Genetik und Genomik
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Genetik und Genomik Valéria László Csaba Szalai Erna Pap Sára Tóth András Falus Ferenc Oberfrank Herausgegeben von Csaba Szalai Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genetik und Genomik von Valéria László, Csaba Szalai, Erna Pap, Sára Tóth, András Falus, Ferenc Oberfrank und Csaba Szalai Copyright © 2013 Typotex Created by XMLmind XSL-FO Converter. Inhaltsverzeichnis Genetik und Genomik ........................................................................................................................ xi 1. Übertragung der genetischen Information ...................................................................................... 1 1. Der Zellzyklus und die Regulation des Zellzyklus ................................................................ 1 1.1. G0-G1 Übergang (Transition) ................................................................................... 2 1.2. G1–S Übergang, S-Phase ........................................................................................... 3 1.3. G2–M Übergang (Transition) .................................................................................... 4 1.4. M-Phase .................................................................................................................... 4 1.4.1. Die Gestaltung des Chromosoms ................................................................. 5 1.4.2. 1.1.4.2. Die Auflösung und Neubildung der Kernhülle ............................... 8 1.4.3. Aufbau des Spindelapparats und dessen Rolle in der Mitose ....................... 8 1.4.4. Die Metaphase-Anaphase Transition ......................................................... 11 1.5. Die wichtigsten Vorgänge der Zytokinese .............................................................. 12 1.6. Kontrollpunkte ........................................................................................................ 13 2. Die Meiose .......................................................................................................................... 14 2.1. Die Phasen der Meiose ........................................................................................... 14 2.2. Oogenese ................................................................................................................ 17 2.3. Spermatogenese ...................................................................................................... 18 2.4. Regulation der Meiose ............................................................................................ 19 3. Fragen ................................................................................................................................. 20 2. Mutationen und Polymorphismen ................................................................................................. 22 1. Gruppierung der Mutationen ............................................................................................... 22 2. Genmutationen .................................................................................................................... 24 3. DNA-Reparatur (repair) ...................................................................................................... 29 4. Mutagenitätstests ................................................................................................................. 30 5. Fragen ................................................................................................................................. 31 3. Zytogenetik. Chromosomenmutationen ........................................................................................ 33 1. Chromosomenmutationen oder strukturelle Chromosomenaberrationen ........................... 33 1.1. Deletionen .............................................................................................................. 34 1.2. Duplikation ............................................................................................................ 34 1.3. Translokationen ..................................................................................................... 35 1.3.1. Reziproke Translokation ........................................................................... 35 1.4. Inversionen ............................................................................................................ 37 1.5. Ringchromosom (zirkuläres Chromosom, Chromosomenring) ............................. 38 1.6. Isochromosom ....................................................................................................... 38 1.7. Dizentrische Chromosomen ................................................................................... 40 1.8. Azentrisches Fragment .......................................................................................... 41 2. Numerische Chromosomenaberrationen ............................................................................ 41 2.1. Euploide Chromosomenmutationen ...................................................................... 41 2.2. Aneuploide Chromosomenaberrationen ................................................................ 41 2.3. Die häufigsten numerischen Chromosomenaberrationen ...................................... 42 2.3.1. Trisomie 21 ............................................................................................... 43 2.3.2. Trisomie 13 ............................................................................................... 43 2.3.3. Trisomie 18 ............................................................................................... 44 2.4. Numerische Chromosomenaberrationen der Geschlechtschromosomen (Gonosomen) 44 2.4.1. Turner-Syndrom ........................................................................................ 44 2.4.2. Klinefelter-Syndrom ................................................................................. 44 2.4.3. Triplo X-Syndrom ..................................................................................... 44 2.4.4. Diplo-Y-Syndrom, Supermaskulinitäts-Syndrom oder Jacobs-Syndrom .. 45 3. Uniparentale Disomie (UPD) ............................................................................................. 45 4. Mixoploide Mutationen ...................................................................................................... 46 4.1. Mosaizismus .......................................................................................................... 46 4.2. Chimärismus .......................................................................................................... 47 5. Fragen ................................................................................................................................ 48 4. Epigenetik ..................................................................................................................................... 49 1. Epigenetische Änderungen – Molekulare Veränderungen .................................................. 49 iii Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genetik und Genomik 1.1. DNA-Methylierung ................................................................................................ 49 1.2. CpG, als Mutationsheißpunkt ................................................................................. 50 1.3. Histonmodifikationen ............................................................................................. 50 2. Nicht-Kodierende RNA ...................................................................................................... 50 3. Epigenetische Phänomene ................................................................................................... 50 3.1. X-Inaktivierung ...................................................................................................... 51 3.2. Genomische Prägung .............................................................................................. 51 3.2.1. Imprinting-bedingte Krankheiten ............................................................... 52 3.2.2. Zweck der genomischen Prägung ............................................................. 53 4. Die Bedeutung der epigenetischen Wirkungen .................................................................. 53 5. Fragen ................................................................................................................................. 55 5. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge ....................................................................................... 56 1. Einführung .......................................................................................................................... 56 2. Allgemeine genetische Begriffe, Definitionen .................................................................... 57 3. Begriffe/Phänomene, die den klassischen monogenen Erbgang beeinflussen .................... 58 4. Autosomal dominante Vererbung ....................................................................................... 62 4.1. Die allgemeine Charakterisierung der autosomal dominanten Vererbung (AD) .... 62 4.2. Krankheiten: verursacht durch Genmutationen von strukturellen Proteinen ......... 63 4.2.1. Marfan Syndrom ........................................................................................ 63 4.2.2. Osteogenesis imperfecta ............................................................................. 63 4.3. Krankheiten: verursacht durch Genmutationen von Rezeptoren ............................ 63 4.3.1. Achondroplasie .......................................................................................... 63 4.3.2. Familiäre Hiperkolesterinemie ................................................................... 63 4.3.3. Polycystische Nieren .................................................................................. 63 4.4. Mutation eines Gens, das für ein Protein mit bis jetzt unbekannter Funktion kodiert 64 4.4.1. Huntington Chorea ..................................................................................... 64 4.5. Mutation der Protoonkogene ................................................................................. 64 4.6. Pharmakogenetische Erkrankungen ........................................................................ 64 4.6.1. Porfiria ...................................................................................................... 64 4.6.2. Malignus hypertermia ............................................................................... 64 5. Autosomal rezessive Vererbung .......................................................................................... 64 5.1. Die allgemeine Charakterisierung der autosomal rezessiven Vererbung (AR) ..... 65 5.2. Stoffwechseldefekte - Enzymopathien ................................................................... 65 5.2.1. Phenylketonurie (PKU) .............................................................................. 66 5.2.2. Klassischer Albinismus .............................................................................. 66 5.2.3. 5.5.2.3. Kongenitale adrenale Hyperplasie (CAH) ..................................... 66 5.2.4. Xeroderma pigmentosum ........................................................................... 66 5.3. Mukoviscidose ........................................................................................................ 66 5.4. Hämoglobinopathien .............................................................................................. 66 5.4.1. 5.5.4.1. Sichelzellanämie ........................................................................... 67 5.4.2. 5.5.4.2. Thalassemien ................................................................................. 67 6. Gene und Tumoren ............................................................................................................. 67 7. Gene und Medikamente ...................................................................................................... 67 8. Konklusion .......................................................................................................................... 68 9. Fragen ................................................................................................................................. 68 6. Die Rolle des Geschlechts bei der Vererbung .............................................................................. 70 1. X-Chromosomaler Erbgang ............................................................................................... 70 1.1. X-Cromosomal Dominanter (XD) Erbgang ........................................................... 70 1.2. X-chromosomal rezessiver Erbgang (XR) .............................................................. 71 2. Y-Chromosomaler (Holandrischer) Erbgang ...................................................................... 72 3. Vom Geschlecht beeinflusster Erbgang .............................................................................. 73 4. Geschlechtslimitierter Erbgang ........................................................................................... 73 5. Genomische Prägung .......................................................................................................... 73 6. Zytoplasmatischer Erbgang ................................................................................................. 73 6.1. Mitochondriale Vererbung ...................................................................................... 73 7. X-Inaktivierung ................................................................................................................... 74 8. Fragen ................................................................................................................................. 75 7. Die Genetik von biologischen Prozessen ...................................................................................... 77 1. Entwicklungsgenetik ........................................................................................................... 77 1.1. Morphogene ............................................................................................................ 77 iv Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genetik und Genomik 1.2. Homöotische Gene ................................................................................................. 78 2. Genetik des Geschlechts ..................................................................................................... 78 2.1. Differenzierung des männlichen Geschlechts bei Säugern ..................................... 78 2.2. Differenzierung des weiblichen Geschlechts bei Säugern ...................................... 80 3. Stammzellbiologie .............................................................................................................. 81 4. Onkogenetik ........................................................................................................................ 82 4.1. Onkogene ................................................................................................................ 82 4.2. Tumorsuppressoren ................................................................................................ 83 4.3. Anti-Apoptotische Gene ......................................................................................... 83 4.4. Telomerase ............................................................................................................. 83 5. Immungenetik ..................................................................................................................... 84 6. Fragen ................................................................................................................................. 88 8. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom ...................................................... 89 1. Die Genomik ....................................................................................................................... 89 2. Das Humangenomprojekt (HGP) ........................................................................................ 89 3. DNA Sequenzierung ........................................................................................................... 90 4. Ergebnisse von HGP ........................................................................................................... 92 5. Variationen im Genom ........................................................................................................ 94 6. Junk DNA im menschlichen Genom ................................................................................... 96 7. Vergleichende Genomik ...................................................................................................... 98 8. Literatur ............................................................................................................................... 98 9. Fragen ................................................................................................................................. 99 9. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen ...................................................... 102 1. Allgemeine Merkmale der komplexen Erkrankungen ..................................................... 102 2. Umweltfaktoren ................................................................................................................ 103 3. Warum ist es wichtig den genomischen Hintergrund der komplexen Erkrankungen zu untersuchen? .......................................................................................................................... 103 4. Qualitative und quantitative multifaktorielle Merkmale ................................................... 103 5. Erblichkeit der komplexen Erkrankungen und Merkmale ................................................ 104 6. Berechnung der Erblichkeit ............................................................................................... 105 7. Schwierigkeiten mit den Untersuchungen des genomischen Hintergrundes von den komplexen Erkrankungen ........................................................................................................................ 105 8. Missing heritability ........................................................................................................... 106 9. Schwierigkeiten mit den seltenen Varianten ..................................................................... 107 10. Epigenetik der komplexen Erkrankungen ....................................................................... 107 11. Das zufällige Verhalten des Genoms ............................................................................. 108 12. Statistische Probleme ...................................................................................................... 108 13. Mögliche Lösungen ......................................................................................................... 109 14. Warum steigern die Häufigkeiten der komplexen Erkrankungen? .................................. 109 14.1. Thrifty gene hypothesis ...................................................................................... 110 14.2. Hygiene-Hypothese ............................................................................................ 110 14.3. Weitere Theorien ................................................................................................ 111 15. Literatur ........................................................................................................................... 111 16. Fragen ............................................................................................................................. 112 10. Genomische Methoden für komplexe Erkrankungen ............................................................... 114 1. Genetische Markers ........................................................................................................... 114 2. Methoden für die genomischen Hintergründe der Erkrankungen ..................................... 114 2.1. Untersuchungen der genetischen Varianten .......................................................... 114 2.2. GWAS .................................................................................................................. 115 2.3. Auswertung der GWAS Ergebnisse ..................................................................... 116 2.4. Partial Genom-Screening ...................................................................................... 116 2.5. Positionelle Klonierung ........................................................................................ 116 2.6. Persönliche Genomik ............................................................................................ 116 2.7. Sequenzierung der nächsten Generation ............................................................... 117 2.8. Bestimmung der Genexpression ........................................................................... 117 2.9. Weitere Microarray-basierte Methoden ................................................................ 118 3. Tiermodelle ....................................................................................................................... 118 3.1. Die Vorteile der Tiermodelle ................................................................................ 118 3.2. Genetisch veränderten Tiere und Tiermodellen für menschliche Erkrankungen .. 119 3.3. Nachteile der Tiermodelle .................................................................................... 120 v Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genetik und Genomik 3.4. Experimentelle Tiermodelle ................................................................................. 4. Literatur ............................................................................................................................. 5. Fragen ............................................................................................................................... 11. Populations- und Evolutionsgenetik ......................................................................................... 1. Populationsgenetik ............................................................................................................ 1.1. Arten der Probensammlung .................................................................................. 1.2. Auswahl der Populationen für genetische Studien ............................................... 1.3. Hardy-Weinberg-Gleichgewicht ........................................................................... 1.4. Kopplung und Haplotyp ....................................................................................... 1.5. Founder-Populationen .......................................................................................... 1.6. Assoziationsstudien .............................................................................................. 1.7. Risiko Berechnungen ............................................................................................ 2. Evolutionsgenetik .............................................................................................................. 2.1. Gen-Umwelt Interaktionen und das menschliche Genom .................................... 2.1.1. Natürliche Selektion ................................................................................. 2.1.2. Rolle von Infektionen bei Bildung des Genoms ....................................... 2.1.3. Gendrift .................................................................................................... 2.2. Warum sind manche letalen Mutationen häufig? ................................................. 2.3. Beispiele für Umweltwirkungen am Genom ........................................................ 3. Literatur ............................................................................................................................. 4. Fragen ............................................................................................................................... 12. Gen-Umwelt Interaktion ........................................................................................................... 1. Penetranz der Mutationen ................................................................................................. 2. Interaktionen zwischen hochpenetranten Mutationen und die Umwelt ............................ 3. Beispiele für Interaktionen zwischen lowpenetranten Mutationen und die Umwelt ......... 4. Rauchen-Genom Interaktion ............................................................................................. 4.1. Genomische Hintergrund des Rauchens ............................................................... 4.2. Rauchen-Gen Interaktion in Erkrankung Suszeptibilität ...................................... 4.3. Weitere Beispiele für Gen-Umwelt Interaktionen ................................................ 5. Genomische Untersuchungen der Gen-Umwelt Interaktion ............................................. 6. Nutrigenetik und Nutrigenomik ........................................................................................ 7. Die Zukunft der Gen-Umwelt Interaktion ......................................................................... 8. Literatur ............................................................................................................................. 9. Fragen ............................................................................................................................... 13. Pharmakogenetik und Pharmakogenomik ................................................................................ 1. Definition der Pharmakogenetik und Pharmakogenomik ................................................. 2. Ziele der Pharmakogenomik ............................................................................................. 2.1. Die Entwicklung von Medikamenten ................................................................... 2.2. Unerwünschte Arzneimittel-Wirkungen ............................................................... 3. Genomischer Hintergrund der Unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen ......................... 4. Schwierigkeiten der pharmakogenomischen Forschungen ............................................... 5. Genetische Varianten in Pharmakokinetik ........................................................................ 6. Genetische Varianten in Pharmakodynamik ..................................................................... 7. Beispiele für pharmakogenetische Studien ....................................................................... 7.1. Statine ................................................................................................................... 7.1.1. Clopidogrel ............................................................................................... 7.2. Pharmakotherapie von Asthma ............................................................................. 7.3. Interaktion zwischen genetischen Variationen und β2-Agonisten ......................... 7.4. Interaktion zwischen genetischen Variationen und Leukotrien-Antagonisten ...... 8. Die Zukunft der Pharmakogenomik .................................................................................. 9. Literatur ............................................................................................................................. 10. Fragen ............................................................................................................................. 14. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen .................................................................... 1. Einführung ........................................................................................................................ 2. Darstellung der Interaktionen ............................................................................................ 3. Human Interaktom ............................................................................................................ 4. Krankheitsgene in den Netzwerken ................................................................................... 5. Knoten und Kanten in Erkrankungen ................................................................................ 6. Human Diseasome ............................................................................................................ 7. Gemeinsame Gen-Hypothese ............................................................................................ vi Created by XMLmind XSL-FO Converter. 121 121 121 123 123 123 124 125 126 127 128 129 129 129 129 130 131 131 132 133 134 136 136 136 137 137 138 138 140 142 143 145 145 147 149 149 149 149 150 151 151 152 153 153 153 154 154 155 155 156 156 159 160 160 160 161 161 164 165 165 Genetik und Genomik 8. Gemeinsame metabolische Stoffwechselweg Hypothese .................................................. 167 9. Gemeinsame microRNA Hypothese ................................................................................. 167 10. Phänotypische Krankheitsnetzwerke ............................................................................... 167 11. Anwendungen der systembiologischen Ansätze ............................................................ 168 12. Literatur ........................................................................................................................... 170 13. Fragen ............................................................................................................................. 171 15. Bioethische und forschungsethische Fragen der genetischen Forschung ................................. 172 1. Geschichte ......................................................................................................................... 172 2. Ethische Herausforderungen der genetischen Forschung, die Frage der „Grenzen‖ ......... 173 3. Die Biobanken ................................................................................................................... 175 4. Einige allgemeine ethisch belangte Fragen ....................................................................... 176 5. Bioethische und forschungsethische Fragen spezifisch für genetische Forschung ........... 176 6. Ethische Fragen der kommerziellen Nutzung von Informationen genetischer Herkunft .. 177 7. Ethische und rechtliche Regelung von der genetischen Forschung, der Biobanken und der Datenbehandlung .................................................................................................................. 177 8. Konklusion ........................................................................................................................ 178 9. Literaturverzeichnis ........................................................................................................... 178 vii Created by XMLmind XSL-FO Converter. Abbildungsverzeichnis 1.1. Die Phasen des Zellzyklus (G1, S, G2, M) und dessen Kontrollpunkte (G1, G2, M). Dieser Kontrollmechanismus lässt den Zellzyklus nur im dem Fall weitergehen, wenn kein Defekt bei den Kontrollpunkten wahrgenommen wird und den Zellzyklus arretiert. ................................................ 1 1.2. Zusammenfassung des Zurückkehrs der Zelle von der G 0-Phase in den Zellzyklus, dessen Bedingungen und die Inhibition des Zurückkehrs ............................................................................. 3 1.3. Entstehung des aktiven MPF. Zuerst bindet sich Cyclin B an die Kinase Cdk1, danach wird der Komplex von einer aktivierenden und einer inhibierenden Kinase phosphoryliert. Später spaltet eine Phosphatase von dem immer noch inaktiven MPF die hemmende Phosphatgruppe ab, damit der aktive MPF entsteht – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK28366/figure/A4636/?report=objectonly; 2013. 02. 20. ................................................................................................................................................ 4 1.4. Die Gestaltung eines Chromosoms aus der DNA-Doppelhelix http://www.nature.com/scitable/topicpage/eukaryotic-genome-complexity-437; 2013. 02. 20. ....... 5 1.5. Die Struktur der Cohesine und Condensine http://www.nature.com/nrg/journal/v4/n7/box/nrg1110_BX3.html; 2013.02.19. ............................. 6 1.6. Ein eukaryotisches Chromosom http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/biobk/biobookmito.html; 2013. 02. 20. .................... 7 1.7. Schematische Darstellung des Zentrosoms. In der Mitte befinden sich zwei, aufeinander senkrecht liegende Zentriolen, und diese sind von der pericentriolaren Matrix umgeben. Diese Matrix dient als Ausgangsort der Mikrotubuli – http://www.irbbarcelona.org/index.php/es/research/programmes/cell-anddevelopmental-biology/microtubule-organization; 2013.02.19. ........................................................ 8 1.8. Die Verdopplung und Teilung des Zentrosoms http://www.nature.com/nrc/journal/v2/n11/box/nrc924_BX3.html; 2013. 02. 20. ............................ 9 1.9. Die Struktur des Spindelapparats. Für Einzelheiten siehe den Text http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/19_25.jpg; 2013. 02. 20. ..... 11 1.10. Andocken der Kinetochor-Mikrotubuli an den Kinetochor Regionen http://en.wikipedia.org/wiki/File:MT_attachment_configuration-en.png; 2013. 07.03. ................... 12 1.11. Trennung der Chromatiden (Anaphase A) und das Auseinanderrücken der Polen voneinander (Anaphase B) - http://greatcourse.cnu.edu.cn/xbfzswx/wlkc/kcxx/11English.htm; 2013. 02. 20. ... 12 1.12. Die Struktur des Synaptonemalen Komplexes. Der Komplex hält die homologen Chromosomen (Bivalente, Tetraden) leiterartig beisammen - http://drugline.org/img/term/synaptonemal-complex14373_1.jpg; 2013. 02. 20. ............................................................................................................... 15 1.13. Die unterschiedliche Richtung der Kinetochoren in Mitose und Meiose I http://www.cell.com/retrieve/pii/S0092867406011524; 2013. 02. 20. ............................................. 15 1.14. Meiotische Non-Disjunktion - http://drugline.org/img/term/meiotic-nondisjunction-9351_1.jpg; 2013. 02. 20. .................................................................................................................................... 17 1.15. Vergleichung der Oogenese (rosa) und Spermatogenese (blau). Für Einzelheiten siehe den Text http://www.nature.com/nrg/journal/v11/n2/fig_tab/nrg2723_F1.html#figure-title; 2013. 02. 20. .. 18 2.1. Beispiele für induzierte Mutationen ......................................................................................... 23 2.2. ................................................................................................................................................... 24 3.1. Gruppierung der strukturellen Chromosomenaberrationen ...................................................... 33 3.2. Schematische Repräsentierung der Entstehung und möglicher Konsequenzen eines inäqualen Crossing-overs (chromosomale Überkreuzung). ............................................................................. 35 3.3. Robertson Translokation ........................................................................................................... 36 3.4. Mögliche Folgen von strukturellen Chromosomenaberrationen während der Meiose ............. 38 3.5. ................................................................................................................................................... 39 3.6. Die Entstehung eines dizentrischen Chromosoms durch nicht homologe Rekombination ....... 40 3.7. Prävalenz der numerischen Chromosomenaberrationen https://www.landesbioscience.com/curie/images/chapters/Levy_1.jpg: 2013. 07. 04. .................... 43 3.8. Entstehung von uniparentaler Hetero- oder Isodisomie ............................................................ 45 5.1. Tabelle 5.3. Klassischer Albinismus und die Syndrome vom albino Phenotyp. Ihr genetischer Hintergrund und die veränderten / verlorenen zellbiologischen Funktionen. .................................. 65 5.2. Die Faktoren, die die monogene Vererbungen beeinflussen ................................................. 68 7.1. ................................................................................................................................................... 79 7.2. Somatische Rekombination der V-D-J Gene für die schwere Kette der Immunglobuline http://en.wikipedia.org/wiki/File:VDJ_recombination.png; 2013. 07. 03. ...................................... 84 7.3. http://pandasthumb.org/archives/2006/07/3-recent-report.html; 2013. 07.03. .......................... 85 viii Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genetik und Genomik 7.4. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Class_switch_recombination.png 2013. 07. 03. .................... 86 8.1. Vergleich der Effizienz verschiedener alter und neuer Sequenzierungsmethoden (http://www.ebook3000.com/Taschenlehrbuch-Humangenetik--Auflage--8-_176255.html; 15/02/2013) 91 8.2. Änderung der Preise der DNA-Sequenzierung (rote Linie) und die Menge der Sequenzdaten (blaue Linie). S. http://www.nature.com/news/2009/091021/full/464670a.html; 15/02/2013 ................... 91 8.3. Strukturelle Variationen im Genom (15/02/2013) ..................................................................... 95 9.1. Beispiele für die Fälle der fehlenden Vererbbarkeit. Es wurde anhand der Tabelle im Artikel von Manolio et al. angefertigt (Manolio TA, et al. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature. 2009 Oct 8;461(7265):747-53). ........................................................................................ 106 11.1. LD Karte (http://woratanti.files.wordpress.com/2009/11/picture6.jpg). Es gibt 3 Dreieckregionen, die 3 Haplotypblöcke repräsentieren. Die Nummern oberhalb der Karte zeigen die Marker Nummern und Namen der Allele. Die Zahlen in den Kästchen sind r2 zwischen den Markern (SNPs). r2 ist das Quadrat des LD Korrelationskoeffizienten. ................................................................................................. 127 14.1. Krankheits- und essentielle Gene in dem Interaktom ........................................................... 162 14.2. Schematische Darstellung der Unterschiede zwischen essentiellen und nicht-essentiellen Krankheitsgenen. Nicht-essentielle Krankheitsgene (dargestellt als blaue Knoten) segregieren an der Netzwerkperipherie, während in utero essentielle Gene (dargestellt als rote Knoten) auf dem Funktionszentrum (codieren Hubs, exprimiert in vielen Geweben) des Interaktom (Barabási AL et al., 2011). ............................................................................................................................................. 162 14.3. Eine Krankheitsmodul repräsentiert eine Gruppe der Knoten (rote), deren Perturbation (durch Mutationen, Deletionen, Kopienzahl Variationen oder Veränderungen der Expression) mit einem bestimmten Krankheitsphänotyp verknüpft wird (Barabási AL et al., 2011). ............................... 163 14.4. Störungen (Perturbation) in biologischen Systemen können zu Krankheiten führen. Es gibt Beispiele für Knotenentfernung und Kantenmodifizierung (Vidal M et al., 2011). ...................................... 164 14.5. Human Krankheitsnetzwerk (KNW) Im KNW entspricht jeder Knoten einer deutlichen Störung, gefärbt auf der Grundlage der Störung Klasse, zu der sie gehört.Eine Verbindung zwischen Erkrankungen in derselben Klasse wird mit dem entsprechenden Dimmer Farbe gefärbt. Verbindungen unterschiedlicher Erkrankungklassen werden grau gefärbt.Die Größe der einzelnen Knoten ist proportional zu der Anzahl von Genen, die an der entsprechenden Erkrankung assoziiert ist. Die Namen von Erkrankungen mit >10 assoziierten Genen sind angegeben (Goh et al 2007.). .................................................................. 166 14.6. Komorbidität zwischen Erkrankungen im gemeinsamen KNW gemessen durch den Logarithmus des relativen Risikos. Wenn die krankmachenden Mutationen das gleiche Gen (2. Säule) beeinflussen, dann ist die Komorbidität 2-mal höher. Wenn sie die gleichen Domäne des gemeinsamen Krankheitsproteins beeinflussen, dann wird der Komorbidität noch höher (Barabási AL et al., 2011). ....................... 166 14.7. Krankheitsbezogenheiten basieren auf gemeinsame Wege in der Panther, KEGG und CGAPBioCarta Datenbanken. Grüne Knoten zeigen die neurodegenerativen Erkrankungen, während rosa Knoten die Autoimmunerkrankungen markieren. Die Farben der Kanten die Knoten verbinden spiegeln den gemeinsamen Signalwegrang im Bereich von 3 (höchste Bezogenheit) bis 30 (niedrigste Bezogenheit). Parkinson-Krankheit (Park), Alzheimer- Krankheit (Alz), Multiple Sklerose (MS), rheumatoider Arthritis (RA) und Diabetes-Typ 1 (T1D) (Menon R et al., 2011). ......................... 168 ix Created by XMLmind XSL-FO Converter. Tabellenverzeichnis 1.1. ................................................................................................................................................... 19 2.1. ................................................................................................................................................... 27 5.1. Tabelle 5.1. Die Prävalenz von einigen vererbbaren Krankheiten. ............................................ 57 5.2. Tabelle 5.2. Zusammenfassung der genetischen Charakteristika und Phänomene im Zusammenhang mit einigen AD und AR Krankheiten. „Phänokopie‖ zeigt die Krankheiten, deren negative Genwirkung (die Wirkung der mutierten Gene) durch Diät oder Medikamente kompensiert werden kann ........ 61 8.1. Tabelle 8.1. Einige statistische Daten über das menschliche Genom (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/StatsTable) ............................................................. 92 8.2. Tabelle 8.2. Anzahl der Variationen in einigen Genomen ........................................................ 95 9.1. Tabelle 9.1. Eigenschaften der komplexen Erkrankungen, die die Aufklärung ihrer genomischen Hintergründe schwer machen. ....................................................................................................... 105 10.1. Tabelle 10.1. Einige Tiermodelle für Erkrankungen des Menschen die durch Manipulation eines Gens entwickelt worden sind. ........................................................................................................ 120 x Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genetik und Genomik András Falus, Valéria László, Ferenc Oberfrank, Erna Pap, Csaba Szalai, Sára Tóth Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Semmelweis Egyetem, 2014 © Falus András, László Valéria, Oberfrank Ferenc, Pap Erna, Dr. Szalai Csaba, Tóth Sára Typotex Kiadó, www.typotex.hu ISBN: 978-963-279-188-3 Creative Commons NonCommercial-NoDerivs 3.0 (CC BY-NC-ND 3.0) A szerzők nevének feltüntetése mellett nem kereskedelmi céllal szabadon másolható, terjeszthető, megjelentethető és előadható, de nem módosítható. Készült a TÁMOP-4.1.2/A/1-11/1-2011-0079 számú, „Konzorcium a biotechnológia aktív tanulásáért‖ című projekt keretében. xi Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 1. Übertragung der genetischen Information Valéria László Der Aufbau und die Funktion von Lebewesen werden von deren genetischer Information in Wechselwirkung mit der Umwelt bestimmt. Die Weitergabe von dieser, als DNA gespeicherten Information binnen einem Organismus oder von Generation zu Generation geschieht auf unterschiedliche Weisen. Das Ziel im vorigen Fall ist die mangel- und fehlerfreie Übertragung der Information, während es bei der Übertragung von Generation zu Generation neben der Aufrechterhaltung der genauen Menge der Information auch die Steigerung der Variabilität, zumindest bei höheren Organismen, ist. Zuerst erörtern wir die Übertragung der Information von Zelle zu Zelle binnen einem Organismus. 1. Der Zellzyklus und die Regulation des Zellzyklus Das Erbgut wird von Mutterzellen zu Tochterzellen eines jeden Organismus im Rahmen des Zellzyklus weitergegeben. Im Laufe des Zellzyklus duplizieren sich die Zellen, gefolgt von einer Zellteilung. Wir müssen jedoch zwischen den Ereignissen im Zytoplasma und im Zellkern unterscheiden. Die Verdopplung der DNA im Zellkern wird sehr präzise und streng geregelt, und das verdoppelte Erbgut wird dann in Form von Chromosomen verteilt, was zur Entstehung von zwei, genetisch identischen Zellen führt. Die Duplikation (das heißt hier Wachstum, Vergrößerung) und Teilung des Zytoplasmas ist weniger streng reguliert. Die Duplikation des Zellmaterials erfolgt während der Interphase, die in G1 (postmitotische Phase oder Präsynthesephase, die vor der Duplikation der DNA stattfindet), S (Synthesephase), und G2 (prämitotische Phase oder Postsynthesephase) Phasen unterteilt wird. In der M-Phase teilen sich die Chromosomen, das ist die eigentliche Mitose, gefolgt von der Teilung des Zytoplasmas, das heißt der Zytokinese. Oft werden diese zwei Phasen zusammen Mitose genannt. Die Zellen eines vielzelligen Organismus teilen sich mit sehr unterschiedlicher Intensität, aber die meisten Zellen befinden sich in der G0-Phase, wo es keine Teilung, oft auch kein Wachstum stattfindet. Um in die G1Phase zurückkehren zu können, brauchen die Zellen Wachstumsfaktoren, und/oder müssen sich an andere Zellen oder an die extrazelluläre Matrix verankern. Der Zellzyklus wird von einem komplexen Kontrollsystem reguliert, das Cyclin-abhängige Kinasen, Cdk-s (cyclin-dependent kinases) in seinem Mittelpunkt hat. Diese wurden nach den Cyclinen, die sie zu ihrer Aktivität benötigen, benannt. Die Konzentration der Cycline verändert sich vom Zellzyklus abhängig periodisch, zyklisch. Die Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinasen wird außer der Konzentration der Cycline auch von anderen Faktoren reguliert. Zu diesen Faktoren gehören die Cdk aktivierende und inhibierende Kinasen, die die Cdks phosphorylieren. Die von einem aktivierenden Enzym phosphorylierte Cdk wird aktiviert, die von einem inhibierenden Enzym phosphorylierte Cdk wird inaktiviert. Die Phosphatgruppen können dann von Phosphatasen entfernt werden, und dadurch die Cdk wieder inaktivieren, bzw. aktivieren. Eine andere Gruppe der Proteinen, die Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitoren, hemmen die Aktivität des Enzyms. Die Cdks werden darüber hinaus noch durch weitere Mechanismen reguliert. Die Expression von allen bereits erwähnten Proteinen kann auf der Transkriptions- und Translationsebene reguliert werden, und natürlich auch durch Ubiquitinierung und Degradierung im Proteasom. Diese Mechanismen zusammen bewirken die Komplexität und die präzise und subtile Regulation des Zellzyklus. Die Cyclin-abhängigen Kinasen regulieren den Zellzyklus durch die Phosphorylierung von Target Proteinen. Erst in den letzten Jahren wurde es erkannt, dass neben den Cdks auch andere Kinasen (z.B. Polo-like Kinasen und Aurorakinasen) in der Regulation des Zellzyklus eine Rolle spielen. Die Phasen des Zellzyklus folgen einander in strenger Ordnung und sind nicht miteinander vertauschbar. Ob die Zelle von der einen Phase in die nächste übergehen kann, wird bei den sogenannten Kontrollpunkten (checkpoint) entschieden. Ziel dieses Kontrollmechanismus ist es, für die genetische Identität der entstehenden Zellen zu sorgen (Abbildung 1.1). Abbildung 1.1. Die Phasen des Zellzyklus (G1, S, G2, M) und dessen Kontrollpunkte (G1, G2, M). Dieser Kontrollmechanismus lässt den Zellzyklus nur im dem Fall weitergehen, 1 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information wenn kein Defekt bei den Kontrollpunkten wahrgenommen wird und den Zellzyklus arretiert. Es gibt drei kritische Kontrollpunkte. Der erste, der G1 Kontrollpunkt (bei höheren Organismen auch Restriktionspunkt genannt), findet am Ende der G1-Phase statt und ist vor allem dafür verantwortlich, dass die DNA für mögliche Beschädigungen überprüft wird. Der zweite Kontrollpunkt, der G2-Kontrollpunkt, findet am Ende der G2-Phase statt. Hier werden die Qualität der DNA und der DNA-Duplikation überprüft. Der MKontrollpunkt findet während der Metaphase der Zytokinese statt. Hier wird es überprüft, ob sich die Chromosomen genau in der äquatorialen Ebene ordneten, und wird damit für die korrekte Trennung (Segregation) der Chromatiden gesorgt. Zusammenfassend also wird der Zellzyklus nur in dem Fall fortschreiten, wenn die DNA unbeschädigt und genau dupliziert ist, und sich die Chromosomen in der äquatorialen Ebene ordneten. Unten fassen wir die für mehrzellige Organismen charakteristischen Prozesse des Zellzyklus und deren Regulation zusammen. 1.1. G0-G1 Übergang (Transition) Da sich die Mehrheit der Zellen in einem erwachsenen mehrzelligen Organismus in der G 0-Phase befindet, müssen sie in den Zellzyklus erst zurückkehren. Im Grunde genommen bedeutet das den Überkehr des Restriktionspunktes (R). Vor dem Erreichen des Restriktionspunktes wird die Zelle von verschiedenen Faktoren in ihrer Umgebung beeinflusst. Bekommt die Zelle die geeigneten extrazellulären MatrixKomponenten und/oder Wachstumsfaktoren, wird die Transkription und Translation des, bis dahin fehlenden, Cyclin: Cyclin D, erhöht. Zur gleichen Zeit sinkt die Konzentration von einigen CdkInhibitoren, vor allem durch die Steigerung ihres Abbaus in dem Proteasom. Diese Cdk-Inhibitoren, p16, p15, p18 und p19, sind durch ihre Spezifizität charakterisiert: sie hemmen ausschließlich die Aktivität von Cdk4 und Cdk6, indem sie die Bindung von Cyclin D, aber auch die Aktivität des bereits existierenden Komplexes, hemmen. Die wichtigsten Substrate des aktiven Cdk4/6-Cyclin D Komplexes sind pRb (das Produkt des Retinoblastoma Gens, das für die Tumorbildung der Retina verantwortlich ist), und auch die Proteine p107 und p130. In ihrer unphosphorylierten Form binden all diese Proteine an E2F Proteine, die Mitglieder einer Familie von Transkriptionsfaktoren sind, die in diesem Prozess eine zentrale Rolle spielen. Die Struktur des pRb und der anderen zwei Proteinen verändert sich infolge der Phosphorylierung, so dass sie die Transkription aktivierenden E2F Proteine loslassen. Diese Phosphorylierung bedeutet den Überquer des Restriktionspunktes. Danach induzieren Mitglieder der E2F Familie die Transkription von mehreren Genen, die zum Übergang in die S-Phase nötig, oder für die S-Phase charakteristisch sind. Diese sind z.B. Cyclin E, Cyclin A, Thymidine-Kinase, DNA Polymerase, usw. Cyclin E koppelt sich an Cdk2, und ähnlich dem Cdk4/6Cyclin D Komplex, phosphoryliert vor allem das Rb Protein (positives Feedback). Der Cdk2-Cyclin A Komplex ist dagegen zum Beginn der S-Phase unerlässlich (Abbildung 1.2). 2 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Abbildung 1.2. Zusammenfassung des Zurückkehrs der Zelle von der G0-Phase in den Zellzyklus, dessen Bedingungen und die Inhibition des Zurückkehrs Natürlich können die Umweltbedingungen ungünstig sein, z.B. bei Hypoxia (bei intensiver Zellproliferation ist die Blutzufuhr zu den Zellen unzureichend), oder Vorhandensein von Faktoren die die DNA beschädigen (hier ist die Funktion des später noch weiter diskutierten G1 Kontrollpunktes bedeutend). In diesen Fällen kann das aktive p53 Protein in den Zellen in großen Mengen gefunden werden. Das Protein p53 ist auch ein Transkriptionsfaktor, der die Transkription eines anderen Proteins, des Cdk-Inhibitors p21 steigert. Das Protein p21 hemmt die Aktivität von allen, an der G1-Phase beteiligten Cdk Komplexen (Cdk4/6- Cyclin D, Cdk2Cyclin E, Cdk2- CyclinA), lässt die Zelle also nicht in die S-Phase übertreten. Diese Cdk Inhibitor-Familie hat noch zwei weitere bekannte Mitglieder: p27 und p57. Diese Proteine inhibieren die Verdopplung von beschädigter DNA, halten den Zellzyklus an, und ermöglichen die Reparatur des Defekts. In kurzem, sie verhindern, dass die Zellteilung zwei, genetisch nicht identische Zellen produziert (Abbildung 1.2). Oben wurden die zwei bekanntesten Tumorsuppressoren genannt. Einer von diesen ist p53, dessen Mangel oder Funktionsunfähigkeit bei der Hälfte aller Tumoren nachweisbar ist. Eine andere häufige Ursache für Tumorbildung ist die rezessive Mutation des rb Gens. Im Grunde genommen sind alle Gene, die für CdkInhibitoren kodieren, Tumorsuppressoren, da sie die Aktivität der Cdks, und damit die Zellteilung, hemmen. 1.2. G1–S Übergang, S-Phase Das wichtigste Ereignis der S-Phase ist die Verdopplung, das heißt die Replikation, der DNA. Da es in eukaryotischen Zellen, im Vergleich zu Prokaryoten, sehr viel DNA gibt, wird die Replikation an mehreren Stellen, die Origins genannt werden, angefangen. Die Initiatorproteine lagern sich an diese Stellen an die DNA, die DNA wird entwunden und die anderen Mitglieder des Replikationskomplexes treten ein. Der Replikationskomplex besteht aus nur teilweise bekannten Proteinen. Wie auch während des ganzen Zellzyklus spielen auch hier die Cyclin-abhängigen Kinasen die Hauptrolle. Zur Aktivierung des Cdk2-Cyclin E Komplexes ist der Abbau des Cdk-Inhibitors p27 notwendig, was von einer Ubiquitin-Ligase, dem SCF protein (Skp-Cullin-F-box Protein) durchgeführt wird. Am Ende phosphorylieren die aktivierten Cdk2 Proteine (und eine andere Proteinkinase, Cdk7) bisher nicht genau bekannte Mitglieder des Replikationskomplexes. Dies wiederum verhindert die Bildung und Bindung von einem neuen Initiationskomplex und sorgt dafür, dass die DNA nur einmal verdoppelt wird. Im Laufe der DNA Replikation werden beide Stränge als Matrizen benutzt, und die Nukleotide werden nach dem Prinzip der Komplementarität in den neuen Strang eingebaut. Den semikonservativen Charakter der DNA 3 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Synthese, also die Tatsache dass in den zwei neu entstandenen DNA Molekülen der eine Strang immer neu synthetisiert, der andere jedoch immer der alte Strang ist, wurden mit Untersuchungen mittels Monomeren, die radioaktiven Isotopen enthalten, nachgewiesen. Wegen der Eindeutigkeit der Basenpaarung stimmen die zwei neu entstandenen Moleküle miteinander zwangsläufig überein. 1.3. G2–M Übergang (Transition) Abbildung 1.3. Entstehung des aktiven MPF. Zuerst bindet sich Cyclin B an die Kinase Cdk1, danach wird der Komplex von einer aktivierenden und einer inhibierenden Kinase phosphoryliert. Später spaltet eine Phosphatase von dem immer noch inaktiven MPF die hemmende Phosphatgruppe ab, damit der aktive MPF entsteht – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK28366/figure/A4636/?report=objectonly; 2013. 02. 20. Die Regulation des G2–M Übergangs ist besser bekannt als die des G1–S Übergangs. Hier spielt der Mitosepromoting FaktorMPF eine Hauptrolle. MPF ist ein Komplex, der aus der Cyclin-abhängigen Kinase Cdk1 und Cyclin B besteht, aber zu dessen Aktivierung noch weitere posttranslationale Modifikationen (Veränderungen nach der Proteinbiosynthese) notwendig sind. Diese Modifikationen sind die folgenden: der inaktive MPF ist Substrat einer inhibierenden und einer aktivierenden Kinase. Die vorige phosphoryliert den MPF an einem Tyrosin, der letztere an einem Threonin. Danach spaltet eine Phosphatase (Produkt des cdc25 Gens) die durch den Inhibitor hinzugefügte Phosphatgruppe von dem immer noch inaktiven MPF ab, wodurch der MPF aktiviert wird (Abbildung 1.3). MPF hat zahlreiche Substrate, das bereits erwähnte Protein Cdc25, die Phosphatase, die den MPF aktiviert, ist das erste unter diesen. Im Laufe von diesem Prozess wird also im Rahmen eines positiven feedback Mechanismus mehr und mehr MPF aktiviert. In Säugerzellen funktioniert an diesem Punkt Cdc25C, eine der drei Cdc25 Phosphatasen (Cdc25 A, B und C). Danach stimuliert MPF den Übertritt in die M-Phase durch die Phosphorylierung von zahlreichen Zielproteinen. Zuerst phosphoryliert MPF die Laminae A, B und C der Kernlamina (Lamina Fibrosa Nuclei), was die Auflösung der Kernhülle bewirkt. Die ATPase vom Actomyosin wird auch vom MPF phosphoryliert, was die Inaktivierung des Enzyms, und damit eine Veränderung der Verteilung von Mikrofilamenten bewirkt. Dies wiederum führt zur charakteristischen morphologischen Veränderungen, zur Rundung der Zelle, und verhindert eine vorzeitige Zytokinese. MPF phosphoryliert auch die Condensine, die zur Kondensation der Chromosomen führt. Unter den Histonen werden H1 und 3 phosphoryliert. Auf indirekte Weise wird auch APC während der G2-M Übergangsphase aktiviert. Die MAP (Miktrobululin-assoziierte Proteine) sind auch Substrate für MPF. Die Veränderung dieser Proteine bewirkt die für die Zellteilung charakteristische Umstrukturierung der Mikrotubuli, die Entstehung der Mitosespindel. Der G2-M Übertritt und die Aktivation des MPF ist nur dann ermöglicht, wenn der hiesige Kontrollpunkt die Qualität der DNA und der Verdopplung befriedigend fand. 1.4. M-Phase 4 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Die M-Phase, wie die Interphase auch, ist ein komplizierter Prozess und besteht aus einer Reihe von Vorgängen, die jedoch in einige charakteristische, morphologisch auch abgrenzbare Phasen unterteilt werden können. Während der Mitose erfolgt die Teilung der DNA in Form von Chromosomen, und während der darauffolgenden Zytokinese teilt sich das Zytoplasma. Die Phasen und Ereignisse der Mitose sind die folgenden: Prophase : Im Zellkern kondensiert das Chromatin und sichtbare Chromosomen werden geformt. Dabei wird die DNA gänzlich aufgeschraubt. Da sich die DNA noch bevor der M-Phase, bereits während der Interphase, verdoppelt hat, bestehen alle Chromosomen aus zwei Chromatiden (Schwesterchromatiden). Im Zytoplasma teilt sich das verdoppelte Zentrosom (Zentralkörperchen) und beginnt zu den gegenüberliegenden Polen der Zelle zu wandern, und die Bildung der aus Mikrotubuli bestehenden Mitosespindel beginnt. Prometaphase : Das Nucleolus (Kernkörperchen) löst sich auf, die Bildung der Chromosomen schreitet fort. Die Kernhülle zerfällt in Vesikeln. An den Zentromeren der Chromosomen bilden sich Kinetochore, je eins pro Chromatid, zu denen sich die Kinetochor-Mikrotubuli anheften. Auch die zwei andere Mikrotubuli-Strukturen werden in dieser Phase gebildet: die astralen Mikrotubuli und die polaren Mikrotubuli. Metaphase : Mithilfe der Kinetochorfasern ordnen sich die Chromosomen in der Äquatorialebene der Zelle an. Die Kinetochor-Regionen richten sich an den entgegengesetzten Polen der Zellen, und die Mikrotubuli heften sich an jedes Chromosom von der Seite der beiden Zentrosomen. Anaphase: Die Chromatiden trennen sich voneinander und wandern zu den entgegengesetzten Polen der Zelle. Beim Auseinanderrücken der Chromosomen spielen zu dem Beginn der Anaphase (Anaphase I) die Kinetochorfasern, am Ende der Anaphase (Anaphase II) die Polarfasern die Hauptrolle. Die Anaphase ist die kürzeste Phase der Mitose. Telophase: Die Kinetochor-Mikrotubuli werden abgebaut, eine neue Kernhülle wird um die Chromatiden (Tochterchromosomen) gebildet. Die Chromosomen dekondensieren (entschrauben sich), und damit liegt nun wieder dekondensiertes Chromatin in der Zelle. Neue Nucleoli (Kernkörperchen) werden gebildet. Die Polarfasern verlängern sich und dehnen die Zelle noch weiter aus. Nach der Mitose wird die Zytokinese dargestellt. Zytokinese: Die Einschnürung des Zytoplasmas beginnt am Ende der Anaphase, und wird in der Telophase offenbar. In der Mitte der Zelle, zur Achse der Mitosespindel senkrecht, entsteht eine Einschnürung (ein kontraktiler Ring), die sich immer mehr vertieft, und so die Verbindung zwischen den zwei Zellteilen immer mehr einengt. Aus den Resten der einander deckenden Teile der Polarfasern entsteht das Flemmingkörperchen. Schließlich teilt sich das Zytoplasma ganz und mithilfe der Zentrosomen entsteht die, für die Interphase charakteristische, Mikrotubuli-Struktur. Unten werden die oben zusammengefassten Ereignisse in Einzelheiten diskutiert. 1.4.1. Die Gestaltung des Chromosoms Chromosomen, diese einige µm lange Strukturen, sind bei Eukaryoten notwendig, damit die mehrere Zentimeter lange, verdoppelte DNA genau und ohne Brüche geteilt werden kann. Bei der Gestaltung eines Chromosoms wird die DNA in ihrer Länge um die 10.000-fache verkürzt. Wie diese Verkürzung in Einzelheiten geschieht, wissen wir noch nicht genau. Unten ist ein Modell vorgeführt, das teilweise bereits bewiesen wurde (Abbildung 1.4). Abbildung 1.4. Die Gestaltung eines Chromosoms aus der DNA-Doppelhelix http://www.nature.com/scitable/topicpage/eukaryotic-genome-complexity-437; 2013. 02. 20. 5 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Histon H1verpackt die Nukleosomen, und so entsteht Chromatin (auch als Solenoidstrang bekannt) mit einem Durchmesser von 30 nm. Diese Perlenketten-ähnliche Nukleosom-linker Region-Nukleosom-usw. Struktur hat einen Durchmesser von 11 nm. Bei der Gestaltung des Chromatins verknüpft Histon H1 sechs Nukleosomen auf der gleichen Ebene miteinander. Bei der nächsten Stufe der Organisation bildet das Chromatin, sich an ein Proteingerüst (Chromosomgerüst) heftend, Schleifen. Diese Schleifen bilden die Replikations- und Transkriptionseinheiten und haben einen Durchmesser von 300 nm. Diese Schleifenkette wird noch stärker aufgeschraubt und bildet das Metaphasen-Chromosom, mit einem Durchmesser von 1400 nm (Abbildung 4). Bei der Chromosomen-Kondensation spielen die, von MPF phosphorylierten Condensine, eine bedeutende Rolle. Zwei, einander strukturell ähnliche Proteinkomplexe unterstützen die Gestaltung und das Funktionieren des Chromosoms: die bereits erwähnten Condensine und die Cohesine. Beide Komplexe bestehen aus, mit ATP-Hydrolase Aktivität ausgerüsteten, SMC (structural maintenance of chromosomes) Proteinen und regulatorische Proteinen. Nach der neuesten Konzeption bilden diese Proteinkomplexe ringförmige Strukturen (Abbildung 1.5). Abbildung 1.5. Die Struktur der Cohesine und Condensine http://www.nature.com/nrg/journal/v4/n7/box/nrg1110_BX3.html; 2013.02.19. 6 Created by XMLmind XSL-FO Converter. - Übertragung der genetischen Information Das Metaphasen-Chromosom besteht aus den folgenden Teilen. Da die DNA sich während der S-Phase verdoppelt hat, besteht das Chromosom aus zwei Chromatiden, die in dieser Phase nur in der Region der primären Einschnürung, des Zentromers, aneinander geknüpft sind. Die DNA Moleküle werden nach der DNA Synthese von den oben erwähnten Cohesinen ringartig zusammengehalten. Der Grossteil der Cohesine löst sich vom Chromosom bereits im Laufe der Prophase, und bis zum Ende der Metaphase bleiben nur noch im Bereich des Zentromers Reste von Cohesinen übrig. Die Chromatiden trennen sich in der Anaphase, nach der Abspaltung der Cohesine, vom Zentromer-Bereich. Die Chromosomen werden nach der Lage des Zentromers in Gruppen unterteilt (siehe ’Zytogenetik’). Das Zentromer-Bereich bestimmt die Position des Kinetochors, das während der Pro- und Metaphasen zum Zentromer geknüpft ist, und als Dockungsstelle für die Spindelfaser (ungefähr 30-40) fungiert. Morphologisch betrachtet ist das Kinetochor eine Platte aus drei Proteinschichten, die unter anderem Dynein- und Kynesin-artige Motorproteine enthält. Bei einer bestimmten Autoimmunerkrankung, der Sklerodermie, werden Antikörper gegen einen Bestandteil des Kinetochors produziert. Das Zentromer teilt die Chromosomen in zwei Armen, deren Enden Telomere genannt werden. Diese Bereiche sind bei dem Erhalten der Chromosomenintegrität wichtig (Abbildung 1.6). Abbildung 1.6. Ein eukaryotisches Chromosom http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/biobk/biobookmito.html; 2013. 02. 20. 7 Created by XMLmind XSL-FO Converter. - Übertragung der genetischen Information Es gibt Chromosomen - in dem Humangenom fünf Paare - die zwei Einschnürungsstellen aufweisen. Hier befindet sich in großer Kopienzahl das Gen der großen rRNA Untereinheit (45S), und deshalb wird diese Region NOR, oder Nukleolus-organisierende Region, genannt. 1.4.2. 1.1.4.2. Die Auflösung und Neubildung der Kernhülle Die Laminae der sich an die innere Kernhülle heftende Lamina Fibrosa Nuclei sind die wichtigsten Substrate des MPF. Lamina B ist membran-gebunden, Laminae A und C finden sich in solubler Form im Zytoplasma. Während der Metaphase, der Phosphorylierung folgend, zerfällt die Kernhülle zu Vesikeln. Auch die Kernporen zerfallen in ihre Basiskomponente. Am Ende der Mitose, in der Telophase, dephosphorylieren Phosphatasen die Laminae. Die Neugestaltung der Lamina Fibrosa Nuclei beginnt an de Chromosomen, und so entsteht die neue Kernhülle um die Chromosomen herum. Während die Chromosomen sich einander nähern, verschmelzen diese Kernhüllenfragmente und die Poren werden neu organisiert. Schließlich dekondensieren die Chromosomen und es entsteht das neue Chromatin. 1.4.3. Aufbau des Spindelapparats und dessen Rolle in der Mitose Der Spindelapparat besteht aus dem Zentrosom (Zentralkörperchen) und den Mikrotubuli. In tierischen Zellen ist das wichtigste Mikrotubuli-organisierendes Zentrum (MTOC) das Zentrosom, das sich in der Interphase meistens in der Nähe des Zellkerns befindet. In der Mitte des Zentrosoms befinden sich zwei, senkrecht aneinander liegende zylindrische Strukturen, die Zentriolen, die an ihren Basen von Proteinen zusammengebunden sind. Die Zentriolen sind von einer amorphen Proteinmatrix, der pericentriolaren Matrix, umgeben, die von vielen verschiedenen Proteinen gebildet wird. Die Zentriolen bestehen aus neun Mikrotubuli Tripletts (9x3), also 27 Mikrotubuli, die windmühlenartig organisiert sind. Die Mikrotubuli zweigen sternartig von der pericetriolaren Matrix ab, deshalb wird diese Region auch Aster genannt (Abbildung 1.7). Die negativen Polen der Mikrotubuli sind gegen die Zentriolen, die positiven Polen auswärts gerichtet. In jeder eukaryotischen Zelle gibt es ein Mikrotubuli-organisierendes Zentrum (MTOC), das aber nicht unbedingt Teil eines Zentriols ist. Es wurde demonstriert, dass zur Organisation der Mikrotubuli und die Polymerisation der TubulinMonomere nicht die Zentriolen, sondern eine dritte Form von Tubulin, γ-Tubulin, nötig ist, das sich in tierischen Zellen in der pericentriolaren Matrix als γ-Tubulin-Ring befindet. Abbildung 1.7. Schematische Darstellung des Zentrosoms. In der Mitte befinden sich zwei, aufeinander senkrecht liegende Zentriolen, und diese sind von der pericentriolaren Matrix umgeben. Diese Matrix dient als Ausgangsort der Mikrotubuli – http://www.irbbarcelona.org/index.php/es/research/programmes/cell-anddevelopmental-biology/microtubule-organization; 2013.02.19. 8 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Abbildung 1.8. Die Verdopplung und Teilung des Zentrosoms http://www.nature.com/nrc/journal/v2/n11/box/nrc924_BX3.html; 2013. 02. 20. 9 Created by XMLmind XSL-FO Converter. - Übertragung der genetischen Information Neben der Duplikation der DNA, wird es durch die Verdopplung und Teilung des Zentrosoms im Laufe des Zellzyklus gesichert, dass die entstehenden Tochterzellen genetisch identisch sind. Falls sich das Zentrosom nicht verdoppelt, kann keine Mitosespindel formen, und es geschieht keine Zellteilung, was wiederum zur Polyploidie führt. Immerhin, wenn sich das Zentrosom mehrmals verdoppelt, entstehen mehrere Zellpolen, und die Chromosomen werden ungleich zwischen den Tochterzellen verteilt (siehe bei der Diskussion der Ursachen von atypischen Mitosen). In der späten G1-Phase entfernen sich die Zentriolen ein bisschen voneinander, und in der S-Phase beginnt ihre Verdopplung, senkrecht zu den ursprünglichen Zentriolen. Dieser Prozess dauert bis zur nächsten G1-Phase. Die zwei Zentriolen-Paare trennen sich voneinander am Ende der G2-Phase, bzw. am Anfang der Mitose. Schließlich wandern die Zentriolen mithilfe der Mikrotubuli und Motorproteinen zu den zwei entgegengesetzten Polen der Zelle, wo sie die charakteristische Mikrotubuli-Struktur der Mitosespindel organisieren (Abbildung 1.8). Dazu ist jedoch auch der MPF nötig, weil die MAP, die Mikrotubuli-assoziierten Proteine, die am Anfang der Mitose phosphoryliert werden, die Substrate des MPF sind. Wahrscheinlich wird dank der Phosphorylierung der MAP das Mikrotubuli-Netzwerk umstrukturiert und die Mitosespindel geformt. In einer Zelle in der Interphase befinden sich relativ wenige, lange, und sehr stabil strukturierte Mikrotubuli. Die Mitosespindel ist dagegen charakterisiert von der Gegenwart zahlreicher, kurzer und äußerst dynamischer Mikrotubuli. In der Prophase entstehen sehr viele, ihre Länge dynamisch ändernde Mikrotubuli an allen Seiten um die sich voneinander entfernenden Zentrosomen. Die Mikrotubuli werden stabilisiert, indem sie sich mit ihren positiven Enden zu einer anderen Struktur verknüpfen. Die einander gegenüber wachsenden Mikrotubuli können sich miteinander verknüpfen und so entstehen die einander teilweise deckenden polaren Mikrotubuli. In der Überlappungsregion finden sich wahrscheinlich die positiven Enden der Motorproteine, die teilweise in der Stabilisierung, teilweise im Auseinanderstoßen der zwei Polen in der Anaphase B eine Rolle spielen. In der Prometaphase, wenn sich die Kernhülle auflöst, können sich die Mikrotubuli nicht nur aneinander, sondern zufälligerweise auch an die Chromosomen verknüpfen. Es wurde beobachtet, dass das Chromosom bei diesem Prozess mithilfe seines Kinetochors und Dynein entlang der Mikrotubuli rutscht. In der Nähe des Zentrosoms wirkt eine seltsame Kraft, der Polwind, der nicht näher bekannt ist. Das Wesentliche an dieser Kraft ist es, dass sie alle größere Partikel von den Zellpolen fernhält. Eine Erklärung für dieses Phänomen könnte die mechanische Kraft sein, die sich vom intensiven Wachstum der Mikrotubuli ergibt. Im Zuge ihres Wachstums stoßen die Mikrotubuli alle Strukturen, z.B. die Chromosomen, ab. Gleichzeitig 10 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information verknüpfen sich die wachsenden Mikrotubuli mit ihren positiven Enden zufälligerweise zu dem Kinetochor, der sich an der polaren Seite des Chromosoms befindet, während der andere Kinetochor zunächst frei bleibt. Zu diesem Kinetochor werden sich später die Mikrotubuli, die vom entgegengesetzten Pol heranwachsen, anheften. Diese Mikrotubuli werden Kinetochor-Mikrotubuli genannt. Mithilfe der Kinetochor-Mikrotubuli werden sich die Chromosomen in der Metaphase in der Äquatorialebene der Zelle anordnen (Abbildung 1.9). Abbildung 1.9. Die Struktur des Spindelapparats. Für Einzelheiten siehe den Text http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-19/19_25.jpg; 2013. 02. 20. Diese Verordnung ist jedoch nie standfest, die Chromosomen oszillieren in der äquatorialebene, je nach der Dynamik der Mikrotubuli. Da die Mikrotubuli mit der gleichen Geschwindigkeit an ihren positiven Enden wachsen wie sie an ihren negativen Enden depolymerisieren, verändert sich ihre Länge nicht. 1.4.4. Die Metaphase-Anaphase Transition In Zellen wird im Laufe einer Mitose der Anaphase-promoting complex (Anaphase-fördernde Komplex) oder Cyclosom (APC/C) mithilfe von Proteinkinasen am Ende der Metaphase aktiviert. Im Grunde genommen ist der APC/C eine Ubiquitin Ligase, das heißt ein Enzym, das Ubiquitin an Proteinen bindet, was diese wiederum an das Proteasom richtet. Ein Substrat dieses Enzyms ist Securin, die ein Separase-Inhibitor Enzym ist. Wenn Separase von der Hemmung gelöst wird, spaltet sie die Schwesterchromatiden zusammenhaltende Cohesin von den Chromosomen ab, und so können diese zu den entgegengesetzten Polen der Zelle von den KinetochorMikrotubuli gezogen werden. Das andere Substrat von APC/C ist Cyclin B, das MPF durch sein Proteolysis inaktiviert. Die Endung der M-Phase, also die Degradation des mitotischen Apparats, die Dekondensation der Chromosomen, die Neubildung der Kernhülle und die Zytokinese werden erst durch diese Inaktivierung ermöglicht. Auch in der Metaphase fungiert ein Kontrollpunkt: der M-Kontrollpunkt, dessen Funktion später noch diskutiert wird. Die Aufgabe dieses Kontrollpunktes ist es zu sichern, dass die in der Interphase verdoppelte DNA genau verteilt wird, was nur dann der Fall ist, wenn das eine Schwesterchromatid zu dem einen, das andere zu dem anderen Pol wandert. Abbildung 1.10 stellt die Möglichkeiten, wie sich die Kinetochor-Mikrotubuli zu den Kinetochor Regionen binden können, dar. Die fehlerfreie Teilung der Chromatiden wird durch die amphitelische Bindung sichert. Falls der Spindelapparat fehlerhaft ist, wobei sich Kinetochor-Mikrotubuli nicht an beiden Polen aller Chromosomen anheften und es freie Kinetochore übrigbleiben, wird der APC/C nicht aktiviert, und die Mitose wird angehalten bis der Fehler korrigiert ist. Colchicin ist ein Alkaloid, das die Spindelfaserbildung hemmt, indem es an freie Mikrotubuli bindet, und die Mitose in der Metaphase anhält. Wenn sich die Chromosomen in der Metaphase fehlerfrei anordneten, so wird der APC/C aktiviert und die Zelle kann die Anaphase betreten. Die Regulierung dieser wird später noch ausführlicher diskutiert. 11 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Abbildung 1.10. Andocken der Kinetochor-Mikrotubuli an den Kinetochor Regionen http://en.wikipedia.org/wiki/File:MT_attachment_configuration-en.png; 2013. 07.03. Im Laufe der Anaphase I verkürzen sich die Kinetochor-Mikrotubuli an beiden Enden. Ein Motorprotein Kinetochor – in diesem Fall handelt es sich ausnahmsweise um Kinesin und nicht Dynein – verknüpft Bewegung des Chromosoms mit der Depolymerisation der Mikrotubuli. So gelingen die Chromatiden Chromosomen an die beiden entgegengesetzten Polen der Zelle, aber die zwei Polen stießen sich erst in Anaphase II voneinander ab (Abbildung 1.11). der die der der Abbildung 1.11. Trennung der Chromatiden (Anaphase A) und das Auseinanderrücken der Polen voneinander (Anaphase B) http://greatcourse.cnu.edu.cn/xbfzswx/wlkc/kcxx/11English.htm; 2013. 02. 20. 1.5. Die wichtigsten Vorgänge der Zytokinese An der Teilung des Zytoplasmas beteiligen sich unterschiedliche zytoskeletale Komponenten als bei der Trennung der Chromosomen, aber die zwei zytoskeletalen Systeme sind voneinander nicht unabhängig. Die 12 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Mitosespindel bestimmt die Achse der Zytokinese. Eine asymmetrische Mitosespindel ergibt Zellen von unterschiedlicher Größe. In der späten Anaphase (Anaphase II), nachdem die Chromatiden zu den entgegengesetzten Polen der Zelle gewandert sind, entsteht die Zentralspindel, die außer den polaren Mikrotubuli viele andere Proteine von unterschiedlichen Ursprung und Funktion beinhaltet. Es gibt z.B. unter diesen Proteinen Proteine chromosomalen Ursprungs, Motorproteine (Kinesin), und Kinasen (z.B. Polo-Kinase, die nach den neusten Angaben eine wichtige Rolle bei der Bildung der Mitosespindel spielt). Bei der Anaphase entsteht senkrecht zur Achse der Mitosespindel, unter der Plasmamembran, ein kontraktiler Ring, der aus Aktinund Miosin II Filamenten besteht. Es ist noch nicht näher bekannt, wie die Zentralspindel den Aufbau des kontraktilen Rings reguliert, aber die Rolle von Kinasen und monomer G-Protein ist wahrscheinlich. Die zwei verschiedenen Filamente gleiten aneinander entlang, was zur stufenweisen Einschnürung der Zelle führt. Schließlich verbindet die zwei Tochterzellen unter dem kontraktilen Ring nur das Flemming-Körperchen (midbody), der Rest der Zentralspindel. Die Membran der Tochterzellen entsteht durch die Fusion von Vesikeln. Der Transport dieser Vesikel findet wahrscheinlich entlang der Mikrotubuli der Zentralspindel statt. 1.6. Kontrollpunkte Die Kontrollpunkte und ihre Bedeutung wurden bereits am Anfang dieses Kapitels erwähnt. Aber genau wie funktionieren diese Kontrollpunkte am Ende der G1, G2 und Meta-Phasen? Das System hat drei Hauptkomponenten: die sensorische Komponente, die die DNA-Fehler wahrnimmt, und dieses Signal an ein Überträger-Moleküle (Transducer) überträgt, das schließlich die Effektoren steuert. Bei den G1 und G2 Kontrollpunkten werden die Beschädigungen der DNA, z.B. einstrangige DNA, oder Doppelstrangbrüche, von bestimmten Proteinen wahrgenommen. Die Vermittler hier sind Proteinkinasen (Cyclin-unabhängige Kinasen), die bei dem G1 Kontrollpunkt p53 phosphorylieren, das dadurch stabilisiert wird und den Zellzyklus arretiert. Also p53 fungiert hier als ein Effektor-Molekül. Bei dem G2 Kontrollpunkt wird die Phosphatase Cdc25 phosphoryliert und inaktiviert, deshalb kann Cdc25 die inaktivierende Phosphatgruppe vom MPF abspalten, damit die Zelle die M-Phase nicht betreten kann. Bei dem M Kontrollpunkt binden sich sensorische Proteine an die freien Kinetochoren der Chromosomen. Gleichzeitig binden und hemmen diese Proteine auch die zum Funktionieren des APC/C nötigen Proteine. Binden sich also diese Proteine an freie Kinetochore, wird der APC/C nicht aktiviert und die Zelle wird in der Metaphase angehalten. Das Funktionieren der Kontrollpunkte ist wesentlich komplizierter als oben geschildert, und die Einzelheiten werden erst jetzt besser verstanden. Das präzise Funktionieren dieser Kontrollpunkte sichert die genetische Identität der Tochterzellen während des Zellzyklus. Funktionieren die Kontrollpunkte oder die Regulierung fehlerhaft, erfolgen von den normalen abweichenden, atypische Zellteilungen. Von der Art und der betroffenen Zelle abhängig sind diese nicht unbedingt pathologisch, aber meistens sind solche atypische Zellteilungen für Tumorzellen charakteristisch. Selbstverständlich produziert jede atypische Zellteilung genetisch unterschiedliche Tochterzellen. Bei einer Endomitose löst sich die Kernhülle nicht auf, deshalb steigt der DNA-Gehalt der Zelle. Selbstverständlich nehmen auch der Zellkern und das Zytoplasma in Größe zu, und Riesenzellen entstehen. Die verdoppelte DNA kann sich binnen der Kernhülle teilen, was dazu führt, dass sich die Chromosomenzahl erhöht (Polyploidie). Die Chromatiden mögen aber auch zusammenbleiben, was wiederum zur Entstehung von Riesenchromosomen führt (Polytänchromosom, also viele Chromatiden enthaltendes Chromosom). Das völlige Verbleiben der Zytokinese führt zur Entstehung von Riesenzellen, diese Zellen beinhalten jedoch auch mehrere Zellkerne. Ein Fehler der Mitosespindel steckt im Hintergrund vieler Abnormalitäten. Geschieht die Verdopplung und Teilung der Zentrosomen fehlerhaft, erfolgt anstatt der normalen bipolaren eine multipolare Zellteilung: tri-, tetra- usw. polare Zellteilung. Die Non-Disjunktion der Schwesterchromatiden (also Defekt der Trennung der Schwesterchromatiden) führt zur numerischen Chromosomenaberration (Aneuploidie): die eine Tochterzelle wird ein überflüssiges Chromosom haben, bei der anderen Tochterzelle wird ein Mangel an Chromosomen geben. Die Ursache für das Phänomen ist die Bindung von syntelischen oder monotelischen Kinetochor-Mikrotubuli zum Kinetochor (Abbildung 10). 13 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Die merotelische Bindung führt zur Brückenbildung (Anaphase Brücke). Das Chromatid, zu dessen Kinetochor sich von beiden Polen her Mikrotubuli binden, bildet zuerst eine Brücke zwischen zwei Chromosomensätzen, die später jedoch höchstwarhscheinlich zerbricht (strukturelle Chromosomenaberration) und das verbleibende Fragment, das kein Zentromer enthält, aus der Zelle ausgeschieden wird, und ein Mikronukleus bildet. Dieses Phänomen wird bei Mutagenitätstesten benutzt, um Moleküle zu identifizieren, die Chromosomenbrüche verursachen. 