Disskompl 10.11.09 - TiHo Bibliothek elib

Tierärztliche Hochschule Hannover
Vergleich in vitro produzierter Embryonen
hinsichtlich ihrer Qualität nach dem
Kryokonservieren durch Vitrifikation oder
konventionelle Kryokonservierung
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Hanna Stinshoff
Oldenburg
Hannover 2009
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Christine Wrenzycki
Klinik für Rinder, Reproduktionsmedizinische
Einheit der Kliniken
1. Gutachterin: Prof. Dr. Christine Wrenzycki
2. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2009
Die vorliegende Arbeit wurde durch die H.W. Schaumann Stiftung gefördert.
Meinen Eltern und meiner Großmutter
Inhaltsverzeichnis
___________________________________________________________________
1. Einleitung ______________________________________________________ 1
2. Literatur ________________________________________________________ 3
2.1. In-vitro-Produktion von Embryonen __________________________________ 3
2.2. Grundlagen der Kryokonservierung __________________________________ 9
2.2.1. Physikalische Vorgänge beim Einfrieren von lebenden Zellen ____________ 9
2.2.2. Kryoprotektiva________________________________________________ 11
2.2.2.1. Nichtpenetrierende Kryoprotektiva_______________________________ 12
2.2.2.2. Penetrierende Kryoprotektiva __________________________________ 13
2.3. Konventionelle Gefrierverfahren ___________________________________ 16
2.3.1. Langsame Gefrierverfahren _____________________________________ 16
2.3.2. Schnelle Gefrierverfahren_______________________________________ 17
2.4. Vitrifikation ____________________________________________________ 19
2.4.1. Offene Systeme ______________________________________________ 21
2.4.2. Geschlossene Systeme ________________________________________ 23
2.4.3. Weitere Vitrifikationsmethoden ___________________________________ 24
2.5. Qualität in vitro produzierter Rinderembryonen nach dem Auftauen ________ 27
2.6. Entwicklungsrelevante Gentranskripte präimplantatorischer Rinderembryonen 32
2.6.1. DNA-Methyltransferase 3A (DNMT3A) _____________________________ 34
2.6.2. Glukosetransporter 1 (SLC2A1) und Glukosetransporter 3 (SLC2A3) _____ 36
2.6.3. Heat Shock Protein 70 (HSP70-1) ________________________________ 38
2.6.4. Interferon τ (IFNτ) _____________________________________________ 39
2.6.5. Zona occludens Protein 1 (TJP1) _________________________________ 40
2.6.6. E-cadherin (CDH1) ____________________________________________ 42
2.6.7. Desmocollin II (DSCII) _________________________________________ 43
3. Material und Methoden __________________________________________ 46
3.1. In-vitro-Produktion (IVP) _________________________________________ 46
3.1.1. Herkunft der Ovarien __________________________________________ 46
3.1.2 Vorbereitung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe____________ 46
3.1.3. In-vitro-Maturation_____________________________________________ 49
3.1.4. Fertilisation _________________________________________________ 50
Inhaltsverzeichnis
___________________________________________________________________
3.1.5. In-vitro-Kultur ________________________________________________ 51
3.2. Konventionelle Kryokonservierung _________________________________ 51
3.3. Vitrifikation ____________________________________________________ 53
3.4. Auftauen nach konventioneller Kryokonservierung _____________________ 55
3.5. Auftauen nach Vitrifikation ________________________________________ 56
3.6. Qualitätskontrolle der Embryonen nach dem Auftauen __________________ 58
3.6.1. Reexpansions- und Schlupfrate __________________________________ 58
3.6.2. Färbung ____________________________________________________ 58
3.6.3. Messenger RNA Analyse zur Darstellung entwicklungsrelevanter
Gentranskripte in bovinen präimplantatorischen Embryonen _________________ 60
3.6.3.1. Isolierung der mRNA _________________________________________ 61
3.6.3.2. Reverse Transkription (RT) ____________________________________ 62
3.6.3.3. Polymerase Kettenreaktion (PCR)_______________________________ 64
3.7. Statistische Analyse_____________________________________________ 67
3.8. Allgemeiner Versuchsaufbau______________________________________ 69
3.8.1. Produktion der In-vitro-Embryonen und Etablierung der Vitrifikation und
konventionellen Kryokonservierung boviner Blastozysten ___________________ 69
3.8.2. Darstellung verschiedener entwicklungsrelevanter Gene aus vitrifizierten und
konventionell kryokonservierten Rinderembryonen ________________________ 69
3.8.3. Versuchsanordnung ___________________________________________ 70
4. Ergebnisse ____________________________________________________ 71
4.1. Erstellung der in vitro produzierten Embryonen________________________ 71
4.2. Bestimmung der Reexpansions- und Schlupfraten _____________________ 71
4.3. Ergebnisse der Zellfärbung _______________________________________ 73
4.4.1. HSP70-1, SLC2A1 und TJP1 ____________________________________ 78
4.4.2. SLC2A3 und DNMT3A _________________________________________ 79
4.4.3. IFNτ _______________________________________________________ 80
4.4.4. CDH1 ______________________________________________________ 80
4.4.4. CDH1 ______________________________________________________ 81
4.4.5. DSC2 ______________________________________________________ 82
5. Diskussion ____________________________________________________ 83
Inhaltsverzeichnis
___________________________________________________________________
5.1. Beurteilung der Reexpansionsraten, Schlupfraten und Zellzahlen _________ 86
5.2. Genexpression nach dem Auftauen ________________________________ 90
5.3. Schlussfolgerungen _____________________________________________ 96
6. Zusammenfassung______________________________________________ 98
7. Summary _____________________________________________________ 101
8. Verzeichnisse _________________________________________________ 104
8.1.Verzeichnis der Tabellen ________________________________________ 104
8.2. Abkürzungsverzeichnis _________________________________________ 106
8.3. Abbildungsverzeichnis __________________________________________ 110
9. Anhang ______________________________________________________ 112
9.1. Einzeldaten der Zellzahlzählung nach Differentialfärbung _______________ 112
9.2. Einzeldaten der RT-qPCR _______________________________________ 113
9.3. Medien IVP __________________________________________________ 114
10. Literaturverzeichnis ___________________________________________ 119
Einleitung
___________________________________________________________________
1. Einleitung
Mit fortschreitender Weiterentwicklung und Anwendung der Biotechnologien in der
Reproduktionsmedizin werden jährlich große Zahlen an Embryonen generiert, die
frisch oder nach dem Tiefgefrieren auf Empfängertiere übertragen werden können.
Diese Embryonen werden zum einen in vivo erzeugt und durch Spülungen erhalten.
Zum anderen entstehen sie aus Oozyten, die durch Ovum Pick Up (OPU) erhalten
wurden oder entstehen nach Ovarektomie aus den so gewonnenen KumulusOozyten-Komplexen (KOK). Eine weitere Möglichkeit KOK zu gewinnen besteht
darin, sie aus Ovarien, die vom Schlachthof stammen zu isolieren.
Im Jahr 2007 wurden weltweit über 400000 transfertaugliche Embryonen in vitro
generiert. Von diesen konnten knapp 250000 Embryonen übertragen werden, von
denen aber nur knapp 30000 zuvor kryokonserviert worden waren (THIBIER 2008).
Anhand dieser Zahlen lässt sich ermessen, dass sowohl die In-vitro-Produktion mit
ihren anhängenden Biotechnologien als auch die Kryokonservierung in den letzten
Jahren immens an Bedeutung gewonnen hat. Die Kryokonservierung scheint jedoch
immer noch nicht optimal für in vitro gewonnene Embryonen einsetzbar zu sein.
Dass sich in vitro produzierte Embryonen im Vergleich zu ihren in vivo generierten
Gegenstücken in vielen Punkten unterscheiden, ist vielfach untersucht worden. So
z.B.
sind
Unterschiede
Entwicklungsrate,
hinsichtlich
Sensitivität
Morphologie,
Temperaturen
Farbe,
gegenüber,
Dichte,
Zellzahl,
Einfrierbarkeit,
Trächtigkeitsraten nach dem Transfer (GREVE et al. 1994) und in der Expression
spezifischer entwicklungsrelevanter Gentranskripte (WRENZYCKI et al. 1998;
WRENZYCKI et al. 2007) im Vergleich zu ihren in vivo erzeugten Gegenstücken
erkennbar.
Anfang der 70er Jahre wurden die ersten Embryonen – in diesem Fall murinen
Ursprungs – konventionell kryokonserviert (Whittingham 1971). Dies ermöglichte es,
Embryonen zu lagern, ohne dass sie unbrauchbar wurden. Gleichzeitig entstanden
durch das Einfrieren neue Schädigungsgefahren, wie z.B. durch intrazelluläre
Eisbildung. Als RALL und FAHY 1985 die Methode der Vitrifikation das erste Mal
1
Einleitung
___________________________________________________________________
erfolgreich zur Kryokonservierung von Embryonen einsetzten, war die Möglichkeit
eröffnet, Embryonen ohne die Gefahren der Eiskristallbildung zu konservieren.
Sowohl für die konventionelle Kryokonservierung als auch für die Vitrifikation wurden
diverse Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, die Methoden zu optimieren. So
wurden u.a. für das Verfahren der konventionellen Kryokonservierung immer neue
Kryoprotektiva
angewandt,
um
den
Erfolg
des
Einfrierens
zu
verbessern
(WHITTINGHAM 1971; BIELANSKI u. HARE 1988; SEIDEL et al. 1990; GUTIÉRREZ
et al. 1993; SOMMERFELD u. NIEMANN 1999).
Auch für die Vitrifikation wurden im Laufe der
letzten Jahre die Protokolle so
verändert, dass deutliche Verbesserungen in den Überlebensraten nach dem
Auftauen erzielt werden konnten. Hierbei wurde hauptsächlich an einer Erhöhung der
Kühlraten, wie z.B. durch eine Verringerung des Probenvolumens (ARAV et al.
1993b; ARAV et al. 2002; YAVIN et al. 2009), gearbeitet.
Vergleiche zwischen den Ergebnissen, also den Überlebens- und Trächtigkeitsraten
nach Transfer, beider Methoden auf morphologischer Ebene ergaben bislang, dass
die Vitrifikation potentiell besser zur Kryokonservierung in vitro produzierter
Embryonen geeignet zu sein scheint (DOBRINSKY 2002; KULESHOVA u. LOPATA
2002).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Vergleich zwischen beiden Methoden nicht
nur
auf
morphologischer
Ebene
durchzuführen,
sondern
zusätzlich
auf
molekulargenetischer Ebene festzustellen, ob die Kryokonservierung an sich und die
Art der Tiefgefrierung einen Einfluss auf die Qualität der Embryonen hat.
Es ist bekannt, dass die Herkunft der Embryonen (in vivo vs. in vitro) einen Einfluss
auf die mRNA–Expression verschiedener Gene hat. So wird z.B. bei in vitro
produzierten bovine Embryonen signifikant mehr Interferon τ (WRENZYCKI et al.
2001a) exprimiert als bei ihren in vivo generierten Gegenstücken, dafür jedoch
signifikant weniger Zona Occludens 1 (MILLER et al. 2003). Die Frage, die im
Rahmen
der
angefertigten
Arbeit
erörtert
werden
sollte,
war,
ob
die
Kryokonservierung und die Art nach der eingefroren wurde, einen Einfluss auf die
Expression verschiedener entwicklungsrelevanter Gentranskripte in vitro produzierter
Embryonen aufweist.
2
Literatur
___________________________________________________________________
2. Literatur
2.1. In-vitro-Produktion von Embryonen
Die In-vitro-Produktion (IVP) beinhaltet methodisch drei Schritte. Zunächst die Invitro-Maturation oder –Reifung (IVM), darauf folgend die In-vitro-Fertilisation oder
-Befruchtung (IVF) und anschließend die In-vitro-Culture oder –Kultur (IVC; SIRARD
u. COENEN 2006).
Die In-vitro-Produktion bildet nicht nur die Grundlage für weitere biotechnologische
Methoden [erfolgreiche Nutzung von beim Ovum-Pick-Up (OPU) gewonnenen
Eizellen, somatischer Kerntransfer u.a.], sondern hat in den letzten Jahren auch
mehr und mehr Praxisrelevanz gewonnen. Im Jahr 2007 konnten weltweit fast
435000 transfertaugliche bovine Embryonen in vitro produziert werden. Über 245000
dieser Embryonen wurden transferiert (THIBIER 2008).
Über die ersten erfolgreichen In-vitro-Fertilisationen wurde in den späten 50ern
(CHANG 1959) beim Kaninchen und den 60er Jahren bei der Maus (WHITTINGHAM
1968) berichtet. Die Fertilisation stellte lange Zeit den limitierenden Faktor bei der Invitro-Produktion dar, da es schwer möglich war, die Kapazitation der Spermien, die in
vivo im weiblichen Reproduktionstrakt stattfindet, in vitro nachzuempfinden
(BRACKETT et al. 1982). Das erste in vitro produzierte Kalb wurde im Januar 1981
geboren (BRACKETT et al. 1982).
Heute werden hauptsächlich zwei Verfahren angewendet, um Kumulus-OozytenKomplexe (KOK) für die IVP zu gewinnen. Zum einen werden KOK durch OPU vom
lebenden Tier gewonnen, zum anderen werden Ovarien post mortem von frisch
geschlachteten Tieren gesammelt. Die Gewinnung der KOK erfolgt mittels Aspiration
mit Kanüle und Spritze oder auch mittels der Slicing-Methode (ECKERT u.
NIEMANN 1995). Die so gewonnenen KOK werden dann anhand ihrer Morphologie
in für die IVP-tauglich und –nicht-tauglich eingeteilt (KHURANA u. NIEMANN 2000;
KELLY et al. 2007). Hierbei ist vor allem die Anzahl der die Eizelle umgebenden
Kumuluszellen von Bedeutung, um eine vollständige Reifung der Eizelle und spätere
Entwicklung zur Blastozyste zu erreichen. Ebenso beeinflussen Reifung, Fertilisation
3
Literatur
___________________________________________________________________
und Kultivierung in der Gruppe die Anzahl der gewonnenen Morulae und
Blastozysten positiv.
Die In-vitro-Maturation der KOK beginnt direkt im Anschluss an ihre Selektion.
Hierbei wird die zuvor im Ovar arretierte Prophase beendet und die weitere
meiotische Teilung im Reifungsmedium fortgesetzt (NIEMANN u. MEINECKE 1993;
SIRARD u. COENEN 2006). In Abhängigkeit vom für die Reifung verwandten
Medium und dem Zustand der verwandten Eizellen sind Maturationsraten von 66 –
95% möglich (ADONA et al. 2008).
Nach Abschluss der Reifung erfolgt die In-vitro-Fertilisation. Vorraussetzung hierfür
ist, dass Kapazitation und Akrosomenreaktion bei dem zu verwendenden Sperma
stattgefunden haben. Dies beides sind physiologische Vorgänge, die die Befruchtung
erst ermöglichen (BRACKETT 1993). Ein Zusatz von Heparin bei der Aufbereitung
des Spermas induziert die Akrosomenreaktion und resultiert letztlich in einer
wesentlich höheren Anzahl von befruchtungsfähigen Spermien (NIEMANN u.
MEINECKE 1993). Die in vitro gereiften KOK werden mit aufgereinigtem Sperma
koinkubiert. Entscheidend ist hier, dass die Spermien eine ausreichende Motilität
besitzen und kapazitiert sind. Um solche Spermien zu erhalten, wird eine
Dichtegradientenzentrifugation mit dem aufgetautem Bullensperma durchgeführt.
Früher wurde für diesen Vorgang häufig Isopercoll genutzt. Dieses ist jedoch
aufgrund
fehlender
klinischer
Prüfung
weder
für
den
human-
noch
den
veterinärmedizinischen Bereich zugelassen. Stattdessen werden heute zugelassene,
kommerziell erhältliche Silikate verwandt (Spermfilter®, Cryo Bio System; Pure
Sperm®
und
Bovi
Pure®,
Nidacon).
Bei
der
In-vitro-Fertilisation
werden
Befruchtungsraten von 70-90% erreicht (WRENZYCKI et al. 2007).
Nach der Befruchtung werden die vermeintlichen Zygoten in ein Kulturmedium
überführt, in dem sie verbleiben, bis sie das gewünschte Entwicklungsstadium
(Morulae oder Bastozysten) erreicht haben. Hierbei werden nach 6-8 Tagen Kultur
Entwicklungsraten (Morulae und Blastozysten) von 25-40% erreicht (KESKINTEPE
u. BRACKETT 1996; RIZOS et al. 2003). Diese Vorgänge sind zusammenfassend
schematisch in Abbildung 1 dargestellt.
4
Literatur
___________________________________________________________________
Spermien
Unbefruchtete
Eizellen
In-vitro-Reifung 18-27 Stunden
In-vitro-Kapazitation
Initro-Befruchtung
6-24 Stunden
In-vitro-Kultivierung
6-8 Tage
Morulae/Blastozysten
Abbildung 1: Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion (mod. nach
NIEMANN u. MEINECKE 1993b)
Mit entscheidend für den Erfolg beziehungsweise Verlauf der In-vitro-Produktion sind
die bei den einzelnen Schritten verwandten Medien. Anfänglich wurden häufig
komplexe Medien wie das Tissue Culture Medium 199 (TCM 199) verwandt
(EYESTONE u. FIRST 1989), bei denen dann der Zusatz von undefinierten (z.B.
Serum), semidefinierten (Serumersatzstoffe wie Bovines Serum Albumin - BSA) oder
definierten Stoffen (z.B. Polyvinvlalkohol – PVA) erfolgte. Obwohl diese Medien
erfolgreich
bei
der
In-vitro-Produktion
eingesetzt
wurden,
folgte
eine
Weiterentwicklung der Kultursysteme, um zum einen die Entwicklungsraten zu
optimieren (FARIN et al. 2001). Zum anderen sollte die Qualität der in vitro
produzierten Embryonen verbessert werden. Sie ist immer noch deutlich schlechter
als die der in vivo gewonnenen (NIEMANN et al. 2002). Dies äußert sich unter
anderem bei den Kälbern aus in vitro produzierten Embryonen, die das so genannte
Large Offspring Syndrome (LOS) aufweisen können. Das LOS wird charakterisiert
durch ein signifikant erhöhtes Geburtsgewicht, Polyhydramnion, Hydrops fetalis,
5
Literatur
___________________________________________________________________
verändertes Organwachstum, Defekte der Plazenta, des Skeletts
und des
Immunsystems, sowie durch eine erhöhte perinatale Sterblichkeit (WALKER et al.
1996; KRUIP u. DAAS 1997; YOUNG et al. 1998; RENARD et al. 1999; SINCLAIR et
al. 2000).
Medien, die entwickelt wurden, um diesem Problem entgegenzuwirken, sind einfache
Medien und basieren häufig auf Modifikationen des Synthetic Oviduct Fluid (SOF)Mediums [Zusatz von Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder PVA; KESKINTEPE u.
BRACKETT 1996]. Zu den einfachen Medien zählt auch das Hamster Embryo
Culture Medium (HECM). Durch Verwendung dieser Medien – TCM 199, SOF,
HECM - konnten Entwicklungsraten von bis zu 40% erreicht werden (KESKINTEPE
u. BRACKETT 1996). Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass die
Entwicklungsraten in definierten Medien geringer sind als in semidefinierten Medien
oder undefinierten Medien (ECKERT u. NIEMANN 1995; WRENZYCKI et al. 1999).
Die
Auswahl
des
Kultursystems
hat
nicht
nur
einen
Einfluss
auf
die
Entwicklungsraten, sondern auch auf die Kryotoleranz der Embryonen. In vitro
produzierte Embryonen lassen sich nach wie vor schlechter kryokonservieren als ihre
in vivo generierten Gegenstücke.
Dieses konnten LONERGAN et al. und RIZOS et al. im Jahr 2001 darlegen. So war
es zum einen möglich zu zeigen, dass der Zusatz von Granulosazellen die
Kryotoleranz der in vitro produzierten Embryonen deutlich erhöht (RIZOS et al.
2001). Zum anderen kultivierten LONERGAN et al. Embryonen in vivo im isolierten
Schafeileiter und erzielten höhere Schlupfraten nach Vitrifikation als bei Kultur im
SOF-System (LONERGAN et al. 2001).
Um die Kryotoleranz zu verbessern, sind ebenfalls unterschiedliche Zusätze zu den
Kulturmedien getestet worden. Der Zusatz von 1%igem BSA zu KCL-angereichertem
Simplex Optimisation Medium (KSOM) statt eines SOF-Zusatzes erbrachte keine
signifikanten Unterschiede in der Gesamtüberlebensrate der Embryonen nach
Vitrifikation (NEDAMBALE et al. 2004). Auch das Charles-Rosenkrans-Medium mit
Zusatz von Aminosäuren wurde eingesetzt (PARK et al. 2006). Der Zusatz von
Serum, wie z.B. Estrus Cow Serum (ECS), in das Kulturmedium ist mit einer
abnormen Anreicherung von Lipidtropfen im Embryo assoziiert (ABE et al. 1999), die
6
Literatur
___________________________________________________________________
dafür verantwortlich sein soll, dass IVP-Embryonen die Kryokonservierung schlechter
überleben (MURAKAMI et al. 1998; RIZOS et al. 2003) als ihre in vivo gewonnenen
Gegenstücke. Der Zusatz der trans10, cis12 konjugierten Linolsäuren (CLA) zum
Kulturmedium erwies sich als positiv in Bezug auf die Kryokonservierbarkeit der in
vitro produzierten Embryonen, da die CLAs den zytoplasmatischen Lipidgehalt der
Embryonen signifikant reduzierten (PEREIRA et al. 2008).
