Versuch7_Bestimmung des Phagentiters

Versuch 7: Bestimmung des Phagentiters
Bestimmung des Phagentiters
1. Einleitung
Bakteriophagen befallen lebende Zellen und vermehren sich in diesen. Sie haben
sich auf eine Bakterienart spezialisiert (Indikatorbakterien). Die Spezialisierung
beruht auf der Fähigkeit sich an der Oberfläche der Wirtszelle an einer
Rezeptorsubstanz zu binden. Zur Anheftung an ein Bakterium dienen die
Schwanzfibrillen. Neben diesen ist der komplexe Phage in zwei Großbereiche
gegliedert (siehe Abbildung 1).
Abb. 1: Phage T4 als Beispiel eines komplexen Phagen
Der Kopf beinhaltet die lineare, doppelsträngige Pagen-DNA, die von Capsiden
umhüllt ist. Durch den so genannten Kragen ist der Kopf- von dem Schwanzbereich
getrennt. Der Schwanzbereich besteht aus einer kontraktilen Scheide (Phage T4)
oder einer nicht kontraktilen Scheide (Phage Lambda). Die Scheide wird nach unten
von der Basalplatte abgegrenzt, die sich durch ihre Haken bei der Injektion der DNA
in die Wirtszelle in der Membran verankert. Durch den Stift, der durch die Membran
dringt, wird die DNA in die Zelle injiziert.
Neben den komplexen Phagen gibt es einfache Phagen, die nur einen Kopf besitzen,
in dem die Erbinformationen in Form von DNA oder RNA gespeichert sind. Die
Formen dieser Phagen sind in Abbildung 2 aufgezeigt.
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A: Fadenform
B: Komplexe Form mit Kopf und kontraktiler Scheide (T4)
C: Kopf mit flexiblen Schwanz und nichtkontraktiler Scheide
D: Kopf mit kurzem Schwanz
E: Oktaeder (Kopfform)
F: Eikosaeder (Kopfform)
Abb. 2: Verschiedene Kopfformen von Bakteriophagen (nach Schlegel)
Die Wirtszelle dient den Phagen zur Bildung von Proteinen und zur Replikation der
Phagen-DNA. Ohne die Wirtszelle ist ein Überleben der Phagen ausgeschlossen, da
die Phagen über keinen eigenständigen Stoffwechsel verfügen.
Es gibt Phagen, die für die Wirtszelle virulent sind. Nach der Adsorption auf der
Oberfläche wird die Phagen-DNA in die Zelle injiziert. Der Injektion schließt sich die
Latenz-Periode in der Bakterienzelle an, die durch die Replikation der Phagen DNA,
sowie durch die Bildung von Phagenproteinen gekennzeichnet ist. Danach erfolgt die
Reifung, bei der die DNA in Capside verpackt wird. Danach vereinigen sich der Kopfund Schwanzbereiches der Phagen. Abschließend kommt es zu einer Lyse der
Bakterienwand durch Phagenlysozym. Die Phagen gelangen ins Medium und sind in
der Lage weitere Bakterien zu befallen. Man spricht von einem lytischen
Lebenszyklus (Beispiel für Phage T4).
Temperente
Bakteriophagen
(Bsp.
Phage
Lambda)
adsorbieren
an
der
Zelloberfläche der Bakterien und injizieren ihre DNA. Es kommt jedoch nicht zur Lyse
der Zellen, sondern zu einem Einbau der Phagen DNA in das ringförmige
Bakterienchromosom. Bevor diese Integration (Insertion) der DNA erfolgen kann,
muss die lineare doppelsträngige DNA der Phagen zu einem Ring geschlossen
werden. Die lineare DNA besitzt so genannte ´sticky ends´, die eine komplementäre
DNA-Sequenz aufweisen. Ein Ringschluss ist somit vereinfacht, wird jedoch
zusätzlich durch ein Bakterienenzym, der Polynukleotidligase, katalysiert. Die
Bakterien replizieren bei jeder Teilung auch die DNA-Bereiche des Phagen, der nun
als Prophage bezeichnet wird. Dieser vermehrt sich somit bei jeder Teilung der
Bakterienzelle. In diesem Fall spricht man von einem lysogenen Lebenszyklus
(Beispiel: Lambda Phage). Jedoch kann es durch äußere Einflüsse (z.B. UV-Licht) in
seltenen Fällen zur Excision (Ausgliederung) der Phagen DNA kommen. Dies liegt
daran, dass die durch die UV-Strahlung ausgelöste SOS-Antwort die Bildung des
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cycloplasmatischen Repressorproteins verhindert. Der Repressor verhindert die
Vermehrung vegetativer Phagen und somit ihren lytischen Lebenszyklus. Die
Phagen sind nun jedoch für die Bakterienzelle virulent.
