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Pflanzenviren Teil II
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PflanzenViren
Caulimoviren
Geminiviren
Comoviren
Tobamoviren
Potyviren
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Pflanzenviren Teil I
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Pflanzenviren II Poty-, Gemini,- Caulimo-, Baculoviren
Potyviren:
große wirtschaftliche Bedeutung, über 100
verschiedene Viren, fast alle Nutzpflanzen
können betroffen sein (Protease-Inhibitoren)
Geminiviren:
einzige bedeutende Familie mit ss-DNA,
bidirektionelle Expressions-Strategie,
“rolling-circle” Replikation.
Caulimoviren:
Transkriptase, Regulationselemente für
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“Pararetroviren” im Pflanzenreich, reverse
genetische Transformation von Pflanzen
Baculoviren:
Insektenviren, eukaryontische Genexpression
Potyviren
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Eigenschaften: positive ss-RNA, 9600 nt
700 – 900 nm lang, filamentös (flexible Stäbchen)
Durchmesser 12 -15 nm
RNA mit 3' poly A und covalent geb. VPg am 5'
ein großes ORF  ein Polyprotein, das dann
proteolytisch gespalten wird (ähnlich Poliovirus)
Transmission:
aphids (Blattläuse)
fungi (Pilze)
mite (Milben)
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wirtschaftl.
Obwohl meist enges Wirtsspektrum: fast jede
Bedeutung:
Nutzpflanze kann von Potyviren infiziert werden
(> 100 versch. Potyviren). Meist deutliche
Symptomausbildung – oft totaler Ernteverlust.
Potyviren
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Copyright ©2002, UF Department of Plant Pathology
PO Box 110680, Gainesville, FL 32611-0680
(352) 392-3631, Fax: (352) 392-6532.
Plum pox potyvirus induced chlorotic rings/blotches on nectarine.
Photograph courtesy P. Gentit, Ctifl, France.
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Potyvirus
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http://www.uq.edu.au/vdu/VDUPotyvirus.htm
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PROTEIN POSSIBLE FUNCTION(S)
P1 Proteinase;
Cell-to-cell movement (speculation).
HC-Pro
Aphid mediated transmission;
Proteinase;
Cell-to-cell movement (speculation).
P3 Unknown (possible role in replication)
CI Genome replication (RNA helicase);
Membrane attachment;
Nucleic acid stimulated ATPase activity;
Cell-to-cell movement (speculation).
CP RNA encapsidation;
Involved in vector transmission;
Cell-to-cell movement.
NIa-VPg Genome replication (Primer for initiation of RNA synthesis).
NIa-Pro
Major Proteinase
NIb Genome replication (RNA-dependent RNA polymerase [RdRp]).
6K1 & 6K2
Unknown, but possible roles in: - RNA replication;
- Regulatory function inhibiting NIa nuclear translocation;
- Membrane anchoring of replication machinery.
Table 1: Potyvirus proteins and their known and speculated functions.
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Potyvirus
Expression
Ein großes
Polyprotein
wird durch
Proteasen in
funktionelle
Proteine
gepalten.
Potyviren
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Tobacco
Etch
virus
(TEV)
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Functional Dissection of Naturally Occurring Amino Acid
Substitutions in eIF4E That Confers Recessive Potyvirus
Resistance in Plants W OA
Potyviren
Inhwa Yeam,a,1 Jason R. Cavatorta,a Daniel R. Ripoll,b Byoung-Cheorl Kang,a,c and Molly M. Jahna,d,2
a Department of Plant Breeding and Genetics, College of Agriculture and Life Sciences, Cornell University, Ithaca, New York
14853
b Computational Biology Service Unit, Life Sciences Core Laboratories Center, Cornell University, Ithaca, New York 14853
c Department of Plant Science, College of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, Seoul 151-742, Republic
of
Korea
d College of Agricultural and Life Sciences, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin 53706
Naturally existing variation in the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) homolog encoded at the pvr1 locus in
Capsicum results in recessively inherited resistance against several potyviruses. Previously reported data indicate that the
physical interaction between Capsicum-eIF4E and the viral genome-linked protein (VPg) is required for the viral infection in
the Capsicum-Tobacco etch virus (TEV) pathosystem. In this study, the potential structural role(s) of natural variation in the
eIF4E protein encoded by recessive resistance alleles and their biological consequences have been assessed. Using
highresolution
three-dimensional structural models based on the available crystallographic structures of eIF4E, we show that
the amino acid substitution G107R, found in many recessive plant virus resistance genes encoding eIF4E, is predicted to
result in a substantial modification in the protein binding pocket. The G107R change was shown to not only be responsible
for the interruption of VPg binding in planta but also for the loss of cap binding ability in vitro, the principal function of eIF4E
in the host. Overexpression of the Capsicum-eIF4E protein containing the G107R amino acid substitution in Solanum
lycopersicum indicated that this polymorphism alone is sufficient for the acquisition of resistance against several TEV
strains.