Im direkten Vergleich zwischen konventioneller Kryokonservierung und Vitrifikation
ließ sich so feststellen, dass die vitrifizierten Embryonen eine wesentlich höhere
Reexpansions- und Schlupfrate aufwiesen, wenn das Kulturmedium vor der
Kryokonservierung nicht mit ECS supplementiert worden war (MUCCI et al. 2006).
Einen positiven Effekt auf die Kryokonservierbarkeit wies auch der Zusatz von
Phenazinethosulfat (PES) auf. PES reduziert den cytoplasmatischen Lipidgehalt
deutlich. Dies erhöhte die Kryotoleranz der so vitrifizierten und konventionell
kryokonservierten Embryonen signifikant (BARCELO-FIMBRES u. SEIDEL 2007). Im
Gegensatz dazu hatten andere Arbeitsgruppen, die z.B. am porcinen Modell
arbeiten, Ergebnisse, die zeigen, dass der Zusatz von fetalem Rinderserum (FBS)
sich positiv auf die Überlebensraten nach dem Vitrifizieren auswirkt (MEN et al.
2005).
Ebenfalls positiv wirkte sich der Zusatz von Lipiden zum Kulturmedium vor der
konventionellen Kryokonservierung in Bezug auf die Überlebensfähigkeit boviner
Embryonen nach dem Einfrieren aus (LIM et al. 2008). Einen Überblick hierzu gibt
Tabelle 1. Es werden auch Stoffe zum Kulturmedium hinzugesetzt, um die
Kryokonservierbarkeit der IVP-Embryonen zu verbessern. So konnte durch den
Zusatz von Beta-Mercaptoethanol die Überlebensrate von Embryonen nach dem
Vitrifizieren signifikant verbessert werden. Ebenso hatten so generierte Embryonen
eine höhere Gesamtzellzahl nach Vitrifikation als solche, denen kein BetaMercaptoethanol im Medium zugefügt worden war (NEDAMBALE et al. 2006).
Ebenfalls eine signifikante Verbesserung der Kryokonservierbarkeit konnte der
Zusatz von Cytochalasin B, welches zur Stabilisierung des embryonalen Zytoskeletts
beiträgt, bewirken. Hier wurde eine gesteigerte Überlebensrate nach konventioneller
Kryokonservierung festgestellt (FRANCO u. HANSEN 2006). Der Zusatz von
7
Literatur
___________________________________________________________________
Palmsäure
hingegen
führte
zu
einer
signifikanten
Verschlechterung
der
Überlebensraten nach Vitrifikation (SHEHAB-EL-DEEN et al. 2009).
Tabelle 1: Übersicht über Medienzusätze zur Verbesserung der Kryotoleranz in
vitro produzierter Embryonen
Autor
Spezies
Genutzte
Medien
Art der
Kryokonservierung
Nedambale et
Rind
al. (2004)
KSOM + BSA
(1%)
KSOM + SOF
Vitrifikation
Mucci et al.
(2006)
Rind
Zusatz von
ECS zum
Kulturmedium
Vitrifikation und
konventionelle
Kryokonservierung
Men et al.
(2005)
Zusatz von
Schwein FBS zum
Kulturmedium
Lim et al.
(2007)
Rind
Zusatz von
Lipiden zum
Kulturmedium
Konventionelle
Kryokonservierung
BarcelóFimbres et al.
(2007)
Rind
Zusatz von
FCS oder PES
Vitrifikation und
Konventionelle
Kryokonservierung
Vitrifikation
8
Einfluss auf
Kryotoleranz
Kein signifikanter
Unterschied
zwischen den
beiden Medien
Schlechtere
Überlebensraten
als ohne ECS
Bessere
Überlebensraten
als ohne
Serumzusatz
Bessere
Überlebensraten
als ohne
Lipidzusatz
Zusatz von PES
verbesserte
Kryotoleranz für
beide Verfahren
Literatur
___________________________________________________________________
2.2. Grundlagen der Kryokonservierung
2.2.1. Physikalische Vorgänge beim Einfrieren von lebenden Zellen
Gefrieren ist das Überführen von Wasser aus dem Lösungszustand in die kristalline
Form
(MERYMAN
1956).
Einfriergeschwindigkeit
Beim
verschiedene
Einfrieren
von
physikalische
Zellen
können
Prozesse
je
stattfinden,
nach
die
letztendlich sogar den Tod der Zellen zur Folge haben können. So kommt es zur
Dehydrierung der Zellen, dem intrazellulären Anstieg der Konzentration gelöster
Stoffe und zur Bildung von Eiskristallen (MAZUR 1965).
Bis zu einer Temperatur von -5°C bleiben sowohl die flüssigen Stoffe in der Zelle als
auch die, die sich in der direkten Umgebung der Zelle befinden, flüssig. Dieses
geschieht sowohl durch anwesende Stoffe mit potentiellen kryoprotektiven
Eigenschaften als auch durch den Effekt des Supercoolings. Als Supercooling wird
das Herabsetzen der Temperatur einer Flüssigkeit unter den eigentlichen
Gefrierpunkt, ohne dass sich eine kristalline Form bildet, verstanden.
Bei Temperaturen zwischen -5°C und -15°C gefriert d ie die Zelle umgebende
Flüssigkeit entweder spontan oder die Kristallisation wird durch Eiskristalle ausgelöst
(ein Prozess, der „Seeding“ genannt wird). Nun verlässt bei ausreichend langsamer
Kühlgeschwindigkeit das intrazelluläre Wasser durch Exosmose die Zelle, da der
intrazelluläre Raum ein höheres chemisches Potential besitzt als die gefrorene
Umgebung. So ist es möglich ein chemisches Äquilibrium zu erreichen. Ist die
Geschwindigkeit, mit der eingefroren wird, zu hoch, so hat die Zelle keine Möglichkeit
durch Exosmose ihr Äquilibrium zu erreichen und es entstehen intrazelluläre
Eiskristalle. Die intrazelluläre Eisbildung kann zu Schäden an der Zelle führen (siehe
Kapitel 2.2.2.). Diese Prozesse sind in Abbildung 2 schematisch dargestellt.
9
Literatur
___________________________________________________________________
-2° C
-5°C
Langsames
Einfrieren
Sehr schnelles
Einfrieren
Schnelles
Einfrieren
< - 10°C
=Zellorganelle
= Zellkern
= Eiskristalle
Abbildung 2: Schematische Darstellung der physikalischen Prozesse beim
Einfrieren von lebenden Zellen (mod. nach Mazur 1977)
Diese Schäden haben hauptsächlich zwei Ursachen. Zum einen kann es durch das
verlängerte
Ausgesetztsein
in
konzentrierten
10
Lösungen
zu
schädigenden
Literatur
___________________________________________________________________
Lösungseffekten kommen, zum anderen verursacht intrazelluläre Eisbildung schwere
Zellschäden. Die Größe intrazellulärer Eiskristalle ist ebenfalls abhängig von der
Einfriergeschwindigkeit. Bei sehr hohen Einfriergeschwindigkeiten entstehen kleine
unvollständige
Kristalle,
die
aufgrund
ihres
hohen
Oberflächen-Volumen
Verhältnisses relativ instabil sind. Wird die Zelle anschließend langsam genug
aufgetaut, kommt es während des Auftauens zum Verschmelzen der kleinen Kristalle
zu größeren Kristallen, die dann vollständige Kristallform annehmen und die Zelle
schädigen können.
Die Art der Schäden ist abhängig von der Einfriergeschwindigkeit (MAZUR 1966).
Sind die Gefrierraten zu hoch, so kommt es zu intrazellulärem Gefrieren, sind sie zu
niedrig, so werden Schäden durch Lösungseffekte verursacht.
Die optimale
Einfriergeschwindigkeit wird als solche definiert als die, bei der die Schäden durch
beide Schädigungsformen minimal sind (MAZUR 1970; MAZUR et al. 1972).
2.2.2. Kryoprotektiva
Als Kryoprotektiva werden Stoffe verstanden, die in der Lage sind, durch ihre
chemischen Eigenschaften Schäden, die durch Gefrieren entstehen können, zu
verringern bzw. zu verhindern. Kryoprotektiva werden in zwei Gruppen in
Abhängigkeit
von
ihrem
Verhalten
gegenüber
Zellmembranen
eingeteilt:
penetrierende und nichtpenetrierende Kryoprotektiva (MERYMAN 1971).
Mit der Nutzung von Kryoprotektiva unabhängig welcher Gruppe sie angehören,
entstehen für das zu konservierende Material weitere Gefahren. Es kann zu Schäden
durch Lösungseffekte, die durch das Ausgesetztsein in hochkonzentrierten Lösungen
entstehen,
kommen.
Ebenso
haben
die
meisten
Kryoprotektiva
in
den
Konzentrationen, in denen sie eingesetzt werden, zelltoxische Eigenschaften.
Diesem
Problem
wird
versucht
entgegenzuwirken,
indem
zum
einen
die
Konzentration des jeweiligen Kryoprotektivums geändert wird und zum anderen,
indem der Zeitraum, in dem die Zelle im Kryoprotektivum verbleibt, variiert wird.
11
Literatur
___________________________________________________________________
2.2.2.1. Nichtpenetrierende Kryoprotektiva
Bei nichtpenetrierenden Kryoprotektiva handelt es sich in der Regel um
Makromoleküle und Zucker, die nicht in die Zellen eindringen, sondern ihre
Schutzwirkung von außen erwirken. Ihre Hauptfunktion liegt in der Unterstützung des
osmotischen Abtransportes von Wasser aus der Zelle heraus in die Umgebung.
Dieses Phänomen rechtfertigt ihren Einsatz besonders bei hohen Einfrierraten, da
hier ein schneller Abtransport des intrazellulären Wassers wichtig für den Schutz der
Zelle ist (MERYMAN et al. 1977).
Stoffe, die als nichtpenetrierend bezeichnet werden, sind Makromoleküle wie Ficoll,
Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyvinylalkohl (PVA) ebenso wie die Zucker
Saccharose und Trehalose. Das Wirkungsspektrum von Saccharose und Trehalose
ist ähnlich. Sie finden hauptsächlich Anwendung als Puffersubstanz beim
Ausverdünnen von wieder aufgetauten Embryonen. Hier verhindern sie das
Anschwellen des Embryos, indem sie der Zelle Wasser entziehen (SUZUKI et al.
1990). Der Einsatz von Saccharose bietet sich ebenfalls beim Auftauen von
konventionell kryokonservierten Embryonen an. Die Flüssigkeitssäulen an beiden
Enden des Straws (Abbildung 3), die aus Kryoprotektivum (z.B. Ethylenglycol)
bestehen, werden hierbei durch je eine Säule mit Saccharose ersetzt. Die
Saccharose
dient
als
so
genanntes
Holding-Medium,
mittels
dessen
die
Ausverdünnung des Ethylenglykols (EG) dann direkt beim Auftauen erfolgt, indem
die Flüssigkeit der Säule mit dem Embryo sich mit der in den anderen Säulen
vermischt.
Saccharose
Luft
EG
Luft
EG+Embryo
Luft
EG
Abbildung 3: Aufziehen des Embryos in einer Paillette
Luft
Saccharose
mit Saccharose als
Holding-Medium, das zum direkten Ausverdünnen nach dem Auftauen
verwandt werden kann ( EG =Ethylenglykol)
Dies ermöglicht ein so genanntes One-step-Verfahren, bei dem ein Direkttransfer
ohne vorheriges Ausverdünnen des EGs von konventionell kryokonservierten
Embryonen erfolgt.
12
Literatur
___________________________________________________________________
Vielen Kryoprotektiva wurden bis in die 90er Jahre hinein BSA oder fetales
Kälberserum (FCS) als Proteinquelle zugesetzt. Problematisch daran war jedoch die
Möglichkeit der Kontamination durch Viren wie das bovine Virus Diarrhoe Virus
(BVDV; GUTIERREZ et al. 1993). Um dieser Problematik entgegenzutreten, wurden
anorganische oder synthetische Makromoleküle wie Ficoll, PVP und PVA als Ersatz
für die Proteine gewählt.
Ficoll verhindert beim Auftauen von eingefrorenen Embryonen die Rekristallisation
von Wasser und so damit verbundene Schäden an der Zelle. Weiterhin hilft sein
Einsatz die Konzentration von penetrierenden Kryoprotektiva zu senken, und damit
auch ihre Toxizität zu verringern (PALASZ et al. 1997).
PVP war schon in den 70er Jahren von WHITTINGHAM zur Kryokonservierung von
Mäuseembryonen
verwandt
worden
(WHITTINGHAM
1971).
Er
erreichte
Weiterentwicklungsraten von 69,1 % nach dem Auftauen. Schon kurz darauf wurde
jedoch über die hohe Toxizität des PVPs berichtet (WILMUT u. ROWSON 1973).
Spätere Untersuchungen konnten beweisen, dass die Problematik nicht allein in der
Toxizität des PVPs liegt. So wurde von einer erschwerten Handhabung der
Embryonen berichtet, die auf ein Festkleben der Embryonen am Inneren der Straws
und einem Aufschwimmen zurückzuführen war. Dieses führte zu hohen Verlusten an
Embryonen (SEIDEL et al. 1990).
Die Trächtigkeitsraten sind nach dem Einsatz von 4%igem PVP und PVA als Ersatz
für Serum mit 31% bzw. 25% deutlich niedriger (SEIDEL et al. 1990). Ebenso
konnte eine verringerte Überlebensfähigkeit in vitro produzierter Embryonen beim
Einsatz von PVA als Substitut für Serum festgestellt werden (SOMMERFELD u.
NIEMANN 1999).
2.2.2.2. Penetrierende Kryoprotektiva
Penetrierende Kryoprotektiva entwickeln ihre Schutzwirkung im Vergleich zu
nichtpenetrierenden Kryoprotektiva im intrazellulären Raum. Charakterisierend ist die
Fähigkeit durch die Zellmembran hindurch zu diffundieren. Das Kryoprotektivum
muss vollständig durch die Membran hindurch diffundieren, da es ansonsten zu einer
13
Literatur
___________________________________________________________________
schädlichen Dehydrierung der Zelle kommen kann. Weiterhin charakteristisch für
penetrierende Kryoprotektiva ist das geringe molare Gewicht. Penetrierende
Kryoprotektiva ohne Beimengung anderer Kryoprotektiva werden hauptsächlich bei
konventionellen Gefrierverfahren eingesetzt, bei denen niedrige Einfrierraten zum
Einsatz kommen (MERYMAN 1971). In Kombination mit nichtpenetrierenden Stoffen
werden sie auch zur Vitrifikation verwandt.
Es handelt sich hierbei um Stoffe wie Glycerin, Dimethylsulfoxid (DMSO), Propandiol
oder Ethylenglykol (EG).
Glycerin wurde 1949 zum ersten Mal erfolgreich beim Kryokonservieren von
Geflügelsperma eingesetzt (POLGE et al. 1949). Heute wird es häufig in Verbindung
mit anderen Kryoprotektiva bei der Vitrifikation eingesetzt. So verwandten
BIELANSKI und HARE z.B. eine Mischung aus 10%igem Glycerin und 20%igem
Propandiol (BIELANSKI u. HARE 1988). Andere Mischungen aus penetrierenden
und nichtpenetrierenden Kryoprotektiva wurden ebenfalls zur Vitrifikation eingesetzt.
Zum einen verwandten GUITÉRREZ et al. eine Zusammensetzung aus 3,0 molarem
Glycerin und 0,25 molarer Saccharose, zum anderen verwandten sie die
Makromoleküle PVA, PVP und Ficoll jeweils in Kombination mit Glycerin
(GUTIERREZ et al. 1993).
Im Vergleich zu Glycerin dringt Dimethylsulfoxid zwar schneller in Zellen ein, das
Glycerin wurde jedoch schon früh aufgrund seiner niedrigeren Toxizität präferiert
(MERYMAN 1971). Bei der Vitrifikation wird DMSO jedoch gern verwandt, da es eine
hohe Fähigkeit zur Glasbildung aufweist (FRIEDLER et al. 1988). Auch hierbei ist
eine vollständige Penetration der Zelle unbedingt erforderlich, da das DMSO
ansonsten seine Schutzwirkung nicht vollständig entwickeln kann.
Weiterhin zur Verfügung stehende penetrierende Kryoprotektiva sind EG und
Propandiol. Propandiol ist noch eher in der Lage einen glasartigen Zustand
auszubilden als Glycerin und DMSO (RENARD u. BABINET 1984), allerdings sind
die Überlebensraten von Embryonen, die alleinig mit Propandiol kryokonserviert
werden sehr gering, so dass eine alleinige Verwendung als Kryoprotektivum
ausscheidet (SUZUKI et al. 1990; SEIDEL 1992).
14
Literatur
___________________________________________________________________
EG wurde das erste Mal Ende der 70er Jahre als Kryoprotektivum beschrieben
(MIYAMOTO u. ISHIBASHI 1977). Hier schon zeigte sich, dass eine Konzentration
zwischen 0,9 M und 1,2 M die wohl geeigneteste Konzentration für die
Kryokonservierung von Embryonen war. Bei VOEKEL und HU schien eine 1,5 M
Konzentration die optimale Schutzwirkung beim Gefrieren von Embryonen zu
erzielen (VOELKEL u. HU 1992). SOMMERFELD und NIEMANN konnten 1999
darstellen, dass EG auch in hohen Konzentrationen bis zu 7,2 M, so wie sie für die
Vitrifikation
nötig
sind,
nicht
toxisch
wirkt.
Dies
ist
abhängig
von
der
Umgebungstemperatur, der Penetrationsgeschwindigkeit des EGs und einer
schrittweisen Konzentrationserhöhung des EGs.
15
Literatur
___________________________________________________________________
2.3. Konventionelle Gefrierverfahren
Bei den konventionellen Gefrierverfahren wird zwischen langsamen und schnellen
Gefrierverfahren unterschieden. Beiden Verfahren ist gleich, dass das zu gefrierende
Material mit gleich bleibenden langsamen Raten auf eine bestimmte Temperatur
deutlich unter dem Gefrierpunkt heruntergekühlt wird. Dies geschieht u.a. durch den
Einsatz von programmierbaren Einfrierautomaten. Bei den schnellen Verfahren
erfolgt anschließend eine Überführung des zu konservierenden Materials in flüssigen
Stickstoff. Die Einfrierraten während dieses Prozesses sind relativ hoch und der
Einfrierprozess erfolgt entsprechend schnell.
Es
wird
versucht,
die
Überlebensfähigkeit
der
Embryonen
weder
durch
Gefrierschäden noch durch toxische Effekte des Kryoprotektivums negativ zu
beeinflussen.
2.3.1. Langsame Gefrierverfahren
Die langsamen Gefrierverfahren zeichnen sich durch niedrige Kühlraten aus, mit
denen das zu gefrierende biologische Material langsam auf -60°C - -120°C
heruntergekühlt wird. Die ersten Säugetierembryonen, die durch dieses Verfahren
erfolgreich eingefroren wurden, waren Mäuseembryonen (WHITTINGHAM et al.
1972). Hierbei wurden Gefrierraten von ungefähr 1°C /Sekunde bis zu einer
Temperatur von -79°C verwandt. Das Herunterkühlen e rfolgte mäßig kontrolliert mit
einer Mischung aus Eis und Azeton. Die Embryonen verblieben für ungefähr 30
Minuten bei dieser Temperatur, bevor sie wieder aufgetaut wurden (WHITTINGHAM
1971). Das nachfolgende Auftauen erfolgte mit Raten um die 1,4°C/Sekunde bis zu
einer Temperatur von 20°C.
Die gewählten Einfrierraten sollten gewährleisten, dass die Zelle das osmotische
Äquilibrium mit dem Extrazellulärraum durch Dehydration aufrecht erhalten konnte
(MAZUR 1966). Die Auftauraten waren bei diesen ersten Versuchen etwas höher als
die Einfrierraten, da generell davon ausgegangen wurde, dass ein schnelleres
Auftauen für die Überlebensfähigkeit der Zellen von Vorteil sei (MAZUR 1966).
16
Literatur
___________________________________________________________________
Die zuerst genutzten Kryoprotektiva enthielten neben PBS (Phosphate Buffered
Saline) als Lösungs- und Verdünnungsmittel alle PVP (MAZUR et al. 1969;
WHITTINGHAM 1971)
Bei den ersten Versuchen zum Einfrieren nutzten die Autoren Plastik- und
Glasröhrchen mit einem Volumen von bis zu 5 ml, in die bis zu zwanzig Embryonen
platziert wurden (WHITTINGHAM 1971). Seit 1977 werden Straws, welche bislang
nur zum Einfrieren von Sperma genutzt worden waren, zum Einfrieren von
Mäuseoozyten und später auch zum Einfrieren von Embryonen verwandt
(TSUNODA u. SUGIE 1977; MASSIP et al. 1979).