2. Die Meiose Das Erbgut kann von Generation zu Generation auf zwei verschiedene Weisen weitergegeben werden. Im Laufe der Evolution entstand zuerst die für primitive Organismen charakteristische asexuelle Fortpflanzung. Asexuelle Fortpflanzung ist ein einfacher Mechanismus, und benötigt nur eine Elternhälfte, und da die Nachkommen aus somatischen Zellen durch Mitose entstehen, sind die Tochterzellen (Nachkommen) mit der Mutterzelle genetisch identisch. Die Bedeutung der geschlechtlichen Fortpflanzung, die zwei Elternhälften benötigt, liegt darin, dass die Genome der Eltern miteinander mischen, und so die Nachkommen genetisch sowohl von den Eltern, als auch voneinander unterschiedlich werden. Geschlechtliche Fortpflanzung bietet einen wichtigen evolutionären Vorteil, indem er den Individuen eine Art genetische Variabilität sichert, die wiederum ermöglicht, sich zu unvorhersehbaren Umweltbedingungen anpassen zu können. Dieser Prozess ist also von der Hinsicht des Fortbestands der Art sehr wichtig. Die Bedeutung dieses Prozesses ist auch von der Tatsache bestätigt, dass sogar bei primitiveren, sich asexuell fortpflanzenden Organismen (z.B. Bakterien, einzelligen Organismen), eine Form von genetischer Rekombination vorkommt, wodurch fremde DNA in die Zelle gelingt, und die genetische Variabilität sichert. Bei sich sexuell fortpflanzenden Organismen erfolgt diese Rekombination während einer speziellen Zellteilung, der Meiose, wobei die Keimzellen, bei Pflanzen die Gameten oder Sporen, entstehen. Bei Organismen mit geschlechtlicher Fortpflanzung wechseln zwei Generationen von Zellen einander: eine diploide Generation, die durch Meiose haploide Zellen produziert, und eine haploide Generation, die bei primitiven Pflanzen sogar über die diploide Generation dominieren kann, aber bei höheren Organismen meistens stark reduziert ist, und sich bei Tieren auf eine einzige Zelle, die Keimzelle, begrenzt. Mit der Vereinigung der haploiden Gameten (Befruchtung), der Entstehung der Zygote, wird die artspezifische Chromosomenzahl wiederhergestellt, und das Leben des neuen Individuums beginnt. Wie entstehen diese haploiden Zellen? Bezüglich der oben erwähnten Tatsachen dient dieser Prozess einem zweifachen Zweck: einerseits wird die Chromosomenzahl während der Meiose halbiert, andererseits vermischt sich die genetische Information. 2.1. Die Phasen der Meiose Die Meiose besteht aus zwei, einander folgenden Zellteilungen. Während der Prophase der ersten Meiose, ganz wie bei der Mitose, werden die Chromosomen geformt, das Nucleolus (Kernkörperchen) geht verloren und die Kernhülle löst sich auf. Die Rekombination der homologen Chromosomen geschieht in der Prophase, wobei sich die homologen (also gleichförmigen und gleich großen mütterlichen und väterlichen Chromosomen) Chromosomen paaren und gewisse Abschnitte miteinander austauschen. Dies ist die längste Phase der Meiose, und kann in fünf Stadien unterteilt werden: Leptotän, Zygotän, Pachytän, Diplotän und Diakinese. Die fadenartigen, aus zwei Chromatiden bestehenden Chromosomen haften sich im Leptotän mit ihren Telomeren random an die innere Zellkernmembran (Kernhülle) an, später scharen sie sich um das Zentrosom wie ein Blumenstrauß (bouquet Anordnung). Damit rücken sich die homologen Chromosomen einander näher, was zum Übergang zum nächsten Stadium notwendig ist. Im Zygotän beginnt die Paarung - auch Synapsis genannt - der homologen Chromosomen. Nach der neuesten Forschung entstehen mehrere hundert Doppelstrangbrüche bereits am Anfang des Leptotän, bevor der Paarung, und die Synapsis entsteht erst hinterher. Die Paarung wird von einem sogenannten Synaptonemalen Komplex gefördert, die einer Leiter ähnelt. Der Synaptonemale Komplex setzt sich aus lateralen und transversalen 14 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Elementen zusammen. Das Zentralelement findet sich bei der Überlappung der vorigen zwei Elemente (Abbildung 1.12). Abbildung 1.12. Die Struktur des Synaptonemalen Komplexes. Der Komplex hält die homologen Chromosomen (Bivalente, Tetraden) leiterartig beisammen http://drugline.org/img/term/synaptonemal-complex-14373_1.jpg; 2013. 02. 20. Durch die Kondensation der DNA werden die Chromosomen immer sichtbarer, und ihre Paarung endet im Pachytän. Die Bivalenten (zwei Chromosomen enthaltende) Chromosomen bilden Tetrade (2x2 Chromatiden), was anscheinend zu einer Verringerung der Chromosomenzahl führt (Pseudoreduktion). Die meisten DNA Doppelstrangbrüche werden korrigiert, aber ein Teil von diesen Brüchen führt zur homologen Rekombination (Crossing-over, Umkopplung), also bestimmte homologe Abschnitte werden miteinander ausgetauscht. Dieser Prozess geschieht mithilfe von den Umkopplungsknoten, die enorme Multienzym Komplexe mit einem Durchmesser von 100 nm sind, und sich im Zentralelement befinden. Die Einzelheiten des molekularen Mechanismus des Crossing-overs werden hier nicht ausführlicher diskutiert. Im Wesentlichen tauschen benachbarte Chromatiden bestimmte Abschnitte reziprokerweise miteinander aus. Das Crossing-over kann zwischen je zwei beliebigen Chromatiden erfolgen, also nicht nur zwischen den Schwesterchromatiden, sondern auch zwischen den mütterlichen und väterlichen Chromatiden, die also keine Schwesterchromatiden sind. Eine neue Kombination der Gene entsteht aber nur in dem Fall, wenn sich mütterliche und väterliche Chromatiden rekombinieren. Ungefähr je 1 bis 3 Crossing-overs erfolgen zwischen Chromosomen-Paaren. Sogar die, miteinander nur in einem sehr kurzen Abschnitt homologen, kurzen Arme des X und Y Chromosoms rekombinieren sich jedes Mal in der sogenannten PAR1 (Pseudoautosomale Region) Region. Auf die Bedeutung der Rekombination weist die neueste Entdeckung von einem Kontrollpunkt während der Rekombination. Dieser Kontrollpunkt überwacht die Ausbildung und den Verlauf des Crossing-over. Im Diplotän löst sich der Synaptonemale Komplex auf, die Homologen trennen sich voneinander und werden nur an den Rekombinationsstellen über Chiasmata zusammengehalten. Schließlich, während der Diakinese, werden die homologen Chromosomen des Bivalents über Chiasmata, und die Schwesterchromatiden von Cohesinen, zusammengehalten, die später nur in der Zentromer Region erhalten bleiben. Die Kinetochor Region der Chromosomen entsteht während der Prophase, und, im Gegenteil zur Mitose, sind beide Chromatiden in dieselbe Richtung, zu dem einen Polen hin, gestellt, während die zwei Chromosomen in die entgegengesetzte Richtung gestellt sind (Abbildung 1.13). Abbildung 1.13. Die unterschiedliche Richtung der Kinetochoren in Mitose und Meiose I - http://www.cell.com/retrieve/pii/S0092867406011524; 2013. 02. 20. 15 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information In der Metaphase der Meiose I werden Chromosomenpaare in der Äquatorialebene angeordnet, da die Chiasmata, die die homologen Chromosomen zusammenhält, erst gegen das Ende dieser Phase aufgelöst werden, und zurzeit der Metaphase die Chromosomenpaare noch zusammenhalten. In der Anaphase, da die Kinetochore der homologen Chromosomen in derselben Richtung stehen, ziehen die an ihnen heftende Kinetochor-Mikrotubuli keine Chromatiden, sondern Chromosomen zu den entgegengesetzten Polen. So ermöglicht die Synapsis nicht nur das Crossing-over, sondern auch die Halbierung der Chromosomenzahl. Die Trennung der Homologen, also welche Homologhälfte zu welchem Pol wandert, geschieht zufällig, was bei Menschen eine Variationsmöglichkeit von 223 ermöglicht. In der Telophase wird die Kernhülle neugebildet, die zwei Zellkerne werden gebildet, und das Zytoplasma teilt sich. Da sich in der Anaphase homologe Chromosomenpaare trennen, werden die Tochterzellen haploid, obwohl die Chromosomen in den Tochterzellen aus je zwei Chromatiden bestehen. Deshalb wird die erste meiotische Teilung auch Reduktionsteilung genannt. Die erste meiotische Teilung wird meistens von einer kurzen Interphase gefolgt, im Laufe deren jedoch keine DNA Replikation erfolgt. Die zweite meiotische Teilung wird auch in Pro-, Meta-, Ana-, und Telophasen unterteilt, die jedoch im Wesentlichen den gleichnamigen Phasen der Mitose ähnlich sind. So ordnen sich einzelne Chromosomen in der Äquatorialebene während der Metaphase, und trennen sich die Schwesterchromatiden in der Anaphase voneinander. Der Meiose zufolge entstehen also vier haploide Zellen, die hinsichtlich ihrer Chromosomenzahl identisch sind. Mit der Vereinigung der zwei Gameten entsteht die Zygote, und die artcharakteristische diploide Chromosomenzahl wird wiederhergestellt. Dabei ist die genetische Information dieser Tochterzellen wegen des Crossing-overs in der Prophase der Meiose I, und wegen der zufälligen Segregation der homologen Chromosomenpaare, nicht identisch. Dieser Mechanismus sichert die für die Erhaltung der Art so wichtige Variabilität. 16 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Die häufigste, während der Meiose entstehende Aberration ist die Non-Disjunktion, die sowohl während der ersten, als auch während der zweiten Meiose vorkommen kann (Abbildung 1.14). Non-Disjunktion bedeutet, dass die zwei Chromosomen eines homologen Chromosomenpaars (während der ersten Meiose), oder die Chromatiden eines Chromosoms (während der zweiten Meiose) sich im Laufe der Anaphase nicht voneinander trennen. Falls so eine Non-Disjunktion erfolgt, ändert sich die Chromosomenzahl der entstehenden Gameten. Wenn solche aberranten Gameten an der Befruchtung teilnehmen, entsteht eine aneuploide Genommutation. Abbildung 1.14. Meiotische Non-Disjunktion - http://drugline.org/img/term/meioticnondisjunction-9351_1.jpg; 2013. 02. 20. Die Entstehung der Gameten bei Wirbeltieren ist ein komplizierter Vorgang, und die Meiose ist nur ein Teil dessen. In einer sehr frühen Phase der Ontogenese wandern die sogenannten Urkeimzellen in die entwickelnden Gonaden. Nach einer Reihe von Mitosen, Meiose und - bei Spermien auch noch Differenzierung - werden die Urkeimzellen zu reifen Gameten. 2.2. Oogenese Bei den meisten Tieren ist die Eizelle viel größer als die somatischen Zellen, denn sie muss genug Dottersubstanzen (Lipide, Eiweiße und Kohlenhydrate) beinhalten, um den Embryo zu ernähren, bis er sich selbständig ernähren kann. Bei Vögeln müssen die Dottersubstanzen den Embryo bis zur Schlüpfung ernähren, deshalb haben sie polylecithale Eizellen (d.h. viele Dottersubstanzen enthaltende Eizellen), während die Eizellen der Säuger wenig Dottersubstanzen beinhalten, also oligolecithal sind. Trotzdem sind auch die Eizellen der Säugetiere, und auch die der Menschen, viel größer, als somatische Zellen. Die Urkeimzellen differenzieren sich in den entwickelnden Gonaden des Embryos zu Oogonien (mit 46 Chromosomen), und teilen sich mitotisch. Die erste Reifeteilung (Reduktionsteilung oder Meiose I) betretend werden sie als Oozyten erster Ordnung (primäre Oozyten) (immer noch mit 46 Chromosomen) bezeichnet, und bleiben jahrelang, eventuell jahrzehntelang im Diplotän Stadium der Prophase. Inzwischen wird um die Oozyten eine Schutzhülle, die Zona Pellucida (Glashaut), geformt, und es entstehen hier die Kortikalgranula, deren Inhalt nach dem Eindringen des Spermiums ausgeschüttet wird, was durch die Veränderung der Oberfläche der Zona Pellucida das Eindringen von weiteren Spermien in die Eizelle verhindert. Von der Pubertät an setzt auf hormonalen Einfluss pro Menstruationszyklus je eine Zelle die Meiose fort. Während der 17 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Zytokinese teilt sich das Zytoplasma asymmetrisch, und die größere Zelle wird als Oozyte zweiter Ordnung (sekundäre Oozyte) (mit 23 Chromosomen), die kleinere Zelle als Polkörperchen (mit 23 Chromosomen) bezeichnet. Die ungleiche Teilung des Zytoplasmas ist wahrscheinlich von der asymmetrischen Lage der Mitosespindel ermöglicht. Beide Zellen teilen sich noch einmal - Meiose II, zweite Reifeteilung, auch Äquationsteilung genannt - aus dem Polkörperchen entstehen zwei Polkörperchen (mit 23 Chromosomen), und die sekundäre Oozyte bildet durch eine weitere asymmetrische Teilung eine Eizelle (mit 23 Chromosomen), und ein kleines Polkörperchen (mit 23 Chromosomen). Bei Menschen, aber auch bei Wirbeltieren im Allgemeinen, hält die zweite Meiose in diesem Stadium, also der Metaphase, an. Bei der Ovulation (Eisprung, Follikelsprung) wird die Eizelle in diesem Stadium aus dem Eierstock ausgestoßen, und beendet die zweite Meiose erst nach der Befruchtung (Abbildung 14). 2.3. Spermatogenese Während bei den meisten Lebewesen die Eizelle die größte, zu eigenständige Bewegung unfähige Zelle ist, ist der andere Gamet, das Spermium, die kleinste, zu eigenständige Bewegung fähige Zelle. Die Spermatogenese beginnt in der Pubertät, wobei ein Teil der Spermatogonien im Keimepithel der Hodenkanälchen sich kontinuierlich mitotisch teilt. Ein anderer Teil dieser Zellen wird zum Spermatozyt erster Ordnung (primärer Spermatozyt), und beginnt die erste meiotische Teilung, am Ende deren zwei haploide Zellen, sogenannte Spermatozyten zweiter Ordnung (sekundäre Spermatozyten), entstehen. Die Spermatiden werden während der zweiten Meiose geformt. Danach beginnt ein Differenzierungsprozess, der aus den runden, bewegungsunfähigen Zellen zu eigenständiger Bewegung fähige Spermien hervorgehen lässt. Dieser Differenzierungsprozess wird Spermiogenese genannt, und erfolgt in den Sertoli-Zellen (Stütz-Zellen) eingebettet. Von da an gelingen die Spermien in die Lumina der Hodenkanälchen (Abbildung 1.15). Abbildung 1.15. Vergleichung der Oogenese (rosa) und Spermatogenese (blau). Für Einzelheiten siehe den Text http://www.nature.com/nrg/journal/v11/n2/fig_tab/nrg2723_F1.html#figure-title; 2013. 02. 20. 18 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Die charakteristische Struktur des Spermiums (Kopfteil, Mittelstück und Schwanz) dient einem einzigen Zweck: den sicheren Transport der DNA zu der Eizelle. Der Kopfteil behält den Zellkern, der die DNA als besonders dicht verpacktes Heterochromatin enthält, um möglichst wenig Platz einzunehmen. An der Ausbildung dieser Struktur beteiligen sich sogenannte Protamine, Proteine, die noch positiver geladen als Histone sind. Gleich vor dem Zellkern befindet sich der Akrosom, der im Grunde genommen ein riesiges Lysosom ist. Der Akrosom beinhaltet hydrolytische Enzyme, deren Aufgabe ist es, die Schutzhüllen der Eizelle während der Befruchtung aufzulösen. Nach dem Mittelstück kommt der Schwanz des Spermiums, der auch Geißel genannt wird. Die Geißel besitzt, abgesehen von den 9x2+2 Mikrotubuli, in der Peripherie auch noch 9 sogenannte dichte Fibrillen, die vor allem reich an Keratin sind. Ihre Funktion ist unbekannt. Im Mittelstück findet sich noch eine, aus miteinander fusionierten Mitochondrien bestehende Kapsel (Mitochondrien-Paket), wo die zur Bewegung des Spermiums nötige ATP produziert wird. In der letzten Zeit wurde es nachgewiesen, dass sich die Spermatogenese und Oogenese bereits bei der Prophase der ersten Reifeteilung in vieler Hinsicht voneinander unterscheiden, die in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst sind: Tabelle 1.1. primärer Spermatozyt primäre Oozyte Die Synapsis fängt hier an den Chromosomen an: an den Enden in der Mitte der Synaptonemale Komplex ist kompakter weniger kompakt kürzer länger Die Position der Chiasmata an den Chromosomen an den Enden in der Mitte Die Zahl der Chiasmata weniger mehr 2.4. Regulation der Meiose Die Regulation der Meiose wurde bisher meistens bei der Oogenese von Fischen und Amphibien untersucht. Auch der MPF wurde zuerst als Regulator der Oogenese bei Amphibien bekannt, und erst später wurde es entdeckt, dass derselbe Faktor, der aus Cdk1 und Cyclin B bestehende MPF auch bei der Mitose eine regulatorische Rolle spielt. Vor allem wurden diejenigen Aspekte der Regulation der Meiose untersucht, die bei der Oogenese und Spermatogenese unterschiedlich sind. Einer von diesen Aspekten ist der Beginn der Meiose, der im Fall der Oogenese bereits im embryonalen Zustand, bei der Spermatogenese erst in der Pubertät erfolgt. Im Hintergrund dieses Unterschieds steht die Retinsäure. Die Retinsäure wird in den entsprechenden Zellen der Embryonen beiden Geschlechts produziert. Die Aktivität des CYP26B1 Enzyms, das im Metabolismus der Retinsäure eine Rolle spielt, ist jedoch unterschiedlich. In männlichen Embryonen wird die Retinsäure wegen der höheren Aktivität dieses Enzyms abgebaut, während bei weiblichen Embryonen die Retinsäure wegen der geringeren Aktivität dieses Enzyms nicht abgebaut wird und als Signalmolekül die Expression und Wirkung des STRA8 Transkriptionsfaktors erhöht, dessen zufolge die Oogonien die Meiose betreten. Die Meiose beginnt, wird aber im Diplotän angehalten. Im Hintergrund dieses Phänomens steht der erhöhte cAMP Spiegel der primären Oozyten, der solche, durch PKA regulierte Veränderungen auslöst, die den MPF inaktivieren. Die Aufhebung der Ausschaltung dieses Prozesses geschieht zyklisch bei je einer Zelle von der 19 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information Pubertät an. Wahrscheinlich wird MPF auf indirekte Weise, wegen der auf die Wirkung des LH erfolgten Senkung des cAMP Spiegels, aktiviert und die Meiose wird fortgesetzt. In der Metaphase der zweiten Reifeteilung (sekundäre Oozyte) hält die Kernteilung wieder an. Hier wird die Rolle eines noch nicht näher bekannten zytostatischen Faktors (CSF) angenommen, der die Aktivität der APC/C über die Signalübertragungswege MAPK und Mos Protein (eine Serin-Threonin-Kinase, der Produkt des c-mos Protoonkogens) hemmt, wodurch der Prozess angehalten wird. Voraussetzung für die Vollendung der Meiose ist die Befruchtung, die den Ca2+ Spiegel der Zelle erhöht, was wiederum zur Aktivierung des APC/C führt. Aktiviertes APC/C ubiquitiniert Cyclin B und Securin, die danach in den Proteasomen abgebaut werden. Wenn kein Securin mehr vorhanden ist, spaltet Separase die Cohesine vom Zentromer der Chromosomen ab und so können die Schwesterchromatiden zu den entgegengesetzten Polen der Zelle wandern. Der Abbau des Cyclin B inaktiviert MPF und die Zelle, die eigentlich bereits eine Zygote ist, vollendet die Meiose. Danach beginnt die Zygote die Furchung, und betritt einen aus zellbiologischer Hinsicht speziellen Zellzyklus, den embryonalen Zellzyklus. Interessant dabei ist, dass derselbe MPF von nun an einen anderen Prozess, die Mitose, reguliert. 3. Fragen 1. Erklären Sie den Zellzyklus. 2. Welche Phasen hat der Zellzyklus bei mehrzelligen Organismen? 3. Welche Phasen des Zellzyklus enthalten Kontrollpunkte und was ist der Zweck von diesen? 4. Beschreiben Sie die wichtigsten Moleküle, die den Zellzyklus regulieren. 5. Was sind die Merkmale des G0-G1 Übergangs? 6. Beschreiben Sie den G1-S Übergang. 7. Wie wird der Eintritt in die M-Phase reguliert? 8. Was sind Cohesine und Condensine? 9. Nennen Sie die Phasen und Vorgänge der M-Phase. 10. Beschreiben sie die Struktur eines Chromosoms. 11. Wie entsteht und funktioniert die Mitosespindel? 12. Was ist der APC und wie funktioniert er? 13. Wie verläuft die Zytokinese? 14. Nennen Sie und beschreiben Sie die atypischen Zellteilungen. 15. Wie funktionieren die Kontrollpunkte? 16. Was ist der Zweck und Bedeutung der Meiose? 17. Vergleichen Sie die Mitose und die Meiose. 18. Beschreiben Sie die Merkmale der homologen Chromosomen. Was ist homologe Rekombination und was ist ihre Bedeutung? 19. Was sind die Unterphasen der Prophase der ersten Meiose? 20. Was geht in den Unterphasen der Prophase der ersten Meiose vor? 21. Vergleichen Sie die Meiose I und Meiose II. 20 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Übertragung der genetischen Information 22. Was ist meiotische Non-Disjunktion und was sind ihre Folgen? 23. Wann geschieht die Meiose während der Oogenese? 24. Wann geschieht die Meiose während der Spermatogenese? 25. Was wissen Sie über die Regulation der Meiose? 21 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 2. Mutationen und Polymorphismen Sára Tóth Der klassischen Definition nach werden unvermittelt entstandene, vererbbare Veränderungen im Erbgut, also in der DNA, Mutationen genannt. Heutzutage ist jedoch die Definition von ’Mutation’ etwas komplizierter: eine Mutation ist eine, in der DNA Sequenz auftretende Veränderung, die eine Prävalenz von weniger als 1 Prozent in der Population aufweist. Solche Varianten (Allelvarianten) dagegen, die eine Prävalenz von mehr als 1 Prozent aufweisen, werden Polymorphismen genannt. Diese Definition ist einigermaßen künstlich und verwirrend, da es sich in beiden Fällen um eine Veränderung der DNA Sequenz handelt, und auch die Mechanismen, die zu diesen Veränderungen führen, gleich sind. Da Stelle, Ursprung, Entstehungsmechanismus, Auswirkungen und Folgen von Mutationen und Polymorphismen sehr vielfaltig sein können, gibt es zahlreiche Möglichkeiten zu deren Gruppierung. In beiden Fällen können die Veränderungen von einem sehr kurzen (Einzelnukleotidpolymorphismus - SNP=single nucleotide polymorphism, das heißt eine Veränderung, die ein einzelnes Nukleotid betrifft) bis zu einem sehr langen Abschnitt (strukturelle Chromosomenmutationen - Chromosomenpolymorphismen, z.B. 1qh+) betreffen. In beiden Fällen können diese Veränderungen entweder harmlos sein oder Symptome/Krankheit verursachen. In diesem Kapitel befassen wir uns mit Genmutationen, die vor allem kürzere DNA Abschnitte betreffen, während längere DNA-Abschnitte betreffende Veränderungen im Kapitel „Zytogenetik‖ 3 behandelt werden. Polymorphismen, und deren biologisch-genetische Rolle und medizinische Bedeutung werden im Kapitel „Genomik‖ 8 diskutiert. 1. Gruppierung der Mutationen Bei der Analyse von Mutationen ist der Zelltyp, in dem die Mutation entsteht, von entscheidender Bedeutung: demnach unterscheiden wir zwischen somatischen Mutationen und Keimbahnmutationen (konstitutionelle oder gametische Mutationen). Eine somatische Mutation entsteht in einer somatischen Zelle (Körperzelle), und wird im Laufe der nachfolgenden Zellteilungen an die Tochterzellen vererbt. Auf diese Weise entsteht ein Klon, deren Zellen dieselbe Mutation aufweisen. Je nachdem, wie früh die Mutation während der Ontogenese auftritt, wird die Zahl der betroffenen Zellen, also die Größe des mutanten Klons, unterschiedlich. Ein klassisches Beispiel für eine somatische Mutation ist der Fall, wenn ein Auge blau, das andere braun ist. In diesem Fall erfolgte die Mutation nach der Trennung der zwei Augenbläschen. In anderen Fällen sind braune Flecken in dem blauen Auge zu sehen. In diesem Fall erfolgte die Mutation noch später, und nur in einigen Zellen der einen Regenbogenhaut. Somatische Mutationen werden unter natürlichen Umständen nicht an die Nachkommen weitergegeben - eine Ausnahme hier bildet die vegetative Fortpflanzung von Pflanzen. Aus medizinischer Hinsicht sind somatische Mutationen trotzdem bedeutend, da sie eine Rolle bei der Tumorentstehung spielen können. Nach der Knudsonhypothese (Two-Hit Theory) sind zur Entstehung von gewissen Tumoren zwei aufeinander folgende Mutationen nötig, die zwei Allele eines Tumorsuppressorgens (siehe das Kapitel 7, Genetik von biologischen Prozessen) betreffen. Mutationen von Tumorsuppressorgenen sind rezessiv: zum vollkommenen Funktionsverlust und damit zur Tumorbildung sind zwei mutante Kopien nötig. Eine von diesen Mutationen ist meistens geerbt, also bereits vorhanden, während die andere Mutation nur in einem Organ oder einigen Organen auftritt, und damit zum Verlust der Heterozygotie führt. Der Tumor entsteht also wegen dem homozygot mutanten Tumorsuppressorgen. Dieses Phänomen wird Verlust der Heterozygotie = loss of heterozygosity = LOH genannt, und mit modernen molekularbiologischen Untersuchungsmethoden könnte es zum Ermitteln des präkanzerösen Stadiums, also des Stadiums vor der Entstehung eines Tumors, benutzt werden. Keimbahnmutationen sind in den Keimbahn-Stammzellen oder während der Gametogenese in den Gameten entstehende Mutationen, die vererbbar sind, und damit aus medizinischer Hinsicht eine große Bedeutung haben. Dem Ursprung nach können wir zwischen spontanen, infolge einer fehlerhaften DNA-Replikation auftretenden, und durch verschiedene Umwelteinflüsse (Strahlung, Chemikalien) induzierten Mutationen unterscheiden. 22 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mutationen und Polymorphismen Die Mutationsrate hängt von der Evolutionsebene ab: bei Prokaryoten ist die Mutationsrate wegen des Mangels an DNA-Reparatur-Mechanismen viel höher, als bei Eukaryoten. Dementsprechend ist die Mutationsrate von Mitochondrien, die prokaryoten-ähnliche DNA besitzen, sehr hoch. Diese Mutationsrate ist ungefähr das Zehnfache der Mutationsrate der nuklearen DNA, die pro Gen und pro Generation zirka 10 -5 ist. Spontane Mutationen entstehen am häufigsten als Ergebnis einer 1.) Desaminierung oder 2.) Depurinierung. 1.) Bei einer Desaminierung entsteht Uracil aus Cytosin, und Hypoxanthin aus Adenin. 2.) Bei einer Depurinierung bleibt das Phosphat-desoxyribose Rückgrat unverändert, aber eine Purinbase, z.B. ein Guanin bricht ab, und so entsteht eine Lücke im DNA Strang. Die Häufigkeit von spontanen Mutationen ist auch vom Zell- und Gewebetyp bedingt. Sich intensiv teilende Zellen und Gewebe weisen mehr spontane Mutationen auf, da je öfter sich die DNA verdoppelt, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit eines fehlerhaften Einbaus von Basen. Das bestbekannte Beispiel für induzierte Mutationen sind die durch UV-Strahlung induzierten Mutationen (Abb. 1). UV-Strahlung führt zur Dimerisation der Thymin Basen, was zur Deformation der DNA führt, und DNA Verdopplung und Transkription hindert. Gleichermaßen führt der Einbau von Basenanalogen, wie z.B. Bromdesoxyuridin (BrdU) während der DNA Replikation, und die darauf folgende inkorrekte Reparatur, zur Veränderung der ursprünglichen DNA Sequenz. Alkylierungsmittel (auch Alkylantien, alkylierende Verbindungen) (EMS=Ethylmetansulfonat, MNU=Methylnitrosoharnstoff) können Ethyl- oder Methylgruppen auf DNA Basen übertragen, und so entsteht z.B. aus Guanin ein O6-Methylguanin. Eine solche Veränderung führt zur Mutation, weil sich O6-Methylguanin anstatt Cytosin mit Thymin verknüpft (Fehlpaarung), und so wird bei den nachfolgenden DNA-Replikationen eine unterschiedliche Base in den neu synthetisierten Strang eingebaut, womit die Mutation befestigt wird. Interkalierende Substanzen (Proflavin, Acridine Orange) können sich zwischen DNA Basenpaare einschieben, oder eine Schleife auf einem DNA Strang bilden, was im Laufe der darauffolgenden Replikationen und Reparaturen zur Verkürzung (Deletionen) oder Verlängerung (Duplikationen) der DNA führt. Manche Karzinogene (z.B. Benzpyren) können größere Moleküle an die DNA verknüpfen, und erzeugen damit Addukte. Mutationen können auch nach dem Ausmaß der im Erbgut verursachten Veränderungen gruppiert werden. Dementsprechend können wir von Genmutationen – auch Punktmutation genannt –, Chromosomenmutationen, die mehrere Gene betreffen, und Genommutationen, die das ganze Erbgut betreffen können, reden. Abbildung 2.1. Beispiele für induzierte Mutationen 23 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mutationen und Polymorphismen 2. Genmutationen Genmutationen können eine einzige Base des Gens - Punktmutation im engeren Sinn -, oder einen kürzeren oder längeren Teil des Gens betreffen. Unter den Punktmutationen, die eine einzige Base betreffen, können wir zwischen Insertion = Zugewinn einer Base, Deletion = Verlust einer Base, und Substitution = Austausch einer Base unterscheiden. In den ersten zwei Fällen, falls die Zahl der hinzugefügten íoder verlorenen Basen nicht drei oder ein Mehrfaches von drei ist (6, 9, 12 usw.), entsteht eine Verschiebung des Leserasters, also eine Frameshift Mutation. Das bewirkt, dass sich die kodierte Information hinter der Mutationsstelle in die Leserichtung verändert (siehe das Beispiel unten). Ursprüngliche Sequenz: Abbildung 2.2. 24 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mutationen und Polymorphismen Handelt es sich um drei, 6, 9 usw. hinzugefügten oder verlorenen Basen, können wir von einer in frame Mutation sprechen. Dementsprechend verändert sich der Informationsgehalt des betroffenen Abschnitts, nicht aber der Informationsgehalt der anderen Abschnitte des Gens. Bei dem Austausch von Basen gibt es zwei Möglichkeiten: Transition und Transversion. Bei einer Transition wird eine Purinbase gegen eine andere Purinbase, oder eine Pyrimidinbase gegen eine andere Pyrimidinbase ausgetauscht, z.B. A→G oder C→T. Bei einer Transversion wird eine Purinbase gegen eine Pyrimidinbase oder umgekehrt, ausgetauscht. Die Folgen von einer Substitution können unterschiedlich sein. Es gibt missense, nonsense, stille (silent) oder sense Mutationen. Bei einer missensen Mutation (sinnverändernden Mutation) verändert sich das Codon, und so wird eine abweichende Aminosäure in das Protein eingebaut. Ein Beispiel hier ist die Sichelzellenanämie verursachende Mutation, wobei an der sechsten Position der β-Globin Kette des Hämoglobins ein Glutamin durch ein Valin ersetzt wird. Bei einer nonsensen Mutation (sinnentstellenden Mutation) wird das ursprüngliche Codon durch ein Stop Codon ersetzt. Dadurch wird die Proteinkette zu früh terminiert, und somit entsteht ein verkürztes Proteinmolekül. Bei einer stillen Mutation (silent oder sense), dank der Degeneriertheit des genetischen Codes, wird bei einem veränderten Codon die gleiche Aminosäure erhalten, also die Mutation hat keine Konsequenzen. Solche Mutationen entstehen meistens wenn die zweite oder dritte Base des Codons ausgetauscht wird. Da eine Zelle während ihrer Lebensdauer ihre DNA mehrmals repliziert, außerdem mehrmals dem Einfluss von Mutagenen ausgesetzt werden kann, kann eine Zelle von mehreren - sogar unterschiedlichen - Mutationen betroffen sein. Wiederholte Mutationen können auch die vorher bereits mutierten Abschnitte betreffen, und können die ursprüngliche Sequenz wiederherstellen. In diesem Fall handelt es sich um eine reverse oder back Mutation, das heißt die DNA mutiert zurück, und damit werden die möglicherweise schädlichen Folgen behoben. Es gibt auch eine andere Möglichkeit, um die Folgen einer Mutation scheinbar zu beseitigen. Bei Prokaryoten wurde es beobachtet, dass trotz einer Mutation der DNA, keine abweichende Aminosäure in die Proteinkette eingebaut wurde. Es stellte sich heraus, dass in diesem Fall auch die tRNA mutiert war, und zu dem veränderten Codon der mRNA trotzdem die ursprüngliche Aminosäure transportiert hat. Solche tRNAs werden suppressor tRNA genannt. Betrifft eine Mutation einen längeren Abschnitt, also eine beliebige Zahl von Basen des Gens, handelt es sich um eine Gendeletion, -addition (-insertion), oder - wenn der Abschnitt sich umkehrt - um eine Geninversion. 25 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mutationen und Polymorphismen Längere Deletionen können nicht nur ein Gen, sondern ganze Genfamilien betreffen (wobei die Gene, die sich aus einem einzigen Stammgen evolviert haben, heute aber unterschiedliche Funktionen aufweisen, sich in einer Reihe auf der DNA befinden). Ein Beispiel dafür sind die Deletionen der Globin Genfamilie in verschiedenen Hämoglobin Störungen (Hämoglobinopathien), z.B. Thalassämien (der Mutationsmechanismus wird später, bei der Diskussion von Hotspots, detailliert dargestellt). Je länger die betroffene Sequenz ist, desto schwerwiegender sind die Folgen, also desto fehlerhafter, veränderter und funktionsunfähiger ist das Proteinprodukt. Ein spezieller Fall der Additionen ist es, wenn Alu Sequenzen oder LINE Elemente mithilfe von Transposition oder Retrotransposition in einen kodierenden Abschnitt des Gens eingebaut werden. In diesen Fällen wird die Insertion des springenden Gens (Transposon oder Retroposon) die ursprüngliche Exon Sequenz unterbrechen, und somit entstehen RNA und Proteine mit einem veränderten Informationsgehalt. Z.B. bei Hämophilie A wird die Erkrankung durch die Insertion einer Alu Sequenz herbeigeführt. Gleichermaßen kann die Verdopplung eines Gens infolge einer Rekombination zu einer Genmutation führen. Diese Verdopplung kann entweder während der Meiose, im Lauf des inäqualen Crossing-overs zwischen homologen Chromatiden (die aber keine Schwesterchromatiden sind), oder während der Mitose, falls die äußerst seltene mitotische Rekombination (Crossing-over) zwischen Schwesterchromatiden stattfindet, erfolgen. In dem letzten Fall ist die Mutation somatisch, und kann, durch die Produktion von Tochterzellen, wo Heterozygotie in der einen Tochterzelle verloren geht, unter anderem zur Entstehung eines Tumors führen. (In der anderen Tochterzelle gibt es drei Kopien desselben Gens, da ein homologes Chromatid eine Genduplikation aufweist, das andere aber nur eine Kopie des Gens am betroffenen Locus hat.) Hier müssen wir die sogenannten Hotspots erwähnen. DNA Abschnitte und Gene mutieren sich mit erhöhter Wahrscheinlichkeit an Stellen, die repetitive Sequenzen aufweisen. Solche sich wiederholenden Sequenzen können sowohl die Replikation, als auch die meiotischen Paarung der homologen Chromatiden stören. Die Replikationsstörung hat physische Ursachen: symmetrische oder repetitive DNA Sequenzen auf dem getrennten Einzelstrang können sich wegen der Komplementarität paaren, oder eine Schleife bilden, und damit können sie die Funktion der, in der Replikation und Reparatur beteiligten Enzyme stören. Zum Beispiel bei Hämophilie B ist die Zahl der Mutationen 10-100-mal erhöht auf den Abschnitten des Faktor IX kodierenden Gens, wo es umfangreiche CG Repeatsequenzen gibt. Jedoch ist die erhöhte Mutationsrate auf diesem Abschnitt auch auf epigenetische Ursachen zurückzuführen. Methyliertes Cytosin desaminiert sich leicht zum Thymin, und damit entsteht eine C→T Transition auf dem einen Strang und eine G→A Transition auf dem anderen Strang. Mit dem oben erwähnten inäqualen Crossing-over (siehe auch unter dem Kapitel ’Zytogenetik’ 3) können die Wiederholungen (Repeats) von größeren Abschnitten, sogar ganze Gene, erklärt werden. Ein gutes Beispiel dafür ist die Entstehung des α-Thalassämie. Unter normalen Umständen gibt es je zwei, einander folgende αGlobin Gene auf beiden homologen Chromosomen des Chromosoms 16. Infolge eines fehlerhaften Crossingovers können jedoch Gameten entstehen, die nur 1 oder auch eben 3 α-Globin Gene tragen. Damit entstehen nach der Befruchtung Zygoten, die ein α-Globin Gen entweder zu viel oder zu wenig haben. Auch die Gesundheit der betroffenen Person hängt von der Zahl der α-Globin Gene ab: 0 Kopie bedeutet intrauterines Tod, 1 Kopie führt zur schweren, 2 Kopien zur milderen Anämie, während asymptomatische Träger 3 Kopien haben. Heute kennen wir über 30 verschiedene Erkrankungen, die als Folge eines ungleichen Crossing-overs entstehen (z.B. Farbfehlsichtigkeit). Nicht nur die sich direkt wiederholenden Sequenzen, sondern auch palindromischen Sequenzen (also Sequenzen, die die gleiche Basenabfolge in 5’-3’ Richtung auf beiden Strängen haben) können oft Mutationen verursachen, meistens Additionen und Deletionen. Die sogenannten Repeat Mutationen (dynamische Mutationen), die repetitive DNA-Sequenzen (Nukleotid Repeat Sequenzen) betreffen, bilden einen Spezialfall der Genmutationen. Neben den bestbekannten Trinukleotid Repeat Mutationen, die Basentripletts (Trinukleotids) betreffen, gehören auch Mutationen, die Sequenzen anderer Länge, z.B. 24 Nukleotide betreffen und damit die Anhäufung von Octapeptide verursachen (z.B. Creutzfeld-Jakob Krankheit), hierher. Trinukleotid Repeat Mutationen (Trinukleotiderkrankungen) können in mehrere Gruppen unterteilt werden. 1. Polyglutaminerkrankungen (das Basentriplett CAG codiert für Glutamin) sind von der Anhäufung des Basentripletts CAG verursacht. Die heute bekannten CAG Trinukleotid Repeat Mutationen verursachen schwere neurodegenerative Krankheiten, obwohl die Zahl der Wiederholungen des Basentripletts unterschiedlich sein 26 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mutationen und Polymorphismen kann. Bei Chorea Huntington und Spinobulbäre Muskelatrophie Typ Kennedy (auch Kennedy-Krankheit genannt) betreffen die repetitiven Sequenzen die proteincodierende Region des Gens. 2. Die andere bekannte Gruppe bilden die Polyalaninerkrankungen, wo die Anhäufung des Basentripletts GCN (N steht für jedes beliebige Nukleotid), und damit eine Anhäufung von Alanin im Protein im Hintergrund der Erkrankung steht. Diese Mutationen betreffen meistens Transkriptionsfaktoren, und verursachen vor allem Entwicklungsstörungen, wie z.B. Polysyndaktilie oder Facio-digito-genitale Dysplasie (auch als AarskogSyndrom bekannt). 3. Während bei den bisher erwähnten Trinukleotid-Repeat-Erkrankungen die repetitiven Sequenzen in codierenden Regionen liegen, sind die Wiederholungen bei Fragiles-X-Syndrom und Myotoner Dystrophie außerhalb des Leserahmens, in der UTR (UTR=untranslated region, untranslatierte Region). Bei diesen Erkrankungen ist auch die Zahl der Basentriplett-Wiederholungen meistens größer. Tabelle 2.1. EINIGE BEISPIELE FÜR TRINUKLEOTIDREPEATERKRANKUNGE N: Erkrankung Prävalenz Trinukleotid normale Zahl der Zahl der bekannten Wiederholungen mutanten Allele Chorea Huntington 1: 10 000 (CAG)n 11–34 42–100 Fragiles-X-Syndrom 1: 2000 (CGG)n 10–50 52–500 Myotone Dystrophie 1: 8000 (CTG)n 5–35 50–200 Kennedy-Krankheit (CAG)n 11–31 40–65 1: 50 000 Charakteristisch für die Repeat-Mutationen ist es, dass sie nur über einem Schwellenwert, also über einer bestimmten Anzahl von Wiederholungen Erkrankungen verursachen, es gibt also ein Prämutations-Stadium. Außerdem erfolgt eine Expansion, also die Erhöhung der Anzahl der Wiederholungen, während des Generationswechsels, wahrscheinlich während der Meiose. Die Expansion der Basentripletts (z.B. CAG) kommt wahrscheinlich infolge eines - bei der Diskussion von Hotspots bereits erwähnten - Prozesses zustande, indem der eine Strang der DNA während der Replikation wegen der repetitiven Sequenzen eine Schleife bildet. Entsteht diese Schleife auf dem Tochterstrang, so nimmt es der Replikationsapparat als einen unvollständig kopierten Strang wahr, und fügt weitere Basentripletts zum neu synthetisierenden Strang hinzu. Damit wird der Tochterstrang mehr Wiederholungen aufweisen als der Mutterstrang. Die unterschiedliche Länge der zwei Stränge wird dann durch Reparaturmechanismen ausgeglichen, wobei auch der Mutterstrang weitere Basentripletts hineingeschoben bekommt. Das Umgekehrte kann auch vorkommen, wobei sich die Zahl der Wiederholungen verringert. In solchen Fällen wird die Schleife auf dem Matrize-Strang gebildet, deshalb entsteht ein, im Vergleich zum Matrize-Strang verkürzter Tochterstrang. Auch in diesem Fall wird der Fehler korrigiert, und so werden die überflüssigen Tripletts auch von dem Mutterstrang entfernt, und ein neues DNA Molekül entsteht, das wenigere repetitive Elemente aufweist als das alte. Da DNA Replikation sowohl vor einer Mitose als auch vor einer Meiose stattfindet, könnte eine Veränderung der Anzahl der Wiederholungen theoretisch in beiden Fällen erfolgen. Tatsächlich kann aber die Veränderung der Anzahl der Repeats im Fall der GCN Basentriplett Repeats mit einem inäqualen Crossing-over während der Meiose erklärt werden. Da die Anzahl der repetitiven Sequenzen sich von Generation zu Generation verändert, die Mutation also instabil ist, werden diese Mutationen heutzutage auch dynamische Mutationen genannt. Bei Prokaryoten ist dieser Dynamismus als ein wichtiger Mechanismus bei der Abwehr der antibakteriellen Effekte des wirtlichen Immunsystems betrachtet; bei Eukaryoten könnte er bei Tumorbildung eine Rolle spielen. Die krankheitsverursachende Rolle der Repeat Mutationen ist leicht zu verstehen, da die überflüssigen Wiederholungen, die in den Leserahmen hineingeschoben werden (Expansion), die Struktur des betroffenen 27 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mutationen und Polymorphismen Gens immer mehr verzerren, und damit auch das von diesem Gen codierte Protein immer fehlerhafter und funktionsunfähiger wird. Dieser Mechanismus erklärt auch ein, in der Humangenetik längst bekanntes aber früher unerklärbares Phänomen, die Antizipation. Antizipation besagt, dass sich eine Erbkrankheit von Generation zu Generation immer früher manifestiert, und einen schwereren Verlauf nimmt (stärker ausgeprägt ist). Da die aus medizinischer Hinsicht bedeutenden Repeat Expansionen vor allem während der Meiose (oder der vorangehenden S-Phase) entstehen, und durch diese Repeat Mutationen das betroffene Gen immer defekter wird, kann das oben erwähnte Phänomen erklärt werden. Bei Eukaryoten, also auch bei Menschen, ist bei einer Genmutation nicht nur der Grad der Mutation, also die Länge des betroffenen DNA-Abschnitts wichtig, sondern auch die Position der Mutation. Es ist sehr wichtig, ob die Mutation in einem codierenden oder nicht-codierenden (UTR=untranslatierte Region) Abschnitt, in Exons oder Introns, oder eben an der Grenze zwischen diesen liegt. In dem letzteren Fall handelt es sich um eine Spleißen-Mutation, da die Sequenz an der Grenze zwischen Exons und Introns eine bedeutende Rolle an der Zirkularisierung des Introns, also die Bildung der lassoartigen Struktur (Lariat), und damit das Funktionieren des Spliceosomes spielt. Als Folge einer Spleißen-Mutation geht entweder ein Exon verloren, oder wird auch ein Intron transkribiert. In beiden Fällen wird ein fehlerhaftes Protein als Endprodukt gebildet. Selbst die Mutationen eines einzigen Gens - je nach der Position und Ursprung (ob Basenaustausch oder fehlerhaftes Spleißen) der Mutation - können Symptome unterschiedlichen Schweregrades hervorrufen. Ein gutes Beispiel dafür ist die zystische Fibrose (Mukoviszidose), die von zahlreichen bekannten Mutationen verursacht werden kann. Die Rolle der nicht translatierten UTR Mutationen wurde erst neulich begreifbar. Auf den ersten Blick könnten wir davon ausgehen, dass eine Mutation, die einen nicht-codierenden DNA-Abschnitt betrifft, also nicht zur Produktion eines fehlerhaften Proteins führen kann, keine Symptome oder Erkrankungen verursachen kann. Heute aber wissen wir, dass z.B. die 5’ UTR Region zur Anhaftung der mRNA zum Ribosom nötig ist, und damit für eine normale Proteinsynthese unerlässlich ist. Damit wurde es auch auf einmal klar, weshalb gewisse Trinukleotid-Repeat-Mutationen, bei denen die Expansion eine UTR Region betrifft, zu Erkrankungen führen. Außerdem induziert die Methylierung von Cytosin-haltigen Repeat Sequenzen eine Reihe von epigenetischer Veränderungen (methylbindende Proteine, Verknüpfen von non-codierenden RNAs, Chromatin Remodeling), die auch als Erklärung der krankheitsverursachenden Rolle von UTR-Mutationen dient. Obwohl dank des Humangenomprojekts die Sequenz der menschlichen DNA beinahe vollkommen bekannt ist, bedeutet die Kenntnis der Sequenz noch lange nicht die Kenntnis der Gene, und auch die Kenntnis der Gene bedeutet nicht automatisch die Kenntnis ihrer Funktionen! Dies stellt besonders in den Fällen, wo die Mutation zur Produktion eines Proteins mit einer neuen, veränderten Funktion führt, aber weder das ursprüngliche Protein noch die Mutation bekannt sind, ein Problem dar. In solchen Fällen handelt es sich um Gain-of-Function-Mutationen. In diesen Fällen ist das Erkunden viel schwieriger. So war es auch bei der Erforschung der Chorea Huntington, wo die Funktion des am Ende identifizierten Proteins, Huntingtin, das die Krankheit verursacht, auch heute noch nicht genau bekannt ist. Die Lage ist einfacher bei Mutationen, bei denen ein Protein mit einer bereits bekannten Struktur und Funktion verlorengeht oder seine Funktion verändert. In diesen Fällen sprechen wir über eine Loss-of-FunctionMutation, wie z.B. die Phenylketonurie oder die Sichelzellenanämie. Loss-of-Function-Mutationen sind meistens rezessiv, bewirken einen Phänotyp also nur in homozygoten Trägern (in reinerbiger Form). Dies kann geschehen, weil bei den meisten Genprodukten die genaue Dosis nicht wichtig ist, und das System auch mit einer halben Dosis funktioniert. Es gibt jedoch Dosis-abhängige Gene, bei denen die um 50% reduzierte Menge des Genprodukts für die Aufrechterhaltung der Genfunktion unzureichend ist. Dieses Phänomen wird Haploinsuffizienz genannt. Haploinsuffiziente Gene bewirken bereits in heterozygoten Trägern einen kranken Phänotyp, und damit wird die Loss-of-Function-Mutation in diesen Fällen mit einem dominanten Erbgang assoziiert. Es kommt auch vor, dass einer Mutation zufolge nicht nur die ursprüngliche Funktion des Genprodukts verlorengeht, noch dazu verhindert das mutante Produkt das normale Funktionieren des normalen Produkts, wenn z.B. das normale und abnormale Produkt keine Dimeren miteinander bilden können. Dies ist der sogenannte dominant-negativ Effekt, also die Mutation ist mit einem dominanten Phänotyp assoziiert und ist auch in Heterozygoten ausgeprägt. 28 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mutationen und Polymorphismen 3. DNA-Reparatur (repair) Da in der DNA und somit in Genen, Mutationen auf vielfältige Weise entstehen können, verwundert es nicht, dass es sich im Laufe der Evolution vielfältige Mechanismen zur Aufrechterhaltung der Integrität des Erbgutes, also zum Abwehren von Mutationen und zur Korrektur der entstandenen Fehler, entstanden. Der zusammenfassende Name dieser Mechanismen ist DNA-Reparatur oder Repair. Die Reparaturmechanismen werden je nachdem gruppiert, ob sie 1.) auf die Mutation verursachende chemische Reaktion gerichtet sind - direkte Reparatur 2.) die beschädigten Basen ausschneiden und durch unbeschädigte Basen ersetzen - Exzisions-Reparatur 1.) Das beste Beispiel für die direkte Reparatur ist das Entfernen der durch UV-Strahlung induzierten Timin Dimere. Photoreaktivierung ist ein Mechanismus, der vor allem bei Prokaryoten und in manchen Eukaryoten (z.B. bei Hefen) charakteristisch ist. Während der Photoreaktivierung werden mithilfe von Lichtenergie die durch UV-Strahlung entstandenen Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere aufgelöst, und da die Basen dabei auf ihrer ursprünglichen Stellen bleiben, wird die ursprüngliche Struktur wiederhergestellt. Obwohl UV-Strahlung eine der ubiquitärsten Mutagene überhaupt ist (denken wir nur an die wegen des wachsenden Ozonlochs immer intensivere UV-Strahlung, deren Effekt die Erdfläche ausgesetzt ist), sind viele Arten - unter denen auch Menschen - bedauerlicherweise unfähig zur photoreaktiven Reparatur. Könnte es vielleicht mit der relativ späten - der Erscheinung der Ozonschicht und damit die Reduzierung der UV-Strahlung folgenden - Erscheinung der menschlichen Rasse im Laufe der Evolution erklärt werden? Der andere direkte Reparaturmechanismus richtet sich auf das Entfernen von alkylierten Basen. Das Enzym O6Methylguanin-DNA-Methyltransferase entfernt Methylgruppen von Guanin Basen indem es diese an das Cystein in seinem Aktivzentrum verknüpft. Solche Enzyme sind sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten vorhanden. 2.) Exzisions-Reparaturen sind bei weitem häufiger als direkte Reparaturen. Es gibt drei Formen von Exzisions-Reparaturen: a) Basen-Exzisions-Reparatur b) Nuleotid-Exzisions-Reparatur c) Basenfehlpaarungs-Reparatur (Mismatch-Reparatur) a) Bei Basen-Exzisions-Reparatur wird eine einzige beschädigte oder inkorrekte Base ausgeschnitten, und eine DNA Polymerase füllt die entstandene Lücke aufgrund der Basensequenz des komplementären Strangs mit der korrekten Base. b) Bei Nukleotid-Exzisions-Reparatur werden nicht nur die mutanten Basen, z.B. Thymin-Dimere, sondern auch die benachbarten Basen ausgeschnitten, also ein Oligonukleotid. Die Lücke wird von der DNA Polymerase, abhängig von dem komplementären Strang, gefüllt, und eine DNA Ligase verknüpft die ursprünglichen und die neu synthetisierten Basen. In Menschen benötigt dieser Prozess die Produkte von sieben verschiedenen Genen, beim Mangel an irgendeiner von diesen fällt die Reparatur der durch UV-Strahlung ausgelösten Mutationen aus. Das ist der Fall bei einigen seltenen Erbkrankheiten, wie z.B. Cockayne-Syndrom oder Xeroderma Pigmentosum. Dieses letztere Erkrankungsbild ist ein gutes Beispiel für die genetische Heterogenität, da die Beschädigungen verschiedener Exzisions-Reparatur-Enzymen die gleichen Symptome hervorrufen können. c) Bei Basenfehlpaarungs-Reparatur (Mismatch-Reparatur) werden die nicht genau komplementären, also sich in die Doppelhelix nicht genau fügenden Basen erkennt und entfernt. Bei der DNA-Replikation werden die inkorrekt eingebauten Basen dank der Proofreading Aktivität der DNA Polymerase (3’→5’ Exonuklease Aktivität) erkannt und entfernt. Die inkorrekten Basen, die durch diesen Reparatur-Mechanismus durchgeschlüpft sind, werden von dem Enzymkomplex der Basenfehlpaarungs-Reparatur korrigiert. Während die bakterielle Basenfehlpaarungs-Reparatur relativ gut erforscht ist, ist die menschliche nur ungenügend bekannt. Soviel ist jedenfalls bekannt, dass ein häufiger vererbbarer Dickdarmkrebs mit der 29 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mutationen und Polymorphismen Mutation des Basenfehlpaarungs-Reparatur-Enzymkomplexes im Zusammenhang steht. Also nicht nur die Beschädigung eines einzigen, für ein bestimmtes Protein codierenden Gens, sondern auch die Beschädigung von irgendeiner der DNA-Reparaturmechanismen zur Entstehung einer Erkrankung führt. Sowohl die direkte Reparatur als auch die Exzisions-Reparatur erfolgt noch bevor der DNA-Replikation, und garantiert damit, dass nur fehlerlose DNA verdoppelt wird. Die Zellen benutzen aber weitere Versicherungsmechanismen, und verfügen neben den bereits erwähnten Mechanismen über zwei weitere, alternative, Post-Replikations-Reparatur-Mechanismen. Einer von diesen ist die RekombinationsReparatur, der andere die error-prone oder SOS-Reparatur. Bei der Rekombinations-Reparatur verhindert die nicht reparierte Mutation, z.B. ein Thymin-Dimer, die Synthese der DNA, folglich entsteht eine Lücke an jener Stelle auf dem Tochterstrang. (Die Synthese bricht nicht ganz ab, da die DNA-Polymerase den Tochterstrang auch - wie bei den Okazaki-Fragmenten - in Stücken synthetisieren kann). Die Lücke wird später, mit dem Mutterstrang rekombinierend, gefüllt, während die Lücke, die auf diese Weise auf dem Mutterstrang entsteht, von der DNA Polymerase und Ligase zusammen gefüllt wird, da es hier keine, die Synthese störende Beschädigung gibt. Hauptsache bei diesem Mechanismus ist es, dass er eine spätere, aber die folgende Replikation vorangehende, Reparatur ermöglicht. Die am schwierigsten zu reparierenden Mutationen sind die – meistens infolge von ionisierenden Strahlung oder oxidativer Beschädigung entstandene - DNA-Doppelstrangbrüche (double stranded breaks), da es bei diesen im Gegensatz zu den vorher erwähnten Reparaturmechanismen - keinen Strang als Matrize zur Verfügung steht. Doppelstrangbrüche führen zur Bildung von freien Enden, und damit erhöhen sie die Instabilität der Chromosomen, was zur Entstehung von Chromosomenaberrationen führen kann. Zwei Mechanismen dienen zur Behebung von Doppelstrangbrüchen: a) nicht homologe End-zu-End Verknüpfung (nicht homologes Endjoining, non-homologous end joining, NHEJ) - die Verbindung von nicht-homologen Enden b) Homologe Rekombination Bei NHEJ verknüpft eine spezielle DNA Ligase mithilfe eines Kofaktors die gebrochenen Enden. Falls im Bereich des Doppelstrangbruchs der eine Strang etwas länger als der andere ist und auch einen mikrohomologen Abschnitt aufweist, wird die Reparatur mit hoher Wahrscheinlichkeit genau. Sind die beiden Stränge jedoch von gleicher Länge, steigt das Risiko zur Verknüpfung von nicht zusammengehörenden Abschnitten, und damit zur Entstehung von strukturellen Chromosomenaberrationen. Bei einer homologen Rekombination wird entweder der geeignete Abschnitt des homologen Chromosoms, oder die bereits in der G2 Phase des Zellzyklus entstandenen Schwesterchromatiden als Matrize zur Reparatur benutzt, mithilfe von Enzymen, die beim Crossing-over benutzten Enzymen ähneln. Die SOS Reparatur oder error-prone repair ist nur bei Prokaryoten bekannt (obwohl es angenommen wird, dass ähnliche Mechanismen auch bei Eukaryoten zu finden sind), und wird nur in dem Extremfall, wenn das Überleben der Zelle fragwürdig ist, angewendet. Falls sehr starke Strahlung oder ein anderer mutagener Einfluss den Grossteil der DNA beschädigt, gibt es keine Zeit für die oben erwähnten genauen, aber langsamen Reparaturmechanismen, und um den sofortigen Zelltod zu vermeiden, muss die Integrität der DNA - auch noch so inkorrekt - schnell wiederhergestellt werden. Es ist leicht einzusehen, dass solche Reparaturmechanismen bei Eukaryoten unnötig wären, da der Tod einer einzigen Zelle nicht zum Tod des ganzen Organismus führt, da die verlorene Funktion der toten Zelle von den anderen Zellen angenommen wird. Freilich existieren für die Aufrechterhaltung der Integrität des Genoms nicht nur verschiedene Reparaturmechanismen, sondern auch solche Inaktivierungsmechanismen, die die mutagenen Agentien neutralisieren, inaktivieren können. Ein solches System ist das Peroxisom, in dem das Enzym SuperoxideDysmutase (SOD) Superoxid-Anionen zu Wasserstoffperoxid umwandelt, und diese dann wiederum durch das Enzym Katalase in Wasser und Sauerstoff umgesetzt und neutralisiert werden. 4. Mutagenitätstests Um den schädlichen Wirkungen der Mutationen vorzubeugen, können wir uns nicht ausschließlich auf die evolutionell in unsere Zellen eingebaute Reparaturmechanismen veranlassen, wir müssen alles tun, um die Produktion und den Vertrieb von mutagenen Agentien zu vermeiden. Diesem Ziel dienen die Mutagenitätstests. Internationale Vorschreibungen gemäß müssen alle neue Medikamente und Chemikalien in 30 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mutationen und Polymorphismen einem ’Chemikalienbewertung’ genannten Prozessüberprüft werden, und Mutagenitätstests bilden einen Teil dieser Untersuchungen. Ausschlaggebend ist es, dass die Untersuchungen möglichst umfangreich sind, und in vivo und in vitro Untersuchungen an Prokaryoten, Eukaryoten, Säuger, darunter auch Humanforschungen, einschließen, um mutagene (=Mutationen verursachende) Wirkungen ausschließen zu können. Die ersten Tests sind meistens an Bakterien durchgeführt, z.B. das Ames-Test, und sind zum Nachweis von Punktmutationen geeignet. Bei dem Ames-Test werden die Bakterien der zu untersuchenden Chemikalie direkt ausgesetzt. Es kommt aber vor, dass nicht die Testchemikalie/Testsubstanz, sondern ein Metabolit deren mutagen ist. In solchen Fällen werden auch Mikrosomen aus dem Leber eines Säugers, und damit zum Metabolismus nötigen Enzyme, zum Testsystem gegeben. Mutagenitätstests schließen aber auch Tests ein, die nicht nur Punktmutationen, sondern auch die Reparatur betreffenden Mutationen, und numerische und strukturelle Chromosomenmutationen nachweisen können. Die Sister-Chromatid-Exchange (SCE) Technik, wobei der Austausch von Schwesterchromatiden demonstriert wird, ist ein weitverbreitetes in vitro Verfahren. Obwohl es auch noch heute unbekannt ist, warum solcher Austausch von Schwesterchromatiden in gesunden somatischen Zellen stattfindet, da das genetische Material von Schwesterchromatiden 100% gleich ist (die Wirkung von fehlerhaften Replikationen ist geringfügig). Tatsache ist jedoch, dass mutagene Substanzen diesen Austausch von den normalen 4-5 pro Zelle pro Mitose zum Mehrfachen dieser Zahl steigern. Dieses Verfahren hat auch in der klinischen Diagnostik ihren Platz, bei der Diagnose von solchen seltenen Erbkrankheiten, die mit einer erhöhten Instabilität und Brüchigkeit von Chromosomen verknüpft sind, wie z.B. das Bloom-Syndrom, wo ein Testergebnis von 60 SCE/Zelle als Grundlage der Diagnose dienen kann. Bei der Bewertung der mutagenischen Wirkungen sind folgende, in der Populationsgenetik und Evolutionsgenetik benutzten Begriffe/Kategorien nützlich: vorteilhafte, schädliche und neutrale Mutationen. Mit diesen Kategorien werden Mutationen aus der Hinsicht des Überlebens der Art gezeichnet. Es muss jedoch im Auge behalten werden, dass die Mutation hier nicht an sich, sondern ausschließlich im Zusammenhang mit der gegebenen Umgebung untersucht wird. Das beste Beispiel dafür ist der klassische Fall des Birkenspanners, der eine weiß und eine schwarz pigmentierte Variante hat. Das ist auch eine Mahnung, dass sich nicht nur das Erbgut, sondern auch die Umwelt verändert, und eine Eigenschaft, die in einer bestimmten Umwelt günstig oder neutral ist, in einer anderen Umwelt schädlich sein kann, oder umgekehrt. Hier muss es auch bemerkt werden, dass der Unterschied zwischen wilden und mutanten Allelen sich immer auf eine bestimmte Umgebung, Population bezieht, und das häufigste Allel immer als ’wild’ bezeichnet wird. Empfohlene Webseiten : www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/ www.hvgs.org/mutnomen/ http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/hahaha.php http://decipher.sanger.ac.uk/ www.ncbi.nlm.nih.gov 5. Fragen 1. Was ist der Unterschied zwischen einer Punktmutation und einem SNP? 2. Welche Mutationstypen kennen Sie auf ihren Ursprung bezogen? 3. Nennen Sie einige chemische und physische Mutagene! 4. Warum kann ein DNA-Doppelstrangbruch zu einer strukturellen Chromosomenaberration führen? 5. Was ist der Unterschied Polyglutaminerkrankungen? zwischen den Ursachen von 6. Wie erklären Sie die Existenz von Mutations-Hotspots? 31 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Polyalaninerkrankungen und Mutationen und Polymorphismen 7. Was ist der Zusammenhang zwischen Antizipation und Nukleotid-Repeat-Mutationen? 8. Warum gibt es keine SOS-Reparatur in mehrzelligen Organismen? 9. Wann geschieht die Reparatur von Mutationen? 10. Schildern Sie einige Mutagenitätstests! 11. Welche Folgen können Spleißen-Mutationen haben? 32 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 3. Zytogenetik. Chromosomenmutationen Sára Tóth Die Zytogenetik ist das Teilgebiet der Genetik, das sich mit der - für die bestimmte Art und Zelle spezifische Anzahl, der Struktur, den charakteristischen Abschnitten, der funktionellen Rolle und der Anomalien (Chromosomenmutationen) von Chromosomen beschäftigt. Chromosomenmutationen entstehen infolge einer Veränderung in der Anzahl oder Struktur eines Chromosoms, und sind relativ selten, im Gegenteil zu den häufigen, normalen und harmlosen Chromosomenpolymorphismen. Beide Typen von Chromosomenaberrationen - numerische und strukturelle - betreffen viele Gene, außerdem ist die Größe der Chromosomen, bzw. die Größe der betroffenen Abschnitte, binnen der Resolution des Lichtmikroskops. Deshalb können größere Chromosomenmutationen mit dem Lichtmikroskop untersucht werden, im Gegenteil zu Genmutationen, die nur mit molekularbiologischen Methoden identifiziert werden können. Gleichzeitig können kleinere strukturelle Veränderungen (z.B. Mikrodeletionen oder CNVs), die früher mit dem Lichtmikroskop nicht erkennbar waren, mit modernen Hybridisationstechniken (FISH oder CGH) identifiziert werden. Bezüglich der Entstehung von Chromosomenaberrationen sind zwei Fragen von entscheidender Wichtigkeit: wann und wo die Veränderung stattfand. Obwohl Chromosomenmutationen sowohl bei einer Mitose als auch bei einer Meiose entstehen können, die bei der Meiose entstandenen Chromosomenaberrationen können zur Entstehung von fehlerhaften Gameten, und damit kranken Nachkommen, führen. Damit sind diese Aberrationen vom Standpunkt der Medizin wichtiger, als mitotische Chromosomenaberrationen. Bezüglich der mitotischen Chromosomenaberrationen ist es wichtig, wann und in welchem Zelltyp sie während der Ontogenese entstehen. Die, im Laufe der frühen Zellteilungen während der Furchung entstehenden Mutationen können schwerwiegende, den ganzen Organismus betreffende Folgen haben. Aberrationen, die in einem ständig proliferierendem Zelltyp (z.B. Epithelzellen), im Erwachsenenalter entstehen, sind von geringerer Bedeutung. Trotzdem spielen Chromosomenmutationen bei der Entstehung von Tumorzellen, und deren rapider Proliferation, eine entscheidende Rolle. Bei der Entstehung von Chromosomenaberrationen spielen zwei Chromosomenabschnitte eine entscheidende Rolle: das Zentromer und die Telomere. Das Zentromer ist der Bereich der primären Einschnürungsstelle des Chromosoms, wo die Schwesterchromatiden zusammengehalten werden. Die Position des Zentromers ist streng geregelt, und Chromosom-spezifisch. Hier heften sich das Kinetochor und die Spindelfasern (Mikrotubuli). Das Zentromer ist während der Segregation der Schwesterchromatiden in der Anaphase wichtig, und daher spielt es eine Rolle bei der Entstehung von zahlenmäßigen Chromosomenaberrationen. Azentrische Chromosomenfragmente (das heißt Chromosomenabschnitte ohne ein Zentromer) können nicht zu dem entsprechenden Zellpol gelangen und gehen daher während der einander folgenden Zellteilungen verloren. Im Bereich des Zentromers gibt es viele repetitive GC-reiche Sequenzen, und das Zentromer selbst enthält die am spätesten replizierenden DNA. Die Telomere bilden die Ende der Chromosomen, sind reich an TTAGGG Repeatsequenzen, und sind für die Stabilität und Integrität der Chromosomenstruktur verantwortlich. Da die Struktur des Chromosoms ohne Telomere instabil ist, und telomerlose Ende aneinander kleben können, und daher die Bildung von zahlreichen Aberrationen ermöglichen, spielen Telomere eine wesentliche Rolle in der Alterung der Zellen und in der Entstehung von Krebs und strukturellen Chromosomenaberrationen. 1. Chromosomenmutationen oder strukturelle Chromosomenaberrationen Strukturelle Chromosomenaberrationen entstehen infolge von Brüchen in der DNA-Doppelhelix (Doppelstrangbrüche), die spontan oder induziert auftreten können (Abb. 1). Strukturelle Chromosomenaberrationen werden nach der Anzahl und Stelle der Bruchpunkte geordnet. Abbildung 3.1. Gruppierung der strukturellen Chromosomenaberrationen 33 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen 1.1. Deletionen Eine Deletion entsteht, wenn infolge eines Doppelstrangbruchs ein Abschnitt eines Chromosoms verlorengeht. Damit geht auch die genetische Information, die auf dem verlorengegangenen Abschnitt kodiert war, auch verloren, was zur fehlerhaften Funktion oder sogar zur Zerstörung der betroffenen Zelle führt. Eine der frühesten Formen der genetischen Kartierung, die Deletionskartierung war möglich, weil infolge von Deletionen gewisse Funktionen verlorengehen, gewisse Proteine, z.B. Enzyme nicht produziert werden, und so war es bereits bevor der Epoche der Molekularbiologie möglich, die Bereiche der verlorengegangenen Gene zu finden. Eine terminale Deletion entsteht wenn der Doppelstrangbruch in der Nähe des Endabschnitts des Chromosoms ist. In diesem Fall geht - neben anderen Genen - auch das Telomer verloren, was zur frühen Letalität und schweren Symptomen führt. Das bekannteste Beispiel der terminalen Deletion ist das Katzenschrei-Syndrom oder Cri-du-chat-Syndrom, wobei es um den Verlust des kurzen Arms des Chromosoms 5 handelt. Den Namen bekam das Syndrom nach dem charakteristischen, katzenartigen Schreien der betroffenen Neugeborenen. Die Krankheit ist oft letal um die Geburt oder im frühen Kindesalter. Zu einer interstitiellen Deletion kommt es, wenn zwei Doppelstrangbrüche auf einem Chromosom liegen, und der Abschnitt zwischen den Brüchen verlorengeht. Abhängig von dem betroffenen Chromosom haben solche Mutationen meistens schwerwiegende Folgen, schwere körperliche oder geistige Behinderung, spontane Fehlgeburt oder frühzeitiger Tod. Die bekannteste interstitielle Deletion betrifft den langen Arm des Chromosoms 15: del15(q11-13). Diese Deletion verursacht die Prader-Willi, bzw. Angelman-Syndrome (siehe auch Epigenetik und genomische Prägung - ’genomic imprinting’). Bei dem Vorigen handelt es sich um eine Deletion auf dem väterlichen Chromosom, bei dem Letzteren um eine Deletion auf dem mütterlichen Chromosom. Kleinere interstitielle Deletionen, sogenannte Mikrodeletionen stehen im Hintergrund der Williams- und DiGeorge-Syndrome (del7q11.23 und del22q11.2). 1.2. Duplikation 34 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen Duplikation bezeichnet die Verdopplung eines Chromosomenabschnitts. Dies kann durch einen Replikationsfehler oder ungleiches Crossing-over (chromosomale Rekombination) während der Meiose entstehen. In beiden Fällen sind die repetitiven Sequenzen im betroffenen Abschnitt für die Leserasterverschiebung und die inkorrekte Paarung (skipping) von homologen Chromosomen verantwortlich. Ähnlich wie Deletionen, wurden auch Duplikationen zur genetischen Kartierung, das heißt Identifizierung der Bereiche wo bestimmte Gene oder Gengruppen auf einem Chromosom zu finden sind, benutzt (Abb. 2). Abbildung 3.2. Schematische Repräsentierung der Entstehung und möglicher Konsequenzen eines inäqualen Crossing-overs (chromosomale Überkreuzung). 1.3. Translokationen Zur Entstehung einer Translokation müssen mehrere, meistens zwei oder drei Bruchstellen auf dem Chromosom vorhanden sein. Je nach dem Bereich des abgebrochenen Abschnitts, und nach der Anzahl der translozierten Abschnitte unterscheidet man weitere Untergruppen binnen den Translokationen. 1.3.1. Reziproke Translokation Bei reziproken Translokationen gibt es mindestens zwei Bruchstellen auf zwei homologen oder zwei nichthomologen Chromosomen. Die abgebrochenen Abschnitte werden zwischen den zwei Chromosomen wechselseitig (reziprok) ausgetauscht und in die neue Stelle eingebaut. Zufolge einer reziproken Translokation entstehen zwei Chromosomen mit einer veränderten Struktur, was in den meisten Fällen zu keiner phänotypischen Veränderung, das heißt Symptome oder Krankheiten, führt. In diesen Fällen sprechen wir von balancierten Translokationen. Dieses Phänomen wird dadurch erklärt, dass es sich nicht die betroffenen Gene, sondern nur ihre Position verändert hat. Da die kodierenden Regionen nur weniger als 3% des humanen Genoms ausmachen, entstehen die Bruckpunkte meistens auf nicht kodierenden Regionen. In den Fällen, wo die Bruchstelle binnen eines Gens ist, wird das Gen selbst durch die Translokation beschädigt. Daher wird auch das Genprodukt fehlerhaft (die Translokation kann eine Veränderung der Funktion hervorrufen oder sogar zum Verlust der Funktion führen), was wiederum die Entstehung von Aberrationen, z.B. Tumorbildung verursachen kann. Das beste Beispiel dafür ist das Philadelphia Chromosom (Ph1): eine reziproke Translokation zwischen den Chromosomen 9 und 22, das als t(9;22)(q34;q11) bezeichnet wird. Diese Translokation kommt bei chronischen myeloischen Leukämie (CML), und auch bei akuter lymphatischer Leukämie (ALL) vor. Die Bruchstelle auf dem Chromosom 22 betrifft das BCR (breakpoint cluster region) Gen, und der Bruchstelle auf dem Chromosom 9 betrifft das Protoonkogen ABL (Abelson murine leukemie). Da das ABL Gen für eine Tyrosinkinase kodiert, entsteht infolge der Translokation ein bcr/abl Fusionsprotein, das nicht nur ein höheres Molekulargewicht (molekulare Masse) als das ursprüngliche Enzym hat, sondern auch eine stärkere Aktivität 35 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen aufweist. Nämlich geht der eigene, streng regulierte Promoter des ABL Gens infolge der Translokation verloren, was zur kontinuierlichen Transkription des Gens führt. Diese wiederum verursacht die unkontrollierte Proliferation der Zelle und die Entstehung eines Tumors. Ein anderes, aus medizinischer Hinsicht wichtiges Beispiel ist das Burkitt–Lymphom, das meistens vom Epstein-Barr Virus verursacht wird. Bei dieser Krankheit wird das auf dem Chromosom 8 kodierte Protoonkogen c-myc entweder auf das Chromosom 14, auf das Chromosom 2, oder auf das Chromosom 22 [t(8;14) oder t(8;2) oder t(8;22)] transloziert, wo sich die Gene für die schwere Kette des Antikörpers (Chromosom 14), oder die für die leichten Ketten des Antikörpers (κ Kette auf dem Chromosom 2, λ Kette auf dem Chromosom 22) zu finden sind. Da die Gene, die für die Ig Ketten des Antikörpers kodieren, kontinuierlich transkribiert werden, wird mit denen auch die hierher transloziertes c-myc - das für einen als Heterodimer funktionierenden Transkriptionsfaktor kodiert - kontinuierlich transkribiert, was zur Überproduktion des Protoonkogens führt, und daher die Steigerung der Zellproliferation und die Entstehung eines Tumors verursacht. Dieses Beispiel demonstriert den Zusammenhang zwischen Translokationen und Protoonkogene, wo entweder die überflüssige Produktion eines Proteins (z.B. Burkitt-Lymphom) oder - unabhängig von der Regulation - die Produktion eines Fusionsproteins (CML) verantwortlich für die Entstehung eines Tumors ist. Wenn es nicht zwei, sondern drei Bruchstellen gibt, kann eine Insertion entstehen. Bei einer Insertion baut sich ein abgebrochenes Abschnitt eines Chromosoms (das Chromosom mit den zwei Bruchstellen) in ein anderes Chromosom (das mit der einen Bruchstelle) ein. Da der humane Chromosomensatz aus 46 Chromosomen besteht, und jedes beliebige Abschnitt jedes beliebigen Chromosoms abbrechen und mit einem anderen Abschnitt ausgetauscht werden kann, ist die Zahl der möglichen Kombinationen für Translokationen beinahe unendlich. Die Robertson Translokation (auch als Robertson’sche Translokation bekannt, Abb. 3)) oder zentrische Fusion ist ein spezieller Fall der Translokationen. Diese strukturelle Chromosomenaberration betrifft nur akrozentrische Chromosomen, das heißt die humanen Chromosomen 13, 14, 15, 21 oder 22. Nicht nur der Typ der betroffenen Chromosomen, sondern auch die Position der Bruchstelle ist begrenzt: die Bruchstelle liegt immer in der Nähe von oder auf dem Zentromer. Auf diese Weise können fusionierte Chromosomen entstehen, wo das eine Chromosom zwei Zentromere hat (dizentrisches Chromosom), das andere Chromosom aber keins. Bei dem dizentrischen Chromosom bleibt am Ende nur ein Zentromer aktiv, während das azentrische Chromosom bei nachfolgenden Zellteilungen verlorengeht und so vermindert sich die Zahl der Chromosomen. Abbildung 3.3. Robertson Translokation 36 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen Liegt der Bruchpunkt genau auf dem Zentromer, entstehen zwei unizentrische, aber umstrukturierte Chromosomen. Durch die Umstrukturierung entstehen aus den ursprünglich akrozentrischen Chromosomen zwei neue Chromosomen von unterschiedlicher Größe: ein kleineres und ein größeres, meta- oder submetazentrisches Chromosom. Das kleinere Chromosom, das auf beiden Armen Nukleolusorganisatorregionen (NOR) hat, geht während der nachfolgenden Zellteilungen verloren. Da es aber 10 solche NOR Regionen auf den kurzen Armen der akrozentrischen Chromosomen im menschlichen Genom gibt, zieht der Verlust von zwei von diesen keine phänotypischen Konsequenzen hinter sich, das heißt dass die zentrische Fusion balanciert ist. Infolge einer zentrischen Fusion entsteht nicht nur ein abnormal strukturiertes Chromosom, sondern auch die Chromosomenzahl verringert sich von 46 auf 45. Den gegenwärtigen Beweisen der Zytogenetik nach kann die Verringerung der Chromosomenzahl im Laufe der Evolution der Hominiden durch aneinander folgende zentrische Fusionen erklärt werden. Während Gorillas, Schimpansen und Orang-Utans einen Chromosomensatz von 48 Chromosomen haben, hat der Mensch nur 46 Chromosomen. Das bedeutet, dass die zentrische Fusion nach der Trennung der Entwicklungslinie der Hominiden und des Menschen erfolgt haben muss. 1.4. Inversionen Eine Inversion ist eine strukturelle Chromosomenaberration, bei der es zwei Bruchstellen auf dem gleichen Chromosom gibt, und der Abschnitt zwischen diesen Bruchstellen sich um 180 o dreht. Es wird zwischen zwei Formen unterscheidet: 1.) perizentrische Inversion 2.) parazentrische Inversion 1.) Bei einer perizentrischen Inversion bricht das Chromosom auf beiden Armen, das heißt auf beiden Seiten des Zentromers. Relativ häufig ist die perizentrische Inversion des Chromosoms 9. 2.) Bei einer parazentrischen Inversion befinden sich beide Bruchstellen auf dem gleichen Arm des Chromosoms, und so schließt der umgekehrte Abschnitt das Zentromer nicht ein. 37 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen Sowohl die parazentrische als auch die perizentrische Inversion finden meistens auf nicht-kodierenden Regionen statt, und deshalb sind die Betroffenen phänotypisch meistens unauffällig. Unseren heutigen Kenntnissen nach haben auch Inversionen bei der chromosomalen Evolution des Menschen eine Rolle gespielt, da die Struktur von manchen menschlichen Chromosomen von den Chromosomen der Hominiden und Neuweltaffen (Breitnasenaffen) abgeleitet werden kann. Auch die Sumatra- und Borneo-OrangUtans wurden auf der Basis des Vorhandenseins oder Mangels einer Inversion (inv2) in zwei verschiedene Arten unterteilt. 1.5. Ringchromosom (zirkuläres Chromosom, Chromosomenring) In diesem Fall gibt es auf beiden Armen des Chromosoms - meistens in der Nähe der Telomeren - je eine Bruchstelle, die dann miteinander so verknüpft werden, dass ein Ring entsteht. Die abgebrochenen Fragmente, und damit die Information, die sie kodieren, gehen im Laufe der nachfolgenden Zellteilungen verloren. Träger eines Ringchromosoms sind je nachdem, welches Chromosom abnormal ist, und wie groß der verlorene Abschnitt ist, mehr oder weniger schwer betroffen. Die in solchen Patienten typische somatische Retardation (Wachstumshemmung) ist dadurch zu erklären, dass die DNA-Replikation des Ringchromosoms gestört ist: oft kommt es zum Auftreten von Riesenringen (wegen der Duplikation), rekombinanten Chromosomen, Teufelsringen, oder auch zur Entstehung von zwei Ringchromosomen binnen einer Zelle, das heißt einer numerischen Chromosomenaberration. 1.6. Isochromosom Mit dem Namen Isochromosom wird eine strukturelle Chromosomenaberration bezeichnet, das zwei identische Arme hat. Ein Isochromosom entsteht, wenn die Schwesterchromatiden während der Metaphase nicht parallel zu der Chromosoms Längsachse (longitudinal), sondern senkrecht dazu (transversal) getrennt werden und so zu den zwei Zellpolen gezogen werden. So entstehen Tochterchromosomen, die auf beiden Armen nur die Information des langen oder des kurzen Arms enthalten, und die Information, die ursprünglich auf dem anderen Arm kodiert wurde, verlorengeht. Da es auf einem Chromosomenarm sehr viele Gene gibt, führt sowohl ein Mangel als auch die Verdopplung von diesen zu schweren Aberrationen und ist oft letal. Eine Ausnahme davon bilden die X und Y Chromosomen: die meisten bekannten Isochromosomen sind X oder Y Chromosomen. Das ist dazu zurückzuführen, dass das Y Chromosom relativ Gen-arm ist. Andererseits wird ein abnormales X Chromosom inaktiviert, weshalb die Abnormalität teilweise kompensiert werden kann. Mit der Ausnahme der Duplikation entstehen die meisten oben genannten Aberrationen während der G1-Phase, das heißt noch bevor der Duplikation der DNA. So wird die betroffene DNA repliziert und so werden Schwesterchromatiden gebildet, die gleichfalls betroffen sind. Die Trennung dieser Schwesterchromatiden am Ende der Zellteilung führt zur Entstehung von Tochterzellen mit der gleichen Chromosomenaberration. Obwohl solche Aberrationen sowohl während der Mitose als auch während der Meiose auftreten können, sind die Letztere aus medizinischer Hinsicht weitaus wichtiger, da das Vorhandensein von abnormalen Gametenzellen zur Entstehung von abnormalen, von Chromosomenmutation betroffenen Nachfolgen führen kann. Die strukturellen Aberrationen, Translokation und Inversion gibt es nicht nur in balancierten, symptomlosen Formen. Unter den Betroffenen von dieser Aberrationen ist das Risiko, ein unbalanciertes - von schweren Entwicklungsstörungen, somatischer und mentaler Retardation betroffenes - Nachkommen zu zeugen, sehr groß. Oft führen die Symptome zum in utero Tod, das heißt zu einer spontanen Fehlgeburt oder Totgeburt. Im Hintergrund dieses Phänomens stehen die Schwierigkeiten, die mit der Paarung der strukturell fehlerhaften Chromosomen mit ihrem gesunden Homolog während der ersten Meiose verknüpft sind. Abbildung 3.4. Mögliche Folgen von strukturellen Chromosomenaberrationen während der Meiose 38 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen Im Fall der reziproken Translokationen entstehen anstatt der gewöhnlichen Bivalenten Quadrivalente oder Trivalente (bei der zentrischen Fusion), oder eine Schleife (bei einer Inversion). Diese abnormalen Strukturen erschweren und in manchen Fällen verhindern sogar eine normale Segregation, insbesondere angesichts der Paarung von homologen Chromosomen und chromosomaler Rekombination (Crossing-over), und führen mit großer Wahrscheinlichkeit zur Entstehung von unbalancierten Keimzellen mit abnormalen Chromosomen (Abb. 5). Aus einer einzigen reziproken Translokation können Keimzellen mit mehr als 10 verschiedenen unbalancierten Aberrationen hervorgehen. Manche von diesen sind nicht nur vom Verlust eines Abschnitts oder vom Zugewinn eines zusätzlichen Abschnitts betroffen, sondern weisen sogar numerische Chromosomenaberrationen - wie partielle Trisomie oder Monosomie - auf, da es in diesen Fällen oft bereits bei der Segregation Probleme gibt (3:1 oder 4:0 anstatt des normalen 2:2 Verhältnisses), das heißt dass Tochterzellen, anstatt je zwei Chromosomen, 3-4 oder 1-0 Chromosomen bekommen. Abbildung 3.5. 39 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen Eine Störung der Segregation kann auch die Gametogenese hindern, und führt damit zur Infertilität. Das beste Beispiel dafür ist die zentrische Fusion zwischen akrozentrischen Chromosomen. Zum Beispiel kann aus einer t(15;15) oder t(14;14) Robertson Translokation kein lebensfähiges Nachkommen zur Welt kommen, und eine t(21;21) Fusion ergibt ein Nachkommen, das entweder nicht lebensfähig ist, oder Down-Syndrom hat 1.7. Dizentrische Chromosomen Dizentrische Chromosomen - Chromosomen mit zwei Zentromeren - können nicht nur durch eine zentrische Fusion, sondern auch als Ergebnis einer nicht homologen Rekombination entstehen: eine Rekombination die zwischen den kurzen Armen von zwei akrozentrischen, nicht homologen Chromosomen erfolgt (Abb. 6). Abbildung 3.6. Die Entstehung eines dizentrischen Chromosoms durch nicht homologe Rekombination Da dizentrische Chromosomen im Laufe der Zellteilungen nicht zum geeigneten Pol wandern können, inaktiviert sich eines der Zentromeren durch einen durchaus unbekannten Mechanismus, und so entsteht ein Chromosom, das zwar abnormal strukturiert ist, jedoch nur ein Zentromer hat. 40 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen 1.8. Azentrisches Fragment Manchmal bleiben die abgebrochenen Chromosomenabschnitte als zentromerlose Fragmente im Zytoplasma der Zelle erhalten. Da diese Fragmente mangels eines Zentromers nicht zum geeigneten Zellpol wandern können, formen sie entweder ein Mikronukleus, oder gehen während der nachfolgenden Zellteilungen verloren, so dass am Ende nur die Chromosomen mit der Deletion in der Zelle erhalten bleiben. Azentrische Fragmente entstehen meistens unter dem Einfluss eines Mutagens, z.B. Strahlung, und könnnen daher zum Testen von mutagener Wirkung verwendet werden (Mikronukleus Test). 2. Numerische Chromosomenaberrationen Numerische Chromosomenaberrationen sind zahlenmäßige Veränderungen des Chromosomensatzes, das heißt dass es in der Zelle entweder einen Mangel oder einen Überfluss an Chromosomen gibt. Da solche Veränderungen das ganze Erbgut betreffen, werden sie auch als Genommutation bezeichnet. Numerische Chromosomenaberrationen werden in den folgenden drei Gruppen unterteilt: 1.) euploide Mutationen 2.) aneuploide Mutationen 3.) mixoploide Mutationen 2.1. Euploide Chromosomenmutationen Euploidie bezeichnet den Zustand wenn alle Chromosomen des Chromosomensatzes in der gleichen Anzahl vorliegen, das heißt ein einfacher Chromosomensatz bei einer haploiden Zelle, ein doppelter Chromosomensatz bei einer diploiden Zelle, ein dreifacher Chromosomensatz bei einer triploiden Zelle, und so weiter. Die Zahl der Chromosomen in einer haploiden Zelle (charakteristisch für Gameten) ist n, und euploide autosomale Zellen weisen ein ganzzahlig Mehrfaches dieser Zahl auf, z.B. 2n, 3n. Wenn eine Zelle (Gamet oder somatische Zelle) einen ganzzahlig mehrfachen Chromosomensatz besitzt (2n, 3n, 4n, usw.), sprechen wir von Poliploidie. Poliploidie ist eine Mutation nur in dem Fall, wenn die Chromosomenzahl der betroffenen Zelle oder des betroffenen Individuums von der, für die Art charakteristische Zahl abweicht. Die Vermehrfachung des Chromosomensatzes erfolgt in der M Phase des Zellzyklus, wegen der Störung des Spindelapparates und der abnormalen Organisation der Mikrotubuli. Eine Abweichung von der normalen Chromosomenzahl ist bei Pflanzen durchaus vertragbar und kann auch ökonomisch nützlich sein, da eine Vermehrfachung der Chromosomen nicht nur die Vermehrfachung von Genen sondern auch die der Genprodukte bedeutet, was wiederum eine Erhöhung des Proteingehalts, und eine höhere Produktivität bedeutet (z.B. bei angebauten Bananen, Weizen, usw.). Poliploidie bei Pflanzen existiert entweder infolge der natürlichen Evolution der gegebenen Art oder des gegebenen Zelltyps, oder als das Ergebnis der Züchtung/Domestizierung. Poliploidie kann auch mittels Alkaloiden, die die Polymerisation der Mikrotubuli des Spindelapparates verhindern, induziert werden. Dadurch entstehen autopoliploide Tochterzellen, weil alle Chromosomen von der gleichen Art stammen. Hybride (z.B. Weizen), die durch eine Kreuzung zwischen nahe verwandten Arten entstehen, sind allopoliploidisch. Im Gegensatz zur Pflanzen führt Poliploidie bei Tieren und auch beim Menschen zur Letalität (d.h. Tod in der Gebärmutter). Eine Ausnahme bilden bestimmte Zellen/Gewebe, z.B. Megakaryozyten im Knochenmark, und regenerierende Leberzellen. In diesen Fällen wurde es im Laufe der Evolution festgesetzt, welche Zelltypen unter physiologischen Bedingungen eine charakteristische Vermehrfachung des Chromosomensatzes während der Ontogenese aufweisen. Eine Triploidie steht im Hintergrund von etwa 10% aller Fehlgeburten. