieder wird von Uridin (1) ausgegangen. Um die Hydroxygruppen an Positionen C-2
und C-3 mit tert-Butyldimethylsilylchlorid31 schützen zu können, muss erst am C-5
temporär eine Methoxytritylschutzgruppe32 eingeführt werden. Hierfür wird Uridin (1)
31
32
Myers, A. G.; Gin, D. Y.; Rogers, D. H. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116 (11), 4697-4718.
Smith, M.; Rammler, D. H.; Goldberg, I. H.; Khorana, H. G. J. Am.Chem. Soc. 1962, 84 (3), 430440.
32
Durchführung und Diskussion
in trockenem Pyridin gelöst und bei Raumtemperatur mit Methoxytritylchlorid
umgesetzt.
Das
Produkt
wird
sauer/basisch
aufgearbeitet
und
mittels
Säulenchromatographie gereinigt (72% Ausbeute).
Zu
dem
gereinigten
Produkt
werden
in
DMF
Imidazol
und
tert-
Butyldimethylsilylchlorid zugegeben, um die Silylschutzgruppen einzuführen. Nach 15
Stunden wird die Reaktion mit MeOH gequencht, im Vakuum eingeengt und mit
Essigester und destilliertem Wasser extrahiert. Das so erhaltene Produkt wird wieder
säulenchromatographisch gereinigt (91% Ausbeute).
Nun wird die Methoxytritylschutzgruppe wieder abgespalten, um im nächsten Schritt
die Hydroxygruppe am C-5 oxidieren zu können. Der geschützte Zucker wird in
Methylenchlorid gelöst, anschließend werden ein paar Tropfen destilliertes Wasser
zugegeben. MeOH wird solange zugetropft, bis die Lösung erst trüb und dann wieder
klar wird. Bei der Abspaltung mit p-Toluolsulfonsäure muss besonders darauf
geachtet werden, nicht zu sauer zu werden. Der pH wird auf 2 bis 3 eingestellt, da es
sonst bei der relativ langen Rührzeit von 24 Stunden zur Spaltung des Aglycons
kommen könnte. Nach vollständigem Umsatz wird die Lösung mit einer gesättigten
NaHCO3-Lösung neutralisiert und mit CH2Cl2 extrahiert. Das Produkt wird mittels
Säulenchromatographie gereinigt (85% Ausbeute).
Der Aldehyd (8) wird über eine Swern29 (43% Ausbeute) oder eine Dess-MartinOxidation28 (100% Ausbeute) gewonnen, analog zum Syntheseplan 1. Wieder erhält
man bei der Dess-Martin-Oxidation das korrespondierende Dihydrat und bei der
Swern-Oxidation den erwarteten Aldehyden, der wiederum nur schwer zu reinigen
ist. Die Oxidation mit DMP führt allerdings zu besseren Ausbeuten und es ist kein
weiterer
Reinigungsschritt
notwendig.
Beide
Produkte
werden
für
die
Kettenverlängerung im nächsten Schritt eingesetzt, und es stellt sich heraus, dass
sich wieder das Dess-Martin-Produkt besser für die Reaktion eignet, obwohl es als
Dihydrat und nicht als Aldehyd vorliegt. Aufgrund der Vorteile der höheren Ausbeute,
des Wegfallens eines Reinigungsschrittes und der kürzeren Reaktionszeit wird auch
bei den Silylschutzgruppen die Dess-Martin-Oxidation vorgezogen. Mit dieser
Schutzgruppe
kann
die
Reaktion
nach
Vorschrift
mit
einer
gesättigten
33
Durchführung und Diskussion
Thiosulfatlösung
und
einer
gesättigten
Natriumhydrogencarbonatlösung
aufgearbeitet werden, da sich das Produkt nicht in der wässrigen Phase löst.
Die Oxidation nach Pfitzner-Moffatt33 wird ebenfalls ausprobiert, doch sie führt nicht
zum gewünschten Produkt (8).
Die Kettenverlängerung nach einer modifizierten Killiani-Fischer-Reaktion30 (9) und
die anschließende Bildung der Säure (10) durch Aufheizen auf 85 °C führen nicht zu
dem gewünschten Produkt (Abbildung 26). Daraufhin wird die Kettenverlängerung
mit Trimethylsilylcyanid in trockenem Methylenchlorid durchgeführt18. Die bei dieser
Reaktion entstehenden beiden Diastereomere an Position C-5 werden in weiterer
Folge gemeinsam umgesetzt, da dieses Stereozentrum in der nachfolgenden
Oxidation zur α-Ketosäure wieder zerstört wird.
N
C
O
O
O
N
HO
O
OTBDMS
9
O
O
85°C
N
H
TBDMSO
OH
N
HO
N
H
O
OTBDMS
TBDMSO
10
Abbildung 26: Auch mit der Silylschutzgruppe führt dieser Schritt nicht zum Ziel.
Die Dünnschichtchromatographie zeigt, dass das Cyanhydrin (9) nicht stabil ist und
beim Einengen im Vakuum zerfällt. Daher wird überlegt, das Cyanhydrin noch im
selben Schritt zu schützen (Abbildung 27).
33
Howgate, P.; Jones, A. S.; Tittensor, J. R. Corbohyd. Res. 1970, 12, 403-408.
34
Durchführung und Diskussion
Abbildung 27: Erweiterung von Syntheseplan 2 mit einer Acetylschutzgruppe am
Cyanhydrin.
Dafür wird der Aldehyd (8) mit NaCN umgesetzt und das erhaltene Produkt mit
CHCl3 aus der wässrigen Phase extrahiert. Zu der über Na2SO4 getrockneten
Chloroformlösung wird trockenes Pyridin zugegeben und mit Ac2O und DMAP
acetyliert. Die Acetylierung geht trotz der großen Menge an Chloroform sehr schnell,
die Reaktionszeit beträgt ein bis zwei Stunden. Nach vollständigem Umsatz wird mit
MeOH gequencht und sauer/basisch aufgearbeitet. Nun ist das Produkt stabil, und
kann mittels Säulenchromatographie gereinigt werden (87% Ausbeute).