2.3.2. Schnelle Gefrierverfahren
1980 wurde zum ersten Mal ein schnelleres Gefrierverfahren beschrieben (WOOD u.
FARRANT 1980) als die bisher genutzten Verfahren, die die Embryonen langsam bis
zu sehr niedrigen Temperaturen herunterkühlten, bei denen sie dann verblieben.
WOOD und FARRANT beschreiben eine „two-step“-Methode, bei der die Embryonen
im ersten Schritt mit langsamen Kühlraten auf eine Temperatur von -20°C bzw. -25°C
heruntergekühlt wurden, für eine Weile bei dieser Temperatur verblieben, um dann
direkt in flüssigen Stickstoff überführt zu werden. Während dieses zweiten Schrittes
des Einfrierprozesses kommt es zu entsprechend hohen Kühlraten. Sie beschrieben
ebenfalls, dass die Zeitspanne, bei der die Embryonen bei der Temperatur gehalten
wurden, scheinbar keinen Einfluss auf deren Überlebensfähigkeit hatte. Während
des Auftauens war nach ihrem Protokoll eine hohe Auftaurate erforderlich, um eine
möglichst hohe Überlebensfähigkeit zu gewährleisten (WOOD u. FARRANT 1980).
In der Weitentwicklung dieses Verfahrens bildete sich bald ein bis heute genutztes
Grundprotokoll heraus (RALL 1992): Zunächst wird dem Embryo ein ein- bis
zweimolares Kryoprotektivum zugeführt, in dem er zur Äquilibrierung einen gewissen
Zeitraum verbleibt. Während dieser Phase des Äquilibrierens wird der Embryo in den
Behälter, in dem er eingefroren werden soll, überführt. Anschließend wird der
Embryo in seinem Behälter bei einer Temperatur von -6°C - -7°C „geseedet“. Das
Seeding ruft eine Kristallisation der extrazellulären Masse hervor und vermeidet so
17
Literatur
___________________________________________________________________
eine schädliche Unterkühlung des Embryos (LEIBO 1984). Anschließend wird der
Embryo mit kontrollierten Raten bis zu einer Temperatur von -20°C - -40°C
heruntergekühlt, um dann direkt in flüssigen Stickstoff, der eine Temperatur von
-196°C hat, überführt zu werden.
Die Ausverdünnung des Kryoprotektivums nach dem Auftauen der eingefrorenen
Embryonen stellte zunächst den limitierenden Faktor bei der Menge der zeitgleich
auftaubaren Embryonen dar. Das Kryoprotektivum wurde ursprünglich schrittweise
ausverdünnt, was eines zeitlichen Aufwandes von 20 – 60 Minuten bzw. bis zu 90
Minuten bedurfte (LEIBO 1984; VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1995).
LEIBO war es 1984 möglich, das erste Mal ein so genanntes „One-step“Auftauverfahren zu etablieren, das es ermöglichte, eingefrorene Embryonen direkt
nach dem Auftauen ohne weitere Ausverdünnung zu übertragen. Dieses wurde
durch den Zusatz von nichtpenetrierenden Kryoprotektiva - wie in diesem Falle
Saccharose - ermöglicht.
Bis zu Beginn der 90er Jahre waren Glycerin, DMSO sowie Propylenglycol die
Kryoprotektiva, die am häufigsten benutzt wurden (MASSIP 2001). EG wurde zwar
versuchsweise schon Ende der 70er Jahre eingesetzt (MIYAMOTO u. ISHIBASHI
1977), aber erst in den 90er Jahren kam es zum routinemäßigen Gebrauch. Durch
sein geringeres Molekulargewicht ist EG wesentlich permeabler als zum Beispiel
DMSO und es ist möglich, EG als Kryoprotektivum einzusetzen, ohne es beim
Auftauen der Embryonen ausverdünnen zu müssen. Dies vereinfachte die
Handhabung und Übertragung von TG-Embryonen für Embryotransfer-Techniker
(MASSIP 2001).
18
Literatur
___________________________________________________________________
2.4. Vitrifikation
Die Vitrifikation ist ein ultraschnelles Gefrierverfahren, bei dem im Gegensatz zu den
herkömmlichen Verfahren keine Kristallisation – also keine Eisbildung - der
extrazellulären Flüssigkeit hervorgerufen wird, sondern bei dem zelluläres und
extrazelluläres Wasser in einen amorphen glasartigen Zustand überführt werden.
Es entfallen die Schritte des Seedings und des langsamen Herabkühlens auf eine
Temperatur zwischen -20°C und -25°C. Somit werden f ür dieses Verfahren keine
programmierbaren
Einfrierautomaten
benötigt.
Nach
einer
schrittweisen
Äquilibrierung in hochkonzentrierten Lösungen sind die Zellen dehydriert und werden
direkt in flüssigen Stickstoff überführt.
Das erste Mal wurde diese Methode 1985 für Embryonen beschrieben und
eingesetzt (RALL u. FAHY 1985; RALL 1985). Die Embryonen waren einer
umgekehrten Verdünnungsreihe dem Kryoprotektivum ausgesetzt, das sowohl
penetrierende als auch nicht penetrierende Komponenten enthielt (RALL u. FAHY
1985).
Durch die direkte Überführung in flüssigen Stickstoff liegen bei diesem Verfahren
extrem hohe Kühlraten vor (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al. 1995), die bis zu
20000°C/min betragen (VAJTA et al. 1998). Ebenso ho ch sind die Raten, mit denen
die Embryonen wieder aufgetaut werden. Direkt nach dem Auftauen findet eine
schrittweise Ausverdünnung des Kryoprotektivums statt.
Bei dieser Methode des Einfrierens entfällt die Gefahr der Zellschädigung durch
Eiskristallbildung, da die hohe Konzentration des Kryoprotektivums und die hohen
Kühl- und Auftauraten die Eiskristallbildung verhindern (KULESHOVA u. LOPATA
2002).
Neue
Schädigungsgefahren
entstehen
durch
die
erhöhte
Toxizität
der
Kryoprotektiva. Dieser Toxizitätsanstieg geht mit der höheren Konzentration der
Medien einher. Es wird versucht, die toxischen Effekte, die die einzelnen
Kryoprotektiva
in
hohen
Konzentrationen
besitzen,
abzuschwächen,
indem
Gemische eingesetzt werden. Dies geschah schon bei den ersten erfolgreich
vitrifizierten Embryonen durch RALL und FAHY im Jahre 1985. Diese Autoren
19
Literatur
___________________________________________________________________
nutzten eine Mischung aus penetrierenden und nichtpenetrierenden Kryoprotektiva.
Auch andere Autoren nutzen verschiedene Kryoprotektiva in Mischung, um
Embryonen (erfolgreich) einzufrieren. VAJTA et al. und HOLM et al. nutzen 1998
eine Mischung aus EG und DMSO als Kryoprotektivum.
Weiterhin können sich die hohen Einfrier- und Kühlraten negativ auf die
Überlebensfähigkeit der Embryonen auswirken (VAJTA et al. 1998).
ARAV et al. postulierten, dass es drei Hauptfaktoren gäbe, die die Wahrscheinlichkeit
einer erfolgreichen Vitrifikation beeinflussen würden. Der erste Faktor sei die
Viskosität des Kryoprotektivums, der zweite Faktor die Erzielung einer möglichst
hohen und gleich bleibenden Kühlrate und der dritte Faktor die Verringerung des
Probenvolumens (ARAV et al. 2002).
Problematisch stellt sich die Erzielung möglichst hoher und gleich bleibender
Kühlraten dar, wenn der Embryonencontainer direkt in den flüssigen Stickstoff
überführt wird. Durch die ursprünglich höhere Temperatur des Containers verdampft
der Stickstoff um den Container herum, und bildet dabei eine isolierende Schicht aus
Gas (YAVIN et al. 2009). YAVIN et al. verwandten aufgrund dessen statt flüssigem
Stickstoff, Stickstoff der sich am Übergang von der festen zur flüssigen Phase befand
und eine Temperatur von -210°C hatte. Mittels diese s Verfahrens war es ihm
möglich, die Kühlrate auf fast 53000°C/min herauf z u setzen.
Bei der Vitrifikation
werden unterschiedliche Trägersysteme verwandt, die
unterschiedlichen Problemen der Vitrifikation gerecht werden sollen.
So hat sich gezeigt, dass eine Verringerung des Probenvolumens, also der Menge
des Kryoprotektivums, in dem der Embryo vitrifiziert wird, die Wahrscheinlichkeit
einer erfolgreichen Vitrifikation erhöht. Dies geschieht durch eine Erhöhung der
Kühlrate, die mit der Verringerung des Probenvolumens einhergeht (ARAV et al.
2002). Es gibt bereits etliche Möglichkeiten diese angestrebte Verringerung des
Probenvolumens zu erreichen. So wird bereits 1990 die Methode des Vitrifizierens
mittels eines Elektronenmikroskoprasters beschrieben (STEPONKUS et al. 1990).
Zusätzlich zur Probenvolumenverringerung erlaubt es diese Methode mehr als eine
Probe auf ein Mal einzufrieren, in diesem Falle bis zu zwanzig Oozyten gleichzeitig.
20
Literatur
___________________________________________________________________
2.4.1. Offene Systeme
Offene Systeme lassen einen direkten Kontakt zwischen dem flüssigen Stickstoff und
dem einzufrierenden Material zu. Verschiedene Methoden ermöglichen so eine hohe
Einfrierrate, eine geringere Toxizität der Kryoprotektiva und verringern die
Wahrscheinlichkeit von Schäden wie z. B. dem Aufbrechen der Zona pellucida.
ARAV et al. beschrieben 1993 eine Methode des Vitrifizierens mit sehr kleinen
Volumina, die es ermöglicht die Konzentration des Kryoprotektivums um bis zu 50%
zu reduzieren (ARAV et al. 1993a; ARAV et al. 1993b). Diese Methode wird
„Minimum Drop Size Method (MSD)“ genannt.
1990 wurde ein Verfahren vorgestellt, mittels dessen es möglich war eine definierte
kleine Menge des einen Embryo enthaltenden Mediums in flüssigem Stickstoff
einzufrieren.
Der Tropfen des Kryoprotektivums wurde auf das Kupferraster eines
Elektronenmikroskops (EMG) pipettiert und dann in flüssigen Stickstoff überführt.
Hierbei war es auch möglich mehr als einen Embryo – in diesem Falle Drosophila
melanogaster-Embryonen - auf dem EMG zu platzieren und die Embryonen
gleichzeitig einzufrieren (STEPONKUS et al. 1990). Sechs Jahre später nutzten
MARTINO et al. eben dieses EMG-System, um bovine Eizellen ohne das Auftreten
von Kälteschäden tief zu gefrieren und wieder aufzutauen. Die Eizellen befanden
sich hier in Volumina von <1µl Kryoprotektivum. Dies und der direkte Kontakt des
Kryoprotektivums mit dem flüssigen Stickstoff ermöglichte das Erreichen sehr hoher
Einfrierraten (MARTINO et al. 1996). Nach dem Auftauen war es möglich, die so
vitrifizierten Oozyten zu befruchten und den Erfolg des Einfrierens und Auftauens
über die Teilungs- und Blastozystenraten zu beurteilen (MARTINO et al. 1996).
Eine weitere Methode die Einfrierraten zu erhöhen bot sich durch die Open-Pulled
Straws (OPS). Ebenso wie bei den von STEPONKUS et al. und MARTINO et al.
vitrifizierten Zellen, kommt es bei dieser Methode zum direkten Kontakt des
Kryoprotektivums mit dem flüssigen Stickstoff.
Für diese Methode wurden
herkömmliche 250 µl Straws so modifiziert, dass deren Wanddicke um die Hälfte
verringert wurde. Das Volumen des den Embryo enthaltenden Mediums betrug 1-2
µl. Als Kontrollgruppe wurden hier Embryonen in nicht modifizierten Straws in einem
21
Literatur
___________________________________________________________________
Volumen von 4 µl eingefroren. Diese Straws wurden vor dem Kontakt mit dem
flüssigen Stickstoff durch Erhitzen versiegelt. Die Ergebnisse zeigten, dass es
möglich war, durch den Wegfall des isolierenden Einflusses der hitzeversiegelten
Straws die Einfrierraten fast zu verzehnfachen. Weiterhin verringerten sich laut der
Autoren beim Auftauen toxische und osmotische Effekte durch eine zeitgleiche
Ausverdünnung des Kryoprotektivums (VAJTA et al. 1998); Abbildung 4).
.
(a) Oozyten oder Embryonen werden mittels von Kapillarkräften in den modifizierten
Straw gesogen.
(b) Das Einfrieren erfolgt über das direkte Eintauchen in den flüssigen Stickstoff
(c) Beim Auftauen werden die Straws direkt in das neue Medium eingetaucht. Das
Kryoprotektivum verdünnt sich so aus und die Oozyten oder Embryonen werden aus
dem Straw gespült.
Abbildung 4: Durchführung der OPS-Methode nach Vajita (1999)
Weitere Verfahren, die auf eine Erhöhung der Einfrierraten und eine Verringerung
der Kälteschäden abzielen, sind beispielsweise das Cryoloop- (LANE et al. 1999)
und das Cryotopverfahren (KUWAYAMA et al. 2005). Diese Verfahren beruhen
ebenfalls
auf
Minimalvolumina
und
einem
direkten
Kontakt
zwischen
zu
vitrifizierendem Medium und flüssigem Stickstoff. KUWAYAMA et al. (2005) waren
sogar in der Lage Einfrierraten von bis zu 40000°C / min zu erlangen.
Problematisch bei allen offenen Systemen ist das Risiko der Kontamination. Mit
besonderem Augenmerk auf die bovine Spezies war es BIELANSKI et al. im Jahre
2000 möglich, nachzuweisen, dass Viren der bovinen Virusdiarrhoe (BVD) und der
infektiösen bovinen Rhinotracheitis (IBR) in flüssigem Stickstoff überleben und in der
22
Literatur
___________________________________________________________________
Lage sind, dort aufbewahrte Zellen zu infizieren (BIELANSKI et al. 2000). Als
Alternative wurde vorgeschlagen, dass zu vitrifizierende Material im Dampf des
flüssigen Stickstoffes zu lagern, aber zum einen werden dort keine konstanten
Temperaturen gehalten und die Lagerungstemperatur ist deutlich höher als im
flüssigen Stickstoff selbst (KULESHOVA u. SHAW 2000). Zum anderen war es 2003
möglich nachzuweisen, dass auch die Dämpfe des flüssigen Stickstoffes in der Lage
sind, eine Kontamination der Embryonen hervorrufen zu können (BIELANSKI et al.
2003).
2.4.2. Geschlossene Systeme
Die oben besprochenen Systeme zur Vitrifikation weisen den Nachteil einer
potentiellen Kontamination der Embryonen durch im flüssigen Stickstoff enthaltene
Erreger auf. Embryonen, die direkt übertragen werden sollen, die für den Im- bzw.
Export bestimmt sind müssen nach der Richtlinie 89/556/EWG des Rates vom
25.September
1989
und
der
nationalen
Umsetzung
durch
Binnenmarkt-
Tierseuchenschutzverordnung gelagert, identifiziert und transportiert werden. Die
„International
Society
for
Embryo
Transfer“
(IETS)
bietet
hierfür
Durchführungsmöglichkeiten. So sieht die IETS vor, dass alle Embryonen zum
Zeitpunkt des Einfrierens in versiegelten Behältnissen gelagert sind.
Dafür kommen verschiedene Behältnisse in Frage:
Eine Möglichkeit stellt das Straw-in-Straw-System dar, bei dem 0,25 ml-Straws in
0,5 ml-Straws gelagert werden. Der den Embryo enthaltenden 0,25 ml-Straws wird
zu Beginn an beiden Enden gekürzt, so dass er in den größeren Straw hinein passte.
Der 0,5 ml-Straw wird anfangs an einem Ende versiegelt, um den späteren Ablauf zu
beschleunigen. Nachdem der 0,25 ml-Straw mit dem Embryo beladen wurde, wird er
in den 0,5 ml Straw gesteckt und dann direkt in den flüssigen Stickstoff überführt
(KULESHOVA u. SHAW 2000). Eine weitere Möglichkeit den Bestimmungen der
IETS zu entsprechen, bietet sich durch die Nutzung eines modifizierten Open-Pulled
Straw (mOPS) Systems, bei dem ebenfalls ein weiterer, größerer (0,5 ml) Straw, der
versiegelt wird, verwandt wird, um den direkten Kontakt mit dem flüssigen Stickstoff
23
Literatur
___________________________________________________________________
zu verhindern (ISACHENKO et al. 2005). Eine schematische Abbildung dieses
Models ist Abbildung 5 zu entnehmen.
Schema des Straw -in –Straw Models:
(1) 0,5ml Straw;
(2) Metallverschluss;
(3) Open-pulled Straw;
(4) Vitrifikationsmedium mit Embryo/Oozyte
(5) Meniskus des Vitrifikationsmediums
Abbildung 5: Straw-in-Straw Model mit OPS (Isachenko 2005)
CAMUS et al. beschreiben eine weitere Möglichkeit eines geschlossen Systems, das
zugleich aseptisch ist. Hierbei handelt sich um eine Methode, bei der der Embryo
ebenfalls auf eine kleine Rinne hinüberpipettiert und dann vor dem Kontakt mit dem
flüssigen Stickstoff in einen Straw verbracht und versiegelt wird (CAMUS et al. 2006).
2.4.3. Weitere Vitrifikationsmethoden
Bei der High Hydrostatic Pressure-Methode (HHP) wurden die Embryonen vor der
Kryokonservierung einem Druck von bis zu 150 MPa ausgesetzt, um sie vor
Schäden durch die Kryokonservierung zu schützen. Nachdem die Embryonen
schrittweise wieder zum atmosphärischen Druck zurückgeführt wurden, erfolgte die
24
Literatur
___________________________________________________________________
Vitrifikation. So war es möglich gesteigerte Überlebensraten nach der Vitrifikation im
Vergleich zu solchen Embryonen, die zuvor nicht dem HHP ausgesetzt waren, zu
erlangen (PRIBENSZKY et al. 2004).
Eine weitere Möglichkeit biologische Materialien und somit auch Embryonen zu
Vitrifizieren bietet die Solid Surface Vitrification (SSV). Hierbei werden die
Embryonen in Mikrotropfen auf einen Aluminiumblock pipettiert, der zuvor in
flüssigen Stickstoff verbracht wurde. Dadurch, dass Aluminium eine hohe
Wärmeleitfähigkeit aufweist, hat die Oberfläche des Blocks die Temperatur des
flüssigen Stickstoffs und die Mikrotropfen mit den enthaltenen Embryonen vitrifizieren
sofort (DINNYES et al. 2000). Zur besseren Übersicht ist diese Methode in Abbildung
6 dargestellt. Eine Weiterentwicklung der SSV ermöglicht es einzelne Embryonen
ohne Kontakt zum Stickstoff oder zu anderen Embryonen so zu vitrifizieren. Bei
dieser Methode werden zwei Aluminiumzylinder, die solche Aussparungen
aufweisen, dass einzelne 0,5 ml Straws hineinpassen, ineinander gesetzt und in
flüssigen Stickstoff verbracht. 0,5 ml Straws werden an einem Ende verschlossen
und in die Aussparungen zum Vorkühlen verbracht. Nun werden 0,25 ml Straws so
modifiziert, dass das eine Ende mit einem Embryo beladen werden kann.
Anschließend werden die 0,25 ml Straws in die 0,5 ml Straws geschoben und die
Embryonen vitrifizieren aufgrund der Temperaturleitfähigkeit des Aluminiums
ebenfalls direkt (VUTYAVANICH et al. 2009).
25
Literatur
___________________________________________________________________
Styroporbehälter
den Embryo
enthaltende
Flüssigkeitstropfen
Aluminiumblock
Flüssiger Stickstoff
Abbildung 6: Solid Surface Vitrification, modifiziert nach DINNYÉS (2000)
26
Literatur
___________________________________________________________________
2.5. Qualität in vitro produzierter Rinderembryonen nach dem Auftauen
Die Einflüsse des Kryokonservierens lassen sich anhand verschiedener qualitativer
Merkmale nach dem Auftauen untersuchen. Hierbei kommen sowohl invasive
Verfahren, die den Tod des Embryos zur Folge haben, als auch nicht-invasive
Verfahren zum Einsatz. Vitalfärbungen und Transfers sowie die Beurteilung von
Reexpansions- und Schlupfraten stellen einen Teil der nicht-invasiven Verfahren dar.
Die Etablierung von Trächtigkeiten nach dem Transfer von Embryonen auf geeignete
Empfängertiere und die Untersuchung von so entstandenen Kälbern ist die wohl
beste Möglichkeit qualitativ hochwertige Embryonen zu detektieren. Dies ist jedoch
aus zeitlichen Gründen sowie aus wirtschaftlichen Gründen nicht immer möglich.
Bei den invasiven Verfahren stehen Zellfärbungen durch Farbstoffe wie Ethidium
homodimer und Hoechst und die Analyse der relativen Menge bestimmter
Gentranskripte im Vordergrund.