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass 90% dieser Fälle zur Fertilisation durch ein diploides Spermium oder durch zwei Spermien zurückzuführen sind, und nur eine Minderheit von einer diploiden Eizelle verursacht werden. 2.2. Aneuploide Chromosomenaberrationen 41 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen Es handelt sich um eine Aneuploidie, wenn im Chromosomensatz nur bestimmte Chromosomen, aber nicht der ganze Chromosomensatz überzählig vorhanden sind, oder eben fehlen. Gibt es nur ein Chromosom anstatt der normalen zwei homologen Chromosomen, so sprechen wir von einer Monosomie, gibt es drei Chromosomen, so sprechen wir über eine Trisomie. Wenn ein bestimmtes Chromosom vollkommen fehlt, ist eine Nullisomie vorhanden. Diese Letztere ist meistens letal bei Menschen und Tieren, jedoch nicht letal bei Pflanzen. Im Allgemeinen könnten wir sagen, dass der Zugewinn eines Chromosoms bei Menschen und Tieren besser toleriert wird, als der Verlust eines Chromosoms. Es gibt mehrere verschiedene autosomale Trisomien oder Trisomien der Gonosomen bei Lebendgeborenen, aber nur eine Monosomie, das Turner Syndrom, das vom Verlust eines Chromosoms X gekennzeichnet ist. Aneuploide Chromosomenaberrationen entstehen als Folge einer mitotischen oder meiotischen Non-Disjunktion, das heißt dass Schwesterchromatiden oder Chromosomen wegen eines Fehlers des Kinetochors, des Zentromers oder beides, während der Anaphase nicht voneinander getrennt werden. In manchen Fällen (bei uniparentaler Disomie) bleiben bestimmte Chromatiden/Chromosomen während der Anaphase zurück (Anaphase Verspätung - anaphase lag) und können nicht zum geeigneten Zellpol und damit zur geeigneten Tochterzelle gelingen. Anaphase Verspätung führt dazu, dass es in einer Tochterzelle ein überzähliges Chromosom gibt, in der anderen Tochterzelle dagegen ein Chromosom fehlt. Natürlich sind meiotische Non-Disjunktionen aus medizinischer Hinsicht wichtiger als mitotische Non-Disjunktionen, da die Vorige zu fehlerhaften Gameten und damit Abnormalitäten in den Nachkommen führen können. Bei einer mitotischen Non-Disjunktion ist es entscheidend, wann und in welchem Zelltyp sie vorkommt. Eine früh entstandene Non-Disjunktion betrifft viele Zellen und Organe und führt zur schwerwiegenden Folgen (Mosaizismus). Meiotische Non-Disjunktionen werden danach kategorisiert, ob die Non-Disjunktion bei der ersten oder der zweiten meiotischen Teilung erfolgt ist. Erfolgt die Non-Disjunktion bei der ersten meiotischen Teilung, so handelt es sich um einer defekten Trennung zwischen bestimmten homologen Chromosomen. Erfolgt die NonDisjunktion während der zweiten Meiose, so ist es ein Defekt der Trennung der Schwesterchromatiden. Aufgrund dieses Unterschieds sind auch die Folgen dieser zwei Formen der Non-Disjunktion unterschiedlich. Eine Non-Disjunktion während der ersten Meiose führt zu einer aneuploiden Chromosomenaberration in allen vier Tochterzellen, also z.B. bei Spermiogenese werden alle vier Spermien abnormal. Zwei entstandene Tochterzellen werden ein überzähliges Chromosom (n+1) haben, und zwei Tochterzellen wird ein Chromosom fehlen (n-1). Bei einer Non-Disjunktion während der zweiten Meoise wird nur die Hälfte der Tochterzellen abnormal. Nur eine Tochterzelle wird ein überzähliges Chromosom (n+1) haben, und einer Tochterzelle wird ein Chromosom fehlen (n-1). Bei der Vereinigung eines abnormalen Gameten mit einem normalen Gameten entstehen Zygoten mit einer Trisomie oder einer Monosomie. Bei Trisomien ist der Ursprung der drei homologen Chromosomen unterschiedlich, je nachdem, in welcher meiotischer Teilung die Mutation stattfand. Bei Trisomien der ersten Meiose sind alle drei homologen Chromosomen unterschiedlicher Herkunft (ein Chromosom kommt von der Großmutter der mütterlichen Seite, eins vom Großvater der mütterlichen Seite, und eins vom Vater). Bei Trisomien der zweiten Meiose sind zwei homologe Chromosomen gleich (z.B. beide kommen von der Großmutter oder dem Großwater der mütterlichen Seite), nur das Dritte kommt von der anderen Elternhälfte. Menschliche aneuploide Chromosomenabnormalitäten sind zu 70% auf eine Non-Disjunktion der ersten Meiose, und 30% auf eine Non-Disjunktion der zweiten Meiose zurückzuführen. Also die meisten meiotischen Non-Disjunktionen entstehen im Laufe der ersten Meiose, und kommen von der Mutter, und die Häufigkeit der maternalen Non-Disjunktionen - und somit das Risiko von aneuploiden, z.B. vom Down-Syndrom betroffenen, Nachkommen, steigt mit zunehmendem Alter der Mutter an. Grund dafür sind die Besonderheiten der weiblichen Gametogenese: wahrscheinlich führt die Veralterung des synaptonemalen Komplexes zur Produktion von Eizellen mit einer numerischen Chromosomenabnormalität, da es die Chancen für eine gemeinsame Segregation der homologen Chromosomen verringert. Daher sind prenatale Tests für werdende Mütter über ein bestimmtes Alter (35-40) empfohlen, bzw. obligatorisch, um diagnostizieren zu können, ob der Fötus eine Chromosomenaberration hat. 2.3. Die häufigsten numerischen Chromosomenaberrationen 42 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen Obwohl Trisomien aller Chromosomen - mit der Ausnahme von dem größten menschlichen Chromosom: Chromosom 1 - bei Fehlgeburten gefunden werden können, kommen bei Lebendgeborenen Trisomien von nur drei autosomalen Chromosomen und einige Trisomien der Geschlechtschromosomen (Gonosomen) vor. Das weist auf zwei Tatsachen hin: einerseits hängt das Schicksal von Trisomien stark von der Zahl und Funktion der Genen auf dem betroffenen Chromosom ab; andererseits ist die Selektion in der Gebärmutter sehr stark, und die am schlimmsten betroffenen Föten sterben bereits in der Gebärmutter ab. Dies wird auch von der Tatsache bestätigt, dass die, bei Fehlgeburten am häufigsten vorkommende Trisomie, die Trisomie des Chromosoms 16, bei Lebendgeborenen nie vorkommt (Abb. 7). Monosomien, mit der einzigen Ausnahme der Monosomie des Chromosoms X, sind mit dem Leben unvereinbar. Abbildung 3.7. Prävalenz der numerischen Chromosomenaberrationen https://www.landesbioscience.com/curie/images/chapters/Levy_1.jpg: 2013. 07. 04. - 2.3.1. Trisomie 21 Trisomie 21 führt zum Down-Syndrom. Meistens entsteht Down-Syndrom als Konsequenz der Non-Disjunktion des Chromosoms 21, aber auch eine zentrische Fusion oder Translokation kann zum Down-Syndrom führen. Viele, von Trisomie 21 betroffene Föten sterben in utero, Down-Syndrom kommt mit einer Frequenz von 1:650 in der Durchschnittspopulation vor. Dieses Verhältnis steigert dramatisch mit dem Alter der Mutter und bei einer 45-Jährigen kann sogar weniger als 1:100 sein! Die Lebensaussichten von Down-Syndrom Patienten sind die der gesunden Population ähnlich, Leukämie kommt jedoch häufiger bei ihnen vor, als in der Durchschnittspopulation. Die gesellschaftliche Bewertung des Down-Syndroms hat sich in den letzten Jahren grundsätzlich verändert. Früher war Diskriminierung typisch, und Down-Syndrom Patienten wurden als bildungsunfähig stigmatisiert. Heutzutage versucht man immer mehr, diese Patienten in der Gesellschaft zu integrieren (z.B. mit Spezialkindergärten, Klassen wo gesunde und betroffene Kinder zusammen unterrichtet werden, Sportveranstaltungen usw.). 2.3.2. Trisomie 13 Trisomie 13 führt zum Pätau-Syndrom. Wie auch Down-Syndrom, ist Pätau-Syndrom am häufigsten das Ergebnis einer Non-Disjunktion von der Seite der Mutter. 65% von Trisomien 13 erfolgen als Ergebnis einer Non-Disjunktion während der ersten Meiose. Die Prävalenz des Pätau-Syndroms bei Lebendgeborenen liegt bei 43 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen 1:12500 – 1:21700. Weniger als 5% der Neugeborenen mit diesem Syndrom überleben bis zum ersten Geburtstag. 2.3.3. Trisomie 18 Trisomie 18 führt zum Edwards-Syndrom. Das Edwards-Syndrom ist meistens zur Non-Disjunktion an der Seite der Mutter zurückzuführen. 95% aller Fälle sind die Folge einer Non-Disjunktion während der ersten Meiose. Die Häufigkeit bei Lebendgeborenen liegt bei 1:6000-1:10000, aber die Frequenz beim Empfängnis ist wahrscheinlich viel höher, da etwa 95% von betroffenen Föten in utero sterben. 30% der Neugeborenen mit Edwards-Syndrom sterben im ersten Lebensmonat, und mehr als 95% sterben binnen einem Jahr. 2.4. Numerische Chromosomenaberrationen der Geschlechtschromosomen (Gonosomen) 2.4.1. Turner-Syndrom Das Turner-Syndrom ist von dem Karyotyp 45,X0 gekennzeichnet. Das Turner-Syndrom ist die einzige Monosomie, die mit dem Leben vereinbar ist. Die Erklärung dafür ist, dass - obwohl bei Autosomen beide homologen Chromosomen zur Ausbildung eines normalen Phänotyps nötig sind (das heißt dass Monosomien letal sind), ist in Frauen nur je eins von den zwei Chromosomen X aktiv (siehe unter Dosiskompensation mit XInaktivierung), es also sich um eine funktionelle Monosomie und Barr-Körperchen-Negativität handelt. Zur Gestaltung von normalen weiblichen Merkmalen sind jedoch beide Chromosomen X nötig, was durch das Erscheinungsbild des Turner-Syndroms offensichtlich ist. Bei neugeborenen Mädchen liegt die Häufigkeit dieses Syndroms bei 1:5000, bei der Empfängnis ist die Frequenz aber viel höher. 99% der betroffenen Föten sterben in utero, was mit dem Standpunkt über die Lebensfähigkeit von Monosomien betroffenen Nachkommen übereinstimmt. 80% der Fälle können auf eine Non-Disjunktion in der Meiose an der väterlichen Seite zurückzuführen, so haben die meisten Patientinnen ein einziges Chromosom X, das von der Mutter stammt. Obwohl Störungen der sexuellen Entwicklung begreiflich sind, ist die Ursache für den Minderwuchs nicht genau geklärt. Es wird angenommen, dass unter anderem ein Gen (RPS4X), das für ein Protein in der kleinen Untereinheit des Ribosoms kodiert, darin eine Rolle spielt. Dieses Gen hat nämlich ein Äquivalent auf dem Chromosom Y (RPS4Y), weshalb dieses ribosomale Protein sowohl in Männern als auch in Frauen in doppelter Dose produziert wird. In Turner-Syndrom Patientinnen wird von diesem Protein weniger als nötig hergestellt, was auch die Produktion von anderen Proteinen, und damit die Körpergröße beeinflusst. Turner-Syndrom Patientinnen sind meistens nicht geistlich behindert, aber hier gibt es Unterschiede sowohl in den verbalen Fähigkeiten als auch in den gesellschaftlichen Anpassungsfähigkeiten je nachdem ob das Chromosom X vom Vater oder von der Mutter geerbt wird. Nach den Statistiken sind Träger eines mütterlichen Chromosoms X mit geringeren Fähigkeiten ausgestattet als Träger eines väterlichen Chromosoms. Dieses Phänomen kann mit dem unterschiedlichen Methylationsstatus, mit der genomischen Prägung erklärt werden. 2.4.2. Klinefelter-Syndrom Klinefelter Syndrom ist von einem maskulinen Phänotyp mit einem 47,XXY Kariotyp charakterisiert. Die Häufigkeit des Syndroms liegt bei 1:1000. Der prozentuale Anteil von mütterlichen (56%) und väterlichen (44%) Non-Disjunktionen ist fast gleich. 36% aller mütterlichen Non-Disjunktionen entstehen während der ersten Meiose. Da diese Patienten zwei Chromosomen X haben, sind sie Barr-Körperchen positiv. Ihre Sterilität ist eine Folge der Präsenz von zwei Chromosomen X, genauer gesagt eine erhöhte Dose von bestimmten Genprodukten des Chromosoms X. 2.4.3. Triplo X-Syndrom Ein weiblicher Phänotyp und 47,XXX Karyotyp sind bei diesem Syndrom typisch. Das Syndrom entsteht aufgrund einer meiotischen Non-Disjunktion an der mütterlichen (zu 89%) oder an der väterlichen (8%) Seite, und 3% entstehen als Folge einer mitotischen Non-Disjunktion nach der Befruchtung. Die Häufigkeit des Syndroms ist 1:1000 bei Neugeborenen. Das Vorhandensein von doppelten Barr-Körperchen ist für das Syndrom charakteristisch. 44 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen 2.4.4. Diplo-Y-Syndrom, Supermaskulinitäts-Syndrom oder Jacobs-Syndrom Vom Jacobs-Syndrom betroffene Männer sind normal, besitzen meistens eine überdurchschnittliche Körpergröße, und haben einen 47,XYY Karyotyp. Die Häufigkeit bei männlichen Neugeborenen liegt bei 1:1000. Das Syndrom entsteht ausschließlich als Folge einer Non-Disjunktion der zweiten Meiose bei dem Vater. Im Gegensatz zu allen anderen erwähnten Non-Disjunktionen, hängt diese Non-Disjunktion nicht vom Alter ab, da Gametogenese ab der Pubertät kontinuierlich ist, und es keine veralteten Spermien gibt. Betroffene sind oft durch eine erhöhte Aggressivität und schlecht erduldete Frustration gekennzeichnet. Vielleicht sind diese Merkmale dafür verantwortlich, dass diese Chromosomenaberration mit einer erhöhten Frequenz unter Gefängnisinsassen gefunden werden kann. Diese Statistiken sind aber womöglich durch unausgewogene Probeentnahme bedingt, da eine große Mehrheit von Insassen wegen gewalttätigem Verbrechen (Delikt) verurteilt wird. Die Frage der Aggressivität und eine Veranlagung zur Gewalttätigkeit könnte mit 100% Sicherheit nur dann entschieden werden, wenn vergleichende Statistiken über den Karyotyp und die Aggressivität der gesamten männlichen Population vorhanden wären. Heutzutage sind zahlreiche andere Gene, bzw. Genmutationen bekannt, die mit der Aggressivität zusammenhängen, und so wurde die Rolle des Chromosoms Y in Frage gestellt. In der Kenntnis des meiotischen Zellteilungsprozesses könnten wir annehmen, dass bei aneuploiden Eltern mit dem 47,XXX oder 47,XYY Karyotyp diese Chromosomenaberrationen auch deren Nachkommen häufiger betreffen. Zum Beispiel sind bei Diplo-Y-Syndrom Nachkommen mit den folgenden Karyotypen zu erwarten: 2 XXY, 2 XY, 1 XX und 1 XYY. Insofern wurden in Publikationen aber nur gesunde Nachkommen von betroffenen Eltern erwähnt. Eine genaue Erklärung dieses Phänomens ist noch nicht bekannt. 3. Uniparentale Disomie (UPD) Diese Chromosomenaberration, die mit zytogenetischen Methoden nicht oder nur schwierig, aber mit molekularbiologischen Methoden ohne weiteres diagnostizierbar ist, wurde erst in den letzten Jahrzehnten erkannt. UPD bedeutet, dass die Chromosomenzahl des Betroffenen normal ist, aber die Homologen eines bestimmten Chromosoms ausschließlich von derselben Elternhälfte, also ausschließlich von der Mutter oder vom Vater stammen. Um das zu erreichen, sind zwei, aneinander folgende Ereignisse nötig, die auch einzeln zur numerischen Aberration führen würden: eine meiotische Non-Disjunktion und eine Anaphase Verspätung die während der frühen Zellteilungen der Furchung auftritt. Zuerst entsteht eine Zygote mit Trisomie, aber später geht das dritte homologe Chromosom verloren. Je nachdem, ob die Non-Disjunktion im Laufe der ersten oder zweiten Meiose stattfand, sprechen wir über eine uniparentale Heterodisomie oder uniparentale Isodisomie. Bei einer uniparentalen Heterodisomie erbt das Nachkommen zwei verschiedene homologe Chromosomen von derselben Elternhälfte (also je ein homologes Chromosom von der Großmutter und dem Großvater), also die Non-Disjunktion fand während der ersten Meiose statt. Bei einer uniparentalen Isodisomie erbt das Nachkommen zwei identische homologe Chromosomen von derselben Elternhälfte (also entweder zwei homologe Chromosomen von der Großmutter oder vom Großvater), also die Non-Disjunktion fand während der zweiten Meiose statt. Abbildung 3.8. Entstehung von uniparentaler Hetero- oder Isodisomie 45 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen Wegen der genomischen Prägung sind bei UPD die Symptome je nach dem Ursprung der homologen Chromosomen unterschiedlich. Bei den Prader-Willi- und Angelmann-Syndromen steht in manchen Fällen nicht eine Deletion, sondern UPD im Hintergrund der unterschiedlichen Symptomen. 4. Mixoploide Mutationen Bei einer Mixoploidie sind in einem Organismus Zellen mit unterschiedlichen Karyotypen vorhanden, wobei wir je nach dem Ursprung zwei Formen unterscheiden: Mosaizismus und Chimärismus. 4.1. Mosaizismus Genetische Mosaike haben in ihrem Körper Zellen mit unterschiedlichen Karyotypen, die jedoch den gleichen Ursprung haben (damit unterscheiden sie sich von Chimären, die Zellen mit unterschiedlichen Karyotypen haben, die jedoch auch einen unterschiedlichen Ursprung haben). Mosaike können entweder aneuploide oder polyploide Mosaike sein. Bei einem aneuploiden Mosaik gibt es zwei verschiedene Karyotypen: einen normalen Karyotyp und einen aneuploiden Karyotyp (meistens eine Trisomie), die infolge einer mitotischen Non-Disjunktion während der frühen embryonalen Zellteilungen, oder wegen einer Anaphase Verspätung entstehen. Zum Beispiel, falls eine normale und eine abnormale Zellteilung bei einem zweizelligen Embryo stattfinden, entstehen 2 normale Zellen und je eine Zelle mit Trisomie bzw. Monosomie. Da Zellen mit einer Monosomie nicht lebensfähig sind, wird es in dem erwähnten Fall schließlich zwei normale Zellen und eine Zelle mit einer Trisomie geben. Bei einem polyploiden Mosaik entstehen eine normale Zelllinie und eine polyploide, meistens triploide oder tetraploide Zelllinie. In diesem Fall ist es jedoch eine Störung des mitotischen Apparates, das zur Entstehung der Aberration führt. Bei einem zweizelligen Embryo, bei dem die eine Zellteilung normal, die andere jedoch abnormal abläuft, wird es am Ende anstatt der normalen vier, nur drei Zellen geben, zwei davon normal, eine aber tetraploid. Je nach dem genauen Zeitpunkt, wann die Aberration stattfindet - während der Furchung, der Organogenese oder noch später - werden die Symptome schwergradiger oder milder. Entscheidend für die Schwere der 46 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen Symptome ist der Anteil von normalen und abnormalen Zellen. Mosaizismus, der die Gonosomen betrifft, kommt relativ häufig vor. Bei einem gonadalen Mosaizismus weisen ausschließlich die Keimzellen eine numerische Chromosomenaberration auf, und so ist die Wahrscheinlichkeit, ein betroffenes Nachkommen zu produzieren, sehr hoch. Leider gibt es auch heute noch keine routinemäßigen prädiktiven Tests zum Diagnosis solcher Aberrationen, und nur die bereits geborenen, betroffenen Nachkommen weisen auf einen gonadalen Mosaizismus der Eltern hin. In erweitertem Sinne können auch somatische Mutationen, bei denen unterschiedliche Mutationen eines bestimmten Gens in verschiedenen Organen oder in verschiedenen Zellen desselben Organs zu finden sind, als Mosaizismus betrachtet werden (z.B. verschiedene Augenfarbe bei derselben Person). 4.2. Chimärismus Nach dem Ungeheuer aus der griechischen Mythologie, mit dem Kopf eines Löwen, die Fänge eines Greifvogels und der Schwanz eines Drachen, werden Organismen, die zwei Zelllinien unterschiedlichen Ursprungs, also von verschiedenen Zygoten, aufweisen, Chimären genannt. Eine natürliche menschliche Chimäre entsteht nach der Fusion von zwei dizygotischen Zwillingen, nach der doppelten Befruchtung der Eizelle und der Polarzelle, und - am häufigsten - durch einen transplazentalen Austausch von haematopoietischen Stammzellen (Blutgruppen-Chimärismus) zwischen dizygotischen Zwillingen. Neulich werden auch transgenische Tiere/Pflanzen Chimären genannt, die entweder Zellen unterschiedlichen Ursprungs haben (z.B. sie entstanden durch eine Fusion zwischen zwei frühen Embryonen), oder durch den Zufuhr von fremden Genen - z.B. durch eine Mikroinjektion in die Eizelle - hergestellt wurden. In den letzten Jahren haben sich mehrere Artikel mit dem Mikrochimärismus beschäftigt. Es ist seit ungefähr 25 Jahren bekannt, dass es im Blutkreislauf einer Frau nach einer Schwangerschaft mit einem männlichen Fötus (ganz gleich ob sie zu einer Geburt oder Fehlgeburt geführt hat), Zellen mit einem Chromosom Y zu finden sind. Kürzlich wurde es auch erkannt, dass diese Zellen noch viele Jahre nach der Schwangerschaft im Körper der Mutter nachweisbar sind, also anstatt einfach überzuleben, müssen sich diese Zellen auch teilen. Das wiederum heißt, dass embryonale Stammzellen vom männlichen Fötus in den Mutterleib gelungen haben, und sich dort an gewissen Organen festhaftend, Zellklonen geformt haben müssen. Deshalb ist auch die Hypothese entstanden, dass manche autoimmune Erkrankungen gar nicht autoimmun, sondern eine natürliche Reaktion des mütterlichen Immunsystems auf die, für die Mutter zur 50% fremden Zellen, sind. Diese Hypothese könnte auch erklären, warum autoimmune Erkrankungen bei Frauen öfter auftreten als bei Männern. Gleichzeitig ist eine transplazentale Zellmigration in die andere Richtung (also von der Mutter zum Fötus), auch nicht ausgeschlossen, und könnte die Toleranz des Nachkommens gegen Alloantigene erklären, obwohl der genaue Mechanismus und die Folgen dieser noch nicht ausreichend bekannt sind. Empfohlene Webseiten : www.nlm.nih.gov/medlineplus/geneticsbirthdefects.html www.mayoclinic.com/health-information www.rarechromo.org/html/ChromosomesAndDisorders.asp#ANAL www.livingwithtrisomy13.org www.trisomy18support.org www.t21online.com www.williams.org www.turnersyndrome.org www.klinefeltersyndrome.org www.pwsausa.org 47 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Zytogenetik. Chromosomenmutationen 5. Fragen 1. Geben Sie eine Erklärung für die erhöhte Häufigkeit von meiotischer Non-Disjunktion während der ersten Meiose? 2. Was sind die Ursachen für Aneuploidie und Poliploidie? 3. Was sind die wichtigsten Teile eines Chromosoms? 4. Wie können Sie das relativ seltene Vorkommen von Monosomien erklären? 5. Was ist Mikrochimärismus und was ist die biologische Bedeutung vom Mikrochimärismus? 6. Bei welchen Syndromen hat UPD eine ätiopathologische Rolle? 7. Was sind die Folgen von Doppelstrangbrüchen an verschiedenen Stellen auf einem Chromosom? 8. Welche Techniken können zum Diagnosis von Chromosomenaberrationen verwendet werden? 48 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 4. Epigenetik Sára Tóth In den letzten Jahren Epigenetik ist eines der sich am dynamischsten entwickelnden Gebiete der Genetik geworden. Nach den Angaben der Datenbank PubMed sind allein im letzten Jahr mehr als 10000 Publikationen in diesem Bereich erschienen. Der Begriff „Epigenetik― wurde erstmals von Conrad Hal Waddington verwendet, als er Anfang der 1950er Jahre während seiner Untersuchungen der Ontogenese den Begriff „epigenetic landscape― (epigenetische Landschaft) eingeführt hat, in dem Versuch, die außerordentliche Vielfalt der von einer einzigen Zelle (der Zygote) stammenden Zellen zu erklären. Das heißt dass, obwohl sie genetisch identisch sind, diese Zellen verschiedene Morphologien und Funktionen aufweisen, weil sie auf verschiedene Gegenden (Spitzen, Schiefen oder Tälern) des Landes angelangt haben; oder mit anderen Worten, weil genetische Regulation der Zellen die Prozesse der Ontogenese beeinflusst hat. Heute werden alle meiotisch oder mitotisch vererbbaren Prozesse, die die Funktion (meistens die Exprimierung) von Genen ohne eine Änderung der DNA-Sequenz, also ohne Mutationen, verändern, epigenetische Phänomene genannt. Die Liste der epigenetischen Phänomene und in epigenetischen Prozessen involvierten Enzyme und regulatorische Proteine wird immer aufwendiger und es wurde über epigenetische Änderungen bezüglich beinahe aller biologischen Phänomene berichtet. Indem wir epigenetische Prozesse immer besser kennenlernen, werden viele früher unerklärbare Beobachtungen und Phänomene verständlich. 1. Epigenetische Änderungen – Molekulare Veränderungen Veränderung von Molekülen, die das Chromatin aufbauen (DNA und Histonen) beteiligen sich maßgeblich bei epigenetischen Prozessen. Die epigenetisch veränderte DNA, und die dazu gebundenen, veränderten Histonen ziehen, von den Veränderungen abhängig, verschiedene Non-Histon Proteine an, wodurch sie die Struktur des Chromatins beeinflussen, remodellieren. Chromatin existiert in zwei fundamentalen funktionellen Zuständen: Heterochromatin, also eine stark gepackte, gehemmte und der Transkription nicht zugängliche Struktur; und Euchromatin, eine aufgelockerte, geöffnete und der Transkription zugängliche Struktur. Epigenetische Änderungen bieten eine zusätzliche, feinere Möglichkeit der Regulation. 1.1. DNA-Methylierung Epigenetische Veränderung der DNA bedeutet eigentlich die Methylierung von Cytidin-Basen der DNA, deren zufolge 5-Methylcytidin entsteht. In diesem Fall, methylierte Cytosine befinden sich fast ausschließlich in den sogenannten CpG Dinukleotiden. CpG Dinukleotide bestehen aus einer Cytidin- und einer Guanin-Base, die auf jedwedem DNA-Strang kovalent miteinander gebunden sind. Methyliertes Cytosin, genau wie unmethyliertes Cytosin, ist komplementär zu Guanin, wodurch die genetische Information unverändert bleibt. Gleichzeitig liegt die Methylgruppe des 5MeC gegen die große Furche der DNA, wodurch sie zugänglich für verschiedene nukleinsäurebindende Proteine wird. CpG Dinukleotide befinden sich vor allem in dem Promotorbereich der Gene, manchmal sind sie aber auch in dem Gen - von dem Gen abhängig - in den Exonen oder auch Intronen zu finden. Nicht alle CpG Dinukleotide sind methyliert: Methylierung dieser CpG Dinukleotide, also das Methylierungsmuster, hängt auch von der gegebenen Zelle, und ihrem metabolischen Zustand ab. Methylierung der CpG Dinukleotide in den Promotorbereichen stellt ein grundsätzliches Mittel für Genexpressions-Regulierung dar: Methylierung in diesen Abschnitten führt in den meisten Fällen (obwohl es auch Ausnahmen gibt) zu reduzierter Genaktivität. Da epigenetische Signale von Zellteilung zu Zellteilung, aber - im Allgemeinen - nicht von einer Generation zur nächsten Generation weitervererbt werden, sind die Methylierungsenzyme entsprechend spezialisiert. Es sind zwei wichtige Methylierungsenzyme bekannt: die maintenance- (Wartungs-) Methyltransferase (DNMT1) und die de novo DNA Methyltransferase (DNMT3). Das Enzym DNMT1 methyliert Cytosine in den CpG Dinukleotiden des neuen, komplementären Strangs der DNA damit das ursprüngliche Methylierungsmuster erhalten bleibt. DNMT3 ist imstande, die früher noch nicht methylierte Cytosine zu methylieren. Dieser Prozess ist bei der Gametogenese wichtig, wenn das ursprüngliche, ererbte Methylierungsmuster entfernt, und ein neues, dem Geschlecht des Lebewesens entsprechendes Methylierungsmuster aufgebaut wird. Entfernung des Methylierungsmusters ist von DNA Demethylasen durchgeführt. 49 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Epigenetik 1.2. CpG, als Mutationsheißpunkt Das Cytosin verwandelt sich, durch spontane Desaminierung, zu Uracil. Diese Instabilität gilt auch bei methyliertem Cytosin, in diesem Fall entsteht aber nicht Uracil, sondern Thymin. Das heißt dass aus dem CpG Dinukleotid ein TpG Dinukleotid entsteht, was zur Veränderung der DNA-Sequenz, also einer Mutation führt. Analyse von Mutationsdatenbanken hat es erwiesen, dass bei zahlreichen Erkrankungen die CpG Dinukleotide als Mutationsheißpunkte fungieren. Auch die Tatsache, dass - obwohl die Methylierung der DNA allgemeingültig ist - die Frequenz von methylierten Cytosinen viel geringer als erwartet ist, weist auf die chemische Instabilität, also Mutabilität des Cytosins hin. Im menschlischen Körper sind knapp 3% der Cytosine methyliert. Scheinbar sinkt die Frequenz von CpGs im Laufe einer längeren Evolutionszeitspanne langsam, aber progressiv, bedingt durch die stete Veränderung von CpG zu TpG. Obwohl die genomische Frequenz von CpGs bei Wirbeltieren gering ist, gibt es kurze unmethylierte DNA Abschnitte, deren CpG Häufigkeit dem Erwarteten entspricht. Diese Abschnitte sind die sogenannten CpG Inseln, die reich an CG Dinukleutide sind, und sich häufig am 5’ Ende der Gene, auf einem einige hundert Basen langen Abschnitt befinden. Verstreut in dem menschlichen Genom befinden sich etwa 27-31,000 CpG Inseln. Für diese Abschnitte ist die Veränderung von CpG zu TpG untypisch. Die Beständigkeit der CpG Dinukleotide ist vielleicht dadurch erklärt, dass hier der Methylierungsmechanismus nicht funktioniert, oder dass diese CpG Inseln so wichtig sind, dass die natürliche Selektion ihre Veränderung verhindert. Im Promotorgebiet von etwa 50% der menschlichen Gene gibt es CpG Inseln, die normalerweise unmethyliert sind. Abnormale Methylierung dieser Abschnitte ist pathologisch und führt zum Beispiel - durch Veränderungen in der Regulierung der Genaktivität - zur Tumorbildung (siehe auch das Kapitel 7 „Genetik von biologischen Prozessen―). 1.3. Histonmodifikationen Neben DNA-Methylierung, auch Histonmodifikationen sind grundlegend in der epigenetischen Regulation. Histone sind evolutionär hoch konservierte, basische, Lysin- und Arginin-reiche Proteine, die an DNA binden können. Je zwei Kopien der H2A, H2B, H3 und H4 Histone beteiligen sich an der Bildung des nukleosomalen Oktamers, während H1 Histone an die - die Nukleosomen verbindende - Linker DNA binden. Die endständigen, N-terminalen Armen der nukleosomalen Histone ragen aus dem Nukleosom heraus, und hier können Histonmodifikationen erfolgen. Es werden vor allem die entsprechend positionierten Lysine der endständigen Armen von H3 und H4 Histone modifiziert - methyliert, acetyliert, phosphoryliert, ubiquitiniert, usw. Diese Modifikationen bewirken ein Histonmuster, das abhängig von dem Zelltyp, der Entwicklungsphase, der physiologischen Funktion, dem Gen und dem Genabschnitt, ist. Dieses Muster, der sogenannte Histon-Code hat einen grundlegenden Einfluss auf die Expression der betreffenden Region. Sowohl die methylierte DNA, als auch die modifizierten Histone ziehen weitere methylierte DNA, Histon-bindende Proteine und nichtkodierende RNA an, und die Elemente des auf diese Weise entstehenden Komplexes bestimmen - in Wechselwirkung miteinander - das epigenetische Muster, das dem Entwicklungsstadium, Zelltyp und Gen entspricht. Defekt von irgendeinem Element dieses Komplexes kann ein fehlerhaftes epigenetisches Signal, und somit fehlerhafte Funktion und Krankheit hervorrufen. Ein Beispiel dafür ist das Rett-Syndrom, in dessen Hintergrund die Mutation des MECP2 Gens steht (Methyl-CpG-binding Protein 2, das für ein Protein, das methyliertes Cytosin selektiv bindet, kodiert). 2. Nicht-Kodierende RNA Nach dem Humangenomprojekt wurde es offenbar, dass lediglich knapp 2 Prozent des menschlichen Genoms für Proteine kodiert, und so ergab sich die berechtigte Frage, wozu denn die anderen Regionen dienen? Heute wissen wir, dass ein Großteil des Humangenoms für kürzere und längere nicht-kodierende RNAs kodiert, die eine regulatorische Rolle haben (siehe auch Kapitel 8). Diese RNAs modifizieren die Expression von Genen durch RNA-RNA, RNA-DNA und DNA-Protein Wechselwirkungen, ohne die Sequenz des regulierten Gens zu modifizieren. Solche RNAs können auf der Transkriptionsebene wirken, indem sie die Transkription hemmen, wie z.B. XIST RNA (siehe unten), oder auf der Post-Transkriptionsebene (z.B. microRNAs), wobei sie die Translation der mRNA hemmen. Die nicht-kodierende RNA kann auf dem gleichen Chromosom wie das regulierte Gen liegen (Cis-Effekt), oder auch auf einem anderen Chromosom (TransEffekt). 3. Epigenetische Phänomene 50 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Epigenetik Die wichtigsten epigenetischen Vorgänge sind die genomische Prägung und X-Chromosom-Inaktivierung. Außerdem können Karzinogenese, Altern, bestimmte psychiatrische Syndromen, sogar Verhaltensstörungen mit epigenetischen Prozessen in Zusammenhang gebracht werden. Bestimmte Beobachtungen weisen darauf hin, dass solche Veränderungen, die die Funktion der DNA, nicht aber deren Sequenz betreffen, nicht nur von Mitose zu Mitose, sondern während der Gametogenese - durch die Meiose sogar zu Gameten übertragen werden, und dadurch nach der Befruchtung auch bei den Nachkommen erhalten bleiben. Es gibt also Zeichen für die Existenz von einer transgenerationalen Epigenese. 3.1. X-Inaktivierung Säugern sind diploide Organismen, das bedeutet dass beide Allele eines jeden autosomalen Gen-Locus funktionieren, was wiederum zur biallelischen Genexpression führt. Wenn eines der Autosomen wegen einer Chromosomenmutation nicht funktioniert, also nur ein Allel des gegebenen Locus erhalten bleibt, entstehen schwerwiegende, meistens letale Symptome. Im Fall der Gonosomen sind homologe Chromosomen (XX) nur bei Frauen vorhanden, das Y-Chromosom der Männer ist kein funktionelles Homolog des X-Chromosoms. Während das Y-Chromosom nur wenige Gene beinhaltet, die meistens für die männliche Geschlechtsdetermination (SRY) und die Gametogenese (z.B. AZF) verantwortlich sind, enthält das XChromosom zahlreiche Gene, die für somatische Eigenschaften verantwortlich sind. Falls die Gene, die auf einem einzigen X-Chromosom kodiert sind, für die normale Entwicklung und die gesunde physiologische Funktion von Männern ausreichen, so muss ein einziges X-Chromosom auch für den weiblichen Organismus ausreichend sein. Das bedeutet, dass evolutionär betrachtet, die Kompensation für die verschiedenen Dosen von X-chromosomalen Genen zwischen den zwei Geschlechtern nötig geworden ist. Diese Dosiskompensation wird, nach ihrer Entdeckerin Mary Lyon, auch Lyonisierung genannt. Diese Dosiskompensation kommt bei Säugern, also auch beim Menschen, durch die Inaktivierung des XChromosoms zustande. Es muss jedoch betont werden, dass bei anderen Organismen mit heteromorphen Geschlechtschromosomen die Dosiskompensation durch unterschiedliche Mechanismen geschieht. Die XInaktivierung erfolgt bei Säugern im Blastozystenstadium der Embryonalentwicklung. Als erster Schritt der Dosiskompenstaion erfolgt - durch nicht näher bekannte Mechanismen - die Chromosomenzählung. Dadurch bekommt die Zelle Information über die Zahl der sich in ihr liegenden X-Chromosomen. Falls es zwei oder mehr X-Chromosomen gibt, bleibt nur eins von diesen aktiv, und das andere (oder die anderen) wird/werden inaktiviert. Die Inaktivierung erfolgt zufällig (random), das heißt, dass sowohl das mütterliche, als auch das väterliche X-Chromosom inaktiviert werden kann. Nach der X-Inaktivierung wird jedoch in allen Tochterzellen der gegebenen Zelle das gleiche X-Chromosom inaktiviert, das Inaktivierungsmuster bleibt also bis zum Lebensende des Organismus erhalten. Da die X-Inaktivierung nach dem Zufallsprinzip erfolgt, sind in einem weiblichen Organismus Zellen mit einem inaktivierten mütterlichen X-Chromosom und Zellen mit einem inaktivierten väterlichen X-Chromosom vorhanden. Das heißt dass der weibliche Organismus ein funktionelles Mosaik ist. Die meisten intakten Gene des X-Chromosoms werden nicht exprimiert. Eine Ausnahme davon bilden die pseudoautosomalen Regionen in der Nähe der Telomer-Regionen auf beiden Armen des XChromosoms (PAR1 und PAR2 Regionen), und auch einige Gene, die der X-Inaktivierung entkommen. Diese Gene bleiben auch auf dem inaktivierten X-Chromosom aktiv. Die Frage, warum und wie diese Gene der X-Inaktivierung entkommen, wird auch heute noch intensiv erforscht. Obwohl das Inaktivierungsmuster bei autosomalen Zellen von Mutterzelle zu Tochterzelle übertragen wird, ist die Lage bei Geschlechtszellen anders. Bei der Bildung von Eizellen wird das inaktivierte X-Chromosom wieder aktiviert, und unabhängig davon, welches X-Chromosom in die reife Eizelle kommt, bleibt es aktiv. Bei der X-Inaktivierung spielt das sogenannte XIC=X-Inaktivierungs-Zentrum eine entscheidende Rolle. Hier, in der Xq13 Region befindet sich das XIST Gen, das nur auf inaktivierten X-Chromosomen transkribiert wird. Das Genprodukt ist eine lange nichtkodierende RNA, die das zukünftige inaktivierte X-Chromosom durch einen nicht vollkommen bekannten Mechanismus, sozusagen bedeckt. Die Expression des XIST Gens wird von anderen epigenetischen Ereignissen gefolgt: DNA-Methylierung, Histon-Methylierung, die Zusammensetzung der Histone verändert sich, weil die macroH2A Histonvariante erscheint, die Chromosomenkondensation gesteigert wird, und schließlich auch eine späte DNA-Verdopplung das inaktivierte X-Chromosom charakterisiert, das heißt dass die DNA des inaktivierten X-Chromosoms sich später als die DNA auf allen anderen Chromosomen verdoppelt. Die erhöhte Chromosomenkondensation führt zur Heterochromatisierung, und schließlich wird die betroffene Region der Transkription wenig zugänglich, also das Chromosom wird inaktiviert. 3.2. Genomische Prägung Klassische genetische Untersuchungen erweckten den Anschein, dass es auch bei Heterozygoten gleichgültig ist, von welchem Elternteil ein bestimmtes Allel stammt. Da es beide Allele exprimiert werden, könnte man annehmen, dass die Herkunft der Allele unwichtig ist. Bestimmte Tierforschungen, aber auch gewisse seltene 51 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Epigenetik Erkrankungen, wiesen jedoch darauf hin, dass diese Annahme bei manchen Genen falsch ist. Bei der Manipulation von Maus-Embryonen wurde es festgestellt, dass diploide Zellen, sogenannte Gynogenoten, die durch die Einsetzung von einem Zellkern einer Eizelle in eine andere Eizelle desselben Maus-Weibchens hergestellt werden, die Embryonalentwicklung zwar beginnen, gleich danach aber zugrunde gehen, da die fötalen Membranen nicht ausgebildet werden können. Wenn diese Untersuchungen auf eine andere Weise durchgeführt wurden, wobei zwei Zellkerne von Spermien in eine zellkernfreie Eizelle eingesetzt worden, war die Embryonalentwicklung wiederum nicht normal, jedoch entstand ein anderes Phänomen. In diesen Androgenoten gab es nur überwuchernde fötale Membranen. Aus diesen Mausuntersuchungen ließ es sich darauf schließen, dass die mütterlichen und väterlichen Genomhälften funktionell nicht gleichwertig sind. Darauf wiesen auch solche seltene menschliche Erkrankungen hin, wie die vollständige Blasenmole. Bei einer vollständigen Blasenmole handelt es sich um eine pathologische Schwangerschaft wo ein doppelter Chromosomensatz vorliegt, der aber ausschließlich vom Vater stammt. Im Hintergrund des Phänomens steht eine Eizelle, bei der die mütterlichen Chromosomen verlorengegangen waren, und die von zwei Spermien oder von einem diploiden Spermium befruchtet wurde. Diese „Zygoten‖ stellen sich bei weiteren Untersuchungen als homozygot für alle Loci aus. Genau das Gegenteil fand man bei der Analyse von Teratokarzinomen, wo das pathologische Gewebe nur mütterliche Chromosomen aufwies. Anhand dieser frühen Beobachtungen nahm man an, dass alle Chromosomen ein Kennzeichen tragen, das auf die elterliche Herkunft hinweist. Dieses Kennzeichen wird während der Gametogenese irgendwie im Erbgut festgelegt. Die Kennzeichnung der elterlichen Herkunft im Genom wird genomische Prägung genannt. Zur Klärung des Mechanismus der genomischen Prägung wurden weitere Untersuchungen durchgeführt. Wenn die früher erwähnten Mausuntersuchungen auf eine Weise wiederholt wurden, wobei nur ein Chromosomenpaar oder nur die proximale oder distale Hälfte des Chromosoms rein väterlich oder rein mütterlich waren, stellte es sich heraus, dass nicht das ganze Genom, sondern nur bestimmte Chromosomenabschnitte, bestimmte Gene Kennzeichen der elterlichen Herkunft tragen. Ein solches Phänomen ist die uniparentale Disomie (UPD) (siehe das Kapitel „Zytogenetik‖), wobei aufgrund seltener Segregationsabnormalitäten diploide Organismen mit einem vollständigen Chromosomensatz entstehen, bei denen beide Kopien von bestimmten Chromosomen oder Chromosomenabschnitten von der gleichen Elternhälfte stammen, und die - abhängig von dem betroffenen Chromosom - schwerwiegende Symptome, Syndromen aufweisen. Da von der Hinsicht der Basenabfolge die elterliche Herkunft gleichgültig ist, ist die Kennzeichnung in diesem Fall epigenetisch. Wenn ein Vater ein imprintetes Gen, das er selbst von seiner Mutter geerbt hat, an sein Nachkommen weitervererbt, ist dieses Gen bei dem Vater mütterlich geprägt, bei den Nachkommen des Vaters jedoch väterlich geprägt. Das bedeutet, dass die Prägung reversibel ist. Also gleich der X-Inaktivierung wird das epigenetische Kennzeichen bzw. Muster, das die genomische Prägung bewirkt, bei somatischen Zellen unverändert weitervererbt, bei Keimzellen jedoch wird das geerbte, ursprüngliche Kennzeichen gelöscht, und ein neues, dem Geschlecht des Individuums entsprechendes epigenetisches Muster wird gebaut. Heute kennen wir beim Menschen ungefähr hundert Gene, die der genomischen Prägung unterliegen, und die vor allem bei der Ontogenese – meistens gegen die Implantation –, und beim Wachstum und Verhalten eine Rolle spielen. Diese Gene liegen nicht verstreut im Genom, sondern bilden Gruppen, sogenannte differenziert imprintete Regionen (Clusters). Das siebte Chromosom bei der Maus und die elfte und fünfzehnte Chromosomen beim Menschen sind besonders reich an imprinteten Regionen. 3.2.1. Imprinting-bedingte Krankheiten Die Forschung der Imprinting-bedingten Krankheiten ist noch sehr unentwickelt, da es eine Reihe von sehr fein regulierten Mechanismen zur Entstehung von diesen Krankheiten nötig ist. Die bekanntesten Krankheiten, die zur genomischen Prägung zurückzuführen sind, sind das Prader-Willi- und das Angelman-Syndrome, bei denen die 15q11-q13 Region betroffen ist. Väterliche Deletion oder mütterliche UPD der genannten Region verursacht das Prader-Willi-Syndrom, während das Angelman-Syndrom entweder von einer mütterlichen Deletion, oder väterlichen UPD oder von einer Mutation des UBE3A (Ubiquitin Ligase) Gens, das in dieser Region liegt, hervorgerufen wird. In beiden Fällen kann auch das für das Imprinting verantwortliches Zentrum (IC) mutiert sein. Das Prader-Willi-Syndrom ist von Fettleibigkeit, kleinen Händen und Füssen, unterentwickelten äußeren Geschlechtsorganen und milder kognitiver Behinderung gekennzeichnet. Bei dem Angelman-Syndrom sind die Symptome völlig unterschiedlich. Diese Krankheit ist charakterisiert von Entwicklungsverzögerung, zwanghafter Bewegung, unmotiviertem Lachen, und reduzierter Sprachentwicklung oder dem Ausbleiben des Spracherwerbs. Weitere bekannte, seltene, Imprinting-bedingte Krankheiten sind: 52 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Epigenetik a. das Beckwith-Wiedemann-Syndrom, bei dem es in der 11p15.5 Region zwei differenziert imprintete Regionen zu finden sind, mit den H19, IGF2 und KCNQ10T Genen. Syndrome, die mit Nierentumoren im Kindesalter (Wilms-Tumor, Beckwith-Wiedemann-Syndrom) einhergehen, verwiesen auf dieses Syndrom. Verlust der Heterozygotie (LOH, siehe auch Kapitel 2, das Mutationen behandelt) in dem Nierengewebe führt zur Entstehung des Tumors, aber in den meisten Fällen (mehr als 90%) geht das mütterliche Allel verloren. b. Silver-Russell-Syndrom (7p11.2 oder 11p15.5); c. der Pseudohypoparathyreoidismus (20q13.2) d. transienter neonataler Diabetes Mellitus (6q24). 3.2.2. Zweck der genomischen Prägung Zahlreiche Theorien existieren für die evolutionäre Herkunft des Imprinting. Eine der bekanntesten ist die Theorie des elterlichen Interessenkonflikts. Nach dieser Theorie können Väter ihre Gene am besten verbreiten, wenn sie viele Nachkommen produzieren. Wenn infolge der vielen Geburten der Körper der Mutter erschöpft wird oder die Mutter stirbt, kann der Vater mit weiteren Partnern trotzdem weitere Nachkommen zeugen und seine Gene verbreiten. Im Gegenteil dazu, die Interesse der Mutter diktiert, ihren Energieaufwand zu beschränken. Indem sie nicht all ihre Energie für ein einziges Nachkommen verwendet, kann sie weitere Reproduktionszyklen überleben und schließlich ihre Gene weitervererben. Das heißt dass die väterlichen Gene das Wachstum der Nachkommen fördern - sogar auf Kosten der Mutter -, während die mütterlichen Gene die für die Nachkommen zugänglichen Ressourcen beschränken. Diese Theorie ist im Einklang mit Beobachtungen der vollständigen Blasenmole und Teratomen der Eierstöcke, und auch mit der Tatsache, dass die Gene die für IGF2 (Insulinähnlicher Wachstumsfaktor 2 = insulin-like growth factor 2) und dessen Rezeptor (IGFR) kodieren, imprintet sind. Die Prägung dieser zwei Gene ist besonders interessant: das väterliche IGF2 ist schwach, das IGFR Gen stark methyliert. Bei der Mutter ist es genau umgekehrt. Die Bedeutung dieses Phänomens besteht darin, dass die entgegengesetzte Wirkungen von der zwei Elternhälften einander auf diese Weise gegenseitig kompensieren: Vorhandensein von mehr Wachstumsfaktoren ist wirkungslos, wenn es keine geeignete Rezeptoren gibt. Diese Theorie wird aber von den Angelman- und Prader-Willi-Syndromen nicht unterstützt, deshalb müssen noch weitere, bisher unbekannte ’Absichten’ im Hintergrund der Prägung stehen. Eine der neuesten Theorien vermutet eine Rolle der aufgerichteten Körperhaltung und Verschiebung des Schwerpunktes während der Schwangerschaft. Nach dieser Theorie beschränkt die mütterliche Prägung das Wachstum des Embryos, und dadurch die Verschiebung des Schwerpunktes, und ermöglicht auf diese Weise eine stabilere Körperhaltung und Gang, was bei den frühen Vorfahren des Menschen lebensrettend gewesen sein mag. 4. Die Bedeutung der epigenetischen Wirkungen DNA-Methylierung und die darauffolgenden Veränderungen des Histonmusters und der Chromatinstruktur sind grundlegend bei der Regulation der Genexpression. Es kann angenommen werden, dass solche Mechanismen ausschlaggebend bei der Erstellung und Aufrechterhaltung der Identität der Zelle und des Gewebes sind. Untersuchungen an Tumorzellen - wobei die Hypermethylierung und folglich Hemmung von Tumorsuppressoren, und Hypomehtylierung und folglich Induktion von Onkogenen beobachtet wurde - liefern ein gutes Beispiel dafür. Beide Veränderungen mögen ausschlaggebend bei der Onkogenese sein. Neben der Karzinogenese hat auch die medizinisch unterstützte Fortpflanzung die Rolle der epigenetischen Veränderungen gezeigt. Die Daten, die seit der Geburt des ersten geklonten Säugers, Dolly, angehäuft wurden, zeigen, dass die geklonten Säuger oft abnormal, z.B. größer als erwartet sind, und auch die Sterberate der sehr jungen Nachkommen erhöht ist. Da das Erbgut des, aus einem erwachsenen Organismus stammenden Zellkerns, der zum Klonen mit Zellkerntransfer benutzt wird, bereits eine Reihe von epigenetischen Veränderungen durchgemacht hat, sollten zur normalen Funktion diese Veränderungen vor der Einsetzung des Zellkerns in eine entkernte Eizelle eigentlich gelöscht werden. An einer solchen epigenetischen Reprogrammierung ist aber auch das Zytoplasma der Eizelle beteiligt, und es scheint, dass diese unter künstlichen Umständen nicht vollkommen funktioniert: die Reprogrammierung ist meistens unvollkommen und nicht fehlerfrei. Auf die Bedeutung der epigenetischen Reprogrammierung weist auch die erhöhte Prävalenz des Beckwith-Wiedemann-Syndroms unter menschlichen Nachkommen die durch IVF produziert wurden. Obwohl die Prävalenz von 1:5000 nicht hoch ist, ist sie trotzdem höher, als es unter natürlich empfangenen Nachkommen beobachtet wurde. Wahrscheinlich sind die künstlichen Umstände der IVF Techniken ungünstig für die epigenetische Reprogrammierung. Dabei spielen die epigenetischen Veränderungen eine entscheidende Rolle bei der Adaptation zu der Umwelt. 53 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Epigenetik Ein weiterer Beweis für die epigenetische Bedeutung der Umgebung kam von Zwillingsuntersuchungen. Die epigenetische ähnlichkeit (z.B. Methylierungsmuster, Histonmuster) von eineiigen Zwillingen ist sehr hoch, sinkt aber mit zunehmendem Alter, was darauf hinweist, dass die unterschiedliche Umgebung, Lebensgewohnheiten und Ernährung immer größere epigenetische Unterschiede verursachen. Die transgenerationale Epigenese ist eine umstrittene Theorie, die auf epidemiologischen Untersuchungen basiert. Schwedische Untersuchungen haben einen Zusammenhang zwischen der Ernährung der Väter und väterliche Großeltern im Kindesalter und die Lebensspanne und auf Diabetes oder Kardiovaskulären Erkrankungen zurückzuführende Mortalität der untersuchten Personen entdeckt. (Auch neuere Tierforschungen haben auf einen Zusammenhang zwischen fettreicher Ernährung der Eltern und Fettleibigkeit bzw. Diabetes der Nachkommen hingewiesen). Andere Untersuchungen beschrieben einen Zusammenhang zwischen dem Beginn des Rauchens im Kindesalter des Vaters und einem erhöhten Body-Maß-Index (BMI) der Nachkommen im Alter von 9 Jahren. Diese Beobachtungen sind zurzeit schwer zu erklären, vor allem an der mütterlichen Seite, wo man auch mit der Übertragung von Signalen durch die Plazenta zählen muss. Die Übertragung von epigenetischen Signalen an der väterlichen Seite - also durch Spermien - ist einfacher zu deuten. Aus der Hinsicht der transgenerationalen Epigenese ist die Rolle von Umwelteinflüssen wie Ernährung und Schadstoffe (z.B. Pestizide) und die Weitergabe von den, durch diese entstandenen Veränderungen an die Nachkommen, besonders interessant. Da Folsäuren eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Methyl-Donoren, die zur DNA-Methylierung nötig sind, haben, ist es begreifbar, dass das Folsäuregehalt der Diät aus epigenetischer Hinsicht wichtig ist, was durch eine später berühmt gewordene Mausuntersuchung bewiesen wurde. Das Grundton des Fells von wilden Mäusen ist aguti (eine eigenartige Mischung von braun und grau), es gibt aber eine Mutation - Avy (viable yellow) - die für gelbes Fell kodiert. Dieses Allel ist metastabil, da es nur in nicht methyliertem Zustand zur Entstehung von gelbem Fell führt, in methyliertem Zustand entsteht aguti-farbenes Fell. Obendrein dominiert bei Heterozygoten (uAvyA) das nicht-methylierte mutante Allel, während die methylierte Form dem wilden Allel gegenüber rezessiv ist. Das nicht-methylierte uAvy Allel ist dem methylierten mAvy Allel gegenüber dominant, also in einem homozygot Avy Tier hängt die Fellfarbe von dem Methylierungsstatus der Allele ab. In den besagten Untersuchungen wurden homozygot wilde Mütter (AA) mit heterozygot Vätern (AvyA) gekreuzt. Während der Schwangerschaft wurde eine Gruppe der Mütter mit Methyl-Donor-reicher Nahrung gefüttert, währen die andere Gruppe normales Futter bekam. In der ersten Gruppe hatten die meisten heterozygot Nachkommen entweder aguti-farbenes Fell oder Fell mit größeren oder kleineren gelben Flecken (was auf die beschränkte Expression der nicht-methylierten mutanten Allel hinwies). Normales Futter hatte die entgegengesetzte Wirkung: unter den heterozygot Nachkommen gab es meistens gelbe Tiere oder Tiere mit großen gelben Flecken. In diesem Fall konnte diese Wirkung auch noch bei der F2 Generation beobachtet werden, nicht aber bei den darauffolgenden Generationen. Diese metastabile Mutation hat auch weitere Folgen: Tiere mit gelbem Fell sind meistens adipös und weisen mit einer erhöhter Frequenz Tumore auf, was wiederum den Zusammenhang zwischen Epigenetik und Onkogenese unterstützt. In einer anderen Reihe von Untersuchungen wurden schwangere Mütter mit Vinclozolin, eine Pestizide mit antiandrogener Wirkung behandelt. Hier wurden Veränderungen im Methylierungsmuster auch noch bei der F4 Generation beobachtet (bei der Untersuchung von 25 verschiedenen DNA-Sequenzen). Nachkommen von beiden Geschlechtern waren von den Auswirkungen der Behandlung der Mutter betroffen, aber die weiteren Auswirkungen wurden nur an der väterlichen Seite (patrilinear) weitervererbt. Das weist womöglich darauf hin, dass transgenerationale epigenetische Einflüsse geschlechts- und organspezifisch wirken können, und die Folgen mögen erst später, im Erwachsenenalter auftreten. So können epigenetische Veränderungen bestimmte, spät im Leben auftretende Krankheiten verursachen. Aufgrund der oben geschilderten und ähnlichen Untersuchungen, bzw. humanen Daten, erkennen wir zwei Formen der mütterlichen Übertragung von epigenetischen Wirkungen. Die eine ist die direkte transgenerationale Epigenese, wobei (wie bei den Vätern) die epigenetischen Veränderungen (Epimutationen) die Keimbahnzellen betreffen, die andere ist die epigenetische Reprogrammierung der Ontogenese (intrauterin, oder perinatal durch das pflegende Benehmen der Mutter). Obwohl die genaue Art der epigenetischen Veränderungen und ihre transgenerationale Übertragung noch nicht in jeder Einzelheit bekannt und erklärt sind, es kann mit Sicherheit festgestellt werden, dass sie eine wichtige Rolle bei der feinen Regulation der Genexpression, und bei normalen und abnormalen Entwicklungsprozessen spielen . Empfohlene Webseiten : 54 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Epigenetik www.geneimprint.com http://atlasgeneticsoncology.org/Deep/GenomImprintID20032.html http://teach.genetics.utah.edu/content/epigenetics/ http://epigenie.com/ 5. Fragen 1. Was ist der Zweck der Dosiskompensation? 2. Wie könnte man die genomische Prägung aus evolutionärer Hinsicht erklären? 3. Was nennen wir einen differenziert methylierten Cluster? 4. Welche molekularen Modifikationen stehen im Hintergrund der epigenetischen Veränderungen? 5. Warum können die CpG Dinukleotide als Mutationsheißpunkte fungieren? 6. Welche Rolle spielen die nicht-kodierenden RNAs bei der X-Inaktivierung? 7. Welche Mechanismen führen zur Entstehung des Angelman-Syndroms? 8. Was ist der Histon-Code? 9. Was sind die CpG-Inseln und was ist ihre epigenetische Bedeutung? 10. Was ist Chromatin Remodelling? 55 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 5. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge Erna Pap 1. Einführung Die mendelsche Vererbung ist die Grundlage der klassischen Genetik. Unsere Erkenntnisse sind jetzt aber in diesem Feld deutlich tiefer, trotzdem wird die Untersuchung der menschlichen Merkmale / Krankheiten immer noch zu mendelschen Erbgängen verglichen. Erbgänge, die zu den Mendel-Erbgängen gehören, sollen zwei Voraussetzungen entsprechen: 1. Die MendelRegeln können angewendet werden. 2. Die Umgebung hat keinen Einfluss auf die Vererbung. Die formale, klassische Verteilung ist die folgende: autosomal dominante, rezessive, kodominante, Xgebundene dominante, rezessive und Y-gebundene Vererbung. In den letzten Jahrzehnten wurde die Frage aufgeworfen, ob diese Voraussetzungen immer noch verwendbar und gültig sind. Zahlreiche Phänomene kommen bei dem Auftreten der monogenen Krankheiten vor, die man nach der klassischen Einordnung nicht erklären kann: entweder wird das Prinzip der Dominanz in einigen Generationen nicht verwirklicht, oder der Schweregrad der Krankheit unterscheidet. Zusätzlich kann der Einfluss der Umgebung bei der unterschiedlichen Manifestierung der gleichen Genmutation auch nicht voll ausgeschlossen werden. Heute ist es eindeutig, dass der „ein Gen/ein Lokus‖ Genotyp die klinischen Symptome der Krankheit nur teilweise bestimmt, und die Kombination von vielen sekundären genetischen und Umgebungsfaktoren die Ausprägung der Krankheit ändern kann. Die Penetranz, die Expressivität, der sogenannte oligogene Einfluss, die X-Inaktivierung in Frauen und zahlreiche weitere epigenetische Faktoren gehören unter anderem zur Gruppe der Phänomene, die die „klassischen‖ monogenen Erbgänge modifizieren. Es ist ziemlich schwer die Genetik der menschlichen Merkmale zu studieren, da es nicht möglich ist Rückkreuzung durchzuführen, auch ist die Zeit zwischen den Generationen viel länger als im Fall der klassischen Modelle (wie Bakterien, Hefezellen, Drosophila, Maus, Ratte) und endlich ist die Größe der Familien auch viel kleiner als bei den Modelltieren. Bis jetzt sind mehr als 6000 monogene Merkmale / Erkrankungen bekannt. Es ist wichtig zu betonen, dass weniger als 6000 Gene in dem Hintergrund dieser monogenen Krankheiten stehen. Eine Ursache ist dass die Mutationen von den gleichen Genen wegen der Umgebungsfaktoren und der weiteren genetischen Wirkungen (siehe unten: modifizierende Gene) unterschiedlich manifestierende Krankheiten hervorrufen können. Eine weitere Ursache ist wenn die Mutationen verschiedene Regionen in dem gleichen Gen treffen, wodurch die Proteinprodukte bei unterschiedlichen funktionellen Domänen betroffen werden. Andererseits können die Mikrodeletionen und Chromosomenduplikationen die Symptome bei einigen Krankheiten auch verursachen, und diese Fehler folgen manchmal den Mendel-Regeln. Obwohl die Krankheiten in diesem Fall auf kein einzelnes Gen zurückgeführt werden können, werden sie in Humangenetik zu den monogenen Krankheiten eingezählt. Obendrein ist ungefähr 10% der mendelschen Krankheiten geschätzt, die Krankheit von Mutationen in den nicht-kodierenden Regionen der Gene verursacht zu werden. Das zeigt auch, dass die Weise des Erbgangs auf kein Gen aber auf die Eigenschaft sich bezieht. Die Prävalenz der menschlichen mendelschen Erkrankungen ist deutlich kleiner in den Bevölkerungen als bei den komplexen polygenen (multifaktoriellen) Erkrankungen. (Tabelle 5.1.) Obwohl es denkbar ist, dass die Ärzte diese Krankheiten in ihrer Praxis nur selten treffen, ist dieses Thema für jeden Arzt jedoch von grundlegender Wichtigkeit, da das „Genetikum‖ von diesen Erkenntnissen „abgebildet‖ werden kann. Die genetischen Prozesse, die Interaktionen zwischen den Genen, sogar die ganze Genetik kann in den monogenen Systemen relativ einfacher untersucht und analysiert werden. Diese Erkenntnis kann dem Verständnis der Entwicklung, des Ablaufs und der Heilbarkeit der polygenen multifaktoriellen Krankheiten helfen. Vielmal sind auch die Gene der polygenen, komplexen Erkrankungen nicht bekannt, aber es ist schon bewusst, dass zahlreiche Gene in ihrer Entwicklung beteiligt sind. Deswegen 56 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge kann der Zusammenhang: „Gen – mRNA – Protein – klinisches Bild‖ nicht aufgestellt werden. Dementgegen bei den monogenen Fällen kann man diese Relation aufzeichnen. Tabelle 5.1. Tabelle 5.1. Die Prävalenz von einigen vererbbaren Krankheiten. Monogene Krankheiten Huntington chorea AD 1:10 000 Osteogenesis imperfecta AD 1:10 000 Familiäre Hypercholesterolemie AD 1:500 Polycystische Nieren AD 1: 800 Mukoviscidose AR 1:3600 Phenylketonurie AR 1:12 000 Albinismus AR 1:1000–10 000 Duchenne muskuläre Dystrophie XR 1: 4500 (in boys) Mitochondriale Krankheiten Leber optische Neuropathie 1:50 000 Chromosomale Krankheiten Prader-Willi Syndrom Deletion 1:30 000 Down Syndrom Trisomie 1:500 (nicht Allgemeinen) Multifaktorielle Krankheiten) im (Komplexe Schizophrenie 1: 100 Diabetes mellitus II.* 7: 100 Diabetes mellitus I. 4: 1000 Depression 1: 10 Breast Karcinom* 1: 10 (in Frauen) Allergie 2: 10 Asthma 1: 10 Hypertonie* 3: 10 Adipositas* 1: 10 * Wesentlich Erwachsenenalter vererbbar häufiger im Das Ziel dieses Kapitels ist keine detaillierte Analyse oder Aufzählung von allen monogenen Krankheiten. Zur Verfügung stehen zahlreiche Bücher und die reiche OMIM online Quellverzeichnis (online mendelian inheritance in men), dieses Thema tief zu studieren. http://omim.org/ Obendrein beschäftigt sich mit den Erbkrankheiten das später im Curriculum kommende Fach „Klinische Genetik‖. Wir möchten die Ansicht ausweiten: die Aufmerksamkeit auf einige neue Aspekte außer den allgemeinen Regelmäßigkeiten zu richten, dadurch die Komplexität der Erbgänge vorzuzeigen, und zu demonstrieren, dass es kein Absolutum in Natur – derzeit in Vererbung – existiert. Das Zusammenspiel der Gene miteinander und mit der Umgebung bietet die Möglichkeit von unendlichen Variabilitäten im einzelnen Menschen an. Diese Erkenntnisse können uns in der Zukunft zur personalisierten Medizin führen. Gleichzeitig treten wir unmerklich aus der Welt der Genetik in die Welt der Genomik ein. 2. Allgemeine genetische Begriffe, Definitionen 57 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge Gen: ein Abschnitt der DNA, der für eines oder mehrere funktionelle Produkte kodiert. Diese Produkte können Proteine (über mRNA vermittelt), aber auch irgendwelche andere RNA Moleküle, wie tRNA, rRNA, snRNA, miRNA, siRNA, usw. sein. Allel: die alternative Form eines Gens oder eines Lokus. In einer diploiden Zelle sind zwei Allele gleichzeitig auf dem gleichen Lokus (Genort) der homologen Chromosomen vorhanden. Auf Grund der Beziehung in der die Allele zueinander stehen, nennt man die Vererbung des von bestimmtem Gen kodierten Merkmals dominant oder rezessiv. Multiplex Allelismus: bei vielen Merkmalen und Krankheiten existieren mehr als zwei Allele eines Gens. Die Anzahl dieser Varianten ist drei bei der AB0 Blutgruppe, alle sind gesunde Formen, während mehrere Hundert mutierte Formen in Mukoviscidose bekannt sind. Komplexe Heterozygote: bei diesen Personen sind beide Allele des „Krankheitsgens‖ mutiert aber die betroffenen Allele tragen unterschiedliche Mutationen (z.B. die Mutationen des CFTR Gen in Mukoviscidose). Als die Krankheit sich manifestiert, spricht man über Homozygotie in Hinsicht der Ausprägung des „Krankheitsallels‖, aber wegen der verschiedenen Mutationen sind die DNA Sequenzen auch unterschiedlich, also von diesem Gesichtspunkte aus sind die Allele heterozygot. Genetische Heterogenität: es existieren viele Konditionen / Krankheiten, die von verschiedenen genetischen Ursachen ausgelöst werden. - Lokus Heterogenität:Die Mutationen von mehreren unterschiedlichen Genen können den gleichen Phänotyp hervorrufen (Retinitis pigmentosa, Taubheit). Im Fall von Retinitis pigmentosa sind mehr als ungefähr100 Gene bekannt, deren Mutationen einzeln die gleichen Symptome ergeben: die Sterbung der Zapfen und Stäbchen und die Blindheit as eine Folge. Im Fall von Taubheit sind mehr als 50 Gene bekannt, deren Mutationen einzeln die gleichen Symptome ergeben. - Allel Heterogenität: die mutierten Allele des gleichen Gens können ähnliche oder verschiedene Symptome hervorrufen (z.B. die Mutationen des FGFR3 Gens. Siehe später!). Dominanz / Rezessivität: die Dominanz / Rezessivität bezieht sich auf den Phänotyp, nicht auf die Gene. Ein Merkmal ist dominant, wenn es auch in den Heterozygoten sichtbar wird. Im Fall wird es nicht sichtbar, wird das Merkmal rezessiv genannt. In der Tat zeigen diese Ausdrücke die Beziehung der zwei Allele von dem gleichen Gen. Man spricht über Dominanz wenn die Expression eines Allels die Expression (die phänotypische Ausprägung) des anderen Allels unterdrückt. Was macht ein Merkmal dominant oder rezessiv? Missense Mutationen und die Mutationen von regulatorischen Proteinen verursachen oft „gain of function‖, das bedeutet dass das Genprodukt eine neue, zusätzliche Funktion erhält – das kodierte Protein gefährlich wird. Als die neue Wirkung auftritt, ergeben diese Mutationen meistens einen dominanten Phänotyp. Das Protein funktioniert ebenfalls wenn es inaktiv bleiben müsste. Im Gegenteil verursachen die nonsense oder frameshift Mutationen „loss of function‖, den Verlust der Funktion. Das Protein kann seine ursprüngliche Funktion nicht mehr ausführen. Abhängig davon, wie empfindlich der Organismus für den Verlust der bestimmten Funktion ist, wird der Phänotyp dominant oder rezessiv. Der Erbgang ist rezessiv, wenn 50% der Genaktivität genügend ist die gesunde Lebensfunktion zu unterstützen. Kodominanz: beide Allele manifestieren sich phänotypisch in den Heterozygoten (z.B. AB Blutgruppe). Wenn die Allel-Mutation eine Krankheit verursacht, treten die Symptome bei den Heterozygoten auf, aber die Symptome sind schwächer als in den Homozygoten (z.B. Mutation des LDLR Gens in Familiärer Hiperkolesterinemie). 3. Begriffe/Phänomene, die den klassischen monogenen Erbgang beeinflussen Die meisten folgenden Phänomene modifizieren das saubere Verhältnis von „ein Gen – ein Merkmal‖. Sie erschweren die Stammbauanalyse für den Genetiker und den Arzt. 58 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge Expressivität: qualitativer Begriff, die „Kraft‖ der Ausprägung eines Merkmals. Es ist ziemlich häufig, dass die gleiche Mutation unterschiedliche Manifestierung in den betroffenen Personen ergibt. In diesem Fall spricht man über variable Expressivität. Penetranz: in einer Familie/Bevölkerung überspringt die Erbkrankheit eine oder mehrere Generationen trotz dem Auftreten der autosomal dominanten Vererbung. Die sicheren Träger der Mutation zeigen keine klinischen Symptome, obwohl Heterozygoten(Aa) die Symptome manifestieren sollten. Solche Eltern geben ihre mutierten Allele den Kindern weiter, und wird die Krankheit in diesen Kindern ausgeprägt. Die Penetranz wird angegeben in Prozent der Häufigkeit, in der ein Gen sich im Phänotyp manifestiert. P % = 100 x Anzahl der betroffenen Personen / Anzahl der obligat Träger . Den obligat Träger wird die Person betrachtet, der mindestens ein Elter und ein Kind betroffen ist, oder die selbst betroffen ist. Bewirkt ein Gen immer die Ausprägung des Merkmals, dessen Information es trägt, so beträgt seine Penetranz 100%, d.h. dass es eine vollständige Penetranz vorliegt. Liegt die Penetranz unter 100%, spricht man über unvollständige oder reduzierte Penetranz. Wenn die Krankheit z.B. nur in 3 Personen aus 4 obligat Träger (Heterozygoten) in der gleichen Familie sich manifestiert, wird die Penetranz 75%. Unvollständige Penetranz und variable Expressivität können nicht durch die Mendel-Regeln erklärt werden. Diese zwei Phänomena modifizieren am meistens die Regelmässigkeit der klassischen mendelschen Vererbung, zusätzlich erschweren sie die Stammbauanalyse. Der genaue Hintergrund ist noch nicht bekannt. Wir müssen vermuten, dass nicht nur ein, sondern mehrere Gene expressiert werden, deren Produkte und Wirkungen auch beteiligt sind, die Expression des „Hauptgens‖ zu regulieren. (Siehe unten: „modifier‖ Gene). Ausserdem kann ein ganzes Arsenal von epigenetischen regulatorischen Mechanismen die Ausprägung eines Gens auf der Ebene der Transkription oder Translation beeinflussen (siehe Vorkapitel!). Perinatales Imprinting spielt eine bedeutende Rolle dabei. Die feinen regulatorischen Mechanismen werden nicht nur von inneren, intrazellulären Faktoren gelenkt, aber auch durch die Umgebung üben sie unterschiedliche Wirkungen aus. Also die zwei Ansätze, das Fundament der klassischen mendelschen Vererbung – die absolut monogene Wirkung und der Ausschluss der Umgebung – ist nicht mehr gültig in diesen Fällen. Deswegen ist es möglich zu behaupten, dass die monogene Vererbung in dieser Weise nicht existiert, sondern sprechen wir stattdessen über oligogene Vererbung, und obendrein können die Umgebungsfaktoren auch nicht aus der Vererbung ausgeschlossen werden Antizipation: die Krankheit wird von Generation zur Generation früher in Lebensalter und/oder in schwererer Form manifestiert. Antizipation könnte als ein spezieller Fall der variablen Expressivität betrachtet werden, obwohl die allgemeine Erklärung der variablen Expressivität für die Antizipation nicht verwendet werden kann. Die Antizipation ist nicht von der Umgebung oder von anderen Genen beeinflusst, sondern ist es schon sicherlich bekannt und bewiesen, dass die frühere Ausprägung der Krankheit in jeder Generation von der Expansion der Trinukleotidrepeat Mutationen verursacht wird. Wiederum, wenn der Träger der Mutation früher stirbt als die Symptome ausgeprägt gewesen wären, entspricht dieser Fall einer unvollständigen Penetranz nach Ansicht von der Familie. Die Stammbauanalyse wird deswegen eben mehr kompliziert. Komplexe Heterozygotie: oft bei einigen rezessiven Krankheiten vererbt der Nachkommen von den Eltern zwei unterschiedlich mutierte Allele des gleichen Gens, wodurch der „aa‖ Genotyp mit „a 1a2‖ Genotyp beschrieben werden soll. Infolgedessen werden die zwei Allele nicht unbedingt gleich stark betroffen, beziehungsweise wird der Schweregrad der Symptome variabel in den Kranken. Noch dazu kann die Wirkung der zwei Allele einander neutralisieren, wodurch die Krankheit sich nicht manifestiert. Pleiotropie: eine vielfältige Merkmalausprägung, wenn die Erbkrankheit sich in mehreren Organen, Organsystemen manifestiert. Die Erklärung steht darin, dass das gleiche Gen in mehreren Organen expressiert werden kann, und das translatierte Protein vielleicht verschiedene Funktionen ausführen kann (siehe Kapitel 11., EDAR Gen as Beispiel). Oft ist das Protein ein Intermediärmolekül der Stoffwechselprozesse oder das Protein - als regulatorisches Molekül – kann in der Regulation von mehreren Prozessen beteiligt werden. Zusätzlich, was die Strukturproteine betrifft, sind sie in zahlreichen Geweben vorhanden. Wenn das ausgeprägte Protein (oder das davon hergestellte Molekül) ein Hormon ist, können auch vielfältige Wirkungen ausgelöst werden. Heterogenie: sieht dem Gegenteil der Pleiotropie aus.Zwei (oder mehrere) voneinander unabhängige Gene den gleichen Phänotyp ergeben. In diesen Fällen bei den rezessiv vererbten Krankheiten können auch zwei betroffene, kranke Eltern phenotypisch gesunde Kinder haben. 59 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge Phänokopie: trotz der Anwesenheit von mutierten Allelen wird die Erbkrankheit wegen Umgebungswirkungen nicht oder milder manifestiert. Das kann bei Arzneimittel Behandlung geschehen oder bei einer geeigneten Diät in Phenylketonurie. Eigentlich lässt die Umgebung keine schuldige Wirkung des Gens ausprägen, aber sie kann die Wirkung kompensieren. Das Gegenteil dieser günstigen Wirkung ist wenn Umgebungsfaktoren die Symptome einer Erbkrankheit auslösen, ohne die Anwesenheit von irgendwelchen mutierten Allelen. In diesem Fall geht es um die Folge einer Infektion (z.B. Rubella verursachte Taubheit). Man spricht über pathologische Phänokopie wenn der Phänotyp trotz dem gesunden Genotyp auftritt, und spricht über normale Phänokopie, wenn trotz dem pathologischen Genotyp der gesunde, normale Phänotyp manifestiert wird. Neue, „de novo” Mutation: nur gesunde Personen sind in einer Bevölkerung (Familie) durch Generationen bezüglich eines bestimmten Gens geboren, aber plötzlich tritt die Krankheit in einem Nachkommen auf. Im Hintergrund steht die Entstehung und die Stabilisierung einer neuen, spontanen Mutation in einem Allel in einem der Eltern. Damit kann man verstehen, wie einige Erbkrankheiten in den menschlichen Populationen verbleiben, warum sie nicht verschwinden. Diese Mutationen werden immer in einigen Individuen wiedermal „reproduziert‖. Z.B. Rett Syndrom entsteht in 95%, Achondroplasie in 80% in den Populationen wegen neuer Mutationen. Der Einfluss des Alters: je älter ein Mann bei der Zeugung seines Kindes ist, desto mehr Mutationen überträgt er dem Nachwuchs, - zeigen die Untersuchungen. Studien haben bereits einen Zusammenhang zwischen den neu entstehenden Mutationen und einem erhöhten Risiko für einige monogene (und für einige polygene) Krankheiten aufgezeigt. Die Erklärung ist, dass die Spermatogenese bis spätes Alter verbleibt, also die regulatorischen Mechanismen können während der Mitose der Spermatogonien beschädigt werden. Die auf diese Weise während der Replikation der DNA in der S Phase entstehenden spontanen Mutationen werden beständig. Lethale / sublethale Gene: die mutierten Gene verursachen Tod in 100% (lethal) oder weniger als in 100% (subletal) in den Trägern / Betroffenen. Das dominante lethale Allel verursacht Tod in den Heterozygoten bevor der Zeugung eines Kindes (z.B. Hutchinson-Guilford – progeria http://ghr.nlm.nih.gov/condition/hutchinsongilford-progeria-syndrome ). Dadurch könnte das Gen aus der Bevölkerung verschwinden, aber die neu entstehenden Mutationen lassen es nicht. (Siehe oben!). Im Fall der Huntington Chorea ist die Lage gegensätzlich. Die Krankheit ist tödlich, aber sie manifestiert sich später im Leben, wodurch die betroffenen Personen die Krankheit unbewusst auf ihre Kinder übertragen können. Auf diese Weise wird das mutierte Allel den Kindern übertragen. Modifizierende Gene: Gene, die die Ausprägung eines anderen Gens beeinflussen. Da vorliegt eine Interaktion zwischen zwei oder mehreren Genen, die sich auf unterschiedlichen Orten befinden. Erzeugt eine monogene Erbkrankheit Symptome mit individuell variabler Stärke, dann kann man annehmen, dass weitere Gene im Hintergrund stehen, welche die Expression des bestimmten mutierten Gens beeinflussen. Die Anzahl von diesen so genannten modifizierenden Genen ist gewöhnlich ein oder zwei. Ihre Anwesenheit und Einfluss wurden erst bemerkt, wenn ihre mutierten Forme entdeckt wurden, deren Einfluss an die Expression von dem konkreten Gen nachgewiesen werden konnte. Es erklärt gleichzeitig den Unterschied des Krankheitsverlaufs in den betroffenen. (Siehe oben variable Expressivität und inkomplette Penetranz.) Epistase wurde lange als ein einziges Phänomen betrachtet, aber es ist heute klar, dass es um Interaktionen zwischen den bis jetzt unbekannten modifizierenden Genen und anderen Genen geht. Die Anzahl der heute bekannten modifizierenden Gene ist relativ wenig, jedoch kann man vermuten, dass die Expression eines Gens und die Manifestation einer Krankheit in vielen Fällen auch von den modifizierenden Genen geleitet werden. (Siehe Kapitel 14. Systemsbiologie). Das Bild wird weiter kompliziert, als die modifizierenden Gene selbst irgendwelchem Erbgang folgen, wodurch ihre Mutationen oder Polymorphismen auch die Ausprägung der Symptome beeinflussen. Bei dem so genannten oligogenen Erbgang sind schon die modifizierenden Gene bekannt und identifiziert. Zum Beispiel folgen Mukoviscidose und polycystische Nieren diesem Erbgang, obwohl beide bis jetzt als klassische monogene Erbkrankheiten betrachtet gewesen sind. Als die „whole genom sequencing‖ (Sequenzing des ganzem Genoms) und die Exon-Sequenzing billiger geworden ist (Kapitel 10.), kann es von allen monogenen Erbkrankheiten nachgewiesen werden, dass die Wirkungen von anderen Genmutationen außer der Mutation des „Hauptgens‖ in der Manifestierung des Merkmals beteiligt sind (Kapitel 14.) Heterozygotenvorteil: (Siehe auch Kapitel 11.) wenn Individuen, die für einen bestimmten Genort heterozygot sind, eine bessere Überlebenschance und einen größeren Fortpflanzungserfolg als jegliche Formen von Homozygoten haben. Im allgemeinen sind die heterozygoten Individuen meist im Vorteil da sie ein weiteres Allel tragen dass ihnen vielleicht in einer veränderten Umwelt von Vorteil sein kann. Dies tritt in den autosomal 60 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge rezessiv vererbten Krankheiten auf. Die Krankheitsfrequenz wird dadurch innerhalb einer Population erhöht. Zusätzlich zu den Umgebungsfaktoren, spielen auch die modifizierenden Gene wahrscheinlich eine Rolle bei der Entstehung des Vorteils. Der Einfluss des Geschlechtes: die Manifestierung oder der Schweregrad von einigen Krankheiten ist unterschiedlich in dem weiblichen und männlichen Geschlecht. (Siehe Details im Kapitel 6.) Die von dem Geschlecht beeinflussten Merkmale erzeugen eine stärkere Expression von bestimmten autosomalen Genen in einem der Geschlechter (z.B. Kahlheit). In Congenital adrenal hyperplasia (Adrenogenitales Syndrom) werden zwei verschiedene Phänotypen in den zwei Geschlechtern ausgebildet. Bei der geschlechtsbegrenzten Vererbung ist die Beschränkung der Genwirkung der autosomalen Gene auf ein Geschlecht, d. h. Gene kommen in vor, prägen sich aber nur in einem Geschlecht aus. Spezifische Hormone – tatsächlich die Sexhormone regulieren die Ausprägung des Merkmals. Die Erbkrankheit Pubertas präcox manifestiert sich nur in Jungen. Der Einfluss der Umgebung (Siehe Details im Kapitel 12.): obwohl der Genotyp mutiert ist, manifestieren sich einige monogene Erkrankungen aber nur wenn bestimmte induzierende Wirkungen den Organismus betreffen. Die auslösende Ursache ist oft Arzneimittel oder Nahrungsmittel. Vorzeiten wurden diese Erkrankungen als ökogenetisch genannt. (Porfiria, malignus hipertermia, Glukose-6-Phosphat -Dehydrogenase Mangel) (siehe 5.4.4.). Natürlich stehen im Hintergrund der auslösenden Wirkung epigenetische Phänomene oder veränderte Funktionen von modifizierenden Genen. Tabelle 5.2. stellt den Zusammenhang zwischen den oberen Phänomenen, Begriffen und autosomalen typischen Krankheiten dar. Tabelle 5.2. Tabelle 5.2. Zusammenfassung der genetischen Charakteristika und Phänomene im Zusammenhang mit einigen AD und AR Krankheiten. „Phänokopie” zeigt die Krankheiten, deren negative Genwirkung (die Wirkung der mutierten Gene) durch Diät oder Medikamente kompensiert werden kann Multiple Allel Lokus Variable Inkompl Pleiotro Der Antizipa Heteroz Phänokop x Heterog Heterog Expressi ette pie Einfluss tion yie allelism enität enität vität Penetran des gotenvor us z Alters teil Achond roplasia X X Marfan X Syndro m X Osteoge ? nesis imperfe cta X X X X Familiä X re Hyperc holester olemie Polydac tyly X X X X X X Hunting ton Chorea Taubhei t Mukovi X scidose X X X X X Phenylk 61 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge etonurie X Albinis mus (albino Phänoty p) X X X Xeroder X ma pigment osum X Sichelze llanämi e X CAH X X X 4. Autosomal dominante Vererbung 4.1. Die allgemeine Charakterisierung der autosomal dominanten Vererbung (AD) Aus den bis jetzt mehr als 6000 bekannten monogenen Merkmalen / Erkrankungen sind cirka 4500 AD bekannt. Wie es schon in der Einführung hervorgebracht wurde, stehen in dem Hintergrund dieser monogenen Krankheiten weniger als 6000 Gene. Mikrodeletionen und Chromosomenduplikationen auch folgen manchmal den Mendel-Regeln. Obwohl die Krankheiten auf kein einzelnes Gen zurückgeführt werden können, werden sie in Humangenetik zu den monogenen Krankheiten eingezählt. Die Prävalenz der AD Krankheiten ist im Durchschnitt zwischen 1/1000 und 1/10 000 Lebensgeburten. Natürlich gibt es Unterschiede, in Familiärer Hiperkolesterinemie z.B. ist die Prävalenz 1/ 500, in Achondroplasia ist sie 1/20 000. Die krankheitsverursachenden Gene befinden sich auf den körperlichen Chromosomen (Autosomen). Der Schweregrad und die Häufigkeit sind gleich in beiden Geschlechtern. Das Merkmal manifestiert sich schon in dem heterozygoten Genotyp (Aa), d.h. auch im Fall von einem mutierten Allel. In einigen Fällen gibt es keinen Unterschied zwischen den Homozygoten und Heterozygoten bezüglich des Schweregrades der Symptome. Huntington Chorea ist ein Beispiel dazu, wenn das falsche Proteinprodukt eines einzelnen mutierten Allels des Huntingtin Gens ein sehr schweres klinisches Bild und endlich zum Tod führende Krankheit hervorrufen kann. Es ist der Fall der dominanten negativen Mutation. (Nicht zu verwechseln: die Manifestierung der Krankheit nach dem Alter und der langsamere oder schnellere Krankheitsablauf werden nicht von dem heterozygoten oder homozygoten Genotyp entscheidet, aber von der Anzahl der Trinukleotidrepeat-Einheiten in dem mutierten Allel. Sieh 5.3.2.: Antizipation) Der homozygote Zustand ist jedoch wesentlich schwerer in vielen Krankheiten als der heterozygote Zustand. (Als Beispiel werden hier Osteogenesis imperfecta, Marfan Syndrom, Waardenburg Syndrom oder Familiäre Hiperkolesterinemie erwähnt.) Der homozygote Genotyp ist ziemlich selten bei den AD Krankheiten, zwei betroffene Eltern wären dazu gebraucht. (Neue Mutationen treffen tatsächlich niemals gleichzeitig beide Allele des gleichen Gens in einem der Eltern.) Die Krankheit wird häufig von solchen schweren Symptomen begleitet, die beim Babyempfang schon ein Hindernis darstellen kann. Eine weitere Erklärung ist möglich, dass die Krankheit wegen ihre dominanten Natur nicht geborgen wird, also die Eltern sind schon dessen bewusst, dass ein Risiko bezüglich der Gesundheit des Kindes vorliegt. Es ist wichtig zu betonen, dass viele Krankheiten durch pränatale Diagnostik ausgesiebt werden können. Eben dann kann das „Krankheitsgen‖ aus den Populationen wegen der neu entstehenden Mutationen (Siehe 5.3.) nicht entfernt werden. Die Ursache der heterozygoten Dominanz kann Haploinsuffizienz, dominante negative Wirkung oder „loss of function‖ Mutation sein. Das AD klinische Bild wird meistens von den Mutationen der Gene der strukturellen Proteine, der Rezeptoren und der Protoonkogene verursacht. Es ist zu bemerken, dass diese Gruppierung nur künstlich ist, mit mehreren Ausnahmen. Die typischen Charakteristika der AD Vererbung, die den klassischen mendelschen Erbgang 62 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge verändern, sind die folgenden: variable Expressivität, inkomplette Penetranz, Auftritt einer neuen Mutation und der Einfluss des väterlichen Alters. (Siehe 5.2.) Unten werden einige Beispielkrankheiten nach diesen Phänomenen und nach der künstlichen Einordnung diskutiert. 4.2. Krankheiten: verursacht durch Genmutationen von strukturellen Proteinen 4.2.1. Marfan Syndrom Die Krankheit wird von der Mutation des Fibrillin-Gens ausgelöst. Die Krankheit ist das typische Beispiel für Pleiotropie, da Fibrillin eines der wichtigsten vorliegenden extrazellulären Proteinen in den elastischen und nicht elastischen Bindegeweben ist. Zahlreiche Proteine können betroffen werden: die Haut, die Lungen, die Nieren, das Skelettsystem, das Gefäßsystem, die Kornea, usw. Es kann individuell unterscheiden, welches Organ schwerer betroffen wird, beziehungsweise ist die Expressivität variabel. Eine starke Korrelation kann mit der Mutation und dem Alter des Vaters nachgewesen werden. 