Neurospora crassaals Modellorganismus im

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WISSENSCHAFT
Functional Genomics
MINOU NOWROUSIAN
LEHRSTUHL FÜR ALLGEMEINE UND MOLEKUL ARE BOTANIK, RUHR-UNIVERSITÄT
BOCHUM
Neurospora crassa ist der erste Hyphenpilz, dessen Genom vollständig
sequenziert wurde. Zurzeit werden Deletionsmutanten von allen 10.000
vorhergesagten Genen hergestellt; außerdem wurden GesamtgenomMikroarrays etabliert. Damit ist N. crassa ein vielseitiges Modellsystem
für die molekulare Analyse genetischer Regulationsmechanismen in
Eukaryoten.
ó Pilze (Eumycota, „echte Pilze“) stellen eine
artenreiche Gruppe von Eukaryoten dar,
deren Vertreter in nahezu allen Ökosystemen
anzutreffen sind. Neben ein- oder wenigzelligen Arten gibt es eine große Anzahl vielzelliger Pilze, die Hyphenpilze. Ihre Zellen
wachsen in Form von lang gestreckten Fäden
(Hyphen), welche durch Verzweigung und
Fusion netzartige Myzelien ausbilden können. Zusätzlich können sich Hyphenpilze
meist durch sexuelle oder asexuelle Sporen
vermehren. Eine Reihe von Hyphenpilzen aus
der Gruppe der Ascomyceten ist saprophytisch, also in der Lage, auf totem organischen
Substrat zu wachsen. Sie lassen sich daher
meist leicht im Labor kultivieren, sodass sie
bereits seit Jahrzehnten als Modellorganismen für die Untersuchung verschiedener biochemischer, genetischer und molekularbiologischer Fragestellungen verwendet werden.
Hierzu zählt neben Aspergillus nidulans
besonders Neurospora crassa (im weiteren
Verlauf nur Neurospora genannt), der in den
letzten Jahren eine Vorreiterrolle bei der Etablierung von Genomics- und Functional Genomics-Techniken bei Hyphenpilzen gespielt
hat.
Neurospora: ein Pilz für alle Fälle
Neurospora ist ein haploider, saprophytischer
Ascomycet, der sich sowohl sexuell als auch
vegetativ vermehren kann (Abb. 1). Neurospora hat eine lange Tradition als Modellsystem[1]. Bereits in der ersten Hälfte des letzten Jahrhunderts wurde dieser Pilz von Ber-
nard Dodge für klassisch-genetische Studien
genutzt, und in den 40er Jahren konnten
George Beadle und Edward Tatum durch die
Analyse von auxotrophen Neurospora-Mutanten die Ein-Gen-ein-Enzym-Theorie aufstellen (Nobelpreis 1958). Seit den 70er Jahren
wurden molekulargenetische Methoden für
Neurospora etabliert, sodass dieser Pilz ein
wichtiger Modellorganismus für die Untersuchung der Lichtrezeption und der circadianen Rhythmik sowie für die Analyse von Differenzierungsprozessen bei Hyphenpilzen
wurde[2]. Weiterhin war Neurospora einer der
ersten Organismen, bei denen Faktoren identifiziert wurden, die essenziell für RNAi sind,
das hier zuerst unter dem Begriff „Quelling“
beschrieben wurde[3]. Zusätzlichen Auftrieb
als Modellsystem erhielt Neurospora dadurch,
dass das Genom als erstes Hyphenpilzgenom
sequenziert und öffentlich zugänglich
gemacht wurde[4].
Das Neurospora-Genom-Projekt
Das Neurospora-Genom hat eine Größe von
etwa 40 Mb und kodiert für etwa 10.000 Gene.