Die Methode des in-situ Schützens funktioniert auch bei einer Kettenverlängerung mit
Trimethylsilylcyanid, jedoch muss hier vor der Acetylierung mit stark verdünnter HCl
ausgeschüttelt werden, wodurch es zu einer Rückreaktion kommen kann. Außerdem
ist diese Art der Kettenverlängerung mit längeren Reaktionszeiten verbunden und es
kann zur Bildung von Silylketten kommen.
35
Durchführung und Diskussion
Mittels reduktiver Hydrolyse mit Pd auf BaSO4 soll Aldehyd (14) gebildet werden,
allerdings ohne Erfolg. Daher wurde Verbindung 13 mit DIBAl unter N2-Atmosphäre
bei -78 °C reduziert und mit einer gesättigten NH 4Cl-Lösung und einer gesättigten
Natriumhydrogencarbonatlösung aufgearbeitet. Zuerst werden 2 Äquivalente DIBAl
genommen. Hier zeigen NMR-Untersuchungen, dass nicht nur das Nitril reduziert
wird, sondern auch die Acetylgruppe abgespalten wird. Es entsteht eine Mischung
aus 13, 14 und 17. Daher wird versucht, durch Variation der DIBAl-Äquivalente eine
vollständige Reaktion zu Verbindung 17 zu erhalten (Abbildung 28).
Abbildung 28: Möglicher Syntheseplan, bei dem 13 sofort zu 17 durch Variation der
DIBAl-Äquivalente reduziert wird.
Jedoch wird bei 4 Äquivalenten auch der Uracilrest reduziert, und auch bei
3 Äquivalenten erhält man mehrere Nebenprodukte. Deswegen wird versucht,
Verbindung 14 nach Syntheseplan 2 zuerst mit NaOCl und NaH2PO4 zur Säure zu
oxidieren und anschließend mit CH2N2 zu verestern. Inzwischen wird auch versucht,
Verbindung 4 aus dem ersten Syntheseplan in-situ mit TBDMS-Cl zu schützen, um
anschließend das Nitril mit DIBAl reduzieren zu können, da die Silylschutzgruppe
gegenüber dem DIBAl stabiler ist. Es stellt sich heraus, dass mit 2 Äquivalenten
DIBAl ein vollständiger Umsatz zum gewünschten Produkt erreicht wird. Daher wird
ein neuer Syntheseplan 3 (siehe Abbildung 29) basierend auf Syntheseplan 1 erstellt
und Syntheseplan 2 nicht weiter verfolgt.
36
Durchführung und Diskussion
Syntheseweg 3:
Abbildung 29: Syntheseplan 3.
37
Durchführung und Diskussion
Wie schon im ersten Syntheseplan wird Uridin (1) mit Aceton und konzentrierter
Schwefelsäure 2’,3’-O-Isopropyliden geschützt und anschließend an Position C-5 mit
DMP oxidiert. Die Kettenverlängerung am C-5 erfolgt mittels modifizierter KillianiFischer-Reaktion mit NaCN. Nach vollständigem Umsatz wird die wässrige Lösung
mit Essigester extrahiert. Das Produkt geht nur schwer in die organische Phase. Die
Essigesterphase wird über Na2SO4 getrocknet, und DMF, Imidazol und TBDMS-Cl
werden zugegeben. Jetzt kann das Reaktionsgemisch gefahrlos im Vakuum
eingeengt werden, bis eine stark konzentrierte Lösung übrig bleibt. Erneut werden
Imidazol und TBDMS-Cl zugegeben, um vollständigen Umsatz zu erreichen. Es wird
mit MeOH gequencht und mit EE und H2O dest. ausgeschüttelt. Das Produkt (19)
wird säulenchromatographisch gereinigt und in einer Ausbeute von 57% erhalten.
Verbindung 19 wird mit zwei Äquivalenten DIBAl zu Aldehyd (20) in einer Ausbeute
von 73% reduziert.
Der Aldehyd (20) wird mit NaOCl und NaH2PO4 in THF, t-BuOH und Isopenten bei
0 °C zur Säure ( 21) oxidiert. Hier ist zu beachten, dass die Reaktionszeiten bei
größeren Ansatzmengen deutlich zunehmen. Die Reaktion wird mit einer gesättigten
Na2SO3-Lösung und einer gesättigten NaCl-Lösung gestoppt und auf pH 3
angesäuert und mit EE ausgeschüttelt. Die Säure (21) wird in einer Ausbeute von
96% erhalten.
Im nächsten Schritt wird die Silylschutzgruppe mit Bu4NF·3H2O in THF abgespaltet
und die so erhaltene Hydroxysäure (22) mit DMP in absolutem CH2Cl2 zur Ketosäure
(6) oxidiert. Das erhaltene Produkt wird mittels Säulenchromatographie gereinigt und
in einer Ausbeute von 30% erhalten.
38
Durchführung und Diskussion
Im letzten Schritt soll die Isopropylidenschutzgruppe, laut Vorschrift34, mit 4N HCl in
Dioxan abgespalten werden. Massenuntersuchungen von Vorversuchen zeigen,
dass das gewünschte Produkt (12) in kleinen Mengen gebildet wurde, doch muss die
Methode noch verbessert werden, und ein geeignetes Reinigungsverfahren
entwickelt werden. Außerdem fehlen noch die analytischen Schritte um die erhaltene
Verbindung hinreichend als die α-Ketosäure identifizieren und charakterisieren zu
können, diese laufen gerade35.