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(B) View of the molecular surface area of a model of CapsicumeIF4E with the amino acid substitutions colored as follows:o acid
substitutions colored as follows: T51A and P66T in green;
G107R in red; V67E, L79R, and D109N in yellow; and 7-methylGDP in magenta.
Geminiviren
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als Beispiel für antivirale Strategien:
1. Movement Suppression
2. Defective Interfering Particles (DI)
3. Antisense RNA
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Geminiviren
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Eigenschaften: positive ss-DNA, 2500 - 3000 nt,
sehr kleines zirkuläres Genom
Replikation im Zellkern („rolling circle“)
Transmission:
weisse Fliege ist häufigster Vektor
wirtschaftl.
Vorkommen in Karibik, Amerika, Südostasien,
Bedeutung:
Indien, Mittelmeerraum;
bevorzugt tropische Nutzpflanzen
z.B. Zuckerrohr, aber auch Mais
Electron micrograph of plant virus prepared by
Dr RG Milne
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Istituto di Fitovirologia Applicata
Strada delle Cacce 73
10135 Torino
Italy
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copyright owners. The images are not in the public domain. The images can be
freely used for educational purposes.
Geminiviren
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Dikotyle
Pflanzen:
Geminiviren meist bipartite
Geminiviren meist monopartite
Übertragung: weisse Fliege
Übertragung: häufig Zikaden
Komponente A
meist ausreichend für
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Monokotyle
Pflanzen:
Koponente B
für systemische Ausbreitung,
Replikation in einer
braucht Komponente A zur
Zelle, kodiert coat-
Replikation
Protein
Geminiviren
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A simplified version of the
geminivirus DNA replication cycle and
intercellular movement of viral DNA.
Geminivirus DNA replication occurs in
two stages. First, the ssDNA is
converted into dsDNA with the
participation of cellular factors. The
dsDNA serves as template for viral
gene expression. Secondly, the
dsDNA initiates the rolling circle
phase, with the participation of viral
and cellular factors, to produce new
ssDNA products. These can (i) reenter the DNA replication pool, (ii)
associate with CP or (iii) be
transported outside the nucleus and
to the neighbouring cell, most
probably through plasmodesmata,
with the help of viral MPs.
The EMBO Journal (2000) 19, 792–799, doi:10.1093/emboj/19.5.792
Geminiviren
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www.cals.ncsu.edu/.../geminivirus.jpg
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TGMV and CaLCV both have two components, designated
A and B, which are similar in size. The common region (CR)
is indicated by black boxes. The CR contains the viral origin
of DNA replication and is conserved between the A and B
components, but varies between members of the
begomoviruses. The A component encodes genes needed
for replication, gene expression, and encapsidation. AL1 is
also known as AC1(required for replication), AL2 as AC2,
and AL3 as AC3. The B component contains two proteins
needed for viral movement, BR1 (BV1) and BL1 (BC1).
Geminiviren
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bidirektionelle
ExpressionsStrategie:
v: virus sense genes
c: complentary
sense genes
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intranukleäre dsDNA-Formen mit
zwei “non-codingRegionen“
1. Promotoren
2. zwei Polyadenylatoren
coat-Protein (V1) nicht
notwendig für Replikation
aber Transmission.
ACMV: African
cassava mosaic
virus
BCTV: Beet
curly top virus
(single component virus)
WDV: Wheat
dwarf virus
Geminiviren – Movement Supression
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Geminiviren-Movement Supression
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Testsystem:
Koinokulation von TGMV BL1 Gen und
DNA B von ACMV führt zur Reduzierung
systemischer Symptome.
Mechanismus: Einbau des BL1 Proteins (NH2-terminale
Sequenz) inhibiert ACMV-movement.
Transdominant negative Mutante
BC 1
BC 1
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ACM
V
BC 1
BC 1
BL 1
BC 1
Geminiviren- Defective Interfering Particles
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Defective Interfering (-RNA/-DNA/-particles/-viruses:
DIs haben ein unvollständiges Genom und sind auf
“Helferviren” zur Replikation angewiesen.
Ihre Genome sind verkürzt und enthalten in der Regel 5' und 3'Enden der entsprechenden Helferviren, sowie ein
Verpackungssignal Ω.
Sie besitzen auf Grund ihres kurzen Genoms einen
Replikationsvorteil und interferieren (negativ) mit der
Replikation des Helfervirus. Große Mengen an DIs können bei
Infektionsversuchen die Ausbeute an vollständig intakten,
replikationsfähigen Viren erheblich senken.