Eine sichtbare Kontrolle ist das mikroskopische Überprüfen der Reexpansion und
gegebenenfalls des Schlupfes der Blastozysten. Innerhalb der letzten 20 Jahre
haben sich hierbei für die Vitrifikation die Überlebensraten verzweieinhalbfacht. Hatte
BIELANSKI et al. 1988 noch Überlebensraten von 20% 24 Stunden nach dem
Auftauen, so waren es bei MUCCI et al. (2006) rund 52% und bei NEDAMBALE et al.
(2004) sogar über 80% (jeweils 24 Stunden nach dem Auftauen). Tabelle 2 gibt
einen Überblick über die Entwicklung der Überlebensraten nach konventioneller
Kryokonservierung und Vitrifikation in den letzten Jahren. Es ist jedoch nicht möglich
Reexpansions- und Schlupfraten miteinander zu vergleichen, ohne die Art des
Kultursystems, das Stadium und Alter des Embryos vor dem Einfrieren und das
jeweilige Protokoll, nach dem kryokonserviert wurde, mit einzubeziehen. Es konnte
gezeigt werden, dass in vitro produzierte Embryonen, die ein fortgeschritteneres
Entwicklungsstadium
(Stadium
der
expandierten
Blastozyste)
besaßen,
unempfindlicher thermischen Reizen gegenüber waren als solche, die sich erst im
Stadium der Blastozyste befanden. Mit expandierten Blastozysten konnten nach dem
Auftauen signifikant höhere Reexpansions- und Schlupfraten erzielt werden
(MAHMOUDZADEH et al. 1994). Ein verändertes Protokoll für die Vitrifikation
27
Literatur
___________________________________________________________________
wiederum erbrachte Reexpansionsraten von bis zu 100% für Tag sieben expandierte
Blastozysten (LUCAS-HAHN et al. 2006).
Tabelle 2: Übersicht über Überlebensraten in vitro produzierter Embryonen
nach Vitrifikation oder konventioneller Kryokonservierung
Autor
Art der Kryokonservierung
BIELANSKI et al. (1988)
Vitrifiziert
Konventionell kryokonserviert
PALASZ et al. (1996)
Vitrifiziert
LUCAS-HAHN et al. (2003)
Konventionell kryokonserviert
NEDAMBALE et al. (2004)
MOREIRA DA SILVA et al.
(2005)
LUCAS-HAHN et al. (2006)
Vitrifiziert
Vitrifiziert
Konventionell kryokonserviert
MUCCI et al. (2006)
Konventionell kryokonserviert
Vitrifiziert (regulärer Straw)
Vitrifiziert (minimum volume
container)
GÓMEZ et al. (2008)
nach 24 Std: 20%
nach 24 Std: 2933%
nach 24 Std: 51 %
Schlupfrate: 17,5%
Reex.rate: 68,7%
Schlupfrate: 38,9%
nach 24 Std: 50 83%
nach 48 Std: 34 72%
nach 24 Std: 27%
nach 48 Std: 14%
nach 24 Std: 39%
nach 48 Std: 35%
Reex.rate: 100%
Schlupfrate: 83,3%
Vitrifiziert
Vitrifiziert
PARK et al. (2006)
Überlebensraten
nach 24 Std: 52%
nach 48 Std: 51%
nach 24 Std: 17%
nach 48 Std: 20%
Reex.rate: 67%
Schlupfrate:46%
Reex.rate: 75%
Schlupfrate:58%
nach 24 Std: 52%
nach 48 Std: 58%
Vitrifiziert
Eine weitere Möglichkeit die Qualität der Embryonen nach dem Auftauen zu
beurteilen, ist die Zellzahl der wieder aufgetauten Embryonen. Hierbei lassen sich
28
Literatur
___________________________________________________________________
u.a. Zell- und/oder Differentialfärbungen einsetzten, die jedoch z.T. den Tod des
Embryos zur Folge haben. So hatten bei MUCCI et al. (2006) die wieder aufgetauten
zuvor vitrifizierten
konventionell
Embryonen durchschnittlich 99,0 ± 2,2 Zellen und die
kryokonservierten
Embryonen
hatten
nach
dem
Auftauen
durchschnittlich 96,6 ± 2,4 Zellen. Andere Autoren beschreiben andere Zellzahlen.
Geschlüpfte Blastozysten, die zuvor nicht kryokonserviert worden waren, hatten im
Mittel 187,0 ± 9,7 Zellen (NEDAMBALE et al. 2004). Embryonen im Stadium der
expandierten Blastozyste an Tag 7, die in NBCS (New Born Calf Serum) kultiviert
worden waren und danach entweder konventionell kryokonserviert oder vitrifiziert
wurden, hatten durschnittlich 130,5 ± 2,9 Zellen (vitrifiziert) und 131,9 ± 4,1 Zellen
(konventionell kryokonserviert; SOMMERFELD u. NIEMANN 1999).
Eine Untersuchung zeigte, dass Embryonen, die zuvor vitrifiziert worden waren nach
dem Auftauen eine signifikant niedrigere Zellzahl (131,0 ± 15,1) hatten als solche die
nicht kryokonserviert (161,2 ± 9,2) wurden (GOMEZ et al. 2009). Zusammenfassend
sind diese Daten in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3: Durchschnittliche Zellzahlen nach Kryokonservierung durch
Vitrifikation
oder
konventionelle
Kryokonservierung
oder
ohne
Kryokonservierung
Autor
MUCCI et al. 2006
NEDAMBALE et
al. 2004
SOMMERFELD u.
NIEMANN 1999
GOMEZ et al.
2009
Zellzahl nach
Vitrifikation
Zellzahl nach
konventioneller
Kryokonservierung
Zellzahl ohne
Kryokonservierung
99,0 ± 2,2
96,6 ± 2,4
-
-
-
187,0 ± 9,7
130,5 ± 2,9
131,9 ± 4,1
-
131,0 ± 15,1
-
161,2 ± 9,2
29
Literatur
___________________________________________________________________
Zusätzlich
ist
es
möglich
Embryonen
hinsichtlich
ihrer
morphologischen
Eigenschaften zu charakterisieren. So werden Scores angewandt, die z.B. die
Helligkeit des Embryos oder das Aussehen der ICM beurteilen. Letztendlich lässt
sich auch die Qualität des Embryos insgesamt morphologisch begutachten
(BARCELO-FIMBRES u. SEIDEL 2007). Der Embryo an sich wird durch diese
Maßnahme nicht geschädigt.
Eine weitere Möglichkeit den Erfolg einer Kryokonservierungsmethode zu beurteilen,
liegt in der Übertragung so behandelter Embryonen nach dem Auftauen. Hierbei wird
zum einen die Etablierung der Trächtigkeit beurteilt, zum anderen ist die Geburt
lebender, gesunder Kälber Erfolgsmaßstab.
Tabelle 4: Trächtigkeitsraten in vivo und in vitro generierter Embryonen nach
Kryokonservierung durch Vitrifikation oder konventionelle Kryokonservierung
Autor
VAN
WAGTENDONK-DE
LEEUW et al. (1995)
GALLI et al. (2001)
Art des Embryos
Trächtigkeitsraten
In vitro/vitrifiziert
8/17 (47%)
In vitro/konventionell
36/76 (47,4%)
kryokonserviert
In vivo/konventionell
62/108 (57,4%)
kryokonserviert
In vivo/konventionell
69/125 (57,8%)
kryokonserviert
LAZZARI et al. (2002)
In vitro/ SOF+BSA/
24/65 (36,9%)
konventionell kryokonserviert
In vitro/ SOF-Serum/
4/24 (16,7%)
konventionell kryokonserviert
In vitro/konventionell
VOEKEL u. HU (1992)
10/26 (38,5%)
kryokonserviert/1,5M EG
In vitro/konventionell
kryokonserviert/1,4M Glycerin
30
28/50 (56,0%)
Literatur
___________________________________________________________________
So
konnten
VAN
WAGTENDONK-DE
LEEUW
et
al.
(1995)
nach
der
Kryokonservierung durch Vitrifikation bei sieben von 17 (44%) Tieren die Trächtigkeit
feststellen und an Tag 90 8 Föten (47%) auffinden. Weitere Untersuchungen, die
sich mit der Anzahl der etablierten Trächtigkeiten nach dem Transfer in vitro
produzierter Embryonen beschäftigten, ergaben dass deren Anzahl im Gegensatz zu
Trächtigkeiten, die sich nach dem Transfer in vivo produzierter Embryonen ergaben
reduziert
waren
(GALLI
et
al.
2001;
LAZZARI
et
al. 2002).
Daten
zu
unterschiedlichen Trächtigkeitsraten sind vergleichend in Tabelle 4 dargestellt.
Eine Arbeit, die sich mit den Trächtigkeitsraten in vitro produzierter konventionell
kryokonservierter Embryonen nach dem Auftauen beschäftigte, ergab, dass solche
Embryonen, die schon an Tag sechs oder sieben das Stadium der Blastozyste
erreicht hatten, verglichen mit solchen, die erst an Tag acht dieses Stadium
erreichten (MASSIP et al. 1995), eine signifikant höhere Überlebensrate nach dem
Auftauen vorweisen konnten.
31
Literatur
___________________________________________________________________
2.6. Entwicklungsrelevante Gentranskripte präimplantatorischer
Rinderembryonen
Die Entwicklung des präimplantatorischen Rinderembryos ist abhängig von der
korrekten Umsetzung des genetischen Programms der Zygote und dem Umfeld, in
dem sich der Embryo befindet. Ein suboptimales Umfeld kann die Expression
wichtiger
Gentranskripte
entwicklungsrelevanter
hierbei
Gene
in
nachteilig
vivo
und
in
beeinflussen.
vitro
generierter
Transkripte
Embryonen
unterscheiden sich deutlich hinsichtlich ihrer Expression (WRENZYCKI et al. 1998).
Zusätzlich gibt es auch Unterschiede zwischen in vitro produzierten Embryonen z.B.
in Abhängigkeit vom verwandten Kulturmedium. Aufgrund dessen ist es möglich
Aussagen über ihre Qualität zu treffen (WRENZYCKI et al. 2007). Tabelle 5 gibt
einen Überblick über verschiedene Gentranskripte und die Menge des exprimierten
Transkriptes in vitro produzierter Blastozysten im Vergleich zu ihren in vivo
generierten Gegenstücken.
Tabelle
5:
Entwicklungsrelevante
Gentranskripte
in
vitro
produzierter
Blastozysten im Vergleich zu in vivo Blastozysten
Expressionsverhalten im
Gen
Vergleich zu in vivo
Referenz
produzierten
Blastozysten
Kompaktierung/Teilung
WRENZYCKI et al.
Cx43
↓
(1996);
RIZOS et al. (2002)
DSC2
↑
KNIJN et al. (2002)
Plako
↓
KNIJN et al. (2002)
TJP1
↓
MILLER et al. (2003)
↓
RIZOS et al. (2002)
Stress
Cu/Zn SOD
32
Literatur
___________________________________________________________________
Tabelle
5:
Entwicklungsrelevante
Gentranskripte
in
vitro
produzierter
Blastozysten im Vergleich zu in vivo Blastozysten (Fortsetzung)
Expressionsverhalten im
Gen
Vergleich zu in vivo
produzierten
Referenz
Blastozysten
Stress
↑
LAZZARI et al. (2002);
WRENZYCKI et al. (2002)
WRENZYCKI et al. (2002)
SLC2A1 (GLUT1)
↓
RIZOS et al. (2002)
SLC2A3 (GLUT3)
↑
LAZZARI et al. (2002)
SLC2A4 (GLUT4)
↓
BERTOLINI et al. (2002)
↑
LAZZARI et al. (2002)
G6PD
↑
WRENZYCKI et al. (2002)
PGK
↑
WRENZYCKI et al. (2002)
HSP
Metabolismus
Trophoblastenfunktion
IFNτ
Masch2
↑
↓
WRENZYCKI et al.
(2001a);
WRENZYCKI et al.
(2001b)
WRENZYCKI
et
(2001a);
WRENZYCKI
et
(2001b)
al.
al.
DNA-Methylierung
DNMT1
↑
WRENZYCKI et al.
(2001b);
WRENZYCKI u.
NIEMANN (2003)
∅
DNMT3A
↑
33
WRENZYCKI u.
NIEMANN (2003)
HÖFFMANN et al. (2006)
Literatur
___________________________________________________________________
2.6.1. DNA-Methyltransferase 3A (DNMT3A)
Die Familie der DNA-Methyltransferasen (DNMT) ist essentiell für die de-novo
Methylierung von embryonalen Stammzellen während der frühen embryonalen
Entwicklung (OKANO et al. 1999). Sie spielen eine essentielle Rolle bei der
epigenetischen
Reprogrammierung des Genoms
während der embryonalen
Entwicklung (WRENZYCKI u. NIEMANN 2003). Hierbei katalysieren die Dnmts den
Transfer einer Methylgruppe der Aminosäure S-Adenosyl-L-Methionin an zuvor nicht
modifizierte DNA (OKANO et al. 1998). Neben der Gruppe der DNMT3 bestehend
aus DNMT3A, -3B und -3L, gibt es zwei weitere Familiengruppen: die DNMT1 und
die DNMT2. Die DNMT3A besteht aus einer großen N-terminalen Domäne und einer
kleineren C-terminalen Domäne (MARGOT et al. 2001).
Bei Mensch und Maus sind zwei Isoformen der Dnmt3a bekannt: Dnmt3a und
Dnmt3a2. Während die Dnmt3a ubiquitär vorzukommen scheint, ist die Dnmt3a2 bei
diesen beiden Spezies hauptsächlich in embryonalen Stammzellen, Karzinomen,
Hoden, Ovarien, Thymus und Milz nachweisbar (CHEN et al. 2002).
Die Bedeutung der Dnmt3a ist bislang vor allem in Mäuseversuchen untersucht
worden. So konnten OKANO et al. (1999) nachweisen, dass bei mutanten Tieren
Störungen in der Dnmt3a Expression einen Letalfaktor darstellen. Bei Knock-outVersuchen auf dem maternalen oder paternalen Gen, stellten KANEDA et al. (2004)
fest, dass es nicht möglich war, Trächtigkeiten zu etablieren, wenn mutierte
männliche Mäuse mit weiblichen Wildtypmäusen gekreuzt wurden (KANEDA et al.
2004). Diese Störungen in der Reproduktion sind auf Störungen in
der
Spermatogenese zurückzuführen.
Beim Rind war es bislang möglich, die Expression von DNMT3A vom 2-Zell Stadium
bis zum Blastozystenstadium nachzuweisen (GOLDING u. WESTHUSIN 2003). Die
Art, auf die die Embryonen produziert wurden, spielt bei der relativen Menge der
mRNA-Transkripte eine entscheidende Rolle. So konnten HÖFFMANN et al. im Jahr
2006 nachweisen, dass der mRNA-Gehalt bei in vivo produzierten Blastozysten
signifikant niedriger ist als bei Blastozysten, die einem IVP-System entstammen
(HÖFFMANN et al. 2006). Ein Anstieg von DNMT3A konnte auch bei Blastozysten
34
Literatur
___________________________________________________________________
nachgewiesen werden, die durch somatischen Kerntransfer entstanden, wiederum
verglichen mit Embryonen aus In-vivo- und In-vitro-Produktionen (WRENZYCKI u.
NIEMANN 2003; DECAMARGO et al. 2005).
35
Literatur
___________________________________________________________________
2.6.2. Glukosetransporter 1 (SLC2A1) und Glukosetransporter 3 (SLC2A3)
Die Familie der Glukosetransporter ist eine Familie von eng miteinander verwandten
Membranproteinen, die in ihrer Struktur deutliche Ähnlichkeiten miteinander
aufweisen. Sie werden heute als Solute Carrier Familie (SLC) – SLC2A1 und
SLC2A3 bezeichnet. Früher wurden sie auch als GLUT1 (SLC2A1) und GLUT3
(SLC2A3) bezeichnet.
Es handelt sich um Na+-unabhängige Membranproteine, die einen Transport der
Glukose in zwei Richtungen entlang eines Konzentrationsgradienten ermöglichen.
Die Hauptaufgabe der Glukosetransporter ist es, den Glukosetransport zwischen
inner- und extrazellulärer Matrix zu regulieren (OLSON u. PESSIN 1996). Die erste
identifizierte Isoform war der Glukosetransporter1 (SLC2A1), der 1985 von
MUECKLER in humanen Geweben entdeckt wurde (MUECKLER et al. 1985).
SLC2A1 wird am stärksten an basolateralen Membranen, wie denen von
Blutgefäßen oder der Blut-Hirn-Schranke exprimiert (OLSON u. PESSIN 1996;
AUGUSTIN et al. 2001). Der Glukosetransporter3 (SLC2A3) wird hingegen
hauptsächlich an neuronalen Geweben gefunden (AUGUSTIN et al. 2001).
Sowohl der SLC2A1 Transporter als auch der SLC2A3 Transporter werden von der
bovinen Oozyte und allen frühembryonalen bovinen Stadien exprimiert. Hierbei
stellen SLC2A1 und SLC2A3 die Hauptisoformen der Glukosetransporter in der
frühen embryonalen Entwicklung dar (AUGUSTIN et al. 2001).
Die Aufnahme von Glukose nimmt bei in vitro produzierten Embryonen mit
zunehmendem Alter stetig zu (RIEGER et al. 1992). Ein erster starker Anstieg des
Glukoseverbrauches findet im 8-16 Zell Stadium des Embryos statt. Zu diesem
Zeitpunkt findet auch die Aktivierung des embryonalen Genoms statt (LEQUARRE et
al. 1997). Ein weiterer extremer Anstieg der mRNA–Expression im Morulastadium
legt nahe, dass sich dieses als das Stadium erweist, in dem der Embryo von Glukose
als Ernährungsquelle abhängig wird. Dieses wurde auch schon 1992 von RIEGER et
al. postuliert, die aussagten, dass der Glukosemetabolismus eines Embryos
hauptsächlich in zwei Schritten anstiege: zum Zeitpunkt der Aktivierung des
embryonalen Genoms und zum Zeitpunkt der Kompaktierung.
36
Literatur
___________________________________________________________________
Bei Rinderembryonen ist der SLC2A1 in trophektodermalen Zellen lokalisiert
(WRENZYCKI et al. 2003) und wird ab dem 2- bis 4-Zellstadium exprimiert.
Untersuchungen
am
murinen
Slc2a1
zeigten
weiterhin,
dass
dessen
Transporteffizienz deutlich erhöht wird, wenn sich die Zelle in einem Zustand des
Glukosemangels befindet (GARDNER u. KAYE 1995). Die Expression von SLC2A1
mRNA ist jedoch nicht nur vom Glukosespiegel der Zellen abhängig, sondern im
Falle von Embryonen auch von ihrer Qualität. An bovinen Embryonen lies sich
zeigen, dass Blastozysten mit der besten morphologischen Qualität die höchste
Expression von SLC2A1-mRNA aufwiesen (LOPES et al. 2007)
Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass auch die Entstehungsform des
Embryos – in vivo oder in vitro – einen Einfluss auf die relative Menge der mRNA
Expression hat. So wird bei in vivo gewonnenen Morulae signifikant mehr SLC2A1Transkript exprimiert als bei in vitro generierten (WRENZYCKI et al. 1999;
WRENZYCKI et al. 2001a). In mit Serum angereicherten Kulturmedium zeigten
8-16 - Zeller, Blastozysten und geschlüpfte Blastozysten eine deutlich höhere
Expression der SLC2A1-mRNA als die Embryonen, die in Medium, das mit PVA
supplementiert war, gewachsen waren (WRENZYCKI et al. 1999).
Der SLC2A3 Transporter ist zwar in allen Geweben nachweisbar, seine
Hauptlokalisation ist jedoch in neuronalem Gewebe (OLSON u. PESSIN 1996;
AUGUSTIN et al. 2001). In Mäuseembryonen wurde der Slc2a3 im 4-Zellstadium
nachgewiesen. Hier ist er an der apikalen Membran des Trophektoderms lokalisiert,
um die Zellen mit maternaler Glukose zu versorgen (PANTALEON et al. 1997). Bei
Rindern ist SLC2A3 maternaler Herkunft und konnte dementsprechend von der
Eizelle bis zur Tag 12-Blastozyste dargestellt werden (AUGUSTIN et al. 2001).
Die Expression von SLC2A3 scheint ein sehr sensitiver Marker für eine suboptimale
embryonale Umgebung zu sein. Die relative Transkriptmenge ist bei der In-vitroKultur im Brutschrank und bei der in vivo Kultur im Schafeileiter, die ansonsten
besser geeignet zu sein scheint, im Gegensatz zu in vivo gewonnenen Embryonen
signifikant erhöht (LAZZARI et al. 2002).
37
Literatur
___________________________________________________________________
2.6.3. Heat Shock Protein 70 (HSP70-1)
Bei der Familie der Heat Shock Proteine (HSP) handelt es sich um eine Gruppe von
Proteinen, die fest mit dem Mikrotubulisystem und dem Zytoskelett von Zellen
verbunden sind (NOVER u. SCHARF 1991). Sie werden in zwei Gruppen eingeteilt:
Adenosintriphosphat (ATP) -abhängige HSPs, die sich durch ein hohes molekulares
Gewicht auszeichnen und ATP-unabhängige HSPs, die ein kleineres molekulares
Gewicht haben (GARRIDO et al. 2001). HSPs haben eine zytoprotektive Funktion,
die es Zellen ermöglicht, sich an ansonsten für die Zelle letale Konditionen
anzupassen (PARCELLIER et al. 2003). Bei Embryonen wird durch die HSPs eine
Resistenz gegenüber Proteindenaturation und eine Thermotoleranz hervorgerufen.