34
Dalhoff, C.; Hüben, M.; Lenz, T.; Poot, P.; Nordhoff, E.; Köster, H.; Weinhold, E. ChemBioChem
2010, 11, 256-265.
35
Wird in einem Addendum nachgereicht.
39
Zusammenfassung
4 Zusammenfassung
Während dieser Diplomarbeit wurde die Synthese der α-Ketosäure von Uracil
Polyoxin C erarbeitet (Abbildung 30).
Abbildung 30: Syntheseweg zur α-Ketosäure von Uracil Polyoxin C.
Uridin (1) wurde 2’,3’-O-Isopropyliden geschützt und an Position C-5 mit DMP
oxidiert. Bei der anschließenden Kettenverlängerung mittels modifizierter KillianiFischer-Reaktion wurde die dabei entstehende Hydroxygruppe am C-5 in-situ mit
einer tert-Butyldimethylsilylgruppe geschützt. Das Nitril (19) wurde mit DIBAl
reduziert und der so gebildete Aldehyd (20) mit einer NaOCl/NaH2PO4-Lösung zur
Säure (21) oxidiert. Anschließend wurde die Silylschutzgruppe abgespalten und die
Ketosäure (6) über eine Dess-Martin-Oxidation erhalten. Der letzte Schritt, in dem die
Isopropylidenschutzgruppe abgespalten werden soll, befindet sich gerade in der
Entwicklung.
40
Zusammenfassung
Alle Syntheseschritte konnten mit relativ guten bis sehr guten Ausbeuten
durchgeführt werden, und auch die Bildung der Diastereomere (19, 20, 21 und 22)
durch die Kettenverlängerung stellte kein Problem dar, da das Stereozentrum durch
die Oxidation zur Ketosäure (6) wieder zerstört wurde. So konnten beide
Diastereomere in den folgenden Reaktionen gemeinsam umgesetzt werden.
Mit Hilfe der so synthetisierten α-Ketosäure von Uracil Polyoxin C soll ein weiterer
Syntheseschritt der Nikkomycin-Biosynthese und die Bedeutung von NikK für selbige
aufgeklärt werden.
41
Experimenteller Teil
5 Experimenteller Teil
5.1 Analytik
Chromatographie
Dünnschichtchromatographie:
Für die Dünnschichtchromatographie werden Kieselgel 60 F254-Fertigplatten der
Firma Merck verwendet. Die Detektion erfolgte mit einer 254 nm UV Lampe und den
unten angeführten Sprühreagenzien. Nach dem Sprühen wurde zur Entwicklung
erhitzt.
Sprühreagenzien:
Vanillin/Schwefelsäure: 1 g Vanillin in 100 mL konzentrierter H2SO4.
Ammoniummolybdat/Cersulfat: 100 g Ammoniummolybdat in 1000 mL 10 %-iger
H2SO4 und 8 g Cer(IV)sulfat in 80 mL 10 %-iger H2SO4.
Anisaldehyd: 10 mL para-Anisaldehyd, 2 mL Essigsäure, 180 mL Ethanol und 10 mL
konzentrierte H2SO4.
Ehrlich-Reagenz: 0,5 g para-Dimethylaminobenzaldehyd in 25 mL Ethanol und
25 mL konzentrierter HCl.
Permanganat-Lösung: KMnO4 in H2O.
Präparative Dünnschichtchromatographie:
Hierfür wurden mit Kieselgel 60 beschichtete Glasplatten (0,25 oder 0,5 mm) der
Firma Merck verwendet.
Säulenchromatographie:
Die Säulenchromatographie wurde mit Merck Kieselgel 60 (230-400 mesh)
durchgeführt. Die Laufmittelzusammensetzungen unterscheiden sich und sind daher
in den Arbeitsvorschriften zur Herstellung der jeweiligen Substanzen angeführt.
42
Experimenteller Teil
Optische Aktivität
Die Drehwerte wurden mit einem PERKIN ELMER Polarimeter 341 bei 20 °C, einer
Küvettenlänge von 1 dm und einer Wellenlänge von 589 nm gemessen. Die
Konzentrationsberechnung bezieht sich auf g/100 mL und das Lösungsmittel für die
jeweilige Messung ist in der Arbeitsvorschrift angegeben.
NMR- Spektroskopie
Die NMR-Spektren wurden mit einem Bruker Ultrashield 300 MHz bei einer Frequenz
von 75,53 MHz (13C) beziehungsweise 300,36 MHz (1H) aufgenommen.
NMR-spektroskopische Daten:
δ
chemische Verschiebung in ppm gegen Trimethylsilan
in Klammer:
13
zugeordnetes Kohlenstoffatom
1
Multiplizität, Anzahl der Wasserstoffe, zugeordnete Wasserstoffe,
C:
H:
Kopplungskonstante (J) in Hz
Multiplizität:
s
Singlett
d
Duplett
bs breites Singlett
dd
duplettisches Duplett
t
ddd duplettisches dd
Triplett
m Multiplett
n.a. nicht aufgelöst
43
Experimenteller Teil
5.2 Darstellung der Produkte
5.2.1 2’,3’-O-Isopropylidenuridin (2)
Uridin (1) (5 g; 20,5 mmol) wird in trockenem Aceton (250 mL) suspendiert.
Konzentrierte H2SO4 (2,5 mL) wird bei Raumtemperatur zugetropft. Die Reaktion wird
bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt und schließlich mit Et3N neutralisiert und
im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mittels Säulenchromatographie gereinigt.
Ausbeute: 5,8 g (20,4 mmol) weißes Pulver (100%).