Bei diesem Versuch wird der Phagentiter des Phagen T4-1Ly bestimmt. Voraus geht
eine Inkubation des Bakteriums E. coli B 519 mit dem Phagen. Man geht davon aus,
dass ein Plaque von je einem freien Phagen ausgeht. Ein Plaque kennzeichnet sich
durch einen Hof im Bakterienrasen, der durch die Lyse der Bakterien entstanden ist.
Unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors und des eingesetzten Volumens
des Phagenlysats kann der Phagentiter, also die Anzahl der Phagen pro
Volumeneinheit berechnet werden.
2. Material und Methoden
Der Versuch wurde wie im Skript beschrieben durchgeführt. Abweichungen von den
im Skript angegebenen Materialien sind hier kurz aufgeführt:
Der Ausgangstiter liegt bei 5 x 108.
Die Verdünnungsreihe des Phagenlysats mit Phagenpuffer wurde bis zu einer
Verdünnung von 10-8 durchgeführt. Wie im Skript beschrieben werden die letzten vier
Verdünnungen für den Versuch verwendet. Allerdings werden Doppelbestimmungen
der Verdünnungsstufe 10-6 und 10-7 durchgeführt.
3. Ergebnisse
Tab. 1: Anzahl der gebildeten Plaques bei verschiedenen Verdünnungsstufen
Verdünnungsstufe der
Anzahl der Plaques pro Platte
Phagenausgangslösung
10-5
294
10
-6
28
10
-6
61
10
-7
8
10
-7
6
10
-8
0
Kontrolle (Bakterien und Puffer ohne Phagen)
0
Berechnung des Phagentiters:
Anzahl der Plaques x Verdünnungsfaktor Phagen
ml Probe Phagenlysat
Anzahl der Phagen / ml PhagenlysatSeite
[pfu/ml]
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Berechnung:
Verdünnungsfaktor 105:
294 x 105 / 0,1ml = 2,94 x 108 pfu/ml
Verdünnungsfaktor 106:
[(28+61)/2] x 106 / 0,1ml = 4,45 x 108 pfu/ml
Verdünnungsfaktor 107:
[(8+6)/2] x 107 / 0,1ml = 7 x 108 pfu/ml
Mittelwert:
(7 x 108 + 4,45 x 108 + 2,94 x 108) / 3 = 4,797 x 108 pfu/ml
4. Diskussion
Die Ergebnisse zeigen, dass bei einer geringeren Verdünnung mehr Plaques
entstehen. Geht man davon aus das jedes Plaque aus einem freien Phagen
entstanden ist, ist es nicht verwunderlich, wenn bei einer geringeren Verdünnung
mehr Plaques entstehen, da mehr Phagen in dem Lysat vorliegen.
Der berechnete Phagentiter liegt bei 4,794 x 108 pfu/ml. Dieser Wert entspricht
nahezu dem der eingesetzten Konzentration von 5 x 108 pfu/ml. Dies lässt darauf
schließen, dass in der Phagenausgangslösung fast alle Phagen funktionstüchtig
waren und die Zellen befallen haben.
5. Literatur
Madigan, M.: Brock. Biology of Mikroorganisms, Heidelberg, 2001
Schlegel, Hans G.: „Allgemeine Mikrobiologie“, 7. überarbeitete Auflage, Thieme
Verlag, Stuttgart, 1992
Skript „Übungen in Mikrobiologie F1-Teil2a“
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