Sie fungieren als „molekulare Chaperonen“ bei der Proteinfaltung und bei der
Stabilisierung von geschädigten Proteinen (NOVER u. SCHARF 1991). Durch diese
Fähigkeit
sind
die
Angehörigen
der
HSP70-Familie
in
der
Lage,
Zellen
Thermoprotektion zu gewähren, indem sie die durch Hitze geschädigten Proteine
neu falten (DUNCAN u. HERSHEY 1989).
Untersuchungen an Mäuseembryonen ergaben, dass die transkriptionelle Aktivität
bezogen auf das Hsp70-Gen bei in vitro produzierten Embryonen 15fach erhöht ist
im Vergleich zu ihren in vivo generierten Gegenstücken (CHRISTIANS et al. 1995).
Auch bei bovinen Embryonen, die in vitro produziert worden waren, konnte gezeigt
werden,
dass
die
Expression
von
HSP70-1
signifikant
heraufgeregelt
ist
(WRENZYCKI et al. 2001a). Eine zusätzliche Heraufregulierung konnte bei in vitro
produzierten bovinen Embryonen festgestellt werden, nachdem ein kontrollierten
thermischer Reiz zugefügt wurde (KAWARSKY u. KING 2001).
Die Proteine der HSP70 Familie sind bei bovinen Embryonen während der gesamten
Präimplantationsperiode
nachweisbar.
Sie
reagieren
jedoch
in
jedem
Entwicklungsstadium unterschiedlich auf Hitzereize (WRENZYCKI et al. 1998):
Wurden Oozyten mit einen kontrollierten thermischen Reiz konfrontiert, so war die
Entwicklung zur Blastozyste beeinträchtigt. Wurden jedoch Morulae dem gleichen
Reiz ausgesetzt, so war keine Veränderung bei der Entwicklung zur Blastozyste
festzustellen (EDWARDS u. HANSEN 1996; EDWARDS u. HANSEN 1997). Nicht
nur Hitzereize wirken sich auf die Expression von HSP70-1 aus, sondern auch dass
38
Literatur
___________________________________________________________________
Einfrieren von Zellen mit anschließendem Auftauen. So exprimieren bovine
Blastozysten nach dem Einfrieren durch Vitrifikation signifikant mehr HSP70-1 als die
nicht eingefrorene Kontrollgruppe (PARK et al. 2006).
Als Stressoren, die die erhöhte Transkription von HSP70-1 verursachen, sind auch
andere exogene Einflüsse möglich. Mehrfach wurde die Expression von Heat Shock
Protein bei in vitro und in vivo generierten bovinen Embryonen miteinander
verglichen. Zum einen ist HSP70-1 bei allen in vitro produzierten Embryonen im
Vergleich zu ihren in vivo Gegenstücken heraufreguliert (WRENZYCKI et al. 2001a),
zum anderen hat auch das Kulturmedium einen Einfluss auf die relative
Transkriptmenge. So ist die Transkriptmenge bei der Kultur im TCM-Medium im
Vergleich zum SOF-Medium und in vivo generierten Embryonen signifikant
heraufreguliert (WRENZYCKI et al. 2001a). Werden Medien miteinander verglichen,
denen entweder Serum oder PVA zugesetzt wurden, so ist die Expression bei dem
Medium, das mit PVA supplementiert wurde, signifikant herabgesetzt (WRENZYCKI
et al. 1999). Auch FBS scheint als Stressor zu fungieren, da nach seinem Zusatz
zum IVP-Medium ebenfalls eine erhöhte Transkriptmenge an HSP70-1 notiert
werden konnte (WARZYCH et al. 2007).
2.6.4. Interferon τ (IFNττ)
Interferon τ (IFNτ), das früher auch als bovines Trophoblastenprotein (bTP) bekannt
war, ist wesentlich für das Überleben des Embryos, da es für die Aufrechterhaltung
des zuvor zyklischen Gelbkörpers zu Beginn der Trächtigkeit essentiell ist (MARTAL
et al. 1990). Dadurch dass die Regression des Gelbkörpers verhindert wird, wird
auch der Progesteroneinfluss aufrechterhalten. Somit wird die Trächtigkeit erhalten
(BAZER et al. 1991). Mittlerweile wird davon ausgegangen, dass es sich bei IFNτ um
das Primärsignal zur Erhaltung und Etablierung der Trächtigkeit handelt (JOHNSON
et al. 2006), indem die maternale Erkennung der Gravidität induziert wird
(WRENZYCKI et al. 1998). Sobald sich der bovine Embryo zur Blastozyste formiert,
beginnt die Expression von IFNτ (WRENZYCKI et al. 1998). Die Expression geht
hierbei vom Trophektoderm des Embryos aus (FARIN et al. 1990) und ist damit auch
39
Literatur
___________________________________________________________________
abhängig von einem funktionstüchtigen Trophektoderm (HERNANDEZ-LEDEZMA et
al. 1993).
Die Menge des exprimierten Interferons wird durch das Entwicklungsstadium des
Embryos beeinflusst (HERNANDEZ-LEDEZMA et al. 1993).
Auch bei in vitro produzierten Embryonen wird Interferon τ exprimiert, wobei hier die
Menge des exprimierten IFNτs signifikant höher ist als bei in vivo produzierten
Blastozysten
(WRENZYCKI
et
al.
2001a).
Zwischen
unterschiedlichen
Kultursystemen treten ebenfalls Unterschiede in der Menge der mRNA–Expression
auf: So exprimieren geschlüpfte Blastozysten, die einem mit PVA supplementierten
Kultursystem entstammen, signifikant mehr IFNτ als solche, die in einem
Kultursystem mit Serumzusatz generiert wurden (WRENZYCKI et al. 1999). 2004
war es Kubisch et al. möglich zu zeigen, dass die Menge exprimierten IFNτs bei
expandierten Blastozysten, die aus einem In-vitro-System stammten, signifikant
höher war als bei frühen Blastozysten und Blastozysten, die nach demselben
Protokoll generiert worden waren. Gleichzeitig konnte im Tierversuch gezeigt
werden, dass eine niedrigere Expression von Interferonτ zu einem frühen
Entwicklungsstadium des Embryos (Morula, Blastozyste) mit einer höheren
Wahrscheinlichkeit der Etablierung der Trächtigkeit korrelierte (KUBISCH et al.
2004).
Es ist möglich, IFNτ als einen Indikator für die Qualität eines bovinen Embryos zu
nutzen. Zwischen der Expression von IFNτ zu einem frühen Entwicklungsstadium
und der Entwicklungskompetenz boviner Embryonen besteht eine negative
Korrelation (KUBISCH et al. 1998). Beim direkten Vergleich von in vivo und in vitro
produzierten Embryonen spricht das frühe und hohe Vorhandensein von IFNτ mRNA für eine schlechte Qualität des Embryos (LEPPENS-LUISIER et al. 2001;
WRENZYCKI et al. 2001a).
2.6.5. Zona occludens Protein 1 (TJP1)
Analog zu ihren Aufgaben gibt es unterschiedliche Verbindungen zwischen Zellen.
Sie werden in drei Hauptgruppen eingeteilt: die verschließenden Verbindungen, wie
z.B.
Zona
occludens
Verbindungen,
die
40
Adhäsionsverbindungen,
die
über
Literatur
___________________________________________________________________
Desmosomen vermittelt werden und die kommunizierenden Verbindungen, wie z.B.
die Gap junctions.
Zur ersten Gruppe der Zell-Zell-Verbindungen zählen die Tight junctions (TJ). Sie
bestehen
aus
einer
Reihe
von
integralen
Membranproteinen
und
aus
Plaqueproteinen. Zu den Letztgenannten gehören die Zona Occludens-Proteine
TJP1 und TJP2 (STEVENSON u. KEON 1998).
Das Zona occludens-Protein 1 existiert in zwei Isoformen, die durch alternatives
Splicen an der 80 Aminosäuren großen C-Terminale entstehen. Diese Isoformen
werden als ZO-1α+ und ZO-1α- bezeichnet (BALDA u. ANDERSON 1993).
Bei der Kompaktierung eines Embryos wird aus einem Embryo, der aus zuvor acht
deutlich voneinander abgrenzbaren Blastomeren bestand, ein Zellhaufen mit nicht
voneinander abzugrenzenden Zellen (VESTWEBER et al. 1987). Während dieses
Prozesses entstehen die ersten ausdifferenzierten Zellen des Embryos: das
Trophektoderm (TE) und die Inner Cell Mass (ICM). Ein kritischer Schritt bei der
Ausdifferenzierung des TEs ist die Ausbildung der Tight junctions an der
apicolateralen Grenze der Zellen zueinander (MILLER et al. 2003). Dieser Vorgang
wird
durch
ein
Calcium-abhängiges
Glykoprotein
vermittelt.
Sobald
die
Kompaktierung stattgefunden hat, verbindet sich TJP1 mit der rab-GTPase rab13
und wird somit aktiviert (FLEMING et al. 1989; SHETH et al. 1997).
Die Analyse von murinen Tight junction-Proteinen und -Genen während der
einzelnen Teilungsschritte hat ergeben, dass das Programm, nach dem die Proteine
zusammengesetzt werden, ein dynamischer Prozess ist, bei dem die Transkription
zwischen dem 4- und 8-Zellstadium heraufreguliert wird (HAMATANI et al. 2004; CUI
et al. 2007).
Mittels Immunocytochemie ließ sich feststellen, dass die TJ Formierung bei Mäusen
und Rindern ähnlich verläuft (BARCROFT et al. 1998) und sich TJP1 bei beiden
Spezies als fortlaufender Ring um die apikalen Punkte des Zell-Zell-Kontaktes
darstellen lässt.
Bei Embryonen im Stadium der Morula und der Blastozyste wird ein drastischer
Anstieg der Expression der Tight junction-Transkripte verzeichnet. Dieses geschieht
sowohl bei in vivo als auch bei in vitro generierten bovinen Embryonen (MILLER et
41
Literatur
___________________________________________________________________
al. 2003).
Bei in vitro produzierten Blastozysten ist weiterhin ein Unterschied
zwischen Tag 7- und Tag 8-Blastozysten festzustellen. So wird an Tag 8 sowohl im
Trophektoderm als auch in der ICM signifikant mehr TJP1 exprimiert als an Tag 7
(WRENZYCKI et al. 2003).
Weiterhin ist zu beobachten, dass in vitro produzierte Morulae und Blastozysten, die
eine kurze Kompaktierungsphase aufweisen, deutlich weniger TJP1 exprimieren als
solche mit einer längeren Kompaktierungsphase. Da die TJP1α+ -Isoform nicht in
ihrer Expression verändert ist, liegt die Vermutung nahe, das die zeitliche Dauer der
Kompaktierung und die In-vitro-Kultur einen stärkeren Einfluss auf die TJP1α- Isoform haben (MILLER et al. 2003).
2.6.6. E-cadherin (CDH1)
E-cadherin (CDH1), auch Uvomorulin genannt, ist ein Calcium-abhängiges
Glykoprotein, welches Zell-Zell-Kontakt vermittelt (BARCROFT et al. 1998). Die
Kompaktierung eines Embryos vom 8-Zell Stadium mit klar abgegrenzten
Blastomeren hin zu einem Zellball mit nicht deutlich abzugrenzenden Zelllgrenzen
wird
hauptsächlich
über
die
Aktivierung
von
E-cadherin
vermittelten
Zell
Verbindungen aktiviert (VESTWEBER et al. 1987). Gentranskripte für CDH1 können
vom frühsten Zygotenstadium die gesamte Präimplantationsperiode über im bovinen
Embryo detektiert werden. Die Expression von CDH1 im Embryo ist eng an seine
Entwicklung und die Differenzierung von Zellen gekoppelt. Mit der Ausdifferenzierung
des Trophektoderms, welches neben der ICM der erste differenzierte Zelltyp
während der Embryogenese ist (ECKERT u. FLEMING 2008), steigt auch die
Expression von CDH1. Das Trophektoderm ist das erste funktionsfähige Epithel.
Während CDH1 bei Zygoten und Embryonen in den frühen Teilungsstadien noch
gleichmäßig um den Rand der einzelnen Blastomeren verteilt ist, ist das
Verteilungsmuster ab dem Stadium der Morula verändert. Ab diesem Stadium ist die
Expression von CDH1 auf die basolaterale Membran trophektodermaler Zellen
beschränkt (BARCROFT et al. 1998). Zellen, die wie die basolateralen Membran des
42
Literatur
___________________________________________________________________
Trophektoderms mit CDH1 transfiziert sind, entwickeln sich später zu Zellen, die
einen epithlialen Phänotyp haben (MARRS et al. 1993).
Das oben beschriebene Verteilungsmuster lässt sich durch die Darstellung mittels
Immunfloureszenz bildhaft zeigen. Zusätzlich ist in der Immunfloureszenz erkennbar,
dass CDH1 ebenfalls die Peripherie der Inner Cell Mass (ICM) einkreist.
Bei der Expression von murinem Cdh1 ist ein enger Zusammenhang zur
Kompaktierung des Embryos ersichtlich (PRATT et al. 1982). So wird diese
hauptsächlich durch die Aktivierung von CDH1 vermittelt (BARCROFT et al. 1998).
Bei bovinen Embryonen wird CDH1 vornehmlich ab dem Stadium der Morula
exprimiert (WRENZYCKI et al. 1999; WRENZYCKI et al. 2001a), wobei in vivo
erzeugte Morulae signifikant mehr CDH1 exprimieren als in vitro generierte aus SOFoder TCM-Kultur (WRENZYCKI et al. 2001a).
E-cadherin wird auch bei expandierten Blastozysten im Trophektoderm und der ICM
exprimiert (SHEHU et al. 1996; BARCROFT et al. 1998), wobei das Trophektoderm
bei Tag 8 Blastozysten signifikant mehr CDH1 exprimiert als bei Tag 7-Blastozysten
(WRENZYCKI et al. 2003).
Beim Vergleich von Embryonen, die durch somatischen Kerntransfer generiert
wurden, mit solchen, die aus einem Standard-IVP-System stammten, konnte 2007
gezeigt werden, dass die Embryonen, die im somatischen Kerntransfer mit
weiblichen Kumulszellen erzeugt wurden, signifikant mehr CDH1 exprimierten als
ihre Gegenstücke, die durch Kerntransfer von männlichen Fibroblasten erzeugt
wurden und solchen, die aus einem Standard-IVP System stammten (AMARNATH et
al. 2007).
2.6.7. Desmocollin II (DSCII)
Desmosomale Verbindungen sind Teil des Zell-Zell-Verbindungsapparates und
gehören zur Superfamilie der Cadherine. Sie bestehen aus TransmembranGlycoproteinen und zytoplasmatischen Proteinen (SCHWARZ et al. 1990). Zu den
Transmembran – Glykoproteinen gehören die Desmogleine und Desmocolline. Bei
den Desmocollinen handelt es sich um Calcium-abhängige Moleküle (LEGAN et al.
1994).
43
Literatur
___________________________________________________________________
1994 konnten LEGAN et al. das Desmocollin III nachweisen, womit schließlich drei
Desmocolline (DSCI, DSCII und DSCIII) beim Rind nachgewiesen waren (LEGAN et
al. 1994). Jedes Desmocollin ist das Produkt eines eigenen Gentranskripts (LEGAN
et al. 1994). Im Mäusemodell konnte gezeigt werden, dass desmosomale
Verbindungen bei der Entwicklung des Blastocoels von Bedeutung sind und ihre
Entwicklung mit der des Blastocoels einhergehen. Ferner spielen sie eine
entscheidende Rolle bei der Stabilisierung des Trophektoderms, während die
Blastozyste expandiert (FLEMING et al. 1991; COLLINS et al. 1995). Hier konnte
Desmocollin II von der Oozyte bis zum frühen 8-Zell Stadium nachgewiesen werden.
Im kompaktierten 8-Zell Stadium konnte kein DscII nachgewiesen werden. Eine
Darstellung war erst wieder ab dem 16-Zell Stadium möglich (COLLINS et al. 1995).
Beim Rind kann DSC2 ab dem 2-4 Zell-Stadium aufwärts nachgewiesen werden.
Dieses legt den embryonalen Ursprung der Desmocollin II-Transkripte nahe
(WRENZYCKI et al. 1998).
Weitere Untersuchungen am bovinen Beispiel konnten zeigen, dass Desmocollin II
signifikant mehr vom Trophektoderm exprimiert wird als von der ICM und hierbei
wiederum signifikant mehr bei Tag acht-Blastozysten als bei Tag siebenBlastozysten (WRENZYCKI et al. 2003). Schon zuvor konnte heraus gefunden
werden, dass in vivo
erzeugte Morulae (WRENZYCKI et al. 2001a) und
Blastozysten (WRENZYCKI et al. 2001a; KNIJN et al. 2002) wesentlich mehr DSC2
exprimieren als ihre in vitro generierten Gegenstücke. Hierbei spielt auch die Art des
Kultursystems nur eine untergeordnete Rolle, da sowohl Blastozysten die im SOFMedium generiert wurden als auch Blastozysten, die im TCM-Kultursystem kultiviert
wurden, signifikant weniger DSC2 exprimieren als in vivo erzeugte Embryonen. Dies
könnte erklären, weshalb die Entwicklung bei in vitro produzierten Embryonen
bisweilen beeinträchtigt zu sein scheint (PRATHER u. FIRST 1993).
Beim Vergleich einzelner Kultursysteme miteinander zeigte sich 1999, dass
Embryonen, die in einem Kultursystem, das mit PVA supplementiert
wurde, im
Stadium der Blastozyste und der geschlüpften Blastozyste signifikant mehr
Desmocollin II exprimierten als Embryonen des gleichen Stadiums, die einem
Kultursystem entstammten, das mit Serum supplementiert worden war (WRENZYCKI
44
Literatur
___________________________________________________________________
et al. 1999). Bei Untersuchungen, bei denen IVP-Embryonen in einem Insulin-Like
Growth-Faktor-1 (IGF)-Kultursystem erzeugt wurden, konnte nachgewiesen werden,
dass diese Blastozysten im Vergleich zu Blastozysten, die kein IGF erhielten,
signifikant mehr DSC2 exprimierten. Der Autor schreibt diese Auffälligkeit jedoch
eher einer beschleunigten Entwicklung der Blastozysten zu, die mit IGF kultiviert
wurden (BLOCK et al. 2008).
45
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3. Material und Methoden
Die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Chemikalien sowie die
verwendeten Geräte sind – sofern nicht im Text angegeben – im Anhang
beschrieben. Sofern nicht anders angegeben stammen die Chemikalien von der
Firma Sigma (Steinheim, Deutschland).
3.1. In-vitro-Produktion (IVP)
Die In-vitro-Produktion (IVP) besteht methodisch aus drei Schritten: der In-vitroMaturation (IVM) oder Reifung, der In-vitro-Fertilisation (IVF) und der In-vitro-Kultur
(IVC). Diese drei Schritte erfolgen an drei aufeinander folgenden Tagen.
3.1.1. Herkunft der Ovarien
Die Ovarien wurden einmal wöchentlich aus einem nahe gelegen Schlachthof von
frisch geschlachteten Tieren gesammelt. Hierbei wurde darauf geachtet, dass die
Tiere, denen die Ovarien entnommen wurden, weder trächtig noch juvenil waren und
die Ovarien keine zystischen Veränderungen aufwiesen. Die Ovarien wurden nach
dem Abschneiden in 37°C warmem PBS Complete in eine m Thermobehälter
schnellstmöglich ins Labor gebracht, um dort weiter bearbeitet zu werden. Das PBS
Complete enthielt auf 1000 ml destilliertes Wasser 9,65 g Dulbecco’s Phosphate
Buffered Saline, 10 ml PBS-Stocklösung, 11,2 mg Heparin (= 4 I.E.) sowie 1 g
Bovines Serumalbumin (Fraktion V).
3.1.2 Vorbereitung und Selektion der Kumulus-Oozyten-Komplexe
Die
Vorbereitung der Kumulus-Oozyten-Komplexe
(KOK) begann mit
dem
dreimaligen Waschen der frischen Ovarien mit je 350 ml 0,9%iger Natrium-ChloridLösung, die zuvor im Wasserbad auf 37°C erwärmt wur de. Der Lösung waren 0,06 g
Penicillin und 0,1 g Streptomycin pro Liter zugesetzt.
46
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Anschließend wurden mittels der Slicing-Methode (ECKERT u. NIEMANN 1995) die
Oozyten aus den Ovarien isoliert. Die Ovarien wurden hierzu mit einer
Arterienklemme fixiert und in eine Petrischale, die 100 ml PBS Complete enthielt,
getaucht. Das Schneiden fand mit einem Block bestehend aus zehn parallel
zueinander befestigten Rasierklingen (im Abstand von ca. 2-3 mm zueinander) statt.