4.2.2. Osteogenesis imperfecta Die Mutationen des Kollagen-Gens stellen Symptome von verschiedenem Schweregrad her. Die Kollagen – Genfamilie umfasst 45 Gene, die auf mehreren Chromosomen verteilt sind. Sie Kodieren für Proteine mit verschiedenen Eigenschaften. Als Kollagen das häufigste, wichtigste in der extrazellulären Matrix vorliegende Protein ist, ist es nicht überraschend, dass die Mutationen auch dieser Gene pleiotrope Wirkung erzeugen. Die Expressivität ist ebenfalls variabel. In Homozygoten sind die Knochen manchmal so zerbrechlich, dass es schon während der Geburt tödlich wird. Wiederum kann nur Taubheit wegen der Beschädigung der Hörknochen auftreten oder keine Taubheit, jedoch zerbrechliche Knochen oder blaue Sclera. Inkomplette Penetranz kann bei der Vererbung der Osteogenesis imperfecta auch vorkommen. In Wirklichkeit weiß man nicht genau, was bestimmt, welche AD Krankheiten in einigen betroffenen Heterozygoten sich nicht manifestieren. Die rolle der modifizierenden Gene sind hier auch vermutet. 4.3. Krankheiten: verursacht durch Genmutationen von Rezeptoren 4.3.1. Achondroplasie Die Krankheit wird von der Mutation des FGFR3 (fibroblast growth factor receptor Typ 3) Gens verursacht. Eigentlich können drei vererbbare Krankheiten zu den Mutationen dieses Gens gekoppelt werden Achondroplasie, Hypochondroplasie und Tanatophoroplasie - je nachdem, an welchem Ort des Gens die Mutation entsteht. Hier vorliegt der Fall von Allelheterogenität. Die Mutation ist eine „gain of function‖ Mutation, der Rezeptor bleibt aktiv auch ohne Ligande. Meistens tritt die Mutation wie neue Mutation auf, sie weis starke Korrelation mit dem Alter des Vaters nach. 4.3.2. Familiäre Hiperkolesterinemie Die Inzidenz ist relativ hoch - 1:500 -. Der Schweregrad der Symptome hängt wesentlich von dem homo –oder heterozygoten Zustand ab. Im LDL Rezeptor – Gen wurde mehr als hundert Mutationen nachgewesen, man spricht über multiplex Allelismus in diesem Fall. Zusätzlich ist Lokus Heterogenität für die Krankheit bezeichnend, als mehrere Gene bekannt sind, deren Mutationen ebenfalls vererbbare hoche Konzentration von Cholesterin verursachen. Solche ist die Mutation eines Liganden des LDLRs, die Mutation von APOB, - oder die Mutationen des PCSK9-Gens, dessen Produkte bei dem Abbau des LDLRs eine Rolle spielen. Diese Mutationen folgen ebenfalls AD Vererbung, jedoch folgen einige Krankheiten rezessivem Erbgang. (Siehe: http://en.wikipedia.org/wiki/Familial_hypercholesterolemia). 4.3.3. Polycystische Nieren Mit einer 1:800 Häufigkeit, ist diese Krankheit eine der häufigsten AD Erkrankungen. Im Hintergrund der Krankheit steht ein Rezeptor-Ionkanal Komplex, der aus zwei Polycistin Proteinen besteht. Der Komplex reguliert die G-Protein gekoppelte Signalübertragung und einen zellmembrangebundenen Ca++ Kanal. Das 63 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge Polycistin1 Protein wird von PKD1 Gen, das Polycistin2 Protein wird von PKD2 Gen kodiert. 80% der Mutationen treffen das erste Gen. Die Krankheit manifestiert sich in dem frühen oder späten Erwachsenalter. Die Expressivität erzeugt Variabilität auch in der gleichen Familie was die Ausprägung und den Schweregrade anbelangt. Diese hängen von Umgebungsfaktoren und von genetischen Faktoren ab, da Infektionen können die Entwicklung der Symptome beschleunigen, wiederum zählt auch der Ort der Mutation im Gen. Die modifizierenden Gene können gleichzeitig die Ausprägung der Krankheit beeinflussen. Die Wirkung der modifizierenden Gene wird zusätzlich von ihren Polymorphismen beeinflusst. Es wurde nachgewesen, dass einige bestimmte Polymorphismen des Gens der Nitrogen-Monoxid Syntase (eNOS) eine frühere und schwerere Manifestierung der Symptome auslösen. 4.4. Mutation eines Gens, das für ein Protein mit bis jetzt unbekannter Funktion kodiert 4.4.1. Huntington Chorea Wird von der Trinukleotidrepeat Mutation des Huntingtin-Gens verursacht. Die Rolle des von dem gesunden Allel-kodierten Huntingtin Proteins ist noch nicht bekannt. Durch den Anstieg der Anzahl der CAG Repeats gewinnt das Protein eine falsche Funktion. Der Anstieg der Anzahl erscheint meistens in der väterlichen Keimbahn. (Siehe 5.3. und 5.4.1.). 4.5. Mutation der Protoonkogene Siehe 5.6. 4.6. Pharmakogenetische Erkrankungen Trotz dem mutierten Genotyp, manifestieren sich einige monogene Erkrankungen nur unter bestimmten Umständen. Umgebungsfaktoren lösen die Ausprägung der Krankheit aus. Nach einer älteren Anordnung gehörten die pharmakogenetischen Erkrankungen zu den ökogenetischen Erkrankungen. In Wirklichkeit ist die „pharmakogenetische‖ Bezeichnung auch nicht richtig, weil die Umgebungsfaktoren anders als Medikamente sein können (siehe Kapitel 12). 4.6.1. Porfiria Die betroffenen Gene kodieren für die Enzyme von einigen Schritten der Hem- und Porfirin- Synthese. Je nachdem, welche Gene in mehrschrittigen Reaktionen mutiert wurden, unterscheidet man verschiedene Porfirias. Die Vererbung ist meistens AD, aber in einigen Fällen autosomal rezessiv. Obwohl die mutierten Allele in den betroffenen Personen vorhanden sind, ist es nicht genug um die phänotypische Manifestierung hervorzurufen, sind bestimmte Umgebungsfaktoren dazu gebraucht. Die auslösenden Umgebungsfaktoren können vielfaltig werden: Arzneimittel, Alkohol, Steroide (z.B. Kontrazeptive), Stress, Hungern, Licht usw. Die genaue und komplizierte Einordnung der Porfirias in internaler Medizin und ihr biochemischer Hintergrund werden nicht in diesem Kapitel diskutiert. Wir möchten hier nur betonen, dass die Gene in sich nicht allvermögend sind. Obwohl der monogene genetische Hintergrund wohl bekannt ist, unterscheidet sich die Vererbung dieser Krankheit sehr stark von dem klassischen mendelschen Schema. 4.6.2. Malignus hypertermia Die Krankheit kann unerwartet in Narkose während einer Operation auftreten. Die Krankheit kann von den Mutationen von mindestens 6 verschiedenen Genen ausgelöst werden. Die gewöhnlich aufkommenden Mutationen sind die Mutationen von CACNA1S und RYR1 (Rianodinrezeptor) Genen. Das Proteinprodukt des CACNA1S Gens reguliert die Funktion des Rianodinrezeptors. Und als der Rianodinrezeptor die Funktion von Ca++ Kanälen reguliert, führt die Mutation von entweder dem CACNA1 Gen oder von dem RYR1 Gen zur Freisetzung von großen Mengen von Ca++ Ionen aus dem sarkoplasmatischen Retikulum. Das wird von der schnelleren Öffnung oder von dem langsameren Schließen der Ionkanälen ermöglicht. Die vergrößerte Ca ++ Ion Konzentration ergibt eine erhöhte Muskelkontraktion und erhöhte Wärmeerzeugung, die unstillbares Fieber und eben Tod verursachen kann. Diese Krankheit ist wirklich eine pharmakogenetische Erkrankung, die nur von Arzneimitteln (Barbiturate und Muskelrelaxants) ausgelöst werden kann. 5. Autosomal rezessive Vererbung 64 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge 5.1. Die allgemeine Charakterisierung der autosomal rezessiven Vererbung (AR) Das Merkmal / die Krankheit manifestiert sich in den Homozygoten (aa). Die Häufigkeit und der Schweregrad sind gleich in beiden Geschlechtern. Aus der evolutionären Hinsicht sind wahrscheinlich der Gründereffekt und der Heterozygotenvorteil die Ursache der Ausbreitung von einigen bestimmten Erkrankungen in den Populationen. (Siehe Kapitel 11.) Komplexe Heterozygotie ist charakteristisch für die AR Krankheiten. Der Stammbaum ist horizontal, aber das sporadische Auftreten ist auch häufig. Bei dieser Vererbung kann die Anzahl der betroffenen Personen wegen der Ehe zwischen Verwandtschaften erhöhen, damit wird die Prävalenz der Krankheit wesentlich grösser als in den Populationen außer der betroffenen Familie. Verwandtschaften lassen die bis dann „geborgenen Gene‖ sichtbar machen, weil die Heterozygoten sind in einer grösser Anzahl in einer solchen Familie vertreten. Die AR Krankheiten sind meistens von den Mutationen der Gene von Enzymen, von Hämoglobin und von Tumorsuppressoren verursacht. Mukoviscidose, die in keine der oberen Gruppen angeordnet werden kann, gehört auch zu den AR Krankheiten. Es ist bei diesem Thema wiedermal zu bemerken, dass diese Anordnung künstlich ist, mit Ausnahmen, ähnlich wie bei der AD Erkrankungen. Obwohl wesentliche Unterschiede sich ereignen können, ist die Inzidenz der AR Krankheiten im Durchschnitt 2,5:10000 in Europa. Die Inzidenz von Mukoviscidose ist z.B. 1:1600, von Phenylketonurie 1-10000, von Mukopolyscharidose 1:50000. Abbildung 5.1. Tabelle 5.3. Klassischer Albinismus und die Syndrome vom albino Phenotyp. Ihr genetischer Hintergrund und die veränderten / verlorenen zellbiologischen Funktionen. 5.2. Stoffwechseldefekte - Enzymopathien Als Enzymopathien bezeichnet man Stoffwechselerkrankung>Stoffwechselerkrankungen, die auf einen strukturellen "Enzymdefekt (Seite nicht vorhanden)">Enzymdefekt oder einen Enzymmangel zurückzuführen sind. Die mutierten Allele ergeben verminderte Enzymaktivität schon in den Heterozygoten, trotzdem manifestieren sich die Symptome der Krankheit häufig nicht. Pleiotropie kann einfach auch bei diesen Krankheiten verstanden werden, weil die Enzyme vielmal die Schritte von Kaskadreaktionen katalysieren. Fehlt das Enzym vom Anfang oder von einem Verzeigungspunkt der Kaskade, ist die Wahrscheinlichkeit grösser mehrere Stoffwechselprozesse beschädigt zu werden. 65 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge 5.2.1. Phenylketonurie (PKU) Phenylketonurie (PKU) wird vom Mangel der Phenylalaninhydroxylase verursacht. Anstatt Tyrosin entsteht die toxische Phenylpyruvat. Betroffene Patienten können die Aminosäure>Aminosäure an Tyrosin nicht umwandeln, wodurch Phenylalanin>Phenylalanin sich im Körper anreichert. Der Mangel beeinflusst die Umwandlung von Tyrosin weiter in seiner Kaskade. Obwohl Tyrosin in den Körper auch durch Diät gelangt, bleibt diese Menge unter dem normalen Tyrosin-Bedarf des Organismus, wodurch weniger DOPA und Melanin entsteht. Solange die PKU durch phenylalaninfreie oder phenylalaninarme Diät behandelt werden kann, kann die Ausprägung vermeidet werden, - trotzdem bleiben in den betroffenen Personen eine helle Haut, blaue Augen und helle Haare als Phänotyp. Letztens ist es ausgefallen, dass das Gen von Phenylalaninhydroxylase mehrhundert Arten von Mutationen besitzen kann, deren Manifestierung von modifizierenden Genen abhängt. 5.2.2. Klassischer Albinismus Der sogenannte klassische Albinismus entwickelt wegen der Mutation der Tyrosinkinase, wodurch Melaninsynthese unterbleibt.Dieses Enzym ist ebenso ein Mitglied der oben erwähnten Kaskade, infolgedessen durchdringt die pleiotrope Wirkung auch in den Albinos. Es ist zu betonen, dass es zahlreiche Mutationen von anderen Genen existieren, die sehr ähnlichen Phänotyp den Albino Personen verleihen. Im Hintergrund dieser Phenotypen steht der falsche Melanin Transport. Die Beschädigung der im Transport beteiligten Proteine verursacht das gleiche Problem, nämlich den Mangel der Melanin-Sekretion. Die Mutationen von vielen Genen wurden schon identifiziert und unterschiedliche Namen wurden diesen Krankheiten gegeben. (Siehe Tabelle 5.3.) 5.2.3. 5.5.2.3. Kongenitale adrenale Hyperplasie (CAH) Die Kongenitale adrenale Hyperplasie (CAH) bezeichnet eine Gruppe von Krankheiten mit entweder kompletten (klassische Formen) oder partiellen (nicht-klassische Formen) Biosynthese-Störungen der Nebennierenhormone. Die Mutation des Gens von 21-Hydroxylase (CYP21A2) verursacht 21-HydroxylaseMangel. Die Prävalenz der klassischen Form des Mangels wurde zu 1:14.000 bestimmt, die nicht-klassische Form ist häufiger. Die pleiotropen Wirkungen der Krankheit können mit dem Kaskade-Charakter erklärt werden. http://pediatrics.aappublications.org/content/106/6/1511.full Die Krankheit ist viel häufiger unter den yapi Eskimos, 1:300. Es ist möglich diese große Prävalenz mit dem heterozygoten Vorteil gegen Hemophilus Influenza B zu erklären. 5.2.4. Xeroderma pigmentosum In Xeroderma pigmentosum wird eines der Gene der „nucleotide excision repair‖ (NER) DNA korrektierenden Enzyme beschädigt, man spricht über Lokus Heterogenie hier. (Siehe 5.2.). http://ghr.nlm.nih.gov/condition/xeroderma-pigmentosum 5.3. Mukoviscidose Das Gen dieser Krankheit kann in keine Genfamilie, die dem klassischen AR Erbgang folgt, eingeordnet werden. Die Krankheit wird von keiner Enzymmutation oder Hämoglobinmutation verursacht, sondern entsteht die Mutation im Gen eines Cl-Ion Kanal regulatorischen Proteins (CFTR Gen). Mukoviscidose ist die häufigste vorkommende AR Erbkrankheit in Europa. Heterozygoter Vorteil gegen Cholera in dem Mittelalter ist vermutlich die Erklärung des Anstiegs der mutierten Allele in den weißen Populationen in Europa. (Siehe Kapitel 11.) Pleiotropie kann mit keinem Fehler der Stoffwechselskaskade bei der Mukoviscidose erklärt werden, sondern mit der Tat, dass die dichte Mukus-Sekretion die Durchgänge in mehreren Organen anstecken, was für die Pathogene eine sehr gute Umgebung versichert. Die entstehenden ständigen Entzündungen können sehr stark die Bauchspeicheldrüse, den Samenleiter und die Lungen beschädigen. Die Krankheit ist noch nicht heilbar, aber der Schweregrad kann bedeutend unter den betroffenen Kranken unterscheiden. Dies verweist auf die Wirkung von modifizierenden Genen, ebenso darauf dass einige Mutationen unterschiedlich die Funktion des gleichen Proteins verändern können. Im CFTR Gen sind mehr als 800 Mutationen bekannt, was mit dem Phänomen der komplexen Heterozygotie gezeichnet werden kann (Siehe 5.3.) 5.4. Hämoglobinopathien 66 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge 5.4.1. 5.5.4.1. Sichelzellanämie Die Mutation von Sichelzellanämie ist eine der allbekannten Mutationen. Die Transversion - Substitution der 6sten Aminosäure der Betaglobin-Kette von Glutamin zu Valin ergibt das so genannte S Hämoglobin. Dieses Protein verursacht die Sichelform der Zelle und diese Zellen verursachen die pleiotropen Wirkungen. Die Heterozygoten bevorzugen einen Vorteil gegen Malaria. (Siehe Kapitel 11.) 5.4.2. 5.5.4.2. Thalassemien Thalassemien können von verschiedenen Mutationen verursacht werden. Leserastermutationen, Deletionen und Splicingsmutationen können in den alpha und beta Ketten entstehen. Dies erklärt die Unterschiede der Thalassemien nach ihrer geographischen Ausbreitung und nach dem Schweregrad der Krankheit. Die Heterozygoten bevorzugen ebenso einen Vorteil gegen Malaria. 6. Gene und Tumoren Das Thema der Onkogenetik wird mehr detailliert im Kapitel 7. diskutiert. Es ist jedoch wichtig dieses Themenfeld im Kapitel der monogenen Vererbung vorbringen, insofern viele tumorauslösende Gene schon wohl bekannt sind und in vielen Fällen wurde die Beziehung zwischen dem Gen und seinem falschen Proteinprodukt identifiziert. Trotz allem sind die Tumoren in die Gruppe der multifaktoriellen Vererbungen eingeordnet, indem die Entwicklung der Krankheit grundlegend von den Umgebungsfaktoren beeinflusst ist. Weiterhin führen die gleichzeitigen abnormalen Funktionen der Genprodukte von mehreren mutierten Genen zusammen zur Ausprägung der Krankheit. Dieses Phänomen ist die so genannte „multiple hit theory‖, die man damit erklären kann, dass andere gesunde Proteine während des Lebens der Zellen die Fähigkeit lange haben, die ausgefallenen Funktionen zu ersetzen. Alle Zellen tragen tatsächlich mehrere oder wenigere genetische Fehler. Einzelfehler verändert aber die Zelle nicht sofort zu einer Tumorzelle. Die Mutation wird beständig in der ursprünglichen gesunden Zelle und wird den Tochterzellen weitergegeben. Wenn die Anzahl der Mutationen eine kritische Menge erreicht („multiple hit theory‖), wird die Zelle wirklich an eine Tumorzelle transformiert. Die dominant vererbten Mutationen treffen meistens die Protoonkogene und das gewandelte Gen wird Onkogen genannt. Die Vererbung der Tumorsuppressorgene ist rezessiv. Die Wandlung wird in der Funktion der Aktivität der Proteine gespiegelt. Die Produkte der mutierten Gene sind Mitglieder von Signalisierungswegen, die das Wachstum, die Teilung und die Differenzierung der Zellen regulieren. Insofern entsteht die Mutation in der Keimbahn, wird das betroffene Allel auch auf die Nachkommen vererbbar. In vielen Tumoren sind die Gene bekannt, die die Entwicklung der Krankheit prädisponieren. Es ist wichtig zu bemerken, dass obwohl die Tumorsuppressorgene ihre Wirkung in homozygoter rezessiver Form ausüben, kann ihr Erbgang nach der Manifestierung dominant gesagt werden. Die Krankheit tritt in den Stammbäumen oft in jeder Generation auf. (Wie bereits angemerkt, ist der vertikale Stammbaum für die dominante Vererbung charakteristisch.) Hier sind einige Beispiele willkürlich herausgegriffen: RB1, BRCA12, APC Gene, usw. Wenn das mutierte Allel in solchen Zellen zu befinden ist, welche in irgendeinem Stadium des Lebens intensiv proliferieren, kann eine zweite neue Mutation relativ einfach auf dem ursprünglich gesunden Allel entstehen. („two hit theory‖). Dieser Prozess ist als „Verlieren des heterozygoten Zustandes‖ bezeichnet. (loss of heterozygosity = LOH.) Also zwar zwei betroffene Allele zur abnormalen Funktion führen, ist schon einer der die Mutation tragenden Eltern genügend die Prädisposition für die Krankheit auf das Nachkommen weiterzugeben. Das Risiko der Entstehung einer zweiten Mutation grösser ist als zwei neu entstehenden Mutationen einzuholen, so die vererbte Mutation entspricht einer Prädisposition. Es ist zwar wiedermal wichtig zu betonen, dass eine Mehrzahl von rezessiv mutierten homozygoten oder dominant mutierten heterozygoten Allelpaaren nötig ist, den Ausbruch der Krankheit – die Entwicklung des Tumors – auszulösen. http://themedicalbiochemistrypage.org/oncogene.php 7. Gene und Medikamente Menschen reagieren unterschiedlich auf die gleichen Medikamente. In der medizinischen Praxis müsste dieser Tat immer berücksichtigt werden. Der Unterschied kann auf die individuellen Polymorphismen zurückgeführt werden, welches Thema mehr detailliert im Kapitel „Pharmakogenomik‖ (Kapitel 12.) diskutiert wird. Hierzu ist zu bemerken, dass es Mutationen existieren, die dem monogenen autosomal rezessiven, dominanten oder Xgebundenen Erbgang folgen, und dass sie für die adverse Reaktionen auf bestimmte Medikamente 67 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge verantwortlich sind. Aber diese Krankheiten sind gewöhnlich sehr selten und sind nicht zu vermischen mit den im 5.4.6. beschriebenen pharmakogenetischen Krankheiten (Siehe http://ebooks.thieme.com/pdfreader/coloratlas-genetics41792 273.o.) Diese Dinge sind auch nicht damit zu vermischen, dass Menschen oft unterschiedlich auf die alltäglichen Medikamente reagieren können, deren Erklärung auch in den individuellen Polymorphismen zu finden ist. 8. Konklusion Abbildung 5.2. Die Faktoren, die die monogene Vererbungen beeinflussen Eine neue Interpretation der gewöhnlichen Anwendung und der Gültigkeit der klassischen monogenen Vererbung und der Mendel-Regeln hat sich in den letzten Jahrzehnten abgezeichnet. Sicher scheint zu sein, dass die Umgebungsfaktoren, die epigenetischen Wirkungen und die Produkte von modifizierenden Genen alle die phänotypische Manifestierung des mutierten Allelpaars beeinflussen, wodurch die Ausprägung der Krankheit variabel wird. Eben die monogenen Erbgänge, die früher relativ einfach geglaubt wurden, scheinen mehr kompliziert und komplex zu sein. (Siehe Systemsbiologie, Kapitel 14.) Obwohl die Komplexität den polygenen, multifaktoriellen Erbgängen angewiesen wurde, hat unsere Ansicht wegen der neuen Entdeckungen von Genetik / Genomik auch über das Bild der monogenen Erbgänge geweitet. (Abbildung 5.1.) 9. Fragen 1. Beschreiben Sie die Mendel-Regeln! 2. Erklären Sie die folgenden Ausdrücke! --- Gen, Allel, Multiplex Allelismus, Komplexe Heterozygotie, Locus Heterogenität, Allel Heterogenität, Dominanz, Rezessivität, Kodominanz. 3. Welche Phänomene interferieren mit der klassischen Anwendung der Mendel-Regeln im Fall von monogenen Erkrankungen? 4. Erklären Sie die folgenden Ausdrücke! Geben Sie Krankheitsbeispiele für jeden Ausdruck! ---- Pleiotropie, Expressivität, Penetranz, Antizipation, Phänokopie, Komplexe Heterozygote, Heterogenie, subletale/letale Gene, neue Mutation, modifizierende Gene. 5. Beschreiben Sie die Bedeutung und geben Sie Beispiele: Das Alter und das Geschlecht beeinflussen die Manifestierung von einigen monogenen Krankheiten. 68 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Mendel-Erbgänge: autosomal Erbgänge 6. Welche sind die klassischen monogenen Erbgänge? 7. Wie hat die Entdeckung des oligogenen Erbgangs unseres Bildes über die monogene Vererbung bewirkt? Geben Sie Beispiele! 8. Welche Typen von Genen werden im Allgemeinen mutiert in AD und AR Erkrankungen? Geben Sie Beispiele für jede Gruppe! 9. Wird die Manifestierung der monogenen Erkrankungen von Umgebungsfaktoren beeinflusst? 10. Beschreiben Sie die Vererbung und die Manifestierung der Tumoren und der pharmakogenetischen Krankheiten in Bezug auf die Umgebungswirkungen! Literatur http://ebooks.thieme.com http://omim.org/ Mendelian Ratios and Lethal GenesIngrid Lobo, 2008 http://www.nature.com/scitable/topicpage/mendelian-ratios-and-lethal-genes-557 69 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Nature Education: Kapitel 6. Die Rolle des Geschlechts bei der Vererbung Sára Tóth Das Geschlecht hat, durch die Gonosomen und die von diesen kodierten Genen, einen direkten Einfluss auf den Erbgang und den Phänotyp. Durch die Eigenheiten der Gametogenese und die Befruchtung hat das Geschlecht aber auch einen indirekten Einfluss auf diesen. 1. X-Chromosomaler Erbgang Das Verstehen von X-chromosomalen Erbgängen wird dadurch erschwert, dass bei Menschen die Frauen homogametisch, die Männer heterogametisch sind. Da Frauen zwei Chromosomen X haben, können sie sowohl homozygot als auch heterozygot bezüglich Gene auf dem Chromosom X sein. Frauen, die aufgrund des Familienstammbaums oder einer Genotypisierung nachgewiesen heterozygot sind, werden obligatorisch heterozygot genannt (Überträgerinnen - Konduktorinnen). Falls sie aufgrund einer Familienstammbau-Analyse vermutlich aber nicht nachgewiesen heterozygot sind (z.B. sie haben noch keine betroffenen Nachkommen, aber betroffene Brüder), werden sie fakultativ heterozygot genannt. Männer dagegen haben nur ein X-Chromosom, daher sind sie hemizygot, und so sind sie entweder krank/betroffen wenn sie ein mutantes X-Chromosom haben, oder gesund, wenn sie ein gesundes (nicht mutiertes) X-Chromosom haben. Bei Krankheiten mit einem X-chromosolamen Erbgang haben die betroffenen Männer in ein Drittel aller Fälle eine neue Mutation! Da hemizygot Männer wegen der steten Ausprägung von X-chromosomaler Merkmalen/Krankheiten einen Reproduktionsnachteil haben, werden solche Gene aus der Population selektiert. Bei Frauen ist der Fall wegen der Inaktivierung des X-Chromosoms noch komplizierter, da der Phänotyp einer Heterozygoten, abhängig von den Eigenschaften des inaktivierten XChromosoms, ziemlich variabel -mild oder schwer betroffen - sein kann. 1.1. X-Cromosomal Dominanter (XD) Erbgang In diesem Fall sind die Familienstammbäume wie bei einem autosomal dominanten Erbgang, die zwei Geschlechter sind jedoch zu unterschiedlichem Masse betroffen. Die wichtigsten Merkmale solcher Erbgänge sind: 1./ vertikaler Familienstammbaum 2./ zweimal so viele Frauen wie Männer sind betroffen; 2:1 weiblicher : männlicher Anteil 3./ 50% der Nachkommen einer betroffenen Frau sind - geschlechtsunabhängig - auch betroffen 4./ die Töchter eines betroffenen Mannes sind immer krank, die Söhne immer gesund (der Vater vererbt den Töchtern immer ein Chromosom X, den Söhnen immer ein Chromosom Y) 5./ die Symptome von betroffenen Frauen sind oft milder und vielfältiger als die von betroffenen Männern Während die Symptome von homozygot dominanten XAXA Frauen nur durch X-Inaktivierung gelindert werden, hilft bei heterozygot XAXa Frauen auch die, von dem gesunden Xa Allel kodierter Proteinprodukt. Aus den, von Genen in der PAR1 Region auf dem X-Chromosom kodierten Merkmalen entsprechen die Erbgänge von Xg Blutgruppen Antigen und Amelogenesis Imperfecta (= angeborener Zahnschmelzhypoplasie), dem oben erwähnten Erbgang. Bei der letzteren (Amelogenesis Imperfecta) fehlt der Zahnschmelz und solche Zähne haben ein erhöhtes Risiko für Kariesbildung. Hypophosphatämie (auch als X-chromosomal dominante Vitamin D-resistente Rachitis oder familiäre phosphatämische Rachitis bekannt) ist die bekannteste Krankheit, die einem X-chromosomal dominanten Erbgang folgt. Die Krankheit ist vom Defekt eines Gens auf dem langen Arm des Chromosoms X kodiert. Die X-chromosomal dominante Hypophosphatämie ist von Minderwuchs, Rachitis und einem niedrigen Blut- 70 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Rolle des Geschlechts bei der Vererbung Phosphatspiegel charakterisiert. Die Krankheit kann durch Verabreichung von hohen Dosen von Vitamin D und Phosphat behandelt werden! Das Fragiles-X-Syndrom, ein Trinukleotiderkrankung (CGG), ist auch von einem X-chromosomal dominanten Erbgang charakterisiert. Diese Krankheit ist die häufigste Ursache kognitiver Behinderung bei Männern. Während die normale Zahl der Tripletts <30 ist, ist bei Betroffenen diese Zahl zwischen 200 und 2000. Zwischen 50 und 200 Repeats ist die Prämutationszone oder graue Zone. Betroffene Männer sind von einem schmalen Gesicht, abstehende Ohren, hervorstehendem Kinn und vergrößerten Hoden gekennzeichnet. Neben kognitiver Behinderung können auch Verhaltensstörungen und Stimmungsschwankungen auftreten. Das vom FMR1 Gen kodierte Protein bindet wahrscheinlich an die mRNA von anderen, für die Funktion des Nervensystems wichtigen Genen, und verursacht die Symptome auf diese Weise. Die Analyse von Familienstammbäumen mit einem X-chromosomalen Erbgang ist durch die X-chromosomal dominante Vererblichkeit mit männlicher Letalität erschwert. Da kein gesundes Allel vorhanden ist, sterben die hemizygot, männliche Emrbyonen bereits in utero ab. Meistens gibt es in diesen Familien nicht genug Nachkommen, um das, für solche Erbgänge typische 2:1 Frau:Mann Verhältnis erkennen zu können. Das Bloch-Sulzberger-Syndrom, auch als Incontinentia Pigmenti gekannt, ist durch Letalität bei Hemizygoten gekennzeichnet. Das Syndrom verursacht im frühen Kindesalter Hautblasungen, Pigmentationsstörungen, unvollständigen Haarausfall (Haarschwund), und erscheint also nur bei Frauen. Auch das Rett-Syndrom folgt einem X-chromosomal dominanten Erbgang mit Letalität bei Hemizygoten. Das RettSyndrom ist eine Störung der neuoronalen Entwicklung und ist teilweise epigenetisch bedingt. Die charakteristischen, fortschreitenden Symptome: Verlust von erworbenen Sprachfähigkeiten und motorische Fähigkeiten, Ataxie, Händeringen und epileptische Anfälle, die bei Mädchen erscheinen, sind durch die Mutation des Gens, der für das Methyl-Cytosin-bindenden MECP2 Protein kodiert, bedingt. 1.2. X-chromosomal rezessiver Erbgang (XR) Bis heute wurden mehr als 400 Merkmale mit einem X-chromosomal rezessiven Erbgang identifiziert. Diese Zahl ist viel größer als die geschätzte Zahl für ein einziges Chromosom bezüglich der Zahl der menschlichen Gene, und ist dadurch erklärt, dass die Erkundung und Identifizierung solcher Merkmale wegen des speziellen, vom männlichen Heterogametismus bedingten Erbgangs erleichtert ist. Unter diesen Merkmalen gibt es vergleichsweise harmlose, nur milde Symptome verursachende Merkmale, wie z.B. die Rot-GrünSehschwäche, aber auch schwere Symptome verursachende wie z.B. Hämophilie, und tödliche, wie z.B. die Duchenne-Muskeldystrophie. Charakteristisch für einen X-chromosomal rezessiven Erbgang sind: 1./ Zickzackverlauf: die Krankheit wird von Mutter auf Söhne, von Söhne auf deren Töchter übertragen 2./ die Betroffenen sind meistens Männer 3./ eine kranke Frau kann zu einem kranken Vater und einer obligat heterozygoten Frau geboren 4./ betroffene Männer sind meistens zu gesunden Eltern geboren, wo die Mutter eine obligate Überträgerin ist 5./ es gibt keine Vererbung von Mann auf Mann Obwohl die Hämophilie seit mindestens 4000 Jahren bekannt ist - bereits im Talmud wird es erwähnt, dass in Familien, wo ein Sohn eines Verwandten an der mütterlichen Seite nach der Beschneidung verblutet hat, dürfen männliche Neugeborene nicht beschnitten werden -, wurde die erste Mutation erst in 1986 genau beschrieben. Die X-chromosomal rezessive Hämophilie hat zwei Formen: Hämophilie A und Hämophilie B, die auf eine Mutation des Faktors VIII, bzw. IX zurückzuführen sind. Bei 40% der Betroffenen in Hämophilie A kommt eine spezielle Mutation des Faktor VIII Gens vor. Intron 22 des Gens beinhaltet zwei kleine Gene, deren Funktion nicht näher bekannt ist: F8A und F8B. F8A hat weitere Kopien auf dem Chromosom, etwa 400 kb entfernt. Zwischen diesen Kopien kann es während der Meiose zu einem intrachromosomalen Crossing-over kommen, was wiederum zur Inversion des betroffenen Abschnitts des Chromosoms führt, und damit das Gen des Faktors VIII in zwei, weit voneinander liegende Teile zerbricht. Das steht im Hintergrund des Mangels an dem Faktor und ist damit die Ursache der 71 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Rolle des Geschlechts bei der Vererbung Hämophilie. Die Mutation die zur Hämophilie führt, entsteht meistens in der väterlichen Keimbahn, während der Meiose. Die zahlreichen Zellteilungen, und die dadurch bedingte höhere Mutationsrate, die für die männliche Gametogenese charakteristisch sind, sind die Ursachen dafür, dass die Wahrscheinlichkeit für die Entstehung von - unter anderen - dieser Mutation bei den Nachkommen von älteren Vätern erhöht ist. Eine der bekanntesten und am besten untersuchten Zytoskelett-Erkrankungen ist die Muskeldystrophie des Typs Duchenne. Diese X-chromosomal rezessive Krankheit, die in der zweiten Hälfte des neunzehnten Jahrhunderts beschrieben wurde, fängt im 2-3. Lebensjahr mit Schwierigkeiten beim Aufstehen (GowersZeichen) an, und ist von zunehmender Muskelschwäche charakterisiert. Die betroffenen Jungen werden um das zehnte Lebensjahr auf den Rollstuhl angewiesen, und sterben um das zwanzigste Lebensjahr. Da die Krankheit relativ häufig auftritt (mit einer Prävalenz von ca. 1:3500), und bis heute noch unheilbar ist, ist es verständlich, dass sie intensiv untersucht wird. So wurde es entdeckt, dass die Ursache der Krankheit eine das zytoskeletale Protein Dystrophin betreffende Mutation ist. Dystrophin ist ein für Muskelzellen charakteristisches Protein, das am C-terminalen Ende über einen, aus sechs Komponenten bestehenden Glykoprotein Komplex zu dem Sarkolemma, am N-terminalen Ende zum zytoskeletalen Aktin heftet. Dystrophin ist das Produkt des bisher bekannten größten Gens, das 2400 kb lang ist, und dessen Transkription mehr als 16 Stunden lang dauert! Die Funktion des Dystrophins ist die Stabilisierung der Basalmembran der Muskelzellen. Die Mutation ist oft eine Leserasterverschiebung verursachende Deletion, die zum Mangel der Dystrophin Produktion oder zur Entstehung von funktionsunfähigen, strukturell veränderten Proteine führt. Erfolgt im Dystrophie-Gen nur eine in-frame Mutation, also wird nur ein kleiner Abschnitt deletiert, entsteht die Becker-Kiener-Muskeldystrophie, die von milderen Symptomen gekennzeichnet ist. So sind die Duchenne- und die Becker-Kiener-Muskeldystrophien von den mutanten Allelen desselben Gens verursacht, also es handelt sich hier um allelische Heterogenität. Da es bei dem Dystrophin Gen auch zahlreiche andere Mutationen (z.B. Punktmutationen, Duplikationen) vorkommen, besteht auch hier Multiple Allelie. Weil die betroffenen Männer bis zum geschlechtsreifen Alter meistens nicht überleben, sind sie außerstande, das mutierte Gen an ihren Nachkommen zu übertragen, und so sollte das subletale mutante Gen eigentlich aus der Population nach und nach verschwinden. Trotzdem ist die Prävalenz der Krankheit ziemlich konstant, was nur im Fall einer hohen Mutationsrate möglich ist, das heißt dass das fehlerhafte Gen immer neu produziert wird. Den Beobachtungen nach entstehen neue Deletionen, die das Dystrophin betreffen, in der mütterlichen Keimbahn, während die anderen Mutationstypen in der väterlichen Keimbahn entstehen. Die Ursache dieses Phänomens ist bisher unbekannt. Die X-Inaktivierung erschwert die Familienstammbaum-Analyse auch beim X-chromosomal rezessiven Erbgang. Der Phänotyp (das Erscheinungsbild) von heterozygot Frauen hängt von dem Anteil der Zellen mit einem gesunden XA bzw. mutanten Xa Chromosom. Falls das Gen für ein solubles Protein kodiert, wie z.B. die Gerinnungsfaktoren bei den Hämophilien, so gleichen die Wirkungen des gesunden und des mutierten Proteins einander aus. Deshalb sind betroffene Frauen in solchen Fällen asymptomatisch, obwohl sie biochemisch von dem Normalen abweichen. Bei Genprodukten, bei denen das Produkt spezifisch für einen bestimmten Zelltyp ist, werden mosaische Symptome auftreten. Ein Beispiel dafür ist die anhydrotische ektodermale Displasie, wobei die Mutation die mangelhafte Entwicklung oder Fehlbildung von Schweißdrüsen und Zähne verursacht. 2. Y-Chromosomaler (Holandrischer) Erbgang Bis heute wurde ein Y-chromosomaler Erbgang ausschließlich bei den mit der männlichen Geschlechtsdetermination und der Gametogenese verbundenen Genen, SRY und AZY, nachgewiesen. Zurzeit ist keine Krankheit mit einem holandrischen Erbgang bekannt, das nicht mit der männlichen Infertilität im Zusammenhang wäre! Das einzige, von Mann auf Mann übertragene körperliche Merkmal, ein starker Haarwuchs im äußeren Gehörgang, ist nicht holandrisch vererbt, aber das bezügliche Gen und Locus sind bisher unbekannt. Charakteristisch für den holandrischen Erbgang sind: 1./ ausschließlich Männer sind betroffen 2./ die Väter von betroffenen Männern sind auch betroffen 72 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Rolle des Geschlechts bei der Vererbung 3./ alle Söhne der betroffenen Männer sind auch betroffen 3. Vom Geschlecht beeinflusster Erbgang Bestimmte Merkmale werden in den zwei Geschlechtern unterschiedlich stark exprimiert. Dies kann von der, bei dem X-chromosomalen Erbgang bereits erwähnten, männlichen Letalität verursacht werden, aber auch davon, dass das Merkmal wegen der inneren Umgebung, also wegen der Wirkung von anderen Genen, abweichend oder gar nicht erscheint, das heißt dass die Erscheinungsform des Merkmals vom Geschlecht der betroffenen Person abhängt. Das bekannteste Beispiel für ein solches Merkmal ist die Glatze, die bei Männern einem autosomal dominanten Erbgang folgt, also sowohl bei Homo- als auch bei Heterozygoten exprimiert wird. In Frauen dagegen folgt das Merkmal einem rezessiven Erbgang, wird also nur in homozygoter Form und bei einem hohen Serum-Testosteron-Spiegel ausgeprägt. Auch eine Form des Pubertas Praecox erscheint meistens bei Männern. In diesem Fall ist der Rezeptor des luteinisierenden Hormons (LH) mutiert, und so löst es auch in der Abwesenheit des Ligands eine erhöhte Testosteronsynthese und damit verbunden somatische Veränderungen, die die frühe Pubertät kennzeichnen, aus. 4. Geschlechtslimitierter Erbgang In dem Fall, wenn das Gen ausschließlich in einem der beiden Geschlechter exprimiert wird, handelt es sich um einen geschlechtslimitierten Erbgang. Das klassische Beispiel dafür ist die Milchproduktion, da es Brustdrüsen bei beiden Geschlechtern vorhanden sind, die Milchproduktion dagegen nur für das weibliche Geschlecht typisch ist. Von Rinderzüchtern längst bekannt ist die Tatsache, dass die Milchproduktion der Kühe auch vom Stier, also dem Vater, abhängt. Nicht nur die Menge, sondern sogar die Zusammensetzung (z.B. Fettgehalt) der Milch wird von den väterlichen Genen beeinflusst. Die Präeklampsie, die jedes Jahr mehr als 50,000 Frauen das Leben kostet, kann auch von väterlichen Genen beeinflusst werden. In diesem Fall wird die Entwicklung der Plazenta von der väterlichen Hälfte des embryonalen Genoms so beeinflusst, dass es zu einer plötzlichen Erhöhung des Blutdrucks bei der Mutter führt. 5. Genomische Prägung Genomische Prägung (genomisches Imprinting) bezeichnet das Phänomen, dass in gewissen Fällen die Expression der Gene dadurch bedingt wird, von welcher Elternhälfte das Allel kommt. Wegen der Eigentümlichkeiten dieses Prozesses (DNA-Methylierung, Histon Modifikationen, Chromatin Remodeling) wird genomische Prägung in dem Kapitel ’Epigenetik’ behandelt. 6. Zytoplasmatischer Erbgang Die Rolle des Geschlechts wurde auch bei anderen, speziellen Erbgängen nachgewiesen, wie z.B. bei dem zytoplasmatischen Erbgang, wobei die, in der Eizelle gespeicherte Moleküle (mRNA, nicht-kodierende RNA, Proteine) nach der Befruchtung die Genexpression im Laufe der Ontogenese des Nachkommens beeinflussen können. So kann die Ausprägung der Gene unter den Nachkommen unterschiedlich sein, ohne die Entstehung einer Mutation im Genom. Diese Form der Vererbung ist also auch eine Folge von epigenetischen Veränderungen. Für dieses Phänomen gibt es zahlreiche Beispiele bei Fruchtfliegen (Drosophila) und anderen primitiven Organismen. So ist z.B. auch die Entstehung von rechtsgewundenen oder linksgewundenen Schneckenhäusern. Hier beeinflussen die während der Reifung der Eizelle von den Nährzellen produzierte Faktoren die Zygote. Während der frühen Zellteilungen der Ontogenese ergeben diese Einflüsse durch die änderung der Orientation der Mitosespindel - die entgegengesetzte Windung des Schneckenhauses. Ein transgenisches Mausmodell für die Erscheinung von Merkmalen die nicht im Genom der Nachkommen kodiert sind, sondern durch die RNA der väterlichen Spermien ausgelöst werden, existiert auch. Eine Rolle des zytoplasmatischen Erbgangs bei Menschen wurde bisher jedoch nicht nachgewiesen. 6.1. Mitochondriale Vererbung Die Rolle des Geschlechts bei der Vererbung von Mitochondrien ist unbestreitbar, da es hier um die ausschließliche mütterliche Vererbung von zytoplasmatischen Organellen handelt. Das Mittelstück des Spermiums gelingt bei der Befruchtung nicht in die Eizelle, deshalb beinhaltet der sich entwickelnde 73 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Rolle des Geschlechts bei der Vererbung Organismus nur Mitochondrien mütterlichen Ursprungs. Das bedeutet dass die Mutter ihre Mitochondrien an alle Nachkommen - Töchter und Söhne - vererbt, aber die darauffolgende Generation diese Mitochondrien nur von den Töchtern, nicht aber von den Söhnen bekommt. Da diese Form der mütterlichen Vererbung den Mendelschen Regeln nicht folgt, wird sie als eine Form der Nicht-Mendelschen Vererbung betrachtet. Zahlreiche Krankheiten entstehen wegen der Mutation der mitochondrialen DNA. Zurzeit kennen wir 59 mitochondriale Erkrankungen, die aber glücklicherweise alle selten sind. Da die wichtigste Funktion der Mitochondrien die oxidative Phosphorylation ist, betreffen die mitochondrialen Krankheiten (Mitochondriopathien) vor allem Organe mit hohem Energiebedarf (Muskulatur, Nervensystem). Eine der bekanntesten Mitochondriopathien ist die, einer Punktmutation zufolge entstehende, Lebersche Optikusatrophie (Leber hereditary optic neuropathy), die meistens von einem zentralen Gesichtsfeldausfallen (Verlust der zentralen Sehschärfe), das bei Jugendlichen oder jungen Erwachsenen auftritt, charakterisiert wird. Hier muss es bemerkt werden, dass es auch Mitochondriopathien gibt, die wegen der Mutation der nuklearen DNA entstehen, da die meisten mitochondrialen Proteine im Zellkern kodiert werden! Bei diesen Krankheiten gelten die Mendelschen Regeln, wie z.B. bei der chronisch progressiven externen Ophtalmoplegie, deren Gen auf dem langen Arm des Chromosoms 10 lokalisiert ist. Bei den bisher bekannten mitochondrialen Krankheiten kommen zwei verschiedene Mutationstypen vor: Punktmutationen und Deletionen. Der Schweregrad der Symptomen hängt von dem genauen Typ der Mutation ab, der Zahl der mutanten Mitochondrien und auch dem betroffenen Organ/Gewebe. Die Mehrheit der mitochondrialen Mutationen entsteht nicht in der Keimbahn, sondern somatisch. Außerdem unterscheidet der Anteil an mutanten Mitochondrien auch von Zelle zu Zelle innerhalb eines Gewebes. Deshalb unterscheiden sich auch die Zytoplasmen von solchen Zellen voneinander. Wenn die Zytoplasmen normale Mitochondrien oder Mitochondrien mit der gleichen Mutation besitzen, sprechen wir von Homoplasmie, wenn die Zellen unterschiedliche Mitochondrien - also normale und mutante Mitochondrien, oder Mitochondrien mit zwei verschiedenen Mutationen - besitzen, sprechen wir von Heteroplasmie. Offensichtlich variiert dadurch auch der Schweregrad der Symptome. Bei den Nachkommen von heteroplasmischen Müttern variieren die Symptome je nach der Zahl der mutanten Mitochondrien in der Eizelle. Neulich wurden Untersuchungen an mitochondrialen DNA und das Feststellen von Homo- und Heteroplasmie zur Identifizierung der Überreste der 1917 hingerichteten Zarenfamilie benutzt. Da Mitochondrien mütterlich vererbt werden, wurden die heute noch lebende Verwandten und ihre Nachkommen an der mütterlichen Seite der Zarenfamilie untersucht, und ihre mitochondriale DNA mit den aus den Überresten stammenden Proben verglichen. So konnten nicht nur die Überreste identifiziert, sondern auch festgestellt werden, dass Nikolaus II. Heteroplasmie hatte. Mitochondriale DNA-Untersuchungen könnten auch die Debatte um eine alte Frage der menschlichen Evolution entscheiden: ob die Vorfahren des heutigen Menschen (Homo sapiens) sich mit Neandertalschen Populationen gekreuzt haben (siehe auch das Kapitel „Genomik’)? Auch in der Populationsgenetik werden vergleichende Untersuchungen der mitochondrialen Mutationen benutzt, z.B. um den Ursprung und Abstammung von verschiedenen Völkern, Volksgruppen zu erkunden. Es stellte sich z.B. heraus, dass die amerikanischen Indianer Mitochondrien mit einer Deletion haben, also jedermann, der eine solche Deletion hat, muss mindestens eine indianische Ahne gehabt haben. Mitochondriale DNA Untersuchungen haben auch nachgewiesen, dass die Ungarn und Finnen nur sprachlich aber nicht genetisch verwandt sind! 7. X-Inaktivierung In somatischen Zellen werden sowohl die mütterliche als auch die väterliche Kopie beinahe aller autosomalen Gene exprimiert. Diese Genprodukte liegen also in doppelter Dosis vor. Eine Ausnahme bilden nur die so genannten imprintierten Gene. Die Expression der Gene, die vom X-Chromosom kodiert werden, wird davon beeinflusst ob das Chromosom X in einer Frau oder einem Mann vorkommt, und auch von der Tatsache, dass mit der Ausnahme der PAR Regionen, die Gene auf den Chromosomen X und Y keine Homologe haben. Daher würden die Gene auf dem Chromosom X in Frauen in doppelter Dosis exprimiert, als in Männern. Das wird jedoch von der Dosiskompensation verhindert. Das Entscheidende bei diesem Phänomen ist es, dass in Frauen nur die Gene auf dem einen Chromosom X exprimiert werden, weil das andere Chromosom X sich in der frühen embryonalen Entwicklung, während des Blastozystenstadiums, inaktiviert. Damit werden die Genprodukte für 74 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Rolle des Geschlechts bei der Vererbung die das Chromosom X kodiert, in gleicher Menge in Frauen mit XX Gonosomen und in Männern mit XY Gonosomen, vorliegen. Wir könnten auch sagen, dass Männer konstitutiv hemizygot sind, während Frauen der Inaktivierung zufolge funktionell hemizygot werden. Die Inaktivierung, nach ihrer Entdeckerin, Mary Lyon, auch Lyonisierung genannt, geschieht vollkommen zufällig, es wird entweder das mütterliche oder das väterliche Chromosom X inaktiviert, aber nach der Inaktivierung bleibt immer dasselbe inaktivierte Chromosom X in allen Tochterzellen der gegebenen Zelle inaktiv. Da die erste Inaktivierung in der Blastozyste erfolgt, sind in dem weiblichen Organismus Zellen mit aktivem väterlichen oder mütterlichen Chromosom X vollkommen random verteilt, also entsteht ein funktionelles Mosaik. Das bekannteste Beispiel für die X Inaktivierung ist das Schildpattmuster (Calico) bei Katzen. Nur Weibchen sind dreifarbig, mit schwarzen und roten Flecken. Die Größe und Verteilung der Flecken hängt davon ab, wo und wie viele Zellen mit einem inaktivierten Chromosom X, das für Rot oder Schwarz kodiert, vorhanden sind. Während die Inaktivierung bei somatischen Zellen immer zufällig ist, erfolgt die X-Inaktivierung in extraembryonalen Geweben (Plazenta) imprintiert, sie hängt also vom Ursprung des Chromosoms X (ob es väterlich oder mütterlich ist) ab. In der Plazenta ist immer das väterliche Chromosom X inaktiviert. Das inaktivierte Chromosom X ist in der Interphase nachweisbar. Anheftend an die Kernhülle findet sich das inaktivierte Chromosom X als Barr-Körperchen oder stark anfärbbares Geschlechtschromatin, in dem Zellkern von Epithelzellen. Der Trommelschlägel-Ansatz des segmentierten Kerns der neutrophilen Granulozyten ist eine eigentümliche Erscheinungsform des Barr-Körperchens. Die lichtmikroskopische Identifizierung des Barr-Körperchens ist schnell und einfach, und wurde früher z.B. bei Sportwettkämpfen als schneller Test (Barr-Test) zur Feststellung der sexuellen Identität der Teilnehmer/Innen benutzt. Die Inaktivierung wird vom XIST Gen bewirkt, das auf dem inaktivierten Chromosom X aktiv ist! Dieses Gen kodiert für eine konservative, lange, non-kodierende RNA mit tandem Repeats, die wahrscheinlich nur für das Beginnen der Inaktivierung, nicht aber für die Aufrechterhaltung der Inaktivierung verantwortlich ist. Diese RNA bewirkt Chromatin Remodeling (strukturelle Veränderungen im Chromatin), das schließlich zur X-Inaktivierung führt. Früher wurde es angenommen, dass das ganze Chromosom X inaktiviert wird. Heute wissen wir, dass die PAR Regionen nie inaktiviert werden! Auch andere, nicht inaktivierte Gene befinden sich auf dem Chromosom X, die teilweise funktionelle (also transkribierende) Homologe, teilweise nicht-funktionelle Homologe (Pseudogene) auf dem Chromosom Y haben (so sind z.B. das STS Gen - Steroid-Sulphatase -, oder das Anosmin Gen das für das Kallman-Syndrom verantwortlich ist). Bei anderen Arten mit heteromorphen Geschlechtschromosomen kommen auch andere Mechanismen der Dosiskompensation vor: z.B. das Chromosom X ist bei Fruchtfliegen Männchen zweimal so aktiv wie bei Weibchen. Das ergibt ein Verhältnis von 2:2 anstatt 1:1. Es ist auch möglich dass beide Geschlechtschromosomen nur halb so aktiv in Weibchen als in Männchen sind, und das ergibt dann schließlich ein Verhältnis von 1/2+1/2 : 1 = 1:1. Eine interessante Form der X-Inaktivierung ist die sogenannte schiefe (skewed) X-Inaktivierung. Das heißt dass in bestimmten Geweben immer nur dasselbe - z.B. immer das väterliche - Chromosom X inaktiviert wird, was zur schwerwiegenden Folgen führen kann. So wird es versucht, die Entstehung und die erhöhte weibliche Prävalenz von manchen autoimmun Erkrankungen damit zu erklären, dass die im Thymus reifende TLymphozyten nur Antigene die von einem Chromosom X kodiert werden, tolerieren, Antigene vom anderen Chromosom X jedoch nicht. So werden alle Zellen/Gewebe, wo das andere Chromosom X aktiv bleibt, von diesen Zellen als fremd erfunden, was zur Immunreaktion und somit zur Entstehung von autoimmunen Symptomen führt. Natürlich kann dieser Mechanismus nicht ausschließlich für die autoimmunen Erkrankungen verantwortlich sein, z.B. er erklärt den Auftritt solcher Erkrankungen in verschiedenen Lebensaltern nicht. Empfohlene Webseiten : www.hemophilia.org www.mda.org Strachan and Read (2004) Human www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=books Molecular Genetics 8. Fragen 75 Created by XMLmind XSL-FO Converter. (2nd edition, Garland) Die Rolle des Geschlechts bei der Vererbung 1. Was ist die Rolle der non-kodierenden RNA bei der zytoplasmatischen Vererbung? 2. Welche Mechanismen der Dosis-Kompensation kennen Sie? 3. Was kann die Rolle der schiefen X-Inaktivierung bei der Entstehung von autoimmunen Erkrankungen sein? 4. Wie kann man zwischen einem X-chromosomal dominanten und einem autosomalen dominanten Erbgang unterscheiden aufgrund eines Familienstammbaums? 5. Was sind Homo- und Heteroplasmie? 6. Zu welchen Folgen kann mütterliche Heteroplasmie führen? 7. Was wissen Sie über die Genetik der Präeklampsie? 8. Wovon ist Pubertas Praecox gekennzeichnet? 9. Welche Gene entkommen der X-Inaktivierung? 10. Wie unterscheiden sich die Symptome einer Trägerin, wenn das X-chromosomale Gen für ein solubles oder zell-gebundenes Produkt kodiert? 76 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 7. Die Genetik von biologischen Prozessen Sára Tóth In diesem Kapitel wird die Genetik von drei biologischen Prozessen kurz dargestellt: a. Entwicklungsgenetik b. Tumorgenetik c. Immungenetik 1. Entwicklungsgenetik Für die Biologie und Genetik war es für lange Zeit unerklärbar, wie aus einer einzigen befruchteten Eizelle so viele unterschiedliche, für den Organismus charakteristische Zellen hervorgehen können. In einem Erwachsenen finden sich mehr als 200 different Zelltypen, die das gleiche Erbgut (DNA) besitzen, funktionsmäßig doch sehr unterschiedlich sind. Nur eine epigenetische Betrachtungsweise ermöglicht die genauere Erklärung der Veränderungen während der Ontogenese. Während der Ontogenese wird das Entwicklungspotenzial immer mehr beschränkt, und so gelingen wir von der totipotenten Zygote, durch den pluripotenten Embryonalknotender Blastozyste und die multipotenten Zellen der Keimblätter zu den spezifischen unipotenten Zellen, die nur sich selbst ähnliche Tochterzellen produzieren können. Die Bestimmung des Schicksals einer Zelle beginnt mit einer naiven, für Vieles geeigneten Zelle, die sich genetisch für eine Differenzierung in einer bestimmten Richtung verpflichtet, und dann als Ergebnis von - zuerst reversiblen, später irreversiblen - Veränderungen ein endgültig differenziertes Stadium erreicht, wobei die Zelle alle Merkmale aufweist, die vom ursprünglichen genetischen Programm verwirklicht wurden. Schon sehr früh wurde es klar, dass die Ontogenese nichts anderes als eine Schicksalsbestimmung der Zellen (cell fate determination) ist. Dabei muss die differenzierende Zelle Informationen über ihre Abstammung (lineage) und Position, also über ihre eigene Identität, erhalten. Bei dem Vorigen spielen hauptsächlich intrinsische, also interne Faktoren (z.B. die symmetrische oder asymmetrische Art der Zellteilung), beim Letzteren extrinsische, also äußere Faktoren - Zelle-Zelle, Zelle-Matrix Wechselwirkungen oder soluble Morphogene - eine Rolle. Für die Asymmetrie der Zellkernteilung finden wir sowohl in der Neurogenese (Neuroblast → Neuron und Glia) als auch in der männlichen und weiblichen Gametogenese Beispiele. Bei dem Vorigen sind die Entstehung von Spermatogonien A und B, bei dem Letzteren das Polkörperchen und die Eizelle Ergebnis von asymmetrischen Zellteilungen. Die Asymmetrie geht nicht unbedingt mit morphologischen Unterschieden zusammen, oft sind es nur funktionelle Unterschiede zwischen den entstandenen Zellen (und in den aus diesen Zellen entstandenen Tochterzellen). Obwohl die Ursache der Asymmetrie nicht immer klar ist, wird es angenommen, dass die Produkte von bestimmten Genen in der Urzelle nicht gleichmäßig verbreitet sind, was - durch Beeinflussung der Achsel der Mitosespindel - zur Asymmetrie führt. Eine andere mögliche Ursache für die Asymmetrie sind die unterschiedliche Stabilität der verschiedenen Mikrotubuli (Kinetochor-, astrale und polare Mikrotubuli), und die Unterschiede der durch die Mikrotubuli generierten Ziehungskräfte. 1.1. Morphogene Morphogene sind soluble Moleküle, die, abhängig von ihren Konzentrationsgradienten, bei der Differenzierung der Zellen eine Rolle spielen. Ein solches Morphogen ist z.B. Activin, das konzentrationsabhängig verschiedene Zelltypen bestimmt (z.B. in einer Konzentration von ~0,1ng/ml verursacht es die Differenzierung von Mesenchyma, in einer Konzentration von 1,0 ng/ml die Differenzierung von quergestreiften Muskeln in vitro). Ein anderesMorphogen ist Sonic Hedgehog, das bei der Differenzierung von dem Neuralrohr und den Augenbläschen eine Rolle spielt. In dem Neuralrohr diffundiert das von den ventralen, zentralen Zellen produzierte Sonic Hedgehog allmählich zu den dorsalen Zellen. Wegen der geringen Sonic Hedgehog 77 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Genetik von biologischen Prozessen Konzentration differenzieren sich die dorsalen Zellen zu sensorischen Nervenzellen,während die ventralen und lateralen Zellen wegen der höheren Konzentration sich zu motorischen Zellen differenzieren. 1.2. Homöotische Gene Am Anfang der Ontogenese steuern die, von der Mutter bedingte Genprodukte die Embryonalentwicklung (siehe das Kapitel ’Die Rolle des Geschlechts bei der Vererbung’), dann werden von den eigenen Genen des Embryos die für die Segmentierung zuständige Gene exprimiert, die von HOX-Genen (homöotische Gene), die die positionelle Identität, die Längsachse (cranio-caudal Achse, bzw. proximo-distale Achse bei den Extremitäten) bestimmen, gefolgt werden. Homöotische Gene bilden eine evolutionell hoch konservierte große Genfamilie, bei der die räumliche Ordnung der Expression von Drosophila bis zu den Säugern übereinstimmt. Alle Mitglieder der Genfamilie kodieren für Transkriptionsfaktoren. Da die einzelnen Stufen der Ontogenese von diesen Genen durch eine Transkriptionsfaktor-Kaskade gesteuert werden, können sie als die MasterGene der Morphogenese betrachtet werden. Alle Mitglieder der Genfamilie verfügen über eine aus 60 Codons bestehende Sequenz, die Homöobox, die für die Homöodomäne - ein für die DNA-Bindung dieser Transkriptionsfaktoren zuständiges Proteinmotiv - kodiert. In Menschen gibt es 4 HOX Genfamilien: HOXA, HOXB, HOXC und HOXD, die eine unterschiedliche Anzahl von Genen umfassen. Den Zusammenhang zwischen den Hox-Genen und den Morphogenen haben Experimente über die Differenzierung der Extremitäten von Hühnchen Embryonen aufgeklärt. Die Zone polarisierender Aktivität (Zone of polaryzing activity =ZPA) der Extremitätenknospe exprimiert das Morphogen Sonic Hedgehog, dessen Konzentrationsgradient bewirkt, dass die Mitglieder der HoxD Familie in einer bestimmten Reihenfolge exprimiert werden und so die Gestaltung der Finger steuern. Auf den Zusammenhang des Morphogens und HOX Gens weist auch die Tatsache hin, dass eine Mutation des SHH (Indian-Sonic-Hedgehog Gen) Gens oder die eines HOXD Mitglieds beim Menschen die gleiche Fehlbildung, Holoprosencephalie verursacht. Natürlich sind zu einer normalen Differenzierung nicht nur diese frühen Schlüsselgene nötig, sondern auch von zahlreichen Wachstumsfaktoren aktivierten Transkriptionsfaktor-Kaskadensysteme, und die korrekte Regulierung von Apoptose und Zellproliferation. Die detaillierte Diskussion von diesen Letzteren würde jedoch die Grenzen dieses Kapitels überschreiten. 2. Genetik des Geschlechts Ein Zweig der Entwicklungsgenetik beschäftigt sich mit den Fragen der Sexdetermination und Geschlechtsdifferenzierung, also allen genetischen Prozessen, die die Entstehung eines männlichen oder weiblichen Phänotyps bewirken. 2.1. Differenzierung des männlichen Geschlechts bei Säugern Viele Jahre Forschungsarbeit waren zur Identifizierung des Gens, des molekulären Hauptschalters, das die Geschlechtsdifferenzierung in Gang setzt, nötig. Dieses Gen ist das, auf dem kurzen Arm des Y-Chromosoms, in der Nähe der pseudoautosomalen Region (PAR1) lokalisierte SRY Gen. Falls ein Y-Chromosom, auf dem sich ein normales SRY befindet, vorhanden ist, wird die männliche Geschlechtsdifferenzierung unbedingt erfolgen. Diese Rolle des SRY Gens wurde mithilfe von transgenen Maus-Experimenten bewiesen, bei denen die für das SRY Gen kodierende DNA Sequenz in die Embryonalknospe von weiblichen, XX Blastozysten mikroinjektiert wurde. Wenn diese Embryonen in austragende Mütter eingesetzt wurden, wurden Mäuse mit männlichen Geschlechtsorganen, äußeren Geschlechtsmerkmalen und sexuellem Benehmen geboren. Also das SRY Gen war zur Veränderung des Geschlechts genügend, es ist also tatsächlich das für die männliche Geschlechtsdifferenzierung zuständige Gen. Diese Mäuse waren aber nicht fertil, was - wie bei Patienten mit Klinefelter-Syndrom - durch das Vorhandensein von zwei X-chromosomen bedingt ist. SRY kodiert für ein Protein - das früher TDF, Hoden-determinierender Faktor (testis-determining factor) genannt wurde - , das, den früheren Vorstellungen entgegen, kein gewöhnlicher Transkriptionsfaktor ist, sondern ein Protein, das sich an die DNA koppelt und sie so beugt, dass die naheliegenden DNA-Sequenzen und Gene für klassische Transkriptionsfaktoren zugänglich werden. Das nächste Glied in der Kette der von SRY eingeleitete Differenzierungskaskade ist die Produktion von AntiMüller-Hormon (AMH) oder MIS (Müllerian inhibiting substance) durch die Sertoli-Zellen der entwickelnden Hoden. Dadurch wird die Differenzierung zum weiblichen Geschlecht, also die Entwicklung 78 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Genetik von biologischen Prozessen der Müller-Gänge, gehemmt. Kurz danach fangen die Leydig-Zellen an, Testosteron zu produzieren, und damit können sich die Gonaden und äußere Geschlechtsorgane entwickeln. Abbildung 7.1. Auf die Rolle des SRY Gens weisen - abgesehen von den bereits erwähnten Experimenten - auch Störungen der Geschlechtsdifferenzierung beim Menschen hin. So eine Störung ist die Geschlechtsreversion, wobei ein männlicher Phänotyp mit Chromosomen XX auftritt oder bei einem ’XY’ Genotyp ein weiblicher Phänotyp entsteht. Solche Störungen entstehen wenn sich die Stelle des obligaten Crossing-overs bei der väterlichen Meiose nicht in der PAR1 Region, sondern proximal davon, gegen das Zentromer findet. So gelingt das SRY Gen auf das X-Chromosom, wodurch ein fehlerhaftes, rekombinantes X-Chromosom und eine Y-Chromosom mit einer Mikrodeletion entstehen. Es gibt auch Geschlechtsrevertanten, bei denen ein weiblicher Phänotyp wegen einer Mutation des SRY Gens entsteht. In vielen Fällen ist der HMG (high mobility group) Teil des Proteins, also die DNA-bindende Domäne fehlerhaft, und da das Protein nicht an die DNA binden kann, verbleibt die Differenzierungskaskade. Obwohl SRY an sich zu der männlichen Geschlechtsdetermination, also zur Einleitung der Differenzierung, genügt, es sind zahlreiche andere, autosomale (z.B. das auf dem Chromosom 17 lokalisierte Gen SOX9 [SRY HMG box related genes] das für einen Transkriptionsfaktor kodiert) und auf dem XChromosom lokalisierte Gene zum Einschalten des SRY Gens, bzw. zum gesamten Prozess der Geschlechtsdifferenzierung, nötig. Zur normalen Geschlechtsdifferenzierung ist nicht nur die geeignete Menge und Qualität von Induktoren, sondern auch das Vorhandensein von adäquaten Rezeptoren nötig. Die Mutation von diesen führt auch zur Störung der Geschlechtsdifferenzierung. 79 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Genetik von biologischen Prozessen Der Androgenresistenz (androgen insensitivity syndrome), oder testikuläre Feminisierung (X-gebundene rezessive Erbkrankheit) hat die Aufmerksamkeit auf ein X-chromosomales Gen, das in der männlichen Geschlechtsdifferenzierung eine Rolle spielt, gelenkt. Betroffene Patienten weisen weibliche äußerliche Merkmale bei einem XY Genotyp und einem normalen Serum Testosteronspiegel auf, obwohl im Bauchraum Hoden zu finden sind. Da sich keine Eierstöcke oder Gebärmutter entwickeln, sind solche Patienten steril. Die Symptome wiesen darauf hin, dass der Defekt der Differenzierungskaskade „stromab‖ des Testosterons zu suchen ist (entweder das Rezeptor, oder die Weitergabe des Signals, oder die Zielgene müssen fehlerhaft sein). Schließlich wurden Mutationen des Testosteron-Rezeptors als Verursacher des Syndroms identifiziert. Das Krankheitsbild der vom Kallmann-Syndrom (olfaktogenitales Syndrom) betroffenen Patienten beweist die wichtige Rolle, die die Geschlechtshormone der Hypophyse bei der Geschlechtsdifferenzierung erfüllen. Charakteristisch für diese Krankheit sind die Abwesenheit der Hoden trotz eines XY Genotyps, und das Fehlen des Geruchssinns (Anosmie). Verursacht wird die Krankheit von der Deletion eines, proximal der PAR1 Region liegenden Gens des X-Chromosoms. Dieses Gen kodiert für ein Zell-Adhäsions-Protein, das in der Wanderung der Nervenzellen eine Rolle spielt. Während der Ontogenese wandern diese Nerven-Stammzellen zum Teil in den Geruchsnerv, zum Teil in den Hypothalamus ein. In diesem letzteren Ort produzieren diese Zellen die Gonadoliberin (Gonadotropin-releasing-Hormon, GnRH), und so haben sie, durch die Produktion von Gonadotropins von der Hypophyse, einen mittelbaren Einfluss auf die Differenzierung der Gonaden. Damit werden die ungewöhnlichen Symptome - Abwesenheit der Hoden und des Geruchssinns - begreifbar: Das Gen KAL1 hat zwar ein Homolog auf dem Y-Chromosom, das aber ein inaktives Pseudogen ist. 2.2. Differenzierung des weiblichen Geschlechts bei Säugern Zur Zeit der Entdeckung des SRY Gens, 1990, wurde es angenommen, dass die Differenzierung zum weiblichen Geschlecht ein passiver Prozess ist, das heißt dass in Abwesenheit eines Y-Chromosoms, also des SRY Gens, unbedingt ein weiblicher Organismus entsteht. Nach der Computer-Sprache wurde es „default pathway‖ genannt. Später, gestützt von Analysen von Familien mit der seltenen Frau-zu-Mann Geschlechtsreversion, wurde es herausgefunden, dass es auch ein Gen für weibliche Geschlechtsdetermination gibt: das R-spondin 1 (RSPO1). Falls dieses Gen mutiert ist, erscheint ein männlicher Phänotyp bei einem 46,XX Karyotyp. Im Gegensatz zu SRY, RSPO1 kodiert für einen solublen Ligand, der für das Membran-Rezeptor frizzled im Wettbewerb mit Faktor WNT4 steht, und den Signalweg β-catenin anschaltet, was zur Aktivierung von Zielgenen führt, die zur weiblichen Geschlechtsdetermination, später Differenzierung, führen. Natürlich, wie bei Männern, sind auch hier zahlreiche andere Transkriptionsfaktoren und Wachstumsfaktoren zur vollständigen Differenzierung nötig, und möglicherweise wissen wir über diese noch weniger als über die Faktoren die zur männlichen Geschlechtsdetermination und Differenzierung nötig sind. Soviel steht jedenfalls fest, dass die Komponenten der zwei Systeme einander hemmen. Unseren heutigen Kenntnissen nach sind die Faktoren, die für eine Differenzierung in die männliche oder weibliche Richtung, in den bipotenziellen Gonaden noch im Gleichgewicht, und erst später, mit der Expression des SRY und RSPO1, überwiegen die Faktoren in die eine oder andere Richtung. Eine Störung des Stoffwechsels der Steroide, die auch bei der weiblichen Geschlechtsdifferenzierung eine wichtige Rolle spielen, führt zu einer autosomalen rezessiven Krankheit, das Androgenitale Syndrom. Betroffene Mädchen haben bereits bei der Geburt bei einem XX Genotyp vermännlichte äußere Genitalien und eine vergrößerte Klitoris. Andere Symptome sind die Vergrößerung der Nebennierenrinden, Mangel an Cortisol, und Salzverlust. Die Krankheit entsteht wegen der Mutation der Steroid-21-Hydroxylase. Wegen der Mutation wird Progesteron nicht in Deoxycortisol, sondern in 17-Hydroxy-Progesteron umgesetzt. Das letztere hat eine Androgen-ähnliche Wirkung, und ist für die Vermännlichung der äußeren Genitalien verantwortlich. Obwohl in der europäischen Population die Häufigkeit der Krankheit 1:8000-25000 ist, ist sie bei den Yupik Eskimos sehr häufig mit einer Prävalenz von 1:500. Die wahrscheinliche Ursache dafür ist der Selektionsvorteil, den Heterozygoten gegen eine Infektion von Haemophilus influenzae B haben, die bei normalen Eskimos mit einem AA Genotyp nicht nur einen Schnupfen sondern auch Hirnhautentzündung verursachen kann. Zusammenfassend werden Störungen der Geschlechtsdifferenzierung vor allem durch die folgenden erblichen Veränderungen verursacht : a. Mutationen des SRY, seltener des RSPO1 Gens, und strukturelle Abnormalitäten, die diese Proteine betreffen b. Störungen des Steroiden-Stoffwechsels (Androgen/Östrogene) 80 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Genetik von biologischen Prozessen c. Mutationen des Androgen Rezeptors d. Defekte des AMH Gens e. X0/XY Mosaizismus f. Mutationen der Gene (z.B. SF1, WT-1), die bei der Differenzierung des Mesoderms, bzw. Harn/Geschlechtsanlagen eine Rolle spielen. Numerische Chromosomenaberrationen können bei der Geschlechtsentwicklung unter anderem zu Störungen führen, weil sie die den Prozess regulierenden Faktoren aus dem Gleichgewicht bringen können. Dabei beeinflussen all die oben erwähnten Abnormalitäten das chromosomale Geschlecht, oder verursachen eine Störung der Geschlechtsorgan-Entwicklung und die Entstehung des geschlechtsspezifischen Phänotyps (gonadales und genitales Geschlecht). Allerdings sind Krankheiten bekannt, bei denen sowohl das gonadale als auch das genitale Geschlecht ungestört, die Keimzellenbildung trotzdem defekt ist. Dafür sind meistens autosomale Mutationen verantwortlich, es kann z.B. um eine Störung des Stoffwechsels der Gonadotropine oder der Sexualhormone handeln, aber es ist auch eine Y-chromosomale vererbbare Unfruchtbarkeit, die von Genen (z.B. AZF=Azoospermiefaktor) auf dem langen Arm des Y-Chromosoms verursacht werden, bekannt. 3. Stammzellbiologie Die Erweiterung der entwicklungsbiologischen Kenntnissen hat es zu Beginn der 1980-er Jahre ermöglicht, embryonale Stammzellen von Mäusen, und später auch transgene Mäuse, zu erzeugen. Seit daher entwickeln sich, einander gegenseitig beeinflussend, diese zwei Bereiche. Die Erweiterung unserer Kenntnisse über Stammzellen hat zum großen Teil zur Erweiterung der genetischen Kenntnisse über Entwicklungsbiologie und Differenzierung beigetragen, und hat dazu geführt, dass es Forschern 1996 gelang, die erste menschliche embryonale Stammzelllinie zu begründen, was weiterhin zur Schaffung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS=induced pluripotent stem cells) geführt hat. Die in den, von der Embryonalknospe einer Blastozyste stammenden, pluripotenten embryonalen Stammzellen steckenden Möglichkeiten wurden früh erkannt, und - durch die sorgfältige Auswahl der Zellkulturbedingungen und die Differenzierung in einen bestimmten Zelltyp, z.B. zu Insulin-produzierenden β-Zellen oder dopaminerge Neuronen - ist inzwischen auch ihre therapeutische Anwendung in greifbare Nähe gelangen. Die Anwendung von humanen embryonalen Stammzellen hat aber schwerwiegende ethische Probleme mitgebracht. Woher sollen die angewendeten Embryos stammen? Dürfen für ausschließliche Forschungszwecke menschliche Embryonen produziert werden? Was sollte man mit den überzähligen Embryonen, die für eine in vitro Fertilisation produziert, aber nicht implantiert wurden, tun? Verschiedene Länder haben unterschiedliche Antworten auf diese Fragen gegeben, und in ihren Gesetzen kodifiziert. In Ungarn dürfen keine neuen menschlichen Stammzelllinien produziert werden, im Besitz von bestimmten Genehmigungen darf man aber mit bestimmten Stammzelllinien, die früher im Ausland produziert wurden, arbeiten. Deshalb hat die internationale wissenschaftliche Gemeinde die - 2012 mit dem Nobel-Preis ausgezeichneten Ergebnisse von Shinya Yamanaka mit großer Anerkennung empfangen. Mithilfe seiner Methode können bereits differenzierte, erwachsene, unipotente Zellen in einen Zustand versetzt werden, der den pluripotenten Zellen einer Embryonalknospe oder Epiblast ähnlich ist. Diese Zellen werden induzierte pluripotente Stammzellen genannt. Zur Reprogrammierung wurden Kombinationen von Pluripotenz-Faktoren, deren Rolle aus der Entwicklungsgenetik bereits bekannt war, eingesetzt, wobei Zielzellen mit Plasmide die für diese Faktoren kodierende Gene beinhalteten, transfektiert wurden. Da es unter diesen Faktoren (LIF, SOX2, KLF4, cMYC) auch Onkogene (cMYC) gibt, wäre die therapeutische Anwendung von Zellen, die auf diese Weise produziert wurden, nicht ohne Gefahren. Deshalb werden heutzutage zahlreiche andere Methoden zur Reprogrammierung benutzt, z.B. Anwendung von einer onkogenfreien Kombination, oder einer Mischung von ausschließlich für die Pluripotenz verantwortlichen Proteinen. Obwohl die auf diese Weise erzeugten Zellen, den embryonalen Stammzellen ähnlich, gesteuert differenziert werden können, und bei einer therapeutischen Anwendung keine immunologische Unverträglichkeit entstünde, da der Donor und Rezipient dieselbe Person wäre, sind die epigenetische Veränderungen während der Differenzierung und der Reprogrammierung leider nicht in aller Einzelheiten bekannt. Vor allem sind die Einzelheiten der Ausbildung und Auslöschung von epigenetischen Mustern unbekannt, und so können wir diese zurzeit auch nicht steuern. Trotzdem ist die Forschung an iPS Zellen sowohl aus entwicklungsgenetischer Hinsicht als auch für therapeutische Zwecke von enormer Bedeutung, da zahlreiche Krankheiten mithilfe von diesen Zellen geheilt 81 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Genetik von biologischen Prozessen werden könnten, und die vom Mangel an Donor-Organen resultierenden Schwierigkeiten überwunden werden könnten. 4. Onkogenetik Obwohl Sie über die Ursachen und den Verlauf der Karzinogenese auch im Rahmen von anderen Fächern hören werden, werden hier die bedeutendsten genetischen Vorgänge der Tumorbildung zusammengefasst, da Tumoren als genetische Erkrankungen betrachtet werden können. Krebserkrankungen betreffen 1 von 3 Personen weltweit, also jede beliebige Person hat eine 40% Chance, an einem Tumor zu erkranken. Bereits diese Häufigkeit weist darauf hin, dass es sich bei der Entstehung von Tumoren nicht um monogene (monogenetische) Erkrankungen handelt. Eine Ausnahme bilden solche seltene monogene Tumorerkrankungen, wie z.B. das Retinoblastom, oder das Li-Fraumeni-Syndrom. Im Hintergrund der Tumorbildung stehen zahlreiche genetische Prädispositionen (Mutationen) und äussere Einflüsse. Krebserkrankungen sind eine Gruppe von Erkrankungen, die von der ungehemmten Proliferation und Ausbreitung von mutierten Zellen im Körper charakterisiert sind. Die Markenzeichen der Karzinogenese sind die Folgenden: a. Unabhängigkeit von Wachstumsfaktoren b. Ungehemmte Proliferation c. Mangel an wachstumshemmenden Signalübertragunsgwegen d. Vermeidung der Apoptose e. Angiogenese f. Fähigkeit zur Metastase. Die Mutationen können entweder spontan, oder von äußeren Einflüssen induziert - durch Mechanismen, die im Kapitel ’Mutationen und Polymorphismen diskutiert werden - entstehen. Die meisten mutagenen Substanzen sind auch Karzinogene. Bei der Karzinogenese spielen Mutationen, die drei große Genfamilien betreffen, eine Schlüsselrolle. Die Onkogene, die Tumorsuppressorgene und die sogenannten Mutator-Gene. Mutator-Gene beteiligen sich in der DNA Reparatur (siehe dort), deshalb kann die defekte Funktion von diesen Genen zur Festsetzung von Tumor-induzierenden Mutationen im Genom führen. 4.1. Onkogene Onkogene sind normale Gene mit einer veränderten Funktion (Protoonkogene), die im wesentlichen in der Regulation des Zellzyklus eine Rolle spielen. Solche Gene sind die Wachstumsfaktoren (z.B. EGFR), die Komponenten der Signalübertragungswege deren, und die Gene die für Transkriptionsfaktoren kodieren. Die Mutationen dieser Gene können zum ungehemmten, von Wachstumsfaktoren unabhängigen Wachstum führen: z.B. das ist das Ergebnis bei der konstitutiven Aktivierung von mutanten Rezeptor Tyrosin-Kinasen. Nicht nur Punktmutationen, sondern auch Genamplifikationen und Chromosomen-Translokationen (die t(9;22) Translokation bei Chronischen Myeloischen Leukämie, die zur Entstehung des Ph1 Chromosoms führt, das für ein Fusionsprotein mit erhöhter Tyrosin-Kinase Aktivität kodiert) können zur Aktivierung von Onkogenen führen. Neben klassischen genetischen Veränderungen können auch epigenetische Veränderungen – Epimutationen – zur Aktivierung von Onkogenen führen. Es ist bekannt, dass die Hypomethylierung des Genoms, die mit fortschreitendem Alter steigert, oft Onkogene betrifft. Damit kann nicht nur die erhöhte Aktivität der Onkogene erklärt werden, sondern auch die Erscheinung, dass die Häufigkeit von gewissen Tumoren mit zunehmendem Alter wächst. Ein seltsames Beispiel für den Zusammenhang zwischen Onkogenen und Epigenetik ist das imprintierte IGF2 (insulinähnliches Wachstumsfaktor 2) Gen. In gesunden Dickdarmepithelzellen wird nur das mütterliche Allel exprimiert, bei Dickdarm-Tumoren geht 82 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Genetik von biologischen Prozessen das Imprinting verloren (LOI=loss of imprinting), das väterliche Allel wird auch exprimiert, und folglich entsteht das Tumor. 4.2. Tumorsuppressoren Infolge von Mutationen können Tumorsuppressorgene ihre wachstumshemmende Aktivität verlieren. Gesunde Tumorsuppressoren, Hand in Hand mit den Protoonkogenen, sind für die Regulierung des Zellzyklus und die Unversehrtheit des Genoms verantwortlich. Falls Tumorsuppressoren einen Defekt im Genom wahrnehmen, bringen sie den Zellzyklus zum Stillstand und ’veranlassen’ die Zelle zur Reparatur. Nach diesen zwei Funktionen wird es zwischen „Pförtnern” (gate keeper) und „Hausmeistern” (carekaters) unterschieden. In der ersten Kategorie gehören die klassischen Tumorsuppressoren, z.B. die RB und TP53 Gene, in der letzteren Kategorie gehören die DNA Reparatur-Gene (z.B. die MLH1 und MSH2 Mismatch-Reparatur-Gene), die nach anderen Kategorisierungen auch Mutatoren genannt werden. Bei Protoonkogenen genügt ein mutantes Allel zur Onkogenese, also diese Mutationen sind dominant, bei Tumorsuppressoren ist die Mutation von beiden Allelen zum Verlust der wachstumshemmenden Funktion nötig. Hier ist die Mutation also rezessiv. Bei caretaker oder Mutator-Genen trägt auch Haploinsuffizienz zur Onkogenese bei, da falls ein Allel mutiert ist, ist das andere, gesunde Allel nur zur verringerten Funktion fähig. In vielen Fällen ist das schon zur Entstehung eines Tumors genügend, weil die Anzahl der nicht reparierten Mutationen steigert. Während der Untersuchung von Tumorsuppressoren (RB) hat Knudson seine zwei-Mutation-Theorie (Knudsonhypothese, two-hit theory)erstellt. Nach dieser Hypothese sind zur Entstehung eines Tumors zwei, einenader folgenden Mutationen von Tumorsuppressorgenen nötig. Meistens ist die erste Mutation bereits geerbt vorhanden (z.B. familiäres Retinoblastom), und die andere Mutation entsteht nur in einem Organ oder in gewissen Organen, und führt so zum Verlust der vorigen Heterozygotie, und wegen des homozygot mutierten Tumorsuppressor Gens entsteht der Tumor. In den sporadischen Varianten entstehen beide Mutationen neu in dem Betroffenen. Dieses Phänomen wird auch Verlust der Heterozygotie=loss of heterozygosity=LOH genannt, und mit den Methoden der modernen Molekularbiologie könnte es zur Identifizierung von Präkanzerose benutzt werden. Wie bei Onkogenen spielen Epigenetik und Epimutationen auch bei Tumorsuppressor Genen eine Rolle. Die CpG Dinukleotiden der Promotor Region von gesunden Tumorsuppressor Genen sind nicht methyliert, was die Expression des Gens ermöglicht. Diese Regionen sind in Tumoren oft hypermethyliert, was die Transkription des Gens hemmt, wodurch das Gen die Fähigkeit zur Hemmung von übermässigen Zellproliferation verliert. Die Entstehung von Komplexen von Tumorsuppressor Proteinen und HDAC (Histon Deacetylasen) ist ein anderer Zusammenhang mit Epigenetik. Gesunde Tumorsuppressor Proteine bilden einen Komplex mit HDAC, was Chromatin Remodelling, also Heterochromatin-Bildung, bewirkt, was die Funktion der Gene der betroffenen Region hemmt, was wiederum zur Inhibierung der Zellproliferation führt. Mutierte Tumorsuppressoren sind dazu ausserstande, was zur Erhaltung der euchromatischen Struktur und Fortsetzung der Proliferation führt. 4.3. Anti-Apoptotische Gene Das Tumorsuppressor Gen TP53, „the guardian of the genom‖, spielt nicht nur in der Anhaltung des Zellzyklus und Einschaltung der DNA-Reparatur nach Beschädigung der DNA eine Rolle, sondern auch in der Einschaltung der Apoptose, wenn der Defekt nicht repariert werden kann. Das heisst, dass infolge der Mutation dieses Gens wird der Zellzyklus fortgesetzt, und überleben die mutierten, defekten Zellen. Die Mutation des TP53 trägt also von beiden Seiten zur Tumorentstehung bei. Das erklärt die Entstehung von vielfältigen Tumoren in multiplen Organen bei dem Li-Fraumeni-Syndrom, bei dem das TP53 Gen mutiert ist. Das defekte Funktionieren des intrinsischen Wegs der Apoptose, z.B. wegen der Mutation des p53 und/oder desmitochondriellen Bcl-2, kann nicht nur das Verbleiben der Apoptose, sondern auch die ChemotherapieResistanz von Tumorzellen verursachen. 4.4. Telomerase Es ist bekannt, dass eukaryonte DNA in somatischen Zellen, wegen der Eigentümlichkeiten der Replikation, von Zellteilung zu Zellteilung kürzer wird. Diese Kürzung betrifft die repetitiven telomerischen und subtelomerischen Abschnitte der Chromosomen, und führt, nach ungefähr 50-70 Zellteilungen, zur Veralterung 83 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Genetik von biologischen Prozessen der Zelle und zur Anhaltung der Zellteilungen. In den Zellen der Keimbahn ist das Enzym Telomerase, das aus einer reversen Transkriptase und einer mit dem telomerischen DNA-Abschnitt komplementären RNA besteht, imstande, die ursprüngliche Telomerenlänge wiederherzustellen. Dieser Mechanismus ist für die Aufrechterhaltung der ursprünglichen Länge des Genoms von Generation zu Generation, von grundsätzlicher Bedeutung. Tumorzellen sind auch imstande, die Telomerenlänge, durch die Induktion des Telomerase Enzyms oder einer, auf Rekombination basierenden, alternativen Telomerenverlängerung, wiederherzustellen. Falls eine Zelle, wegen verschiedenen Mutationen, die den - von extrem kurzen Telomeren normalerweise verursachten - Zelltod vermeidet, wird deren Genom instabil, was, durch die früher erwähnten Mutationen (Amplifikation, Translokation) zur onkongenen Transformation der Zelle führt. Dieser Prozess wird von den mutierten Genen induzierten Telomerase weiter verstärkt (z.B. das Gen c-MYC ist imstande, die Telomerase durch Bindung an deren Promotor, zu aktivieren!). 5. Immungenetik Im Rahmen des Immunologiestudiums wurden bereits viele, für die Funktion des Immunsystems grundsätzliche genetische Prozesse erwähnt. Vielleicht am meisten interessant von diesen ist der Prozess, der zur enormen Diversität der T- und B-Zell-Rezeptoren (Immunglobuline) führt. Alle Menschen können ungefähr 1011 verschiedene Immunglobuline herstellen, obwohl das haploide menschliche Genom aus ’lediglich’ 3x10 9 Basenpaaren besteht. Dieses Paradox wird von der somatischen Rekombination und somatischen Mutationen aufgelöst. Im menschlichen Genom gibt es drei Immunglobulin (Ig)/B-Zell-Rezeptor (BCR) Loci (IGH, IGK undIGL), die für die schwere Kette und die zwei leichten Ketten (κ und λ) kodieren, und vier T-Zell-Rezeptor (TCR) Loci (TRA, TRB, TRG und TRD), die die Synthese der vier TCR-Ketten (α,β,γ und δ) ermöglichen. Trotz der enormen Diversität sind alle B- und T-Zellen monospezifisch, das heißt dass eine Zelle nur eine bestimmte Ig-Kette oder TCR-Heterodimere produzieren kann, die für ein einziges Antigen spezifisch sind. Die verschiedenen B- und T-Zellen experimieren verschiedene Ig-Ketten oder TCR-Heterodimeren, die für verschiedene Antigene spezifisch sind. So ermöglicht die Population von Milliarden von Immunzellen die Erkennung von praktisch allen Antigenen. Die Diversität ist der speziellen Struktur und Expression der bezüglichen Genen zu verdanken. Sehen wir uns z.B. die Immunglobuline an. Alle Immunoglobuline bestehen aus 4 Ketten, zwei schwere (H) und zwei leichte (L) Ketten. Alle Ketten haben eine variable (V) und eine konstante (C) Region. Im menschlichen Genom gibt es keine komplette Gene, die für schwere und leichte Immunglobulin-Ketten kodieren. Stattdessen kodieren zahlreiche, voneinander separierte Gene für H und L-Ketten. Die variable Region der schweren Kette besteht aus drei Domänen: V (variable), D (diversity) und J (joining) (Abb. 1). Im Fall der leichten Kette gibt es keinen D Segment. Im Lokus H gibt es ungefähr 200 V, 30 D und 9 J Gene (davon 3 Pseudogene). Diese Gene sind in nicht-immun-Organen inaktiv, und werden nur während der Reifung der T- und B-Zellen aktiv. In den zentralen Immunorganen kombinieren sich je eins von diesen Genen (ein V, ein D und ein J) random miteinander, und werden so geordnet, dass ein Fusionsexon entsteht, das für die variablen Regionen der H Kette kodiert. Dieser Prozess wird somatische Rekombination genannt, und kommt durch DNA Spleißen zustande. An der Rekombination der V-D-J Gene nehmen auch die, von den Rekombination-aktivierendes-Gen 1 und 2 Genen kodierten, RAG1 und RAG2 Enzyme teil. In der schweren Kette der Immunglobuline kommt eine D-J und V-D-J Rekombination zustande, bei der leichten Kette kommt eine V-JC Rekombination in der λ-Kette und eine V-J Rekombination in der κ-Kette zustande. Die weiteren Rekombinationen von sowohl der schweren (VDJ-C) als auch der leichten (VJ-C) Ketten entstehen durch mRNA Spleißen. Abbildung 7.2. Somatische Rekombination der V-D-J Gene für die schwere Kette der Immunglobuline - http://en.wikipedia.org/wiki/File:VDJ_recombination.png; 2013. 