5
HO
O
N
4
9
1
3
N
H
2
O
O
7
6
O
11
12
10
O
DC LM:
EE/MeOH (10:1) (v/v)
Säulen LM:
EE/MeOH (10:1) (v/v)
Ausbeute:
100%
Rel. Molmasse:
284,27 g/mol (C12H16N2O6)
[α]58920
-0,172
8
H-NMR (MeOD) δ: 7.76 (d, 1H, J11,12=8.1 Hz, H-12), 5.80 (d, 1H, J1,2=2.4 Hz, H-1),
1
5.61 (d, 1H, H-11), 4.84 (dd, 1H, J2,3=6.2 Hz, H-2), 4.75 (dd, 1H, J3,4=3.4 Hz, H-3),
4.13 (dd, 1H, J4,5=7.4 Hz, H-4), 3.67 (ddd, 2H, J4,5’=3.2 Hz, ,J5,5’=11.6 Hz, H-5), 1.47
(s, 3H, H-7), 1.27 (s, 3H, H-8).
C-NMR (MeOD) δ: 166.2 (C-10), 152.1 (C-9), 144.0 (C-12), 115.2 (C-6), 102.7 (C-
13
11), 94.2 (C-1), 88.4 (C-4), 85.9 (C-2), 82.3 (C-3), 63.1 (C-5), 27.6, 25.6 (2C, C-7, C8).
5.2.2 5’-Oxa-2’,3’-O- isopropylidenuridin (3)
Zu einer Suspension von Verbindung 2 (4 g; 14,1 mmol) in absolutem CH2Cl2
(200 mL) wird DMP (6,57 g; 15,5 mmol; 1,1 eq) bei Raumtemperatur zugegeben. Die
Reaktion wird für 2-3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach vollständigem
Umsatz wird die Reaktion mit festem Bicarbonat neutralisiert, das Bicarbonat
abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird
44
Experimenteller Teil
säulenchromatographisch gereinigt. Ausbeute: 2,6 g (9,21 mmol) weißes Pulver
(65,5%).
O
5
O
N
4
1
3
9
7
6
N
H
2
O
O
O DC LM:
Säulen LM:
11
10
12
O
EE/MeOH (10:1) (v/v)
EE/Toluol (2:1) (v/v)
Ausbeute:
65,5%
Rel. Molmasse:
282,25 g/mol (C12H14N2O6)
[α]58920
-0,175
8
Dihydrat:
H-NMR (MeOD) δ: 7.90 (d, 1H, J11,12=8.1 Hz, H-12), 5.92 (d, 1H, J1,2=2.8 Hz, H-1),
1
5.72 (d, 1H, H-11), 4.97-4.88 (m, 2H, H-2, H-3), 4,73 (d, 1H, J4,5=4.1 Hz, H-5), 4.18
(dd, 1H, J3,4=2.1 Hz, H-4), 1.56 (s, 3H, H-7), 1.37 (s, 3H, H-8).
C-NMR (MeOD) δ: 166.3 (C-10), 152.2 (C-9), 143.8 (C-12), 114.8 (C-6), 102.4 (C-
13
1), 97.8 (C-5), 94.7 (C-11), 89.1 (C-4), 85.9 (C-2), 82.2 (C-3), 27.6, 25.6 (2C, C-7, C8).
5.2.3 5’-O-t-Butyldimethylsilyl-6’-cyano-2’,3’-O-isopropylidenuridin (19)
Verbindung 3 (2,6 g; 9,21 mmol) wird in absolutem Acetonitril (15 mL) und H2O dest.
(15 mL) suspendiert. Unter Eiskühlung wird NaCN (451,5 mg; 9,21 mmol; 1 eq)
zugegeben. Die Lösung wird bei 0 °C für 3 Stunden g erührt. Das Reaktionsgemisch
wird mit Essigester extrahiert. Dieser Schritt muss sehr oft mit geringen Mengen EE
wiederholt werden, um das Produkt vollständig aus der wässrigen Phase zu
bekommen. Die vereinten organischen Phasen werden getrocknet. Anschließend
wird DMF (15 mL) zugegeben. Imidazol (7,53 g; 111 mmol; 12 eq) und TBDMS-Cl
(8,33 g; 55,3 mmol; 6 eq) werden nacheinander zugegeben. Die Lösung wird für
ungefähr 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Schließlich wird der EE im
Vakuum entzogen und die Reaktion wird für weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Eventuell muss weiteres TBDMS-Cl zugegeben werden. Nach vollständigem
Umsatz wird die Reaktion durch Zugabe von MeOH (30 mL) gequencht, eingeengt
45
Experimenteller Teil
und mit EE und H2O dest. ausgeschüttelt. Die wässrige Phase wird 3-mal mit jeweils
20 mL EE extrahiert und die organischen Phasen werden vereint, über Na2SO4
getrocknet, einrotiert und mittels Säulenchromatographie gereinigt. Ausbeute: 2,2 g
(5,19 mmol) gelbliches Pulver (57%).
DC LM:
N
13
O
5
TBDMSO
12
N
4
H
2
O
O
7
6
EE Silylierung
9 N
1
3
O
Kettenverlängerung;
O
11
10
EE/MeOH (10:1) (v/v)
Säulen LM:
CH/EE (2:1) (v/v)
Ausbeute:
57%
Rel. Molmasse:
423,54 g/mol
8
(C19H29N3O6Si)
Die absolute Konfiguration wurde nicht bestimmt, deswegen werden die Signale für
die beiden Diastereomere als a und b angegeben.
H-NMR (CDCl3) δ: 7.42 (d, 1H, J11b,12b=8.1 Hz, H-12b), 7.23 (d, 1H, J11a,12a=8.1 Hz,
1
H-12a), 5.81 (d, J1b,2b=2.4 Hz, H-1b), 5.78-5.69 (m, 2H, H-11a, H-11b), 5.57 (d, 1H,
J1a,2a=1.6 Hz, H-1a), 5.04 (dd, 1H, J2a,3a=6.5 Hz, H-2a), 4.91-4.82 (m, 3H, H-2b, H-3a,
H-3b), 4.72 (d, 1H, J4b,5b=5.8 Hz, H-5b), 4.70 (d, 1H, J4a,5a=7.8 Hz, H-5a), 4.30 (dd,
1H, J3b,4b=3.0 Hz, H-4b), 4.24 (dd, 1H, J3a,4a=3.3 Hz, H-4a), 1.56 (s, 3H, H-7b), 1.53
(s, 3H, H-7a), 1.34 (s, 3H, H-8b), 1.32 (s, 3H, H-8a), 0.95-0.84 (m, SiC(CH3)3, a und
b), 0.22, 0.18, 0.15, 0.10 (4s, 12H, Si(CH3)2, a und b).