Bsp.:
Ω
Ω
DI
Helfervirus
DIs
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Positivkontrolle
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Protektion
durch DIs
Geminiviren- Defective Interfering Particles
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Defective Interfering (-RNA/-DNA/-particles/-viruses):
Bsp.: African cassava mosaic virus (vorheriges Bild)
Defekte DNAs leiten sich ausschließlich von DNA B her
(BV 1 komplett deletiert, BC 1 Carboxy-Terminus deletiert).
DIs inhibieren generell die Produktion von DNA A und B.
Da aber DNA A und B für die systemische Infektion notwendig sind, ist
es bei geringer Konzentration der DNA B wenig wahrscheinlich, dass
es unter diesen Bedingungen zur gleichzeitigen Infektion einer Zelle
mit A und B kommen kann.
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Dies führt zu einer Reduktion der systemischen Ausbreitung.
DIs interferieren auf der Ebene der DNA-Replikation
DIs kompetieren mit Helfervirus um transaktivierende Proteine
Antisense RNA
LMU Inhibition der Virusreplikation durch Antisense-RNA:
Prinzip: Zur viralen RNA komplementäre RNA soll die Replikation
inhibieren (Störung der Polymerase, ...).
Häufig werden hierbei Antisense-RNAs eingesetzt, deren Bindung sich
gegen Sequenzen viraler Replikasen richtet, da diese Gene essentiell
sind und deren Expression nur auf relativ geringem Niveau erfolgt.
Probleme: Antisense RNAs werden nur in relativ geringer Menge
transkribiert, ihre Expression ist genetisch nicht stabil, schnelle
“Rückmutation”.
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Praktisches Beispiel für Antisense-RNA-Strategie: Entsprechende,
gentechnisch veränderte Pflanzen, zeigen bei Infektion mit dem
Tomato Golden Mosaic Virus eine Reduktion der Zahl von Pflanzen mit
Symptomen einer Virusinfektion.
Retroviren und Pararetroviren
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4 Typen von Viren mit Reverser Transkriptase Aktivität:
Retroviren
Hepadnaviren (HBV)
Badnaviren (Bacilliforme
Pflanzenviren,
wenig untersucht)
Caulimoviren
Genom: RNA
“echte” Retroviren
Genom: DNA
Pararetroviren
Integration in das
Zellgenom
Mehrere nicht integrierte
“Minichromosomen” im ZK
Beiden Gruppen gemeinsam: gag und pol Proteine
env: bei Caulimoviren nicht vorhanden (unbehüllt), hier wurden „Reste“
von env durch Sequenzhomologie identifiziert ORF VI (scaffolding ?)
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Caulimoviren
Viren mit reverser Transkription (Pararetroviren)
ds-DNA, 7800 – 8200 bp, zirkulär
keine Hülle, dafür ein mehrschichtiges Kapsid
Ikosaedrisch, Durchmesser 45 – 50 nm
Übertragung häufig durch Blattläuse (wie z.B. CaMV)
DNA Replikation durch RT eines „full-length“-Transkriptes
Priming der DNA-Synthese durch t-RNAMet
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„strand-switching“
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Genome: Quelle für Regulationselemente in der Gentechnik
Genom mit ungewöhnlicher Topologie (3 Formen)
Caulimoviren – Symptome bei Infektion
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Vergilbung der Blätter
Mosaikartige Blattaufhellungen, Streifenbildung
Aufhellung der Blattadern
Reduziertes Wachstum
eingerollte Blätter
Farbveränderungen (Abnahme der grünen Blattpigmente)
Blattränder erscheinen gewellt, „ausgefranst“
Verkürzte Internodien
Uncharakteristisches, buschiges Wachstum
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Verzweigung verändert
Auftreten von Nekrosen (absterbende Gewebebereiche)
Caulimoviren – Genom
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ORF I Movement
protein
ORF II Insect
transmission factor
ORF III minor struct. Pr.
ORF IV Capsid protein
VII
VI
II
ORF V Protease,
reverse transcriptase
and RnaseH
CaMV
8000 bp
ORF VI Translational
activator / Inclusion
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body protein
ORF VII Unknown
(dispensable)
I
V
III
IV
Cauliflower Mosaic Virus - Genom
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3 Genom-Formen
1. Twisted Virus-DNA
Drei Lücken in der DNA
an defin. Stellen:
eine im (-) strang
zwei im (+) strang
2. Supercoiled DNA,
„Minichromosom“
Transkriptionstemplate
Expression durch zwei
Promotoren kontrolliert
(P) einmal für
genomische 35S RNA +
subgenom. 19S RNA
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3. 35S RNA
Template für Translation
und Reverse Transkript.