07. 03. 84 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Genetik von biologischen Prozessen Beim Wechsel von membranverankerten IgM C Domäne zur solublen IgM C Domäne erfolgt auch RNA Spleißen. Die somatische Rekombination der T-Zell-Rezeptoren findet in einer ähnlichen Ordnung wie bei den Immunglobulinen statt. Die Diversität wird dadurch weitergesteigert, dass die Rekombination in 5’ und 3’ Richtungen um einige Basen verschoben werden kann, und die RAG Rekombinase Doppelstrangbrüche verursachen können, die ungenau repariert werden. Durch diese Mechanismen wird die Spezifizität der Antikörper noch unterschiedlicher, noch diverser. Es gibt auch einen, somatische Hypermutation genannten, Mechanismus, mithilfe dessen zufällige Basenpaarenaustausch-Mutationen entstehen im V-Segment der B-Zellen. Dieser Mechanismus existiert in keiner anderen Zelle, und betrifft keine anderen Gene, nur eine ungefähr 1.5 kB Region, und kommt nur bei der Aktivierung einer B-Zelle zustande. Wenn die B-Zelle auf den Einfluss eines Antigens sich teilt, wird die Antigen-bindende Region durch somatische Hypermutation modifiziert. Die, das Antigen am strengsten bindende B-Zellen überleben, und teilen sich mehr, als die anderen B-Zellen. Dieser Vorgang ist die Affinitätsreifung. Dieser Prozess wird vom Enzym Activation-Induced-Cytidin-Deaminase (AID) ausgelöst, das Uracyl Basen zu Cytidin desaminiert. Dieses nicht genau reparierte Basenpaar-Mismatch ergibt, durch verschiedene Mechanismen, mehrere unterschiedliche Mutationen. Abbildung 7.3. http://pandasthumb.org/archives/2006/07/3-recent-report.html; 2013. 07.03. 85 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Genetik von biologischen Prozessen Der dritte Fall der somatischen Rekombination ist der Klassenwechsel der Immunglobuline. Aufgrund ihrer C-Region können die schweren Ketten in 5 Klassen unterteilt werden. Alle H Gene beinhalten alle 5 C Regionen, in einer Verordnung, bei der die C Region die für IgM kodiert, zu der V-Region am nächsten liegt. Die IgG und IgA Klassen haben zahlreiche andere C Regionen, die diese Immunglobuline in mehrere Unterklassen unterteilen. IgM ist der erste Immunglobulin Typ, der von jeder B-Zelle produziert wird. Nach einiger Zeit wechselt die B-Zelle zu einer anderen Klasse von Immunglobulin. Das geschieht mithilfe eines DNA-Spleißens, was zwischen den VDJ und C Segmenten stattfindet und dafür sorgt, dass eine neue Ig Klasse entsteht. Da die variable Region dabei unverändert bleibt, verändert sich die Antigen-Spezifizität des Immunglobulins nicht. Die Affinität gegen das bestimmte Antigen bleibt unverändert, nur bindet sich der Antikörper an unterschiedlichen Effektor-Molekülen. Abbildung 7.4. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Class_switch_recombination.png 2013. 07. 03. 86 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Genetik von biologischen Prozessen Diese Diversifikations-Mechanismen ergeben oft funktionsunfähige Ig Gene, die entweder Stop Codons beinhalten oder eine Leseasterverschiebung aufweisen. Die entwickelnden B-Zellen benutzen einen „allele Exklusion” genannten Mechanismus, der dafür sorgt, dass alle B-Zellen nur eine aktive L-Kette und eine aktive H-Kette produzieren. Die Zelle probiert zunächst alle LGene und alle H-Gene: wenn eine aktive Kette entsteht, braucht die Zelle keine weiteren DNA-Spleißen. Entsteht jedoch ein funktionsunfähiges Immunglobulin, probiert die Zelle das nächste L- oder H-Gen. Dieser Vorgang setzt sich solange fort, bis eine aktive H- und L-Kette entsteht, oder bis alle Gene probiert worden sind (im letzteren Fall vergeht aber die Zelle). Neben den oben genannten Mechanismen spielen auch bestimmte epigenetische Mechanismen in der Diversifikation eine Rolle, indem durch Histon-Modifikationen und Chromatin-Remodelling ein Rekombinationszentrumentsteht, womit die Ig oder TCR-Regionen für die RAG Rekombinasen zugänglich werden. Die Rolle der Epigenetik in Immunologie ist auch von einer, früher nicht erwähnten, monogenen Erkrankung, dem ICF-Syndrom, unterstützt. Diese Erkrankung, die durch Immundefizienz (Agammaglobulinämie), die zentromerische Instabilität der Chromosomen 1, 9 und 16, und faciale Dysmorphie charakterisiert ist, entsteht durch die Mutation eines autosomalen Gens auf dem Chromosom 20, DNMT3B, das für eine DNA de novo Methyltransferase kodiert. Obwohl die Mutation nur ein einziges Gen betrifft, entstehen die Symptome der Krankheit wegen der fehlerhaften Methylierung von zahlreichen Genen, genauer gesagt wegen des Mangels einer örtlich und zeitlich geeigneten Methylierung. 87 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Die Genetik von biologischen Prozessen Empfohlene Webseiten : www.imgt.org www.p53.iarc.fr6index.html www.methylgene.com www.cancer.org www.isscr.org 6. Fragen 1. Welche Mechanismen der Onkogen-Aktivierung kennen Sie? 2. Wofür steht LOI? 3. Was sind die Aufgaben der caretaker und gatekeeper Gene? 4. Was wissen Sie von iPS Zellen? 5. Was ist, und wie funktioniert Sonic Hedgehog? 6. Was ist die Rolle der HOX Gene? 7. Was ist die Rolle von SRY und RSPO1? 8. Nennen Sie Beispiele für epigenetische Veränderungen bezüglich der Karzinogenese! 9. Schildern Sie die Knudson-Hypothese! 10. Warum kann die somatische Rekombination nicht als ein epigenetischer Mechanismus betrachtet werden? 88 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 8. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom Csaba Szalai 1. Die Genomik Zuerst definieren wir, was das Genom ist. Genom: die Gesamtheit der vererbbaren Informationen einer Zelle, also die Gesamtheit der DNA in den Chromosomen und Mitochondrien. Genomik ist die Untersuchung der Funktionen, der Struktur und der Wechselwirkungen des Genoms und die entsprechende Methode. Aber der Begriff Genomik umfasst einen breiteren Anwendungsbereich der wissenschaftlichen Untersuchung verbundenen Technologien als wenn Genomik wurde zuerst berücksichtigt. Neben den Untersuchungen der DNA auch die Untersuchungen der RNA (Transkriptomik), der Proteine (Proteomik) und die Bioinformatik gehören zur Genomik. Weil in Englisch die Genomik (Genomics), und auch die meisten anderen wissenschaftlichen Felder mit „omics― enden, die Omics (die Omik) ist häufig verwendet, als unabhängiges wissenschaftliches Feld (http://en.wikipedia.org/wiki/Omics; http://www.omicsworld.com/). Manchmal ist die Genomik auch als Synonym der molekularischen Systembiologie verwendet. Das Ziel der Systembiologie ist, ein integriertes Bild aller regulatorischen Prozesse über alle Ebenen, vom Genom über das Proteom, zu den Organellen bis hin zum Verhalten und zur Biomechanik des Gesamtorganismus zu bekommen. Nach dieser Definition ist die Genomik eher ein Teil der Systembiologie als umgekehrt. Die Genomik kann in mehrere Fachgebiete aufgeteilt werden: Strukturelle Genomik, Funktionelle Genomik, Vergleichende Genomik, Pharmakogenomik, Humangenomik, Medizinische Genomik usw. In diesem Buch werden die letzten drei Fachgebiete untersucht. Es gibt noch eine wichtige Frage. Was ist der Unterschied zwischen Genetik und Genomik? Manchmal sind die zwei Begriffe als Synonyme verwendet. Und es gibt auch keinen scharfen Unterschied zwischen den zwei Gebieten. Aber im Allgemeinen ist die Untersuchung der Rollen und Funktionen der einzelnen Gene ein Schwerpunkt der Genetik, und es ist ein gemeinsames Thema der modernen medizinischen und biologischen Forschung. Forschungen einzelner Gene fallen nicht in die Definition der Genomik, es sei denn, wenn das Ziel die Wirkung der Gene auf das gesamte Genom-Netzwerk aufzuklären ist. Weil Genomik zur Systembiologie gehört, erfordert sie viel komplexere Methoden. 2. Das Humangenomprojekt (HGP) Für den großen Sprung in unserer Kenntnis in der Genomik können wir dem Humangenomprojekt (HGP) danken. Unten stellen wir die kurze Geschichte des HGPs dar (aus dem deutschen Wikipedia): Das Projekt wurde in den USA im Oktober 1990 als Projekt eines öffentlich finanzierten internationalen Forschungsverbunds gegründet. Geleitet wurde das HGP zuerst von James Watson, einem der Entdecker der DNA-Struktur. 1992 verließ er das Projekt jedoch nach einem Streit mit NIH-Chef Bernadine Healy, weil er Healys Versuche ablehnte, Gensequenzen patentieren zu lassen. Sein Nachfolger wurde der renommierte Genetiker Francis Collins. Am Projekt nahmen zu Beginn über 1.000 Wissenschaftler in 40 Ländern teil. Ziel war die Sequenzierung des menschlichen Genoms bis 2005. 1992 veröffentlichte das Projekt Genkarten für die Chromosomen 21 und Y. Im Juni 1995 schloss sich auch Deutschland dem internationalen Humangenomprojekt der Human Genome Organisation an und nahm seine Arbeit ein Jahr darauf auf. Das Deutsche Humangenomprojekt (DHGP) wird durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung und die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefördert. Die Human Genome Organisation bekam 1998 durch die neu gegründete US-Firma Celera geleitet von J. Craig Venterprivate Konkurrenz. Bis 1999 erfolgte nur die Sequenzierung des Chromosoms 22. Das HGP fand in der Öffentlichkeit seinen vorläufigen Höhepunkt, als 2001 unabhängig von 89 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom beiden Forschungsunternehmungen die vollständige Sequenzierung des menschlichen Genoms verkündet wurde, die in den Medien häufig als „Entschlüsselung― tituliert wurde. 2003 wurde endgültig die Fertigstellung im Rahmen der angelegten Maßstäbe verkündet. Das Deutsche Humangenomprojekt beendete erfolgreich im Juni 2004 seine Aktivitäten. Auf die Arbeiten des Deutschen Humangenomprojekts aufbauend, fördert das Bundesministerium für Bildung und Forschung seit 2001 das Nationale Genomforschungsnetz (NGFN). Im Mittelpunkt der Arbeiten steht die Erforschung der genetischen Ursachen von häufigen Krankheiten. Als Nachfolgeprojekt wurde vom National Human Genome Research Institute (NHGRI) das ENCODE-Projekt gestartet (siehe unten). Seit April 2003 gilt das menschliche Genom offiziell als vollständig entschlüsselt. Zwar ist die Bedeutung aller Gene noch nicht bekannt, diese werden jedoch seit 2003 in Folgeprojekten des HGPs erforscht. Die Ziele des Projekts waren unter anderem: • alle Gene des Menschen zu identifizieren; • · die Sequenz der etwa 3 Milliarden Basenpaare der DNA zu finden; • · Variationen des Genoms zu identifizieren • · relevante Technologien, wie Datenanalyse, zu entwickeln und verbessern; • · Sequenzierung Modelorganismen (Maus, Schimpanse, Haustiere, Caenorhabditis elegans, Drosophila (Fruchtfliege), die erste Pflanze: Arabidopsis thaliana (Acker-Schmalwand), Pathogene, usw.); • · ethische, rechtliche und soziale Fragestellungen, die in Folge des Projekts auftreten würden, anzusprechen. 3. DNA Sequenzierung DNA Sequenzierung ist die Bestimmung der Nukleotid-Abfolge in einem DNA- Molekül. Die DNA Sequenzierung hat die biologischen Wissenschaften revolutioniert und die Ära der Genomik eingeleitet. Es gibt heute mehrere Verfahren zum Ablesen der Sequenzinformation von einem DNA-Molekül. Lange Zeit waren überwiegend Weiterentwicklungen der Methode nach Frederick Sanger in Verwendung. Auch in HGP war diese Methode verwendet. Die Didesoxymethode wird auch Kettenabbruch-Synthese genannt. Ein größeres Sequenzierprojekt, wie das Humangenomprojekt, bei dem mehrere Milliarden Basenpaare sequenziert wurden, erfordert darum eine Herangehensweise, die als Shotgun Sequencing bezeichnet wird. Dabei werden längere DNA-Abschnitte zunächst in kleinere Einheiten zerlegt, diese dann sequenziert und die Sequenzinformationen der einzelnen kurzen Abschnitte anschließend mit bioinformatischen Methoden wieder zu einer vollständigen Gesamtsequenz zusammengefügt. Um aus den rohen Sequenzdaten biologisch relevante Informationen zu gewinnen (beispielsweise Informationen über vorhandene Gene und deren Kontrollelemente), schließt sich an die Sequenzierung die DNA-Sequenzanalyse an. Ohne sie bleibt jede Sequenzinformation ohne wissenschaftlichen Wert. Moderne Verfahren bieten Möglichkeiten der beschleunigten Sequenzierung durch hochparallelen Einsatz. Die nach der Sanger-Methode entwickelten Sequenzierungsverfahren werden häufig als Sequenzierung der nächsten Generation (next generation sequencing oder NGS) bezeichnet. Das Potential des NGS ist von sehr großer Bedeutung. Es gibt auch schon einen NGS-Wettbewerb, dessen Preis, immerhin 10 Mio. $, gewinnt, wer es schafft, ein Gerät zu entwickeln, das 100 menschliche Genome in 10 Tagen oder weniger für maximal 10.000 $ pro Genom sequenzieren kann. Verschiedene Firmen haben Verfahren mit unterschiedlichen Vor- und Nachteilen entwickelt. Außer den hier aufgeführten gibt es noch weitere: Pyrosequenzierung (454 Life Sciences und später Roche Diagnostics), Sequenzierung durch Ligation (Applied Biosystem, Solid), Sequenzierung mit reversiblen FarbstoffTerminatoren (Illumina), Ionen-Halbleiter-DNA-Sequenzierungssystem (Ion Torrent, jetzt Life Technologies). Das Potential des NGS ist von sehr großer Bedeutung. Es gibt auch einen NGS-Wettbewerb (Archon-X Prize), dessen Preis, immerhin 10 Mio. $, gewinnt, wer es schafft, ein Gerät zu entwickeln, das 100 menschliche Genome in 10 Tagen oder weniger für maximal 10.000 $ pro Genom sequenzieren kann. Durch NGS ist es möglich, das Grundprinzip des Sequenzierens in unglaublich verdichteter, effizienter und massiv paralleler 90 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom (weswegen NGS manchmal auch „massive parallel sequencing‖ genannt wird) Weise zur Anwendung zu bringen. Im Rahmen von NGS-Verfahren können mehrere Tausend bis zu Millionen Sequenzierreaktionen gleichzeitig ablaufen und sie sind dabei noch hochgradig automatisierbar, d.h. von Maschinen ohne menschliche Interaktion zu bearbeiten. Dies ermöglicht einen hohen Probendurchsatz, so dass ein komplettes menschliches Genom mit seinen 3,2 Milliarden Buchstaben, für das das HGP noch 10 Jahre brauchte, inzwischen innerhalb weniger Tage sequenziert werden kann! 2007 wurde die DNA Sequenzierung die Methode des Jahres von Nature Methods ausgewählt. Im Jahre 2007 wurde James Watson mit 454-Technologie in 2 Monaten und für $1 Millionen sequenziert. Das ist noch weit entfernt von dem Ziel, aber schon ein großer Sprung. Und seitdem der Preis jedes Jahr geringer und geringer und die Zeit kürzer und kürzer ist (Abbildung 8.1 und 8.2). Im Jahre 2012, gibt es Firmen, die behaupten, dass sie das gesamte menschliche Genom in einem Tag und für $1000 sequenzieren können (zum Beispiel Ion Torrent von Life Technologies, und s. Ion semiconductor sequencing). In „1000 Genomes Projekt― gestartet 2008 wurde das Folgendes geplant: bis Ende 2011 die Genome von rund 2500 Menschen zu sequenzieren, um daraus einen detaillierten Katalog menschlicher genetischer Variationen zu erstellen, inkl. SNPs, INDELs und strukturelle Variationen wie Kopienzahlvariationen. Im Jahre 2010 wurde schon der erste Artikel in Nature über die ersten Ergebnisse veröffentlicht. Ähnliche Projekten sind das „Genome 10k―, wo das Ziel die Sequenzierung die Genome von 10.000 Wirbeltieren ist, und das i5k Projekt, wo das Ziel die Sequenzierung über 5 Jahren die Genome von 5.000 Insekten und verwandten Gliederfüßern ist. Abbildung 8.1. Vergleich der Effizienz verschiedener alter und neuer Sequenzierungsmethoden (http://www.ebook3000.com/TaschenlehrbuchHumangenetik--Auflage--8-_176255.html; 15/02/2013) Abbildung 8.2. Änderung der Preise der DNA-Sequenzierung (rote Linie) und die Menge der Sequenzdaten (blaue Linie). S. http://www.nature.com/news/2009/091021/full/464670a.html; 15/02/2013 91 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom 4. Ergebnisse von HGP Zuerst wurden 2001 unabhängig von beiden Forschungsunternehmungen die ersten Ergebnisse von der Sequenzierung des menschlichen Genoms in zwei Journals (offizielles HGP: Nature, Celera: Science) veröffentlicht. Seitdem wurden mehrere Artikel über die Funktionen und Struktur des menschlichen Genoms publiziert, und sehr oft die originellen Ergebnisse ergänzt und sogar korrigiert. Es gibt mehrere Webseiten über diese Ergebnisse, z.B.: http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml). Hier werden wir nur die wichtigsten und interessantesten Ergebnisse schildern. Eine interessante Frage ist, wessen Sequenz zuerst in den beiden Projekten bestimmt wurde? Es wurde von beiden Projekten angegeben, dass zuerst die Genome von mehreren Spendern mit gemischtem ethnischem Hintergrund von beiden Geschlechtern sequenziert und publiziert wurden. Wahrscheinlich war es auch wahr im Fall vom offiziellen HGP, aber später hat es sich herausgestellt, dass in Celera zuerst nur das Genom von Craig Venter sequenziert und veröffentlicht wurde. Es heißt, dass der erste Mensch Craig Venter war, dessen Genom sequenziert wurde. Das wichtigste erste Ergebnis ist vielleicht, dass die Anzahl der Gene nicht viel mehr als 20.000 ist. Das war ein überraschendes Ergebnis, weil die meisten Experte vor dem HGP die Anzahl der Gene auf ungefähr 100.000 geschätzt hatten. Hier ist einige statistische Daten über das menschliche Genom, aktualisiert im Oktober 2012: Tabelle 8.1. Tabelle 8.1. Einige statistische Daten über das menschliche Genom (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/StatsTable) Base Paaren: 3,300,551,249 Golden Path Length: 3,101,804,739 Das letzte Mal aktualisiert Oktober 2012 Gen Zahlen Bekannte kodierende Gene 20.476 Nicht kodierende Gene 22,170 Pseudogene 13,322 92 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom Gen exons 700,947 Varianten Kürze Varianten (SNPs, indels, somatic mutations): 54,418,495 Strukturelle Varianten: 9,235,137 Einige weitere interessante Ergebnisse über das menschliche Genom, korrigiert mit neuen Daten von dem, unter anderem, 1000 Genome und ENCODE Projekts: Das größtes Gen: DMD, kodiert für dystrophin; Größe: 2,224,919; Lokalisierung: Xp21.2. Längste kodierende Sequenz: TTN; kodiert für titin; kodierendes Sequenz: 104,076 bp; 34,692 Aminosäuren. • Das längste Exon: TTN: 17,106 bp • Gen mit den meisten Exons: TTN; 351. • 20% des Genoms sind Gen-Wüste (Regionen >500,000 bp ohne Gen) • Genreiche Chromosomen: 17, 19, 22; das reichste ist Chromosom 19; 1451 Gene/59Mb • Genarme Chromosomen: Y, 4, 13, 18, X. das ärmste ist Y mit 51 Gene/59Mb • Das 5’ Ende von 98,12% der Introns sind GT Basen und AG am 3’ End. • Die Rekombination ist höher in Frauen als in Männern, aber die Anzahl von Mutationen ist höher in männlicher Meiose. Das heißt, dass die Mehrzahl der Mutationen aus den Männern stammen. • Alle Neugeborene bekommen 60 Mutationen von ihren Eltern. • Jeder Mensch hat 250-300 Loss-of-function Mutationen. Loss-of-function Mutationen sind meistens rezessiv, da ein anderes Allel den Funktionsverlust eines Gens auffangen kann. Aus diesen Mutationen beteiligen 50100 Gene in Mendelian Krankheiten. Das ist die Ursache, warum es gefährlich ist, wenn die Eltern Verwandten sind. • 46% des Genoms bestehen aus Wiederholungen. Viel davon sind Transposons (umgangssprachlich springende Gene), inaktiviert vor 40 Milliarden Jahren. • Die häufigsten Wiederholungen heißen Alu, sie besetzen 10,6% des Genoms. • Mehrere Hunderte Gene kommen aus Bakterien durch horizontalen Gentransfer. • Auf den Zentromeren und Telomeren gibt es lange Wiederholungen. • Heutzutage kennen wir 156 Gene die genomischem Imprinting (genomische Prägung) unterliegen. Ein mutiertes Allel, das genomischem Imprinting unterliegt, scheint rezessiv vererbt zu werden, wenn es von einem bestimmten geschlechtlichen Elternteil kommt, und dominant, wenn es vom anderen geschlechtlichen Elternteil kommt. In Säugern wie dem Menschen ist dieses Phänomen am besten untersucht, und der Mechanismus, der dem Imprint zugrunde liegt, ist eine spezifische epigenetische Modifikation (oftmals eine Methylierung von CpG-Inseln) der DNA an bestimmten Regulations-Stellen imprinteter Gene. Als Folge dieser DNA-Methylierung>DNA-Methylierung kommt es zu einer Stilllegung des Gens (Gen-Silencing). Die Modifikationen werden beim Durchgang durch die Keimbahn (Meiose) zuerst gelöscht, dann geschlechtsspezifisch wieder aufgebaut (entweder nur maternal oder paternal). Einige genetische Krankheiten beim Menschen werden mit (fehlerhaftem) Imprinting in Zusammenhang gebracht, wie etwa das BeckwithWiedemann-Syndrom, Angelman-Syndrom oder Prader-Willi-Syndrom. Auch bei der Entstehung mancher Krebsarten (z. B. Wilms-Tumor) ist die Beteiligung von genomischem Imprinting von Bedeutung. Genomisches Imprinting ist vermutlich auch bei den Problemen bei In-vitro-Fertilisation (IVF) mittels intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (s. Kapitel 4). • CpG-Inseln (engl.: CpG islands) sind Regionen im Genom mit statistisch erhöhter CpG-DinukleotidDichte. Diese Dichte wird auf die Einzelnukleotid- und Dinukleotidfrequenzen im gesamten betrachteten Genomausschnitt bezogen. CpG bedeutet Cytosin-phosphatidyl-Guanin. Das p wird mit angegeben, um 93 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom besser zwischen dem hier gemeinten CG innerhalb eines DNA-Strangs und der CG-Basenpaarung eines DNA-Doppelstranges zu unterscheiden. CpG-Inseln sind als DNA-Abschnitte von 0,5 kb bis 2 kb Länge innerhalb des eukaryotischen Promotors definiert, die einen erhöhten GC-Gehalt von über 60% aufweisen. CpG-Inseln entstehen durch Mechanismen, die mit der Nutzung der Erbsubstanz als Informationsträger zu tun haben. Zwischen 2% und 7% der Cytosine einer Zelle sind methyliert. Meist sind es die Cytosine aus 5'-CpG3' Dinukleotiden, die auf beiden komplementären DNA-Strängen eine Methylgruppe tragen, wodurch ein palindromisches Methylierungsmuster entsteht. CpG-Inseln werden auch zur Regulation der Expression (des Ablesens) der Gene verwendet, und sind damit ein Mechanismus der epigenetischen Genregulation. Methylierung der CpG-Inseln in den Promoterbereichen eines Genes bedeutet, dass diese Gene nicht abgelesen werden (Genrepression). Circa 70% aller menschlichen Gene haben CpG-Inseln in ihren Promotorbereichen. Methylierung im Genkörper, dagegen, erhöht das Genexpression (s. ENCODE Projekt; und Kapitel 4). • Es gibt zwei Sorten von regulatorischen genomischen Regionen. Promoterregionen der Gene, die in der Nähe und stromaufwärts der Gene liegen, die sie regulieren, und Enhancerregionen, die fernen Gene regulieren. Im ENCODE Projekt wurden mehr als 70.000 Promoterregionen und beinahe 400.000 Enhancerregionen identifiziert. Die Enhancerregionen sind oft Zell-spezifisch. Die dreidimensionale Struktur der DNA hat eine wichtige Rolle in den Wechselwirkungen der verschiedenen regulatorischen Regionen und der Gene, aber die sehr komplexen Mechanismen sind wenig bekannt. • Bis Oktober 2012 wurden 13.322 Pseudogene identifiziert. Pseudogene sind Genkopien, die durch Mutationen ihre Funktionen losgeworden wurden. Aber im ENCODE Projekt wurde gefunden, dass 9% der Pseudogene transkribiert werden, und regulatorische Funktionen haben. Sie können die Transkription der Eltern-Gene durch verschiedene Mechanismen regulieren. Z.B. sie können als short interfering RNA (siRNA) funktionieren, und die Transkription der Eltern-Gene regulieren. Es gibt auch Pseudogene, die in Wechselwirkung mit der miRNA der Gene treten, und die Blockierung der Funktionellen Gene modifizieren. Höhe Transkription der Pseudogene können die Stabilität der mRNA der Eltern-Gene reduzieren. Transkribiert Pseudogene können Antisense-RNA bilden, und durch komplementäre Basenpaarung die am codogenen Strang gebildete mRNA blockieren und damit die Translation verhindern. Es gibt sehr viele Webseiten über die Genome der verschiedenen Organismen (z.B. http://genome.ucsc.edu/; http://www.ensembl.org/; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Es gibt noch ein sehr wichtiges Thema über die Variationen des Genoms, das vorher nicht diskutiert wurde. Aber es ist so wichtig für unseren Standpunkt, dass wir ein ganzes Subkapitel für dieses Thema widmen (s. unten). Obwohl das HGP 2003 als fertiggestellt verkündet wurde, es war noch nicht total komplett. Insgesamt gab es insgesamt 350 Lücken (gaps), besonders in den repetitiven Regionen, die sehr schwer zu sequenzieren sind. Das „Genome Reference Consortium― wurde gegründet, um diese Lücken aufzufüllen. Diese Regionen sind aber gar nicht klein. Sie sind insgesamt 5% des Genoms, und es ist auch nicht leicht sie aufzufüllen. Nach 6 Jahren, bis 2009 wurden nur 50 Lücken aufgefüllt. 5. Variationen im Genom Eines der wichtigsten Ziele des HGPs war, Variationen im Genom zu identifizieren. Die häufigsten Variationen sind die SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), mutativen Veränderungen durch den Austausch einzelner Nukleotide in der DNA, die meist durch Ablesefehler während der Replikation entstehen. SNPs machen sich also durch Unterschiede in einzelne basenpaarender DNA bemerkbar. Früher wurden nur solche Variationen SNP genannt, deren Populationenfrequenz mehr als 1% ist. Die seltenen Variationen wurden Mutationen genannt. Jetzt wird oft jede Single Nukleotide Mutation als SNP genannt, unabhängig von deren Frequenz. MAF (Minor allele frequency) ist die Frequenz des selteneren Allels. Wenn MAF > 5% ist, die SNPs sind häufig genannt, zwischen 0,5-5% ist die MAF niedrig, unter 0,5% ist sie selten. Relativ sind die Introns, wo die SNPs am dichtesten vorhanden sind, seltener sind in den intragenischen Regionen, und am seltensten sind die SNPs in Exons. Jetzt sind mehr als 54 Millionen SNPs und kurze Variationen bekannt (Tabelle 8.1), aber nur 0,1% der SNPs führt zu einem Aminosäure-Austausch, und nur 40% deren sind nicht konservativ. Neben den kurzen Variationen gibt es große strukturelle Variationen. Einen bis vor kurzem unterschätzten Anteil an der Variation des Genoms haben DNA-Kopienvarianten (copy number variation, CNV), die durch Verlust (Deletion) oder Gewinn (Duplikation) von DNA-Sequenzen entstehen und bis zu mehreren Millionen 94 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom Basenpaaren lang sein können. Strukturelle Variationen können auch durch die Änderung der Reihenfolge genomischer Regionen entstehen (Inversion) (s. Abbildung 8.3). Tausende von Kopienvarianten unterschiedlicher Größe sind im Genom bereits kartiert. In 12% des menschlichen Genoms wurden CNVs entdeckt, und 13% der Gene können in verschiedenen Kopien in verschiedenen Menschen vorhanden sein. Im Allgemeinen, verursachen sie keinen großen phänotypischen Unterschied, aber manchmal spielen CNVs wichtige Rollen in verschiedenen Krankheiten, wie z.B.: Alzheimer-Erkrankung, Morbus Crohn, AIDS, Fettleibigkeit, Autismus usw. Abbildung 8.3. Strukturelle Variationen im Genom (15/02/2013) CNVs können auch in Transplantation eine Rolle spielen. Eineiige (monozygote) Zwillinge können sich auch in CNVs unterscheiden. Es heißt, dass CNVs auch somatisch entstehen können, und deshalb sind eineiige Zwillinge nicht total identisch auf genetischer Ebene. Nach dem HGP sagte man, dass SNPs für den meisten Unterschied verantwortlich sind. Dadurch ist der Unterschied zwischen zwei Menschen 0,1%, d.h. sind die Menschen zu 99,9% genetisch identisch. Aber später, als die Bedeutung der CNVs entdeckt wurde, hat man es festgestellt, dass die CNVs für größeren Unterschied verantwortlich sind als die SNPs. Als die genomischen Sequenzen von Craig Venter und James Watson publiziert wurden, wurde es geschätzt, dass CNVs für weiteren 0,4% Unterschied verantwortlich sind. Insgesamt kann man sagen, dass der Unterschied zwischen zwei Menschen um 0,5% ist. In der Tabelle 8.2 können Variationen von unterschiedlichen sequenzierten Genomen gesehen werden. Neueren Beobachtungen zufolge kann der Unterschied zwischen zwei Menschen, die historisch längst getrennt sind, sogar 2-3% sein. Für diesen großen Unterschied sind große genomische Neuordnungen verantwortlich. Tabelle 8.2. Tabelle 8.2. Anzahl der Variationen in einigen Genomen Anzahl der SNPs Genom von J. Craig Venter 3,213,401 Genom von James Watson 3,322,093 Asiatisches Genom 3,074,097 Yorubaner (Africaner) Genom 4,139,196 Strukturelle Variationen Venters Genom in n Länge (bp) CNV 62 8,855–1,925,949 Insertion/Deletion 851,575 1–82,711 95 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom Block Substitution 53,823 2–206 Inversion 90 7–670,345 In den letzten Jahren gab es eine große Veränderung in unserer Auffassung über die Entwicklung des menschlichen Genoms. 2010 wurde in Science ein Artikel von Scante Pääbo über die Sequenzierung des Genoms des Neandertalers publiziert. Die rekonstruierte Neandertaler-DNA wurde anschließend mit DNAProben moderner Menschen aus Afrika, Europa und Asien verglichen. Sie berichteten unter anderem, dass das Genom der Neandertaler eine signifikant größere Ähnlichkeit mit dem Genom von Europäern und Asiaten hat als mit dem Genom von Afrikanern: Der Franzose, der Han und der Papua stehen den Neandertalern in gleichem Maße nahe, der Yoruba und der San weisen diese genetische Nähe gleichermaßen nicht auf. Die Autoren deuten dies so: „Die sparsamste Erklärung für diese Beobachtung ist, dass Neandertaler Gene mit den Vorfahren der Nicht-Afrikaner austauschten.― Da anhand weiterer Analysen der untersuchten Genome der fünf Vertreter heutiger Populationen ein Genfluss vom Homo sapiens zum Neandertaler ausgeschlossen werden konnte, kam die Studie zu dem Ergebnis „dass der Genfluss vom Neandertaler zu den Vorfahren der NichtAfrikaner erfolgte, bevor sich die eurasischen Gruppen voneinander trennten―, das heißt im Nahen Osten, wo Neandertaler und anatomisch moderne Menschen in der Zeitspanne von vor 110.000 Jahren bis vor rund 50.000 Jahren koexistierten. Gestützt wird diese Vermutung, der Genfluss sei ausschließlich in eine Richtung gegangen, unter anderem durch eine Studie, der zufolge die Wahrscheinlichkeit grundsätzlich sehr viel größer ist, dass Gene von einer ortsansässigen Population in eine andere Population übergehen, wenn diese andere Population in das Siedlungsgebiet der ansässigen Population eindringt, als umgekehrt. 2012 wurde die Zeitspanne des möglichen Genflusses zunächst in die Zeit vor 65.000 bis 47.000 Jahren eingegrenzt. Das Ausmaß des Genflusses vom Neandertaler zu Homo sapiens beträgt den Autoren der Studie zufolge zwischen einem und vier Prozent des Genoms der heutigen nicht-afrikanischen Bevölkerung. Einige Monate später hat das Team von Pääbo einen anderen Artikel über die Sequenz des Genoms der Denisova-Menschen publiziert. Daher wurde auch die genetische Distanz des Denisova-Fossils zu heute lebenden Ethnien analysiert, wobei auf Daten von 938 Menschen aus 53 Populationen zurückgegriffen wurde. Den Befunden zufolge steht das Denisova-Fossil den heute lebenden europäischen, asiatischen und afrikanischen Menschen ferner als die Neandertaler. Hingegen wurde eine signifikante Nähe zur DNA von Menschen aus Melanesien (Papua und Bougainville-Bewohner) festgestellt. Dies führte zur Aussage, dass das Genom der Melanesier – wie das aller nicht-afrikanischer Menschen – zu 2,5 ± 0,6 Prozent vom Neandertaler stammt, zusätzlich aber weitere 4,8 ± 0,5 Prozent vom Denisova-Menschen beigesteuert wurden; zusammengerechnet wären dies laut Studie 7,4 ± 0,8 Prozent des Genoms der Melanesier, die von einer früheren Vermischung mit archaischen Homininen stammen. Eine weitergehende Analyse ergab im Jahr 2012 unter anderem, dass Allele nachgewiesen werden konnten, „die bei heute lebenden Menschen verbunden sind mit dunkler Haut, braunem Haar und braunen Augen―. Ferner gelang es, Teile der von Vater und Mutter stammenden Erbanlagen getrennt auszuwerten; hieraus wurde auf ein sehr geringes Ausmaß an Heterozygotie geschlossen. Nach dem HGP, haben mehrere Projekte zu den SNP Databanken beigetragen. Die größten Projekte waren das HapMap Projekt und das 1000 Genome Projekt (siehe z.B. http://www.sciencemag.org/content/330/6004/574). Die MHC (HLA) Region (6p21.3) ist ein besonderer Teil des Genoms. In dieser, 7,6 Mb lange Region sind Gene, die in der Immunantwort eine wichtige Rolle spielen. In der MHC-Klasse-III Region sind die Gendichte und die genetische Vielfältigkeit die höchste. Hier gibt es 59 kodierende Gene, und die Anzahl der DNA Variationen (SNPs und CNVs) sind mit einer Größenordnung höher, als in anderen Teilen des Genoms. 6. Junk DNA im menschlichen Genom Als nicht kodierende DNA werden diejenigen Teile der DNA bezeichnet, die nicht für Proteine kodieren. Vielleicht war die niedrige Anzahl der Gene das überraschendste Ergebnis des HGPs. Die Anzahl der Gene war sehr ähnlich wie in viel einfacheren Organismen, wie z.B. in Caenorhabditis elegans. Insgesamt 98,8 Prozent des menschlichen Genoms enthält nicht kodierende DNA-Sequenzen, deren Funktionen meistens unbekannt waren. Früher hat man geglaubt, dass diese Sequenzen meistens keine Funktionen hätten, und deshalb haben einige Experten die als junk DNA = Müll DNA, bezeichnet. Aber die meisten Experten waren sicher, dass das Genom nicht 98,8% Müll enthalten dürfen. Für die Aufklärung dieses Problems wurde im September 2003 das ENCODE Projekt (Encyclopedia of DNA Elements) eingeleitet. Das Ziel des Projekts war, 96 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom alle funktionellen Elemente des menschlichen Genoms sowie das Transkriptom zu identifizieren und zu charakterisieren. In der Pilotphase wurden zunächst 30 Megabasen DNA-Sequenz des humanen Genoms ausgewählt, was etwa 1% umfasst, und mit bereits etablierten Methoden analysiert. Nach der Pilotphase kam die Produktionsphase, in der das gesamte Genom untersucht wurde. Insgesamt kostete das Pilotprojekt 55 Millionen US-Dollar, und die 2012 beendete Produktionsphase weitere 130 Millionen. Im September 2012 wurden 30 Artikel in verschiedenen Zeitungen über die Ergebnisse der Projekte publiziert. Die wichtigste Erkenntnis war, dass die Konsortium bei dem > 80 Prozent des Genoms biochemische Funktionen identifizieren konnte. Kurz gefasst wurden die folgenden funktionellen Elemente identifiziert: • Protein kodierende Regionen • RNA kodierende Regionen (nicht transkribiert zu Protein) • Promoter Regionen (ca. 70.000) • Enhancerregionen (fern regulatorische Regionen, ca. 400.000) • Chromatid Interaktionen (Long Range) • DNA Methylierung Bereiche • Histon Modifikationen Aus den 30 Artikeln lassen wir uns einige wichtige oder interessante Ergebnisse ansehen: 75 Prozent des Genoms wird in den verschiedenen Zellen transkribiert. Beide Stränge werden manchmal durch überlappende Weise transkribiert. Die Gene sind oft verflechtet. Diesen Ergebnissen zufolge muss man die Definition des Gens überdenken. Für die Prognose genetischer aktiverer Regionen wurde DNase I hypersensitivity (DHS) assay benutzt. DHS sind Regionen im Genom, die zugänglich für DN-ase I durch Verlagerung der Nukleosomen sind. Die Autoren haben mehrere Zell-spezifischen DHS entdeckt, und diese haben bemerkenswerte Konkordanz zu experimentell bestimmten oder Computer prognostiziert Transkriptionsfaktor Bindestellen. Es wurde auch gefunden, dass die Bindung der Transkriptionsfaktoren die Methylierung blockieren, und nicht umgekehrt. Die fern liegenden regulatorischen Elemente können miteinander durch Schleifenbildung kommunizieren. Das ENCODE Projekt haben 8800 kurze RNA und 9600 lange nicht kodierende RNA identifiziert. Die verschiedenen RNA Molekülen werden immer zu bestimmten Zellfächern transportiert. Vorige Untersuchungen, die den genomischen Hintergrund der komplexen Merkmale bestimmen wollten, haben gefunden, dass die Mehrheit (93%) der Merkmal assoziierte Variationen in den nicht kodierenden Regionen waren, deren Funktionen meistens unbekannt waren. Die Ergebnisse des ENCODE Projekts haben gezeigt, dass die Mehrheit dieser Variationen in den neuentdeckten regulatorischen Regionen liegt. Aber die Zellsorten sind wichtig. Das heißt, dass die Zellen unterscheiden sich in ihren regulatorischen Elementen. Deshalb haben die Variationen nur in manchen Zellen Wirkungen. Die Mehrheit der Chromatin Interaktionen sind intra-chromosomal. Die Wissenschaftler können letztendlich genug Daten akkumulieren um die Funktionen der unbekannten Sequenzen vorhersagen zu können. Dieser Prozess heißt man Imputation. In der Zukunft kann die Imputation exakter und einfacher sein, als die laboratorischen Experimente. Die dreidimensionale Struktur des Genoms ist auch konserviert. Es gibt Mutationen die diese Struktur ändern, und können dadurch Krankheiten verursachen. Nach diesen Ergebnissen enthält die Mehrheit des Genoms regulatorische Sequenzen, die viel mehr sind, als die proteinkodierenden Sequenzen. Introns oder Exons können fakultativ sein, d.h. ein Intron kann entfernt werden, muss aber nicht. Umgekehrt muss auch ein Exon nicht erhalten bleiben, sondern kann ebenfalls herausgeschnitten werden (sogenannte WahlIntrons oder Wahl-Exons). Dieser Vorgang heißt alternatives (oder differenzielles) Splicing. Durch diesen Mechanismus können aus einem Gen unterschiedliche Genprodukte entstehen. Etwa 94 Prozent der Gene 97 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom kodieren mehrere Proteine. So können die 20.000 Gene des Menschen insgesamt für mehr als 250000 verschiedene Proteine kodieren. Wenn man die posttranskriptionelle Modifikation der mRNA und die posttranslationale Modifikation von Proteinen betrachtet, die Anzahl der Proteine kann ca. 2 Millionen sein. 7. Vergleichende Genomik Die Vergleichende Genomik (eng. Comparative genomics) befasst sich mit der Beziehung der Strukturen und Funktionen der Genome der verschiedenen Organismen. Sie sucht Antworten zu den Folgenden Problemen, z.B.: • Evolutionsmechanismen • Worin gleichen sich unterschiedliche Arten? • Gene für grundsätzliche Prozesse • Worin unterscheiden sich nah verwandte Arten? • Identifizierung spezieller Anpassungen Der Vergleich des menschlichen Genoms mit dem Genom unserer nächsten Verwandten soll offenbaren, wie spezifische menschliche Eigenschaften entstanden. Zu wissen, was genau uns von anderen Spezies unterscheidet, hat auch praktischen Nutzwert – zum Beispiel für die Medizin. Die Genome unserer nächsten lebenden Verwandten, der Menschenaffen, sind inzwischen zumindest grob entziffert. Und selbst über einen unserer nächsten, längst ausgestorbenen Verwandten – den Neandertaler – werden immer mehr genetische Geheimnisse gelüftet. All diese Erkenntnisse helfen uns, eine Reihe zentraler Fragen über die Natur des Menschen zu beantworten: Welche Gene definieren die biologische Spezies Homo sapiens? Was ist die Grundlage typisch menschlicher Eigenschaften wie Denken, Sprache und Kultur? Und welche Defekte führen zu Störungen wie Autismus oder Schizophrenie? Wenn Sequenzen zwischen zwei Spezies, die historisch längst getrennt sind (z.B. Maus und Mensch), sehr ähnlich sind, dann sind sie konserviert. Konservierte Sequenzen weisen auf wichtige Komponenten hin. Ebenso wichtig wie der Vergleich zwischen verschiedenen Spezies ist es, die Gen-variationen innerhalb einer Art zu identifizieren. Damit lassen sich solche DNA-Sequenzen aufspüren, die von der natürlichen Selektion begünstigt wurden. Der Vergleich des menschlichen Genoms mit dem Genom der Maus hat gezeigt, dass 99 Prozent der proteinkodierenden Gene homolog sind. Es heißt, dass sich die zwei Spezies ca. 300 Gene unterscheiden. Deshalb ist die Maus ein geeignetes Modeltier für die Untersuchungen der meisten Gene und Krankheiten. 8. Literatur 1. http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml 2009. 2. International Human Genome Sequencing Consortium: Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001;409:860-921. 3. Venter JC et al. The sequence of the Human Genome. Science 2001;291:1304-51. 4. International Human Genome Sequencing Consortium: Finishing the euchromatic sequence of the human genome Nature 431, 931 - 945 (21 October 2004) 5. http://genomics.xprize.org/ 6. Rusk N, Kiermer V.Primer: Sequencing—the next generation. Nature Methods 2008;5:15. 7. http://www.genome.gov/10005107; 2009. 8. Pennisi E. 1000 Genomes Project Gives New Map Of Genetic Diversity. Science 2010; 330: 574-5.) 98 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom 9. http://www.epigenome.org/; 2009. 10. Redon R. et al.: Global variation in copy number in the human genome. Nature 2006; 444: 444-454. 11. Armour JA. Copy number variation and antigenic repertoire. Nat Genet. 2009;41(12):1263-4. 12. 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Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project. Nature 2007; 447:799-816. 20. Parker SC, Hansen L, Abaan HO, Tullius TD, Margulies EH. Local DNA Topography Correlates with Functional Noncoding Regions of the Human Genome. Science. 2009; 324: 389 – 392. 21. Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S, Mello C (1998). "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans". Nature 391 (6669): 806–11. 22. Swami M. RNA world: A new class of small RNAs Nature Reviews Genetics 2009;10, 425. 23. Waterston RH et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 2002; 420 (6915) 520 - 562. 24. Kirkness EF et al.: The Dog Genome: Survey Sequencing and Comparative Analysis. Science. 2003; 301:1898-1903 25. Krause J et al.: The Derived FOXP2 Variant of Modern Humans Was Shared with Neandertals. Current Biology 2007; 17: 1908-1912 26. ENCODE Project Consortium, et al.: An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 2012 Sep 6;489(7414):57-74. 27. Murken J et al.: Taschenlehrbuch Humangenetik. Thiemen, http://www.ebook3000.com/Taschenlehrbuch-Humangenetik--Auflage--8-_176255.html 9. Fragen 1. Was ist das Genom? 2. Was ist die Genomik? 3. Was ist der Unterschied zwischen Genetik und Genomik? 4. Wann hat das Humangenomprojekt begonnen? 5. Was ist der Name der Firma, die 1998 von J. Craig Venter gegründet wurde? 99 Created by XMLmind XSL-FO Converter. 8. Auflage; Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom 6. Wann wurde zum ersten Mal die beinahe vollständige Sequenzierung des menschlichen Genoms publiziert? 7. Was waren die Hauptziele des HGPs? 8. Welche Sequenzierungsmethoden wurden in HGP verwendet? 9. Was bedeutet NGS? 10. Wer kann den Archon-X Preis gewinnen? 11. Geben Sie Beispiele für größere Genomprojekte! 12. Was ist die Größe des Humangenoms? 13. Wie viele kodierende Gene gibt es im Humangenom? 14. Wie viele Varianten sind derzeitig im Humangenom bekannt? 15. Welches ist das größte menschliche Gen? 16. Welches Gen hat die längste kodierende Sequenz? 17. Geben Sie Beispiele für Genarme und Genreiche Chromosomen! 18. Ungefähr wie viele Mutationen bekommen die neugeborenen Kinder von ihren Eltern? 19. Wie viele „Loss-of-Function― Mutationen gibt es in einem Mensch? 20. Wo ist häufiger die Rekombination und wo stammen die meisten Mutationen? 21. Was wissen Sie über die Wiederholungen im Humangenom? 22. Was wissen Sie über genomische Imprinting? 23. Was wissen Sie über die CpG-Inseln? 24. Welche Sorten von regulatorischen genomischen Regionen gibt es, und wie viele sind sie ungefähr im Humangenom? 25. Was wissen Sie über die Pseudogene? 26. Was bedeutet SNP? 27. Was bedeutet MAF? 28. Was wissen Sie über CNVs? 29. Ungefähr was kann der Unterschied zwischen Genomen von zwei Menschen sein? 30. Was wissen Sie über die Vermischung der Genome von Homo sapiens mit archaischen Homininem? 31. Wo ist im Humangenom die genetische Vielfältigkeit die höchste? 32. Wie viel Prozent des Humangenoms enthält nicht kodierende DNA? 33. Was war das Ziel des ENCODE Projekts und was für Ergebnisse hat es bekommen? Geben Sie Beispiele! 34. Welche funktionellen Elemente im Genom wurden in ENCODE identifiziert? 35. Was ist die Bedeutung der DHS Regionen im Genom? 36. Was bedeutet Imputation in Genomik? 100 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Einführung in die Humangenomik. Das menschliche Genom 37. Was bedeutet Wahl-Intron? 38. Was bedeutet vergleichende Genomik? 39. Auf was weisen konservierte Sequenzen hin? 101 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 9. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen Csaba Szalai 1. Allgemeine Merkmale der komplexen Erkrankungen Multifaktorielle Merkmale und Erkrankungen kommen durch ein Wechselspiel (Interaktion) genetischer und nicht genetischer Faktoren zustande. Sie folgen keinem Mendel-Erbgang. Die nicht genetischen Faktoren werden häufig als Umwelt bezeichnet, schließen aber auch stochastische und epigenetische Faktoren ein. Heute werden multifaktorielle Erkrankungen auch als komplexe Erkrankungen bezeichnet (wegen des komplexen Zusammenspiels von genetischen und Umweltfaktoren bei ihrer Entstehung). Der Begriff „komplexe Erkrankungen― wird hier für die häufigen multifaktoriellen Erkrankungen wie koronare Herzkrankheit, Diabetes mellitus und Allergie verwendet. Multifaktorielle/komplexe Erkrankungen sind wesentlich häufiger und im medizinischen Alltag relevanter als monogene Erkrankungen, werden aber in der Praxis noch zu selten unter genetischen Gesichtspunkten betrachtet. Sie schließen ein breites Spektrum von Erkrankungen und Merkmalen ein, und umfassen praktisch die gesamte Medizin mit Ausnahme der monogenen Erkrankungen und Unfälle. Unter der Vorstellung, dass es sich bei den genetischen Faktoren in der Regel um viele verschiedene Gene (oder besser: um Varianten verschiedener Gene) handelt, die an der Ausprägung eines bestimmten Merkmals oder einer Erkrankung beteiligt sind, wird der Begriff polygene Vererbung benutzt. Rein polygene Merkmale oder Erkrankungen sind beim Menschen nicht bekannt. Einige Eigenschaften der komplexen Erkrankungen: • Manche sind sehr häufig: Die Frequenz von Asthma ist zwischen 6-10%, es gibt insgesamt 300 Millionen Asthmatiker in der Welt. Die Anzahl der Diabetiker ist ähnlich. Die Frequenz der Hypertension ist 20-30% in den Entwickelten Ländern. Kardiovaskuläre Krankheiten sind verantwortlich für 39% der Ursache aller Todesfälle. • Vom wirtschaftlichen Standpunkt sind sie von großer Bedeutung. Z.B. wird in der Europäischen Union für kardiovaskuläre Erkrankungen jährlich €170 Milliarde, in der USA $300 Milliarde ausgegeben. Obesität und die assoziierten Erkrankungen kosten jährlich $60 Milliarde in den USA. • Es gibt familiäre Aggregation aber keine Mendel-Erbgänge. • Gene, die die relativen Risiken für eine Erkrankung beeinflussen, werden als „Suszeptibilitätsgene― bezeichnet. Sie sind per Definition polymorph, somit kommen die Allele (Varianten) eines Suszeptibilitätsgens häufig in der normalen Bevölkerung vor. Varianten eines Suszeptibilitätsgens sind jedoch weder hinreichend noch notwendig, um eine bestimmte Krankheit auszulösen. • Sie sind oft häufiger in post-reproduktivem Alter. Es heißt, die Suszeptibilitätsgene leichter weitervererbt werden können. • Die Häufigkeit mancher komplexen Erkrankungen steigern. • Häufig kann man Komorbidität beobachten (s. Kapitel 14) Die strikte Unterscheidung zwischen monogenen (Mendel-)Erkrankungen und multifaktoriellen/komplexen Erkrankungen wird zunehmend verwischt. Biologisch betrachtet stehen strikt monogene und polygene/multifaktorielle Erkrankungen jeweils nur am Ende eines kontinuierlichen Spektrums. Begriffe wie inkomplette Penetranz und variable Expressivität von monogenen Erkrankungen sind letztlich Ausdrücke dafür, dass das „Monogen― nicht allein für das Auftreten, den Schweregrad oder die phänotypische Ausprägung der Erkrankung verantwortlich ist. 102 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen 2. Umweltfaktoren Umweltfaktoren spielen eine wichtige Rolle in der Entstehung der komplexen Erkrankungen. Umweltfaktoren sind z.B.: Lebensmittel, Rauchen, Infektionen, Wetter, psychische Wirkungen, intrauterine Wirkungen (durch epigenetische Modifikationen), Luftverschmutzungen, Stress, Lebensweise usw. 3. Warum ist es wichtig den genomischen Hintergrund der komplexen Erkrankungen zu untersuchen? Das Verständnis des Beitrags genetischer Faktoren zur Ätiologie und Pathogenese komplexer Erkrankungen und multifaktorieller Merkmale ist eine der größten Aufgaben der medizinischen Forschung unseres Jahrhunderts. Derzeit gewinnen wirerste Einblicke.Genomische Methoden sind oft hypothesefrei, d.h. mit denen man unbekannte Krankheitmechanismen identifizieren kann. Vielleicht heutzutage ist diese die größte Bedeutung der genomischen Untersuchungen. Wenn man die unbekannten genomischen Faktoren identifizieren kann, kann man den grundlegenden Prozessen der Krankheitsentstehung besser verstehen, dadurch neue Drug Targets, Medikamente und Therapien entdecken. Genetische Variationen können das Risiko der Erkrankungen und auch die Wirksamkeit und Nebenwirkungen von Arzneimitteln und Therapien beeinflussen (s. Kapitel 13). Dadurch kann es möglich sein, die personalisierteTherapie zu verwirklichen. Es sind sowohl Gen-Gen als auch Gen-Umwelt und Umwelt-Umwelt-Interaktionen bekannt. Die Realität der meisten komplexen Erkrankungen wird vermutlich alle Situationen inkludieren. Leider den komplexen Interaktionen zufolge, die wahre Gesamtwirkung der Variationen, die ein Mensch hat, fast unmöglich zu schätzen ist. Deshalb gibt es große Probleme mit der klinischen Verwirklichung der genomischen Resultate. Wegen der geringen Vorhersagekraft der meisten einzelnen Suszeptibilitätsvarianten wurde vorgeschlagen, viele solche Varianten an verschiedenen Genorten gleichzeitig zu testen, um damit die Aussagekraft über ein Erkrankungsrisiko zu erhöhen. Grundlage ist die Identifizierung einer großen Zahl von Genomvarianten, die die Risiken für multifaktorielle Erkrankungen modifizieren. Einige Firmen bieten bereits sog. Gen-Chips (SNPChips) als prädiktive, genetische Diagnostik außerhalb der Medizin („over the counter―) über das Internet an, mit denen mehrere medizinisch relevante Merkmale erfasst werden sollen. Die resultierenden, persönlichen genetischen Profile sollen Aussagen über Krankheitsrisiken erlauben. Die Anwendung solcher Verfahren, die als „genomic Profiling― bezeichnet werden, wird aber derzeit aus theoretischen und praktischen Überlegungen abgelehnt. Es gibt keinerlei wissenschaftlich gesicherte Daten zu solchen multiplen Tests. Mit den modernen Hochdurchsatz-Sequenzierverfahren, die es erlauben, in kurzer Zeit und mit immer geringeren Kosten individuelle Genome zu sequenzieren, können grundsätzlich alle krankheitsassoziierten Varianten erfasst werden. Limitierend werden in naher Zukunft nicht technische Möglichkeiten, sondern die Probleme der Interpretation und die Möglichkeiten der medizinischen Konsequenzen sein. 4. Qualitative und quantitative multifaktorielle Merkmale Bei multifaktoriell bedingten Merkmalen, Störungen oder Erkrankungen kann es sich um qualitative oder quantitative Merkmale handeln (s. Humangenetik). Beispiele für multifaktorielle quantitative Merkmale sind die meisten medizinischen Laborparameter wie Cholesterolspiegel, Glukose-Konzentrationen, Harnstoffkonzentrationen, aber auch Merkmale wie Körpergröße, Körpergewicht und Intelligenz. Auf English quantitative Merkmale sind QT (quantitative trait) genannt. Als Quantitative Trait Locus (abgekürzt QTL, deutsch: Region eines quantitativen Merkmals) wird in der Genetik ein Abschnitt eines Chromosoms bezeichnet, für den in entsprechenden Studien ein Einfluss auf die Ausprägung eines quantitativen phänotypischen Merkmals des betreffenden Organismus nachgewiesen wurde. 103 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen Beispiel für qualitative Störungen sind die multifaktoriell bedingten Fehlbildungen wie Lippen-KieferGaumen-Spalten. Für viele qualitative Merkmale wurde früher aufgrund von Familienbefunden ein sogenannter polygener Erbgang mit Schwellenwerteffekt postuliert. Diese Hypothesen entstammen mathematischen Modellen, die aber beim Menschen nicht bestätigt wurden. Viele, aber nicht alle quantitativen Merkmale sind normal verteilt. Für manche komplexe Erkrankungen wie die koronare Herzkrankheit sind Risikofaktoren bekannt, wie etwa erhöhtes Plasma-LDL-Cholesterol, die selbst wiederum komplexe quantitative Merkmale darstellen. Derartige quantitative Merkmale werden auch als intermediäre Phänotypen bezeichnet, da sie quasi zwischen dem Genotyp und dem klinischen Phänotyp stehen. Es ist einleuchtend, dass der Beitrag einer genetischen Variante auf intermediäre Phänotypen größer ist als auf den klinischen Phänotyp. 5. Erblichkeit der komplexen Erkrankungen und Merkmale Die Heritabilität (Symbol: H2oder im engeren Sinn h2 s. hier) ist ein Maß für die Erblichkeit von Eigenschaften, bei deren phänotypischer Ausbildung sowohl die Gene als auch Umwelteinflüsse eine Rolle spielen. Sie ist zwar grundsätzlich auf sämtliche genetische Eigenschaften anwendbar; ihre praktische Anwendung ist aber fast nur bei komplexen Erbgängen und kontinuierlicher Phänotyp-Ausprägung sinnvoll. Für die Berechnung der Erblichkeit eines quantitativen Merkmals stehen verschiedene Modelle zur Verfügung. Die Heritabilität eines Merkmals ist keine konstante Eigenschaft eines phänotypischen Merkmals, sondern hängt von der Umwelt ab. Die Heritabilität des gleichen phänotypischen Merkmals kann sowohl zwischen verschiedenen Populationen mit verschiedenen Umwelteinflüssen unterschiedlich sein, als auch in der historischen Abfolge bei sich ändernder Umwelt. Aus der Regression eines Merkmals zwischen Verwandten lässt sich die Heritabilität berechnen. Während für quantitative Merkmale das Maß die Korrelation ist, ist es bei qualitativen Merkmalen bzw. Erkrankungen die Häufigkeit des gemeinsamen Auftretens, bei Blutsverwandten in Abhängigkeit vom Verwandtschaftsgrad. Die Häufigkeit des gemeinsamen Auftretens kann nur empirisch gewonnen werden. Die empirischen Werte können aber auch zur Risikovorhersage benutzt werden. Sie werden daher auch als empirische Risikoziffern bezeichnet. Eine einfache Methode ist, wenn man die Konkordanz der Erkrankungen in Verwandten mit der Populationsfrequenz vergleicht. Das ist die λR Wert, wo R aus der englischen „relative― (Verwandte) ist. Oft wird λs benutzt, wo ‚s’ siblings (Geschwister) bedeutet. Wenn die Konkordanz in Geschwistern einer Erkrankungen 0,8 ist, und die Populationsfrequenz 0,2, dann λ s = (0,8/0,2 =) 4. Wenn λs = 1 ist, dann hat die Erkrankung keinen genetischen Hintergrund, d.h. das Risiko ist nicht vererbbar; wenn λ s > 1 ist, die Erkrankung hat einen genetischen Hintergrund. Z.B. für die monogene zystische Fibrose λ s = 500, für den multifaktoriellen Typ 2 Diabetes mellitus (T2DM) λs = 3,5; für Asthma λs = 2; für Schizophrenie λs = 8,6; und für Typ 1 Diabetes mellitus λs = 15. Im Allgemeinen, je häufiger eine Erkrankung ist, desto niedriger das λ s ist. Das Problem mit λs ist, dass es durch die gemeinsame Umwelt der Relativen beeinflusst wird. Es gibt verschiedene Methode, mit denen dieses Problem korrigiert werden kann. Z.B. Zwillingsuntersuchungen. Mit Zwillingsuntersuchungen kann man prüfen, ob Evidenz für die Beteiligung von Genen an der Ätiologie einer Erkrankung besteht. Eineiige Zwillinge sind genetisch identisch, lässt man mögliche Unterschiede durch somatische Mutationen und in mitochondrialen Genen einmal außer Acht. Daher stimmen die Gene eineiiger Zwillinge auch für monogene Erkrankungen zu 100% überein, sie sind zu 100% konkordant. Zweieiige Zwillinge entstehen aus zwei Eizellen, die von jeweils einem Spermium befruchtet wurden, also aus zwei unabhängigen Zygoten (= dizygot). Sie sind sich also genetisch so ähnlich wie „normale― Geschwister, d.h. sie haben 50% identische Gene. Vergleicht man eineiige mit zweieiigen Zwillingen bezüglich des Auftretens einer Erkrankung, müssen bei eineiigen häufiger beide betroffen sein als bei zweieiigen, wenn genetische Faktoren beteiligt sind. Sind von einem Zwillingspaar beide betroffen, spricht man von Konkordanz, ist nur ein Partner betroffen, von Diskonkordanz. Die Konkordanz-Diskordanz-Analyse beruht also darauf, die Häufigkeit der konkordanten und diskordanten Zwillingspaare zwischen eineiigen und zweieiigen Zwillingspaaren zu vergleichen, um damit Aussagen für die Beteiligung von genetischen Faktoren bei der Ausprägung eines Merkmals treffen zu können. Die Konkordanz-Diskordanz-Analyse erlaubt eine Abschätzung des relativen Anteils genetischer und nicht genetischer (Umwelt-)Faktoren an einer Erkrankung. 104 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen Eine Abwandlung der Zwillingsmethode besteht im Vergleich gemeinsam und getrennt aufgewachsener eineiiger Zwillinge hinsichtlich des Auftretens einer Erkrankung oder der Ausprägung eines Merkmals. Findet sich kein signifikanter Unterschied zwischen gemeinsam und getrennt aufgewachsenen Zwillingen in der Konkordanzrate, weist dies auf geringe Einflüsse durch das familiäre Milieu als Umweltfaktor hin. Eine weitere Methode, die angewendet werden kann, um zwischen genetischen und Umweltfaktoren zu unterscheiden, sind sog. Cross-Foster-Studien (Kreuz-Adoptions-Studien). Hier wird das Auftreten einer Erkrankung zwischen Adoptivkindern verglichen, deren biologische Eltern die Erkrankung aufweisen, aber die Adoptiveltern nicht und umgekehrt (s. Humangenetik). 6. Berechnung der Erblichkeit Der gemessene Wert des phänotypischen Merkmals wird durch zwei prinzipielle Komponenten beeinflusst, nämlich durch einen genetischen und einen Umweltfaktor. Es gilt somit: P=G+E Hierbei bezeichnet P den phänotypischen Wert, G den dem Genotyp zugeordneten Wert und E (für „Environment―) den durch Umwelteinflüsse bedingten Anteil der phänotypischen Merkmalsausprägung. Die phänotypischen Merkmalswerte (d.h. die gemessenen Werte) sind in der Population um einen Mittelwert gestreut. Daraus lässt sich die Varianz dieser Werte bestimmen. Verschiedene Varianzen dürfen mathematisch addiert werden, um eine Gesamtvarianz (Vp) zu bilden. Umgekehrt darf eine Gesamtvarianz (VP) in einzelne additive Varianzkomponenten aufgeteilt werden. Wird VP in einem genotypischen Varianzanteil VG und einen umweltbedingten Varianzanteil VE aufgeteilt, so gilt: VP=VG+VE. Der Anteil der genetischen Varianz (VG) an der phänotypischen Varianz (VP) wird als Erblichkeit oder Heritabilität (H2) bezeichnet. Oft wird die Erblichkeit in Prozent gegeben: H2 = VG/VP × 100 (%). Z.B. in einer Zwillingsstudie betrug die Erblichkeit des Herzinfarkts 57 Prozent bei Männern und 28 Prozent bei Frauen. Als Erblichkeit im engeren Sinn (=Heritabilität, h2) wird der Anteil der additiven genetischen Varianz an der phänotypischen Varianz bezeichnet: h2=VA/VP Siehe für die verschiedenen Berechnungen mehr in Englisch hier. 7. Schwierigkeiten mit den Untersuchungen des genomischen Hintergrundes von den komplexen Erkrankungen Am Anfang der genomischen Ära, sogar unmittelbar nach dem Abschluss des HGPs haben die Experten geglaubt, dass die Genomik die Medizin revolutionieren, und sich die personalisierte Therapie in wenigen Jahren verwirklicht würde. Jetzt, 2012 weiß man schon, dass diese Ziele nicht realisiert wurden, und sichsogar in vielen Jahren auch nicht erfüllen werden. Was kann die Ursache für dieses Phänomen sein? Das Problem ist vielfältig. Eine Erklärung wurde im vorigen Subkapitel (9.3) gegeben. In der Tabelle 9.1 werden einige Eigenschaften der komplexen Erkrankungen bekannt gegeben, die die Aufklärung ihrer genomischen Hintergründe schwer machen. Tabelle 9.1. Tabelle 9.1. Eigenschaften der komplexen Erkrankungen, die die Aufklärung ihrer genomischen Hintergründe schwer machen. Problem Erklärung 105 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen Genetische Heterogenität Verschiedene allelische Kombinationen können zu ähnlichem Phänotyp führen. Phänokopie Umweltfaktoren können zu selbemPhänotyp wie genetische Faktoren führen. Pleiotropie Die gleichen genetischen Variationen können zu verschiedenen Phänotypen führen. Reduzierte Penetranz Die Penetranz wird angegeben in Prozent der Häufigkeit, in der ein Gen sich im Phänotyp manifestiert. Unvollständige Penetranz: Die Penetranz liegt unter 100%. In komplexen Erkrankungen sind die Penetranzen der Variante sehr niedrig. Die genaue Diagnose ist schwer Für komplexe Erkrankungen gibt es oft keinen Diagnose-Standard. Manchmal gibt es Subtypen der Erkrankungen, die mit Standardmethoden nicht differenziert werden können. Die Symptome können sich mit der Zeit verändern. Verschiedene Erkrankungen mit den gleichen Symptomen. Konkordanz von verschiedenen Erkrankungen. 8. Missing heritability In den letzten Jahren wurden viele Methoden entwickelt (s. nächstes Kapitel), die die Identifizierung einer großen Zahl von Genomvarianten ermöglicht haben. Z.B. in GWAS (genome wide association study) kann man mehrere Millionen Varianten in einer Messung bestimmen. Durch diese Studien konnten eine Reihe von beteiligten Genen identifiziert werden, aber mit der Gesamtheit der Ergebnisse kann bislang nur ein geringer Anteil der Erblichkeit der komplexen Erkrankungen und Merkmalen, durchschnittlich weniger als 10%, aufgeklärt werden. Dieses Phänomen wird in Englisch als „missing heritability“ (fehlende Vererbbarkeit) genannt. Z.B. die Größe ist ein QT (quantitativ Merkmal), das sehr leicht zu bestimmen ist, und es ist bekannt, dass die Erblichkeit der Größe ungefähr 80 Prozent ist. Mehrere GWAS wurden in vielen großen Populationen durchgeführt, und 180 Größe assoziierte Loci wurden entdeckt. Aber diese konnten nur 10 Prozent der Erblichkeit der Größe erklären. Das Problem war ähnlich bei den meisten Merkmalen. Dagegen ist es viel besser bei monogenen Erkrankungen gegangen. Bisher wurden die genetischen Hintergründe von ca. 4000 monogenen Erkrankungen aufgeklärt. Siehe Abbildung 9.1, die anhand der Tabelle im Artikel von Manolio et al. angefertigt wurde. Was kann die Ursache für das „missing heritability― sein? Abbildung 9.1. Beispiele für die Fälle der fehlenden Vererbbarkeit. Es wurde anhand der Tabelle im Artikel von Manolio et al. angefertigt (Manolio TA, et al. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature. 2009 Oct 8;461(7265):747-53). 106 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen 9. Schwierigkeiten mit den seltenen Varianten In GWAS werden häufige (MAF > 5%) und bekannte Variante bestimmt. Es gibt eine Hypothese, die „common disease - common variants; oder CD/CV― (häufige Krankheit - häufige Variationen) genannt wird. Diese behauptet, dass die häufigen Krankheiten durch häufige Variationen mit schwachen Wirkungen verursacht werden. Die schwachen Wirkungen dieser Variationen akkumulieren sich, und verursachen höhere Suszeptibilität. Wenn die Umweltfaktoren ungünstig sind, dann können sich die Erkrankungen entwickeln. Es gibt verschiedene Beispiele, dass die Häufige Varianten mit häufigen Erkrankungen assoziieren können. Z.B. die Allelfrequenz des apoE4 ist ~15%, und das Allel wird mit Auftreten der Alzheimer-Erkrankung assoziiert. Sein Vorhandensein reicht jedoch nicht notwendigerweise aus, um die Erkrankung zu verursachen. Viele Träger der E4-Variante erkranken nicht. Auch häufige Allele vom Gen FTO werden mit Obesität assoziiert. Man kann sagen, dass die GWAS für die Untersuchungen solcher Krankheiten geeignet sind, für die die CD/CV Hypothese wahr ist. Es gibt aber auch Beweise für die „common disease - rare variants (CD/RV) (häufige Krankheit - seltene Variationen) Hypothese. Diese behauptet, dass die häufigen Erkrankungen durch seltene Variationen mit starken Wirkungen verursacht werden. Es gibt auch Beispiele für die CD/RV Hypothese. Z.B. bei Brustkrebs wurden mehrere Tausend Mutationen mit starken Wirkungen entdeckt. Und es war der Fall bei der Taubheit oder den psychischen Erkrankungen. Und die seltenen Variationen können nicht mit GWAS bestimmt werden. Es wurde auch bestätigt, dass seltene Variationen auch bei Erkrankungen eine Rolle spielen, wo häufige Variationen bekannt sind. Seltene Variationen können auch zu statistischen Problemen führen. Mit Standard statistischen Methoden können im Allgemein die seltene Variationen nicht finden können. Es kann vorkommen, dass diese Variationen nur je in einem Mensch, oder in einer Familie vorhanden sind. In populationsgenetischen Untersuchungen können diese Variationen nicht bestimmt werden. Manchmal häufige SNPs können positives Signal geben im Lokus, wo die seltene Variation ist, und dadurch falsche Variationen bestimmt sind. Es nennt man als synthetische Assoziation. 10. Epigenetik der komplexen Erkrankungen Die Epigenetik wird in Kapitel 4 ausführlich behandelt. 107 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen Es gibt viele Beweise, dass die steigernde Häufigkeit der komplexen Erkrankungen mit epigenetischen Faktoren erklärt werden kann. Der genomische Hintergrund der Menschheit hat sich nicht in den letzten Jahren verändert, und trotzdem die Häufigkeit vieler Erkrankungen steigern (z.B. Allergie, T2DM, Obesität, Asthma, Psychosen usw.). Umweltfaktoren können die Funktionen der Gene durch epigenetische Modifikationen beeinflussen. Und diese Modifikationen können auch vererbt werden, und das Risiko der Erkrankungen erhöhen. In der Regel sind die intrauterinen Wirkungen die stärksten, aber später gibt es viele wichtige Umweltfaktoren, wie das Rauchen, die Drogensucht oder die Lebensmittel, die die epigenetischen Merkmale beeinflussen. Leider geben die Methoden wie GWAS keine Information über epigenetische Merkmale, und die Methoden sind für die Bestimmung der epigenetischen Modifikationen gar nicht einfach. Außerdem sind die epigenetischen Merkmale in den verschiedenen Zellen oder Geweben unterschiedlich, und können sich in der Zeit ändern. 11. Das zufällige Verhalten des Genoms In September 2010 wurde publiziert, dass die genetischen Schaltungen, die die zellulären Funktionen Regulieren, zufällige Fluktuationen zeigen. Das heißt, dass das Verhalten des Genoms nicht genau vorhergesagt werden kann, deshalb ist es unmöglich sogar von einem bekannten Genom, den zukünftigen Phänotyp eines Neugeborenen genau zu prognostizieren. 12. Statistische Probleme Die meisten Variationen, die mit erhöhtem Risiko assoziieren, steigern das Erkrankungsrisiko nur mit 10-20 Prozent. Das heißt, dass das erhöhte Risiko nur mit 1,1-1,2-mal höher als in den Nicht-Trägern. Die Erkennung der Variationen mit solchen niedrigen Wirkungen ist sehr schwer. Außerdem, da die Populationen genetisch heterogen sind, und es gibt Interaktionen zwischen den Varianten, die mögliche Anzahl der genetischen Hintergründe, die mit der Erkrankungen assoziieren können, praktisch unendlich ist. Vom statistischen Standpunkt ist es vorteilhaft, wenn die Population groß ist, aber eine größere Population ist genetisch heterogener, und die Wirkungen der einzelnen Varianten werden verdünnt und können bei den statistischen Berechnungen verloren gehen. Das andere Problem ist, dass es keine richtigen statistischen Methoden gibt. Ein Hauptproblem ist das multiple Test Problem. Die Alphafehler-Kumulierung, häufig auch α-Fehler-Inflation genannt, bezeichnet in der Statistik die globale Erhöhung der Alpha-Fehler-Wahrscheinlichkeit (Fehler 1. Art) durch multiples Testen in derselben Stichprobe. Anschaulich formuliert: Je mehr Hypothesen man auf einem Datensatz testet, desto höher wird die Wahrscheinlichkeit, dass eine davon (fehlerhaft) als zutreffend angenommen wird. In den modernen Hochdurchsatzmethoden, wie in GWAS, wo Millionen von SNPs in jedem Teilnehmer bestimmt werden, jede Messung (SNP) ist unabhängig, und die Wahrscheinlichkeit des falschen positiven Ergebnisses sind millionenfach. Wie kann man dieser α-Fehler-Inflation entgegenwirken, bzw. sie korrigieren? Die Bonferroni-Korrektur ist die einfachste und konservativste Form, das multiple α-Niveau anzupassen. Die Bonferroni-Methode oder Bonferroni-Korrektur (nach Carlo Emilio Bonferroni) ist ein Verfahren der mathematischen Statistik. Mit ihrer Hilfe wird die Alphafehler-Kumulierung bei multiplen Paarvergleichen neutralisiert. Sie besagt, dass, wenn man n unabhängige Hypothesen an einem Datensatz testet, die statistische Signifikanz, die für jede Hypothese getrennt benutzt werden soll, 1/n der Signifikanz ist, die sich beim Test nur einer Hypothese ergeben würde. Um also das multiple Gesamtrisiko α einzuhalten, muss man in jedem Einzeltest das Signifikanzniveau α' entsprechend anpassen. In der populationsgenetischen Statistik wird p-Wert benutzt. Der p-Wert ist eine Wahrscheinlichkeit und nimmt daher Werte zwischen Null und Eins an. Der Wert wird bestimmt durch die gezogene Stichprobe. Er deutet an, wie wahrscheinlich es ist, ein solches Stichprobenergebnis oder ein noch extremeres zu erhalten, wenn die Nullhypothese wahr ist. Ein häufiges Missverständnis ist die Gleichsetzung dieser Aussage mit der falschen Behauptung, der p-Wert würde angeben, wie wahrscheinlich die Nullhypothese bei Erhalt dieses Stichprobenergebnisses ist. Mit dem p-Wert wird also angedeutet, wie extrem das Ergebnis ist: je kleiner der pWert, desto mehr spricht das Ergebnis gegen die Nullhypothese. In Populationsgenetik hat sich festgesetzte Grenze etabliert. P<0,05 wird hier verwendet, um Entscheidungen zu treffen, ob die Nullhypothese abgelehnt werden kann. Wenn die Nullhypothese verworfen wird, wird das Resultat als statistisch signifikant bezeichnet. 108 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen Signifikant bedeutet hierbei lediglich überzufällig. Die Größe des p-Werts gibt keine Aussage über die Größe des wahren Effekts. Bei der Bonferroni-Korrektur wird der p-Wert mit der Zahl der Messung dividiert. Die sehr konservative Vorgehensweise bei der Bonferroni-Korrektur hat den Nachteil, dass das Ergebnis einen sehr geringen p-Wert aufweisen muss, um als statistisch signifikant gelten zu können. In Populationsgenetik gibt es zwei Möglichkeiten mit denen man einen geringen p-Wert erreichen kann. Entweder die Wirkung der Variation stark ist, oder die Population sehr groß ist. Nach der CD/CV Hypothese ist die Wirkung der Variationen gewöhnlich gering, und deshalb müssen für diese Untersuchungen große Populationen verwendet werden. Außerdem gibt es vielfache Interaktionen (Gen-Gen, Gen-Umwelt, Gen-Gen-Gen, Gen-Gen-Umwelt usw.), die die Gesamtwirkungen beeinflussen können. Sie sind auch unabhängige Hypothesen, und man muss auch mit denen die Kalkulationen korrigieren. Die Anzahl der unabhängigen Hypothesen sind praktisch unendlich. Das heißt, dass die Bonferroni-Korrektur und die ähnlichen Methoden gewöhnlich nicht geeignet für die Identifizierung der schwachen Variationen in Hochdurchsatzmessungen sind. 13. Mögliche Lösungen Es gibt verschiedene Entwicklungen, die die oben genannten Probleme zu lösen versuchen. Z.B., die Resultate des 1000 Genom Projekts wurden für Entwicklungen neuer Chips geführt, mit denen können seltene Variationen (MAF <0,05) bestimmt werden (z.B. Illumina 5M Chip mit ~5 Millionen Markers). Die Entwicklung des NGS kann dazu führen, dass dieses Verfahren für populationsgenetische Untersuchungen geeignet sein wird. Mit NGS kann in einem Genom jede Variation bestimmt werden. Das Problem ist natürlich, dass die statistischen Schwierigkeiten größer sind. Die Handlung der immens großen Datenmenge, die Genauigkeit der Sequenz, die Funktionen der seltenen oder der strukturellen Variationen sind noch alle ungelösten Schwierigkeiten. NGS kann auch für bessere epigenetische Verfahren benutzen, damit man mehr epigenetische Daten bekommen kann. Aber die Auswertung dieser Daten ist auch sehr schwer (s. oben). Es gibt neue Methoden für die statistischen Probleme, die das multiple Test Problem, oder die AlphafehlerKumulierung besser handeln können, und verschiedene Interaktionen, Gen-, Stoffwechsel- oder Proteinnetzwerke besser auswerten können. Z.B. das Bayes-Theorem wird bei der Risikoberechnung in der Humangenetik häufig eingesetzt, und ist daher von besonderer Wichtigkeit. Es erlaubt, ausgehend von zwei oder mehr Alternativhypothesen (a-priori-Wahrscheinlichkeiten), Informationen über Wahrscheinlichkeiten aus verschiedenen Quellen (konditionale Wahrscheinlichkeiten) zu kombinieren und zu einem einzigen Wert zusammenzufassen (a-posteriori-Wahrscheinlichkeit). Mit Bayesscher Statistikkann manauch Netzwerke auswerten und deshalb ist für systemische biologische Zwecke geeignet. Mit besseren statistischen Methoden können aus älteren Daten mehr Information extrahiert werden. Mehrere Ergebnisse wurden neu analysiert, und neue Ergebnisse wurden bekommen. Z.B. mit einer neuen statistischen Methode konnte man 67 Prozent statt 10 Prozent der Erblichkeit der Größe mit den alten GWAS Daten erklären. Es ist eine große Herausforderung, dass 93 Prozent der durch GWAS gefundene Krankheit- oder Merkmalassoziierten Variationen in den nicht kodierenden Regionen lokalisieren. Das ENCODE Projekt hat gezeigt, dass 76,6% dieser nicht kodierenden Variationen innerhalb der DHS (DNase I hypersensitive site) Regionen lokalisieren, oder in Kopplungs-ungleichgewichts (Linkage disequilibrium = LD) mit denen sind. DHS Regionen sind aktiv in manchen Zellen und zeigen Konkordanz zu experimentell bestimmten oder Computer prognostiziert Transkriptionsfaktor Bindestellen. Durch die Ergebnisse des ENCODE Projekts können die Funktionen dieser Variationen besser bestimmt werden. 14. Warum steigern die Häufigkeiten der komplexen Erkrankungen? Viele komplexe Erkrankungen sind wesentlich häufiger als vor einigen Jahrzehnten, besonders in den entwickelten Ländern. Sie sind oft als zivilisatorische Erkrankungen bezeichnet. Ein gutes Beispiel ist die Obesität. Sie ist mit verschiedenen Erkrankungen wie T2DM, Bluthochdruck, Asthma und Atherosklerose assoziiert. Hier kann man folgen, wie in den USA die Häufigkeit der Obesität in den letzten 109 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen Jahrzehnten gesteigert hat. Und der Trend ist ähnlich in anderen entwickelten Ländern, und in anderen Erkrankungen wie z.B. Allergie. Was können die Ursachen für diesen Trend sein? Der genomische Hintergrund hat sich nicht in dieser Zeit geändert. Welche Umweltfaktoren und wie haben diese Steigerungen verursacht? Es gibt verschiedene Hypothese und Erklärungen dafür. Unten werden einige davon vorgestellt. 14.1. Thrifty gene hypothesis Die „thrifty gene hypothesis“, oder Hypothese der sparsamen Gene wurde schon 1962 vom Genetiker James Neel postuliert. Sparsame Gene erlauben es ihren Trägern, in Zeiten des Überflusses und die aus der Nahrung gewonnene Energie in Form von Fett zu speichern. Für die nächste Hungerperiode sind die Träger der "thrifty genes" daher optimal gerüstet. Bleiben die Hungerphasen jedoch aus, erweist sich eine solche Genausstattung aber als Nachteil. Die sparsamen Gene bewirken zunächst, dass ihre Träger fettleibig werden. In den modernen Zeiten besonders in den entwickelten Ländern gibt es keine Hungerperiode, und deshalb werden mehr und mehr Menschen fettleibig, und Fettleibigkeit kann zu den anderen Erkrankungen führen. Eine ähnliche Hypothese ist die sparsame Phänotyp Hypothese. Damit kann man die hohe Zahl des Bluthochdrucks in den schwarzen Amerikanern erklären. Früher war es Vorteilhaft, besonders in warmen Regionen, wie in Afrika, wenn man wenigeres Salz losgeworden ist. In diesen Zeiten gab es viel wenigeres Salz, und das normale Natrium Chloride Niveau ist notwendig für das gesunde Leben. Dadurch hat der Salz-sparsame Genotyp damals einen selektiven Vorteil gegeben. Heute, wenn das Salz reichlich ist, sich die Menschen weniger bewegen, die meisten schwarzen Amerikanern in kühlerem Klima leben, dieser Genotyp kann dazu führen, dass sich das Salz akkumuliert, und das Bluthochdruck verursachen kann. Aber die Salz-Akkumulierung kann bei anderen Populationen vorkommen. Der Selektionsdruck hat Verlangen für Salz in allen Menschen verursacht, und weil das Salz heutzutage reichlich ist, essen die meisten Menschen heute mehr Salz als nötig ist. Es gibt viele Beispiele für diese Hypothesen. Die Pima-Indianer in Arizona und die Bewohner der Pazifikinsel Nauru haben bei Diabetesforschern traurige Berühmtheit erlangt: Fast jeder zweite Angehörige dieser Volksgruppen leidet an dem T2DM. Sie sind Extrembeispiele für eine Entwicklung, die sich auch in den meisten anderen Volksgruppen vollzieht. Die Häufigkeit des T2DM nimmt auch unter Chinesen, Japanern, Indern und Schwarzafrikanern sowie unter den Ureinwohnern von Australien, Papua-Neuguinea und Amerika dramatisch zu. Auslöser hierfür ist ein zunehmend an westlichen Standards orientierter Lebensstil mit einer kalorienreichen Nahrung und wenig Bewegung. 14.2. Hygiene-Hypothese Die Steigerung der Häufigkeit der Allergie und Autoimmunerkrankungen wird oft mit der Hygiene-Hypothese erklärt. Es heißt, dass übertriebene Hygienemaßnahmen für eine mangelnde Aktivierung („Unterforderung―) des Immunsystems – vor allem in der Kindheit und frühen Jugend – führen können. Es wird vermutet, dass der Kontakt mit bestimmten Bakterien insbesondere in den ersten Lebensmonaten wichtig ist, um das Immunsystem, das während der Schwangerschaft eher Th2-lastig ist, wieder in Richtung einer Th1-Antwort zu lenken, die weniger mit allergischen Reaktionen assoziiert ist. Die physiologische Funktion von IgEAntikörpern ist die Abwehr von Wurm- und anderem Parasitenbefall. Der Rückgang parasitärer Erkrankungen könnte zu einer Umlenkung des Immunsystems auf andere, harmlose Strukturen führen. Hierfür spricht das geringere Aufkommen von Allergien in Ländern mit geringeren Hygienestandards. Da in den westlichen Industrienationen Parasitenbefall so gut wie nicht mehr vorkommt, bei allergischen Reaktionen aber eine verstärkte IgE-Antikörper-Bildung vorliegt, wird geprüft, ob hier ein Zusammenhang bestehen könnte. Viele Beispiele bestätigen diese Hypothese. Die Karelians leben in Russland und in Finnland. Die finnischen Karelians leben in viel höher Hygiene als die russischen. Und, obwohl die zwei Populationen zur gleichen ethnischen Gruppe gehören, die Häufigkeit der Allergie in finnischen Karelians ist wesentlich höher, als in den russischen. Das NOD (non-obese diabetes) Maus ist ein gutes Model für den Autoimmun T1DM. Wenn die Mäuse in keimfreier Umgebung gehalten werden, dann entwickelt sich der T1DM viel häufiger. Die frühe Verwendung der Antibiotika verändert die Darmflora und assoziiert mit Obesität, Autoimmunerkrankungen und anderen Erkrankungen. Es gibt auch eine alte Freunde Hypothese (Old Friends 110 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen hypothesis), die sagt, dass die Menschen und auch das menschliche Immunsystem zusammen mit vielen Mikroben entwickelt haben. Unseren neuen Lebensstil, die Verwendung der Antibiotika haben diese Mikrobepopulationen verändert, und so haben wir unsere alten Freunde verloren, und unser Immunsystem kann nicht mehr richtig funktionieren. Eine andere Hypothese ist die Th1 Reifung Hypothese. Kinder mit angeborenem Defekt in der Th1 Reifung konnten früher zu den Infektionen nicht richtig antworten, und haben oft früh gestorben. Heute bleiben sie am Leben, aber können sich mit größerer Wahrscheinlichkeit Allergie oder Asthma entwickeln. 14.3. Weitere Theorien Es gibt eine Theorie, die sagt, dass es genetische Variationen gibt, die früher Selektionsvorteil gegeben haben, aber heute machen sie die Trägers anfälliger für bestimmte Erkrankungen. Solche Variationen können z.B. sein, die mit Entzündungen assoziieren. Früher könnte es Vorteilhaft sein, wenn ein Genotyp mit einer starken Immunantwort assoziiert hat, weil es eine größere Chance für das Überleben der Infektionen geben konnte. Heute aber können diese Variationen zu chronischen Inflammationen führen, und mit Erkrankungen wie Asthma, Allergie, oder Atherosklerose assoziieren. Es gibt Variationen, die in jungem Alter Vorteilhaft sind, aber später können schädlich sein und umgekehrt. Das nennt man antagonistische Pleiotropie. Eine stärkere entzündliche Antwort kann in jungem Alter Vorteilhaft sein, aber später mit chronischen entzündlichen Erkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, AlzheimerErkrankung, Atherosklerose assoziieren. Allergene wie das Hauptallergen der Birke, Bet v 1, können sich an Dieselrußpartikel (auch Feinstaub) anheften und so beim Einatmen unter Umständen in tiefere Lungenabschnitte gelangen. Es ist möglich, dass die Dieselrußpartikel als „Träger― der Allergene auch eine adjuvante (unterstützende) Wirkung haben und somit eine Sensibilisierung fördern. Es kann eine Erklärung für die Häufigkeit der Allergie in größeren Städten sein. Viele Menschen leben anderswo als ihr Vorfahren, die für bestimmte Umwelt selektiert wurden. Für die neue Umgebung können sie sich nicht anpassen, und sie entwickeln sich verschiedene Erkrankungen. Z.B. Menschen, deren Vorfahren aus Afrika stammen, und heute in nördlichen Ländern leben, bekommen zu wenig Sonnenlicht, entwickeln sich D-Vitamin Mangel und oft Autoimmunerkrankungen. 