C-NMR (CDCl3) δ: 163.6, 163.5 (2C, C-10a, C-10b), 150.4, 150.2 (2C, C-9b, C-9a),
13
143.5, 141.6 (2C, C-12a, C-12b), 118.7, 117.9 (2C, C-13a, C-13b), 115.2, 114.8 (2C,
C-6b, C-6a), 103.2, 103.1 (2C, C-11b, C-11a), 97.0, 94.1 (2C, C-1a, C-1b), 88.6, 87.6
(2C, C-4a, C-4b), 84.3 (2C, C-2a, C-2b), 82.2, 80.8 (2C, C-3a, C-3b), 63.5, 62.9 (2C,
C-5b, C-5a), 27.2, 27.1 (2C, C-7b, C-7a), 25.7, 25.6 (6C, SiC(CH3)3, a und b), 25.4,
25.3 (2C, C-8b, C-8a), -4.8, -5.0, -5.1, -5.2 (4C, Si(CH3)2, a und b).
46
Experimenteller Teil
5.2.4 6’-Oxa-5’-O-t-butyldimethylsilyl-2’,3’-O-isopropylidenuridin (20)
Verbindung 19 (2,2 g; 5,19 mmol) wird in absolutem Toluol (20 mL) vorgelegt. Der
Kolben mit der Lösung wird evakuiert und mit N2 belüftet (Vorgang 3-mal
wiederholen) und danach auf -78 °C gekühlt. Die Rea ktion wird unter N2-Atmosphäre
bei -78 °C durchgeführt. DIBAl (8,6 mL; 10,4 mmol; 2 eq) wird mittels Spritze
langsam über ein Septum zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird für 2 Stunden bei
-78 °C gerührt. Eine gesättigte NH 4Cl-Lösung (30 mL) wird zugetropft und die
Reaktion wird für weitere 10 Minuten bei -78 °C ger ührt. Nach Zugabe von CH2Cl2
wird die Kühlung entfernt und das Gemisch auf Raumtemperatur gebracht. Die
Reaktion wird mit einer gesättigten NaHCO3-Lösung und CH2Cl2 ausgeschüttelt. Die
wässrige Phase wird mehrmals mit CH2Cl2 extrahiert, die organischen Phasen
werden vereint und über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum
entfernt. Der Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt. Ausbeute: 1,6 g
(3,75 mmol) gelbes Pulver (73%).
O
H
12 1110
13
O
5
TBDMSO
N
4
1
3
9
H
2
O
O
7
6
N
O
DC LM:
EE/CH (2:1) (v/v)
O Säulen LM:
EE/CH (2:1) (v/v)
Ausbeute:
73%
Rel. Molmasse:
426,54 g/mol
(C19H30N2O7Si)
8
H-NMR (CDCl3) δ: 7.64 (d, 1H, J11b,12b=8.1 Hz, H-12b), 7.20 (d, 1H, J11a,12a=8.0 Hz,
1
H-12a), 6.00 (d, J1b,2b=2.8 Hz, H-1b), 5.80 (d, 1H, J1a,2a=2.5 Hz, H-1a), 5.70 (2d, 2H,
H-11a, H-11b), 4.95 (dd, 1H, J2a,3a=6.5 Hz, H-2a), 4.86-4.78 (m, 2H, H-2b, H-3a),
4.69-4.60 (m, 2H, H-3b, H-4b), 4.36-4.31 (m, 2H, H-5a, H-5b), 4.20 (dd, 1H,
J3a,4a=4a,5a=4.7 Hz, H-4a), 1.58-1.48 (m, CH3 a und b, H-7 a und b), 1.34-1.28 (m, CH3
a und b, H-8 a und b), 0.94-0.84 (m, SiC(CH3)3, a und b), 0.15-0.04 (m, Si(CH3)2, a
und b).
47
Experimenteller Teil
C-NMR (CDCl3) δ: 201.3, 200.0 (2C, C-13a, C-13b), 163.3, 163.3 (2C, C-10b, C-
13
10a), 150.2, 150.1 (2C, C-9b, C-9a), 141.8, 140.4 (2C, C-12a, C-12b), 115.3, 114.9
(2C, C-6a, C-6b), 103.2, 102.7 (2C, C-11a, C-11b), 92.7, 91.7 (2C, C-1a, C-1b), 86.2,
85.9 (2C, C-4a, C-4b), 85.1, 83.9 (2C, C-3b, C-3a), 80.3, 80.0 (2C, C-2b, C-2a), 78.7,
77.4 (2C, C-5b, C-5a), 27.4, 27.3 (2C, C-7b, C-7a), 25.6, 25.5 (2C, C-8a, C-8b), 25.9
(6C, SiC(CH3)3, a und b), -4.3, -4.7, -5.1 (4C, Si(CH3)2, a und b).
5.2.5 6’-Carboxy-5’-O-t-butyldimethylsilyl-2’,3’-O-isopropylidenuridin (21)
Verbindung 20 (0,8 g; 1,88 mmol; 1 eq) wird in THF abs. (5 mL), t-BuOH abs.