CaMV - Proteine
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ORF
Protein
I
P1, cell to cell movement (durch Plasmodesmata)
II
P2, transmission
III
minor structural protein P3
gag
IV
major coat protein P4 (phosphoryliert)
gag
V
Rev. Transkr. (PR aber keine INT), Aspartat-PR
pol
VI
P6 „verkrüppeltes“ env, Transaktiv. der Translat.
“env”
VII
kodiert vermutlich kein Protein, involviert in
Expression der 35S polycistronischen mRNA
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CaMVLebenszyklus
beide CaMV RNAs werden
posttranskriptionell polyadenyliert (AATAAA)
35S RNA: 600 Basen
leader Sequenz
Genprodukt ORF VI
stabilisiert 5'-Ende der
35S-RNA und erhöht
Translation
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Insertionen in Genprodukt
VI attenuieren Schwere
der Symptome bei
Infektion
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CaMV – Genregionen mit Einfluss auf
die Symptomausbildung
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Viren bei
Invertebraten
Baculoviren
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Baculoviren
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400 verschiedene Baculoviren bekannt
ds-DNA, ca. 129.000 bp, zirkulär, supercoiled, DNA im Kern
behüllt
Ikosaedrisch, Durchmesser 45 – 50 nm
Zuerst: Immediate Early Gene Transkription (zelluläre
Polymerasen)
Immediate Early Genes aktivieren Delayed Early Genes,
danach folgt die DNA-Replikation (12 h p.i.)
Late Genes (z.B. Glycoprotein gp41, Kapsid Protein p24, ...)
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Very Late Genes (18 h p.i.), p10, u. Polyhedrin- Expression,
Polyhedrin kann in Zellkultur deletiert und Fremdgene
stattdessen einkloniert werden.
Baculoviren – Autographa californica
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Am besten untersuchter Vertreter der Baculoviren:
Autographa californica nuclear polyhedrosis virus
Wirte: Arthropoden, Insekten, besonders Schmetterlinge
sonst keine bekannten Wirte
Für die Larven von Insekten verläuft die Infektion fatal,
hohe Virustiter
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Insektenlarven „verflüssigen“ sich auf Grund der Infektion,
daher z.T. Einsatz als Insektizid.
Baculoviren - Genexpression
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Baculoviren interessant wegen der Möglichkeit der
Expression rekombinanter Proteine.
Vorteile:
Modifikation von Proteinen in eukaryontischem System
im Gegensatz zu E. coli, hier:
Glycosilierung, post-translational processing, trafficking
(Sekretion), native Proteine mit entsprechenden antigenen
und immunogenen Eigenschaften
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Hohe Expressionsrate (bis zu 50% des Gesamt-Zell-Proteins)
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Gene bis zu ca. 10.000 bp sind exprimierbar
Baculoviren – 2 Phänotypen
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Beim Durchlaufen eines kompletten Lebenszyklus treten zwei
völlig unterschiedliche Phänotypen des Virus auf.
1. PDV (Polyhedra-derived-virus)
Initiation der Infektion von Larven, die Virus z.B. durch
Nahrung aufnehmen. Parakristalline Proteinstruktur.
Großteil des Materials ist Polyhedrin („occlusion bodies“).
Sehr stabil, 1-5 µm, lichtmikroskopisch sichtbar.
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BV (oder EV), budded virus / extracellular virus
Für Zell-zu-Zell Transport im Wirt. Budding von Zellmembran
als einzelnes Nukleokapsid, lose Hülle aus env gp64,
surface projections, nie „occluded forms“
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Baculovirus
Polhedra
Lichtmikroskopische
Darstellung
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Baculoviren - BV/PDV
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Beide Formen genetisch völlig identisch, aber morphologisch
und in Bezug auf Infektiosität und Antigenität völlig verschieden
Oral appliziert:
PDV 25000 x infektiöser als BV
in Zellkultur:
BV (EV) 1000 x infektiöser als PDV
Baculovirus - Lebenszyklus
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Baculovirus – rekombinante Expression
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Hohe Expressionsraten (Effizienz des Promotors?)
Wegen der Größe des Genoms: Einbringen von
Fremdgenen oft über Plasmide/Rekombination
Wichtig ist eine 12 nt Transkriptions-Initiations-Sequenz,
aber diese Sequenz findet sich auch bei anderen
Genen mit geringeren Expressionsraten
Zytopathogenese wird durch „shut-down“ der Synthese
von Makromolekülen des Wirtes getriggert
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Radikale Restrukturierung des Zytoskeletts
(„Verflüssigung“)
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Baculovirus Expressions Systeme
Diverse
kommerzielle
Systeme
verfügbar
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Baculovirus – Transfer - Vectors
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