Ausgehend von der Genomsequenz wurde im
Jahr 2004 das Neurospora-Genom-Projekt
begonnen, bei dem im Rahmen von vier Teilprojekten eine Reihe von Functional-Genomics-Ressourcen für Neurospora etabliert werden (Abb. 2). Hierzu zählt die Erzeugung von
Deletionsmutanten für alle der rund 10.000
vorhergesagten offenen Leserahmen (ORFs)
sowie die Herstellung von GesamtgenomMikroarrays. Weiterhin sollen EST(expressed
sequence tag)- sowie SNP(single nucleotide
polymorphism)-Datenbanken angelegt werden, die zur verbesserten Annotation des
Genoms sowie zur Kartierung von Mutationen genutzt werden können. Außerdem wird
die manuelle Annotation des Genoms durch
die Neurospora-Community vorangetrieben,
um experimentelle Ergebnisse mit den
Genomdaten zu verknüpfen. Hierzu zählen
beispielsweise Expressionsdaten oder Mutantenphänotypen für einzelne Gene, die in
die Genomdatenbank integriert werden. Das
Neurospora-Genom-Projekt wird von verschiedenen Labors in den USA koordiniert,
es sind aber auch Kooperationspartner aus
anderen Ländern beteiligt[5]. So wurde ein
Teil der Sequenzierung sowie der Annotation
am MIPS (Munich Information Center for Protein Sequences) durchgeführt[6]. Sämtliche
Ergebnisse und Ressourcen wie Deletionsmutanten und Mikroarrays sind vollständig
öffentlich und stehen allen interessierten Forschern zur Verfügung. Im Folgenden werden
das Deletionsmutanten- sowie das Mikroarray-Projekt genauer vorgestellt, da beide
bereits weit fortgeschritten sind und die daraus hervorgehenden Ressourcen von einer
breiten Gruppe von Anwendern genutzt werden können.
Gesamtgenom-Mikroarrays
Die Mikroarray-Technologie ist eine Hochdurchsatz-Anwendung, welche die gleichzeitige Hybridisierung von hunderten bis tausenden Träger-gebundenen DNA-Sonden
ermöglicht. Mikroarrays werden besonders
für Expressionsanalysen verwendet. Dabei
werden die DNA-Sonden auf dem Trägermaterial mit revers transkribierter RNA, dem
Target, hybridisiert. Mikroarray-Expressionsanalysen können beispielsweise dazu
genutzt werden, Mutanten oder bestimmte
physiologische Zustände zu charakterisieren
sowie bisher nicht-charakterisierte Gene in
funktionelle Gruppen einzuordnen. Die Vorhersage von rund 10.000 ORFs im Neurospora-Genom erlaubte die Herstellung von Mikroarrays, die jeweils ein Oligonukleotid für
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Neurospora crassa als Modellorganismus
im „postgenomischen“ Zeitalter
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Die Oligonukleotide werden auf Glas-Objektträger aufgebracht („gespottet“); die Arrays
sind über das Fungal Genetics Stock Center
(FGSC) zu beziehen. Die GesamtgenomMikroarrays wurden bereits dazu verwendet,
um Transkriptionsprofile für die Keimung der
Makrokonidiosporen zu erstellen; weiterhin
wurde die transkriptionelle Regulation der
Aminosäurebiosynthese, die cross pathway
control, auf Gesamtgenomebene untersucht[7, 8]. Diese Untersuchungen sind Teil
eines umfassenden Projekts, bei dem das
Basis-Transkriptom von Neurospora erstellt
werden soll. Ziel ist es hierbei, Transkriptionsprofile für eine Reihe von unterschiedlichen Wachstumsbedingungen sowie verschiedenen Entwicklungsstadien (Abb. 1) zu
ermitteln, die als Grundlage für nachfolgende Analysen dienen können. Zusätzlich können die Arrays auch für die Analyse von
Mutanten verwendet werden, und sie lassen
sich auch für Hybridisierungen mit Targets
aus anderen Hyphenpilzen einsetzen (s. u.).