15. Literatur 1. Murken J et al. Taschenlehrbuch Humangenetik. Thiemen, http://www.ebook3000.com/Taschenlehrbuch-Humangenetik--Auflage--8-_176255.html 8. Auflage; 2. Sørensen TI, et al. Childhood body mass index--genetic and familial environmental influences assessed in a longitudinal adoption study. Int J Obes Relat Metab Disord. 1992 Sep;16(9):705-14. 3. Manolio TA, et al. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature. 2009 Oct 8;461(7265):74753. 4. Kaati G, et al. Cardiovascular and diabetes mortality determined by nutrition during parents' and grandparents' slow growth period. Eur J Hum Genet. 2002 Nov;10(11):682-8. 5. Eldar A, Elowitz MB. Functional roles for noise in genetic circuits. Nature. 2010 Sep 9;467(7312):167-73. 6. Moore JH, Asselbergs FW, Williams SM (2010) Bioinformatics challenges for genome-wide association studies. Bioinformatics 26: 445-455. 7. Yang J et al.: Genomic inflation factors under polygenic inheritance. Eur J Hum Genet. 2011;19(7):807-12. 8. Torkamani A, Topol EJ, Schork NJ. Pathway analysis of seven common diseases assessed by genome-wide association. Genomics. 2008 Nov;92(5):265-72. 9. Johnson RJ, Andrews P, Benner SA, Oliver W. Theodore E. Woodward award. The evolution of obesity: insights from the mid-Miocene. Trans Am Clin Climatol Assoc. 2010;121:295-305; 111 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen 10. Lev-Ran A, Porta M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes Metab Res Rev. 2005 Mar-Apr;21(2):118-31. 11. Franceschi C, et al. Inflamm-aging. An evolutionary perspective on immunosenescence. Ann N Y Acad Sci. 2000 Jun;908:244-54. 12. Capri M et al. Human longevity within an evolutionary perspective: the peculiar paradigm of a postreproductive genetics. Exp Gerontol. 2008 Feb;43(2):53-60. 13. Candore G et al. Inflammation, longevity, and cardiovascular diseases: role of polymorphisms of TLR4. Ann N Y Acad Sci. 2006 May;1067:282-7. 14. ENCODE Project Consortium, et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 2012 Sep 6;489(7414):57-74. 16. Fragen 1. Was wissen Sie über die allgemeinen Merkmale der komplexen Erkrankungen? 2. Geben Sie Beispiele für Umweltfaktoren! 3. Warum ist es wichtig den genomischen Hintergrund der komplexen Erkrankungen zu untersuchen? 4. Warum ist es schwierig die Gesamtwirkung der Variationen zu schätzen? 5. Was bedeutet „genomic Profiling―? 6. Was bedeutet QT und QTL? 7. Geben Sie Beispiele für qualitative und quantitative Störungen! 8. Was bedeutet intermediärer Phänotyp, und was ist seine Bedeutung? 9. Was wissen Sie über Heritabilität? 10. Was ist der λR Wert? 11. Was ist das Problem mit dem λS Wert? 12. Was ist die Konkordanz-Diskordanz-Analyse? 13. Wie kann man das Problem mit dem λS Wert korrigieren? 14. Wie kann man die Erblichkeit berechnen? 15. Was sind die Schwierigkeiten mit den Untersuchungen des genomischen Hintergrundes von den komplexen Erkrankungen? 16. Was bedeutet die genetische Heterogenität? 17. Was ist Phänokopie? 18. Was bedeutet Pleiotropie? 19. Warum ist die genaue Diagnose der komplexen Erkrankungen schwer zu stellen? 20. Was bedeutet ―missing heritability― in Genomik, und was kann ihre Ursache sein? 21. Was bedeuten die CD/CV und CD/RV Hypothese? 22. Was bedeutet synthetische Assoziation? 23. Was wissen Sie über die Epigenetik der komplexen Erkrankungen? 112 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Der genomische Hintergrund der komplexen Erkrankungen 24. Was ist der Konsequenz des zufälligen Verhaltens des Genoms? 25. Was ist das multiple Test Problem und womit kann man es korrigieren? 26. Geben Sie Beispiele für die Entwicklungen, mit denen die Probleme mit der Aufklärung des genomischen Hintergrunds der komplexen Erkrankungen überwinden werden können! 27. Was hat das ENCODE Projekt gezeigt über die Ergebnisse von GWAS? 28. Warum steigern die Häufigkeiten der komplexen Erkrankungen? Welche Hypothese wissen Sie darüber? 29. Was ist die thrifty gene hypothesis? 30. Was ist die sparsame Phänotyp Hypothese? 31. Was ist die Hygiene-Hypothese? 32. Was ist die alte Freunde Hypothese? 33. Was ist die Th1 Reifung Hypothese? 34. Was bedeutet die antagonistische Pleiotropie? 35. Was kann die Konsequenz für Migration sein? 113 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 10. Genomische Methoden für komplexe Erkrankungen Csaba Szalai In diesem Kapitel werden die wichtigsten genomischen Methoden für die komplexen Erkrankungen und auch einige dazugehörige theoretische Überlegungen aufgeführt. Genetische Grundmethoden werden hier nicht erklärt. 1. Genetische Markers Genetische oder DNA Markers sind Sequenz-Varianten mit einer bekannten Lokalisierung in einem Chromosom, mit denen man Einzelpersonen identifizieren oder zwischen Allels in homologen Chromosomen unterscheiden kann. In Genetik werden zwei Markersorte verwendet: Mikrosatelliten und SNPs. Mikrosatelliten (bis 5 Basenpaare, die sich 8–25-mal tandemartig wiederholen). Sie machen ca. 0,5% des Genoms aus und sind im Genom verstreut zu finden. Die Zahl der Wiederholungen kann sich bei den Zellteilungen ändern, wodurch ebenfalls Polymorphismen entstehen. Diese sind die Grundlage der STRPs (short tandem repeat polymorphisms). Ca. 30.000 Mikrosatelliten sind im menschlichen Genom bekannt. Mikrosatelliten sind die häufigste Form repetitiver DNA. Am häufigsten sind die Dinukleotidwiederholungen vom Typ (CA)n. Die DNA-Fragmente werden mithilfe der PCR amplifiziert. Die PCR-Primer sind durch Fluoreszenzfarbstoffe markiert, für genomweite Kopplungsanalysen können vorwiegend Mikrosatellitenmarker benutzt werden. Ein Mikrosatellit kann viel mehr Allels haben als ein SNP, und früher wurde für Genkartierung und genomweite Kopplungsanalysen vorwiegend Mikrosatellitenmarker benutzt. Aber der Bestimmung der Mikrosatellitenmarker ist für Durchsatzmethoden nicht geeignet. In populationsgenetischen Untersuchungen wurden gewöhnlich zwischen 300-800 solche Markers verwendet. Ein SNP ist aufgrund eines Austausches nur eines einzigen Nukleotids entstanden, aber es gibt viel mehr SNPs (> 54 Millionen), und sie können viel leichter bestimmt werden, und so sind viel geeigneter für Hochdurchsatz Screeningverfahren. Mit den modernen SNP-Chips können mehrere Millionen davon in einer Messung bestimmt werden. Weil die SNPs viel dichter nebeneinander als die Mikrosatelliten liegen, die Wahrscheinlichkeit ist viel größer, dass SNP Marker mit den funktionellen Varianten gekoppelt sind, und deshalb geht man jetzt für genomweite Kopplungsanalysen zunehmend auf SNPs über. 2. Methoden für die genomischen Hintergründe der Erkrankungen 2.1. Untersuchungen der genetischen Varianten Es gibt zwei Methodensorten für die Suche für Erkrankung assoziierte genetische Varianten: • Hypothesengesteuerte Methoden, wie Kandidatengen Assoziationsstudien, Single Gen Sequenzierung usw. Sie sind genetische Methoden. • Hypothesenfreie Methoden, wie genomweite Kopplungsanalysen, genomweite Assoziationsstudien (GWAS), Exome Sequenzierung, Gesamtgenom Sequenzierung usw. Sie sind genomische Methoden. Genetische Varianten spielen wichtige Rollen in Suszeptibilität für Erkrankungen, Verschiedenheiten zwischen Menschen, Antworten zu Drugs usw., und deren Untersuchungen können zu Entdeckung neuer Drug Targets, personalisierte Therapie usw. führen. Das HGP und die folgenden Projekte (Human Variome Project, HapMap, 1000 Genome Project usw.) haben Millionen von genetischen Varianten entdeckt. Jetzt gibt es mehr als 54 Millionen kürze Varianten und mehr als 10 Millionen strukturelle Varianten in den Datenbanken. 114 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genomische Methoden für komplexe Erkrankungen Die einfachste Methode für die Untersuchung des genetischen Hintergrunds einer Erkrankung ist Kandidatengen Assoziationsstudie. Hier werden Gene ausgewählt, über die man vermutet, dass in der Erkrankung eine Rolle spielen. Dann werden Varianten in diesen Genen gesucht. Früher wurden die Gene sequenziert, heute enthalten SNP Datenbanken (z.B. dbSNP) alle häufige Varianten. Die vorige nennt man in Englisch „wet“ oder nasse Labormethode, die zweite ist die „in silico“ Methode. Dann werden die ausgewählten Varianten gewöhnlich in zwei Populationen genotypisiert, die eine hat das untersuchte Merkmal (z.B. die Krankheit), die andere nicht (Kontrollpopulation; Fall-Kontroll-Studien). Dann werden die Frequenzen der Variationen in den zwei Populationen verglichen. Weichen die Frequenzen einer Variante in den zwei Populationen signifikant voneinander ab, sagt man, dass diese Variante mit dem Merkmal assoziiert ist. Mehrere 10 Tausend solche Assoziationsstudien wurden in den letzten Jahrzehnten durchgeführt, aber es gibt viele Probleme mit dieser Methode. Vielleicht das wichtigste sind die vielen falschen positiven Ergebnisse. Es ist dasselbe Multiple Test Problem, wie bei GWAS in dem vorigen Kapitel. In der Welt untersuchen verschiedene Forschungsgruppen dieselben Varianten. Die Wahrscheinlichkeit ist groß, dass in einer Gruppe eine davon (fehlerhaft) als zutreffend angenommen wird. Und es ist immer viel leichter positive Assoziation zu publizieren. Es nennt man als „publication bias―. Deshalb gibt es sehr viele falsche positive Ergebnisse in der wissenschaftlichen Literatur. Die andere Schwäche ist, dass nur die bekannten Gene mit dieser Methode untersucht werden, und es gibt wenige Möglichkeiten für die Entdeckung von neuer Gene, Pathomechanismen, oder Stoffwechselwegen. Die hypothesenfreien genomischen Methoden können diese Schwäche mindern. Zuerst wurden genomweite Kopplungsanalysen eingeleitet, und in vielen komplexen Erkrankungen durchgeführt. In diesen Untersuchungen wurden Mikrosatelliten und Familien mit mindesten zwei betreffenden Geschwistern (in Englisch affected sib pair (ASP)) verwendet. Hier wird LOD-score („Log of the Odds―) kalkuliert. Für die Berechnung und Bedeutung von LOD-score siehe Humangenetik. Kurzum, geben die Lod-Scores den Logarithmus (zur Basis 10) der statistischen Sicherheit der Schätzung von der Kopplung zwischen der Erkrankung und dem Marker an. Bei der Schätzung wird allgemein angenommen, dass mit einem Lod-Score von 3 oder größer die Kopplung statistisch gesichert ist. Dies entspricht einer Wahrscheinlichkeit von 1:1000, womit eine statistische Signifikanz von p = 0,05 erreicht wird. Bei einem Lod-Score von –2 ist eine Kopplung zwischen der Erkrankung und dem Marker statistisch gesichert ausgeschlossen. Diese Methode hat viele interessante Ergebnisse gegeben, aber es gibt damit verschiedene Probleme. Zuerst, ist es nicht leicht viele Familien mit zwei betreffenden Geschwistern zu sammeln. Zweitens, ist die Bestimmung der Mikrosatelliten kompliziert und teuer. Deshalb wurden gewöhnlich nicht mehr als 400 in den Untersuchungen verwendet. Es bedeutet, dass die Wahrscheinlichkeit groß ist, dass kein Mikrosatellit mit der funktionellen Variante in Kopplung ist. Außerdem kann dieses Verfahren nur große Genomregionen und nicht Gene bestimmen. Diese Genomregionen können mehrere Megabase lang sein, und mehrere Hundert Gene enthalten. Die Bestimmung der funktionellen Gene fordert weitere Methoden. 2.2. GWAS Heutzutage ist die populärste Methode für die Untersuchungen der genomischen Hintergründe der komplexen Erkrankungen und Merkmale die genomweite Assoziationsstudie (genome wide association study, GWAS). Bei GWAS werden hochauflösende DNA-Chips eingesetzt, die die gleichzeitige Typisierung von bis zu 4,3 Mio. SNPs einer Person erlauben. Es werden jeweils mehrere unabhängige Kollektive untersucht (Prinzip der Replikation), die zusammen meist mehrere Tausend Personen umfassen. Die enormen Datenmengen erfordern auch einen erheblichen bioinformatischen Aufwand. In 2007 wurde dieses Verfahren für Durchbruch des Jahres ausgewählt. Es gibt verschiedene Firmen, die die SNP-Chips produzieren. Die zwei Größte sind: Affymetrix und Illumina. In den neuen Chips werden nicht nur SNPs bestimmt, aber auch CNVs. Die CNVs werden durch Kopplung mit SNPs bestimmt. Der Illumina HumanOmni5-Quad (Omni5) Chip kann 4,3 Millionen tagSNPs bestimmen. Diese SNPs wurden aus Internationalem HapMap, und 1000 Genom Projekt ausgewählt. Es gibt Varianten mit MAF von 1 Prozent. Weil die SNPs dicht nebeneinander liegen, ist die Wahrscheinlichkeit ziemlich groß, dass einige davon mit den funktionellen Varianten in Kopplung sind, und mit der Erkrankung oder dem Merkmal assoziieren. Die GWAS ist für die Untersuchungen quantitativer und qualitativer Merkmale geeignet. Mit GWAS wurden schon um 8000 Merkmale assoziierte SNPs identifiziert und in Datenbanken wie in Catalog of Published Genome-Wide Association Studies veröffentlicht. Die Zahl der SNPs steigern ständig, und diese 115 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genomische Methoden für komplexe Erkrankungen sind mit großer Wahrscheinlichkeit richtige Assoziationen, weil die Genehmigung der Veröffentlichung sehr strikte statistische Bedingungen fordern. 2.3. Auswertung der GWAS Ergebnisse Die Auswertung von GWAS Daten ist eine große bioinformatische Herausforderung. Wie in dem vorigen Kapital erwähnt wurde, eines des größten Problems ist das Multiple Test Problem. Wenn man z.B. 1.000.000 SNPs genotypisiert, laut der Bonferroni-Korrektur ist der p-Wert = 5×10-8. Das nennt man als genomweite Signifikanz (genome wide significance) Niveau. Da das Hauptmerkmal der komplexen Erkrankungen der CD/CV Hypothese zufolge die Varianten mit schwächen Wirkungen ist, müssen für die Wahrnehmung der Varianten große Populationen sammeln. Für Varianten mit sehr schwächen Wirkungen kann die Zahl der erforderlichen Teilnehmer mehrere 100.000 sein. Solche viele Teilnehmer sind sehr schwierig zu sammeln, in seltenen Erkrankungen ist die Sammlung sogar unmöglich. Aus diesem Grund wurden GWAS oft von großen internationalen Konsortien durchgeführt (z.B. WTCCC, Kapitel 11). Ein Verfahren, das dieses Problem mildern kann, ist, wenn mehrere kleinere Populationen unabhängig untersucht werden. Auf diese Weise werden die p-Werte in den unabhängigen Studien für jeden SNP multipliziert, und es ist einfacher, die niedrigen p-Werte zu erreichen (z.B. 10-3×10-3 = 10-6). Üblicherweise wird eine Entdeckung GWAS in einer kleineren Population (Entdeckungskohorte) durchgeführt.Dann werden SNPs mit einer nicht so strengen p-Wert ausgewählte (z.B. Cut-off-p-Wert <5 x 10-2), dann mehrere unabhängigen Populationen werden gesammelt (Replikationskohorten), und nur die ausgewählten SNPs untersucht.Die SNPs, die in den Replikationskohorten bestätigt werden können, werden diejenigen, die mit der Erkrankung wirklich assoziieren. Wie es in Kapitel 9 diskutiert wird, neue statistische Methoden wie Bayes-Statistik sind ebenfalls in der Entwicklung. Es gibt Methode wie Stoffwechselweg Analyse (pathway analysis) oder Stoffwechselweg Anreicherung Analyse (Pathway enrichment analysis). Hier werden die Gene, die zu dem gleichen Stoffwechselweg gehören, gruppieren, die einzelnen Gruppen analysieren, ob die Verteilung der Varianten sich in den Gruppen zwischen den Populationen unterscheiden. Für diese Analysis stehen verschiedene Datenbanken wie Gene Ontology (GO; http://www.geneontology.org)) oder KEGG zur Verfügung. Mit diesen Methoden wurden mehrere neue Erkrankung-assoziierte Stoffwechselwege identifiziert. 2.4. Partial Genom-Screening Partial Genom-Screening Studien (PGAS) sind einfacher Variationen der genomweite Assoziationsstudien. In diesen Untersuchungen werden in den Genomregionen, die mit genomweite Kopplungsanalysen oder GWAS identifiziert wurden, mit dicht nebeneinander liegende SNPs, SNP-Screenings durchgeführt. In diesen Studien werden viele der statistischen Schwierigkeiten gelöst, und es gibt eine größere Chance, die verantwortlichen Gene oder Varianten zu finden. 2.5. Positionelle Klonierung Positionelle Klonierung ist die Methode, wenn Gene in den Genomregionen, die durch Kopplungsstudien gefunden wurden, mit in vitro und in vivo Experimenten identifiziert und verifiziert werden. S. http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_screen#Positional_cloning. 2.6. Persönliche Genomik Neben den strengen wissenschaftlichen Studien werden die Ergebnisse und Methoden der Genomik von gewinnorientierten Unternehmen genutzt. Es heißt direkt an die Verbraucher Service (Direct to Consumer, DTC). S. mehr in http://en.wikipedia.org/wiki/Personal_genomics, und vorigem Kapitel 9.3. Einige Unternehmen nutzen die erhobenen Daten auch für wissenschaftliche Studien, natürlich, nachdem die Einwilligung von den Teilnehmern unterzeichnet worden ist. Die 23andMe beispielsweise hat bereits ein Papier über den genomischen Hintergrund der Parkinson-Krankheit veröffentlicht (s. http://www.plosgenetics.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pgen.1002141) 116 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genomische Methoden für komplexe Erkrankungen Die Erfahrungen sind in der Regel positiv. Früher wurde allgemein angenommen, dass, wenn eine Person Daten empfängt, dass er / sie ein größeres Risiko für eine bestimmte Krankheit hat, wird er / sie depressive sein oder es wird seine / ihre Psyche negativ beeinflussen. Aber laut Umfragen hat man keine solchen Dinge erlebt. Möglicherweise ist es ähnlich, wenn jemand ein Raucher oder fettleibig ist, und weiß, dass er/sie eine größere Chance für die Entwicklung von mehreren schweren Krankheiten hat, aber wird nicht depressiv.Im Gegensatz dazu, veränderten die meisten Teilnehmer ihre Lebensweise, um die Krankheit zu vermeiden.Es muss jedoch hinzugefügt werden, dass diese Teilnehmer müssen mehr gesundheitsbewusst als der Durchschnittsmensch sein. Möglicherweise ist es ähnlich, wenn jemand ein Raucher oder fettleibig ist, und weiß, dass er/sie eine größere Chance für die Entwicklung von mehreren schweren Krankheiten hat, aber wird nicht depressiv.Im Gegensatz dazu, veränderten die meisten Teilnehmer ihre Lebensweise, um die Krankheit zu vermeiden.Es muss jedoch hinzugefügt werden, dass diese Teilnehmer müssen mehr gesundheitsbewusst als der Durchschnittsmensch sein. 2.7. Sequenzierung der nächsten Generation Über die Sequenzierung der nächsten Generation (next generation sequencing oder NGS) kann mehr in Kapitel 8 erfahren werden.Derzeit NGS ist zu teuer, und resultiert in zu vielen und unsicheren Daten, und auf diese Weise ist es nicht geeignet für Populationsstudien. Oft werden seine reduzierten Varianten verwendet. Eine solche Anwendung ist die Exom Sequenzierung, wo nur die Protein-kodierenden Bereiche sequenziert werden, die etwa 30 Mb oder 1% des gesamten Genoms sind.Nach Schätzungen sind 85% der Mutationen von den monogenen Erkrankungen in dieser Region. Sein Nachteil ist, dass die Mehrheit der Variationen in den komplexen Krankheiten außerhalb dieser Region liegt.Aber möglicherweise liegen die seltenen Varianten mit starken Effekten eher hier. Mit der Entwicklung der NGS mehrere Verfahren wurden mit Verwendung der Technik ausgearbeitet. Die zentrale Methode des ENCODE Projektes war die DNase-seq. Die DNase I-Enzym schneidet vorzugsweise lebendige Chromatin Präparationen wo spezielle (Nicht-Histon-) Proteinen in der Nähe sind.Die daraus resultierenden Schnittpunkte werden dann mit Hochdurchsatz-Sequenzierung sequenziert, um diese Regionen, die überempfindlich für DNase I sind zu bestimmen. Diese Regionen zeigen Konkordanz zu experimentell bestimmten oder Computer prognostiziert Transkriptionsfaktoren oder Enhancer-Bindestellen. ChIP-seq. Ziel der Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) ist es, festzustellen, ob bestimmte Proteine (meist Transkriptionsfaktoren) bestimmte Teile des endogenen Chromatin lebendiger Zellen oder Geweben binden. Das Grundprinzip der Chromatin-Immunopräzipitation beruht darauf, die zu einem Zeitpunkt bestehenden Protein-DNA-Bindungen durch Fixierung mit Formaldehyd festzuhalten. Anschließend werden die Zellen zerstört und das Chromatin mittels Ultraschall in Stücke von einigen hundert Basenpaaren Länge zertrümmert. Jene DNA-Stücke, die das gewünschte Protein gebunden haben, werden mit einem für das Protein spezifischem Antikörper immunopräzipiert (isoliert). Die isolierten DNA-Protein-Komplexe werden gelöst. Die Identität der jeweiligen DNA-Stücke kann auf verschiedene Weise geklärt werden. In ChIP-seq werden die DNA-Stücke mit NGS sequenziert. 2.8. Bestimmung der Genexpression Die dritte grundlegende Methode zur Untersuchung des genomischen Hintergrunds von Krankheiten ist die Bestimmung der Genexpression. Die Theorie ist, dass, wenn das Expressionsniveau eines Gens sich in einem pathologischen Gewebes relativ zu dem gesunden Gewebe unterscheidet, dann kann dieses Gen in dem Pathomechanismus der Krankheit beteiligt sein.Ebenso verändern externe Effekte des Niveaus der Genexpression, also können ihre (z.B. Arzneimittel) Wirkungen untersucht werden.Das Problem ist, dass es oft sehr schwierig ist, lebende Gewebe zu gewinnen. Z.B.: Für die Untersuchung der Atherosklerose ist das beste Gewebe die atherosklerotischen Plaques von großen Arterien, in Asthma ist die Lunge, in Alzheimer Erkrankungen ist das Gehirn, in T1DM ist das Pankreas usw. So werden diese Bestimmungen in den meisten Krankheiten aus anderen Quellen, wie Gewebe von Modell-Tiere, oder aus Zell-oder Gewebekulturen durchgeführt. Die wichtigsten Ausnahmen in dieser Hinsicht sind die Tumoren, die in der Regel entfernt werden, und können ex vivo analysiert werden. Es ist der Grund, warum die Bestimmung der Genexpression in der klinischen Praxis nur in der Onkologie vorkommt. Diese Technik entwickelt sich in ähnlicher Geschwindigkeit wie die Sequenzierung oder Genotypisierung. Erstens konnte die Expression von nur einem Gen gemessen werden und wurde durch Vergleich ihrer 117 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genomische Methoden für komplexe Erkrankungen Expression zu einer internen Kontrolle, oder ein Haushaltsgen quantifiziert. (Ein Haushaltsgen (auch englisch housekeeping gene, nicht-reguliertes Gen, konstitutiv exprimiertes Gen) ist ein Gen, welches unabhängig von Zelltyp, Zellstadium und äußeren Einflüssen exprimiert wird, im Gegensatz zu den regulierten Genen. Haushaltsgene sind typischerweise Gene, die die Strukturmoleküle und Enzyme, die mit dem Grundstoffwechsel von Zellen zusammenhängen, beispielsweise mit dem Glukose-Stoffwechsel, codieren. http://de.wikipedia.org/wiki/Haushaltsgen) Später spezielle Geräte wurden (real time PCR) zur Quantifizierung der Genexpression entwickelt, und dann kamen die Mikroarrays, mit denen die Expression aller Gene auf einem Chip oder Array gemessen werden konnte. Zunächst waren die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Messung nicht sehr gut und es war sehr teuer, aber später wurde das Verfahren erheblich verbessert und deutlich billiger, so könnte es in die StandardDiagnoseverfahren in einigen Bereichen eingeführt werden.Heutzutage kommt ein neuartiges Verfahren, das wahrscheinlich die traditionelle (aber nicht zu alte) Methode ersetzen wird. Diese Methode ist die RNASequenzierung, oder RNA-Seq. Als RNA-Seq wird die Bestimmung der Nukleotidabfolge der RNA bezeichnet. Hierfür wird die RNA in cDNA übersetzt, damit die Methode der DNA-Sequenzierung (NGS) angewendet werden kann. RNA-Seq enthüllt Informationen zur Genexpression, wie zum Beispiel unterschiedliche Allele eines Gens exprimiert sind. Im Falle von RNA-Seq sind auch das Erkennen von posttranskriptionalen Modifikationen oder Identifizierung von Fusions-Genen möglich. Die Entwicklung von NGS auch beschleunigt und verbessert die epigenetischen Studien. Durch Behandlung von DNA mit Natriumhydrogensulfit (alter Name Bisulfit) werden Cytidine (C) in Uracil (U) umgewandelt. Bei einer anschließenden Sequenzierung findet man daher an den Stellen, wo vorher ein C war, nun ein U/T. Da bisulfit-behandelte DNA sehr labil ist, wird daher das Gen, das man analysieren möchte, mittels PCR wieder amplifiziert. Bei der nachfolgenden Sequenzierung werden dann T bzw. TG (Thymin-Guanosin-Dimere) identifiziert, wo in der unbehandelten DNA Cytosin bzw. CG-Dimere existierten. Für die epigenetische Analyse ist wichtig, dass nur nicht-methylierte C-Basen konvertiert werden, während meC in CG-Dimeren nicht in Thymin konvertiert werden. Man kann daher mit dieser Methode exakt analysieren, welche CG-Dimere in einer bestimmten Zelle methyliert waren. 2.9. Weitere Microarray-basierte Methoden Mehrere neue Mikroarray-basierten Verfahren sind in den letzten Jahren entwickelt worden. Nach der Entdeckung der miRNA, haben Produkte auf dem Markt erschienen, mit denen diese gemessen werden konnten. Vergleichende genomische Hybridisierung ( comparative genomic hybridization , CGH) macht sich zunutze, dass nach einer Hybridisierung die Fluoreszenzintensität an einem speziellen Locus mit der Zahl der gebundenen Sondenfragmente korreliert. Die Methode wird eingesetzt, um Deletionen und Amplifikationen (d.h. CNV) von DNA-Sequenzen im Genom nachzuweisen und zu kartieren. Die Array-CGH hat das Potenzial, kleinere CNVs (von weniger als 100 kb) zu detektieren, die mit anderen Verfahren nicht identifiziert werden können. ChIP-on chip Array ist eine ähnliche Methode wie die ChIP-Seq, nur die Bestimmung ist array-basierte. 3. Tiermodelle 3.1. Die Vorteile der Tiermodelle Tiermodelle und Tierexperimente spielen eine wichtige Rolle bei der Untersuchung des genomischen Hintergrunds komplexer Krankheiten. Es gibt Krankheiten, wo der Großteil unserer Kenntnisse über ihre molekulare Pathogenese aus Tiermodellen stammen. Welche Vorteile haben die Verwendung von Tieren? • Die Versuchstiere können oft frei gekreuzt werden. Im Gegensatz zum Menschen, gibt es eine größere Möglichkeit, die Verbindung zwischen Genotypen und Phänotypen durch mehrere Generationen zu untersuchen. • Es ist viel einfacher QTL Studien durchzuführen. Die Generationszeit von einer Maus ist 2 Monate (bei Menschen ist es 20-30 Jahre), also in einem Jahr können mehrere Maus-Generationen untersucht werden.Mit gerichteten Kreuzungen und Rückkreuzungen können die Segregation der genetischen Marker und Symptome oder QTs durch mehrere Generationen verfolgt werden. 118 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genomische Methoden für komplexe Erkrankungen • Es gibt verschiedene Mausstämmen, die sich voneinander in Krankheit-Suszeptibilitäten oder anderen Phänotypen unterscheiden.Diese können als Tier-Modellen verwendet werden, oder durch Kreuzungen kann die Verbindung zwischen Segregation von genetischen Markern und Phänotypen studiert werden. Diese Tiere können in streng kontrollierten Umgebungen gehalten werden, damit die Umweltwirkungen einfacher untersucht werden können. • Auf genetischer Ebene Mensch ist nicht so anders als der Rest der Tiere.Die essentiellen Gene sind in der Regel die gleichen; z.B. unterscheiden wir uns von der Maus nur in 300 Genen. Arten wie Drosophila melanogaster (SchwarzbäuchigeTaufliege oder Fruchtfliege) ebenfalls weit verwendet sind, und eine Menge von Stoffwechselwegen (wie der Hippo Stoffwechselweg, der konserviert ist und spielt eine wichtige Rolle bei Organgröße Kontrolle) wurde zunächst in diesem Tier entdeckt. Drosophila melanogaster ist einer der am besten untersuchten Organismen der Welt. • Es gibt eine Menge von Experimenten, die beim Menschen nicht aus ethischen Gründen durchgeführt werden kann, nur bei Tieren. • Es ist viel einfacher, Gewebe von Tieren zu erhalten (Lunge, Hirn etc.), Genexpression zu bestimmen usw. Die Diagnosen von Krankheiten sind in der Regel viel genauer. • Es gibt eine Vielzahl von Tiermodellen für verschiedene menschliche Krankheiten. Es besteht die Möglichkeit, genetisch veränderten Tieren zu entwickeln. 3.2. Genetisch veränderten Tiere und Tiermodellen für menschliche Erkrankungen Es gibt zwei grundlegende Arten von genetisch modifizierten Tieren, die in diesen Studien verwendet werden. Eine von denen ist die Knock out oder KO Tieren, meistens Mäuse. Eine KO-Maus ist eine Maus, bei der mittels einer genetischen Manipulation gezielt ein oder mehrere Gene deaktiviert wurden (Gen-Knockout). Diese Manipulation geschieht an den embryonalen Stammzellen (von Mäusen), die dann in die Keimbahn einer Maus eingebracht werden. Es gibt inzwischen Knockout-Mäuse für die unterschiedlichsten Forschungsgebiete. Mit Hilfe der genetisch veränderten Tiere können beispielsweise biologische Mechanismen untersucht werden. Außerdem eignen sie sich als Modelle für menschliche Erkrankungen oder für pharmakologische Fragestellungen. Für die Arbeiten an Knockout-Mäusen wurde der Nobelpreis für Physiologie oder Medizin 2007 vergeben. Im Jahr 2006 gründete 33 Forschungszentren in neun Ländern den Internationalen Knockout Mouse Consortium (IKMC), dann im Juli 2011 das Internationale Mouse Phenotyping Consortium für das Ziel, eine riesige, gemeinsame Ressource für die biomedizinische Forschung zu bauen. Embryonalen Stammzellen der Maus wurden hergestellt, in denen Forscher haben jede der mehr als 20.000 spezifischen Maus-Gene deaktiviert („knocked out―) die für Proteine kodieren.Durch Mäuse die aus diesen Zellen stammen, können die Forscher Einblick in die Rolle der fehlenden Gene in Gesundheit und Krankheit gewinnen.Die Phänotypisierung Anstrengungen zielen auf die Anatomie, Entwicklung, Physiologie, Verhalten und Erbkrankheiten von 5000 dieser Mauslinien bis Ende 2016. KO Gene können auch für Tier-Modelle für verschiedene Krankheiten verwendet werden (Tabelle 10.1).Bei diesen Tieren können die molekularen Pathomechanismen oder verschiedene Therapien der Erkrankungen untersucht werden. Die anderen Arten von genetisch veränderten Tieren nennt man transgene. Hier sind durch genetische Manipulation das Expression der Gene verstärkt oder neue genetische Information in das Mausgenom eingefügt (Transgen). Diese Tiere können für die gleichen Zwecke verwendet werden, wie die KO Tieren. Hier die Gene sind in der Regel unter der Regulierung von Promotoren mit starker Aktivität. Es ist auch möglich, dass die Promotoren nur aktiv in bestimmten Organ oder Gewebe sind. Auf diese Weise wird das Gen überaktiv nur in diesen Organen oder Gewebe.Z.B. das Gen SCGB1A1 exprimiert nur in der Lunge, aber hier ist es stark exprimiert. Das IL5-Gen wurde nach dem Promotorbereich des SCGB1A1 Gens in einem Maus-Stamm gesetzt. Die Maus hat IL5 in ihrer Lunge überexprimiert. Da IL-5 ein Eosinophil-Kolonie-stimulierender Faktor und ein wichtiger Regulator des Eosinophilakkumulation in Geweben ist und das Verhalten von Eosinophil in jeder Phase von der Reifung zum Überleben modulieren kann, IL5 Überexpression verursacht Eosinophilie in der Lunge von dieser Maus und asthmatische Symptome werden entwickelt. 119 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genomische Methoden für komplexe Erkrankungen Tabelle 10.1. Tabelle 10.1. Einige Tiermodelle für Erkrankungen des Menschen die durch Manipulation eines Gens entwickelt worden sind. Gen Modifikation Tier Erkrankung LDLR KO Maus Atherosclerosis APOE KO Maus Atherosclerosis Maus Obesität Ob (LEP Leptin) in Mensch: KO (ob/ob) LPR (Leptin Rezeptor) KO (db/db) Maus Obesität TBX21 KO Maus Asthma ANP KO Maus Bluthochdruck SNCA Überexpression Drosophila Parkinson Erkrankung Mutante APP Überexpression Maus Alzheimer Erkrankung Früher war es schwierig, essentielle Gene in Tieren zu untersuchen, da fehlende oder Überexpression dieser Gene oft letal in der embryonalen Entwicklung sind.Zur Vermeidung dieser Probleme, bedingte transgene Tiermodelle (conditional transgenic animal models) wurden entwickelt. Bei diesen Tieren werden die Gene in vivo inaktiviert oder induziert. Eines der bekanntesten Verfahren hierfür ist das Cre/loxP-System. Es ermöglicht das gezielte Entfernen von DNA-Sequenzen in lebenden Organismen. Mit dieser Technik können beispielsweise einzelne spezifische Zell- oder Gewebearten genetisch modifiziert werden, während andere Gewebe davon unberührt bleiben. Cre (cyclization recombination) sind Enzyme der Klasse der Rekombinasen. Diese Proteine, die natürlicherweise in allen Organismen vorkommen, katalysieren die Spaltung und Neuverknüpfung von DNA zwischen spezifischen Basensequenzen. Diese Erkennungssequenz wird als loxP bzw. FRT bezeichnet. Mittlerweile ist es zur Herstellung gewebsspezifischer Knockout-Mäuse weit verbreitet. In welchem Gewebe und zu welchem Zeitpunkt in einem Lebewesen ein Gen angeschaltet wird, hängt hauptsächlich von dem zugehörigen Promotor ab. Promotor und Cre werden zusammen als Transgen in das Mausgenom eingebracht. Sollen z.B. Gene nur im Gehirn ausgeschaltet werden, sucht man sich ein Protein, das nur dort vorkommt und setzt den zugehörigen Promotor vor das Cre-Gen, wodurch Cre-Rekombinase nur im Gehirn gebildet wird. Ein Nachteil hierbei ist, dass die meisten Promotoren schon bald in der Embryonalentwicklung aktiviert werden. Wird ein wichtiges Gen schon früh ausgeschaltet, sind die Tiere oft nicht lebensfähig und können nicht untersucht werden. Um dieses Problem zu umgehen, wurden Methoden erfunden, dass Cre zu einem beliebigen Zeitpunkt angeschaltet werden kann. Dies gelingt z.B. mit Liganden-aktivierbaren Cre-Rekombinasen. Cre wurde dabei mit der modifizierten Ligandenbindungsdomäne (LBD) von Estrogenrezeptoren fusioniert, an die nicht mehr körpereigenes Estrogen bindet, wohl aber synthetisches Tamoxifen, ein Antiestrogen. Die Estrogenrezeptoren befinden sich im Zytoplasma und werden erst nach Bindung des Liganden in den Zellkern überführt, wo sich die DNA befindet. Somit verbleibt auch das mit dem Estrogenrezeptor assoziierte Cre-Enzym im Zytoplasma, bis den Tieren Tamoxifen verabreicht wird. Sobald dieses an den modifizierten Rezeptor bindet, wird er zusammen mit Cre in den Zellkern gebracht, wo Cre dann die gefloxten Gene ausschneiden kann. Die RNA-Interferenz wird in der Grundlagenforschung zur Aufklärung der noch unbekannten Funktion eines zu untersuchenden bekannten Gens und dessen kodierten Proteins genutzt. Die RNA-Interferenz erlaubt die gezielte Ausschaltung jedes beliebigen Gens. Aus dieser Ausschaltung kann die Funktion des von Gen kodierten Proteins abgeleitet werden. Es muss einzig die Nukleotidsequenz des zu untersuchenden Gens bekannt sein, um potenziell interferierende RNA-Moleküle zu entwickeln. Damit ist die auch als „Gen-Knockdown― bezeichnete Anwendung der RNA-Interferenz zur Untersuchung der Funktion eines Gens und dessen kodierten Proteins deutlich weniger aufwendig als der konventionelle Gen-Knockout. 3.3. Nachteile der Tiermodelle Es ist wahr, dass der Unterschied zwischen Tieren und Menschen auf Gen-Ebene relativ klein ist. Aber wie es sich herausstellte (siehe ENCODE Projekt), haben etwa 80% des Genoms bestimmte Funktionen. Und auf genomischer Ebene sind die Unterschiede größer.Vergleicht man Mensch und Maus, ist es auch wahr, dass die einige Prozesse unterschiedlich sind oder Homolog Gene unterschiedliche Funktionen haben können. Wegen dieser Gründe müssen alle Ergebnisse aus Tiermodellen in Menschen oder menschliche Systeme bestätigt werden. 120 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genomische Methoden für komplexe Erkrankungen Ebenso können die ähnlichen Krankheiten in Tieren unterschiedliche Pathomechanismen haben, und es gibt menschlichen Krankheiten, für die bisher keine guten Tiermodelle entwickelt wurden. 3.4. Experimentelle Tiermodelle Da verschiedene Krankheiten durch Genmanipulationen entwickelt werden können, können diese für die Entwicklung experimentellen Krankheitsmodelle genutzt werden.Es kann auch durch Induktion zufälliger Mutationen durch mutagene Substanzen durchgeführt werden, dann durch Phänotypisierung der Tiere und Kreuzungen können verschiedene Stämme entwickelt werden.Danach genomische Screening kann durchgeführt und die genomische Hintergrund der Erkrankungen gefunden werden. Diese Methode ist auch für die Untersuchung komplexer Erkrankungen geeignet. Solche Mäuse werden z.B. im Jackson Laboratory hergestellt von wo Mausstämme mit einem bestimmten Phänotyp bestellt werden können. Es gibt Datenbanken mit der Maus Phänotypen, wie Maus Phenome Datenbank (Mouse Phenome Database), die charakterisierten Stämme von Labormäusen enthalten, die translationale Entdeckungen erleichtern und bei der Auswahl der Mausstämmen für experimentelle Studien unterstützen. Es gibt einige verbreitete Tiermodelle für polygene Erkrankungen, wie NOD (non-obese diabetic) Maus für T1DM, SHR (spontaneously hypertensive rat) Ratte für Salz-Sensitive Bluthochdruck, NZO (New Zealand Obes) Maus für die Obesität, usw. 4. Literatur 1. Murken J et al. Taschenlehrbuch Humangenetik. Thiemen, http://www.ebook3000.com/Taschenlehrbuch-Humangenetik--Auflage--8-_176255.html 8. Auflage; 2. International HapMap 3 Consortium, Altshuler DM, et al. Integrating common and rare genetic variation in diverse human populations. Nature. 2010;467(7311):52-8. 3. International HapMap Consortium, Frazer KA, et al. A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. Nature. 2007;449(7164):851-61. 4. Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature. 2007;7;447:661-78. 5. Pennisi E. 1000 Genomes Project Gives New Map Of Genetic Diversity. Science 2010; 330: 574-5.) 6. Wang K, Li M, Bucan M. Pathway-based approaches for analysis of genomewide association studies. Am J Hum Genet. 2007 Dec;81(6):1278-83. 7. https://www.23andMe.com/ 8. Kaye J. The regulation of direct-to-consumer genetic tests. Hum Mol Genet. 2008;17:180-3. 9. Allayee H, Ghazalpour A, Lusis AJ. Using mice to dissect genetic factors in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 Sep 1;23(9):1501-9. 10. Mehrabian M, et al. Identification of 5-lipoxygenase as a major gene contributing to atherosclerosis susceptibility in mice. Circ Res. 2002 Jul 26;91(2):120-6. 11. Rapp JP. Genetic analysis of inherited hypertension in the rat. Physiol Rev. 2000 Jan;80(1):135-72. 12. ENCODE Project Consortium, et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 2012 Sep 6;489(7414):57-74. 5. Fragen 1. Was sind die genetischen Markers? 2. Was ist der Vorteil der SNPs gegenüber den Mikrosatelliten? 121 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Genomische Methoden für komplexe Erkrankungen 3. Welche Methodensorten kennen Sie für die Suche für Erkrankung assoziierte genetische Varianten? 4. Was sind die nassen und in silico Methode? 5. Was ist die Kandidatengen Assoziationsstudie? 6. Was ist „publication bias― in Genomik? 7. Was wissen Sie über genomweite Kopplungsanalysen, was ist ihr Nachteil? 8. Was bedeutet die LOD-score? 9. Was wissen Sie über GWAS? 10. Was bedeutet genomweite Signifikanz? 11. Warum können Replikationskohorten nötig sein? 12. Was bedeutet Stoffwechselweg Anreicherung Analyse? Was für Datenbanken kann man dazu verwenden? 13. Was ist der Vorteil von den Partial Genom-Screening Studien? 14. Was bedeutet die positionelle Klonierung? 15. Was bedeutet die persönliche Genomik? 16. Was bedeutet Exom Sequenzierung? 17. Was ist die DNase-Seq? 18. Was ist die ChIP-Seq? 19. Warum kommt die Bestimmung der Genexpression in der klinischen Praxis nur in der Onkologie vor? 20. Was ist ein Haushaltsgen und wofür kann man es verwenden? 21. Wofür kann man RNA-Seq verwenden? 22. Wie kann man epigenetische Merkmale untersuchen? 23. Was ist die CGH? 24. Was sind die Vorteile der Tiermodelle? 25. Welche genetisch veränderten Tiere kennen Sie? Wofür kann man sie verwenden? 26. Welche Tiermodelle kennen Sie für Erkrankungen des Menschen die durch Manipulation eines Gens entwickelt worden sind? 27. Was ist das bedingte transgene Tiermodell? 28. Wozu kann man bei Tieren die RNA-Interferenz verwenden? 29. Was sind die Nachteile der Tiermodelle? 30. Wie kann man experimentelle Tiermodelle für verschiedene Krankheiten entwickeln? 31. Geben Sie Beispiele für Tiermodelle für polygene Erkrankungen! 122 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 11. Populations- und Evolutionsgenetik Csaba Szalai 1. Populationsgenetik EinePopulation im genetischen Sinne ist die Gesamtheit der Individuen einer Gruppe, die an der Fortpflanzung von einer Generation zur nächsten beteiligt sind oder beteiligt sein könnten (Humangenetik). Die Populationsgenetik ist eine der häufigsten verwendeten Methode für die Untersuchung der genetischen oder genomischen Hintergründe von komplexen Erkrankungen. Im ersten Teil dieses Kapitels werden die grundlegenden Begriffe und Methoden dieser Studien beschrieben. 1.1. Arten der Probensammlung In menschlichen Populationsgenetische Studien gibt es zwei grundlegende Methoden für die Probensammlung. Eine ist die retrospektive Probensammlung, die für die retrospektive Studie verwendet wird. Eine Studie wird als retrospektiv bezeichnet, wenn man von der Gegenwart ausgehend die Vorgeschichte untersucht. Die Daten und die Proben werden nach der Hypothesenaufstellung eigens für die Prüfung derselben gesammelt. Eine typische Form retrospektiver Studien sind Fall-Kontroll-Studien (englisch case-control), die wie folgt durchgeführt werden. Man wählt Probanden aus, bei denen das zu untersuchende Ereignis, beispielsweise das Auftreten einer Krankheit, eingetreten ist. Dazu wird eine Gruppe von Probanden gewählt, bei denen das Ereignis (die Krankheit) nicht aufgetreten ist, wobei diese in ihren für die Untersuchung wesentlichen Eigenschaften, wie Alter, Gewicht und so weiter, denen der ersten Gruppe in etwa entsprechen sollte. Anschließend werden die Probanden daraufhin untersucht und/oder befragt ob und wie stark sie dem zu untersuchenden ursächlichen Faktor ausgesetzt waren. Mit Hilfe statistischer Auswertmethoden wird anschließend analysiert, ob dies häufiger, seltener oder gleich oft in der ersten, im Vergleich zur zweiten Gruppe, auftrat. Da retrospektive Studien jedoch grundsätzlich nicht-interventionelle Studien sind, haben sie bedeutende erkenntnistheoretische Nachteile: 1. Sie können nur zur Erstellung von Hypothesen dienen, oder empirische Evidenz zur Stärkung von Hypothesen liefern, sie können aber keine anerkannten Beweise liefern. 2. Man kann die Richtung eines Kausalzusammenhangs nicht endgültig klären. Es ist stets zu überlegen, ob das vermeintliche Ergebnis in Wirklichkeit die vermeintliche Ursache bewirkt hat, oder eine dritte Sache beides verursacht hat (der so genannte Confounder). 3. Da man auf die Erinnerung des Patienten und alte Unterlagen angewiesen ist, sind solche Studien sehr anfällig für Fehler. Hat der Patient vielleicht einfach ein ursächliches Ereignis vergessen, oder die Reihenfolge durcheinander gebracht? So vergessen Patienten etwas, das sie nicht in einen ursächlichen Zusammenhang mit ihrer Erkrankung bringen eher, beziehungsweise erinnern sich nicht so gut daran (Recall Bias). Andererseits wurden in alten Unterlagen vielleicht bestimmte Daten nicht erhoben oder nicht so zuverlässig, weil sich die erhebende Person sich der späteren Bedeutung nicht im Klaren war (und sein konnte). Neben den vielen kleineren retrospektiven Studien gibt es mehrere große Studien zu den genetischen Hintergründen der Krankheiten. Das Wellcome Trust Case-Control Consortium (WTCCC) begann im Jahr 2005. Das ist ein Konsortium von 50 Forschungsgruppen aus dem UK. Die Ziele von WTCCC waren die Fortschritte im Verständnis von Mustern der menschlichen Genomsequenz Variation entlang mit den Fortschritten in Hochdurchsatz-Genotypisierung Technologien zu nutzen und den Nutzwert, Design und Analyse von genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) zu erkunden. Das WTCCC steigerte erheblich die bekannte Anzahl von Genen, die eine Rolle in der Entwicklung der einige der häufigsten 123 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Populations- und Evolutionsgenetik Erkrankungen spielen. Das Konsortium hat ungefähr 90 neuen Varianten über alle der analysierten Krankheiten identifiziert. Das WTCCC wurde ein großer Erfolg, und im Jahr 2008 die WTCCC2 wurde gegründet. 120.000 Proben wurden gesammelt und mehrere weitere Erkrankungen wurden mit GWAS untersucht. Im Jahr 2009 WTCCC3 wurde auch gestartet. Eine prospektive Studie ist die Überprüfung der Hypothese der medizinischen oder psychologischen Wirksamkeit einer Behandlungsmethode unter vorheriger Festlegung, welche Hypothese geprüft werden soll. Dabei werden insbesondere die Daten gemäß der Hypothese erhoben im Gegensatz zur retrospektiven Auswertung bereits vorhandenen Datenmaterials. Der Begriff prospektiv wird in der Hochsprache im Sinne von „vorausschauend―, „der Möglichkeit nach― und „die Weiterentwicklung betreffend― verwandt. Die Prospektivität einer Studie sagt etwas über den zeitlichen Ablauf der Hypothesenerstellung und Datenerfassung aus. Die Daten in einer solchen Studie werden nach der Hypothesenaufstellung eigens für die Prüfung der Hypothese gesammelt. Ein Vorteil ist, dass das Datenmaterial dann genau auf die Anforderungen der Studie zugeschnitten werden kann. In einer retrospektiven Studie hingegen kann man z. B. nach Aufstellung der Hypothese vorhandene Datenbanken suchen und daraus Daten nehmen - diese passen dann evtl. nicht genau zu den Anforderungen der Studie, andererseits ist dieses Verfahren oft weniger kosten- und zeitintensiv. Prospektive Studien lassen sich in experimentelle prospektive Studien und beobachtende prospektive Studien unterteilen. In der experimentellen Studie wird die Stärke der unabhängigen Variable und deren Zuordnung zu den einzelnen Probanden vom Untersucher in der Regel durch Randomisierung durchgeführt. In der beobachtenden Studie findet eine solche Zuteilung nicht statt. Es gibt viele berühmten prospektiven Studien. Die erste derartige große Studie hat im Jahr 1948 in Framingham, USA gestartet und Proben und Daten aus 5209 Teilnehmern gesammelt. Seitdem ist der Framingham Heart Studyim Gang und bereits in der 3. Generation wurde ebenfalls beteiligt. Die meisten unserer Kenntnisse über die Risikofaktoren von Herz-Kreislauf-Erkrankungen stammen aus dieser Studie. Die UK Biobank-Projekt ist noch größer.Es begann im Jahr 2007 und richtet sich für das Sammeln von Proben und Daten von rund 500.000 Freiwilligen in Großbritannien, im Alter von 40 bis 69. Die Freiwilligen werden für mindestens 25 Jahre danach verfolgt. Das Hauptziel ist es, die jeweiligen Beiträge der genetischen Prädisposition und Umwelteinflüssen (einschließlich Ernährung, Lebensstil, Medikamente usw.), um die Entwicklung der Krankheit zu untersuchen. Die Avon Longitudinal Study of Parents and Children (ALSPAC) - die auch als Kinder der 90er Jahre bekannt ist eine langfristige Gesundheit Forschungsprojekt.Mehr als 14.000 Mütter wurden während der Schwangerschaft in den Jahren 1991 und 1992 eingeschrieben, und seitdem wird die Gesundheit und Entwicklung der Kinder in aller Ausführlichkeit gefolgt. Die ALSPAC Familien haben eine große Menge von genetischen und umweltbedingten Informationen im Laufe der Jahre zur Verfügung gestellt. Rund 2012 wurden die ersten Enkelkinder geboren und auch in die Studie aufgenommen. Auf der Webseite der Studie können einige interessante Ergebnisse abgelesen werden. 1.2. Auswahl der Populationen für genetische Studien Wenn Patienten zum Ziel einer retrospektiven Studie zur Untersuchung des genomischen Hintergrunds einer Erkrankung ausgewählt werden, gibt es zwei Strategien.Wir können strenge Bedingungen erfordern, d.h. die Symptome der Patienten müssen genau die gleichen sein. Aber sehr oft ist es sehr schwierig, sogar unmöglich. Z.B. bei Asthma gibt es eine Menge von Phänotypen, die mit Asthma verbunden sind, wie Rhinitis, Konjunktivitis, Dermatitis, hohe IgE-Spiegel, Eosinophilie, die alle teilweise unterschiedlichen genetischen Hintergrund haben, aber keiner von ihnen ist notwendig für die Entwicklung der Krankheit.Es gibt Asthmatiker, die all diese Symptome haben, einige nur Teile davon, und einige keiner von ihnen. Je ähnlicher die Phänotypen der Patienten sind, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass ihr genetischer Hintergrund der gleiche ist, und desto leichter ist es, es aufzuklären. Aber wenn man nur die Patienten in einer Gruppe, die genau den gleichen Phänotyp haben, umfasst, wäre es sehr schwierig, genügend Patienten zu 124 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Populations- und Evolutionsgenetik sammeln und wird Schwierigkeiten in der statistischen Analyse aufweisen.Wenden wir lose Kondition an, z.B. alle Asthmatiker könnten Teilnehmern sein, dann könnten wir größere Populationen haben, aber ihre genetischen Hintergründe werden heterogen sein, und die Auswirkungen der einzelnen genetischen Variationen verdünnt werden. Eine der möglichen Lösungen besteht darin, intermediäre Phänotypen (z.B. IgE-, HDL-C-, LDL-C-, Insulinspiegel usw.) zu verwenden, die auch als Endophänotypen bezeichnet werden (s. Kapitel 9). 1.3. Hardy-Weinberg-Gleichgewicht Für die zuverlässigen Ergebnisse muss in den populationsgenetischen Studien die Abweichung vom HardyWeinberg-Gleichgewicht (HWE) immer kontrolliert werden.Die HWE gibt die erwartete Verteilung der Genotypen in einer zufälligen (random) Population. Angenommen, in der Stichprobe sind an einem Genort nur die Allele A und a vorhanden, die mit den Häufigkeiten p und q auftreten, so finden wir: • Eizellen mit A mit der Häufigkeit p und • Eizellen mit a mit der Häufigkeit q sowie entsprechend • Samenzellen mit A mit der Häufigkeit p und • Samenzellen mit a mit der Häufigkeit q. Bei Panmixie verteilen sich die drei Genotypen AA, Aa und aa in den Zygoten, aus denen die Individuen der folgenden Generation hervorgehen • p2 für AA • pq und qp für Aa (bzw. aA) • q2 für aa (Unter der Bedingung von Panmixie (engl. Random Mating) liegt ein System der Partnerwahl vor, bei dem der Genotyp eines Genortes nicht berücksichtigt wird und die Paare sich nach den Gesetzen der Wahrscheinlichkeit finden.) Die Formeln lauten: p + q = 1 und p2 + q2 = 1. Mithilfe der Formel des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts kann die Heterozygotenhäufigkeit errechnet werden, wenn die Zahl der homozygot Betroffenen bekannt ist. Ist die Häufigkeit einer autosomal rezessiv vererbten Krankheit mit q2 gegeben, so beträgt die Genhäufigkeit q =√q2. Wenn q vernachlässigbar klein ist, z.B. bei einer sehr seltenen Krankheit, wird man p = 1,0 setzen können, da p + q = 1,0 ist. Die Heterozygotenfrequenz 2pq errechnet sich dann mit: 2pq≈2×1×√q2. Bei Polymorphismen können wir die erwartete Anzahl der Patienten in jeder Genotyp Gruppe durch Multiplikation der Anzahl der Patienten in der Population mit den Frequenzen berechnen. Z.B. wenn die MAF (Minor Allel Frequenz) 0,2 ist (q = 0.2; p = 0.8), und die Zahl der Teilnehmer 100, dann die erwartete Anzahl von minor Allel homozygot ist 0,22 × 100 = 4; heterozygote: 2×0.2×0.8×100 = 32; major Allel homozygot 0,82 × 100 = 64. In populationsgenetischen Studien muss kontrolliert werden, ob die realen Zahlen in jeden Genotyp, von den theoretisch erwarteten Werten abweichen. Dafür stehen verschiedene Methoden und Online-Programme zur Verfügung, wie in Web-Seite: http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl, wo viele Allele können 125 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Populations- und Evolutionsgenetik zur gleichen Zeit untersucht werden, und wenn wir zwei Populationen vergleichen, führt das Programm auch Assoziationsstudien aus. Es gibt verschiedene Voraussetzungen, die für das Bestehen eines Populationsgleichgewichts unabdingbar sind. Außerdem existieren Faktoren, die ein Populationsgleichgewicht stören oder verändern können. Im e-book Humangenetik kann man über die Faktoren, die Einfluss auf das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht haben können, lesen. Hier werden die möglichen Ursachen und Folgen, wenn die Ergebnisse statistisch von dem Gleichgewicht abweichen, besprochen. In populationsgenetischen Studien, die den genetischen Hintergrund einer Krankheit untersuchen, kann die Abweichung von HWE von verschiedenen Faktoren entstanden sein: • Falsche Genotypisierung • Die Sammlung der Proben war nicht zufällig (random). Z.B. gibt es viele Verwandten in der gesammelten Bevölkerung. • Die Population ist Inzucht. In beiden letzten Fällen wird den Anteil der Homozygoten erhöht. • Das studierte Allel ist in einer CNV (repetitiven) Region. In diesem Fall wird die Rate von Heterozygoten erhöht. • Der untersuchte Genotyp spielt eine Rolle in der Erkrankung. Z.B. löst es die Krankheit in homozygote Form (rezessive Erkrankungen). In diesem Fall ist die Anzahl von Homozygoten größer als die erwartete. Wenn es eine Abweichung von der HWE bei Kontrollen gibt, dann das Allel muss in der Regel von der Studie ausgeschlossen werden, weil sie zu falschen Schlussfolgerungen führen kann. In den Fällen (Fall-KontrollStudien) an den ersten vier Punkten die Situation ist die gleiche, aber auf dem fünften, weil die wirklichen Ursachen unbekannt sind, die Ergebnisse muss weiter untersucht werden. In beiden Gruppen kann der Genotypisierung mit einer alternativen Methode wiederholt werden, und die familiären Beziehungen müssen untersucht werden, wenn es möglich ist. Bei genomischen Studien (z.B. bei GWAS), wenn mehrere tausend parallelen Genotypen untersucht werden, ist dies möglich, es gibt sogar Programme dafür. Der letzte Punkt ist der interessanteste in den Fällen. Wenn ein Genotyp tritt signifikant häufiger in Fällen auf, dann kann dies bedeuten, dass es das Risiko für die Krankheit erhöht, falls es wesentlich seltener ist, dann kann davor schützen. Beide sind wertvolle Informationen über den genetischen Hintergrund der Krankheit, aber sie müssen mit alternativen Methoden bestätigt werden. In beiden Fällen lässt sich sagen, dass der Genotyp mit der Krankheit assoziiert ist. 1.4. Kopplung und Haplotyp Unter Kopplung versteht man das Phänomen, dass manche Allele (oder DNA Marker) im Laufe mehrerer Generationen gemeinsam vererbt werden. Je näher zwei Allele beieinander liegen, desto seltener werden sie getrennt, die Rekombinationswahrscheinlichkeit verhält sich also proportional zur Entfernung der Sequenzen zueinander. Durch diesen Zusammenhang kann man mit Hilfe von mindestens drei DNA-Marken eine Kartierung auf einem Chromosom vornehmen. Dies geschieht mit einer sogenannten Kopplungsanalyse. Auch der relative Abstand von Marken ist somit ermittelbar. Werden zwei Marken in einem Fall pro 100 Meiosen getrennt, so hat man definiert, besitzen sie einen Abstand von 1 centiMorgan (cM). Beim Menschen entspricht ein 1cM durchschnittlich etwa 1Million Basenpaaren, das kann jedoch stark variieren. Die beiden Allele eines Lokus auf den beiden homologen Chromosomen bezeichnet man als Genotyp. Die gemeinsam vererbten Allele von eng gekoppelten Loci oder Sequenzvarianten auf einem Chromosom bilden einen Haplotyp. Neue Daten der Genomforschung legen nahe, dass das komplette Genom in Form sogenannter Haplotypblöcke (Haploblöcke), die in der Regel nicht durch Cross-over getrennt werden, organisiert ist. Es handelt sich dabei um Bereiche, deren Sequenzvarianten gemeinsam vererbt wurden und auch noch werden. Diese Sequenzen wurden im Laufe der Evolution des modernen Menschen (also ca. in den letzten 175000 Jahren) nicht komplett durch Rekombination voneinander getrennt, sondern es bestehen mehr oder weniger stark ausgeprägte Kopplungsungleichgewichte (Linkage disequilibrium = LD) zwischen diesen Markern. Diese Blocks haben Größen von ca. 100 kb. 126 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Populations- und Evolutionsgenetik Die Definition dieser Blocks in verschiedenen Bevölkerungen ist Ziel des Internationalen HapMap-Projekts , eines Nachfolgeprojekts des Humangenom-Sequenzierungs-Projekts. Exakte Größe und Zahl dieser Blocks sind derzeit umstritten. Jedoch sind die Blocks bei Schwarz-Afrikanern kleiner und durch eine höhere Haplotypdiversität charakterisiert, was mit dem höheren Alter der afrikanischen Population erklärt ist. Ein Kopplungsungleichgewicht (LD) oder allelische Assoziation liegt vor, wenn zwei Allele an zwei benachbarten Allele häufiger gemeinsam vererbt werden, als durch Zufall in einer Population zu erwarten wäre.Die beiden häufigsten verwendeten Werte des Kopplungsungleichgewichts sind die LD Koeffizienten D 'und r2. Beide können zwischen 0 und 1 sein. Der 0 Wert bedeutet vollständiges Kopplungsgleichgewicht, 1 Kopplungsungleichgewicht. S. Kalkulationen für LD Koeffizient hier. In populationsgenetischen Studien, wenn mehrere benachbarte SNPs genotypisiert werden, kann ihre LD Karte in Form eines Dreiecks (Abbildung 11.1) oder Hitze Karten dargestellt werden. Für die Berechnung der Haplotypen gibt es mehrere Online-Software-Produkte, wie Haploview 4.1. Kopplung kann auch zwischen einem Phänotyp (QT) und einem Marker sein. Hier kann die Hypothese aufgestellt, dass ein Allel (genetische Variante oder Marker) in einem Lokus in Kopplung (LD) mit dem Marker ist, der das QT beeinflusst. Abbildung 11.1. LD Karte (http://woratanti.files.wordpress.com/2009/11/picture6.jpg). Es gibt 3 Dreieckregionen, die 3 Haplotypblöcke repräsentieren. Die Nummern oberhalb der Karte zeigen die Marker Nummern und Namen der Allele. Die Zahlen in den Kästchen sind r2 zwischen den Markern (SNPs). r2 ist das Quadrat des LD Korrelationskoeffizienten. 1.5. Founder-Populationen Der Gründereffekt (Founder-Effect) beschreibt eine genetische Abweichung einer isolierten Population oder Gründerpopulation (z.B. auf einer Insel) von der Stammpopulation (z.B. auf dem Festland). Diese Abweichung entsteht aufgrund der geringen Anzahl an vorhandenen Allelen der an ihrer Gründung beteiligten Individuen und nicht infolge unterschiedlicher Selektionsbedingungen. In Founder-Populationen sind die Haplotypblöcke wesentlich größer, und deshalb die Wahrscheinlichkeit ist auch größer, dass ein Marker mit der kausalen Variante in Kopplung und mit dem QT assoziiert ist. Diese Populationen sind deshalb für Kopplungs- oder Assoziationsstudien besser geeignet. 127 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Populations- und Evolutionsgenetik Teilweise wurden Founder-Populationen ausgewählt, die eine hohe Prävalenz bestimmter komplexer Erkrankungen aufweisen, z.B.: • die Pima-Indianer (Diabetes mellitus Typ II) • Mikronesier der Insel Kosrae (Adipositas und Diabetes Typ II) • Bewohner der Tonga-Inseln (Adipositas) Die größte Studie an einer Founder-Population war das isländische Genomprojekt, das von der Firma De Code Genetics zusammen mit dem isländischen Gesundheitssystem und der isländischen Regierung durchgeführt wurde. 1.6. Assoziationsstudien Assoziationsstudien sind die populärsten Populationsgenetische Methoden, um den genetischen Hintergrund der komplexen Merkmale zu klären. Eine typische Form der Assoziationsstudien sind Fall-Kontroll-Studien (englisch case-control).Genetische Marker werden genotypisiert und berechnet, ob diese Marker mit der Erkrankung assoziiert sind. Wenn ein DNA Marker in Fallen signifikant häufiger oder seltener ist, als in Kontrollen, spricht man von einer Assoziation mit der untersuchten Erkrankung. Assoziationen können unterschiedliche Ursachen haben: 1. Direkte Wirkung: Die Marker-Allel hat einen direkten Einfluss auf die Krankheit. 2. Natürliche Selektion: der Marker-Allel erhöht die Überlebenschance der Krankheit 3. Population Stratifizierung (s.u.) 4. Statistische Fehler (Fehler 1. Art, s. Kapitel 9) 5. Das Marker ist in Kopplung mit dem kausalen Allel. Wenn die Ergebnisse ausgewertet werden, müssen all diese Punkte für eine zuverlässige Aussage betrachtet werden. In Assoziationsstudien Population Stratifizierung ist das Vorhandensein eines systematischen Unterschieds in Allelhäufigkeiten zwischen Fällen und Kontrollen möglicherweise aufgrund unterschiedlicher Herkunft. Es kann ein Problem sein, weil die Assoziation, die gefunden wurde, konnte aufgrund der zugrunde liegenden Struktur der Population und nicht einer Krankheit assoziiert Locus vorhanden sein. Population Stratifizierung kann mit dem Transmissions-Disequilibrium-Test (TDT) kontrolliert werden. Der TDT untersucht eine größere Anzahl von Trios (Vater, Mutter, betroffenes Kind). Es wird geprüft, ob die Erkrankung assoziiert ist mit der Weitergabe bestimmter hochpolymorpher Marker oder Haplotypen. Ist dies der Fall, dann erfolgt die Verteilung nicht nach der erwarteteten1:1-Aufspaltung, sondern weicht signifikant davon ab. In unserer globalisierten Welt mehrere Populationen können nebeneinander leben (wie z.B. in den USA), und es ist nicht so leicht zu Fall-Kontroll-Populationen mit ausgewogenen Ethnizität zu sammeln, und die unausgeglichene Populationen kann sowohl Fehler I. und II. Arten führen. Aber wenn die Populationsstruktur bekannt ist, oder eine mutmaßliche Struktur gefunden wird, gibt es eine Reihe von Möglichkeiten, um diese Struktur in der Assoziationsstudien implementieren und somit über eine Population Bias auszugleichen.Die meisten zeitgenössischen genomweiten Assoziationsstudien können das Problem des Population Stratifizierung mit spezifischen Softwaren kontrollieren, und dass die logistischen Vorteile der Verwendung von nicht verwandten Fällen und Kontrollen diese Studien den familien-Assoziationsstudien vorzuziehen sind. Diese Methoden können auch die Situation bearbeiten, wenn die Populationen auf genomischer Ebene (wie schwarze Amerikaner mit den Kaukasiern) gemischt sind.Dies wird als Population Admixture (Beimischung) bezeichnet. Z.B., es wird geschätzt, dass der mediane Anteil europäischer Beimischung unter den Afroamerikanern in den USA 18,5% ist. Dieses Phänomen kann auch durch ein genomisches Verfahren verwendet werden, genannt als Admixture Mapping. Echte Assoziationen beruhen in der Genetik immer auf Kopplung. Die nächste Aufgabe ist, das kausale Locus zu identifizieren. Der erste Schritt wird üblicherweise hier die Sequenzierung, aber in komplexen Krankheiten können häufig auch in silico Verfahren verwendet werden. Hierzu können Datenbanken, wie dbSNP verwendet 128 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Populations- und Evolutionsgenetik werden, und die Kopplung kann durch die Haploview Software analysiert werden. Wenn es ein mutmaßliches, verantwortliches Allel gibt, muss seine mögliche Funktion in der Krankheit mit in vitro und in vivo Methoden nachgewiesen werden.Normalerweise ist es alles andere als einfach, oft ist es die schwierigste Aufgabe. Wenn das Allel nicht in der kodierenden Region eines Gens ist, oder nicht einen Aminosäure-Code ändert, wird die Aufgabe noch schwieriger. Neben den laboratorischen Experimenten, können auch die Ergebnisse des ENCODE Projekts, und mehrere Software in diesem Job helfen. 1.7. Risiko Berechnungen In Assoziationsstudien gibt es Werte, die die Robustheit der Assoziation zeigen. Einer dieser Werte ist der pWert, der die Wahrscheinlichkeit zeigt, dass die Null-Hypothese wahr ist. Die Nullhypothese zurückgewiesen wird, wenn der p-Wert weniger als die Signifikanzniveau α, die normalerweise 0,05 beträgt. Wenn die Nullhypothese zurückgewiesen wird (p <0,05), wird das Ergebnis als statistisch signifikant gewertet. In retrospektive Studien wird das Quotenverhältnis für Risikoabschätzung verwendet. Das Quotenverhältnis, auch Odds Ratio (OR), genannt, ist eine statistische Maßzahl, die etwas über die Stärke eines Zusammenhangs von zwei Merkmalen aussagt. Es ist damit ein Assoziationsmaß, bei dem zwei Odds miteinander verglichen werden. Ein Quotenverhältnis von • genau 1 bedeutet, dass es keinen Unterschied in den Odds gibt, • >1 bedeutet, dass die Odds der ersten Gruppe größer sind, • <1 bedeutet, dass die Odds der ersten Gruppe kleiner sind. Das relative Risiko (RR) ist ein Begriff der deskriptiven Statistik. Es drückt aus, um welchen Faktor sich ein Risiko (beispielsweise für eine Erkrankung) in zwei Gruppen unterscheidet. Es wird also das Verhältnis der Wahrscheinlichkeiten für ein Ereignis/Merkmal dargestellt. Das relative Risiko, die Bedeutung eines Risikofaktors, errechnet sich aus Quotienten dieser beiden Wahrscheinlichkeiten. Das relative Risiko ist verwandt mit dem Odds Ratio. Anders als das Odds Ratio kann man das relative Risiko aber nur errechnen, wenn die Randwahrscheinlichkeiten der Häufigkeitstabelle zufällig sind. D.h. die Anzahl der Erkrankten darf nicht durch das Studiendesign fest vorgegeben sein. Das RR wird oft in prospektive Studien verwendet. Wenn die Wahrscheinlichkeit zu erkranken gering ist, sind Odds Ratio und relatives Risiko ungefähr gleich. 2. Evolutionsgenetik Die moderne Evolutionsgenetik stammt aus der Synthese der Darwinschen Evolutionstheorie, der Genetik und der modernen Molekularbiologie.Hier diskutieren wir es nur aus menschlichen und medizinischen Gesichtspunkten und vor allem konzentrieren wir uns auf Faktoren die eine Rolle bei der Entwicklung des modernen menschlichen Genoms spielen. 2.1. Gen-Umwelt Interaktionen und das menschliche Genom 2.1.1. Natürliche Selektion Die Bezeichnung natürliche Selektion wurde von Charles Darwin geprägt. Die Selektionstheorie ist ein Aspekt seiner Evolutionstheorie und wurde als wesentlicher Teil der Synthetischen Evolutionstheorie in die moderne Evolutionsbiologie übernommen. Selektion ist einer der Evolutionsfaktoren. Das moderne menschliche Genom wurde durch ständige Interaktionen mit der Umwelt entwickelt. Selektion auf Genebene bedeutet in anderen Worten Änderung der Allelfrequenz. Hierbei können verschiedene Prozesse ablaufen, die jeweils in unterschiedlichen Situationen bedeutsam sind. Zunächst sind prinzipiell zwei Wege zu unterscheiden, wie sich Selektion auf die Allelfrequenz auswirken kann: 129 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Populations- und Evolutionsgenetik • negative Selektion (auch: reinigende Selektion; engl.: purifying selection). Sie besteht in der Entfernung nachteiliger Allele. Die Selektion macht sich demnach vor allem durch die Auslese schädlicher Mutationen, d.h. negative Selektion, bemerkbar. • positive Selektion. Sie bewirkt die Auswahl bestimmter Allele. Sie ist im Verhältnis viel seltener. Positive Selektion tritt im Wesentlichen in zwei Formen auf: • gerichtete Selektion (engl.: directional selection). Bei dieser wird ein Allel ausgelesen und ist in der Folge häufiger in einer Population vorhanden. Dies führt letztlich zur Fixierung des Allels. Gerichtete Selektion vermindert also die Variabilität, auf Genebene spricht man von Polymorphismus. • ausgleichende Selektion (engl.: balancing selection). Bei dieser wird ein Allel je nach seiner Frequenz unterschiedlich ausgelesen. Wenn es selten ist, wird es selektiv bevorzugt. Wird es häufiger, wird es hingegen selektiv benachteiligt. Ausgleichende Selektion erhält also den Polymorphismus. Für das Wirken ausgleichender Selektion sind im Wesentlichen zwei Prozesse bedeutsam: Einerseits können auf bestimmten Genloci heterozygote Individuen gegenüber homozygoten bevorzugt sein (engl.: overdominance). Ein wichtiges Beispiel dafür ist die Evolution des Immunsystems der Wirbeltiere. Für die Vielfalt der Antikörper, die die Erkennung beinahe jedes fremden Organismus ermöglichen, sind vor allem die MHC-Gene verantwortlich. Heterozygote Individuen besitzen logischerweise mehr MHC-Gene als homozygote. Sie haben ein leistungsfähigeres Immunsystem und sind daher bei der Selektion bevorzugt. Der Vorteil liegt nicht darin, dass einzelne MHC-Gene "besser" oder "schlechter" wären, gefördert wird einfach ihre Vielfalt. Dadurch werden seltene Gensequenzen von der Selektion gefördert. Derselbe Effekt kann auch dadurch eintreten, dass ein Allel im heterozygoten Fall günstige Eigenschaften vermittelt, welches bei Homozygotie schädlich oder gar letal ist. Berühmt geworden ist dieser Fall bei der Sichelzellenanämie, einer menschlichen Erbkrankheit, deren Gen im heterozygoten Fall Resistenz gegenüber Malaria bewirkt und dadurch in Malariagebieten selektiv in evolutionär kurzer Zeit stark gefördert worden ist. In der Entwicklung des menschlichen Genoms hat die Stabilisierende Selektion eine wichtige Rolle gespielt. Stabilisierende Selektion findet statt, wenn die Individuen einer Population über viele Generationen hinweg unter konstanten Umweltbedingungen leben. Individuen, deren Merkmale nahe am Mittelwert der Population liegen, zeigen eine höhere Fitness. Extreme bzw. vom Mittelwert abweichende Phänotypen können sich nicht durchsetzen. Somit führt stabilisierende Selektion zu einer geringeren phänotypischen Variabilität. Ein Beispiel dafür ist die Hautfarbe der Menschen. Die Spezies Mensch hat eine besondere Situation in der Tierwelt.Nach einer Theorie von Eva Jablonka kann das menschliche Genom potentiell toxischen Varianten durch Kleidung, Werkzeuge, Landwirtschaft und andere kulturelle Innovationen tolerieren, und die Menschen können mit diesen Varianten überleben. Das menschliche Genom hat dadurch eine Menge von schädlichen genetischen Veränderungen akkumuliert. Die entspannte Selektion durch menschliche Kultur erlaubte die Entwicklung von mehr Vielfalt und Komplexität, aber es hat auch den Menschen mehr auf die Innovationen angewiesen, die ihn von der Selektion befreit. 2.1.2. Rolle von Infektionen bei Bildung des Genoms Die verschiedenen Mikroorganismen und Infektionen haben eine der größten Rollen in der Bildung des menschlichen Genoms gespielt.Dieser Selektionsfaktor spielte sogar eine wichtige Rolle in der Geschichte des modernen Menschen (s. z.B. Population history of indigenous peoples of the Americas.) und seine Wirkung kann auch heute erlebt werden. Z.B., die großen Epidemien, wie Cholera, Pest, Grippe, Pocken, TBC etc., die häufig die Bevölkerungen dezimierten. Personen, die an einem dieser Infektionszeitpunkte gestorben waren, waren nicht in der Lage, ihr Genom an die nächste Generation weiterzugeben. Im Gegensatz dazu gab es Personen, die resistent oder überlebt waren und konnten ihre Genome, die ihnen mehr Fitness gegeben haben, an die nächste Generation passieren. Die heutige Population ist der Nachkomme von denen, die alle Infektionen überstanden und konnten ihr Genom an die nächste Generation weiterzugeben.Natürlich beeinflusst nicht nur das Genom, wie Individuen auf eine Infektion zu reagieren, aber auch eine Reihe anderer Faktoren, wie der aktuelle physikalische Zustand, andere Infektionen, Alter, epigenetische Staaten, reiner Zufall etc. In den letzten Jahren wurden mehrere Spuren dieser Mikroorganismus–menschlichen Genoms Wechselwirkungen im menschlichen Genom erkannt. Z.B.: • Mehrere hundert der menschlichen Gene stammen von Bakterien durch horizontalen Gentransfer. • 8% unseres Genoms stammt aus Retroviren. Diese beiden Punkte sind Beispiele für Genfluss. 130 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Populations- und Evolutionsgenetik • Es gibt menschliche Gene, die spezifisch gegen bakterielle und virale Infektionen sind, wie Gene für die Mustererkennungsrezeptoren wie TLRs, MBL, CD14, NOD2 usw. oder für antivirale Proteine wie APOBC3G, TRIM5, BST2. Die Mikroorganismen machen Selektionsdruck auf das menschliche Genom sogar noch heute. In einer GWAS, die in 52 Populationen durchgeführt wurde, wurden 441 Varianten in 139 menschliche Gene identifiziert, die signifikant mit Virus-Diversität verbunden wurden. Analyse der funktionalen Zusammenhänge zwischen diesen Genen, hat ein komplexes Netzwerk angereichert mit Proteinen, die Interaktion mit viralen Produkten zeigen, identifiziert. 2.1.3. Gendrift Als Gendrift bezeichnet man in der Populationsgenetik eine zufällige Veränderung der Genfrequenz innerhalb des Genpools einer Population. Gendrift ist ein Evolutionsfaktor. Eine quantitative Erweiterung stellt die Genshift dar, bei der ganze Segmente von Genen zusammen ausgetauscht werden. Dies hat oft besonders ausgeprägte funktional-qualitative Änderungen zur Folge. Gendrift bzw. Genshift und natürliche Selektion sind Evolutionsfaktoren und wirken gleichzeitig. Durch sie ändert sich die Zusammensetzung des Genpools. Die Häufigkeit von Allelen (Genvariationen) und damit die vorherrschenden phänotypischen Merkmale in einer Population werden über die Zeit geändert. Bei Gendrift und Genshift ist die Veränderung in der Häufigkeit der Allele unabhängig davon, ob sie vorteilhaft oder nachteilig auf den Phänotyp sind. Gendrift ist zufallsbedingt und ist unabhängig von der genetischen Fitness. Im Gegensatz dazu werden bei der natürlichen Selektion diejenigen phänotypischen Merkmale und damit diejenigen Allele bevorzugt, welche die genetische Fitness erhöhen. In großen Populationen, in denen die Gendrift klein ist, wird die natürliche Selektion selbst bei niedrigem Selektionsdruck den größeren Betrag zur Veränderung der Genfrequenzen haben. In kleinen Populationen dagegen werden die größeren statistischen Schwankungen durch die Gendrift die Änderungen durch die Selektion überlagern. Da eine zufällige Änderung der Genfrequenz in kleineren Populationen statistisch mehr ins Gewicht fällt, stellen die Gendrift und Genshift einen wichtigen Faktor der Evolution von Founder-Populationen und somit für die Artbildung dar. Sie basiert auf der Tatsache, dass eine abgeschnittene Zufallspopulation, die in einem bestimmten Gebiet lebt, nur einen kleinen Ausschnitt der möglichen Genfrequenzen besitzt, die außerdem in einem anderen Verhältnis zueinander stehen als in der Gesamtpopulation. Die evolutionäre Weiterentwicklung dieser Population ist abhängig von diesen verschobenen Genfrequenzen. Als Flaschenhalseffekt wird eine besondere Art der Gendrift bezeichnet, bei der die Populationsgröße durch ein zufälliges Ereignis stark vermindert und dadurch die in der Population vorkommende Variabilität verringert wird. Die Allelfrequenzen unterscheiden sich hinterher meist von denen der ursprünglichen Population, die verminderte Variationsbreite (Polymorphismus) erhöht die Anfälligkeit gegenüber Krankheiten und erschwert zukünftige adaptive Veränderungen. Aus evolutionärer genetischer Sicht ermittelt die Populationsgenetik die relative Häufigkeit der Allele in Populationen und erforscht deren Veränderung unter dem Einfluss von Mutation, Selektion, zufälliger Gendrift, der Separation von Teilpopulationen und dem Genfluss zwischen Populationen. 2.2. Warum sind manche letalen Mutationen häufig? Nach der Darwinschen Theorie und Logik, sollten die Frequenzen von schädlichen Mutationen oder Mutationen, die Organismen mit geringerer Fitness produzieren, von Generation zu Generation verringern. Aber einige schädliche Mutationen, die schweren Krankheiten verursachen, sind sehr häufig in bestimmten Bevölkerungsgruppen. Wie ist es möglich? Eine Erklärung dafür ist die ausgleichende Selektion oder Heterozygotenvorteil, welches beschreibt den Fall, in dem ein Allel im heterozygoten Fall günstige Eigenschaften vermittelt, welches bei Homozygotie schädlich oder gar letal ist.Ein Beispiel ist die Sichelzellenanämie, deren Gen im heterozygoten Fall Resistenz gegenüber Malaria bewirkt und dadurch in Malariagebieten selektiv in evolutionär kurzer Zeit stark gefördert worden ist. Bei der Sichelzellenanämie ist an der Position sechs der β-Protein-Untereinheit des Hämoglobins die Aminosäure Glutaminsäure durch Valin ersetzt. Die betroffenen Erythrozyten verformen sich bei abnehmendem Sauerstoffpartialdruck sichelförmig, verfangen sich leicht in den Kapillaren und lysieren überdies sehr schnell. Durch die Hämolyse werden Hämoglobin, Araginase und freie Sauerstoffradikale freigesetzt. Freies Hämoglobin bindet Stickstoffmonoxid etwa 1000-mal stärker als intrazelluläres und Araginase verwandelt 131 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Populations- und Evolutionsgenetik Stickstoffmonoxid zu Nitrit und Nitrat. Stickstoffmonoxid ist der wichtigste Vasodilatator und die Konzentrationsabnahme führt zur Gefäßverengung und somit zu Durchblutungsstörungen. Das Sichelzellenhämoglobin wird als HbS bezeichnet im Gegensatz zum HbA, dem normalen Hämoglobin des erwachsenen Menschen. Heterozygote Träger des Merkmals bilden neben dem HbS auch HbA in ausreichender Menge um die Funktion der Erythrozyten bei diesen Menschen weitgehend aufrechtzuerhalten. Auffallend ist, dass in Gebieten der Malaria das Sichelzellenallel relativ häufig ist. Dies erklärt sich daraus, dass es gegen Malaria eine Resistenz verleiht, sodass die gesunden Überträger (Aa) Träger des Sichelzellenallels in diesen Gebieten einen Evolutionsvorteil (den sogenannten Heterozygotenvorteil) gegenüber denen ohne Sichelzellenallel (Genotyp AA) haben, die eher an Malaria sterben, und auch gegenüber den an Sichelzellenanämie Leidenden (Genotyp aa) haben, die vorzeitig an Sichelzellenanämie sterben. In Afrika gibt es beispielsweise Gegenden, in denen fast ein Drittel der Bevölkerung heterozygot für dieses Merkmal ist. In den anderen Weltgegenden kommt das Sichelzellenallel praktisch nicht vor, da hier dieser Selektionsvorteil aufgrund der fehlenden Malaria nicht wirksam ist (s. mehr in Sichelzellenanämie). Ein anderes Beispiel ist die Mukoviszidose oder zystische Fibrose (ZF, engl. cystic fibrosis, CF). Die Mukoviszidose ist nach der Hämochromatose die häufigste angeborene Stoffwechselerkrankung hellhäutiger Menschen. Die Erkrankungsquote liegt bei etwa 1:2.000 Neugeborenen. Die Ursache für Mukoviszidose sind verschiedene Mutationen am langen Arm des Chromosoms 7 (Locus 7q31.2). Das betroffene Gen codiert für CFTR (für Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), ein Protein, das in der Zellmembran als Chloridkanal fungiert. Durch die Veränderung im Gen wird ebenso das Protein verändert und die Kanalfunktion bleibt aus. Die häufigste Mutation dieses Gens wird ΔF508 genannt. ΔF508 bezeichnet das Fehlen der Aminosäure Phenylalanin (= F) an der Position 508 im Protein und betrifft etwa 7 von 10 Menschen mit Mukoviszidose. Vier Prozent der deutschen Bevölkerung, also rund drei Millionen Menschen, sind gesunde Genträger, die das mutierte Allel weitervererben können. Die Wissenschaft kann derzeit noch keine schlüssige Erklärung liefern, warum ein Allel, das eine so schwerwiegende Erkrankung hervorruft, so weit verbreitet ist (und nicht mit der Zeit verschwindet). Deswegen lag der Schluss nahe, dass mit einem CFTR-Defekt ein Selektionsvorteil bestehen müsste. • Anfangs wurde vielerorts die Theorie vertreten, dass das heterozygote Vorliegen des defekten CFTR-Gens die Dichte der (funktionierenden) Chlorid-Kanäle im Darm verringere, was die Symptome der Cholera positiv beeinflussen sollte (bei dieser Durchfallserkrankung werden Chloridkanäle dauerhaft geöffnet, was zu massivem Wasserverlust führt). Dies konnte in verschiedenen Studien nicht sicher belegt werden. Auch spricht die Epidemiologie der Mukoviszidose gegen diese Theorie, denn das mutierte Gen ist ausgerechnet in jenen Populationen häufig, in denen die Cholera eher selten auftritt, und umgekehrt. • Auch eine Beziehung zum Typhus konnte nicht sicher hergestellt werden. Das Bakterium ist immerhin auf die CFTR-Kanäle angewiesen, um in die Darmzellen zu gelangen. • Eine weitere mögliche Erklärung liegt in dem mit der Veranlagung für Mukoviszidose wahrscheinlich einhergehenden Schutz vor Tuberkulose. Diese These eines Selektionsvorteils konnte mittlerweile recht gut in klinischen Tests bestätigt werden, es bleibt nur die Frage nach der Verbreitungsdichte der Erbträger, die sich deutlich über die Tuberkulosegebiete hinaus als populationsfähig erwiesen haben. Ein weiteres Beispiel für den Selektionsvorteil ist die häufige (10%) CCR5Δ32 Mutation in der europäischen Population, bei der ein 32-Basenpaar-Segment deletiert ist, führt zu einem Frameshift mit einem vorzeitigen Stoppcodon. Das daraus resultierende verkürzte CCR5 Protein bleibt im Zytoplasma und wird nicht zur Zelloberfläche transportiert. Dies hat eine Resistenz der Träger gegenüber den meisten HIV-Stämmen zur Folge. Als Ursache des ungewöhnlich gehäuften Auftretens dieser Mutation galt zunächst Selektionsdruck durch Seuchen in Nordeuropa vor 700 Jahren. Neuere Untersuchungen deuten jedoch auf ein wesentlich höheres Alter für die ursprüngliche Mutation und den Selektionseffekt. Im Jahr 2012 wurde die CCR5 als zelluläre Determinante für zytotoxische Targeting von myeloischen Zellen und T-Lymphozyten durch die Staphylococcus aureus Leukotoxin ED (LukED) identifiziert.CCR5-defizienten Mäuse sind weitgehend resistent gegen letale S. aureus Infektion, somit dieser Befund setzte sich die Möglichkeit, dass Resistenz gegen S. aureus Leukotoxin kann die Selektion des Δ32 Allel beeinflusst haben. 