(10 mL) und Isopenten abs. (5 mL) gelöst und auf 0 °C gekühlt. Eine
NaOCl/NaH2PO4-Lösung (130 mL) wird über einen Tropftrichter zugetropft. Die
Reaktion wird bei 0 °C für 60 Minuten gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe einer
gesättigten Na2SO3-Lösung (50 mL) und einer gesättigten NaCl-Lösung (20 mL)
gestoppt und mit Eisessig neutralisiert. Das Lösungsmittelgemisch wird mehrmals mit
EE extrahiert und die organischen Phasen vereint, über Na2SO4 getrocknet und im
Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt.
Ausbeute: 800 mg (1,81 mmol) gelbes Pulver (96%).
Herstellung der NaOCl/NaH2PO4-Lösung:
250 mg NaOCl und 250 mg NaH2PO4 werden in 1,2 mL H2O dest. gelöst.
O
HO
13
O
5
TBDMSO
12
N
4
1
3
9
7
6
O
8
EE/CH (1:1) (v/v)
O Säulen LM:
CH/EE (1:1) (v/v)
(0,5% Eisessig)
N
H
2
O
O
11
10
DC LM:
Ausbeute:
96%
Rel. Molmasse:
442,54 g/mol
(C19H30N2O8Si)
48
Experimenteller Teil
H-NMR (MeOD) δ: 7.64 (d, 1H, J11b,12b=8.0 Hz, H-12b), 7.57 (d, 1H, J11a,12a=8.0 Hz,
1
H-12a), 5.74 (d, 1H, J1b,2b=1.4 Hz, H-1b), 5.66-5.58 (m, 3H, H-1a, H-11a, H-11b),
5.12 (dd, 1H, J2b,3b=6.4 Hz, H-2b), 5.02 (dd, 1H, J1a,2a=1.5 Hz, J2a,3a=6.3 Hz, H-2a),
4.92-4.80 (m, 4H, H-3a, H-3b, H-5a, H-5b), 4.21 (dd, 1H, J3a,4a=3.2 Hz, J4a,5a=6.7 Hz,
H-4a), 4.11 (dd, 1H, J3b,4b=3.2 Hz, J4b,5b=8.3 Hz, H-4b), 1.50-1.45 (m, CH3 a und b,
H-7 a und b), 1.30-1.25 (m, CH3 a und b, H-8 a und b), 0.90-0.80 (m, SiC(CH3)3, a
und b), 0.20-0.02 (m, Si(CH3)2, a und b).
C-NMR (MeOD) δ: 175.3 (2C, C-13a, C-13b), 166.2, 166.1 (2C, C-10b, C-10a),
13
152.3, 152.2 (2C, C-9a, C-9b), 146.0, 144.9 (2C, C-12b, C-12a), 115.6, 115.4 (2C, C6a, C-6b), 103.1 (2C, C-11a, C-11b), 98.4, 97.0 (2C, C-1a, C-1b), 90.5, 90.3 (2C, C4a, C-4b), 86.0, 85.7 (2C, C-2a, C-2b), 84.0, 82.7 (2C, C-3b, C-3a), 65.1, 64.2 (2C,
C-5a, C-5b), 28.1, 27.5 (2C, C-7b, C-7a), 27.4, 26.7 (2C, C-8b, C-8a), 26.1, 25.5 (6C,
SiC(CH3)3, a und b), -4.8, -4.9, -5.0 (4C, Si(CH3)2, a und b).
5.2.6 6’-Carboxy-5’-hydroxy-2’,3’-O-isopropylidenuridin (22)
Verbindung 21 (520 mg; 1,18 mmol; 1 eq) wird in absolutem THF (10 mL) gelöst.
Bu4NF·3H2O (483 mg; 1,53 mmol; 1,3 eq) wird zugegeben und die Reaktion für 2
Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach vollständigem Umsatz wird das
Lösungsmittel
im
Vakuum
entzogen
und
der
Rückstand
mittels
Säulenchromatographie gereinigt. Ausbeute: 300 mg (0,91 mmol) gelbes Öl (78%).
OH
O
13
HO
O
5
N
4
1
3
O
12 1110
9
N
H
2
DC LM:
EE/CH (3:1) (v/v)
Säulen LM:
EE/CH (3:1) (v/v)
Ausbeute:
78%
Rel. Molmasse:
328,27 g/mol (C13H16N2O8)
O
O
7
6
O
8
49
Experimenteller Teil
H-NMR (CDCl3) δ: 7.45 (d, 1H, J11b,12b=8.1 Hz, H-12b), 7.40 (d, 1H, J11a,12a=8.0 Hz,
1
H-12a), 5.80-5.70 (m, 2H, H-11a, H-11b), 5.65-5.60 (m, 2H, H-1a, H-1b), 5.27-5.20
(m, 1H, H-2b), 5.05-4.97 (m, 2H, H-3a, H-3b), 4.80-4.73 (m, 2H, H-5a, H-5b), 4.734.66 (m, 1H, H-2a), 4.37-4.27 (m, 2H, H-4a, H-4b), 2.07-1.95 (m, CH3, H-7a, H-7b, H8a, H-8b).
C-NMR (CDCl3) δ: 171.8 (2C, C-13a, C-13b), 165.0, 164.7 (2C, C-10b, C-10a),
13
151.3, 151.0 (2C, C-9b, C-9a), 143.9, 143.8 (2C, C-12b, C-12a), 115.2, 114.9 (2C, C6a, C-6b), 102.9, 102.6 (2C, C-11a, C-11b), 96.4, 96.2 (2C, C-1b, C-1a), 87.6, 86.8
(2C, C-4b, C-4a), 85.8, 85.3 (2C, C-2b, C-2a), 84.1, 83.7 (2C, C-3b, C-3a), 61.9, 61.7
(2C, C-5b, C-5a), 27.1 (2C, C-7a, C-7b), 25.3 (2C, C-8a, C-8b).