˚ Abb. 1: Lebenszyklus von Neurospora crassa. Das vegetative Myzel von Neurospora ist in der
Lage, zwei verschiedene Formen von asexuellen Sporen zu bilden, nämlich die meist mehrkernigen, orange gefärbten Makrokonidien sowie die kleineren, oft einkernigen Mikrokonidien. Im Verlauf der sexuellen Entwicklung bilden sich am vegetativen Myzel Ascogone (weibliche Gametangien). Vom Ascogon geht eine Trichogyne (Empfängnishyphe) aus, die mit einem Konidium oder
auch dem vegetativen Myzel eines Neurospora-Stamms vom entgegengesetzten Kreuzungstyp
verschmelzen kann. Bei Neurospora gibt es zwei Kreuzungstypen (A und a), und nur Stämme mit
verschiedenen Kreuzungstypen können sich gegenseitig befruchten (heterothallischer Lebenszyklus). Nach der Befruchtung werden vom Ascogon die ascogenen Hyphen ausgebildet, die jeweils
zwei Kerne mit verschiedenen Kreuzungstypen (gelb und rot) enthalten. Die Ascogone werden von
sterilen Hyphen umschlossen, welche die Fruchtkörperhülle bilden und zuerst einen Vorfruchtkörper (Protoperithezium) und später das Perithezium bilden. Im Inneren des Fruchtkörpers entwickeln sich die ascogenen Hyphen zu Asci, dabei kommt es zu Karyogamie (K), Meiose (M) und
postmeiotischer Mitose (PM), sodass acht Ascosporen pro Ascus entstehen. Die reifen Asci werden aus dem Perithezium ausgeschleudert.
jeden ORF tragen, sodass alle vorhergesagten Gene auf den Mikroarrays repräsentiert
sind. Bei den Oligonukleotiden handelt es sich
um 70mere, die so ausgewählt wurden, dass
sie wenig interne Sequenzwiederholungen
enthalten, einen relativ einheitlichen GCGehalt aufweisen und bevorzugt in der 3’Region des jeweiligen Leserahmens liegen[7].
Ein weiterer Teil des Neurospora-Genom-Projekts ist die Erzeugung von Deletionsmutanten für alle vorhergesagten ORFs[9]. Hierzu
werden Gendisruptionskassetten erstellt, bei
denen das hph-Gen, das Resistenz gegen das
Antibiotikum Hygromycin vermittelt, von
DNA-Fragmenten flankiert wird, die Bereichen stromauf- und stromabwärts des zu deletierenden Gens entsprechen. Die flankierenden Neurospora-DNA-Fragmente haben eine
Länge von 1,0–1,3 kb. Diese Fragmente sowie
ein das hph-Gen enthaltendes Fragment werden in Saccharomyces cerevisiae transformiert,
wo sie durch homologe Rekombination über
kurze, überlappende Enden zur Disruptionskassette assembliert werden. Die gesamte
Kassette kann dann durch PCR amplifiziert
und zur Transformation von Neurospora eingesetzt werden, um das Wildtyp-Allel des
Gens durch homologe Rekombination innerhalb der flankierenden Bereiche durch das
hph-Gen zu ersetzen[9]. Bei Neurospora wie
auch bei den meisten anderen Hyphenpilzen
integriert transformierte DNA allerdings
meist an beliebiger Stelle (ektopisch) ins
Genom. Die Rate der homologen Integration
liegt oft deutlich unter fünf Prozent, was für
ein Hochdurchsatz-Projekt zur Erzeugung von
Transformanten mit homologer Rekombination sehr nachteilig ist. Abhilfe schaffte hier
die Verwendung spezieller Rezipientenstämme, die Mutationen in den Genen ku70 (mus51) oder ku80 (mus-52) tragen. Diese Gene
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Ein Knock-out-Stamm für jedes Gen
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¯ Abb. 2: Das
NeurosporaGenom-Projekt.
Die Genomsequenz sowie
Annotationsdaten
sind öffentlich
zugänglich, Deletionsmutanten
sowie Mikroarrays sind über
das FGSC erhältlich.
sind für die Verbindung nicht-homologer
DNA-Stränge essenziell und damit auch für
die ektopische Integration. Mutationen in
einem der Gene führen daher zu einer drastisch verringerten Rate der nicht-homologen
Integration[10]. Infolgedessen haben nahezu
alle erhaltenen Transformanten die Disruptionskassette durch homologe Rekombination
am gewünschten Genort integriert und stellen somit Knock-out-Mutanten dar. Bisher
sind mehr als 3.000 Knock-out-Stämme
erzeugt worden, die über das FGSC bestellt
werden können. Die Reihenfolge der Erzeugung der Mutanten richtet sich nach
der Nachfrage durch Neurospora-Forscher.