Dabei wurden oberflächliche und tiefe Follikel eröffnet und die KOK zusammen mit
der Follikelflüssigkeit herausgespült. Anschließend wurde die so gewonnene
Flüssigkeit gemeinsam mit dem bereits in der Petrischale enthaltenen PBS Complete
durch ein herkömmliches Sieb in ein Becherglas gegossen, um überschüssige
Gewebestücke zu entfernen. Die Petrischale und das Sieb wurden anschließend
zweimal mit je 50 ml PBS Complete gespült, um noch eventuell in der Petrischale
vorhandene KOK zu erhalten.
Die nun im Becherglas vorhandene Flüssigkeit stand für zehn Minuten zur
Sedimentation auf einem Styroporstück, um ein Auskühlen der Flüssigkeit zu
verhindern bzw. zu verlangsamen. Anschließend wurde der Flüssigkeitsüberstand
bis auf 100 ml mit einer herkömmlichen Vakuumpumpe abgesaugt. Die Verteilung
des Sediments erfolgte gleichmäßig auf Plastikreagenzbehälter mit je 15 ml
Fassungsvermögen und es ruhte erneut für zehn Minuten zur Sedimentation. Dies
geschah auf einer Wärmeplatte mit einer Temperatur von 37°C.
Das Sediment in jedem Reagenzgefäß wurde nun mittels einer Pasteurpipette
abgesaugt, in eine Plastikpetrischale überführt und auf ca. 80 ml mit PBS Complete
aufgefüllt. Das Heraussuchen der KOK erfolgte unter einem Stereomikroskop (Fa.
Olympus, Hamburg, Deutschland) mit Wärmeplatte aus dem verdünnten Sediment.
Gefundene KOK wurden mit einer 0,25 µl Glaspipette (Fa. Hirschmann, Eberstadt,
Deutschland) und eines Pipettierhelfers (Fa. Brand, Wertheim, Deutschland) in 2 ml
TCM air überführt. Die bereits gefundenen KOK verblieben im TCM air bis die
Sedimente aller Reagenzgefäße nach KOK abgesucht worden waren. Anschließend
erfolgte die Selektion der KOK bezüglich ihrer Qualität. Die Einteilung erfolgte in fünf
Kategorien, die der Tabelle 6 entnommen werden können. Für die In-vitro-Produktion
taugliche KOK (Abbildung 7) waren solche der Kategorien 1, 2 und 3.
47
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Die Kategorie 1 zeichnet sich durch einen mindestens dreilagigen Cumulus oophorus
aus, wobei die Oozyte ein dunkles gleichmäßig granuliertes Zytoplasma aufweist.
KOK der Kategorie 2 haben ebenfalls ein homogenes dunkles Zytoplasma, jedoch
weist der Cumulus oophorus stellenweise weniger als drei Lagen auf. KOK der
Kategorie 3 weisen ein homogenes oder heterogenes Zytoplasma auf und besitzen
einzelne anhaftende Kumuluszellen.
Anschließend wurden die so selektierten KOK zufällig in Gruppen zu zwanzig
Oozyten zusammengefasst und zur Ausverdünnung des TCM air Mediums
nacheinander durch drei unter Silikonöl befindliche 100 µl Tropfen TCM+BSA
pipettiert (Waschen).
Tabelle 6: Klassifizierung gefundener Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK)
Kategorie
1. Kategorie
2. Kategorie
3. Kategorie
4. Kategorie
5. Kategorie
IVP-Tauglichkeit
Homogenes dunkles Ooplasma;
kompakter drei-bis vierlagiger
Kumulus
Homogenes, dunkles Ooplasma;
mindestens eine durchgehende
Lage an Kumuluszellen
Homogenes dunkles Ooplasma,
oder davon abweichend
(heterogenes oder homogenes
helles Zytoplasma);
einzelne anhaftende
Kumuluszellen
Beschaffenheit des Ooplasmas
wie in Kategorien 1 bis 3;
keine anhaftenden
Kumuluszellen;
leere Zonae
Beschaffenheit des Ooplasmas
wie in Kategorien 1 bis 3;
deutliche Expandierung des
Cumulus oophorus
48
Ja
Ja
Ja
Nein
Nein
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Abbildung 7: IVP-taugliche Kumulus-Oozyten-Komplexe
3.1.3. In-vitro-Maturation
Das Reifungsmedium bestand aus TCM + BSA + Suigonan (Fa. Intervet,
Unterschleißheim) und wurde in einer Petrischale (∅ 35 mm) in vier Tropfen à 100 µl
und mit Silikonöl (Fa. Serva, Deutschland) überschichtet. Die Tropfen wurden
mindestens eine Stunde vor Gebrauch im Brutschrank (HeraCell, Fa. Heraeus,
Thermo Fisher Scientific, USA) bei 39,0°C und 5% CO 2 äquilibriert. Die KOK wurden
nach dem oben beschriebenen Waschen in die äquilibrierten Reifungsdrops
überführt und für 24 Stunden bei 39,0°C und 5% CO 2 und feuchtigkeitsgesättigter
Atmosphäre im Inkubator kultiviert.
Abbildung 8: KOK nach 24-stündiger Reifung
49
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.1.4. Fertilisation
Die gereiften KOK wurden dreimal in FertTALP-Gebrauchslösung gewaschen und
anschließend in die Fertilisationstropfen bestehend aus 120 µl HHE (HypotaurinHeparin-Epinephrin) + 2 ml FertTALP überführt. Auch diese waren zu viert mit einer
Tropfengröße von 100 µl in einer Petrischale mit dem Durchmesser von 35mm
angeordnet. Die Fertilisationstropfen wurden zur Äquilibrierung mindestens eine
Stunde vor dem Umsetzten der KOK bei 39,0°C und 5% CO2 in den Brutschrank
verbracht.
Das Tiergefriersperma für die Fertilisation wurde für 10 Sekunden in 30°C warmen
Wasser aufgetaut. Es wurde direkt nach dem Auftauen auf ausreichende Motilität der
Spermien hin überprüft und anschließend für 16 Minuten bei 380 x g
(2380
Umdrehungen/Minute) in einer Zentrifuge (Mini Spin plus, Fa. Eppendorf,
Deutschland) mit einem 90%igen Gradienten aus Sperm Filter® und FertTALP
Lösung in einem Eppendorfgefäß zentrifugiert. Der Überstand wurde nach dem Ende
der Zentrifugation bis auf 50 µl abgenommen und verworfen. Das im Eppendorfgefäß
verbliebene Pellet wurde in 750 µl FertTALP-Gebrauchslösung resuspendiert und
erneut für 3 Minuten bei 380 x g zentrifugiert. Daraufhin wurde der Überstand wieder
bis auf 50 µl abgesogen und verworfen. Eine erneute
Resuspendierung
des
verbliebenen Restes erfolgte mit 750 µl HHE-Lösung. Abschießend wurde die
Spermalösung nochmals bei 380 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde nun bis auf
100 µl abgenommen und die Spermatozoen im offenen Eppendorfgefäß im
Brutschrank bei 39,0°C und 5% CO 2 aufbewahrt. Es erfolgte anschließend eine
Dichtebestimmung der Spermien mittels einer Thomakammer, um die erforderliche
Spermiendichte von 100 000 Spermien/100 µl FertTALP/HHE Lösung zu erlangen.
Der Zusatz der Spermien erfolgte 23-24 Stunden nach Maturationsbeginn direkt in
die zuvor mit KOK bestückten Fertilisationstropfen.
Für die Befruchtung wurden die Petrischalen mit den KOK und den Spermien für 19
Stunden in einen Brutschrank mit 39,0°C und 5% CO 2 und feuchtigkeitsgesättigter
Atmosphäre verbracht.
50
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.1.5. In-vitro-Kultur
Nach 19stündiger Kokultur der gereiften KOK und Spermien, wurden die
vermeintlichen Zygoten in eine 35 mm im Durchmesser große Petrischale mit 2 ml
auf 37°C erwärmten TCM air verbracht und die Kumulu szellen mittels einer
ausgezogenen Glaskapillare unter stereomikroskopischer Sichtkontrolle entfernt. Zur
Temperaturerhaltung des Mediums wurde auf einer Wärmebank gearbeitet. Die von
den
Kumuluszellen
vollständig
befreiten
Zygoten
wurden
nach
drei
Medienausdünnungsschritten in Gruppen à sechs Stück in 30 µl Tropfen (Synthetic
Oviduct Medium (SOF) aa) unter Öl (Fa. Serva, Deutschland) bei 39,0°C, 5% CO 2
und 5% N2 für acht Tage kultiviert. Kontrollen bezüglich der Teilungs- und
Entwicklungsraten erfolgten an Tag 7 und an Tag 8.
Abbildung 9: Expandierte Blastozyste nach siebentägiger In-vitro-Kultur
Hierbei wurden an Tag sieben vorhandene expandierte Blastozysten aus der Kultur
entnommen und randomisiert für die konventionelle Kryokonservierung und die
Vitrifikation eingesetzt.
3.2. Konventionelle Kryokonservierung
Für die konventionelle Kryokonservierung wurde ein Gefriergerät der Firma Cryologic
(Australien) Model CL-5500 mit vorprogrammierten Einstellungen verwandt.
51
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Als Vorbereitung für die konventionelle Kryokonservierung wurde zunächst 1,5M
Ethylenglykol (Fa. Emcare, Mairangi Bay, Neuseeland) in einem Wärmeschrank auf
37°C vorgewärmt. Gelbe Pailletten mit einem Volumen von 25 µl wurden mit 1,5 M
Ethylenglykol gespült. Verschlusskügelchen für die Pailletten wurden bereitgelegt.
Die Embryonen, die sich an Tag sieben der Kultur im Stadium einer expandierten
Blastozyste befanden, wurden den Kulturdrops entnommen und zunächst in TCM air
auf einer Wärmebank aufbewahrt. Anschließend wurden sie dreimal im bereits
vorgewärmten Ethylenglykol gewaschen und dann in eine Petrischale verbracht, in
der
sich
2
ml
des
vorgewärmten
Ethylenglykols
befanden.
Der
Äquilibrierungszeitraum der Embryonen betrug 10 Minuten. Die Embryonen wurden
während dieser Äquilibrierung folgender Abbildung entsprechend in die vorbereiteten
Straws aufgezogen.
Luft
EG
EG
Luft
EG+Embryo
Luft
EG
Luft
EG
////////
Abbildung 10: Aufbau des gefüllten Straws vor der Kryokonservierung (EG =
Ethylenglykol;
= Verschlusskügelchen, //////// = Wattestopfen)
Die Straws wurden dann mit den bereitgelegten Kügelchen verschlossen und bis
zum Überführen in den Gefrierautomaten senkrecht mit dem Wattestopfen nach
unten auf einer Wärmeplatte aufbewahrt. Es erfolgte eine abschließende Kontrolle
der Straws unter dem Lichtmikroskop auf das tatsächliche Vorhandensein eines
Embryos hin.
Nach der Äquilibrierung wurden die Straws von Raumtemperatur direkt in die
Kryokammer des Gefrierautomatens überführt. Hier erfolgte bei -6°C zunächst das
Seeding, indem eine Kristallisation der untersten Flüssigkeitssäule des Straws durch
Kontakt mit einer in flüssigen N2 abgekühlten Arterienklemme ausgelöst wurde. Dies
geschah, um eine schädliche Unterkühlung der Embryonen zu vermeiden. Danach
wurde
das
entsprechende
Programm
zur
Kryokonservierung
von
bovinen
Embryonen gestartet. Hierbei wurde die Embryonen nachdem sie für 10 Minuten bei
einer Temperatur von -6°C gehalten wurden, mit eine r Rate von 0,5°C/min auf eine
52
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Temperatur von -35°C heruntergekühlt. Der
Temperat urverlauf während des
Programms kann Abbildung 11 entnommen werden.
Nach Beendigung des Programms wurden die Straws mit den Embryonen direkt in
flüssigen Stickstoff in eine Temperatur von -196°C überführt. Dort verblieben die
Embryonen bis zum Auftauen.
0
-5
Temperatur/°C
-10
-15
-20
-25
-30
-35
-40
0
10
20
30
40
50
60
70
Zeit/Minuten
Abbildung 11: Programm 0 Einfrierautomat CL-5500, Herabsenken der
Temperatur von -6°C in 0,5 °C-Schritten auf eine En dtemperatur von -35°C 68
Minuten nach Beginn des Programms
3.3. Vitrifikation
Die Vitrifikation der Embryonen erfolgte ebenfalls mit an Tag sieben expandierten
Blastozysten. Hierfür wurde ein kommerziell erhältliches Vitrifikationskit der Firma
Gynemed verwandt. Es bestand aus einem Präinkubationsmedium und zwei
Gefriermedien. Die Lösungen basierten auf einer PBS-Lösung und enthielten
Dimethylsulfoxid (DMSO), Ethylenglykol, Ficoll, Saccharose und humanes Serum
Albumin (HSA). Für die Durchführung der Vitrifikation wurden weiterhin benötigt:
Four-well-dishes, Pipetten, Pipettierhelfer, ein Stereomikroskop, eine Wärmeplatte,
53
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Vitriplugs (siehe Abb. 11 und 12), Straws, flüssiger Stickstoff und eine Stoppuhr. Die
Vitrifikation wurde nach dem beigefügten Protokoll der Firma Gynemed durchgeführt.
Abbildung 12: Vitriplug und Straw
Abbildung 13: Spitze des Vitriplug
Die benötigten Medien waren auf 37°C vorgewärmt. Da nn wurden in Well 1 und 2
des Four-well-dishes jeweils 300 µl des Präinkubationsmediums gegeben. In Well 3
befanden sich 300 µl des VitriStore Freeze 1 Mediums und in Well 4 300 µl des
VitriStore Freeze 2 Mediums. Die Embryonen, die zunächst in TCM air auf einer
Wärmeplatte zwischengelagert waren, wurden zunächst im ersten Well im
Präinkubationsmedium gewaschen und verblieben dann für zwei Minuten im zweiten
Well, ebenfalls im Präinkubationsmedium. Anschließend erfolgte eine Überführung
der Embryonen in das dritte Well, in dem sich das VitriStore Freeze 1 befand. In
diesem Medium äquilibrierten die Embryonen wieder für zwei Minuten. Abschließend
wurden die Blastozysten für 20 Sekunden in das VitriStore Freeze
54
2-Medium
Material und Methoden
___________________________________________________________________
transferiert. Die maximale Kontaktzeit mit diesem Medium war auf 40 Sekunden
beschränkt (Tabelle 7).
Tabelle 7: Protokoll zur Vitrifikation von bovinen Blastozysten (Fa. Gynemed)
Well 1
Well 2
Pre-
Pre-
Inkubations-
Inkubations-
Medium
Medium
Menge
300 µl
Dauer
max 15 Sek.
Medium
Well3
Well 4
VitriStore
VitriStore
Freeze 1
Freeze 2
300 µl
300 µl
300 µl
2 min
2 min
20 – 40 Sek
Die Blastozysten wurden auf den Vitriplug pipettiert und direkt in den bereitgestellten
Stickstoff überführt. Unter Stickstoff erfolgte dann die Insertion des Vitriplugs in den
Straw mit der Hilfe von Arterienklemmen.
3.4. Auftauen nach konventioneller Kryokonservierung
Vor dem Auftauen der Blastozysten wurde TCM air auf 37°C vorgewärmt und eine
Petrischale mit 35 mm Durchmesser mit 2ml befüllt. Auf der Wärmeplatte befand sich
ebenfalls eine zweite Petrischale mit drei Tropfen à 100 µl TCM air. Es erfolgte das
Überführen der Straws mit den konventionell kryokonservierten Embryonen aus dem
Aufbewahrungsbehälter in ein Isoliergefäß, das mit flüssigem Stickstoff gefüllt war.
Nun tauten die Straws für 2 Sekunden bei Raumtemperatur und für 10 Sekunden in
30°C warmem Wasser auf. Dann wurden die Straws geöf fnet und der Embryo wurde
mit dem Ethylenglykol in eine Petrischale überführt. Unter mikroskopischer Kontrolle
wurde der Embryo im Ethylenglykol gesucht und dann zum Waschen durch die
vorbereiteten Tropfen pipettiert. Nach dem Waschen wurden die Embryonen bis
zum Umsetzen in Kulturtropfen, wie sie auch für die IVC verwandt wurden (SOFaa),
in 2 ml TCM air auf der Wärmeplatte aufbewahrt. In den Kulturtropfen befanden sich
sechs bis acht Blastozysten.
55
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.5. Auftauen nach Vitrifikation
Zum Auftauen der vitrifizierten Embryonen wurde ebenfalls ein kommerziell
erhältliches Kit verwandt, das analog zu dem Vitrifikationskit von der Firma Gynemed
stammte. Die Medien enthalten DMSO, Ethylenglycol, Ficoll, Saccharose und
humanes Serumalbumin und basieren auf einer PBS-Lösung. Das mitgelieferte
Protokoll sieht eine vierstufige Ausverdünnung des VitriStore Freeze Mediums 2
mittels der mitgelieferten VitriStore Thaw Medien 1 bis 4 vor.
Zunächst wurden die VitriStore Thaw Medien auf 37°C erwärmt.
Anschließend wurden 2 ml des VitriStore Thaw Mediums 1 in eine Petrischale mit 35
mm Durchmesser gegeben. Von den VitriStore Thaw Medien 2, 3 und 4 wurden je
300 µl in je ein Well eines Four-Well-Dishes pipettiert.
Die Vitriplugs in ihren Straws wurden aus dem Aufbewahrungsbehälter in ein mit
flüssigem Stickstoff gefülltes Isolationsgefäß überführt. In diesem Isolationsgefäß
wurde der Straw vom Vitriplug entfernt, wobei darauf geachtet wurde, dass die Spitze
des Vitriplugs die ganze Zeit im flüssigen Stickstoff verblieb. Dann wurde der
Vitriplug unter mikroskopischer Kontrolle in die Petrischale mit dem VitriStore Thaw
Medium 1 getaucht. Nach dem Auffinden der Blastozysten in der Petrischale wurden
diese mehrfach in die Pipette aufgezogen und wieder ins Medium abgegeben, was
eine Ausverdünnung des Einfriermediums bewirkte. Die Embryonen sollten nicht
mehr als drei und nicht weniger als eine Minute im VitriStore Thaw 1 Medium
verbleiben. Anschließend wurden die Blastozysten in das VitriStore Thaw Medium 2
überführt. In diesem verblieben die Blastozysten zwei Minuten, um dann für weitere
zwei Minuten in das VitriStore Thaw Medium 3 verbracht zu werden. Im letzten
Schritt des Ausverdünnungsprozesses wurden die Blastozysten für zwei Minuten im
VitriStore Thaw 4 Medium aufbewahrt (siehe Tabelle 8). In diesem Medium wurden
die Embryonen mehrfach gespült und dann bis zum Umsetzten in die Kulturtropfen
(SOFaa) in 2 ml TCM air bei 37°C auf einer Wärmep latte aufbewahrt.
56
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Tabelle 8:
Protokoll zum Auftauen von vitrifizierten Blastozysten (Fa.
Gynemed)
Well 1
Well 2
Well 3
Well 4
VitriStore
VitriStore
VitriStore
VitriStore
Thaw 1
Thaw 2
Thaw 3
Thaw 4
Menge
2 ml
300 µl
300 µl
300 µl
Dauer
1-3 min
2 min
2 min
2 min
Medium
In den Kulturtropfen befanden sich sechs bis acht Blastozysten pro Tropfen.
57
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.6. Qualitätskontrolle der Embryonen nach dem Auftauen
Um beurteilen zu können, inwiefern das jeweilige Einfrierverfahren einen Einfluss auf
die Qualität der Embryonen nach dem Auftauen hat, wurden verschiedene
Untersuchungen an den Embryonen durchgeführt.
3.6.1. Reexpansions- und Schlupfrate
Nach dem Auftauen der Blastozysten wurden sie in TCM air auf einer Wärmeplatte
bei einer Temperatur von 37°C aufbewahrt. Eine erst e stereomikroskopische
Kontrolle bezüglich der Wiederherstellung des Blastocoels erfolgte zu diesem
Zeitpunkt. Anschließend wurden die Blastozysten dann in Gruppen zu 6-8 in ein
SOF-Kultursystem verbracht und bei 39,0°C, 5% CO 2, 5% N2 und gesättigter
Atmosphäre für 48 Stunden kultiviert.
Nach 24 Stunden erfolgte zunächst eine mikroskopische Kontrolle bezüglich der
völligen Reexpansion der aufgetauten Embryonen. Die Embryonen wurden hiernach
ohne weitere Manipulation am Kultursystem oder an ihnen selbst erneut in den
Brutschrank verbracht. Nach Ablauf der 48 Stunden wurden die Embryonen ein
weiteres Mal unter dem Stereomikroskop begutachtet. Zu diesem Zeitpunkt wurde
nicht nur die Anzahl der reexpandierten Blastozysten beurteilt, sondern auch die
Anzahl derer, bei denen es in der Kultur zum Schlupf gekommen war.
Ein Teil der geschlüpften Embryonen wurden einzeln dreimalig durch PBS mit
Polyvinylalkohol (0,1%ig) pipettiert und in sterilen Eppendorfcups bei -80°C
eingefroren, um später für die mRNA-Analyse genutzt werden zu können.