5.2.7 6’-Carboxy-5’-oxo-2’,3’-O-isopropylidenuridin (6)
Verbindung 22 (120 mg; 0,37 mmol) wird in absolutem CH2Cl2 (10 mL) suspendiert.
DMP (171 mg; 0,40 mmol; 1,1 eq) wird zugegeben. Die Reaktion wird für 2-3
Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach vollständigem Umsatz wird die Reaktion
mit festem Bicarbonat neutralisiert, das Bicarbonat abfiltriert und das Lösungsmittel
im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird mittels Säulenchromatographie gereinigt.
Ausbeute: 36 mg (0,11 mmol) gelbliches Öl (30%).
OH
O
13
O
5
O
12
N
4
1
3
9
11
10
N
H
2
DC LM:
EE/CH (3:1) (v/v)
O Säulen LM:
EE/CH (3:1) (v/v)
Ausbeute:
30%
Rel. Molmasse:
326,26 g/mol (C13H14N2O8)
O
O
7
6
O
8
Charakteristische Peaks in 1H-NMR (CDCl3) δ: 8.02 (d, 1H, J11,12=7.9 Hz, H-12), 5.80
(d, 1H, H-11), 5.55 (bs, 1H, H-1), 5.18 (d, 1H, J2,3=6.1 Hz, H-2), 5.04 (d, 1H, H-3),
4.40-4.30 (m, 1H, H-4).
50
Experimenteller Teil
C-NMR (CDCl3) δ: 176.2 (C-5), 172.1 (C-13), 163.5 (C-10), 150.4 (C-9), 144.0 (C-
13
12), 115.1 (C-6), 103.7 (C-11), 93.8 (C-1), 86.9 (C-4), 80.3, 76.5 (2C, C-2, C-3), 26.5,
25.3 (2C, C-7, C-8).
5.2.8 6’-Carboxy-5’-oxouridin (12)
Vorversuch:
Verbindung 6 (44 mg, 0,13 mmol) wird in absolutem CH2Cl2 (10 mL) suspendiert. Bei
0 °C wird eine 4N HCl-Lösung in Dioxan (18 mL) zuge tropft. Die Reaktion wird für 1
Stunde bei 0 °C gerührt. H 2O dest. (1 mL) wird zugegeben und das Gemisch für 1
weitere Stunde bei 0 °C gerührt. Nach vollständigem Umsatz wird die Reaktion mit
H2O dest. (10 mL) und Et3N (11 mL) gequencht. Die organische Phase wird mit H2O
dest. extrahiert, die wässrigen Phasen vereint und das Lösungsmittel im Vakuum
entfernt.
OH
O
6
O
5
O
10
N
4
1
3
7
O
9
8
DC LM:
CHCl3/MeOH (1/1) (v/v)
Rel. Molmasse:
286,19 g/mol (C10H10N2O8)
N
H
2
O
HO
OH
51
NMR-Spektren
6 NMR-Spektren
2’,3’-O-Isopropylidenuridin (2)
380.933
440.407
969.533
970.945
1083.430
1087.909
1095.364
1099.836
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1107.494
1115.958
1119.419
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1419.590
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50.0012
63.2013
82.3532
85.9536
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115.2580
143.9951
152.2172
166.3285
52
NMR-Spektren
5’-Oxa-2’,3’-O- isopropylidenuridin (3)
366.822
385.039
429.020
430.876
442.922
677.653
973.100
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2320.786
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25.5658
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48.8661
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49.4339
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102.4784
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143.8559
152.2691
166.3443
166.3705
53
NMR-Spektren
5’-O-t-Butyldimethylsilyl-6’-cyano-2’,3’-O-isopropylidenuridin (19)
45.432
47.357
54.007
56.967
64.865
75.103
261.180
271.388
283.589
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2182.698
2184.835
2232.000
2240.107
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2891.118
-4.9921
-4.8158
18.2437
18.3034
25.3067
25.3937
25.5990
25.6730
25.7947
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27.2345
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63.4579
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77.6535
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103.2208
114.7923
115.2159
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118.6532
141.6980
143.4672
150.2200
150.4457
163.4508
163.5651
54
NMR-Spektren
6’-Oxa-5’-O-t-butyldimethylsilyl-2’,3’-O-isopropylidenuridin (20)
32.496
36.450
40.869
43.481
46.198
49.555
53.893
59.507
64.178
242.713
248.269
260.449
263.591
266.803
272.165
274.439
360.455
367.601
374.751
391.865
396.186
399.276
417.241
423.802
429.069
435.392
450.336
456.713
467.069
470.493
604.431
1216.834
1223.976
1231.117
1234.829
1238.272
1256.369
1261.063
1265.773
1277.415
1287.643
1290.229
1297.906
1299.004
1303.008
1304.192
1304.996
1307.901
1385.176
1387.929
1390.907
1394.088
1396.797
1400.210
1402.987
1406.050
1411.398
1413.944
1417.186
1437.124
1440.465
1443.338
1447.660
1450.374
1454.496
1456.969
1459.520
1462.940
1464.116
1479.466
1484.014
1485.938
1490.524
1670.050
1705.119
1712.080
1719.769
1734.383
1736.838
1743.014
1745.342
1791.043
1793.894
2156.957
2162.320
2164.981
2170.308
2174.594
2200.261
2201.590
2205.126
2289.232
2297.374
2761.697
2787.075
2889.103
2890.151
2894.767
2898.301
-4.6807
-4.3298
14.3787
18.4071
18.4716
21.2378
25.5206
25.5668
25.6031
25.6772
25.8388
25.9076
25.9964
26.0440
27.0898
27.3438
27.4331
60.5930
76.8069
77.2300
77.4289
77.6534
79.9692
80.2891
83.8743
85.1089
85.8634
86.1964
91.6564
92.7364
102.7472
103.1783
114.9406
115.3111
140.3761
141.7930
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150.2472
163.2521
163.3370
171.3798
199.9741
201.3293
55
NMR-Spektren
6’-Carboxy-5’-O-t-butyldimethylsilyl-2’,3’-O-isopropylidenuridin (21)
24.019
26.569
33.070
37.251
47.443
50.905
250.438
256.002
258.926
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274.274
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331.218
332.691
335.358
343.641
350.739
358.082
359.923
365.949
373.850
384.592
389.145
399.754
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414.670
428.153