2.3. Beispiele für Umweltwirkungen am Genom 132 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Populations- und Evolutionsgenetik In den letzten Jahren mehr und mehr Menschen wurden in verschiedenen Populationen sequenziert. Es gibt die Möglichkeit, ihre Genome zu vergleichen und populationsspezifische Varianten zu erkennen, einige von ihnen wurden sich durch populationsspezifischen Gen-Umwelt-Interaktionen entwickelt. Sehen wir uns einige Beispiele! Einer der auffälligsten Unterschiede zwischen den Populationen kann die Hautfarbe sein. Der Umweltfaktor, der die Unterschiede induzierte war das Sonnenlicht. Personen aus Populationen, die in sonniger Umwelt gelebt haben, haben dunklere Haut, diejenigen, die weniger Sonnenlicht erlebt haben, hellere Haut. Die Hauptursache für den Selektionsdruck von Sonnenlicht ist die UV-Strahlung. Sie kann DNA-Mutationen und Krebs in der Haut (Melanom) verursachen. Die beste Verteidigung dagegen ist das Melanozyten produzierte Melanin, das die Haut dunkle Farbe verleiht. Melanin schützt Haut vor der Ultraviolettstrahlung der Sonne. Das Melanin unterbindet die erbgutschädigende Wirkung, insbesondere der UV-B-Strahlung. Ein hoher Melaninanteil ist in Regionen mit starker Sonneneinstrahlung ein Vorteil. Der Melaninanteil der Haut hat dabei auch einen direkten Einfluss auf die Produktion von Vitamin D. Je mehr Melanin in der Haut ist, umso weniger Vitamin D kann produziert werden. Zwei Gene SLC24A5 und SLC45A2 wurden als wichtige Determinanten der Pigmentierung in den Menschen und in anderen Wirbeltieren identifiziert.Das Allel A111T in SLC24A5 und das Allel L374F in SLC45A2 sind beide fast fixiert bei hellhäutigen Europäern, und kann daher als informative Marker sein. Das L374F Substitution in SLC45A2 wurde auf 100% Frequenz in einem europäischen Population gefunden, war aber in asiatischen und afrikanischen Proben abwesend. Es gibt Beispiele, auch heute noch für die Selektionsdruck des Sonnenlichts. Die Prävalenz des Melanoms hat aufgrund der zu viel Sonneneinstrahlung (sunbathe) bei hellhäutigen Populationen zugenommen, und 100% der dunkelhäutigen Personen afrikanischer Herkunft, 93% der Indianer und 85% der Ost-Asiaten, die in Kanada leben, leiden an Vitamin D-Mangel. Auch Lebensmittel können eine Selektionsfaktor sein.Ein Beispiel dafür ist das Gen für Speichel-Amylase AMY1, die die Stärke verdaut. AMY1 ist einer der wenigen Genen im menschlichen Genom, die umfangreiche copy-number Variationen (CNV) zwischen Individuen zeigen. Zusätzliche AMY1 verleihen den Trägern die Kapazität um weitere Speichel-Amylase zu produzieren. In einer Studie wurde gefunden, dass Personen in Populationen mit Stärkereiche Diät mehr Kopien von AMY1 Gen haben, als Personen aus Jäger und Sammler Populationen. Bei Laktoseintoleranz, wird der mit der Nahrung aufgenommene Milchzucker (Laktose) als Folge von fehlender oder verminderter Produktion des Verdauungsenzyms Laktase nicht verdaut. Alle (gesunden) neugeborenen Säugetiere bilden während ihrer Stillzeit Laktase, sie spaltet das Disaccharid Milchzucker in die verwertbaren Zuckerarten D-Galaktose und D-Glukose. Im Laufe der natürlichen Entwöhnung von der Muttermilch sinkt die Aktivität der Laktase auf etwa 5–10% der Aktivität bei der Geburt. Das gilt für den Menschen und alle anderen Säugetiere. Nur bei Populationen, die seit langer Zeit Milchwirtschaft betreiben, hat sich eine Mutation durchgesetzt, die dazu führt, dass auch noch im Erwachsenenalter genügend Laktase produziert wird (Laktasepersistenz). Vermutlich liegt das daran, dass die höhere Laktaseaktivität einen Selektionsvorteil für diese Gruppen bot. Es hat sich nun gezeigt, dass Laktasepersistenz in den verschiedenen Populationen durch mehrere voneinander unabhängige Mutationen verursacht wird. Das ist ein Beispiel für konvergente Evolution, was bedeutet, dass unterschiedliche Prozesse in verschiedenen Populationen zu ähnlichen Phänotypen führen können. Oft können verschiedene Merkmale bei Menschen entwickelt werden, die nur Nebenwirkungen der natürlichen Selektion induzierte Veränderungen sind. Einer der Gründe dafür ist, dass die meisten dieser Gene sind pleiotrope: das heißt, sie sind in mehreren verschiedenen Merkmale involviert.Beispielsweise reguliert EDAR Haarfollikeldichte und die Entwicklung von Schweißdrüsen und Zähne.Beim Menschen hat ein Selektionsdruck von kälterem Klima an EDAR die Haarfollikeldichte, aber auch Zahnform beeinflusst, obwohl dieser beeinträchtigt wahrscheinlich nicht die Populationsfitness. 3. Literatur 1. Murken J et al. Taschenlehrbuch Humangenetik. Thieme, http://www.ebook3000.com/Taschenlehrbuch-Humangenetik--Auflage--8-_176255.html 133 Created by XMLmind XSL-FO Converter. 8. Auflage; Populations- und Evolutionsgenetik 2. International HapMap 3 Consortium, Altshuler DM, et al. Integrating common and rare genetic variation in diverse human populations. Nature. 2010;467(7311):52-8. 3. International HapMap Consortium, Frazer KA, et al. A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs. Nature. 2007;449(7164):851-61. 4. Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature. 2007;7;447:661-78. 5. Pennisi E. 1000 Genomes Project Gives New Map Of Genetic Diversity. Science 2010; 330: 574-5.) 6. Wang K, Li M, Bucan M. Pathway-based approaches for analysis of genomewide association studies. Am J Hum Genet. 2007 Dec;81(6):1278-83. 7. https://www.23andMe.com/ 8. Kaye J. The regulation of direct-to-consumer genetic tests. Hum Mol Genet. 2008;17:180-3. 9. Allayee H, Ghazalpour A, Lusis AJ. Using mice to dissect genetic factors in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003 Sep 1;23(9):1501-9. 10. Mehrabian M, et al. Identification of 5-lipoxygenase as a major gene contributing to atherosclerosis susceptibility in mice. Circ Res. 2002 Jul 26;91(2):120-6. 11. Rapp JP. Genetic analysis of inherited hypertension in the rat. Physiol Rev. 2000 Jan;80(1):135-72. 12. ENCODE Project Consortium, et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 2012 Sep 6;489(7414):57-74. 4. Fragen 1. Definieren Sie die Populationsgenetik! 2. Welche Probensammlung-Methode kennen Sie für Populationsgenetische Untersuchungen? Geben Sie Beispiele an! 3. Welche Strategien kennen Sie für die Auswahl der Populationen für genetische Studien? 4. Was bedeutet der Endophenotyp? 5. Was bedeutet HWE? 6. Was kann die Ursache für die Abweichung von HWE sein? 7. Was bedeutet Kopplung? 8. Definieren Sie den centiMorgan! 9. Definieren Sie den Haplotyp und die Haploblöcke! 10. Definieren Sie LD! 11. Wofür kann man die Founder-Populationen verwenden? 12. Was können die Ursachen für die Assoziationen in Populationsgenetischen Untersuchungen sein? 13. Was bedeutet die Population Stratifizierung? 14. Wie kann man das Problem mit der Population Stratifizierung kontrollieren? 15. Was bedeutet die Population Beimischung (Admixture)? 16. Welche Werte kennen Sie für Risikoberechnungen in Populationsgenetischen Studien? 134 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Populations- und Evolutionsgenetik 17. Definieren Sie die Evolutionsgenetik! 18. Was bedeutet die Selektion auf Genebene? 19. Welche Arten genetischer Selektionen kennen Sie? 20. Warum befindet sich der Mensch in einer besonderen Situation bezüglich genetischer Selektion? 21. Wie können Mikroorganismen und Infektionen in der genetischen Selektion teilnehmen? Geben Sie Beispiele für die Beweise! 22. Definieren Sie die Gendrift und die Genshift! 23. Was bedeutet der Flaschenhalseffekt? 24. Definieren Sie die Populationsgenetik aus evolutionärer genetischer Sicht! 25. Warum sind manche letalen Mutationen so häufig? 26. Warum ist die Sichelzellenanämie so häufig? 27. Warum ist die Mukoviszidose so häufig? 28. Warum ist die CCRΔ532 Mutation so häufig? 29. Wie kann das Sonnenlicht in der natürlichen Selektion eine Rolle spielen? 30. Geben Sie Beispiele für die Rolle des Lebensmittels in dem Selektionsprozess! 31. Was bedeutet die konvergente Evolution? 32. Was können die Konsequenzen in der Evolution sein, dass die Gene pleiotrope sind? 135 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 12. Gen-Umwelt Interaktion Csaba Szalai Im vorhergehenden Kapitel wurden einige Beispiele gezeigt, wie Umweltfaktoren Rollen bei der Bildung des menschlichen Genoms spielen. In diesem Kapitel werden Beispiele gezeigt, wie genetische Variationen die Wirkung von Umweltfaktoren auf ihre Träger beeinflussen können. 1. Penetranz der Mutationen Die Penetranz wird in Prozent der Häufigkeit angegeben, in der ein Gen (Allel oder Genotyp) sich im Phänotyp manifestiert. Die Penetranz eines Allels beeinflusst das Erkrankungsrisiko für Kinder von Trägern eines Erbleidens. In Gen-Umwelt Interaktionen können die Penetranzen der Mutationen die Folgenden sein: • Hochpenetrante Mutation: Die Mutation beeinflusst fast immer den Phänotyp, die Mutation beeinflusst die Funktion des Genes oder seines Produkts. Mutationen, die monogene Erbkrankheiten verursachen, gehören hier. • Lowpenetrante Mutation: Die Mutation verursacht nur selten spürbaren Phänotyp, sie beeinflusst nicht die Funktion des Genes, oder dieses ist nicht essentiell für den normalen Phänotyp. Aber in Interaktionen mit anderen Mutationen oder Umweltfaktoren kann sich ihre Wirkung zeigen. Polymorphismen, z.B. gehören hier. Natürlich ist der Übergang zwischen den zwei Arten von Mutationen kontinuierlich. Der genomische Hintergrund einer Person beeinflusst die Antworten an die Umwelteffekte. Personen, die überempfindlich auf einen Umwelt-Stimulus sind, haben in der Regel monogene Erkrankungen, weil normale Menge von Umweltfaktoren eine Krankheit verursachen kann. Wie z.B. Menschen mit kutanen Porphyrie, die extreme lichtempfindlich sind, und entwickeln Symptome wie Blasen, Nekrosen der Haut und Zahnfleisch, Juckreiz und Schwellungen bei normalem Sonnenlicht.Aber unter den Menschen ohne schädliche, hochpenetrant Mutationen gibt es lichtempfindlich (hellhäutige) und lichtresistent (dunkelhäutigen), deren Verteilung in der Population kontinuierlich und normal (Gauß) sind. 2. Interaktionen zwischen hochpenetranten Mutationen und die Umwelt Neben Porphyrie gibt es mehrere Beispiele, wo Menschen überempfindlich auf bestimmte Umweltfaktoren sind, aber wenn sie diese Faktoren vermeiden könnten, könnten sie verhindern oder reduzieren die schwerwiegenderen Symptome. Z.B. Xeroderma Pigmentosum. Aufgrund eines genetischen, autosomal rezessiv vererbten Defekts, der die DNA-Reparaturenzyme betrifft, bei Personen mit dieser Krankheit kann sich die Haut nach Schäden durch Sonneneinstrahlung nicht regenerieren. Die Patienten müssen konsequent von jeglicher UV-Strahlung abgeschirmt werden; zum Beispiel durch lange Kleidung, getönte Fensterscheiben oder UVabweisende Plastikfolie an den Fenstern. Da die Betroffenen das Sonnenlicht meiden müssen, und in der Mehrheit Kinder sind, existiert der umgangssprachliche Begriff Mondscheinkinder für die Betroffenen. Viel häufiger ist die Phenylketonurie (PKU). Sie ist eine der häufigsten angeborenen Stoffwechselstörungen. Sie wird autosomal-rezessiv mit einer Inzidenz von etwa 1:8000 Neugeborenen vererbt. Betroffene Patienten können die Aminosäure Phenylalanin nicht abbauen, wodurch diese sich im Körper anreichert und Phenylpyruvat, Phenylacetat oder Phenyllactat entsteht, was unbehandelt zu einer schweren geistigen Entwicklungsstörung mit einer Epilepsie führt. Bestimmte Stoffwechselprodukte, die Phenylketone, die mit dem Urin ausgeschieden werden, waren für die Erkrankung namensgebend. Die Erkrankung kann durch eine einfache Reihenuntersuchung schon bei Neugeborenen erkannt werden. Eine rechtzeitig begonnene eiweißarme Diät kann die vorgenannten Symptome verhindern und sollte idealerweise lebenslang durchgeführt werden. Familiäre Hypercholesterinämie (FH) ist eine autosomal kodominant vererbte Krankheit mit einem Prevalenz von 1:500. Ursache ist der Defekt des LDL-Rezeptors infolge einer Mutation des Rezeptorgens (LDLR auf Chromosom 19); da LDL nicht bzw. nur in geringem Maß in die Leber aufgenommen werden kann, 136 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Gen-Umwelt Interaktion geht die Rückkopplungshemmung der Cholesterinsynthese verloren, was zu einer exzessiven VLDL-Synthese der Leber führt. Das daraus gebildete LDL erhöht den Serumcholesterinspiegel massiv. Schon im Kindesalter leiden manche Betroffene an einer sich rasch ausbreitenden Arteriosklerose. Vorrangige Maßnahmen sind Gewichtsreduktion und sportliche Aktivität. Hilfreich dafür können eine cholesterinarme, fettreduzierte, kalorienangepasste und ballaststoffreiche Diät, sowie viel Bewegung an der frischen Luft sein. Reduziert sich der Cholesterinspiegel trotz dieser Maßnahmen nicht ausreichend, kann eine zusätzliche medikamentöse Behandlung mittels Statinen notwendig werden. In monogener Form sind die Symptome so schwer, dass die Krankheit mit Diät, Medikamente oder anderen Umweltfaktoren nicht behandelt werden kann. 3. Beispiele für Interaktionen zwischen lowpenetranten Mutationen und die Umwelt • Der α1-Antitrypsin-Mangel ist eine erbliche Stoffwechselerkrankung aufgrund eines Polymorphismus des Proteinase-Systems. Ein Mangel an Proteaseinhibitoren kann zu Leberzirrhose und Lungenemphysem führen. Die Ursache ist Mutationen in dem SEPINA1 (früher A1AT) Gen. Homozygote Mutationen an Position 342 (PiZZ) führen immer zu klinischen Erscheinungen. Für Homozygoten ist ein absoluter Rauchverzicht unbedingt nötig, da die im Rauch enthaltenen Oxidantien α1-Antitrypsin inaktivieren. Infekte müssen umgehend behandelt werden um die Konzentration an Akute-Phase-Proteinen gering zu halten. In diesem Zusammenhang sind auch Impfungen von Bedeutung. Heterozygoten (Trägerfrequenz: 4,9%) sind empfindlich gegen Zigarettenrauch, und bei ihnen können andere luftgetragenen Partikeln zu Lungenemphysem, COPD oder Asthma führen. • Die Faktor-V-Leiden-Mutation (R506Q) ist der am weitesten verbreitete (Trägerfrequenz: 6,5%) erbliche Risikofaktor für die Thromboseneigung (Thrombophilie), bei der die erhöhte Gefahr besteht, ein Blutgerinnsel (Thrombose) zu erleiden. Der FVL entsteht durch eine Punktmutation im Gen für Faktor V, eines Proteins, das eine wichtige Rolle in der Blutgerinnung spielt. Die Träger haben in der Regel keine Symptome, aber orale Kontrazeptiva, lange körperliche Inaktivität (z.B. Flugverkehr oder nach Operationen oder Frakturen), Übergewicht oder Schwangerschaft können das Risiko für das Auftreten der Thrombose erhöhen. • Eine G→A-Mutation der Polyadenylierungsstelle ist z.B. bei der Thrombophilieneigung • für das Prothrombin-Gen an Position 20 210 beschrieben. Hierbei handelt es sich um die häufigste Mutation in diesem Gen. Ca. 2% der Bevölkerung sind heterozygote Anlageträger. Interessanterweise führt diese Mutation nicht zu einer Destabilisierung der Prothrombin-mRNA, sondern zu einer Stabilisierung, und somit zu einer verstärkten Translation. Die vermehrte Synthese des Prothrombin-Proteins erhöht das Risiko für ein thromboembolisches Ereignis um den Faktor 3 – 4. Diese Mutation nimmt in den gleichen Gen-Umwelt Interaktionen wie die Leiden Mutation teil. Gleichzeitiges Vorliegen von Heterozygotie für Faktor-VLeiden und die Prothrombin-2021A-Variante erhöht das Risiko auf das 20-fache. Dies ist ein Beispiel für eine Gen-Gen-Interaktion (Humangenetik). • Hämochromatose ist eine Erkrankung, bei der es zu einer erhöhten Aufnahme von Eisen im oberen Dünndarm kommt. In den meisten Fällen der Hämochromatose liegt eine autosomal-rezessive Erbkrankheit vor, die sich bei Männern wesentlich häufiger ausbildet als bei Frauen, bei denen die Penetranz geringer ist. Die Erkrankung kann, wenn sie frühzeitig entdeckt wird, erfolgreich behandelt werden. Bei fortgeschrittener Erkrankung treten unumkehrbare Schäden, insbesondere an der Leber, auf. Die erbliche Hämochromatose ist die häufigste Form, sie wird autosomal-rezessiv vererbt. Bei über 80% der Patienten wird sie durch eine Punktmutation im HFE-Gen verursacht, welche einen spezifischen Aminosäure-Austausch (Cystein wird an der Stelle 282 im sogenannten Hereditäre-Hämochromatose-Protein durch Tyrosin ersetzt (C282Y)) bewirkt. Die H63D Mutation ist auch ein Risikofaktor bei C282Y Trägern. Die unvollständige Penetranz zeigt, dass andere Risikofaktoren für die Manifestation nötig sind. Stark eisenhaltige Nahrungsmitteln sollten zurückhaltend konsumiert werden. Schwarzer Tee, zusammen mit der Mahlzeit getrunken, vermindert die Eisenabsorption. Umgekehrt sollte auf den Konsum Vitamin C-haltiger Getränke (z.B. Orangensaft) im Zeitraum von etwa zwei Stunden vor bis zwei Stunden nach den Mahlzeiten verzichtet werden, da Vitamin C die Aufnahme von Eisen aus der Nahrung begünstigt. Da der Konsum von Alkohol die Eisenaufnahme steigert, ist Alkoholkarenz sinnvoll. 4. Rauchen-Genom Interaktion 137 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Gen-Umwelt Interaktion Das Rauchen ist eine der stärksten und gut messbaren Umweltfaktoren, und es gibt mehrere genetische und genomische Ergebnisse über seine Wechselwirkungen mit dem Genom.Diese Wechselwirkungen können in zwei verschiedenen Aspekten untersucht werden.Erstens kann es vielleicht überraschend klingen, aber das Rauchen kann als eine komplexe, multifaktorielle Erkrankung angesehen werden, ähnlich wie Drogenmissbrauch und Alkoholismus. Auf der anderen Seite ist es bekannt, dass es das Risiko für verschiedene Krankheiten, wie Lungenkrebs, Asthma, COPD, Atherosklerose oder Alzheimer-Krankheit erhöht.Diese Erkrankungen werden sich nicht in allen Rauchern entwickeln, sondern sind andere Faktoren für die Entwicklung dieser Krankheiten notwendig. Der stärkste unter diesen Faktoren ist der genomische Hintergrund des Rauchens. 4.1. Genomische Hintergrund des Rauchens Die Erblichkeit des Rauchens ist höher als die von mehreren anderen polygenen Erkrankungen, sie ist 60%. Es ist bekannt, dass das Stress bei Rauchern Zigaretten-Verlangen auslöst.In einer Studie wurde untersucht, ob diese einen genetischen Hintergrund hat.Signifikant stärkeres stress-induziertes Zigarette-Verlangen wurde für Einzelpersonen gefunden, die entweder die DRD2 (D2 Dopamin-Rezeptor-Gen) A1 oder die SLC6A3 (Dopamin-Transporter-Gen) neun repetitive Allelvarianten getragen haben.Stress-induziertes Verlangen war deutlich höher in diejenigen, die beide Allele getragen haben, im Vergleich zu denen die keine. Es steht im Einklang mit den beteiligten getrennten biologischen Stoffwechselwegen (Rezeptor, Transporter).Diese Ergebnisse liefern starke Unterstützung für die Möglichkeit, dass das Dopamin-System an stress-induziertem Verlangen beteiligt ist, und deuten auf einen möglichen genetischen Risikofaktor für persistentes Rauchverhalten.Dieser Stoffwechselweg spielt auch eine Rolle bei Drogenmissbrauch oder Alkoholismus.Beide allelische Varianten sind mit niedrigerer Gehirn-dopaminerg-Funktion assoziiert und man denkt, dass dieses basale Defizit in der Gegenwart von Triggern (z.B. Stress) das Verlangen erhöht. Es kann in Zusammenhang mit der akuten Phase Steigerung des Dopamin-Spiegels stehen. Ein weiterer wichtiger Weg, die eine Rolle in der Sucht zu Rauchen spielt, ist der Nikotin-Weg.Die CYP2A6 Gen (19q13.2) kodiert für ein Enzym, das für den Abbau von Nikotin zuständig ist.Ein Mangel an diesem Enzym ist durchaus üblich (10-17,6%) und verursacht reduzierten Abbau von Nikotin, und Menschen mit diesem Mangel haben reduzierte Wahrscheinlichkeit von Nikotinsucht. Wenn sie Zigarette rauchen, rauchen sie weniger und haben geringeres Risiko für Krebs und Emphysem.Das Nikotin akkumuliert sich in ihrer Organismen, wird das Verlangen schneller reduziert, und somit kann sich weniger toxische Substanz aus dem Rauch in ihrem Körper akkumulieren. Im Jahr 2008 identifizierten drei unabhängige GWAS eine SNP (rs1051730) in einem Nikotinsäure-RezeptorUntereinheit-Gen, das sowohl mit Rauchen und auch mit Lungenkrebs assoziiert ist. Es gab eine Diskussion, welche die wirkliche Assoziation ist.Dann, mit Hilfe von Assoziationsstudien wurde der Nachweis erbracht, dass die genomische Region (CHRNA5-CHRNA3-CHRNB4, 15q24; CHRNA = neuronal acetylcholine receptor subunit alpha), wo es mehrere Nikotinrezeptoren gibt, die verantwortlich für die Assoziation mit starken Rauchens sind, und der Link mit Lungenkrebs nur durch die Rauchen verursachten Phänotypen vermittelt ist.Wenn Patienten mit Lungenkrebs aus der Population genommen wurden, ist die Assoziation geblieben. Die Signifikanz der nikotinischen Rezeptoren wurde durch weitere Untersuchungen bestätigt, wo zusätzliche nikotinischen Rezeptors Gencluster (CHRNA6-CHRNB3) auf Chromosom 8p11 gefunden wurden, die sich mit dem Rauchen und auch mit der Menge der Zigaretten, die an einem Tag geraucht werden, assoziierten. In einer ungarischen Studie wurde eine hoch signifikante Assoziation zwischen immer Rauchern (past + aktuelle Rauchen) und einem spezifischen MHC Haplotyp beobachtet.Die 8.1 Haplotyp ist häufiger bei den immer Rauchern als bei den Nie-Rauchern [Odds Ratio: 4,97 (1,96-12,62), P = 0,001] vorgekommen, und die Assoziation war stärker bei Frauen (Odds Ratio = 13,6) als bei Männern (Odds ratio = 2,79). Eine unabhängige Studie in isländischen Probanden (n = 351) ergab ähnliche und bestätigende Ergebnisse.In Anbetracht der dokumentierten Verbindung zwischen olfaktorischer Stimuli und Rauchen bei Frauen, und das Vorhandensein von einem Geruchsrezeptorgencluster nahe dem MHC Klasse-I-Bereich, die Ergebnisse implizieren eine mögliche Rolle der MHC-gekoppelte Geruchsrezeptorgenebei der Initiierung des Rauchens. 4.2. Rauchen-Gen Interaktion in Erkrankung Suszeptibilität 138 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Gen-Umwelt Interaktion Das Produkt des Gens GSTM1Glutathion-S-Transferase spielt eine Rolle bei der Entgiftung von elektrophilen Verbindungen, einschließlich Karzinogene, therapeutischen Medikamenten, Umweltgifte und Produkte von oxidativem Stress, durch Konjugation mit Glutathion.Seine Nullmutation ist sehr häufig (39%). Dieser Mangel ist bei Rauchern mit einem erhöhten Risiko für Asthma und Lungenkrebs assoziiert. Vitamin E und C können schützend sein. Vorher haben wir schon eine Rauchen-Gen-Interaktion erwähnt, nämlich, dass das Rauchen bei Menschen mit Alpha-1-Antitrypsin-Mangel Lungenemphysem, COPD und Asthma auslösen kann. 80-90 Prozent der Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) haben bestimmte Subtypen von HLA-DRB1: DRB1 * 0401, * 0404, * 0405, * 0408, * 0101, * 0102, die sogenannte Shared-Epitope (HLA-(DRB1) SE).Träger des HLA-SE haben eine erhöhte Anfälligkeit für RA und dies hat auch eine prognostische Bedeutung. In RA ist das Rauchen der wichtigste Umweltrisikofaktor.In den letzten Jahren ist entdeckt worden, dass in RA-Patienten anti-CCP (anti-cyclic citrullinated peptide) Autoantikörper detektiert werden können. In HLA-DRB1 SE Trägern kann Rauchen zum Auftreten von Anti-CCP-Antikörper führen.Es beginnt in der Lunge, und Jahre später entwickelt sich das RA. Rauchen aktiviert das Enzym Peptidylarginin Deiminase, das die Umwandlung von Arginin zu Citrullin in den Proteinen in der Lunge katalysiert.Der Zigarettenrauch funktioniert als lokales Adjuvans, was zur Produktion von anti-CCP führt. Die HLA-DRB1-SEVarianten binden und präsentieren citrullinierte Proteine besonders gut. Monate oder Jahre später kann eine leichte Entzündung in den Gelenken Erscheinungen von citrullinierten Proteinen auslösen. Bei Personen, die hohen anti-CCP-Spiegel haben, kann es zur Entwicklung von chronischen RA führen. Wenn ein Raucher ein HLA-SE-Allel Träger ist, ist sein relatives Risiko 6,5, in zwei Allel-Trägern ist es 21. Ein Gen-Gen-Umwelt Interaktion kann in diejenigen beobachtet werden, die Nullmutation in dem GSTM1 Gen haben, und außerdem HLA-SE Träger und Raucher sind. Sie haben 58-fach erhöhtes Risiko für die Entwicklung von RA. Die erwartete Lebensdauer von Rauchern ist deutlich geringer als die von Nichtrauchern.Personen, die Träger der C4B*Q0, einem inaktiven Varianten des Komplementsystems C4B-Gen in der HLA-Region (6p21.3) sind, haben reduzierte Lebenserwartung.Die Populationsfrequenz dieser Variante ist 16% in jungen Jahren (unter 45) und reduziert sich auf 6% bei Menschen mit 70-79 Jahren.Diese Ergebnisse wurden in der ungarischen Population festgestellt und in Isländisch bestätigt, und zeigten, dass Raucher und Träger des C4B*Q0 ein stark erhöhtes Risiko von Herzinfarkt oder Schlaganfall hatten, und wurden aus der gesunden älteren Bevölkerung ausselektiert. Das CYP1A1 Gen gehört zur Cytochrome P450-Superfamilie (CYP). CYPs leisten einen wichtigen Beitrag bei der Verstoffwechselung wasserunlöslicher Stoffe durch Oxidation. Diese werden dadurch besser wasserlöslich und können schneller aus dem Körper ausgeschieden werden. Als Substrate fungieren sowohl körpereigene als auch körperfremde Stoffe (z.B. Arzneimittel).CYP1A1 baut die Giftstoffe im Zigarettenrauch ab. Der häufigste Krebs bei Kindern ist die akute lymphatische Leukämie (ALL). Kinder, deren Eltern Raucher sind, haben ein deutlich höheres Risiko.In einer Studie wurde festgestellt, dass, wenn der Vater zu Hause raucht, das Risiko 1,8-fach ist. Die Varianten in der CYP1A1 Gen allein beeinflussen nicht das Risiko für ALL, aber wenn die Kinder Träger bestimmter Haplotypen von CYP1A1 sind, und ihre Väter zu Hause rauchen, dann ist das Risiko 2,8-fach, wenn der Vater ein starker Raucher ist, ist das Risiko 4,9-fach. Rauchen ist ein Risikofaktor auch in Asthma. In einem genomweiten Screening wurde eine Hypothese getestet, ob die Einbeziehung der Exposition gegenüber Tabakrauch in der Umwelt (environmental tobacco smoke = ETS), die Fähigkeit zur Genkartierung für Asthma verbessern würde.144 weiße Familien aus der Collaborative Study für die Genetik von Asthma wurden für 323 Mikrosatelliten als genetische Marker genotypisiert und Umweltinformationen wurden über ETS-Exposition während der Kindheit in die Studie einbezogen.Drei Regionen zeigten eine signifikante Zunahme von der LOD-Score Grundlinie: Chromosom 1p zwischen D1S1669-D1S1665 Marker; 5q am D5S1505-D5S816 und 9q am D9S910.Die höchste LOD-Score wurde auf Chromosom 5q gefunden. In dieser genomischen Region wurden 3 Kandidatengene zwischen den Markern D5S1505-D5S816 gefunden: ADRB2, IL4 und IL13.Darunter der stärkste Kandidat hier ist das ADRB2 Gen, welches den adrenerge β2-Rezeptor kodiert, da sie in der Lunge exprimiert und Substanzen aus dem Zigarettenrauch bindet.Der Rezeptor besitzt eine häufige Variante: Arg16Gly, die die Menge des exprimierten Rezeptoren beeinflusst, und pharmakogenetische Bedeutung hat (siehe Kapitel 13). In einer anderen Studie wurde festgestellt, dass mit nie-Raucher Gly-16 Homozygoten vergleichen, hatten die irgendeinmal Raucher Arg-16 homozygoten ein signifikant erhöhtes Risiko für Asthma (Odds Ratio = 7,81, 139 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Gen-Umwelt Interaktion 95% Konfidenzintervall [CI]: 2,07 bis 29,5). Diese Assoziation zeigte eine klare Dosis-Wirkungs-Beziehung mit der Anzahl der gerauchten Zigaretten. Das Rauchen erhöht das Risiko auch für Atherosklerose und T2DM (Diabetes mellitus Typ 2).Die CYP1A1 Gen hat einen Polymorphismus, genannt als MspI (T6235C). Das C-Allel ist mit einem besseren induzierbaren Gen assoziiert, ist seine Frequenz 10%, und es erhöht in milden Rauchern das Risiko für Atherosklerose, T2DM und assoziiert sich mit höherer Komplikationsrate. Bei starken Rauchern ist das Risiko für diese Erkrankungen so hoch, dass die schwache Wirkung dieser Polymorphismus nicht nachgewiesen werden kann. Diese Beobachtung zeigt, dass das Vorhandensein des seltenen C-Allels des CYP1A1 bei Rauchern eine Prädisposition für schwere CAD und T2DM steigern kann. Die Varianten des Gens APOE (E2, E3, E4) beeinflussen die Suszeptibilität für verschiedene Krankheiten, wie Alzheimer-Erkrankung, oder Atherosklerose. Die Varianten sind ziemlich häufig und unterscheiden sich voneinander in ihrer Reduktionspotential und Affinität zu Lipoproteinrezeptoren. Das APOE4 Allel hat das niedrigste Reduktionspotential, was bedeutet, dass es zumindest effektiv durch Rauchen induzierten oxidativen Stress reduzieren kann. In einer Studie wurden den höchsten oxLDL-Spiegel und Suszeptibilität für Atherosklerose in APOE4 Rauchern gemessen. Tragen APOE4 ist mit einem hohen Risiko für Alzheimer-Erkrankung assoziiert, das gleiche ist wahr für das Rauchen (OR = 4,93), aber dieses Risiko ist das höchste in APOE4 Rauchern (OR = 6,56). 4.3. Weitere Beispiele für Gen-Umwelt Interaktionen Die hohe Frequenz des APOE4 Allel (16%) kann durch Selektionsvorteil erläutert werden. Das E4-Allel ist mit höherem LDL-C-Spiegel assoziiert und bindet den LDL Rezeptor mit höherer Affinität.In Bevölkerungen, wo pflanzliche Ernährung die dominante war (z.B. bei Sammlern, oder in einigen Inseln), aßen die Menschen weniger Cholesterin und damit die APOE4 gab einen Selektionsvorteil. Und in der Tat, haben Nachfahren dieser Populationen eine höhere Frequenz dieses Allels. Die APOE Allele beeinflussen auch die Lebenserwartung. APOE2 ist mit der höchsten Lebenserwartung und der APOE4 mit der niedrigsten assoziiert. Wahrscheinlich macht APOE4 empfindlicher auf schädliche Umwelteinflüsse. Es wird oft behauptet, dass Gene, die die Gesundheit im Alter beeinflussen, wie HerzKreislauf und Alzheimer Erkrankungen, sind außerhalb der Reichweite der natürlichen Selektion. Aber in einer Population Studie wurde ein allmählicher Anstieg der E2 und E3 Allele des Gens mit jeder Generation auf Kosten des E4 Allel gefunden. Die E2 Allelfrequenz erhöhte etwas schneller als die von E3. Es ist bekannt, dass hohe Cholesterinspiegel oft durch niedriges Cholesterin Diät verringert werden kann, aber dies nicht in jedem funktioniert.In einer Studie wurde festgestellt, dass es unter anderem durch die APOE Genotypen beeinflusst wurde. Der Träger Status der E2-Allel wurde mit schlechteren Antworten zugeordnet, während die der E4 mit guter Reaktion. Dies bedeutet unter anderem, dass bestimmte Allele können sowohl positive als auch negative Auswirkungen haben. Leukotriene sind Entzündungsmediatoren die aus Arachidonsäure durch das Enzym 5-Lipoxygenase, das von ALOX5 Gen auf 10q11.2 kodiert ist, synthetisiert wurden.Da in Atherosklerose arterielle Entzündung verwickelt ist, wurde in einer Studie untersucht, ob ein repetitiver Polymorphismus im ALOX5 Genpromotor sich mit Atherosklerose assoziiert und ob dieser Effekt mit 5-Lipoxygenase konkurrierenden Substraten interagieren kann.Die ALOX5 Genotypen, Carotis-Intima-Media-Dicke und Entzündungsmarker wurden in einer zufällig ausgewählten Gruppe von 470 gesunden, mittleren Alters, Frauen und Männer aus dem Los Angeles Atherosclerosis Studie bestimmt.Diätetische Arachidonsäure und marine n-3-Fettsäuren wurden durch sechsmal 24-Stunden notierte Nahrungsaufnahme gemessen.SelteneALOX5 Homozygoten (ohne das häufige Allel) wurden in 6,0 Prozent in der Kohorte gefunden.Die durchschnittliche Intima-Media-Dicke korrigiert für Alter, Geschlecht, Größe, und Rasse oder ethnischen Gruppe wurde in Trägern mit zwei Varianten Allele erhöht, wenn sie mit Trägern des häufigen (Wildtyp) Allels verglichen wurde.Erhöhte diätetische Arachidonsäure hat signifikant die atherogene Wirkung von Genotyp steigert, während erhöhte Einnahme von n-3Fettsäuren den Effekt abgestumpft hat.Laut dieser Studie identifizieren Variante ALOX5 Genotypen eine Subpopulation mit erhöhtem Risiko für Arteriosklerose.Die beobachteten Diät-Gen-Interaktionen deuten an, dass diätetische Arachidonsäuren fördern, während marinen n-3 Fettsäuren die Leukotrien-vermittelte Entzündung, die zu Atherosklerose bei dieser Subpopulation führt, hemmen. Hoher Homocysteinspiegel ist mit CAD (koronare Atherosklerose) verbunden.Es trägt zur Beschädigung der endothelialen Wand, der Proliferation von glatten Muskelzellen in dem Blutgefäß, und der Entwicklung von 140 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Gen-Umwelt Interaktion atherosklerotischen Plaques bei. Methylentetrahydrofolat-Reduktase (MTHFR) ist bei vielen Stoffwechselwegen unentbehrlich, unter anderem beim Abbau des schädlichen Homocystein zu Methionin. Eine häufige Variante, das thermolabile MTHFR-Gen (C677T oder Ala222Val) ist mit hohem Homocysteinspiegel und erhöhtem CAD Risiko bei Menschen mit geringen Folataufnahme assoziiert. Der Genotyp 677TT wurde mit dem höchsten Risiko verbunden, aber es könnte mit Folataufnahme reduziert werden. Diese beiden letzten Beispiele zeigen, dass das Wissen bestimmter Genotypen vorteilhaft sein kann, wenn die Umweltfaktoren (hier Lebensmittel) leicht geändert werden können, um ihre schädlichen Auswirkungen abzuschwächen. Es wird von den meisten persönlichen genomischen DTC (direct-to-consumer) Unternehmen, in denen laut Genotypen der Kunden persönliche Ratschläge gegeben werden, ausgenutzt. CD14 ist vor allem von Monozyten und Makrophagen gebildet wird. CD14 bindet Gram negativ bakterielle Fettsäuren und Peptidoglykane. Zusammen mit TLR4 und mit Lymphozyten-Antigen 96 bildet es den Lipopolysaccharid-Rezeptor, dereine Th1 Immunantwort gegen Pathogens induziert.Im SNP-159C/T des CD14-Gens erhöht das seltenere T-Allel das Niveau der Transkription, den löslichen CD14-Spiegel, und verringert den IgE-Spiegel. In einer französischen Studie wurde untersucht, ob verschiedene Umgebungen die Wirkung dieser Allelvariante auf allergische Rhinitis beeinflussen.Der CD14-159TT Genotyp war mit 2-fach reduziertem Risiko für Atopie und Rhinitis assoziiert.Die Exposition gegenüber einer landwirtschaftlichen Umgebung im frühen Leben war mit einem ähnlichen reduzierten Risiko von nasalen Allergien assoziiert. Wenn landwirtschaftliche Exposition und CD14-159C/T zusammen betrachtet wurden, das Risiko der Allergie und nasalen Atopie das niedrigste in Teilnehmern war, in denen sowohl eine frühe Kontakt mit einem landwirtschaftlichen Umgebung und auch den Genotyp-159TT kombiniert waren (OR = 0,21 ~ d.h. 5-fach Risikoreduktion). Diese Studie zeigte, dass eine Gen-Umwelt-Interaktion zwischen CD14-159C / T und dem landwirtschaftlichen Umwelt in der Kindheit die Entwicklung von Atopie ändern kann. In einer ähnlichen Studie waren TLR2 und CD14 SNPs mit Asthma und atopische Asthma assoziiert. Darüber hinaus, haben CD14, TLR2, TLR4 und TLR9 SNPs die Assoziationen zwischen Landleben und Asthma geändert. Das CD14-Gen ist ein gutes Beispiel für die Beobachtung, dass die Wirkungen eines Genotyps können sogar umgekehrt je nach den Umweltfaktoren sein.Eine interessante Studie wurde über karelische ethnische Gruppen in Finnland und Russland veröffentlicht. In Anbetracht der Häufigkeit von Asthma / Allergien, wurde ein Ost-West Gradient zwischen westlichen wohlhabenden Ländern und osteuropäischen Entwicklungsländern konsequent bestätigt. Z.B. sind atopische Erkrankungen häufiger in West- als Osteuropa.Finnische Karelier (Western-Umgebung) wurden bisher gezeigt, dass sie eine höhere Prävalenz von allergischen Erkrankungen als Russisch Karelier (Eastern Umwelt) haben. Diese beiden Regionen sind räumlich benachbart und haben voraussichtlich ähnliche Luftverschmutzung. Die Karelier waren eine ethnische Gruppe, bis sie künstlich durch eine neue finnisch / russischen Grenze während des Zweiten Weltkriegs geteilt wurden, nach denen Veränderungen haben sich hauptsächlich auf der russischen Seite der Grenze mit einem Zustrom von weißen Russen aufgetreten.Allerdings sollte die genetische Make-up der beiden Populationen noch ähnlich sein und in der Tat Unterschiede können leicht als Allelverteilung Unterschiede zwischen den Populationen auf jeder Seite der Grenze erkannt werden.Die wichtigsten Unterschiede zwischen finnischen und russischen Karelier sind daher wahrscheinlich in den kulturellen, wirtschaftlichen und Lifestyle Bedingungen, mit denen sie seit ihrer Trennung zu der Zeit des Zweiten Weltkriegs lebten. In der Studie wurden zwei Asthma / Atopie assoziierte Gene, CD14 und CC16, die durch starke Beweise für die Gen-Umwelt-Interaktionen ausgewählt wurden. Umgekehrte Effekte auf Asthma-Phänotypen wurden für bestimmte Allele sowohl von CD14 -159C/T als auch von CC16 A38G in den karelischen Frauen gefunden. Von besonderem Interesse war die Feststellung der paradoxen Gen-Umwelt Interaktionen für mehrere Allergie-Phänotypen.Z.B., verlieh der CD14 TT-Genotyp das größte Risiko für juckenden Hautausschlag in Finnland, aber der TT-Genotyp war mit dem geringsten Risiko in Russen assoziiert.Ein Paradox wurde auch für CC16 gefunden. Der AA-Genotyp war mit dem größten Risiko für Rhinitis und allergische Auge Symptome in der finnischen Population assoziiert, aber in Russen war dieser Genotyp mit dem geringsten Risiko für diese Phänotypen assoziiert. Gen-Umwelt-Interaktionen wurden vorgeschlagen, um die Widersprüche in den Assoziationen der CD14159C/T mit atopischer Phänotypen zu erklären, und eine Endotoxin Switch-Modell wurde postuliert, in denen 141 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Gen-Umwelt Interaktion der CD14 Promotor Polymorphismus die Schwelle, bei denen Umwelt-Endotoxin Stimulation führt zu einer Th2 Immunantwort, ändert. Mehrere Population- und Familie-basierte Studien zeigten, dass der CD14 -159C/T Polymorphismus einen interaktiven Effekt mit Endotoxin-Exposition auf atopischen Phänotypen hat. Das TAllel des CD14 -159C/T SNP, mit höherem Expression von CD14, zeigten schützenden Wirkungen auf Atopie in Population mit niedrigen Ausgesetztsein gegenüber Endotoxin, dagegen war es ein Risikofaktor in Population mit erhöhter Endotoxin-Exposition. Russische Karelier in der östlichen Umgebung können höheres Endotoxin Exposition gehabt haben, als finnische Karelier in der westlichen Umgebung.Tatsächlich fanden neuere Studien, dass finnische Karelien Kindern eine geringere Prävalenz von mikrobiellen Antikörper und weniger Exposition gegenüber mikrobiellen Belastungen im Trinkwasser, im Vergleich mit den russischen Karelien Kinder hatten.Im Hinblick auf dem Endotoxin Switch-Modell, sind russische Frauen mit dem T-Allel von CD14159C/T potenziell höheren Endotoxinen ausgesetzt als finnischen Frauen, und sollten ein erhöhtes Risiko für atopische Phänotypen haben. Jedoch ergab die Studie, dass die russischen Frauen mit dem T-Allel Schutz gegen atopische Erkrankungen hatten, der unvereinbar mit dem Switch-Modell ist, und zeigt die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen Endotoxin und Genotypen von CD14 (siehe Kapitel 9, Hygiene-Hypothese). Neben Rauchen, ist der Alkoholkonsum ein weiterer starker und messbarer Umweltfaktor.Der erste Schritt des Abbaus von Alkohol wird durch Alkoholdehydrogenasen (ADH) katalysiert. Unter weißen Populationen sind Variante Allele am ADH3 Locus (in 40 bis 50 Prozent) weit verbreitet. Am ADH3 Locus unterscheidet sich das γ1-Allel vom γ2 Allel mit zwei Aminosäuren an den Positionen 271 und 349.Pharmakokinetische Studien zeigen eine 2,5-facher Unterschied in der maximalen Geschwindigkeit von Ethanol Oxidation zwischen den homodimeren γ1 Isoenzym (assoziiert mit einer schnellen Rate) und der homodimeren γ2 Isoenzym (assoziiert mit einer langsamen Geschwindigkeit). Dieser Unterschied könnte die Oxidation von Blut Ethanol auswirken, obwohl die ADH3 Polymorphismus keine erkennbare Wirkung auf die Blutalkoholkonzentration in einer Kurzstudie von hochdosiertem Alkoholkonsum bei Menschen hatte.Epidemiologische Studien haben die ADH3 Polymorphismen mit Alkohol-assoziierten Erkrankungen, wie Alkoholismus (γ2γ2), Alkohol-bezogenen Endorganschäden (γ1γ1), und oropharyngealen Krebs (γ1γ1) assoziiert gefunden. In einer großen Studie wurden 14.916 USA männlichen Ärzten zwischen 40-84 Jahren für 12 Jahre gefolgt. Während dieser Follow-up 396 hatten Myokardinfarkte (MI).In diejenigen, die ADH3 γ2γ2 Genotyp hatten und mindestens 14 Gramm Alkohol / Tag verbrauchten, hatten 0,14 MI-Risiko (7,1-faches Risiko-Reduktion) im Vergleich zu denen, die γ1γ1 Genotyp hatten und verbrauchten keinen Alkohol. Es entspricht der J-förmige Kurve, die gefunden wurde, wenn die Beziehung zwischen dem Alkoholkonsum und Gesamtmortalität untersucht wurden.Der Tiefpunkt der Kurven in einer neuen Meta-Analyse zeigte den optimalen Nutzen bei ungefähr einem halben Getränk pro Tag.Weniger als 4 Drinks pro Tag bei Männern und weniger als 2 pro Tag bei Frauen schien Nutzen zu verleihen. Ermäßigungen in kardiovaskulärem Tod und nicht tödlichem Myokardinfarkt wurden mit leichten bis mäßigen Alkoholkonsum assoziiert.Trunksucht wurde dagegen mit einer Zunahme der Mortalität, Bluthochdruck, Kardiomyopathie, Krebs und zerebrovaskulären Ereignisse, einschließlich zerebrovaskulären Blutung assoziiert. Zahlreiche Mechanismen wurden vorgeschlagen, um den Vorteil des leichten bis mäßigen Alkoholkonsums auf das Herz zu erklären, einschließlich einer Erhöhung von High-Density-Lipoprotein-Cholesterin-Spiegel (HDLC), Verringerung der Plasmaviskosität und Fibrinogen-Konzentration, Steigerung der Fibrinolyse, verringern in Thrombozytenaggregation, Verbesserung der endothelialen Funktion, Verringerung der Entzündung und die Förderung der antioxidative Wirkung. Nach den vorigen Studien wird der Effekt des Alkoholkonsums auch durch genetische Hintergrund beeinflusst und die ADH3 Genotypen haben darin eine starke Rolle. In dieser Studiedie Teilnehmer, die Alkohol getrunken haben und hatten γ2γ2 Genotyp, hatten höhere durchschnitt HDL-C-Spiegel, der bekanntlich schützend gegen Atherosklerose und assoziierte Erkrankungen, wie MI ist. Die antagonistischePleiotropie, die in Kapitel 9 beschrieben wurde, ist auch ein gutes Beispiel für die GenUmwelt-Interaktion. 5. Genomische Untersuchungen der Gen-Umwelt Interaktion In den letzten Jahren wurden mit der Entwicklung von genomischen Methoden und großen Biobanken mit detaillierten klinischen und Umweltdaten die Möglichkeiten für eingehendere Untersuchungen der GenUmwelt-Interaktionen deutlich (siehe z.B. UK Biobank oder ALSPAC) erhöht. Im Folgenden sind einige Beispiele für die neuen Arten von Studien mit Verwendung genomischer Methoden und großer Biobanken. 142 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Gen-Umwelt Interaktion In einer großen Studie mit mehreren Populationen wurden Gen-Umwelt-Interaktionen in MI untersucht. Früher war einer der robustesten genetische Assoziationen für kardiovaskuläre Erkrankungen (CVD) mit dem Chromosom 9p21 Region gefunden worden.In dieser Studie wurde untersucht, ob Umweltfaktoren (Ernährung) die Wirkung von Varianten in 9p21 am MI-Risiko beeinflussen. Alle vier SNP Risiko Varianten erhöht das Risiko von MI um etwa ein Fünftel.Aber der Effekt der SNPs auf MI war durch die "umsichtige" (engl. prudent) Diät-Muster Punktzahl der INTERHEART Teilnehmer (multiethnische Bevölkerung mit 8.114 Personen (3.820 Fälle und 4.294 Kontrollen) aus fünf ethnischen Gruppen: europäischen, Südasien, China, Lateinamerika, und arabische), einen Score, die frisches Obst und Gemüse-Aufnahme in Betracht genommen hat, wie in Lebensmittel-Frequenz Fragebögen erfasst wurde.Das heißt, wurde das Risiko von MI in Menschen mit SNP Risiko Varianten durch ihre Ernährung beeinflusst.Die stärkste Interaktion wurde mit einem SNP genannt als rs2383206 gesehen. Die rs2383206 Träger, die eine Diät arm an Obst und Gemüse gegessen hatten, hatten ein höheres Risiko von MI als Nicht-Träger mit einer ähnlichen Ernährung, die rs2383206 Träger und Nicht-Träger, die eine Obst- und Gemüsereiche Ernährung aßen, hatten ein vergleichbares MI Risiko.Insgesamt waren die Kombination von der wenigsten "umsichtige" Ernährung und zwei Kopien der Risikovariante mit zweifach erhöhtem Risiko für MI in der INTERHEART Studie assoziiert. Diese Ergebnisse wurden in der FINRISK Population bestätigt.Sie zeigen also, dass die schädliche Wirkung von 9p21 SNPs auf CVD durch den Verzehr einer Diät reich an frischem Obst und Gemüse gemildert werden könnte. Eine ähnliche Studie wurde im Zusammenhang mit Obesität durchgeführt.Mehr als 20.000 Menschen mit europäischer Abstammung waren beteiligt.Insgesamt 12 SNPs wurden ausgewählt und genotypisiert, die zuvor starke Assoziation mit einem erhöhten Body-Mass-Index (BMI) zeigten.Eine genetische Prädisposition Punktzahl für jeden Teilnehmer wurde berechnet und ihre beruflichen und Freizeit körperliche Aktivitäten wurden unter Verwendung einer validierten selbst auszufüllenden Fragebogen beurteilt.Dann nutzten die Forscher Modellierungstechniken, um die wichtigsten Auswirkungen des genetischen Prädisposition Scores und seine Wechselwirkung mit körperlicher Aktivität auf BMI / Adipositas Risiko und BMI Veränderung im Laufe der Zeit zu untersuchen.Die Forscher fanden heraus, dass jedes zusätzliche BMI-Erhöhung Allel mit einem Anstieg des BMI, der 445 g an Körpergewicht für eine 1,70 m große Person entspricht, assoziiert war, und dass die Größe dieses Effekts größer in inaktiven Menschen als bei aktiven Menschen war.Bei Personen, die einen körperlich aktiven Lebensstil hatten, war dieser Anstieg nur 379 g / Allel, oder 36% niedriger als bei körperlich inaktiven Personen, bei denen der Anstieg 592 g / Allel war.Darüber hinaus in der gesamten Population erhöhte jede weitere Obesität Suszeptibilitätsallel die Chancen der Obesität im Durchschnitt 1,116-fach. Jedoch waren die erhöhten Odds pro Allel für Übergewicht Risiko 40% niedriger bei körperlich aktiven Personen (1,095 Odds / Allel) im Vergleich zu körperlich inaktiven Personen (1,158 Odds / Allel). Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die genetische Suszeptibilität für Übergewicht um etwa 40% durch eine körperlich aktive Lebensweise reduziert werden kann. Und die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass, während die gesamte Bevölkerung von erhöhter körperlicher Aktivität profitiert, Individuen, die genetisch prädisponiert zu Übergewicht sind, würden mehr als die genetisch geschützt Einzelpersonen profitieren. Mehrere Studien haben gezeigt, dass der regelmäßige Verzehr von Kaffee das Risiko von ParkinsonKrankheit (PD) reduziert. Im nächsten Beispiel werden die Ergebnisse einer genomischen Studie beschrieben, in dem mit der Hilfe von GWAS untersucht wurde, welcher genomische Hintergrund den positiven Effekt des Kaffeetrinkens beeinflusst.In dieser Studie waren genomweite Genotypdaten und lebenslängliche koffeinhaltigen Kaffee-Verbrauchsdaten von 1.458 Personen mit PD und 931 ohne PD analysiert.Eine genomweite Assoziations- und Interaktionsstudie (GWAIS) wurde durchgeführt, die jedes SNP Haupt-Effekt sowie seine Interaktion mit Kaffee, adjustiert für Geschlecht, Alter und zwei Hauptkomponenten getestet hat. Teilnehmer wurden stratifiziert als schwere oder leichte Kaffee-Trinker und ein GWAS wurde in jeder Gruppe durchgeführt. Die rs4998386 SNP, die benachbarten SNPs in GRIN2A Gen und starker Kaffee-Verbrauch waren mit PD Risiko assoziiert.GRIN2A codiert eine NMDA-Glutamat-Rezeptor-Untereinheit, die reguliert exzitatorischen Neurotransmission im Gehirn. In stratifizierter GWAS war das GRIN2A Signal in schweren Kaffeetrinker vorhanden (OR = 0,43, p = 6 × 10-7), aber nicht in leichten KaffeeTrinker. Diese Studie war ein Proof of Concept, dass die Einbeziehung von Umwelt-Faktoren können Gene identifizieren, die in GWAS verpasst wurden. Adenosin-Antagonisten (Koffein-like) und GlutamatAntagonisten (GRIN2A-related) werden derzeit in klinischen Studien für die Behandlung von PD getestet. GRIN2A kann ein nützliches pharmakogenetische Marker für Unterteilung Personen in klinischen Studien sein, um festzustellen, welche Medikamente könnten am besten für die Patienten funktionieren. 6. Nutrigenetik und Nutrigenomik 143 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Gen-Umwelt Interaktion Ernährung spielt eine wichtige Rolle unter Umweltfaktoren, da diese heterogenen Faktor auf jeden wirken und den Phänotyp eines jeden beeinflussen. Selbstverständlich wird der Effekt der Ernährung vom genomischen Hintergrund der Individuen, die durch die Nutrigenetik oder Nutrigenomik studiert, beeinflusst. Normalerweise gibt es zwei Arten solcher Studien. Einer von ihnen untersucht, wie die genetischen Variationen den Effekt der Ernährung beeinflussen (früher wurde es als Nutrigenetik bezeichnet), und die andere, wie die Ernährung, die Expression von Genen und Proteinen oder Stoffwechselwege beeinflussen (Nutrigenomik). Früher in diesem Kapitel haben mehrere Beispiele über die erste gezeigt, wie Ergebnisse im Zusammenhang mit dem APOE und ALOX5 Genotypen, Alkoholkonsum und ADH3, Kaffee-Trinken und GRIN2A, umsichtige Ernährung und Chromosom 9p21 Varianten und Folsäure und MTHFR. Es gibt einige Beispiele in Verbindung mit der zweiten, wie die Studie, die die Wirkung von nativem Olivenöl auf Genexpression untersuchte. Der Konsum von Olivenöl hat deutlich die Expression von 98 proinflammatorischen Genen beeinflusst, von denen viele bei entzündlichen Prozessen bekannt, wie Zytokine gesteuerte Prozesse und Transkriptionsfaktoren, wie NF-κB, und Stoffwechselwege wie die mitogen-aktivierte Protein Kinase.Die Autoren vermuten, dass natives Olivenöl ihre Genexpression herunterregulieren und damit die Entzündung verringern kann.Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Studien, die positive Wirkung von Olivenöl auf Plasmalipidspiegel und reduzierte Entzündung gezeigt haben. Obwohl Ernährung ist eine der stärksten Umweltfaktoren und nutrigenetische Ergebnisse wären sehr hilfreich in der personalisierten Ernährung, wird es sicherlich nicht Teil der Routine-Untersuchungen in der nahen Zukunft werden, aber eine Menge von persönlichen genomischen Unternehmen mit direkt an die Verbraucher (DTC) Services haben diese in ihren Dienstleistungen. Welche Vorteile können die Nutrigenomik präsentieren? • Sie kann Informationen für die personalisierte Ernährung bieten • Personalisierte Ernährung kann mit einer besseren physischen und psychischen Gesundheit in Verbindung gebracht werden • Symptome verschiedener Krankheiten können abgeschwächt oder verhindert werden • Diese können dazu führen, Kosten im Gesundheitswesen zu senken Es gibt Menschen, die aufgrund ihres genetischen Hintergrunds, extrem empfindlich auf bestimmte Nahrungsmittel sind. Z.B.: Der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel (kurz: G6PD(H)-Mangel)ist ein angeborener Mangel des Enzyms Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase beim Menschen durch Mutation des G6PD-Gens auf dem X-Chromosom. Die Wahrscheinlichkeit an einem schwerwiegenden G6PD-Mangel zu erkranken ist für Jungen und Männer somit massiv höher als für Mädchen oder Frauen. Der Mangel des Enzyms G6PD führt durch Veränderung des Zuckerstoffwechsels zu einer vermehrten Zerstörbarkeit der roten Blutkörperchen durch äußere Faktoren in Form einer Hämolyse. Die Erkrankung wurde im Zusammenhang mit dem Genuss von dicken Bohnen (Fava-Bohne, Ackerbohne, Saubohne) erstmals beobachtet, worauf der alternative Name Favismus zurückführbar ist. Neben den Fava-Bohnen besitzen Substanzen wie Henna oder diverse Medikamente die Eigenschaft, hämolytische Krisen auszulösen. Unter Zusammenfassung aller Varianten und Ausprägungen weisen auf der Welt zirka 400 Millionen Menschen irgendeine Form des G6PDMangels auf. Vorwiegend wird der G6PD-Mangel in geographischen Regionen angetroffen, in denen Malaria verbreitet war oder ist. In malaria-freien Gebieten kommt der G6PD-Mangel ebenfalls vor, ist aber deutlich seltener. Diese Verteilung des G6PD-Mangels stellt einen balancierten Polymorphismus dar: die relative Resistenz der betroffenen Frauen gegenüber Malaria-Infektionen wiegt unter Gesichtspunkten der Evolution den Nachteil der Empfindlichkeit der betroffenen Männer auf (siehe: http://de.wikipedia.org/wiki/Glucose-6Phosphat-Dehydrogenase-Mangel). Kenntnisse der genetischen Hintergründe bei Trägern mit solchen Mutationen können lebensrettend sein. Natürlich sind die nutrigenetische Untersuchungen teuer, aber das Hauptproblem ist nicht das.Die Populationsgenetische Studien geben Wahrscheinlichkeiten und Populationsdurchschnitte.Ein Ergebnis kann gültig und signifikant für die gesamte Population sein, aber nicht für alle Individuen.Es kann vorkommen, dass eine Person den "guten Genotyp" trägt, aber aufgrund anderer Faktoren (genetische und andere Umwelteinflüsse) hat die Wirkung einer Umweltfaktor einen entgegengesetzten oder schädlichen Effekt als in der durchschnittlichen Bevölkerung.Z.B. hat jemand den vorteilhaften SNP im GRIN2A Gen in Verbindung mit PD, darf aber nicht Kaffee trinken, weil sein / ihr Magen ist empfindlich für den Kaffee und Geschwür kann sich 144 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Gen-Umwelt Interaktion entwickeln. Aber je mehr Faktoren in die Analyse berücksichtigt werden, desto zuverlässiger die Vorhersage auf individueller Ebene sein kann. 7. Die Zukunft der Gen-Umwelt Interaktion Es gibt ein riesiges Potenzial in den Ergebnissen der Gen-Umwelt-Interaktionen. Neben den wissenschaftlichen Bedeutungen, können diese Studien Ergebnisse liefern, die im Alltag genutzt werden können. Das Hauptproblem mit den Umweltfaktoren ist, dass sie sehr schwer zu messen sind, sind sie oft unberechenbar, zufällig und sogar unsichtbar.Z.B.: Luftverschmutzung ist ein ernster Risikofaktor für viele Krankheiten (Asthma, COPD, Arteriosklerose), aber seine Wirkung auf die verschiedenen Individuen ist schwer zu quantifizieren.Die Auswirkungen der Umweltfaktoren sind durch das Alter, körperliche und mentale Zustände der Individuen beeinflusst. Sie sind sogar durch die Wirkungen der früheren Faktoren beeinflusst. Die Entwicklung von genomischen und Bewertungsmethoden und Biobanken mit hochwertigen Daten werden immer besseres Verständnis der Effekte der Umweltdaten beitragen.Die Studie der Genom-Umwelt-Interaktion kann zu zusätzlichen Daten über den Pathomechanismus der Krankheiten, den optimalen individuellen Lebensstil oder die optimale personalisierte Therapie führen.Aber es sind Netzwerke von Interaktionen in jedermann, welche Systembiologische Methoden und Experten benötigen, um sie zu bewerten.Man kann sich vorstellen, dass in Zukunft Decision Support Systeme der Ärzte oder Ernährungsberater helfen können, die Hunderte oder Tausende oder sogar Millionen von Daten über jeden Einzelnen beinhalten und auswerten können, und können die Wirkung der Ernährung oder andere Umweltfaktoren auf einer persönlichen Ebene vorhersagen. Derzeit ist es jedoch nicht bekannt, ob diese zuverlässige Systeme entwickelt werden können, und wenn ja, dann wann? Ein besonderer Teil der Gen-Umwelt-Interaktion ist die Interaktion zwischen Genen und die Medikamente, was als Pharmakogenetik oder Pharmakogenomik genannt wird. Da aus medizinischen Standpunkten es besonders wichtig ist, das ganze nächste Kapitel wird sich mit diesem Thema befassen. 8. Literatur 1. Laland KN, Odling-Smee J, Myles S. How culture shaped the human genome: bringing genetics and the human sciences together. Nat Rev Genet. 2010 Feb;11(2):137-48. 2. International Human Genome Sequencing Consortium: Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001;409:860-921. 3. Venter JC et al. The sequence of the Human Genome. Science 2001;291:1304-51. 4. Barreiro LB, Quintana-Murci L. From evolutionary genetics to human immunology: how selection shapes host defence genes. Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):17-30. 5. Fumagalli M, et al. Genome-wide identification of susceptibility alleles for viral infections through a population genetics approach. 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Fragen 1. Was bedeutet in Gen-Umwelt Interaktionen, dass eine Mutation Hoch- oder Lowpenetrante ist? 2. Was ist die Verteilung der Population bezüglich der Antworten auf Umwelteffekte? 3. Geben Sie Beispiele für die Interaktionen zwischen hochpenetranten Mutationen und der Umwelt! 4. Geben Sie Beispiele für die Interaktionen zwischen lowpenetranten Mutationen und der Umwelt! 5. Welche Wechselwirkungen gibt es zwischen dem Rauchen und dem Genom? 6. Geben Sie Beispiele für Gene, die eine Rolle in stress-induziertem Verlangen für das Rauchen spielen! 7. Was kann die Konsequenz sein, wenn das CYP2A6 Gen fehlend ist? 8. Womit ist eine SNP in einem Nikotinsäure-Rezeptor-Untereinheit-Gen in drei unabhängigen GWAS assoziiert? 9. Was implizieren die Assoziation zwischen einem MHC Haplotyp und dem Rauchen? Wo war die Assoziation stärker? 147 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Gen-Umwelt Interaktion 10. Geben Sie Beispiele für Gene, die die Gesundheit der Raucher beeinflussen können! 11. Geben Sie Beispiele für Gen-Umwelt Interaktion in rheumatoider Arthritis! 12. Welche Mutation kann die erwartete Lebensdauer von den Rauchern beeinflussen? 13. Was können bestimmte Haplotypen von CYP1A1 verursachen und wie? 14. Welches Gen hat Variationen, die das Risiko für Asthma in Rauchern beeinflussen können? 15. Geben Sie Beispiele für Gen-Umwelt Interaktionen mit APOE Variationen! 16. Was können die ALOX5 Genvariationen beeinflussen? 17. Was können die MTHFR Genvariationen beeinflussen? 18. Welcher Umweltfaktor und wie kann den Effekt der CD14 und TLR2 Genvariationen beeinflussen? 19. Ist es möglich, dass eine genetische Variation gegenläufige Effekte in verschiedenen Populationen haben könnte? Erklären Sie es! 20. Was für einen Umweltfaktor kann mit ADH3 Variationen in Interaktion stehen und wie? 21. Mit welchen Erkrankungen ist das 9p21 Chromosomregion assoziiert, und was und wie kann diese Assoziation beeinflussen? 22. Womit kann man die negativen Effekte der Obesität assoziierte Genvariationen beeinflussen? Erzählen Sie die Untersuchung! 23. Was ist GWAIS und was hat sie in Parkinson-Krankheit gefunden? 24. Definieren Sie die Nutrigenetik und Nutrigenomik! 25. Wie wurde es bewiesen, dass natives Olivenöl einen Entzündungsreduzierenden Effekt hat? 26. Welche Vorteile können die Nutrigenomik präsentieren? 27. Was ist Favismus? 28. Was sind die Schwierigkeiten und Möglichkeiten der Untersuchungen der Gen-Umwelt-Interaktionen? 148 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 13. Pharmakogenetik und Pharmakogenomik Csaba Szalai 1. Definition der Pharmakogenetik und Pharmakogenomik Aufgrund der Definition im Buch Humangenetik: Die Pharmakogenomik umfasst die Erforschung und Entwicklung von neuen Wirkstoffen und fragt nach den komplexen Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen und Genen bzw. Genprodukten. Im Unterschied zur Pharmakogenomik beschreibt die Pharmakogenetik die individuellen genetischen Variationen und deren Einfluss auf die Wirksamkeit und Nebenwirkungen von Arzneimitteln. Da mit den modernen Methoden (GWAS, NGS, systembiologische Methode, s. nächstes Kapitel) auch die Variationen und deren Einfluss auf genomischer Ebene untersucht werden können, werden hier die zwei Begriffe, wie oft auch in der Fachliteratur, als Synonyme verwendet. Die meisten Ergebnisse in diesem Gebiet sind eher pharmakogenetisch. 2. Ziele der Pharmakogenomik 2.1. Die Entwicklung von Medikamenten Pharmakogenomik hat zwei Hauptziele. Eines von ihnen ist für neue Wirkstoffen, Medikamente und Drug Targets mit Hilfe der genomischen Methoden zu suchen. Es hat eine große Bedeutung, weil aktuelle bestehende Therapien nur etwa 400 verschiedene Drug Targets haben, im Vergleich zu den 20 bis 22.000 protein-kodierenden Genen, die etwa 2 Millionen verschiedene Proteine (wegen z.B. posttranslationaler Modifikationen oder Spleißvarianten) kodieren. Pharmakogenomik bietet neue Möglichkeiten zur Zielstruktursuche bei der Entwicklung von Medikamenten. Nicht nur die Proteine können Zielmoleküle (Targets) therapeutischer Interventionen sein. Auch die DNA und RNA werden zunehmend zu Zielmolekülen und als Arzneimittel eingesetzt. Wir wissen schon von dem ENCODE Projekt, dass mindestens 80% des menschlichen Genoms (2,4 Milliarden bp) Funktionen hat, und die Anzahl der zellspezifischen Enhancerregionen ist etwa 400.000. Natürlich sind nur ein Bruchteil davon wirklich Drug Targets, aber nach Schätzungen gibt es mindestens 10 Mal mehr Targets als derzeit vorhanden ist. Im Gegensatz jedoch ist Arzneimittelentwicklung derzeit in der Krise. In den letzten Jahren hat die FDA nur zwischen 18 und 30 neue Medikamente jährlich zugelassen, während zwischen 1998 und 2002 lag diese Zahl im Durchschnitt 68.Die Identifizierung neuer Zielmoleküle können erheblich von dem neuen Hochdurchsatz genomischer Methoden beschleunigt werden, und darüber hinaus kann der Preis für die Entwicklung von Medikamenten deutlich reduziert werden.Z.B., mit Hilfe der GWAS können mehrere Millionen genetische Varianten in kurzer Zeit und bei einem relativ niedrigen Preis untersucht werden, und wenn eine Variante mit einer Krankheit, den Symptomen oder Endophänotypen assoziiert ist, bedeutet, dass es eine Sequenz in der Nähe gibt, welche eine Rolle in dem assoziierten Phänotyp spielt, dann können die Sequenz selbst oder das codierte Protein oder RNA oder der Signalweg als potentiell Drug Targets anzusehen sein. Ein zusätzlicher Vorteil der genomischen Methoden, dass sie hypothesenfrei sind (d.h. es ist nicht erforderlich, den Pathomechanismus zu wissen) und somit können neue Wege entdeckt werden.Leider ist lange Zeit benötigt (bis zu 20 Jahren) von der Target-Identifizierung bis einen Medikamentenkandidat auf den Markt zu bringen, aber genomische und andere moderne Methoden können diese Zeit erheblich verkürzen. In den vorangegangenen Kapiteln wurden einige Beispiele für die Identifizierung neuer therapeutischer Targets gezeigt. Pharmazeutische Unternehmen und Forscher untersuchen mehrere neue potentielle Drug Targets in den letzten Jahren, die durch genomische Methoden identifiziert wurden. 149 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Pharmakogenetik und Pharmakogenomik 2.2. Unerwünschte Arzneimittel-Wirkungen Das Hauptthema dieses Kapitels ist über das andere Hauptziel der Pharmakogenomik.Diese befasst sich mit dem Einfluss genetischer Variationen auf die Antwort zum Medikament bei Patienten durch Korrelation der Genexpression oder SNPs mit der Wirksamkeit oder Toxizität des Medikaments. Mit Hilfe der Pharmakogenomik wird unter anderem eine individualisierte Arzneimitteltherapie („individualisierte Medizin― oder „personalisierte Medizin―) angestrebt, bei der Patienten das für ihr Genmaterial maßgeschneiderte Medikament in der vorhergesagt wirksamen Dosierung erhalten.Diese Art von Studien ist mindestens so wichtig wie die Entdeckung neuer Zielmoleküle. Unerwünschte Arzneimittel-Wirkungen (UAW) beeinträchtigen in erster Linie die Lebensqualität des Patienten, und sie verursachen hohe Kosten in der Gesundheitsversorgung. Sie • sind die Ursache von 5% aller Klinikeinweisungen, • treten bei 10–20% aller hospitalisierten Patienten auf, und • verursachen 0,1% aller internistischen und 0,01% aller chirurgischen Todesfälle. Mehrere hunderttausend Patienten in Deutschland leiden an unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen (UAW). Bis zu 25000 Tote werden aufgrund von UAW jährlich für Deutschland befürchtet. Die Unterschiede der Menschen in den Reaktionen auf Medikamente haben starken genetischen Hintergrund.Nach Schätzungen werden 60-80% dieser Unterschiede durch genetische Unterschiede zwischen den Menschen verursacht. Es gibt mehr und mehr pharmakogenetische Informationen über die verschiedenen Medikamente, aber sie gehen nur langsam in die Praxis.In einer retrospektiven Studie, bei der 53 Tausend Patienten und 99 Medikamente mit FDA-zugelassenen pharmakogenetische Daten untersucht wurden, wurde festgestellt, dass in 300-600 Fällen schwere Nebenwirkungen hätten vermieden werden können, wenn die pharmakogenetische Test durchgeführt worden wäre. Die beiden Zweige der Pharmakogenomik überlappen miteinander. Pharmakogenomik wird zunehmend in der klinischen Arzneimittelentwicklung eingesetzt, vor allem auch in Phase I und II. Bei der Arzneimittelentwicklung steht die Untersuchung polymorpher Stoffwechselwege und des Anteils genetisch kontrollierter Faktoren zur Erforschung der Wirksamkeit von Medikamenten im Vordergrund. Nach Phase-I-Studien kann ein genomweites SNP-Screening in Phase II durchgeführt werden. Ein abgekürztes SNP-Profil für die Wirksamkeit durch Erkennen diejenigen SNPs entlang des Genoms, die in Kopplungsungleichgewicht sind, wenn Patienten mit Wirksamkeit mit Patienten, die nicht an den Medikamentenkandidaten reagieren verglichen werden, konnte in dieser Phase II identifiziert werden. SNPs können dann ausgewählt werden, welche können die Wirksamkeit unterscheiden, und verwenden für die Auswahl der Patienten für größere Phase-III-Studien. Dies könnte viele dieser Phase-III-Studien kleiner und damit effizienter und billiger zu gestalten.Pharmakogenetik könnte auch während der ersten Post-Marketing Surveillance (Phase IV) verwendet werden, um SNP-Marker, die mit schweren, aber seltenen Nebenwirkungen assoziiert sind, zu identifizieren. Diese Marker konnten zu den SNP-Marker für die Wirksamkeit und häufige UAW, die während der Entwicklung identifiziert wurden, hinzugefügt werden, um eine umfassende Medizin Reaktionsprofil zu produzieren, und festzustellen, welche Patienten reagieren auf das Medikament und welche haben ein hohes Risiko für ein unerwünschtes Ereignis (Roses AD, 2000). Diese könnten auch für bestehende Medikamente gemacht werden, und Subpopulationen könnten ausgewählt werden, in denen die Arzneistoffe effizient sein könnten, und das Risiko für schwere UAW minimal ist. Ein interessantes Beispiel hierfür ist der Fall von BiDil oder NitroMed, die bei der Behandlung von kongestiver Herzinsuffizienz vorgeschlagen wurden. Die klinischen Studien, die eine ethnisch gemischte Bevölkerung untersuchten, konnten die Effizienz des Medikaments nicht beweisen, und so war es nicht von der FDA zugelassen.Aber später, wenn die Studie auf einer afroamerikanischen Bevölkerung wiederholt wurde, musste die Studie gestoppt werden, weil der Unterschied so bedeutend zwischen den Placebo und den behandelten Populationen war. Es war das erste ethnisch-spezifische Arzneimittel (Brody H et al., 2006). Da die ethnische Zugehörigkeit oder die Farbe der Haut eher subjektiv sind, und beeinflussen nicht direkt die ArzneimittelReaktion, könnten genetische Marker bestimmt werden, welche die wirkliche Assoziation voraussagen könnten. 150 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Pharmakogenetik und Pharmakogenomik Es gibt eine Menge Beispiele, wenn ein zugelassenes Medikament den schweren, aber seltenen Nebenwirkungen zufolge vom Markt genommen werden muss (z.B. Cerivastatin, s. unten). Dies bewirkt Mrd. $ Verlust für die Pharma-Unternehmen, aber das ist schädlich auch für die kranken Menschen, für die das Medikament effizient war. Wenn die genetischen Ursachen der schweren Nebenwirkungen festgestellt werden könnten, dann die Menschen, die ein hohes Risiko für die negativen Auswirkungen haben, könnten mit alternativer Therapie behandelt werden. Theoretisch ist es möglich, dass in der Zukunft jeder Mensch ein genomisches Profil bei den Ärzten hat, die mit Hilfe eines Entscheidungsunterstützungssystems in der Lage sein könnten, die optimalen Arzneimittel oder Therapie für den Patienten auszuwählen. Dies könnte der Idealfall für die personalisierte Therapie sein. 3. Genomischer Hintergrund der Unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen Eine der wichtigsten Fragen der Pharmakogenomik ist, was die Mechanismen sind, mit denen die genetischen Varianten die Wirkstoff-Reaktion beeinflussen. Es gibt drei mögliche Mechanismen: (1) Pharmakokinetik. Genetische Variationen, die die Mechanismen der Aufnahme und Verteilung des verabreichten Arzneimittels, die chemischen Veränderungen der Substanz in dem Körper, und die Wirkungen und Routen der Ausscheidung der Metaboliten des Arzneimittels beeinflussen. (2) Pharmakodynamik. Genetische Varianten, die in den Genen der Zielmoleküle oder in ihren zugehörigen Stoffwechselwegen sind. Pharmakodynamik wird oft als die Studie von dem, was ein Medikament mit dem Körper tut zusammengefasst, während Pharmakokinetik ist die Studie von dem, was der Körper mit einem Arzneimittel tut. (3) Idiosynkratik. Genetische Variationen in Genen, die für Proteine kodieren, die nicht im Target oder pharmakokinetischen Signalwegen sind, könnten aber die Medikament-Reaktion beeinflussen. Die negativen Effekte konnten beispielsweise durch eine Enzymopathie verursacht werden, so dass die Substanz nicht richtig im Organismus verarbeitet werden kann, und verursacht Symptome durch Akkumulierung bzw. Blockierung anderer Substanzen. 4. Schwierigkeiten der pharmakogenomischen Forschungen Es kann gefragt werden, dass, wenn die Bedeutung der Pharmakogenomik und das Interesse der pharmazeutischen Industrie so groß sind, warum es so wenige wahrgenommene Ergebnisse gibt? Eine der Erklärungen ist, dass die wichtigste Entwicklung des Hochdurchsatzes der genomischen, bioinformatischen und anderen Methoden nur in den letzten Jahren durchgeführt wurde, und es war nicht genug Zeit (10-20 Jahre) für die Vermarktung der neu entwickelten Medikamente. Aber es gibt andere Eigenschaften, die Schwierigkeiten verursachen können. Umweltfaktoren können oft zu ähnlichen Effekten als die genetischen Varianten führen. Es heißt Phänokopie. Aus statistischer Sicht kann es große Schwierigkeiten bei der Auswertung verursachen. Ein weiterer Störfaktor sind die Gen-Gen-Interaktionen.Wie in Kapitel 9 und 10 detailliert wurde, sind sie sehr schwer zu erkennen und zu bewerten.Die Varianten können in der gleichen oder verschiedenen Genen auftreten und verstärken oder schwächen die Wirkungen von einander. Und da die Verteilungen der genetischen Varianten zwischen verschiedenen Populationen unterschiedlich sein können, können die wahren Wirkungen der einzelnen Varianten auch unterschiedlich sein. Auf der Webseite der FDA kann eine Tabelle mit der Liste der FDA-Zulassung pharmakogenomischen Biomarker in Arzneimitteletiketten gefunden werden.In November 2012 gab es 118 Zeilen mit Arzneimitteln in dieser Tabelle.Die meisten sind mit der Onkologie (32), dann mit der Psychiatrie (30) verbunden. Für die Herz-Kreislauf-Erkrankungen gibt es 8 pharmakogenomische Biomarker. Unter den Genen gehören die häufigsten zu den CYP-Gen-Familie (60). Das häufigste Gen ist das CYP2D6 (37) und dann das CYP2C19 (14). Da die CYP-Gen-Familie eine wichtige Rolle in dem Arzneimittel-Metabolismus spielt, zeigt sich, dass die pharmakokinetischen Varianten in dieser Liste überrepräsentiert sind. 151 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Pharmakogenetik und Pharmakogenomik Im Folgenden zeigen wir nur einige Beispiele der oben genannten Liste und werden uns eher auf die Untersuchungen konzentrieren, die in diesem Thema durchgeführt wurden. Wir verwenden zwei Erkrankungen, Arteriosklerose und Asthma als Beispiele. 5. Genetische Varianten in Pharmakokinetik Nach Schätzungen werden die Effekte von etwa 20% der Medikamente auf dem Markt von Polymorphismen in Genen, die Enzyme kodieren, die für den Abbau der Wirkstoffe verantwortlich sind, beeinflusst.Wenn eine Variante die Aktivität des Enzyms erhöht (schnellen Metabolismus), dann der Wirkstoff zu schnell ausgeschieden wird, und ist möglicherweise nicht in der Lage, seine volle Wirkung zu entfalten. Wenn eine Variante einen gegenteiligen Effekt hat (langsame Stoffwechsel), kann das Medikament sich akkumulieren und, mehr unerwünschte Nebenwirkungen haben. Das CYP (Cytochrom P-450)-Gen-Familie verfügt über 57 Mitglieder, und sie spielen eine Rolle bei der Oxidation endogener Substanzen und Xenobiotika. Varianten in diesem Gen sind für 80% aller UAW verantwortlich. CYP2D6, als das am häufigsten vorkommende Gen auf dem zuvor erwähnten FDA Liste, wirkt auf ein Viertel aller verordneten Medikamente.Etwa 10% der Bevölkerung hat eine langsam wirkende Form dieses Enzyms und 7% eine super-schnell wirkende Form, während 35% Träger ein nicht-funktionales 2D6-Allel ist, das deutlich erhöht das Risiko von Nebenwirkungen, wenn die Individuen mehrere Medikamente nehmen. Im Fall von CYP2C9 (Cytochrom P450 2C9), ist etwa 10% der Bevölkerung Träger von mindestens einem Allel für die langsam metabolisierende Form und können mit 50% der Dosis der normalen Metabolisierer behandelt werden. Wegen der bekannten klinischen Bedeutung von CYP Polymorphismen stehen CYP Chips zur Bestimmung der bekannten Prädiktor Genotypen zur Verfügung. Warfarin ist ein Vitamin K-Antagonist und gehört zu den Antikoagulantien und somit eine blutgerinnungshemmende Wirkung hat. Warfarin wirkt bei Patienten unterschiedlich stark, und 30% der Wirksamkeits-Unterschiede können durch Polymorphismen des VKORC1-Gens erklärt werden; weitere 10% durch Polymorphismen des CYP2C9. Bei Afroamerikanern ist der Warfarin-resistent VKORC1 Haplotyp B häufiger, bei Asien dagegen ist der Warfarinsensitiv Haplotyp A häufiger. Dies erklärt, weshalb Afroamerikaner weniger stark auf Warfarin reagieren als Asien-stämmige Amerikaner. Genetische Variationen in einem anderen Cytochrom P450 (CYP4F2) erklären weitere 8% der variablen Reaktionen von Patienten auf Warfarin. Trotz des Versprechens von pharmakogenomischen Tests in Warfarin Dosierung, ist seine Verwendung in der klinischen Praxis umstritten. Zwei randomisierte kontrollierte Studien haben herausgefunden, dass, obwohl Gentests die stabilen Dosen von Warfarin vorhersagen, die Tests erhöhen nicht die Zeit im therapeutischen Bereich (d.h. die Zeit für die gewünschten Grade von Antikoagulation). Eine kürzlich durchgeführte Studie ergab dagegen, dass prospektive Genotypisierung Krankenhausaufenthalt für Patienten, die gerade erst eine Warfarin-Therapie begannen, reduzierte. den Suxamethonium ist ein depolarisierendes Muskelrelaxans, das auch als Succinylcholin oder Succinyldicholin bekannt ist. Es wird in der Medizin verwendet, um eine vorübergehende Muskellähmung herbeizuführen. Die Substanz wirkt als Agonist an den Acetylcholinrezeptoren der motorischen Endplatte. In seltenen Fällen (bei Verminderung der Wirkung des Enzyms Pseudocholinesterase) kann die Wirkung stark verlängert sein, so dass hier eine längere Nachbeatmung notwendig sein kann. Es sind mehrere genetische Varianten der Pseudocholinesterase (BCHEGen) bekannt. Homozygote Personen für die atypische Variante des Enzyms (ca. 1:2000), hydrolysieren das Succinylcholin nur langsam, und es kann Komplikationen verursachen. Mercaptopurin ist ein Analogon der Adenin und Guanin. Es wird als Zytostatikum in der Chemotherapie der Leukämie, sowie zur Langzeittherapie chronischer Darmentzündungen eingesetzt. Mercaptopurin wird durch das Enzym Thiopurin-Methyltransferase (TPMT Gen) metabolisiert. Dieses Enzym zeigt einen relevanten Polymorphismus in der menschlichen Bevölkerung. Etwa 10% der Bevölkerung weisen eine deutlich 152 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Pharmakogenetik und Pharmakogenomik verminderte Enzymaktivität auf und etwa 0,3% (d.h. einer unter 300) zeigen gar keine nachweisbare TPMTAktivität. Bei diesen Patienten kann es zu unerwarteten hohen Toxizitäten kommen, wenn Mercaptopurin in „normaler― Dosis verabreicht wird. Besonders betroffen ist die Blutbildung, wo es zu einer ausgeprägten Zytopenie kommen kann. Ursache der verminderten oder fehlenden Enzymaktivität sind Mutationen im Gen für TPMT. Drei Allele (TPMT *2, *3A und *3C), sind für etwa 80–95% der Fälle von verminderter TPMTAktivität verantwortlich. Das Multidrug-Resistance-Protein 1 (MDR1; ABCB1 Gen) bildet einen aktiven Transporter, der unter ATPVerbrauch zelltoxische Stoffe aus der Zelle pumpt. MDR1 gehört zur Familie der Multidrug-ResistanceProteine, die wiederum Klasse B der ABC-Transporter ausmachen. Beim Menschen wird das Protein in Leber, Nieren, Dünndarm und Gehirn exprimiert.Bei ABCB1 3435T/C SNP ist das T-Allel mit niedrigeren Expressionsniveaus des Gens und höhere Nebenwirkungen (Erdélyi et al., 2006) assoziiert. „Langsame Acetylierer―. Isoniazid war das erste wirksame Medikament gegen Tuberkulose. Erhöhte Blut- und Gewebespiegel rufen gehäuft unerwünschte Nebenwirkungen wie periphere Neuropathie oder selten Lupuserythematodes-ähnliche Symptome hervor. Eine gute Verträglichkeit des Medikaments setzt also voraus, dass es zügig metabolisiert wird. Die Metabolisierung von Isoniazid wird durch seine Acetylierungsrate bestimmt. Das Enzym N-Acetyltransferase-2 (NAT2), für das es mehr als drei Dutzend Allele gibt, ist für die Acetylierung verantwortlich. Einige Menschen entwickeln als besonders „langsame Acetylierer― eine IsoniazidUnverträglichkeit mit oben beschriebenen Symptomen. Erste Familienstudien belegten, dass diese Unverträglichkeit autosomal rezessiv vererbt wird. Die Inzidenz „langsamer Acetylierer―-Genotypen schwankt zwischen 5 und 95% in verschiedenen Populationen. Andere Fremdsubstanzen wie Sulfonamide, Hydralazin, Procainamid und chemische Karzinogene werden in derselben Weise verstoffwechselt (Humangenetik). 6. Genetische Varianten in Pharmakodynamik Es gibt deutlich weniger Ergebnisse in Bezug auf genetische Polymorphismen, die Pharmakodynamik beeinflussen. Das zuvor erwähnte VKORC1 Gen kodiert das Target Enzym von Warfarin, und seine Polymorphismen sind deshalb Beispiele dafür. 7. Beispiele für pharmakogenetische Studien 7.1. Statine Als Statin wird im allgemeinen medizinischen Sprachgebrauch ein Arzneistoff bezeichnet, das der pharmakologischen Substanzklasse der 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase- (HMG-CoAReduktase-) Inhibitoren angehört. Da HMG-CoA ein Zwischenprodukt der menschlichen Cholesterinsynthese ist, werden Statine bislang hauptsächlich bei Fettstoffwechselstörungen als Cholesterinsenker eingesetzt. Von allen Medikamenten, die den Lipidstoffwechsel beeinflussen, weisen sie die höchste Potenz auf. Zu den schwerstwiegenden Nebenwirkungen aller bekannten Gruppen von Cholesterinsenkungspräparaten, auch von Statinen, gehören sogenannte toxische Myopathien. Dabei handelt es sich um strukturelle und funktionelle Veränderungen der Skelettmuskulatur. Die schwerste Form einer toxischen Myopathie ist die Rhabdomyolyse, die sich unter anderem in einer vollständigen Lähmung aller vier Gliedmaßen äußert und häufig tödlich verläuft. In der Literatur sind bis zum Jahr 2003 ca. 3350 Fälle einer durch Lipidsenker ausgelösten Rhabdomyolyse beschrieben worden. Dabei ist die diesbezügliche Wirkstärke der verschiedenen Statine unterschiedlich. Mehr als 100 tödlich verlaufende Fälle von Rhabdomyolyse im Zusammenhang mit der Einnahme von Cerivastatin (Handelsname: Lipobay), insbesondere in der Kombination mit Gemfibrozil, führten im Jahr 2001 dazu, dass das Präparat vom Markt genommen werden musste. Die meisten Statine werden über CYP3A4 abgebaut.Der CYP3A4-Spiegel kann eine 10-fache Differenz zwischen den Menschen zeigen. Dafür sind meistens genetische Varianten verantwortlich. In einer Studie beeinflusst der -290A / G-Promotor SNP nach Behandlung von Atorvastatin signifikant den LDL-C-Spiegel, während die M445T-Variante den LDL-C-Spiegel vor und nach der Behandlung (Kajinami K, et al., 2004) beeinflusst. Menschen mit rs35599367, C> T SNP in Intron 6 des Gens benötigen 0,2 bis 0,6-fache Simvastatin Dosisreduktion für den optimalen Lipid-Spiegel. CYP3A5 trägt zur Biotransformation einiger Statin bei.Es ist ein 6986 G / A SNP in Intron 3 des Gens, das signifikant beeinflusst die Expression des Gens.Nur 10% der europäischen Bevölkerung zeigt hohe CYP3A5 153 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Pharmakogenetik und Pharmakogenomik Expression, und in diesen Menschen ist die Lovastatin, Simvastatin und Atorvastatin Behandlung deutlich weniger wirksam (Kivistö KT, et al 2004). Das multidrog resistance-1 (MDR-1, ABCB1) beeinflusst erheblich die Transport und Lokalisation der Statine. In einer Studie beeinflusste der ABCB1 C3435 SNP den LDL-C-Spiegel in der Atorvastatin-Therapie (Becker ML et al., 2010). Polymorphismen im HMGCR Gen, das die HMG-CoA-Reduktase das Hauptziel der Statine kodiert, beeinflussen auch die Antwort auf die Statine. GWAS wurden auch in diesem Thema durchgeführt. Die Studie von Effectiveness of Additional Reductions in Cholesterol and Homocysteine (SEARCH) identifizierte einen SNP im SLC01B1 Gen (SLCO1B1*5), die mit Statin-induzierte Myopathie in Simvastatin (Zocor) behandelten Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen assoziiert war. Es muss jedoch angemerkt werden, dass die pharmakogenetische Ergebnisse in Verbindung mit den Statinen nicht umstritten sind, und damit in der FDA zugelassene Liste gibt es nur zwei Elemente von Statinen mit pharmakogenomischen Arzneimitteletiketten. 