Der andere Teil der geschlüpften Blastozysten wurde direkt weiter für die LebendTot-Färbung verwandt.
3.6.2. Färbung
Die Färbung der geschlüpften Embryonen erfolgte mittels einer Lebend-Tot-Färbung,
bei der zwei Fluoreszenzfarbstoffe genutzt wurden. Zum Einsatz kamen hier
58
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Ethidium homodimer (Fa. Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland; Abbildung 14) und
Bisbenzimid (Hoechst 33342, Fa. Invitrogen; Abbildung 15). Der Hoechstfarbstoff ist
ein permeabler Farbstoff, der es ermöglicht, lebende Zelle mit intakter Zellmembran
blau an zu färben. Das Ethidium homodimer hingegen ist nicht in der Lage eine
intakte Zellmembran zu passieren und färbt nur solche Zellen an, deren Zellwand
durch den vorhergegangenen Zelltod zerstört wurden. Die Färbung ermöglichte die
Identifizierung von Zellen mit und ohne Zellwanddefekten, sowie die Bestimmung der
Gesamtzellzahl.
Abbildung 14: Strukturformel Ethidium homodimer
Abbildung 15: Strukturformel Bisbenzimid
Von beiden Farbstoffen wurden zunächst Stocklösungen hergestellt, die dann für die
Färbung zu Gebrauchslösungen verdünnt wurden. Um für das Bisbenzimid eine
Endkonzentration der Gebrauchslösung von 0,002% zu erreichen, wurden zunächst
2 mg Bisbenzimid in 1 ml H2O bidest gelöst. Diese Lösung wurde in 10 µl Aliquots
aufgeteilt. Zum Erstellen der Gebrauchslösung wurden dann 2 µl aus einem Aliquot
entnommen und mit PBS + PVA auf ein Gesamtvolumen von 2 ml aufgefüllt.
59
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Die gewünschte Endkonzentration des Ethidium homodimers betrug 0,01%. Die
Stocklösung war eine 0,1%ige Lösung, in der 1mg des festen Ethidium homodimers
mit 1 ml H2O bidest gelöst wurde. Anschließend wurde der Farbstoff in 50 µl
Portionen aliquotiert. Zur Erlangung der Gebrauchslösung wurde der Inhalt eines
Aliquots mit 450 µl PBS + PVA verdünnt.
Bei der Färbung wurden die Blastozysten zunächst dreimalig in auf 37°C erwärmten
PBS gewaschen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur und Lichtausschluss in das
Ethidium homodimer überführt. Anschließend erfolgte ein erneutes dreimaliges
Waschen der Blastozysten in PBS und woraufhin sie für weitere zwei Minuten in das
Bisbenzimid verbracht wurden. Darauf folgend wurden die Embryonen ein drittes Mal
dreimalig in PBS gewaschen, um dann auf einen Objektträger pipettiert zu werden
und mit einem Deckgläschen abgedeckt zu werden.
Nun erfolgte eine Gesamtzellzahlzählung unter dem Floureszenzmikroskop (Fa.
Olympus) bei 20facher Vergrößerung. Parallel wurde zwischen lebenden und toten
Zellen differenziert. Lebende Zellen stellten sich mittels der Differentialfärbung blau
dar, tote Zellen durch das verwandte Ethidium homodimer rot. Anschließend wurden
Floureszenzaufnahmen mit einer Auflicht-Floureszenz-Einrichtung (BX-FLA, Fa.
Olympus, Deutschland) gemacht.
3.6.3. Messenger RNA Analyse zur Darstellung entwicklungsrelevanter
Gentranskripte in bovinen präimplantatorischen Embryonen
Geschlüpfte Blastozysten, die entweder zuvor vitrifiziert oder konventionell
kryokonserviert worden waren sowie solche die zuvor nicht eingefroren worden
waren wurden auf acht entwicklungsrelevante Gentranskripte untersucht. Es wurden
zwei Glukosetransporter (SLC2A1 und SLC2A3), eine DNA-Methyltransferase
(DNMT3A), drei Zell-Zell-Verbindungsproteine (Zona occludens (TJP1), Desmocollin
II (DSC2), E-cadherin (CDH1)), Interferon τ (IFNτ) als Protein, das die maternale
Erkennung der Trächtigkeit induziert sowie ein Stressindikator Heat Shock Proteins
70 (HSP70-1) untersucht.
60
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.6.3.1. Isolierung der mRNA
Die mRNA – Analyse der Embryonen bedurfte mehrerer Schritte. Die Embryonen
waren in silikonisierten Eppendorf-Cups eingefroren.
Der erste notwendige Schritt war die Isolierung der mRNA aus den Embryonen
mittels des Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Kits (Fa. Invitrogen).
Die Aufbereitung der Proben erfolgte mittels eines Lysispuffers. Die mRNA bindet an
die Dynabeads. Durch das Binden der Dynabeads im Magnetic Particle Counter
(MPC) konnte der Flüssigkeitsüberstand abgenommen werden. Dieser Vorgang
wurde dreimal wiederholt.
Zu jedem Embryo wurden 150 µl Lysis-Puffer sowie 1µl Kaninchen-Globin-mRNA
(1 pg/µl) gegeben. Die Kaninchen-Globin-mRNA diente als Standard. Die Proben
wurden anschließend für 10 Sekunden gevortext, dann kurz zentrifugiert und für 10
Minuten bei Raumtemperatur zum Inkubieren belassen. Nach Ablauf der
Inkubationszeit wurden je Probe 10 µl der zuvor präparierten Dynadeads zugegeben
und erneut für 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttelblock inkubiert. Hier
erfolgte die Bindung des PolyA-Schwanzes der embryonalen mRNA an die
Dynabeads. Dann wurden die Proben in den MPC gestellt und der Überstand aus
dem Eppendorf-Gefäß entfernt. Nun wurde jede Probe einmal mit 100 µl WaschPuffer A und dreimal mit 100 µl Wasch-Puffer B gewaschen, wobei jedes Mal der
Überstand nach dem Waschen entfernt wurde.
Die Trennung der embryonalen mRNA von den Dynabeads erfolgte nach dem letzten
Waschschritt bei 65°C in einem Thermomixer der Fa. Eppendorf für drei Minuten.
Hierfür erfolgte zunächst eine Zugabe von 11 µl H2O (Ampuwa). Anschließend
wurden die Eppendorfgefäße in den gekühlten MPC auf Eis verbracht. Der nun
entstandene Überstand wurde sofort für die Reverse Transkriptase Reaktion
verwandt. Die Konzentrationen der einzelnen Medien sind den Tabellen 9-12 zu
entnehmen.
61
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Tabelle 9: Lysis/Bindingpuffer
Konzentration
pH
Tris-HCl
100 mM
7,5
LiCl
500 mM
EDTA
10 mM
LiDS
1%ig
DTT (Dithiothreitol)
5 mM
8,0
Tabelle 10: Wasch-Puffer A
Konzentration
pH
Tris-HCl
10 mM
7,5
LiCl
0,15 mM
EDTA
1 mM
LiDS
0,1%ig
Tabelle 11: Wasch-Puffer B
Konzentration
pH
Tris-HCl
10 mM
7,5
LiCl
0,15 M
EDTA
1 mM
Tabelle 12: Tris-HCl
Konzentration
pH
10 mM
7,5
Tris-HCl
3.6.3.2. Reverse Transkription (RT)
Die Reaktion der Reversen Transkription wurde in einem Endvolumen von 20 µl
durchgeführt. Zusätzlich zum Standard, der Negativ-Kontrolle der Probe, der
62
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Negativkontrolle des Standards und der Probe selbst wurde eine Negativkontrolle
mitgeführt, die anstelle von mRNA steriles Wasser (Ampuwa®, Fa. Fresenius, Bad
Homburg, Deutschland) enthielt, um eine Kontamination der Medien ausschließen zu
können.
Tabelle 13: Zusammensetzung des Master-Mixes (MM)
für die Reverse
Transkription
Komponente
Volumen
Endkonzentration
10 x PCR Puffer
2 µl
1x
MgCl2 (50mM)
2 µl
5 mM
dNTPs (10mM)
2 µl
1 mM
Hexamer Primer (50µM)
1 µl
2,5 µM
RNase Inhibitor (20IE/µl)
1 µl
20 U
1 µl
50 U
Reverse Transkriptase
(50IE/µl)
Der Master-Mix (MM) wurde für alle Proben gemeinsam angesetzt. Die genaue
Zusammensetzung des Master-Mixes ist Tabelle 13 zu entnehmen. Zum Master-Mix
wurden 11 µl mRNA aus der vorangegangenen RNA-Isolierung zugefügt. Die
Negativkontrollen wurden mit 11 µl Ampuwa auf das Endvolumen aufgefüllt.
Die Reverse Transkription fand in einem PCR-Cycler (Fa. Biometra, Göttingen) nach
folgendem Programm statt:
•
10 Minuten bei 25°C
•
60 Minuten bei 42°C (Reverse Transkription der mRN A in cDNA)
•
5 Minuten bei 99°C (Denaturierung)
Anschließend wurden die Proben auf Eis kühl gelagert und dann der PolymeraseKettenreaktion zugeführt.
63
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.6.3.3. Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Mittels der cDNA wurden in einer Polymerase-Kettenreaktion verschiedene
Gentranskripte auf die Intensität ihrer Expression hin untersucht.
Untersucht wurden hierbei Gene, die für die Embryonen eine Entwicklungsrelevanz
darstellen. Die Primersequenzen sind in Tabelle 14 aufgelistet.
64
Material und Methoden
___________________________________________________________________
DNMT3A
SLC2A1
SLC2A3
HSP70-1
IFNτ
TJP1
CDH1
DSC2
Globin
F: ACT ATA CCG ACG TCT CCA ACA TGA
R: ACC GGC CCA GCA GTC TCT
F: CAG GAG ATG AAG GAG GAG AGC
R: CAC AAA TAG CGA CAC GAC AGT
F: ATC CCT GTG GTC CTT GTC TG
R: GAT AAT CAG TCG GCC CAA GA
F: GGG GAG GAC TTC GAC AAC AGG
R: CGG AAC AGG TCG GAG CAC AGC
F: TCT CTA CTG ATG GCC CTG GT
R: GAT CCT TCT GGA GCT GGT TG
F: CGA CCA GAT CCT CAG GGT AA
R: GAA TCA CCC ACA TCG GAT TC
F: TGT GAC TGT GAT GGG ATC GT
R: ATA CAC ATT GTC CCG GGT GT
F: GGC AGC ACG TCT CTC CTA CT
R: GAT GGC CCA CTT TCC AAG TA
F: GCA GCC ACG GTG GCG AGT AT
R: GTG GGA CAG GAG CTT GAA AT
57
257
202
245
203
162
204
199
257
Datenbanknr.
Primersequenz*
Position des
Primers
Gen
Größe des
Amplifikates (bp)
Tabelle 14: Übersicht über die verwendeten Primer
2162
2201
BC114063
894
M60448
1151
295
496
844
1088
95
302
NM_174603
NM_174550
NM_001015511
40
AJ313183
201
2056
2259
AY508164
1744
1942
241
555
*Alle Primersequenzen wurden vom 5’ zum 3’ –Ende aufgelistet.
65
M81190
X04751
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Die bei der PCR eingesetzten Embryonenäquivalente (EA) variierten je nach
untersuchtem Gen. Die entsprechenden EA können der Tabelle 15 entnommen
werden. Die PCR wurde im Doppelansatz durchgeführt
Tabelle
15:
Eingesetzte
Embryonenäquivalente
bezogen
auf
das
zu
untersuchende Gentranskript
Embryonenäquivalent
Embryonenäquivalent
(einfacher Ansatz)
(doppelter Ansatz)
DNMT3A
0,0125
0,025
SLC2A1
0,1
0,2
SLC2A3
0,025
0,05
HSP70-1
0,05
0,1
IFNτ
0,05
0,1
TJP1
0,025
0,05
CDH1
0,0125
0,025
DSC2
0,025
0,05
Globin (Embryo)
0,05
0,1
Gen
Die real time PCR wurde mit einem Endvolumen von 20 µl durchgeführt. Die real
time
PCR
ermöglicht
die
Quantifizierung
von
Gentranskripten
durch
die
Sichtbarmachung derselben mit Fluoreszenzen.
Der Mastermix („Mesa Green qPCR MasterMix Plus for SYBR® Assay w/ flourescin“,
Fa. Eurogentec, Köln) enthielt Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs),
Meteor
Taq Polymerase, MgCl2, SYBR® Green I, Stabilisatoren und Floureszin und ist
kommerziell erhältlich. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die PCR
ist Tabelle 16 zu entnehmen.
Für die Untersuchung jedes Gens erfolgten mindestens 11 Wiederholungen.
66
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Tabelle 16: Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die RT- qPCR
Konzentration
Master-Mix RT-qPCR
Einfacher Ansatz
1-facher Ansatz
10 µl
Primer Forward
0,2 µM
0,4 µl
Primer Reverse
0,2 µM
0,4 µl
(Fa. Eurogentec)
cDNA
2 - 0,25 µl
H2O (Ampuwa, Fresenius,
ad 20 µl
Bad Homburg)
Das Protokoll der real time PCR sah für alle Primer eine zehn Minuten andauernde
Denaturierung bei 95°C vor. Anschließend erfolgten 43 Zyklen des PCR-Programms:
•
15 Sekunden bei 95°C
•
30 Sekunden bei 60°C
•
30 Sekunden bei 72°C
Die anschließende Schmelzkurve zur Verifikation der PCR-Fragmente erfolgte in
einer schrittweisen Erhöhung um 0,5°C (alle 10 Seku nden), beginnend mit einer
Starttemperatur von 55°C bis zu einer Endtemperatur von 95°C.
Die Größe der spezifischen Fragmente wurde über eine Agarosegelelektrophorese
(s. Kapitel 4.4; Abbildung 19) verifiziert.
3.7.
Statistische Analyse
Die statistische Auswertung der Untersuchungen erfolgte mit Hilfe der SigmaStat 2.0
Software (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA). Dabei wurden zunächst alle
Daten eines Gens auf eine Normalverteilung mittels des Kolmogorov-Smirnov Tests
getestet.
Die Auswertung der Reexpansions- und Schlupfraten erfolgte über eine ANOVA mit
anschließendem Tukey Test.
67
Material und Methoden
___________________________________________________________________
Die Auswertung der Zellzahlen und der Lebend-Tot-Ratio erfolgte ebenfalls über eine
Varianzanalyse.
Für die Auswertung der RT-qPCR erfolgte zunächst eine einfache ANOVA
Varianzanalyse für jedes Gen. Daran anschließend erfolgte ein Vergleich der
einzelnen Einfriergruppen und der Kontrollgruppe miteinander durch einen Tukey
Test, um potentiell gegebene Signifikanzen feststellen zu können. Dabei wurden
Unterschiede von P≤ 0,05 als statistisch signifikant angesehen.
68
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.8.
Allgemeiner Versuchsaufbau
Die Schwerpunkte der vorliegenden Arbeit lagen auf zwei Gebieten (Abbildung 16):
•
Vergleich der Vitrifikation und konventionellen Kryokonservierung
in vitro
produzierter boviner Blastozysten
•
Expressionsanalyse
der
entwicklungsrelevanten
Transkripte
der
Gene
DNMT3A, SLC2A1, SLC2A3, HSP70-1, IFNτ, TJP1, CDH1 und DSC2 in
unterschiedlich
kryokonservierten
bovinen
Embryonen
und
einer
Kontrollgruppe.
3.8.1. Produktion der In-vitro-Embryonen und Etablierung der Vitrifikation und
konventionellen Kryokonservierung boviner Blastozysten
Die Aneignung der Methodik zur In-vitro- Produktion boviner Embryonen erfolgte
über einen Zeitraum von vier Monaten, in denen einmal wöchentlich aus
Schlachthofovarien KOK gewonnen wurden, die anschließend gereift, befruchtet und
kultiviert wurden. Parallel erfolgte die Etablierung und Optimierung der Vitrifikation
und konventionellen Kryokonservierung mit Blastozysten, die aus der oben
beschriebenen IVP gewonnen wurden.
3.8.2. Darstellung verschiedener entwicklungsrelevanter Gene aus vitrifizierten
und konventionell kryokonservierten Rinderembryonen
Im Rahmen der Versuche erfolgte die Analyse der relativen Häufigkeit der
Transkripte des DNMT3A-, SLC2A1-, SLC2A3-, HSP70-1-, IFNτ-, TJP1-, CDH1sowie des DSC2-Gens bei Tag sieben-Blastozysten, die vitrifiziert, konventionell
kryokonserviert und nicht eingefroren wurden. Dies geschah mittels real-time RTPCR. Hierbei wurden die relativen Gehalte der genannten Gentranskripte in den
Embryonen, die nach unterschiedlichen Verfahren kryokonserviert wurden, mit denen
der Kontrollembryonen verglichen.
69
Material und Methoden
___________________________________________________________________
3.8.3. Versuchsanordnung
In-vitro-Produktion boviner Embryonen
Kontrollgruppe
Vitrifikation
expandierter
Blastozysten (Tag 7)
Konventionelle Kryokonservierung
expandierter Blastozysten (Tag 7)
Auftauen und Kultur der vitrifizierten und
konventionell kryokonservierten
Blastozysten
Bestimmung der Rexpansionsrate der
aufgetauten Blastozysten (nach 24h)
Kultivierung bis zum Schlupf
Lebend-Tot-Färbung mit
Ethidium homodimer und
Hoechst 33342
Bestimmung der Schlupfrate der
aufgetauten Blastozysten (nach 48h)
Bestimmung der relativen Menge
entwicklungsrelevanter Gentranskripte
DNMT3A
SCL2A1
HSP70-1
TJP1
Abbildung
16:
Schematischer
Überblick
70
über
CDH1
die
SCL2A3
IFNτ
DSC2
Versuchsanordnung
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4. Ergebnisse
4.1. Erstellung der in vitro produzierten Embryonen
Die In-vitro-Produktion von Embryonen erfolgte routinemäßig ein bis zwei Mal
wöchentlich im IVP-Labor der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule,
Hannover. In den Vorversuchen, die im April 2007 begannen, wurden zur Erlernung
der Technik einmal wöchentlich aus Schlachthofovarien im IVP-Labor Embryonen
generiert.
Die Hauptversuche begannen im Dezember 2007. Ingesamt wurden hier aus 28 IVPSitzungen 3981 Eizellen gewonnen, aus denen 738 Blastozysten generiert werden
konnten. Die durchschnittlichen Teilungs- und Entwicklungsraten sind in Tabelle 17
dargestellt.
Tabelle 17: Teilungs- und Entwicklungsraten der IVP-Sitzungen
Eizellen gesamt
Teilungsrate
Entwicklungsrate
n=3981
51,7 ± 10,3% (n=2057)
18,5 ± 6,0 % (n=738)
Von diesen 738 Blastozysten wurden 172 konventionell kryokonserviert, 126
vitrifiziert und 42 gingen im Stadium der geschlüpften Blastozyste in die
Kontrollgruppe für die RT-qPCR und die Differentialfärbung ein.
4.2. Bestimmung der Reexpansions- und Schlupfraten
Insgesamt wurden in 16 Durchgängen 172 Embryonen, die an Tag sieben das
Stadium der expandierten Blastozyste erreicht hatten, mit dem programmierbaren
Einfrierautomaten CL-5500 eingefroren. Das dazu verwandte Programm war
Programm 0. Bei einem Durchgang gab es Probleme mit dem Ablauf des
Programms.
Die
Embryonen
dieses
Durchganges
wurden
nicht
in
die
Untersuchungen einbezogen.
Es wurden in 14 Durchgängen 136 der eingefroren Embryonen wieder aufgetaut. Bei
fünf der 136 (3,7%) aufgetauten Embryonen nach konventioneller Kryokonservierung
71
Ergebnisse
___________________________________________________________________
war die Zona pellucida nach dem Auftauen zerstört. Sie wurden nicht weiter kultiviert.
Somit verbleiben 131 Embryonen, die weiterkultiviert wurden. Von diesen waren
nach 24 Stunden 104 reexpandiert und nach 48 Stunden 80 geschlüpft. Von diesen
80 Embryonen wurden 22 in silikonisierten Eppendorf-Cups bei -80°C für RT-qPCR
gelagert und 25 gingen in die Differentialfärbung ein.
Zusätzlich wurden im Rahmen der Versuche insgesamt 126 Embryonen im Stadium
der expandierten Blastozyste in 15 Durchgängen vitrifiziert. Von diesen wurden in 13
Durchgängen
112
Blastozysten
wieder
aufgetaut.
Sechs
der
aufgetauten
Blastozysten zeigten direkt nach dem Auftauen Schäden an der Zona pellucida und
wurden nicht weiter kultiviert. Somit wurden 106 Embryonen weiterkultiviert. Von
diesen waren nach 24 Stunden 86 Blastozysten reexpandiert und nach 48 Stunden
67 geschlüpft. Eine vergleichende Darstellung der Reexpansions- und Schlupfraten
ist in Tabelle 18 dargestellt.