Wunsch-Mutanten können per E-Mail bestellt
werden ([email protected]). Zukünftig sollen für ausgewählte Knock-out-Mutanten Transkriptionsprofile mithilfe der Gesamtgenom-Arrays erzeugt werden, um so die
Funktion einzelner Gene im Gesamtorganismus besser verstehen zu können.
Neurospora-Ressourcen als
Werkzeuge für die Erforschung
anderer Organismen
Die Functional-Genomics-Ressourcen für Neurospora können zum Teil auch für die Arbeit
mit anderen Pilzen genutzt werden. So ist es
möglich, cross species-Mikroarray-Hybridisierungen durchzuführen, bei denen Targets
aus der RNA eines anderen Hyphenpilzes mit
den Neurospora-Gesamtgenom-Arrays hybridisiert werden. Voraussetzung hierfür ist,
dass die zweite Art genügend Sequenzidentität zu Neurospora aufweist. Dies ist beispielsweise bei dem Ascomyceten Sordaria
macrospora der Fall, für den gezeigt werden
konnte, dass die Nukleinsäure-Identität zu
Neurospora innerhalb von kodierenden Regionen fast 90 Prozent beträgt[11]. Cross speciesHybridisierungen mit S. macrospora-Targets
auf den Neurospora-Gesamtgenom-Arrays verliefen erfolgreich und konnten genutzt werden, um den Einfluss zweier Entwicklungsgene auf die Fruchtkörperdifferenzierung in
S. macrospora zu untersuchen[12].
Auch das Deletionsmutanten-Projekt hat
große Vorteile für die Arbeit mit anderen
Organismen, nicht nur für Pilze, sondern auch
für andere Gruppen, da nun NeurosporaMutanten einfach bestellt und für vergleichende Analysen herangezogen werden können. So kann beispielsweise festgestellt werden, ob die Deletion eines bestimmten Gens
in Neurospora dieselbe Wirkung auf zellulärer oder organismischer Ebene hat wie die
Deletion des orthologen Gens bei anderen
Organismen. Hierdurch ist es viel einfacher,
Faktoren zu identifizieren, deren Wirkung
im Lauf der Evolution konserviert ist oder die
eine Änderung ihrer zellulären Funktion
erfahren haben. Für Spezies, bei denen die
Herstellung von Deletionsmutanten schwierig
ist, kann der Phänotyp der Neurospora-Mutante oftmals als erster Anhaltspunkt für die
mögliche Funktion eines Gens dienen.
Die Kombination des sequenzierten
Genoms mit Gesamtgenom-Mikroarrays und
einer genomweiten Kollektion von Knock-outMutanten macht Neurospora zu einem einzigartigen Modellorganismus im Bereich der
vielzelligen Eukaryoten. Derartige konzertierte Anstrengungen gibt es bei Pilzen bisher
nur für die einzellige Hefe S. cerevisiae, und
es ist zu erwarten, dass Neurospora hierdurch
auch weiterhin einer der wichtigsten Modellorganismen für die allgemeine Zellbiologie
sowie für die Erforschung pilzspezifischer
Fragestellungen sein wird.
Danksagung
Ich möchte Prof. Dr. Ulrich Kück für seine
Unterstützung, Dr. Birgit Hoff und Ines Engh
für die kritische Durchsicht des Manuskripts
und der Deutschen Forschungsgemeinschaft
für die Förderung danken.
ó
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Korrespondenzadresse:
Dr. Minou Nowrousian
Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik
Fakultät für Biologie und Biotechnologie
Ruhr-Universität Bochum
Universitätsstraße 150
D-44801 Bochum
Tel.: 0234-3224588
Fax: 0234-3214184
[email protected]
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AUTORIN
Minou Nowrousian
Jahrgang 1971. 1991–1996 Biologiestudium an der Ruhr-Universität Bochum.
1996–1998 Promotion bei Prof. Dr. Ulrich Kück am Lehrstuhl für Allgemeine und
Molekulare Botanik in Bochum. 1999–2001 Postdoc bei Prof. Dr. Jay Dunlap und
Prof. Dr. Jennifer Loros am Department of Genetics, Dartmouth Medical School
(Hanover, USA). Seit 2002 Postdoc/Projektleiterin am Lehrstuhl für Allgemeine und
Molekulare Botanik, Ruhr-Universität Bochum.
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