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441.696
446.214
576.683
583.186
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972.878
974.326
1135.902
1206.209
1213.420
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1229.933
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1265.679
1268.903
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1444.119
1447.706
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1462.258
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1504.588
1509.357
1510.796
1532.795
1533.697
1539.147
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1676.341
1682.661
1685.597
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1693.566
1722.251
1723.695
2264.196
2267.723
2272.094
2275.719
2287.601
2295.632
-4.9040
-4.7937
-3.6466
19.0318
19.0553
19.1461
19.3925
20.8982
24.7915
25.5160
25.7480
25.8826
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26.1166
26.4840
26.5178
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26.6932
26.7882
26.8380
27.4200
27.4790
27.7195
28.1034
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85.6921
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90.5310
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115.4267
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144.8757
146.0314
152.1686
152.3067
166.1121
166.2047
175.2899
56
NMR-Spektren
6’-Carboxy-5’-hydroxy-2’,3’-O-isopropylidenuridin (22)
367.487
378.955
391.485
409.289
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419.048
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449.404
455.864
592.313
598.896
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610.257
1203.612
1210.077
1217.135
1224.255
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1295.138
1297.443
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1476.763
1480.506
1483.120
1486.111
1504.314
1528.753
1533.489
1537.109
1568.405
1573.768
1633.566
1690.547
1718.759
1726.072
1733.789
1736.168
2174.607
2194.805
2202.936
2216.799
2224.856
2231.554
2239.621
3111.947
3112.488
24.2125
24.2542
25.2179
25.2513
25.3023
25.5574
25.7575
26.9878
27.0523
27.1357
60.6945
60.9951
61.7466
61.9265
76.8058
77.2300
77.6539
80.2006
81.4939
83.6649
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85.2740
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97.9417
102.8554
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114.3130
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117.9938
118.4681
143.7764
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150.9160
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164.7367
165.0441
171.7684
176.5571
57
NMR-Spektren
6’-Carboxy-5’-oxo-2’,3’-O-isopropylidenuridin (6)
267.115
271.715
277.298
293.455
302.635
306.560
313.145
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337.670
343.700
357.706
362.528
369.648
376.767
380.925
383.730
390.557
393.466
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405.344
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429.482
432.722
438.278
444.242
457.466
466.473
478.880
607.048
611.432
624.189
631.729
646.074
1140.934
1189.434
1195.901
1208.124
1210.172
1211.018
1219.194
1226.334
1233.476
1240.627
1301.151
1308.238
1311.561
1314.459
1317.724
1413.391
1416.649
1429.285
1458.506
1463.849
1504.946
1510.078
1516.137
1537.462
1539.791
1543.498
1546.317
1549.708
1555.804
1639.075
1641.720
1666.350
1729.775
1738.668
1743.367
1746.660
2142.097
2148.348
2149.657
2155.869
2157.398
2174.607
2184.379
2194.504
2215.203
2216.007
2223.529
2230.382
2231.135
2379.788
2381.231
2387.595
2389.025
2402.151
2410.070
14.3822
20.8358
21.2581
25.3020
26.4961
27.3067
60.6756
76.4599
76.6443
76.6833
76.8069
76.9882
77.1058
77.2300
77.3560
77.4315
77.5126
77.6532
80.3474
93.7505
103.6792
115.1448
128.1797
132.0026
133.4538
141.9815
143.8285
150.3712
163.5182
170.0125
172.0767
176.2289
58
Publikationsliste
7 Publikationsliste
Poster
„Synthetic Studies towards Uracil Polyoxin C Analogues“, V. Schenk, A. Binter, P.
Macheroux, T. Wrodnigg, 15th European Carbohydrate Symposium, Vienna, Austria,
19 – 24 July, 2009
„Uracil Polyoxin C: Synthesis and Studies of Analogues“, V. Schenk, A. Binter, P.
Macheroux, T. Wrodnigg, 13th Austrian Cemistry Days, Vienna, Austria, 24 – 27
August, 2009
59
Curriculum vitae
8 Curriculum vitae
Persönliche Angaben
Name: Verena Schenk
Staatsbürgerschaft: Österreich
Geburtsdatum: 02.10.1985
Geburtsort: Graz
Ausbildung
1992-1996
Volksschule Alleestraße in Köflach
1996-2004
BG/BRG Köflach, 8580 Köflach, Gymnasialzweig
seit 2004
Studium Technische Chemie, TU Graz
14.03.08
1. Diplomprüfung
seit Mai 09
Diplomarbeit „Synthese der α-Ketosäure von Uracil Polyoxin C“
am Institut für Organische Chemie, TU Graz
Betreuerin: Dipl.-Ing. Dr.techn. Assoc.Prof. Tanja Wrodnigg
Berufserfahrung
Okt. 07 – Apr. 09
Projektmitarbeiterin am Institut für Umweltbiotechnologie, TU
Graz
Juli/Sept. 08
Ferialpraktikum, Glyco Group, TU Graz
Okt. 08
COST Action, TNO Eindhoven
Zusätzliche Qualifikationen
Cambridge Certificate
Celi 3 (Italienisch Zertifikat)
Zertifikat in Spanisch
Poster-Präsentationen
Synthetic Studies towards Uracil Polyoxin C Analogues (15th European Carbohydrate
Symposium 2009)
Uracil Polyoxin C: Synthesis and Studies of Analogues (GÖCH Chemitage 09)
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