7.1.1. Clopidogrel Clopidogrel ist ein Arzneistoff, der die Blutgerinnung hemmt und zur Vorbeugung gegen die Bildung von Blutgerinnseln verwendet wird. Blutgerinnsel können Arterienverschlüsse verursachen und zu einem Herzinfarkt oder Schlaganfall führen. Clopidogrel hemmt bestimmte Abläufe im Gerinnungssystem des Blutes und bewirkt, dass die Thrombozyten nicht miteinander verkleben. Clopidogrel ist ein Prodrug. Erst nach Resorption entsteht durch Oxidation über CYP3A4 und CYP2C19 und anschließende Hydrolyse der pharmakologisch aktive Metabolit.Drei-vier Prozent der kaukasischen Bevölkerung ist homozygot, während 24% heterozygot für die inaktiven Varianten des CYP2C19 Gens ist, die sind mit einer höheren Rate an kardiovaskulären Komplikationen assoziiert. GWAS wurde in einer Amish Population durchgeführt, und ein SNP in der CYP2C19 Gen identifiziert, das mit einer verminderten Arzneimittel-Antwort assoziiert war, und dies war für 12% der Arzneimittel Antwortvariationen verantwortlich. Die traditionellen Risikofaktoren (BMI, Alter, Cholesterinspiegel) waren nur für 10% der Variationen verantwortlich.Dies wurde später in einer weiteren Studie bestätigt und der CYP2C19-Status war in einer 12-Jahre-Follow-up-Studie der einzige unabhängige Risikofaktor, wenn kardiovaskulärem Tod, nicht-tödlicher Myokardinfarkt oder koronare Revaskularisation als Zielwerte angewendet wurden. In einer anderen Studie waren zwei Varianten des ABCB1 mit UAW assoziiert. Das Produkt dieses Gen (MDR1) spielt eine Rolle bei der Absorption des Arzneimittels. CYP2C19 hat eine gain of function Allel (CYP2C19*17), das eine ultra-schnelle Metabolisierung Form des Enzyms kodiert. Träger dieses Allels reagieren besser zum Wirkstoff (Myburgh R et al., 2012). Derzeit empfiehlt FDA alternative Therapien für arme Responder, und im März 2010 wurden die Warnungen über CYP2C19-Genotypen in der Arzneimitteletikett gesetzt. 7.2. Pharmakotherapie von Asthma Es gibt vier große Klassen von Asthma Pharmakotherapie derzeit weit verbreitet: (1) β2-Sympathomimetika, auch β2-Adrenozeptor-Agonisten genannt. In Asthma wirken sie erweiternd auf das Bronchialsystem. Z.B. Salbutamol, Fenoterol, Reproterol, Salmeterol. (2) Glucocorticoide, zählen zu den Corticosteroiden. Glucocorticoid-Präparate haben entzündungshemmende Wirkung. Z.B. Beclomethasone, Triamcinolone, Prednisone. (3) Theophyllin führt primär zu einer Erschlaffung der glatten Muskulatur der Atemwege und somit zu einer Erweiterung der Bronchien. Entzündungshemmende Effekte von Theophyllin können bei Dauerbehandlung ebenso zu dessen Asthmawirksamkeit beitragen. 154 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Pharmakogenetik und Pharmakogenomik (4) Hemmers der LeukotrieneStoffwechselwege. Montelukast, Pranlukast und Zafirlukast sind LeukotrienRezeptor-Antagonisten. Zileuton ist ein Leukotrien-Synthesehemmer. Variabilität in der individuellen Asthmabehandlung-Reaktion kann durch viele Faktoren, einschließlich der Art und Schwere der Erkrankung, Behandlung Compliance, interkurrenten Krankheiten, andere Medikamente genommen (Arzneimittelinteraktionen), Umweltfaktoren und Alter beeinflusst werden. Allerdings gibt es Grund zu der Annahme, dass genetische Faktoren einen Großteil der beobachteten Varianz von Behandlungsantwort unterliegen. Eine Studie der Behandlungsantwort auf Glucocorticosteroiden, Beta-2-adrenergen Agonisten und experimentellen Leukotrien-Inhibitor hat festgestellt, dass bis zu 60-80% der Varianz von der Reaktion auf das Medikament durch genetische Unterschiede zwischen Individuen erklärt werden kann (Szalai et al., 2008). Bisher Untersuchungen im Bereich von Asthma Pharmakogenomik sind drei Klassen von Asthma Therapien spezialisiert: β2-Agonisten, Leukotrien-Antagonisten und Glukokortikoiden. Nachfolgend werden Beispiele für pharmakogenetische Studien über β2-Agonisten und Leukotrien-Antagonisten bei Asthma angezeigt. 7.3. Interaktion zwischen genetischen Variationen und β2Agonisten Die 5q31-33 ist eine wichtige pharmakogenomische Region für Asthma. β2-Agonisten wirken über die Bindung an den β2-adrenergen Rezeptor (ADRB2), einen Zelloberflächen G-Protein-gekoppelte Rezeptor die sich an 5q32 befindet. Antworten auf dieses Medikament sind derzeit die am meisten untersuchten pharmakogenomischen Wege in Asthma. Zwei Kodierungsvarianten (an den Positionen 16 und 27) innerhalb des ADRB2 Gen wurden in vitro als funktionell wichtig gezeigt. Der Gly16-Rezeptor weist verstärkte Herabregulation („Down-Regulation―) in vitro nach Agonist Exposition auf. Im Gegensatz dazu sind Arg16 Rezeptoren widerstandsfähiger gegen Herabregulation. Wegen Kopplungsungleichgewicht sind Personen, die Arg/Arg an Position 16 sind, sind viel wahrscheinlicher Glu/Glu an Position 27; Individuen mit Gly/Gly an Position 16 sind viel eher Gln/Gln an Position 27.Die Genotypen an Position 27 beeinflussen, aber nicht beseitigen die Wirkung der Position 16 in Bezug auf Herabregulation von Phänotypen in vitro.http://de.wikipedia.org/wiki/Theophyllin#cite_notelemmer-22 Retrospektiven Studien und prospektiven klinischen Studien haben vorgeschlagen, dass schädliche Wirkungen bei Patienten homozygot für Arginin (Arg / Arg), statt Glycin (Gly / Gly) an Position 16 auftreten können. Bronchodilator Behandlungen, die β2-Agonisten vermeiden, können für Patienten mit Arg/Arg-Genotyp angemessener sein. 7.4. Interaktion zwischen genetischen Variationen und Leukotrien-Antagonisten Leukotriene sind chemisch von der Arachidonsäure abgeleitet. Ihre Rolle im Stoffwechsel steht im Zusammenhang mit allergischen bzw. entzündlichen Reaktionen des Körpers (z.B. Asthma bronchiale). Das Enzym Arachidonat-5-Lipoxygenase (ALOX5) katalysiert die Reaktion von Arachidonsäure über 5Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HPETE) zu Leukotrien A4 (LTA4). Das sehr instabile Epoxid LTA4 ist die direkte Ausgangsverbindung zur Biosynthese diverser Leukotriene. ALOX5 Aktivität in Teil bestimmt den Grad der bronchokonstriktorische Leukotrienen in den Atemwegen. Pharmakologische Hemmung von ALOX5 bzw. Antagonismus der Wirkung der Cysteinyl-Leukotriene an ihren Rezeptor ist mit einer Verbesserung von Asthma assoziiert. Ein Polymorphismus in dem Promoter von ALOX5 nimmt Gentranskription ab, und weniger Enzym wird produziert, wenn die Anzahl der Wiederholungen einer Sp1 Bindungsmotiv GGGCGG, die als TranskriptionsModulieren Ort wirkt, unterscheidet sich von der üblichen Anzahl von 5 (Kalayci et al., 2006). In einer Studie in den Vereinigten Staaten trägt etwa 6% der Asthma-Patienten kein Wildtyp-Allel am ALOX5 Kern-Promotor Locus (Drazen et al., 1999). Es wurde vermutet, dass Patienten mit verändertem Promotor möglicherweise weniger auf eine Leukotrien-Modifikator reagieren.In randomisierten, doppelt-verblindeten, Placebokontrollierten Studien mit ABT-761, ein ALOX5 Inhibitor, der ein Derivat von Antileukotriene Zileuton ist, wurde diese Hypothese untersucht. Der primäre Endpunkt der klinischen Studie war die Verbesserung des FEV1 (forced expiratory volume in 1 second = forcierten exspiratorischen Volumens in der 1. Sekunde). In der ungeschichteten Population produzierte der Inhibitor eine 12% bis 14% Verbesserung des FEV1. Patienten homozygot für den Wildtyp-Promoter hatten eine 15%-ige Verbesserung des FEV1.Im Gegensatz dazu hatten 155 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Pharmakogenetik und Pharmakogenomik die Patienten homozygot für das mutierte Version der Promotor eine signifikant verringerte FEV1 Reaktion.Es wurde vorgeschlagen, dass Patienten, die auf ALOX5 Hemmung nicht reagieren, sind diejenigen, bei denen eher andere Mechanismen für asthmatische Atemwegsobstruktion verantwortlich sind. LTC4-Synthase ist ein Membran-gebundenes Glutathion Transferase nur von Zellen hämatopoetischen Ursprungs exprimiert und ist ein Schlüsselenzym bei der Synthese von Cys-LTs, wandelt LTA4 zu LTC4 um.Das Gen, das LTC4-Synthase kodiert, befindet sich auf 5q35.Ein Adenin - Cytosin Transversion wurde 444 bp stromaufwärts (-444) der Translationsstartstelle des LTC4-Synthase-Gens gefunden.Das seltene C -444 Allel trat häufiger bei Patienten mit Aspirin intolerant Asthma (AIA) auf (Sanak et al., 1997 und 2000). Eine 5-fach größere Expression der LTC4-Synthase ist bei Individuen mit AIA nachgewiesen worden, wenn sie mit Patienten mit Aspirin-tolerant Asthma verglichen wurden. Weiterhin war die Expression von LTC4-SynthasemRNA höher in Blut Eosinophilen von Asthmatikern verglichen mit Kontrollpersonen und wurde insbesondere in Eosinophilen von Patienten mit AIA erhöht.Darüber hinaus wurde festgestellt, dass, bei Personen mit Asthma die mit Zafirlukast (ein Leukotrien-Rezeptor-Antagonist) behandelt wurden, diejenigen, die homozygot für das A-Allel am -444 Locus waren, wiesen einen niedrigeren FEV1 Reaktion als diejenigen mit der C/C oder C/A Genotyp auf (Palmer et al., 2002). Es muss angemerkt werden, dass diese Beispiele Forschungen sind, und die Ergebnisse sind noch nicht in der klinischen Praxis. 8. Die Zukunft der Pharmakogenomik Die Reaktion auf Medikamente wird durch Wechselwirkungen zwischen vielen genetischen und umweltbedingten Faktoren beeinflusst.Wie in den vorangegangenen Kapiteln diskutiert wurde, und wird im nächsten Kapitel gezeigt werden, können komplexe Netzwerke von Interaktionen aus diesen gezogen werden, deren Auswertungen systembiologische Methoden brauchen. Aber eine Menge von genauen genomischen (und epigenomischen), klinischen und Umwelt-Daten sind auch für die richtigen Netzwerke erforderlich,die große prospektive Studien, und eine Menge von grundlegenden Forschungen zum besseren Verständnis des Verhaltens von unserem Genom und des gesamten Organismus von der molekularen bis ganzen Körper Ebenen erfordern.Außerdem werden bessere Auswerteverfahren für Extrahieren so viele Informationen aus den vorhandenen Daten wie möglich auch benötigt. In den letzten Jahrzehnten ist eine immense Entwicklung in diesen Bereichen erzielt worden, aber wir sind erst am Anfang des Fortschritts, und es ist nicht einmal sicher, welche der pharmakogenetische Ziele erreichbar sind?Derzeit gibt es für die Mehrheit der Medikamente keine verlässlichen pharmakogenetischen Tests, und es gibt auch nur sehr wenige persönliche Therapien oder Medikamente. Die Frage ist, wenn es eine Realität sein wird, dass jeder Mensch genomische Daten haben wird, aus denen jeder Arzt mit Hilfe einer benutzerfreundlichen Decision-Support-System entscheiden kann, welche Therapie oder Medikamente am effektivsten ist von denen die Patienten keine unerwünschten Arzneimittelwirkungen Antwort haben werden. Zu Beginn der 90er Jahre prognostizierten sogar Experten, dass diese Ziele in ein paar Jahren wahr werden würden.Aber als wir die immense Komplexität des Genoms und des gesamten Organismus gelernt haben, stellte sich heraus, dass gegenwärtig es nicht einmal bekannt ist, ob es jemals Wirklichkeit wird?Im Jahr 2012 sind nur sehr wenige genomische Ergebnisse in die Praxis gegangen. Das ist sicher, dass man sich nicht der Illusion hingeben darf, dass es zukünftig für jeden Patienten das optimale Medikament geben wird. Hauptsächlich Mutationen in den Protein kodierenden Regionen mit starken Wirkungen können klinisch relevanten Informationen geben. Die Wirkungen der gemeinsamen SNPs sind gewöhnlich unvorhersehbar und klinisch unbrauchbar. Aber wir sind erst am Anfang dieses Prozesses und aufgrund der enormen Entwicklung der letzten Jahrzehnte, können wir sicher sein, dass die Anzahl der verwendbaren pharmakogenomischen Tests oder persönlichen Therapien in der Zukunft erweitert werden. 9. 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Welche Krankheiten und Genfamilie sind in der Liste der FDA-Zulassung pharmakogenomischen Biomarker in Arzneimitteletiketten überrepräsentiert? 7. Geben Sie Beispiele für Gene, die die Pharmakokinetik der Arzneimittel beeinflussen! 8. Wie kann man CYP Chips verwenden? 9. Was für Gene beeinflussen die Wirkung von Warfarin? 10. Was ist die Konsequenz für die Personen die Homozygote für die atypische Variante des BCHE Gens sind? 11. Was kann die Konsequenz für die Personen sein, die Träger von Mutationen im TPMT Gen sind? 12. Welche Rolle spielen die ABC-Transporter in Pharmakogenetik? 13. Was können die Ursache und Konsequenzen der langsamen Acetylierung sein? 14. Welche Gene können die Pharmakokinetik der Statine beeinflussen? 15. Welches Genprodukt kann die Pharmakodynamik der Statine beeinflussen? 16. Welche Faktoren wurden in einer Amish Population in einer GWAS identifiziert, die die Wirkung von Clopidrogel beeinflusst haben? 17. Welche Genvariation beeinflusst den Effekt von β-Agonisten? 18. Welche Gene können die Wirkung von Leukotrien-Antagonisten beeinflussen? 19. Welche Probleme müssen gelöst werden um die Hauptziele der Pharmakogenomik zu verwirklichen? 159 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 14. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen Csaba Szalai 1. Einführung In den vorherigen Kapiteln wurde es gezeigt, dass es mit der Entwicklung von genomischen Methoden, Computern und Bioinformatik neue Möglichkeiten zur besseren Verständnis und Modellierung von lebenden Organismen als komplexe Systeme gibt, die sich mehr der Realität ähneln. Mit der Verbreitung von Hochdurchsatzverfahren (GWAS, Microarray Messungen, neue Generation Sequenzierung usw.) können wir immensen Daten erhalten, und es ist bekannt, dass diese Datenpunkte nicht voneinander unabhängig sind, sondern sind sie in Verbindung und Wechselwirkung miteinander.Wenn beispielsweise ein SNP in der regulatorischen Region eines Gens lokalisiert ist, beeinflusst er nicht nur die Expression dieses Gens, sondern auch das Funktionieren der Proteine, die in Wechselwirkung mit dem Produkt des Gens sind. Darüber hinaus kann ein weiterer SNP die Wirkung dieses SNP in sowohl positiver als auch negativer Weise beeinflussen. In einem lebenden Organismus sind diese Wechselwirkungen auf mehreren Ebenen, und es ist jetzt klar, wenn wir die Wirkung einer Mutation oder eines Umweltfaktors interpretieren wollen, müssen wir diese Wechselwirkungen berücksichtigen. In der Biologie heißt Systembiologie der wissenschaftliche Bereich, der sich auf komplexe Netzwerke von Interaktionen in biologischen Systemen konzentriert und will sie kartieren und interpretieren. Systembiologie ist die Untersuchung der Interaktionen zwischen den Komponenten von biologischen Systemen, und wie diese Interaktionen zur Funktion und Verhalten des Systems führen. Das Ziel ist, ein integriertes Bild aller regulatorischen Prozesse über alle Ebenen, vom Genom über das Proteom, zu den Organellen bis hin zum Verhalten und zur Biomechanik des Gesamtorganismus zu bekommen. In den letzten Jahren, aufgrund des oben genannten Progresses, hat sich Systembiologie erheblich entwickelt. Im Folgenden wird es auf Krankheiten konzentriert, die Grundbegriffe der Systembiologie eingeführt, und einige Beispiele für die Anwendung und Nutzung dieses wissenschaftlichen Bereichs in Medizin und Pharmakologie vorgestellt. 2. Darstellung der Interaktionen In der Systembiologie werden Interaktionen in Form von Netzwerk, der oft als Graph genannt wird, dargestellt. Diese können auch als Interaktom Netzwerke (interactome networks; Barabási AL et al., 2011) bezeichnet. Ein Graph ist in der Graphentheorie eine abstrakte Struktur, die eine Menge von Objekten zusammen mit den zwischen diesen Objekten bestehenden Verbindungen repräsentiert. Die mathematischen Abstraktionen der Objekte werden dabei Knoten (auch Ecken, engl. nodes) des Graphen genannt. Die paarweisen Verbindungen zwischen Knoten heißen Kanten (manchmal auch Bögen, engl. edges). Die Kanten können gerichtet oder ungerichtet sein. Häufig werden Graphen anschaulich gezeichnet, indem die Knoten durch Punkte und die Kanten durch Linien dargestellt werden. In diesem vereinfachten Ansatz wird die funktionelle Reichhaltigkeit jeder Knoten verloren. Trotz oder sogar wegen solcher Vereinfachungen können nützliche Entdeckungen gemacht werden. In zellularen Systemen sind die Knoten Metaboliten und Makromoleküle wie Proteine, RNA-Moleküle und Gensequenzen, während die Kanten physikalischen, biochemischen und funktionellen Interaktionen, die mit einer Vielzahl von Technologien identifiziert werden können. Eine Herausforderung von Netzwerk Biologie ist so unvoreingenommen wie möglich, solche Interaktionen mit systematischen und standardisierten Ansätze und Assays zu kartieren. Die resultierenden Netze von Interaktionen zwischen zellulären Komponenten können als Gerüst Informationen dazu dienen, um globale oder lokale Graphentheorie Eigenschaften zu extrahieren. Wenn dieses Netzwerk statistisch von randomisierten Netzwerke unterschiedlich ist, können solche Eigenschaften dann zurück zu einem besseren Verständnis der biologischen Prozesse führen. Einige Eigenschaften dieser Netzwerke wurden zunächst in Science (1999) und Nature (2000) von Albert László Barabási, ein Physiker ungarischer Herkunft beschrieben und veröffentlicht.Die vorherigen 160 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen Netzmodelle nahmen an, dass komplexe Netzwerke zufällig verdrahtet sind, so dass jegliche zwei Knoten über eine Verbindung mit der gleichen Wahrscheinlichkeit p verbunden ist.Dieses Erdős–Rényi Modell erzeugt ein Netzwerk mit einer Poisson Grad-Verteilung, das heißt die Kanten zwischen den Knoten sind zufällig. Stattdessen sind komplexe Netzwerke durch spezielle Verteilungen im Auftreten ihrer Elemente gekennzeichnet (Grad-Verteilung), durch einen hohen Clusterkoeffizienten, eine bestimmte Gemeinschaftsstruktur (community structure) oder eine ausgeprägte hierarchische Struktur. Zwei typische Klassen von komplexen Netzwerken wurden in der Vergangenheit intensiv studiert: Skalenfreie Netzwerke und die so genannten small world Netzwerke, deren Entdeckung und Definition kanonische Fallstudien auf diesem Gebiet sind. In skalenfreien Netzwerken haben die Knoten keine typische Anzahl von Verbindungen, sondern die Verteilung der Verbindungen pro Knoten folgt einem Potenzgesetz. Soziale Netzwerke, das World Wide Web und die biologischen Netzwerke sind skalenfreie Netzwerke. In einem skalenfreien Netzwerk haben meiste Knoten nur wenige Interaktionen, und diese mit ein paar hoch verbundenen Knoten, die Hubs (Naben) koexistieren, die das gesamte Netzwerk zusammenhalten (Vidal M et al., 2011). 3. Human Interaktom Infolge der konservierten biochemischen und molekularen Funktionen von den Spezies wird viel von unserem heutigen Verständnis von zellulären Netzwerken von Modell-Organismen abgeleitet. Aber in den letzten zehn Jahren wurden wir Zeugen eines außergewöhnlichen Wachstums in der Mensch-spezifische molekularen Wechselwirkung Daten, die uns helfen, um die wichtige Rolle der ineinandergreifenden (interlocking) Netzwerke bei der menschlichen Krankheit zu verstehen (Barabási AL et al., 2011). Die meiste Aufmerksamkeit konzentrierte sich auf molekularer Netzwerke darunter: Protein Interaktion Netzwerke, deren Knoten sind Proteine, die miteinander über physikalische (binding)-Interaktionen verbunden sind; metabolische Netzwerke, deren Knoten sind Metaboliten, die verbunden sind, wenn sie an der gleichen biochemischen Reaktionen teilnehmen; regulatorische Netzwerke, deren gerichteten Verbindungen darstellen regulatorischen Beziehungen zwischen einem Transkriptionsfaktor und einem Gen, oder posttranslationale Modifikationen, wie zwischen einer Kinase und ihre Substrate;und RNA-Netzwerke, mit RNA-DNAInteraktionen, wie kleine nicht-kodierende microRNAs und siRNAs in der Regulation der Genexpression. Parallel gibt es eine wachsende Zahl von Studien über phänotypische Netzwerke, z.B. koexpression Netzwerken, in denen Gene mit ähnlichen Koexpression Mustern verknüpft sind, und genetische Netzwerke, in denen zwei Genen verknüpft sind, wenn der Phänotyp einer Doppelmutante sich von dem erwarteten Phänotyp von zwei einzelnen Mutanten unterscheidet. 4. Krankheitsgene in den Netzwerken Oberhalb wurde der Begriff von Hub erwähnt. Hubs sind Knoten mit überproportional viele Verbindungen, das darauf hindeutet, dass in biologischen Netzwerken Hub Proteine eine besondere biologische Rolle spielen müssen. Tatsächlich gibt es Beweise von Modell-Organismen, dass die Hub Proteine oft von essentiellen Genen kodiert werden, und dass Hub Gene älter sind und sich langsamer als Gene der Nicht-Hub Proteine entwickeln. Die Deletionen von Hub Genen führen zu einer größeren Anzahl von phänotypischen Ergebnissen als die Deletionen von Genen, die Proteinen mit weniger Verbindungen kodieren. Während die Kraft der Beweise für einige dieser Effekte noch diskutiert wird, erwartet man, dass das Fehlen eines Hubs die Funktion einer außergewöhnlichen Anzahl von anderen Proteinen beeinträchtigen würde. Diese Annahme hat zu der Hypothese geführt, dass bei Menschen, Hubs typischerweise mit Krankheitsgene assoziiert sein sollen. Tatsächlich fand eine Studie, dass die Krankheit Proteine in der OMIM Morbid Karte mehr Protein-Protein-Interaktionen als Nicht-Krankheit Proteine in einer Literatur-kuratierte Protein-Protein Interaktion Datenbanken haben. Einige humane Gene sind in der frühen Entwicklung von wesentlicher Bedeutung, so funktionelle Veränderungen in ihnen oft zum ersten Trimenon Fehlgeburten (embryonale Letalität) führen.Mutationen in diesen "essentiellen" Genen können sich nicht in der Bevölkerung verbreiten, da Individuellen, die sie tragen, nicht reproduzieren können.Im Gegensatz dazu können Menschen für eine lange Zeit die krankmachenden Mutationen, oft über ihre gebärfähigen Alten tolerieren. Die Frage ist, sind beide (Krankheit und essentielle) Gene mit Hubs assoziiert? Goh et al. fanden, dass essentielle Gene eine starke Tendenz zeigen, sich mit dem Hub zu assoziieren und in vielen Geweben zu exprimieren. D.h., neigen sie dazu, an der Mitte der funktionellen Interaktom (Abb. 1) zu lokalisieren. Aber im Gegensatz zu unserer ursprünglichen Hypothese zeigen nicht essentielle Krankheitsgene keine Tendenz Hubs zu kodieren und neigen zur gewebespezifischen zu sein. Das heißt, von einem Netzwerk-Perspektive, 161 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen sind diese Gene an der Peripherie der funktionellen Interaktom (Abb. 2).Zusammenfassend, in humanen Zellen ist es die essentiellen Gene und nicht die Krankheit Gene, die Hubs kodieren (Barabási AL et al., 2011). Abbildung 14.1. Krankheits- und essentielle Gene in dem Interaktom Von den rund 25.000 Genen sind nur etwa 1.700 mit bestimmten Krankheiten in assoziiert. Ungefähr sind 1.600 Gene bekannt, die in utero essentiell sind, d.h. ihr Fehlen zu embryonaler Letalität führen (Barabási AL et al., 2011). Abbildung 14.2. Schematische Darstellung der Unterschiede zwischen essentiellen und nicht-essentiellen Krankheitsgenen. Nicht-essentielle Krankheitsgene (dargestellt als blaue Knoten) segregieren an der Netzwerkperipherie, während in utero essentielle Gene (dargestellt als rote Knoten) auf dem Funktionszentrum (codieren Hubs, exprimiert in vielen Geweben) des Interaktom (Barabási AL et al., 2011). 162 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen Es muss jedoch hinzugefügt werden, dass die oben genannten Erkenntnisse sich vor allem auf monogenen Erkrankungen und hochpenetrant Mutationen (Kapitel 12) beziehen. Angesichts lowpenetrant Mutationen, häufiger SNPs und komplexer Krankheiten, gibt es mehrere Beispiele von Hub Proteine in Krankheit Netzwerke, die mit vielen Krankheiten assoziiert sind.Z.B. häufige SNPs im TNF Gen mit Asthma, Arteriosklerose, Obesität, T1DM, T2DM und Alzheimer Krankheit assoziiert sind. Ebenso ist β 2 adrenergen Rezeptor (ADRB2) auch ein Hub Protein. Seine häufigen lowpenetranten Variationen sind mit Asthma, Reaktionen auf Medikamente, Obesität und Bluthochdruck assoziiert. PPARG kodiert für ein typisches Hub Protein, da Mutationen in ihm zu Hypertonie, Adipositas, T2DM und Atherosklerose führen können. Wenn ein Gen oder ein Molekül in einer bestimmten biochemischen Prozess oder Krankheit beteiligt ist, könnten seine direkten Interaktionpartner auch eine Rolle in dem gleichen biochemischen Prozess spielen.Im Einklang mit dieser Hypothese zeigen Proteine, die in der gleichen Krankheit beteiligt sind, eine hohe Neigung um miteinander zu interagieren.Beispielsweise Goh et al. beobachtete 290 physikalische Interaktionen zwischen den Produkten von Genen die mit der gleichen Erkrankung assoziiert sind.Es ist eine 10-fache Steigerung gegenüber zufälliger Erwartung.Weiterhin wurde es festgestellt, dass Gene, die mit Erkrankungen mit ähnlichen Phänotypen verlinken, haben eine signifikant erhöhte Neigung zur direkten Interaktion miteinander.Diese Beobachtungen zeigen, dass, wenn wir ein paar Krankheitskomponenten identifizieren, die anderen Krankheitskomponenten werden wahrscheinlich in ihrem Netzwerk-basierte Nähe sein.Das heißt, erwarten wir, dass jede Erkrankung zu einer gut definierten Nachbarschaft des Interaktoms verbunden werden kann, das oft als ein Krankheitsmodul bezeichnet (Abb. 3) wird.So repräsentiert ein Krankheitsmodul eine Gruppe von Netzkomponenten, die zu einer zellulären Funktion beitragen, deren Störung zu einer besonderen Krankheit Phänotyp führt. Diese Krankheitsmodule können durch mehrere biochemische und genomische Methoden, auch in silico auf Basis der gegenwärtig verfügbaren Daten durch bioinformatische Ansätze identifiziert werden. Z.B.: Chen et al, gestützt auf einem koexpression Netzwerk, die aus Leber und Fettgewebe konstruiert wurden, konnte das Obesität assoziierte Makrophagen-angereicherte metabolische Subnetzwerk (macrophage-enriched metabolic subnetwork) identifizieren. Abbildung 14.3. Eine Krankheitsmodul repräsentiert eine Gruppe der Knoten (rote), deren Perturbation (durch Mutationen, Deletionen, Kopienzahl Variationen oder 163 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen Veränderungen der Expression) mit einem bestimmten Krankheitsphänotyp verknüpft wird (Barabási AL et al., 2011). 5. Knoten und Kanten in Erkrankungen Von der Interaktom Netzwerk-Theorie lässt sich ableiten, dass das ganze humane interagierende Netzwerk als ein komplexes, großes Netzwerk gezeichnet werden kann.Von systembiologischem Netzwerk-basiertem Ansatz können Krankheiten wie Ergebnisse der Störung dieses Netzwerks (Abb. 4) erklärt werden. Diese Störung kann auch als Perturbation genannt werden. Netzwerke können auf zwei Arten gestört werden: Entfernen von Knoten (z.B. Protein Deletion durch null Mutation in einem Gen) oder Modifizieren von Kanten (z.B. aufgrund einer Mutation in der Liganden-Bindungsdomäne eines Rezeptors). Die Auswirkungen auf die Netzwerk-Struktur und Funktion werden voraussichtlich radikal ungleichen für Knotenentfernung gegenüber Kantenmodifizierung. Knotenentfernungdeaktiviert nicht nur die Funktion eines Knotens, sondern auch deaktiviert alle Interaktionen dieses Knotens mit anderen Knoten, undin diese Weise zerbricht die Funktion aller von den benachbarten Knoten.Eine Kantenmodifizierungentfernt eine oder einige Interaktionen, aber lässt den Rest intakt und funktionsfähig. Es hat feineren Wirkungen auf das Netzwerk, aber nicht notwendigerweise auf den resultierenden Phänotyp. Abbildung 14.4. Störungen (Perturbation) in biologischen Systemen können zu Krankheiten führen. Es gibt Beispiele für Knotenentfernung und Kantenmodifizierung (Vidal M et al., 2011). 164 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen Die Unterscheidung zwischen den Knotenentfernung und Kantenmodifizierung Perturbation Modelle können neue Hinweise auf Mechanismen menschlicher Erkrankungen bieten, wie z.B. die verschiedenen Klassen von Mutationen, die zu dominant gegenüber rezessiven Erbgänge führen. Ungefähr die Hälfte von den 50.000 Mendelian Allelen in dem humanen Gen-Mutation Datenbank kann als potentiell Kantenmodifizierung modelliert werden, wenn man Deletionen und trunkierende Mutationen als Knotenentfernung und Leseraster Punktmutationen, die zu Aminosäure-Veränderungen führen, und kleine Insertionen und Deletionen als Kantenmodifizierung hält. Für Gene, die mit komplexen Erkrankungen assoziiert sind und für die, die vorhergesagten Protein Interaktion Domänen vorhanden sind, wurde gezeigt, dass putative Kantenmodifizieren Allele, wenn sie sich in unterschiedlichen Interaktionsdomänen befinden, sind für verschiedene Erkrankungen verantwortlich. Das heißt, verschiedene Kantenmodifizierende Störungen können zu auffallend unterschiedlichen Phänotypen führen (Vidal M et al., 2011). 6. Human Diseasome Die hochgradig vernetzte Natur des Interaktom bedeutet, dass auf der molekularen Ebene, Erkrankungen nicht unabhängig voneinander sind.Die verschiedenen Krankheitsmoduln können überlappen, so dass Störungen durch eine Krankheit, andere Krankheitsmoduln beeinflussen können. Krankheitskarten, dessen Knoten Krankheiten sind, und deren Links verschiedene molekulare Zusammenhänge zwischen den krankheitsassoziierten zellulären Komponenten repräsentieren, wurde „Diseasome― benannt.Aufdecken solcher Verbindungen zwischen Krankheiten hilft uns nicht nur zu verstehen, wie verschiedene Phänotypen sich, die oft zu verschiedenen medizinischen Teildisziplinen gehören, auf molekularer Ebene assoziieren, sondern kann uns auch helfen zu verstehen, warum bestimmte Gruppen von Krankheiten zusammen auftreten. Der Co-Morbidität der Krankheiten aus dem Diseasome bietet Einblick, der neue Ansätze zur Prävention, Diagnose und Behandlung bringen kann. Diseasome-basierte Ansätze könnten auch in Wirkstoffforschung helfen, insbesondere wenn es um die Verwendung von zugelassenen Medikamenten für molekular verbundenen Krankheiten (Barabási AL et al., 2011) kommt. 7. Gemeinsame Gen-Hypothese Wenn das gleiche Gen mit zwei verschiedenen Krankheitsphänotypen verbunden ist, ist diese Kopplung oft ein Hinweis, dass die beiden einen gemeinsamen genetischen Krankheitsursprung haben. Goh et al. verwendete aus der OMIM-Datenbank gesammelten Gen-Krankheit Assoziationen, um ein Krankheitsnetzwerk zu bauen, die verbunden sind, wenn sie ein oder mehrere gemeinsame Gene haben (Abb. 5). Es konnte gezeigt werden, dass ein Patient doppelt so häufig eine komorbide Krankheit entwickelt, wenn diese Krankheit ein gemeinsames Gen mit der Grunderkrankung hat, als wenn diese Krankheit kein gemeinsames Gen mit der 165 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen primären Krankheit hat. Menschen z.B. mit Obesität entwickeln oft T2DM und Bluthochdruck. Menschen mit T2DM und / oder Bluthochdruck entwickeln oft Arteriosklerose, und Atherosklerose Menschen entwickeln häufig Alzheimer-Krankheit. Alle Erkrankungen haben Komorbiditäten und gemeinsame Gene. Doch viele Krankheitspaare mit gemeinsamen Genen zeigen keine signifikanten Komorbidität.Dieser Mangel an Komorbidität kann auftreten, zum Teil, weil verschiedene Mutationen auf demselben Gen unterschiedliche Auswirkungen auf die Funktion oder Expression des Genproduktes haben können.Solche kantenmodifizierenden Allele betreffen eine spezifische Untergruppe von Verbindungen in der Interaktom und Individuellen, die verschiedene Mutationen im gleichen Gen beherbergen, können sich verschiedene Erkrankungen entwickeln.Im Einklang mit dieser Ansicht, zeigen Krankheitspaaren mit Mutationen in der gleichen funktionellen Domäne eines Proteins höheren Komorbidität als Krankheitspaare, deren Mutationen in verschiedenen funktionellen Domänen sind (Abb. 6) (Barabási AL et al., 2011). Abbildung 14.5. Human Krankheitsnetzwerk (KNW) Im KNW entspricht jeder Knoten einer deutlichen Störung, gefärbt auf der Grundlage der Störung Klasse, zu der sie gehört.Eine Verbindung zwischen Erkrankungen in derselben Klasse wird mit dem entsprechenden Dimmer Farbe gefärbt. Verbindungen unterschiedlicher Erkrankungklassen werden grau gefärbt.Die Größe der einzelnen Knoten ist proportional zu der Anzahl von Genen, die an der entsprechenden Erkrankung assoziiert ist. Die Namen von Erkrankungen mit >10 assoziierten Genen sind angegeben (Goh et al 2007.). Abbildung 14.6. Komorbidität zwischen Erkrankungen im gemeinsamen KNW gemessen durch den Logarithmus des relativen Risikos. Wenn die krankmachenden Mutationen das gleiche Gen (2. Säule) beeinflussen, dann ist die Komorbidität 2-mal höher. Wenn sie die gleichen Domäne des gemeinsamen Krankheitsproteins beeinflussen, dann wird der Komorbidität noch höher (Barabási AL et al., 2011). 166 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen 8. Gemeinsame metabolische Stoffwechselweg Hypothese Enzymatischer Defekt, der auf den Fluss von einer Reaktion wirkt, kann potenziell die Flüsse von allen nachgeschalteten Reaktionen in dem gleichen Stoffwechselweg beeinflussen. Es kann zu Krankheitsphänotypen, die normalerweise mit diesen nachgeschalteten Reaktionen assoziiert sind, führen. So werden es in Stoffwechselerkrankungen mit Verbindungen durch gemeinsame Stoffwechselwege erwartet, dass diese relevanter als die Verbindungen mit gemeinsamen Genen sein. In Unterstützung dieser Hypothese, Lee et al. konstruierten eine Stoffwechselerkrankung Netzwerk, in dem zwei Störungen verbunden sind, wenn die Enzyme die mit ihnen assoziiert sind, katalysieren benachbarten Reaktionen.Komorbidität Analyse bestätigt die funktionelle Relevanz der metabolischen Kopplung: Krankheitspaaren in diesem Netzwerk haben eine 1,8-fach erhöhte Komorbidität gegenüber Krankheiten, die metabolisch nicht paarweise miteinander verbunden sind (Barabási AL et al., 2011). 9. Gemeinsame microRNA Hypothese Aufgefordert durch die zunehmende Beweise für die Rolle von miRNAs in den menschlichen Krankheiten, Lu et al. haben Krankheitspaaren, deren zugehörige Gene durch mindestens eine gemeinsame miRNA-Molekül abgezielt werden, verbunden.Das erhaltene Netzwerk zeigt eine Krankheitsklass-basierte Segregation. Krebsarten zum Beispiel haben ähnliche Assoziationen am miRNA-Ebene, was zu einem deutlichen KrebsCluster führt, der zum Beispiel sich vom Cluster von kardiovaskulären Erkrankungen in dem miRNA-basierten Krankheitsnetzwerk unterscheidet (Barabási AL et al., 2011). 10. Phänotypische Krankheitsnetzwerke Man kann auch Krankheitspaaren auf der Grundlage der direkt beobachteten Komorbidität zwischen ihnen verbinden, die ein phänotypisches Krankheitsnetzwerk (PKN) resultieren. Beispielsweise haben Rzhetsky et al. die Komorbidität-Verbindungen zwischen 161 Erkrankungen aus der Krankheitsgeschichte in Columbia University Medical Center von 1,5 Millionen Patienten abgeleitet. Hidalgo et al. errichteten ein Netz mit 657 Erkrankungen aus der Krankheitsgeschichte von über 30 Millionen Medicare-Patienten. In diesen Netzwerken sind zwei Krankheiten verbunden, wenn ihre Komorbidität eine vordefinierte Schwelle überschreitet. PKN erfasst Krankheitsprogression, da die Patienten Krankheiten zu entwickeln neigen, die in der Netznähe von Krankheiten sind, die sie bereits haben.Darüber hinaus zeigen Patienten mit Erkrankungen mit mehr Verbindungen in der PKN eine höhere Mortalität als solche mit wenigeren verbundenen Krankheiten. 167 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen 11. Anwendungen der systembiologischen Ansätze In Kapitel 9 wurde es diskutiert, dass bei komplexen Krankheiten meisten Varianten, die bis jetzt identifiziert wurden, relativ kleine Risikoerhöhung erfahren wurde, und erläuterte nur ein kleiner Anteil der familiären Häufung.Gao et al. versuchten, dieses Problem in einer systembiologischen Studie zu lindern, in der positionelle Kandidatengene für komplexe Krankheiten mit der Hilfe von Protein-Protein-Interaktion (PPI) Informationen priorisiert wurden.266 bekannten Krankheitsgene und 983 positionelle Kandidatengene aus den 18 etablierten Kopplung Loci von T1DM wurden aus dem T1Dbase (http://t1dbase.org) zusammengestellt. Es wurde festgestellt, dass das PPI-Netzwerk von bekannten T1DM Genen deutliche topologische Eigenschaften mit deutlich höherer Zahl von Interaktionen untereinander hat.Dann wurden die Positionskandidaten wie neue Kandidatenkrankheitsgene definiert, die ersten Grades PPI Nachbarn der 266 bekannten Krankheitsgene waren. Dies führte zu einer Liste von 68 Genen. Dann wurde untersucht, ob die Eigenschaften von diesen denen der Krankheitsgene entsprechen. Krankheitsgene haben mehr Interaktionen und sind häufiger in wissenschaftlichen Arbeiten zitiert.Für die vorhergesagten Gene, kann man argumentieren, dass ihr Auftreten in T1DM Publikationen ein Ergebnis ihrer Interaktionen mit den bekannten Krankheitsgenen sein könnte, da interagierende Gene oft in den gleichen Publikationen erscheinen.Um dieses Problem anzugehen, wurden alle PubMed Datensätze aus der Analyse der vorhergesagten Gene, die die bekannten T1DM Genen zitierten, ausgeschlossen.Von den 68 neuen Kandidaten wurden 13 (~ 20%) deutlich häufiger als zufällig in T1DM Veröffentlichungen zitiert,verglichen mit nur ~ 6,9% der Human Protein Reference Database Gene. Dies war ein ~ 3-fache Anreicherung.Als Gruppe wurden Mitglieder der 68-Liste signifikant (p <10-7) eher in T1DM-Publikationen als Mitglieder einer zufälligen Auswahl von 68 Genen erschienen. Es zeigt, dass es eine hohe Wahrscheinlichkeit gibt, dass diese Gene eine Rolle in T1DM spielen.Von den 68 neuen Kandidaten interagiert mehr als ein Drittel (24) mit mindestens zwei bekannten Krankheitsgenen und ungefähr einen sechsten (12) mit mindestens drei.Es zeigt die Verbindung zwischen Krankheitsmoduln und ist ein weiterer Beweis, dass sie wirklich Krankheitsgene sind. Neue Ergebnisse wurden in einer Studie gewonnen, wo Interaktion Netzwerk von GWAS Ergebnisse von 5 komplexen Erkrankungen abgeleitet wurde (Menon R et al., 2011).Fünf neurodegenerative und / oder Autoimmun, komplexe menschliche Krankheiten (Parkinson-Krankheit (Park), Alzheimer- Krankheit (Alz), Multiple Sklerose (MS), rheumatoider Arthritis (RA) und Diabetes-Typ 1 (T1DM)) wurden einbezogen. Stoffwechselweg Anreicherung Analysen (Pathway enrichment analyses) wurden auf jedes Krankheitsinteraktom unabhängig durchgeführt.Mehrere Stoffwechselwege der Immunfunktion und Wachstumsfaktor Signalwege erschienen in allen Autoimmunerkrankungen, und überraschenderweise bei der Alzheimer-Krankheit.Darüber hinaus ergaben die gepaarten Analysen des Krankheitsinteraktoms bedeutende molekulare und funktionelle Verwandtschaft zwischen Autoimmunerkrankungen und, unerwartet, zwischen T1DM und Alz.T1DM-Alz Paar hatte den höchsten Rang, gefolgt von den Autoimmunerkrankung Paaren MSRA und T1DM-RA, und dann von MS-Alz-und RA-Alz. Alle Park-Scores waren sehr gering. Diese Ergebnisse sind in Abbildung 14.7 dargestellt. Diese Abbildung zeigt ein Netzwerk, eine Zusammenfassung der Beziehungen zwischen den fünf Krankheiten.Dieser systembiologische Ansatz offenbart einige neue und interessante Ergebnisse, von denen einige unten dargestellt sind. Zahlreiche immunbezogene Wege wurden in den Autoimmun Interaktom bereichert. Dieses Ergebnis war zu erwarten, da viele der Suszeptibilitätsgene in RA T1D und MS immunbezogen waren. Insbesondere erschienen die B-Zellaktivierung und T-Zellaktivierung Wege in allen Autoimmunerkrankungen.Es ist bekannt, dass beide Arme der adaptiven Immunität wesentlich zur Autoimmunität beitragen. Überraschenderweise zeigten sich die gleichen Wege in der Alzheimer-Krankheit.Die Rolle der adaptiven Immunität in Alz war bisher unterexploriert, jedoch einige Studien deuten darauf hin, dass veränderte T-Zell-Phänotypen und Antworten in solchen Patienten wären.Interessanterweise verringert regelmäßige Einnahme von entzündungshemmenden Medikamenten die Chancen für die Entwicklung von Alz. Dieses Ergebnis unterstützt die Hypothese, dass, obwohl die primären Insulte in Alz nicht Entzündungen aber Neurodegenerationen sind, aber immunologische Signalwege spielen eine Rolle bei der Ätiopathogenese der Alzheimer-Krankheit. Abbildung 14.7. Krankheitsbezogenheiten basieren auf gemeinsame Wege in der Panther, KEGG und CGAP-BioCarta Datenbanken. Grüne Knoten zeigen die neurodegenerativen Erkrankungen, während rosa Knoten die Autoimmunerkrankungen markieren. Die Farben der Kanten die Knoten verbinden spiegeln den gemeinsamen Signalwegrang im Bereich von 3 (höchste Bezogenheit) bis 30 (niedrigste Bezogenheit). Parkinson-Krankheit (Park), Alzheimer- Krankheit (Alz), 168 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen Multiple Sklerose (MS), rheumatoider Arthritis (RA) und Diabetes-Typ 1 (T1D) (Menon R et al., 2011). Single-Target Medikamente können vielleicht einige dysfunktionalen Aspekte der Krankheitsmodul korrigieren, aber können die Aktivität von anderen Netzwerkumgebungen verändern, was zu Nebenwirkungen führen können.Diese Netzwerk-basierte Perspektive von Medikamenten bedeutet, dass die meisten Krankheitsphänotypen schwierig durch die Verwendung eines einzigen ‚Wundermittel’ umzukehren sind, d.h. durch einen Eingriff, der einen einzelnen Knoten in dem Netzwerk beeinflusst.Während Netzwerk-basierte Ansätze ein relativ neuer Trend in der Wirkstoffforschung sind, angesichts der komplizierten Netzwerk-Effekte, die die Medikamentenentwicklung stellen müssen, der im Entstehen begriffene Bereich der NetzwerkPharmakologie, an der Kreuzung von Netzwerk-Medizin und Polypharmakologie, ist bereit, ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklungsstrategien von Medikamenten zu sein.Die Wirksamkeit dieses Ansatzes wurde von Kombinationstherapien von AIDS, Krebs oder Depressionen nachgewiesen.Dies wirft eine wichtige Frage auf: Kann man systematisch multiple Drug Targets mit optimalen Auswirkungen auf die Krankheitsphänotyp identifizieren? Dies ist ein archetypisches Netzwerk-Problem, das zu Methoden zur Identifizierung von optimalen Arzneimittelkombinationen ausgehend entweder aus dem metabolischen Netzwerk oder aus dem zweigeteilten Netzwerk, das Komponenten ihren Wirkstoff-Reaktion Phänotypen verbinden, führen. Forschungen in diese Richtung haben zu potentiell sicherer Multi-Target-Kombinationen für entzündliche Zustände oder zur Identifizierung von optimalen 14 Krebsmittel-Kombinationen geführt. Ebenso wichtig ist, Drug Target Netzwerke mit Verknüpfungen zwischen zugelassenen oder experimentellen Medikamenten und ihre Protein-Targets haben dazu beigetragen, erhebliches Wissen Basis von dem Zusammenspiel zwischen Krankheiten und Medikamente zu organisieren. Seine Analyse zeigte das Übergewicht der palliativen Medikamenten,d.h. Arzneimittel, die nicht auf die eigentliche Quelle der Erkrankung (d.h. die krankheitsassoziierte Proteine), sondern auf Proteine in der Netzwerkumgebung der Krankheitsproteine zielen. 169 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen Der erste Schritt des Rational Drug Design ist ein Verständnis der zellulären Funktionsstörungen, die durch eine Krankheit verursacht werden.Definitionsgemäß ist diese Dysfunktion auf das Krankheitsmodul begrenzt, was bedeutet, dass man die Suche nach therapeutischen Mitteln verringern kann, die nachweisbaren Veränderungen im jeweiligen Krankheitsmodul induzieren.Dies verursacht eine signifikante Verringerung des Suchraums,und hilft Biomarker für Erkennung von Krankheiten zu entwickeln, da Veränderungen in der Aktivität der Krankheitsmodulkomponenten in der Regel die stärkste Korrelation mit dem Krankheitsverlauf zeigen (Barabási AL et al., 2011). 12. Literatur 1. Barabási AL, Gulbahce N, Loscalzo J. Network medicine: a network-based approach to human disease. Nat Rev Genet. 2011 Jan;12(1):56-68. 2. Vidal M, Cusick ME, Barabási AL. Interactome networks and human disease. Cell.2011 Mar 18;144(6):98698. 3. Barabasi AL, Albert R. Emergence of scaling in random networks. Science. 1999 Oct 15;286(5439):509-12. PubMed PMID: 10521342. 4. Jeong H, Tombor B, Albert R, Oltvai ZN, Barabási AL. The large-scale organization of metabolic networks. Nature. 2000 Oct 5;407(6804):651-4. 5. Albert R, Jeong H, Barabasi AL. Error and attack tolerance of complex networks. Nature. 2000 Jul 27;406(6794):378-82. 6. Goh KI, Cusick ME, Valle D, Childs B, Vidal M, Barabási AL. The human disease network. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 May 22;104(21):8685-90. 7. Duarte NC, et al. Global reconstruction of the human metabolic network based on genomic and bibliomic data. PNAS. 2007; 104:1777–1782.; 8. Ma H, et al. The Edinburgh human metabolic network reconstruction and its functional analysis. Molecular Systems Biology. 2007; 3:135. 9. Chen Y, et al. Variations in DNA elucidate molecular networks that cause disease. Nature. 2008 Mar 27;452(7186):429-35. 10. Goh KI, Cusick ME, Valle D, Childs B, Vidal M, Barabási AL. The human disease network. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 May 22;104(21):8685-90. 11. Lee D-S, et al. The implications of human metabolic network topology for disease comorbidity. PNAS. 2008; 105:9880–9885. 12. Lu M, et al. An Analysis of Human MicroRNA and Disease Associations. Plos ONE. 2008; 3:e3420. 13. Hidalgo C, et al. A Dynamic Network Approach for the Study of Human Phenotypes. Plos Computational Biology. 2009; 5 e1000353. 14. van Driel MA, et al. A text-mining analysis of the human phenome. European Journal of Human Genetics. 2006; 14:535–542. 15. Edwards YJ, et al.Identifying consensus disease pathways in Parkinson's disease using an integrative systems biology approach. PLoS One. 2011 Feb 22;6(2):e16917. 16. Gao S, Wang X. Predicting Type 1 Diabetes Candidate Genes using Human Protein-Protein Interaction Networks. J Comput Sci Syst Biol. 2009 Apr 1;2:133. 17. Menon R, Farina C. Shared molecular and functional frameworks among five complex human disorders: a comparative study on interactomes linked to susceptibility genes. PLoS One. 2011 Apr 21;6(4):e18660. 170 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Systembiologischer Ansatz zu den Erkrankungen 18. Binder CJ, et al. (2004) IL-5 links adaptive and natural immunity specific for epitopes of oxidized LDL and protects from atherosclerosis. J Clin Invest 114: 427–437. 19. Taleb S, Tedgui A, Mallat Z (2010) Adaptive T cell immune responses and atherogenesis. Curr Opin Pharmacol 10: 197–202.) 13. Fragen 1. Definieren Sie die Systembiologie! 2. Wie werden die Interaktionen in der Systembiologie dargestellt? 3. Wer und wie hat die biologischen Netzwerke zuerst beschrieben? 4. Was für biologische Netzwerke kennen Sie? 5. Was ist die Verbindung zwischen Hubs, essentiellen Genen und Krankheitsgenen in biologischen Netzwerken? 6. Was ist der Krankheitsmodul in den biologischen Netzwerken? 7. Wie können Erkrankungen in Netzwerk-Theorie erklärt werden? 8. Was ist Diseasome und wozu kann man es verwenden? 9. Was sagt die gemeinsame Gen-Hypothese? 10. Was wissen Sie über phänotypische Krankheitsnetzwerke? 11. Wie hat man mit Hilfe von Systembiologie neue Gene in T1DM identifiziert? 12. Mit welcher Krankheit hatte die Alzheimer-Krankheit die engste Verbindung in der präsentierten systembiologischen Untersuchung? 13. Was bedeutet Netzwerk-Pharmakologie? 14. Was sind die pallitativen Medikamente? 15. Was ist der erste Schritt des Rational Drug Design? 171 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Kapitel 15. Bioethische und forschungsethische Fragen der genetischen Forschung András Falus Ferenc Oberfrank Genetische Forschungen haben sich in den vergangenen Jahrzehnten grundsätzlich verändert. Infolge dieser Veränderungen modifizieren sich im Grunde auch jede verwandte Anwendungsbereiche. Genetische Forschung bedeutet nicht nur eine wissenschaftlich-technologische Aktivität, die gewisse kognitive, erkennende Sektoren betrifft, sondern auch eine kulturelle, die Gesellschaft gestaltende Tätigkeit. Die Produktivität, Erfolg, Risiken und Perspektiven der genetischen Forschung hängen von den Normen, Kultiviertheit, Kommunikationsfähigkeit und Werte der Gesellschaft ab. Pragmatisch gesehen ist es deswegen notwendig, uns systematisch der Gestaltung und Aufbewahrung von einer gesellschaftlichen und politischen Milieu, die die genetische Forschung und die Anwendung von deren Ergebnissen fördert und akzeptiert. Wegen den weitgehenden, vielfaltigen und unvorhersehbaren Wirkungen von solchen Forschungen sind gründliche, die pragmatische Ansicht übersteigende Analysen, gesellschaftlicher Dialog und das folgerichtige Beziehen von Lehren notwendig. 1. Geschichte In den letzten Jahrzehnten hat sich unser Wissen über Genetik rasant entwickelt. Diese Entwicklung war die Folge des Fortschrittes der modernen Medizin und Biologie, wurde aber weitgehend beschleunigt durch die Unterstützung des „Human Genome Projekts‖ und deren Satellitenprojekten von den britischen und amerikanischen Regierungen. Das Hauptziel der ersten Etappe dieses Projekts wurde viel schneller als erwartet erreicht, was mehreren Faktoren zu verdanken ist. 1. Den Projektleitern gelang es, die kontinuierliche Unterstützung des Projekts sowohl von der Tagespolitik und Verwaltung, als auch von der Gesellschaft - mithilfe der Medien - zu erwerben. Trotz der zeitweilig hitzigen Debatten wurde die Priorität dieses Projekts von der Mehrheit nie in Frage gestellt, da die Meisten sich darin einigten dass das Projekt langfristig viele Vorteile für viele Menschen hat und dazu akzeptable, bezwingbare Risiken darstellt. 2. Mit dieser Unterstützung gelang es den Projektleitern, erstklassige und motivierte Wissenschaftlerinnen, Forschungsteams und Entwicklungsteams aller betreffenden Fachbereichs, samt angemessenem institutionellen Hintergrund und sich stetig erweiternden internationalen Kooperationen, effizient zu betreuen. 3. Die unvorhersehene Spaltung und die geschäftliche, anwendungs- und profitorientierte Aspekte des Projekts haben die ursprüngliche Zielsetzung, anstatt zu gefährden, am Ende - durch den entfesselten Wettbewerb eindeutig beschleunigt. All dies bewirkte dass sich Privatinteressen zu gesellschaftlichen Interessen gesellten, mit der konsequenten Einbeziehung vom Privatkapital, und die Erscheinung von weiteren Akteuren, Zielen und Perspektiven. 4. Der gegenwärtige Zustand unserer Zivilisation begünstigt eine Verbindung zwischen medizinisch-biologische und technische Konzeptionen. Die synergistische Aktivität der Biotechnologie, Informationstechnologie und anderer neuen Technologien (z.B. Nanotechnologie) hat die rapide Entwicklung von Methodik und Techniken der medizinischen Forschung in Fahrt gesetzt. Die Verbreitung von - auf genetische Forschungen basierenden - Verwendungen ist für alle Länder, die für ihre Bürger eine akzeptable Lebensqualität zu sichern versuchen, und ihre Wirtschaft und Kulturleben nachhaltig entwickeln möchten, von grundlegender Bedeutung. Die unerwünschten Nebenwirkungen von angewandten genetischen Technologien zu beheben, vor allem die ethische Akzeptabilität solcher Technologien zu sichern, ist eine echte Herausforderung. Als geeignete Methoden für diese Aufgabe können z.B. Fachunterrichte, ethische, rechtliche und fachliche Regelung und Motivierung zur Einhaltung dieser, ethische Kommissionen, die 172 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Bioethische und forschungsethische Fragen der genetischen Forschung Tätigkeit der Behörden (Genehmigung und Kontrolle), eine autonome Rolle von Fachverbänden, und auch gesellschaftlicher Dialog, dienen. Vermutlich bleibt die heute charakteristische Lage weiter gültig. Das ist sowohl durch die Entwicklung der Wissenschaft als auch durch gesellschaftliche Bedürfnisse und Erwartungen, entscheidende geopolitische Prozesse, wirtschaftliche, politische und kulturelle Trends bedingt. Diese Entwicklung kann zwar von politischen, wirtschaftlichen und kulturellen Krisen kurzfristig/zeitweilig gehindert, aber keineswegs vereitelt werden. Die primären Verwendungsbereiche der genetischen Forschung sind Diagnose und Heilung. Als Folge der Entwicklung der genetischen Forschung verwandeln sich die klinisch-medizinische Praxis und Attitüde, und der Schwerpunkt der klinischen Praxis wird stufenweise von der Versorgung des sich mit Symptomen meldenden Patienten zur - auf einer Diagnose noch während der symptomfreien Periode basierten - Vorbeugung, und personalisierten Medizin umgelegt. 2. Ethische Herausforderungen der genetischen Forschung, die Frage der „Grenzen” In den Wissenschaften ist es von großer Bedeutung, die Grenzen genau zu kennen. Eine Wissenschaft wird sogar erst durch die genaue Kenntnis ihrer Grenzen zur Wissenschaft, durch die Erkennung, dass sie keine Schlussfolgerungen, zu denen sie nicht berechtigt ist, ziehen darf. Die Philosophie, die Theologie und die Biologie geben auf die Frage des Seins und Nichtseins unterschiedliche Antworten. Aufgrund unserer heutigen Kenntnisse gibt es keine ausreichende wissenschaftliche Antwort auf die Wunder der Entstehung des Lebens. Es gibt Hypothesen, Vermutungen, aber keine entscheidende Beweise. Der sich mit dem Materiellen befassenden Wissenschaftler, ob ein Spezialist der DNA, des Gehirns oder des Verständnisses, ist nicht dazu berechtigt, auf das „Warum?‖ des Lebens eine Antwort zu geben. Sei er noch so vertieft in seinem eigenen Fachbereich, niemand kann behaupten, die DNA sei Herr des Universums oder dass die Zufälligkeit der DNA alles entscheidend wäre. Die Verfasser dieses Kapitels betrachten solche Behauptungen als vulgär-materielle Grenzüberschreitung. (Eine andere Grenzüberschreitung ist die Vulgärtheologie, die religiösen Schriften – z.B. die Bibel – auf eine fundamentalistische Weise interpretiert, und deren Worte auf die Modelle und Behauptungen einer, sich auf etwas grundsätzlich Unterschiedliches beziehenden, Offenbarung verlegt.) Die genomische, proteomische, metabolomische und bioinformatische Aspekte in sich integrierende, systembiologische humangenetische Forschung umfasst die Forschung von Krankheiten mit einer traditionellen, mendelischen Vererbung, die Forschung der Risikofaktoren von weitverbreiteten Krankheiten/Erkrankungen, personalisierte Diagnostik und therapie-orientierte Pharmakogenomik. Sie unternimmt aber auch die Untersuchung und Erkundung von normalen und pathologischen genetischen Varianten. Die parallele Entwicklung der genetischen Forschung, der Biotechnologie und der (Bio)Informatik ermöglicht die Sammlung, Lagerung und Analyse großer Datenmengen. Die, aus zahlreichen Quellen stammenden genetischen Informationen, deren Zugänglichkeit, Qualität, und Anwendbarkeit unerlässlich für die Weiterentwicklung der Genetik/Genomik sind, stellen einen enormen Wert dar. In den letzten Jahrzehnten entstanden diverse genetische Datenbanken und Biobanken. Das optimale Nutzen dieses ungeheueren Informationspotentials zur Forschung, Entwicklung von Anwendungen, Gesundheitsförderung, klinische und wirtschaftliche Anwendungen ist in der Interesse der Wissenschaft und der Gesellschaft. Wachstum in den Bereichen der Entwicklung und Anwendbarmachen von leicht verwendbaren, relativ billigen Testen zur Diagnose von vererbbaren, monogenischen Krankheiten und zur damit verknüpften Prognose der Morbidität und Mortalität, ist rapid. Zugleich fand - den originellen Erwartungen der Gentherapie gegenüber kein Durchbruch in der Behandlung dieser Krankheiten statt. Dies wiederum zieht sich wichtige ethische Probleme nach, die weiter erschwert werden dadurch, dass gendiagnostische Teste kommerziell von jedermann leicht erhältlich sind. Deswegen ist die Erweiterung der genetischen Kenntnisse der breitmöglichsten gesellschaftlichen Schichten und die Beschaffung zugänglicher genetischer Beratung, von großer Bedeutung. Manche genetische Veranlagungen sind nicht nur von der Familie sondern auch von der ethnischen und rassischen Zugehörigkeit abhängig, die durch ihre Verhäufung in gewissen Gesellschaftsgruppen markiert ist. Dies wiederum kann mit Stigmatisierung, Diskriminierung und Isolierung verknüpft sein. Eine wichtige Richtung in der genetischen Forschung ist die Untersuchung von weitverbreiteten, nichtinfektiösen, chronischen Erkrankungen, wie z.B. hoher Blutdruck, Krebs, Diabetes und 173 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Bioethische und forschungsethische Fragen der genetischen Forschung neuropsychiatrische Krankheiten. Diese Aufgabe ist sehr komplex, da solche Erkrankungen meistens als Folge verschiedener genetischer, gesellschaftlicher, wirtschaftlicher, kultureller und umweltlicher Einflüsse erstehen. Die Forschung solcher Krankheiten stellt ein forschungsethisches Problem dar, da interdisziplinäre Zusammenarbeit zum Fortschritt erforderlich ist, wobei die Grenzen der traditionellen medizinisch-biologischen Forschungsparadigmas überschritten werden. Zugleich müssen die ethischen Maximen und Normen der Humanforschung respektiert werden. Ein wichtiges Ziel der pharmakogenomischen Forschungen ist es, zu erklären, inwiefern genetische Polymorphismen für individuelle Unterschiede bei der Reaktion des Patienten auf eine bestimmte Therapie (Toxizität, Wirksamkeit, Dosierung) verantwortlich sind. Ein weiteres Ziel solcher Forschungen ist die Charakterisierung von Populationen von unterschiedlicher Größe, mithilfe epidemiologischer Untersuchungen, anhand der Erschließung von der genetischen Vielfältigkeit. Die vielversprechenden populationsgenetischen Forschungen ziehen auch zahlreiche ethische Herausforderungen nach sich. Es gibt zahlreiche, die genetischen Variationen binnen einer Population erkundigende Untersuchungen, die keine bestimmte medizinisch-biologische Daten oder Information zu sammeln versuchen, sondern ihr Hauptziel ist es, kodierte, zweifach kodierte oder anonyme DNA Proben und die mit diesen zusammenhängende Daten zu nutzen. Die moderne Molekularbiologie, Genetik und mehr und mehr auch die Genomik haben einen Durchbruch in drei zusammenhängenden aber trotzdem unterschiedlichen Bereichen der Biologie (und Biomedizin) mitgebracht: die Biotechnologie, Gendiagnostik und Gentherapie. Alle drei Aspekte der Molekularbiologie ziehen wichtige ethische Probleme nach sich. Die Biotechnologie umfasst die Produktion von neuen Verbindungen, Wirkstoffen und Medikamenten. Mithilfe der Biotechnologie werden teuere oder unzulängliche Medikamente billiger und/oder wirksamer. Gleichzeitig müssen wir in Auge behalten dass Biotechnologie - wegen der Anwendung von ähnlichen Technologien - auch die Herstellung von Rauschgiften leichter macht und damit werden diese leichter zu erstehen. Biotechnologische Forschung an Pflanzen und Tieren ermöglicht die Herstellung von genetisch modifizierten Organismen (GMO Genetically Modified Organisms), die nützlich für die quantitative und qualitative Verbesserung der Herstellung von Lebensmitteln sind. Andererseits kann das unverantwortliche, unkontrollierte, den Konsens und internationale Kontrolle nicht beachtende Nutzen von genetisch modifizierten Organismen sowohl die Gesundheit der Bevölkerung als auch die Umwelt (eben auch die ganze Biosphäre) beschädigen. Bedauerlicherweise findet unsere materialistische Welt ihren Nutzen an beiden Seiten. Natürlich gelten die Gesetze der Wirtschaft auch für die Biotechnologie, also fordert diese Frage einen komplexen Überblick. Die Entwicklung der Gendiagnostik ist auch fesselnd. Die Genamplifikationstechniken von Heute sind imstande, komplette genetische Identifizierung aus einem einzigen Haar zustande zu bringen (da es am Ende jedes Härchens eine, aus einiger hundert Zellen bestehende, Haarzwiebel gibt). Die immer präziseren Techniken (Genchips, Mikroperlen, automatische DNA Sequenzierungsgeräte) ermöglichen es, genetische Fragen schnell und genau zu beantworten. Damit wird es möglich, genetische Krankheiten und Infektionen (was z.B. bei einer Bluttransfusion von entscheidender Bedeutung ist) zu identifizieren und kontrollieren. Auch Kriminalistik und andere Zweige der Rechtsprechung (z.B. bei Vaterschaftsbestimmung) profitieren von diesen wissenschaftlichen Techniken. Heutzutage, im Zeitalter der Genomik, im Besitz von mehr und mehr genetischen Varianten und Genexpressionsmustern, sind gendiagnostische Verfahren noch präziser und subtiler. Auch eine neue Wissenschaft, Bioinformatik, ist von großer Bedeutung. Das Netzwerk von Computern ermöglicht die „in silico‖ Arbeit, dass heißt der Biologe kann auf dem Bildschirm eines Computers - in DNA Datenbanken wie in einem Archiv suchend - moderne, nützliche Forschung machen. Wir könnten sagen, dass es ermöglicht wird, neben den Stimmen der einzelnen Instrumente (dass heißt einzelner Gene), auch die Stimmen von ganzen Orchestern (dass heißt das Expressionsmuster von vielen Tausenden Genen, der Informationsgehalt von biologischen Netzwerken) zu analysieren. Es gibt immer mehr Mittel zur Prädiktion des Auskommens verschiedener Krankheiten (z.B. ob ein Tumor Metastasen bilden wird) und auch die Nebenwirkungen gewisser Medikamente. Diese letztere Möglichkeit bedeutet einen beträchtlichen Gewinn (nicht nur im materiellen Sinn, sondern auch gesundheitlich, da es das Vermeiden von einer Reihe erfolglosen Therapien ermöglicht). Die Entwicklung von neuen, personalisierten Impfstoffen ist im Bereich der Immungenomik begonnen. Offenbar bedeutet die immer schnellere und vollkommenere genetische Diagnostik eine Reihe von rechtlichen (Arbeitsrecht, Versicherung) und ethischen („Eigenschaften‖, wortwörtlich „Vorurteile‖) Probleme für Fachleute und auch für die Objekte der Gendiagnostik (das heißt die Patienten). Besonders schwierig ist die Entscheidung des Arztes, wie viel er dem Patienten mitteilen soll, und wann. Es ist manchmal umsonst, die Verfallbarkeit unseres Wissens zu betonen wie es Ärzte tun (und auch tun müssen), 174 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Bioethische und forschungsethische Fragen der genetischen Forschung wenn der Patient und dessen Verwandten Informationen über Chancen und Gefahren, dem aktuellen Zustand der Wissenschaft gemäß, fordern. Die zur Verfügung stehende Datenmenge, und die Erreichbarkeit von internationalen Datenbanken verbessern sich exponentiell. Neben den positiven Seiten dieses Phänomens müssen wir auch die Gefahren von missverstandenen „Gen-Gerüchten‖ verstehen. Es wäre wichtig, das Biologieunterricht und die biologische Erziehung zu modernisieren, und es wäre auch schön wenn man auf die Ehrlichkeit, Besonnenheit und Aufrichtigkeit der Populärwissenschaft zählen könnte. Für so etwas lassen jedoch die immer mehr marktorientierte Medien immer weniger Raum, obwohl auch sehr erfreuliche Tendenzen wahrzunehmen sind. Entscheidend in der Sichtweise des Genetikers ist die Erkennung dass sich Genetik immer auf Wahrscheinlichkeiten bezieht. Trotzdem, auch in dieser Bewusstheit erstehen alltäglich neue, schwierige ethische Probleme. Vielleicht noch problematischer ist der Bereich der Gentherapie, die Frage der Genmanipulation. Gentherapie bedeutet den Übertrag von Genen (DNA Abschnitte) zwischen verschiedenen Organismen und menschlichen Zellen, mithilfe derer eine Krankheit geheilt oder vorbeugt werden kann. Obwohl es in diesem Bereich zurzeit noch mehr Misserfolge als Erfolge gibt, die verlockende Versprechung der Heilung drängt den berechtigten, auf Vorsicht und nüchterne Mäßigkeit mahnenden wissenschaftlichen Skeptizismus immer wieder in den Hintergrund. Obwohl es immer mehr Techniken zur „Genverbesserung‖ gibt (und dabei sind die immer genauere Kenntnisse der Genomik, der menschlichen genetischen Landschaft, instrumental), trotzdem sind wir noch fern von dem wahren Erfolg der genetischen Heilung. Hoffentlich gewinnt die attraktive, gehaltreiche Populärwissenschaft auch in diesem Bereich die Oberhand gegen die den Sensationen nachjagenden Massenmedien. Realistisch betrachtet gibt es beinahe vollkommene Übereinstimmung darin, dass es erlaubt und erwünscht ist, mit Gentechnologie zu heilen und Krankheiten vorzubeugen, solange es keine technischen Hindernisse darstellt. Fähigkeiten zu verbessern ist dagegen nicht erlaubt. Hier muss es bemerkt werden dass eine klare Grenzsetzung zwischen diesen beiden Bereichen problematisch ist. Allerdings, vielleicht zum Glück und im Gegenteil zu der Übertreibungen des wissenschaftlichen Reduktionismus, scheint es immer klarer zu werden, dass Prozesse der psychisch-emotionellen Intelligenz mit genetischen Methoden weder erklärt noch manipuliert werden können (jedenfalls nicht wirksamer als mit chemisch-pharmakologischen Mitteln). 3. Die Biobanken Biobanken dienen zu der Sammlung, angemessene Lagerung, Preservierung und Datenschutz von biologischen Proben (z.B. Organe, Gewebe, Zell und DNA Proben). Biobank ist ein Allgemeinbegriff. Einzelne Biobanken können aufgrund des Spenderorganismus (z.B. Human-, Hunde-, Weizen-, Hefe-Biobanken) oder der Spendergewebe (z.B. Blut, Nierenkarzinome, DNA) auseinandergehalten werden. DNA-Biobanken speichern keine Organe oder Gewebe, sondern die genetische Information eines bestimmten Lebewesens. Biobanken sind jedoch mehr als einfache Sammlungen. Zu jeder einzelnen Probe gehört eine gewisse Datenmenge, die das Lebewesen charakterisiert, von dem die Probe stammt. Es gibt Rechtsnormen je nach Biobanken, die biologische Proben aus verschiedenen Lebewesen sammeln. Verständlicherweise, am besten reguliert sind die Human-Biobanken. Im Falle von Human-Biobanken ist die Identität jeder einzelnen Probe bekannt. Insofern die betreffende Person an einer Krankheit litt oder leidet, gehören auch detaillierte klinische (medizinische) Daten zu den Biobanken. Der Probenspender muss in jedem Fall eine Informationserklärung (über die Biobank, die Probeentnahme und die eventuellen Nebenwirkungen der Probenentnahme) und eine Zustimmungserklärung unterschreiben. Die persönlichen Daten und eventuellen klinischen Details des Probenspenders werden elektronisch oder auf Papier, gemäß Datenschutzregelungen kodifiziert, in den Biobanken gespeichert. In Human-Biobanken werden biologische Proben strengstens anonym gespeichert. Biologische Proben aus jedem einzelnen Donor bekommen eine Nachweisnummer, nach der die Proben organisiert werden. Auf dem Probenbehälter der biologischen Probe dürfen keine Details genannt werden (wie z.B. Name, Geburtsjahr, Adresse), aufgrund deren die Identität des Probenspenders erschlossen werden könnte. Die zur biologischen Probe gehörenden Nachweisnummer, persönliche und klinische Daten werden elektronisch organisiert. Die elektronische Datenspeicherung ist strikt geregelt und hat mehrere Sicherheitszonen so dass die Daten nicht in unzuständige Hände gelingen. In manchen Fällen ist die Anonymisierung endgültig (z. B. bei der genetischen Charakterisierung von großen Populationen), das heißt dass es niemals wieder möglich ist, eine spezifische 175 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Bioethische und forschungsethische Fragen der genetischen Forschung Probe zu einem Individuum zu verknüpfen. Pseudomierung, wobei die Identität des Spenders mit einer Kode, in manchen Fällen mehrfachen Koden, geschützt wird, und die Identität nur von dem - vom Hippokratischen Eid gebundenen - Arzt, und ausschließlich für Heilungszwecke, kennengelernt werden mag, ist jedoch weiter verbreitet. Für das wissenschaftliche Studium verschiedener Krankheiten und anderen biologischen Prozessen (z.B. für die Untersuchung von seltener aber penetranten Allelen) ist das Vorhandensein von einer großen Zahl von biologischen Proben notwendig. Würde die Probensammlung erst am Anfang des Forschungsprojektes beginnen (z.B. mit Einberufung von Patienten, Aufbau von Biobanken), würde sich die Forschung verlangsamen, da es Jahre dauert, eine angemessene Zahl (mehrere Hunderte oder Tausende) von Proben zu sammeln. Vorsorglich aufgebaute, oft internationale Biobanken beschleunigen solche Forschungsprojekte, weil eine angemessene Zahl von biologischen Proben, samt angemessenen Details (z.B. klinischen Daten), bereits am Anfang der Projekte zur Verfügung steht. Zur wissenschaftlichen Forschungszwecken können nur Biobanken mit eigenen ethischen Genehmigung benutzt werden, da in diesen Fällen gehören die an den biologischen Proben ausführten Untersuchungen zu den eng genommenen Untersuchungen für Heilungszwecke. Blutbanken und Gewebebanken bilden eine spezielle Gruppe von Biobanken. Im Falle von Blutbanken wird Blut von freiwilligen Spendern gesammelt und bei Operationen genutzt. Gewebebanken werden bei Gewebetransplantationen benutzt (z.B. Hornhaut Banken bei Hornhaut Transplantationen). Diese Biobanken speichern die Gewebe nur für eine gewisse Zeitspanne, da die Lebensfähigkeit der Zellen begrenzt ist. Auch die zur laboratorischen Untersuchungen entnommenen Proben werden in Biobanken gespeichert, wo die untersuchte Probe nach der Diagnose vernichtet werden muss, was gesetzlich auch streng geregelt ist. 4. Einige allgemeine ethisch belangte Fragen Wie üblich, brauchen auch Forscher im Bereich der Genetik die Freiheit zum Kennenlernen und zur Forschung, die nur in nötigen Fällen und in berechenbarer, transparenter Weise durch Regelungen und Instituten begrenzt werden kann. Im Allgemeinen akzeptiert die Forschergesellschaft Begrenzungen, die mit dem Wert vom menschlichen Leben, und die menschliche Würde der untersuchten Personen im Zusammenhang stehen. Sensitiv sind jedoch jene Bereiche, wo keiner gesellschaftlicher Konsensus erreichbar ist, wie z. B. die Frage um die Zeitpunkt des Beginns des Lebens, der ethische Status des Embryo und Fötus, und die sich daraus ergebenden Forschungsmöglichkeiten, wie z.B. Forschung an Embryos, Entnahme und Nutzen von Stammzellen. Erhitzte Debatten gibt es auch im Zusammenhang mit Tierforschung. Diese umstrittenen Fragen bilden eine schwer überwindbare Spalte sowohl zwischen Forscher als auch in der Gesellschaft. Das nötige gesellschaftliche Vertrauen kann durch einen immer erneuten gesellschaftlichen Dialog gesichert werden, und Forscher müssen die Bürde der Öffentlichkeit mit ins Kauf nehmen. Ein anderes, ethisch wichtiges Problem ist das Auswählen von Forschungsbereichen und Forschungsthemen. Es ist allgemein bekannt dass die, der Forschung widmeten finanziellen Quellen sich vor allem auf die Lösung von Problemen charakteristisch in kapitalistischen Ländern richten. Den Prioritäten von Entwicklungsländern, wo die Mehrheit der Bevölkerung lebt, sind weit bescheidenere Quellen und Aufmerksamkeit von der Seite der Forschung gewidmet. Zu gleicher Zeit kommt es vor, dass Untersuchungen, die in kapitalistischen Ländern aus ethischen Gründen nicht akzeptierbar sind, in nachsichtlicheren und finanziell mehr benötigten Ländern durchgeführt werden. Die verschiedenen genetischen Forschungsbereiche und die angewendeten Methoden werfen zahlreiche Forschungsethische Fragen auf. Diese können aufgrund der forschungsethische Normen, die nach dem Zweiten Weltkrieg allmählich geformt wurden (z. B. Nürnberger Kodex, Helsinki Deklaration, Belmont Reportage, CIOMS, die Vereinten Nationen, UNESCO, Dokumente des Europarates, nationales und internationales Recht), von den zuständigen Instituten (Forschungsinstitute, ethische Kommissionen, wissenschaftliche Komitees, nationale und internationale Fach- und politische Organe, die Behörden, Agenturen) kontrolliert werden. 5. Bioethische und forschungsethische Fragen spezifisch für genetische Forschung Im Zusammenhang mit genetischen Forschungen tauchen zahlreiche ethische Fragen in einem neuen, früher nicht bekannten Kontext auf, die nicht auf „traditionelle‖ Weise beantwortet werden können. 176 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Bioethische und forschungsethische Fragen der genetischen Forschung Eine von diesen ausgezeichneten Fragen ist die Frage der, auf vorheriger Bescheidgebung basierten, Zustimmungserklärung. Solche Fragen werfen eine Reihe von theoretischen und praktischen Problemen auf, im Zusammenhang mit dem Benutzen zu Forschungszwecken von Biobanken, Biobibliotheken, und als genetische Informationsquelle dienenden Probensammlungen. Die andere wichtige Frage ist das Eigentumsrecht von genetischen Informationen, das damit zusammenhängende Verfügungsrecht, und der Anteil an dem, aus kommerzieller Umsetzung eingebrachten, Profit. 6. Ethische Fragen der kommerziellen Nutzung von Informationen genetischer Herkunft Im Zusammenhang mit den non-humanen biotechnologischen Entdeckungen wurden bioinnovatische Ergebnisse von Anfang an als geistiges Eigentum behandelt. Geschützt vom Patentrecht, und wirtschaftliche und kommerzielle Chancen ergreifend, entstand der Markt von lebenden Materialen. Das allein hat schon ernste ethische Probleme mitgebracht, und generiert auch heute noch Debatten. Eine besonders große Herausforderung bedeuten jedoch ethische Fragen im Zusammenhang mit dem menschlichen genetischen Stock. Der Grundsatz, unterstützt von internationalem Recht, nach dem das humane Genom das gemeinsame Erbe und Eigentum der Menschheit ist, ist weitgehend akzeptiert. Dass die Ergebnisse der genetischen Forschungen den wissenschaftlichen Beweis des gemeinsamen Ursprungs und Zusammengehörigkeit aller heute lebenden Menschen liefern, wird auch von niemand in Frage gestellt. Aufgrund dieser Prinzipien sollten die Forschungsergebnisse nur zugunsten des gemeinsamen Interesses, zum gemeinnützigen Zweck benutzt werden, und sie sollten auch unbehindert von Allen zugänglich sein. Diese noblen Prinzipien sind aber sehr schwer in die Praxis umzusetzen, da es die Ausbildung eines Systems fordert, dass auf gemeinsamen Werten basiert ist und gemeinsamen Zielen dient, zugleich aber auch die Vorteile sichert, die durch persönliche Motivation (wissenschaftliche Erkennung, Ambition) und wirtschatfliche Effizienz (Profit) erreichbar sind. Außerdem muss das System gerecht sein: alle sollten an den Ergebnissen und Vorteilen teilhaben, die zu diesen beigetragen haben. Das bioinnovatische System ist vor allem von seinen Normen bestimmt, die unter dem Einfluss der Praxis, von Werten, mithilfe von Prinzipien, deduziert (abgeleitet) werden. Diese haben tiefe Wurzeln in der Gesellschaft, von deren politischen und Fach-Instituten sie gebildet werden. 7. Ethische und rechtliche Regelung von der genetischen Forschung, der Biobanken und der Datenbehandlung Die hier demonstrierte Entwicklung der genetischen Forschung und Verwendungen hat den Anspruch auf eine fachlich-ethische Regelung mit sich gebracht. Verschiedene Normen, Erklärungen, Richtlinien, Regeln, und bald nationale und internationale Rechtsdokumente und Verträge wurden erstellt/angelegt. In den letzten zwanzig Jahren wurden sehr viele solche Normentexte produziert. Ein ernstes Problem bedeutet die Vielfalt der Herkunft und Verfasser dieser Normen, und auch deren unterschiedliche Nomenklatur und Terminologie. Ziel wäre es, bei der gleichen Beachtung der kulturellen Vielfalt, eine global einheitliche, konsequente fachlichethische Regelung zu erstellen und diese dann gemeinsam zu erhalten und durchzusetzen. Die bedrückende Erfahrung ist jedoch, dass diese, auf allgemeinem Konsensus ruhenden Regelungen viel zu universal sind um brauchbar sein zu können. Die praktischen Normen in wichtigen Fragen bleiben oft nur Entwürfe, da es im Zusammenhang mit solchen kein Einverständnis erreicht werden kann. Das ELSI Programm des Human Genom Projektes (http://www.genome.gov/10001618), das beträchtliche Projekte zur Untersuchung von ethischen, juristischen und gesellschaftlichen Zusammenhänge finanziert hatte, gab der Normensetzung bedeutende fachliche Unterstützung. Später wurden ähnliche Projekte von der Europäischen Union gestartet. Die ethischen Grundsätze der genetischen Forschung können von dem Nürnberger Kodex, der Helsinki Deklaration (1964) und deren mehrfachen Modifizierungen, den Richtlinien des Council for International Organisation of Medical Sciences (CIOMS) (http://www.cioms.ch/) deduziert werden. Zahlreiche Aspekte wurden von den, in Fragen der Gesundheit und Biowissenschaft zuständigen Ausschüsse, dem Französischen 177 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Bioethische und forschungsethische Fragen der genetischen Forschung Nationalen Ethischen Konsultativen Rat und dem Nationalen Bioethischen Beratungskomitees der Vereinigten Staaten untersucht. Die Stellungnahmen dieser dienen als wichtige Anleitung, erregen aber auch Debatten. Wichtige Foren für Normeneinigung sind auch die globalen Gipfeltreffen der nationalen bioethischen Komitees. Ein spezielles Beispiel der Normensetzung ist das Europäische Übereinkommen über Menschenrechte und Biomedizin, auch als Oviedo-Konvention bekannt (1997), das trotz aller Vorbehalte, den europäischen Konsensus über die Grundsätze bezüglich der genetischen Forschung und der praktischen Verwendung deren Ergebnissen verkörpert. Ein Zusatzprotokoll der Konvention verbietet das Klonen von Menschen zur Reproduktionszwecke. Auch die Politik äußerte sich, in dem das Europaparlament am siebten September 2007 das Klonen von humanen Embryonen zur therapeutischen Zwecken gesetzlich verbat. Zahlreiche Länder, unter diesen auch Ungarn, hatten aber dasselbe bereits davor gesetzlich verboten. Die UNESCO Deklaration betreffs des menschlichen Genoms und der Menschenrechte (1997) ist im feierlichen Stil geschrieben, bietet aber wenig praktische Hilfe. Trotzdem kann sie zur Entstehung eines globalen Konsensus führen so dass forschungsethische Normen weltweit respektiert werden. UNESCO hat auch eine internationale Erklärung über das Nutzen und Schutz von humanen genetischen Daten abgegeben. Die WHO hat seit 1998 zahlreiche Beschlüsse, Entwürfe für internationale Richtlinien, Reporte und Empfehlungen veröffentlicht. Vielleicht die Wichtigste unter diesen Empfehlungen ist die über genetischen Datenbanken (2003). Sowohl die Europäischen Richtlinien für den Rechtsschutz der biotechnologischen Erfindungen (1998), als auch die Europäische Patent-Konvention beschäftigen sich mit den ethischen Normen in Verbindung mit der Verwendung von Ergebnissen der humangenetischen Innovation. Die 1998 verfasste Stellungnahme der HUGO über DNA Proben war ein bahnbrechendes Dokument, was von den Empfehlungen des Ethischen Komitees des Royal College of Physicians von Groß-Britannien gefolgt wurde (2000). Einen weiteren Meilenstein bedeutete die Äußerung des Deutschen Nationalen Ethikrates über Biobanken in der Forschung (2004), und auch die gemeinsame Stellungnahme der französischen und deutschen Nationalen Ethikkomitees über die Regelung der Biobanken (2003). Weitere wichtige Dokumente sind die Empfehlung der Europäischen Humangenetischen Gesellschaft zur Datenspeicherung und DNA Banking (2001), wie auch die Empfehlung des Europarates zur Regelung der Archivierung von humanbiologischen Daten zu medizinisch-biologischen Zwecken (2003). Die nationale Gesetzgebung von Australien, Singapur, den Vereinigten Staaten, Frankreich, und Kanada (Quebec) sind Pioniere in den Bereichen genetischer Forschung, Biobanken und Datenschutz. Auch das ungarische humangenetische Gesetz wurde mit beträchtlicher Hilfe von Fachleuten 2008 verabschiedet. Die, in deren Wirkung die nationalen Grenzen weit übersteigende, Tätigkeit der australischen und kanadischen Rechtsreformkomitees muss betont werden. Bedeutend ist die nationale und internationale Gesetzgebung fördernde Tätigkeit der niederländischen, deutschen, französischen und amerikanischen PräsidialEthikkomitees. Hinsichtlich der Zukunft stellen die nationalen Genomprojekte ein spezielles fachlich-ethisches Problem dar, wie z.B. die erste isländische Gesundheitsdatenbank (mit der Kooperation vom Isländischen Staat und die deCode Gesellschaft), das Genomprojekt von Estonien und die Bevölkerungsdatenbank von Tonga. Die epochale Bedeutung der Genetik ist auch von der Weltpolitik anerkannt, soviel ist klar von der MillenniumErklärung der UNO (2000) und von mehrfachen Stellungnahmen des G8 Gipfeltreffens. 8. Konklusion Es ist offenbar, und in der Epoche der Genetik und Genomik müssen wir darüber im Klaren sein, dass menschliches Wissen nie von den geistlichen Prozessen und Tagesgeschehen der ganzen Gesellschaft getrennt werden kann. In zahlreichen Sphären (Wirtschaft, Recht, Ethik, Religion) muss sich unsere, nach Erneuerung und Befestigung strebende, Gesellschaft, an die Folgen der Entwicklung unseres Wissens, anpassen. Wir müssen uns, gegen der unwissenschaftlichen Dunkelheit, der Aufklärung nähern. Das dient der Abmarkung von eindeutigen Prioritäten, Werten, Verbundenheit, und persönlicher Verantwortung. 9. Literaturverzeichnis 178 Created by XMLmind XSL-FO Converter. Bioethische und forschungsethische Fragen der genetischen Forschung 1. Bernice Elger, Nikola Biller-Andorno, Alexandre Mauron and Alexander M. Capron (ed.): Ethical Issues in Goberning Biobanks – Global Perspectives; Ashgate (2008) 2. Ferencz Antal, Kosztolányi György, Falus András, Kellermayer Miklós, Somfai Béla, Jelenits István, Hámori Antal: Biogenetika és etika (Sapientia füzetek 4.); Vigília Kiadó (2005) 3. The Advisory Committee on Health Research: Genomics and World Health; World Health Organization (2002) Jan Helge Solbakk, Soren Holm, Bjorn Hofmann: The Ethics of Research Biobanking; Springer (2009) 179 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