Von den 67 geschlüpften Blastozysten wurden 30 in silikonisierten Eppendorf-Cups
bei -80°C für die RT-qPCR gelagert und 25 gingen in die Zellfärbung ein.
Tabelle 18: Reexpansions- und Schlupfraten der kryokonservierten Embryonen
nach dem Auftauen
Vitrifizierte Blastozysten (n=106)
Konventionell kryokonservierte Blastozysten
(n=131)
72
Reexpanionsrate
Schlupfrate
81,1 ± 20,3 %
63,2 ± 24,5%
(n = 86)
(n = 67)
79,4 ± 16,5%
61,1 ± 29,3%
(n = 104)
(n = 80)
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.3. Ergebnisse der Zellfärbung
Die Ergebnisse der Zellzahlzählung nach Lebend-Tot-Färbung mit den Farbstoffen
Ethidium
homodimer
und
Hoechst
33342
ergaben
für
die
konventionell
kryokonservierten Embryonen (n=23; Abbildung 17) nach dem Auftauen und Schlupf
im SOF-Kultursystem eine durchschnittliche Gesamtzellzahl von 117,6 ± 20,4 Zellen.
Die durchschnittliche Anzahl der toten Zellen, die sich rot darstellten, betrug 9,8 ± 5,6
Zellen.
Bei den vitrifizierten Blastozysten (n=22; siehe Abbildung 17) ergaben sich
durchschnittliche Gesamtzellzahlen von 121,3 ± 21,2 Zellen, davon durchschnittlich
11,1 ± 5,2 tote Zellen.
Abbildung 17: Konventionell Kryokonservierte Blastozyste nach Auftauen und
Schlupf mit Ethidium homodimer und Hoechst 33342 gefärbt
.
73
Ergebnisse
___________________________________________________________________
Die Zellfärbung der Kontrollgruppe (n=25), die im regulären Kultursystem ohne
zwischenzeitliche Kryokonservierung schlüpften, ergab ein Mittel der Gesamtzellzahl
von 130,2 ± 25,6 Zellen, bei durchschnittlich 9,24 ± 4,7 toten Zellen. Zwischen den
durchschnittlichen Zellzahlen für die Embryonen der einzelnen Gruppen ergaben sich
keine signifikanten Unterschiede.
Diese Daten sind in Tabelle 19 vergleichend dargestellt. Die Einzeldaten zu den
Zellfärbungen sind dem Anhang zu entnehmen.
Tabelle 19: Gesamtzellzahlen

SEM
Vitrifiziert (n=22)
121,3
21,2
Konventionell Kryokonserviert (n=23)
117,6
20,4
Kontrolle (n=25)
130,2
25,6
Abbildung 18: Vitrifizierte Blastozyste nach dem Auftauen und Schlupf mit Ethidium
homodimer und Hoechst 33342 gefärbt
74
Ergebnisse
___________________________________________________________________
Die Analyse der Lebend-Tot-Zellratio ergab keine signifikanten Unterschiede
zwischen den Embryonen der einzelnen Gruppen. Die Ergebnisse sind Tabelle 20 zu
entnehmen.
Tabelle
20:
Lebend-Tot-Zellratio
vitrifizierter
und
konventionell
kryokonservierter Embryonen sowie der Embryonen der Kontrollgruppe
Vitrifizierte
Embryonen
Lebend-Tot-Ratio
Konventionell
kryokonservierte
Kontrollgruppe
Embryonen
15,3
17,2
75
17,9
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.4. Darstellung der embryonalen mRNA-Expression der verschiedenen
entwicklungsrelevanten Gentranskripte nach dem Auftauen
Es wurde die relative Menge spezifischer Gentranskripte bei vitrifizierten und
konventionell kryokonservierten Embryonen, die an Tag sieben eingefroren wurden,
und nach dem Auftauen bis zum Schlupf weiterkultiviert wurden, untersucht.
Weiterhin erfolgte die Analyse der relativen Menge spezifischer Gentranskripte an
Embryonen der Kontrollgruppe. Hierzu wurden zwei Glukosetransporter (SLC2A1
und
SLC2A3),
eine
DNA-Methyltransferase
(DNMT3A),
drei
Zell-Zell-
Verbindungsproteine (Zona occludens (TJP1), Desmocollin II (DSC2), E-cadherin
(CDH1)), Interferon τ (IFNτ) als Protein, das die maternale Erkennung der
Trächtigkeit induziert sowie ein Stressindikator Heat Shock Proteins 70 (HSP70-1)
untersucht.
Die
Größe
der
einzelnen
PCR-Fragmente
wurde
über
eine
die
Expression
der
Agarosegelelektrophorese (Abbildung 19) verifiziert.
Es
konnten
statistisch
signifikante
Unterschiede
für
Gentranskripte von HSP, SLC2A1, SLC2A3, TJP1, DNMT3A, DSC2 und IFNτ in
Abhängigkeit von der Art des Einfrierens gefunden werden. Für die Expression des
Gentranskripts von CDH1 konnte keine statistische Signifikanz festgestellt werden.
76
Ergebnisse
___________________________________________________________________
100 bp
Marker
Globin
(50 fg)
257 bp
Globin
(Embryo)
257 bp
HSP70-1
245 bp
IFNτ
203 bp
SLC2A1
257 bp
CDH1
204 bp
DNMT3A
57 bp
100 bp
Marker
SLC2A3
202 bp
DSC2
199 bp
TJP1
162 bp
Abbildung 19: Analyse 8 entwicklungsrelevanter Gentranskripte einer bovinen
Blastozyste durch RT-qPCR jeweils im Doppelansatz (Repräsentatives Foto
eines 2%igen Agarosegels in TAE-Puffer, mit Ethidiumbromid gefärbt)
77
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.4.1. HSP70-1, SLC2A1 und TJP1
Für die Gentranskripte von HSP70-1, SLC2A1 und TJP1 zeigt sich eine statistische
Signifikanz in der Expression der relativen Transkriptmenge zwischen den
Embryonen der Kontrollgruppe und denen beider Einfriergruppen (Vitrifiziert und
konventionell kryokonserviert). Zwischen den vitrifizierten und den konventionell
kryokonservierten Blastozysten konnte keine statistische Signifikanz gezeigt werden
(Abbildung 20). Die Blastozysten der Kontrollgruppe hingegen exprimierten
signifikant mehr HSP70-1-, SLC2A1- und TJP1-mRNA als diejenigen beider
kryokonservierten Gruppen.
0,9
a
Relative Transkriptmenge
0,8
0,7
0,6
b
0,5
0,4
a
b
b
a
b
0,3
b
0,2
b
0,1
HSP70-1
SLC2A1
Kontrolle
konventionell
kryokonserviert
Vitrifiziert
Kontrolle
konventionell
kryokonserviert
Vitrifiziert
Kontrolle
konventionell
kryokonserviert
Vitrifiziert
0
TJP1
Abbildung 20: Relative Transkriptmenge von HSP70-1, SLC2A1 und TJP1 in
präimplantatorischen Blastozysten nach dem Auftauen (P a:b <0,05)
78
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.4.2. SLC2A3 und DNMT3A
1,8
b
1,6
Relative Transkriptmenge
1,4
ab
1,2
1
a
0,8
b
0,6
ab
0,4
a
0,2
SLC2A3
Kontrolle
konventionell
kryokonserviert
Vitrifiziert
Kontrolle
konventionell
kryokonserviert
Vitrifiziert
0
DNMT3A
Abbildung 21: Relative Transkriptmenge von SLC2A3 und DNMT3A in
präimplantatorischen Blastozysten nach dem Auftauen (P a:b < 0,05)
Abbildung 21 sind die relativen Transkriptmengen von SLC2A3 und DNMT3A zu
entnehmen. Hierbei zeigte sich eine statistische Signifikanz zwischen den Werten für
die Embryonen der Kontrollgruppe und denen der konventionell kryokonservierten
Blastozysten. Die Embryonen der Kontrollgruppe exprimierten signifikant mehr
SLC2A3 und DNMT3A. Zwischen den Werten der relativen Transkriptmenge der
vitrifizierten Blastozysten und der Kontrollgruppe sowie zwischen den Werten der
vitrifizierten
Blastozysten
und
denen
der
konventionell
kryokonservierten
Blastozysten konnte keine statistische Signifikanz festgestellt werden.
79
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.4.3. IFNττ
Für IFNτ war bei den konventionell kryokonservierten Blastozysten eine signifikant
höhere relative Transkriptmenge im Vergleich zu den Blastozysten beider anderen
Gruppen festzustellen. Die relative Transkriptmenge der vitrifizierten Blastozysten
und die der Kontrollgruppe unterschieden sich nicht signifikant voneinander
(Abbildung 22).
0,7
a
Relative Transkriptmenge
0,6
0,5
0,4
b
b
0,3
0,2
0,1
0
Vitrifiziert
konventionell
kryokonserviert
Kontrolle
Interferon Tau
Abbildung 22: Relative Transkriptmenge von IFNττ in präimplantatorischen
Blastozysten nach dem Auftauen (P a:b < 0,05)
80
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.4.4. CDH1
Zwischen den Blastozysten der einzelnen Gruppen konnte für die relative
Transkriptmenge von CDH1 keine statistische Signifikanz festgestellt werden
(Abbildung 23).
0,7
Relative Transkriptmenge
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Vitrifiziert
Konventionell
kryokonserviert
Kontrolle
CDH1
Abbildung 23: Relative Transkriptmenge von CDH1 in präimplantatorischen
Blastozysten nach dem Auftauen (P > 0,05)
81
Ergebnisse
___________________________________________________________________
4.4.5. DSC2
Abbildung 24 ist die relative Transkriptmenge für DSC2 zu entnehmen. Eine
statistische Signifikanz zeigte sich hier zwischen den Embryonen der Gruppe der
vitrifizierten Blastozysten und denen der Kontrollgruppe. Die Embryonen der
Kontrollgruppe exprimierten signifikant mehr DSC2 als die Embryonen der Gruppe
der vitrifizierten Blastozysten. Es bestand weder zwischen der der relativen
Transkriptmenge der Embryonen der Gruppe der vitrifizierten Blastozysten und
denen der konventionell kryokonservierten Blastozysten noch zwischen denen der
Gruppe der konventionell kryokonservierten Blastozysten und den Embryonen der
Kontrollgruppe
eine
statistische
Signifikanz
in
Bezug
auf
die
relative
Transkriptmenge.
0,7
b
Relative Transkriptmenge
0,6
0,5
0,4
ab
0,3
a
0,2
0,1
0
Vitrifiziert
konventionell
kryokonserviert
Kontrolle
DSC2
Abbildung 24: Relative Transkriptmenge von DSC2 in präimplantatorischen
Blastozysten nach dem Auftauen (P a:b < 0,05)
82
Diskussion
___________________________________________________________________
5. Diskussion
Dass das Kultursystem, aus dem in vitro generierte Embryonen entstammen, einen
Einfluss auf die Qualität der Embryonen hat, ist vielfach untersucht. Arbeiten, die sich
mit dieser Thematik beschäftigen, beurteilen die Qualität der so gewonnenen
Embryonen auf morphologischer Ebene, über die Teilungs- und Entwicklungsraten
(ECKERT u. NIEMANN 1995; KESKINTEPE u. BRACKETT 1996; WRENZYCKI et
al. 1999), die Anzahl an Trächtigkeiten (BLOCK et al. 2009), die sich nach dem
Übertragen
auf
Empfängertiere
etablieren,
auf
molekulargenetischer
Ebene
(WRENZYCKI et al. 1998; WRENZYCKI et al. 1999; KNIJN et al. 2002; WRENZYCKI
et al. 2005; LOPES et al. 2007) und auch über die Verbesserung der Kryotoleranz
(LONERGAN et al. 2001; RIZOS et al. 2001). Den „Goldenen Standard“, also den
Richtwert, an dem die Qualität der in vitro produzierten Embryonen gemessen wird,
stellen Ergebnisse von Untersuchungen an in vivo gewonnenen Embryonen dar.
Einen weiteren Einfluss auf die Qualität von Embryonen hat die Kryokonservierung.
Hierbei ist besonders bei in vitro produzierten Embryonen ein deutlicher Rückgang
der Überlebensfähigkeit nach dem Kryokonservieren zu beobachten. Trotz immenser
Anstrengungen ist es bislang nicht gelungen bei in vitro produzierten Embryonen
solche Überlebensraten nach dem Auftauen zu erzielen, wie bei in vivo generierten
Embryonen (RIZOS et al. 2001).
Autoren, die sich mit dem direkten Vergleich von Vitrifikation und konventioneller
Kryokonservierung
beschäftigt
haben,
verglichen
zumeist
morphologische
Charakteristika der Embryonen nach dem Auftauen. So wurden Gesamtzellzahlen
(MUCCI et al. 2006), Reexpansions- und Schlupfraten (KAIDI et al. 2001;
NEDAMBALE et al. 2004) und die Auswirkungen auf den Metabolismus in Bezug auf
die Aufnahmefähigkeit von Glukose, Pyruvat und Sauerstoff (KAIDI et al. 2001)
untersucht. Andere Autoren beschäftigten sich mit der konventionellen Methode oder
der Vitrifikation allein. Hierbei ist der Fokus auf unterschiedliche Probleme gerichtet.
So wurde z.B. der Einfluss des Kultursystems, dem die Embryonen entstammen, auf
die Qualität der Embryonen nach Vitrifikation untersucht (RIZOS et al. 2001; MEN et
al. 2005). Andere Autoren beschäftigten sich mit der Optimierung der angewandten
83
Diskussion
___________________________________________________________________
Kryoprotektiva oder der Methode an in vivo generierten Embryonen (NIEMANN
1985; PALASZ et al. 1997; MAGNUSSON et al. 2008) oder der Optimierung der
Methode (MASSIP et al. 1979; WALKER et al. 2006).
Der Zusatz von Stoffen, wie konjugierten Linolsäuren (CLA), in semidefinierte und
definierte Medien kann ebenfalls einen Einfluss auf die Kryokonservierbarkeit von in
vitro produzierten Embryonen haben. Einen kurzen Überblick hierzu gibt Tabelle 21.
Tabelle 21: Einfluss von Zusätzen zum Kulturmedium auf die Kryotoleranz in
vitro produzierter Embryonen
Zusatz zum
Art der
Kulturmedium
Kryokonservierung
Einfluss auf die
Kryokonservierbarkeit
Autor
der Embryonen
Erhöhte Überlebens-
BetaMercaptoethanol
und Schlupfraten sowie
Vitrifikation
Zellzahlen im Vergleich
zum nicht
NEDAMBALE et
al. (2006)
Kontrollmedium
Hyaluronan
Palmsäure
Cytochalasin B
CLA (trans10 u.
cis12)
Liposomen
Konventionelle
Signifikant erhöhte
PALASZ et al.
Kryokonservierung
Schlupfraten
(2008)
Signifikante
SHEHAB-EL-
Verschlechterung der
DEEN et al.
Kryotoleranz
(2009)
Signifikante
FRANCO u.
Vitrifikation
Konventionelle
Kryokonservierung
Verbesserung
der HANSEN
Kryotoleranz
(2006)
Signifikante
Vitrifikation
Verbesserung
Kryotoleranz
Konventionelle
Kein Einfluss auf
Kryokonservierung
Kryotoleranz
84
der
PEREIRA et al.
(2008)
die PUGH et al.
(1998)
Diskussion
___________________________________________________________________
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Einflüssen, die unterschiedliche
Kryokonservierungsmethoden auf die Qualität in vitro produzierter Embryonen
haben. Hierzu wurden in vitro erstellte Embryonen, die aus einem SOF-Kultursystem
entstammten, entweder vitrifiziert oder konventionell kryokonserviert. Nachdem sie
wieder aufgetaut worden waren, wurden die Reexpansions- und Schlupfraten bis zur
geschlüpften Blastozyste beobachtet, eine Lebend-Tot-Färbung mit Ethidium
homodimer
und
Hoechst
33342
und
eine
mRNA-Analyse
bezüglich
acht
entwicklungsrelevanter Gentranskripte (DNMT3A, SLC2A1, SLC2A3, HSP70-1, IFNτ,
TJP1, CDH1, und DSCII) durchgeführt. Bei der Lebend-Tot-Färbung und der
Genexpressionsanalyse wurden zusätzlich in vitro produzierte Embryonen, die zuvor
nicht eingefroren waren, analysiert.
In dieser Arbeit wurden Embryonen für das Tiefgefrieren ausgewählt, die an Tag
sieben das Stadium der expandierten Blastozyste erreicht hatten, da davon
ausgegangen wird, das bei IVP-Embryonen, die sich frühzeitig entwickeln, eine
höhere Wahrscheinlichkeit vorliegt, dass sie die Kryokonservierung überstehen
(HASLER et al. 1995).
85
Diskussion
___________________________________________________________________
5.1. Beurteilung der Reexpansionsraten, Schlupfraten und Zellzahlen
Reexpansions- und Schlupfraten sind die ersten Parameter anhand derer der Erfolg
einer Kryokonservierungsmethode nach dem Wiederauftauen bemessen werden
kann.
Unabhängig mittels welcher Methode die Embryonen kryokonserviert wurden
(Vitrifiziert
oder
konventionell
kryokonserviert)
sind
die
Ergebnisse
der
Reexpansions- und Schlupfraten nach dem Auftauen ähnlich.
Die Reexpansionsraten betrugen 81,1% (n = 86) bei den vitrifizierten Blastozysten
und 79,4% (n = 104) bei den konventionell kryokonservierten Embryonen. Die
Schlupfraten lagen bei 63,2% (vitrifiziert) und 61,1% (konventionell kryokonserviert).
Die Reexpansionsraten der vitrifizierten Embryonen der vorliegenden Arbeit liegen im
mittleren Bereich der Ergebnisse anderer Arbeiten, bei denen die Reexpansionsraten
zwischen 64% (NEDAMBALE et al. 2004) und 100% (LUCAS-HAHN et al. 2006)
liegen. Die Schlupfraten liegen für dieselben Arbeiten bei 54% bzw. 83,3%.
Diese relativ breite Spanne lässt sich durch die verschiedenen Einflussfaktoren auf
die Kryotoleranz der Embryonen erklären. So hat z.B. schon der Zeitpunkt der ersten
Teilung einen entscheidenden Einfluss auf die Kryokonservierbarkeit von in vitro
produzierten Embryonen (DINNYES et al. 1999). Ebenso kann auch das Öl, mit dem
die Maturations-, Fertilisations- und Kulturtropfen überschichtet wurden, Einfluss auf
die Einfrierbarkeit der Embryonen nehmen (VAN SOOM et al. 2001). In den oben
erwähnten Arbeiten wurden unterschiedliche Medien zur Erstellung der in vitro
produzierten Embryonen verwandt. Zusätzlich gibt es Unterschiede in der
Ausführung der Methode der Vitrifikation. So verwandten LUCAS-HAHN et al. (2006)
das Kryoloopsystem, während andere Autoren andere Systeme nutzten. Auch das
Alter und das Entwicklungsstadium der Embryonen spielen bei der Interpretation der
Reexpansions- und Schlupfraten eine Rolle und erschweren die Vergleichbarkeit der
verschiedenen
Arbeiten
untereinander.
So
schwanken
die
Werte
für
die
Reexpansionsraten/Schlupfraten zwischen Tag sieben Blastozysten (91,3% /
38,1%), Tag sieben expandierten Blastozysten (100% / 83,3%), Tag acht
86
Diskussion
___________________________________________________________________
Blastozysten (86,4% / 21,0%) und Tag acht expandierten Blastozysten (98% /
50,0%) in derselben Arbeit (LUCAS-HAHN et al. 2006).
Auch die Vitrifikation an sich scheint einen gravierenden Einfluss auf die Zellzahl zu
haben. So konnte nach Vitrifikation eine signifikante Reduktion der Zellzahlen der
ICM festgestellt werden, wohingegen die Zellzahlen des Trophektoderms im
Vergleich zu nicht kryokonservierten Embryonen nicht beeinflusst wurden (GOMEZ
et al. 2009).
Die Reexpansions- und Schlupfraten der zuvor konventionell kryokonservierten
Blastozysten lassen sich ebenfalls nur sehr bedingt mit denen anderer Arbeiten
vergleichen. Die Gründe hierfür sind die oben angegebenen. Die Reexpansionsraten
anderen Arbeiten liegen zwischen 40% (NEDAMBALE et al. 2004) und 71%
(TAKAGI et al. 1994). Schlupfraten liegen hier zwischen 22% (NEDAMBALE et al.
2004) und 80% (SOMMERFELD u. NIEMANN 1999).
Um in der vorliegenden Arbeit eine Vergleichbarkeit zwischen den Embryonen, die
nach beiden Einfrierprotokollen kryokonserviert worden waren zu erreichen, wurden
ausschließlich an Tag sieben expandierte Blastozysten für die Kryokonservierung
verwandt, die einem SOF-Kultursystem entstammten.
Letztlich miteinander vergleichen lässt sich jedoch nur ob es zwischen konventionell
kryokonservierten und vitrifizierten Embryonen eines Stadiums, eines Kultursystems
und einer Arbeit signifikante Unterschiede gibt. In der vorliegenden Arbeit ist dieses
in Bezug auf die Reexpansions- und Schlupfraten nicht der Fall.
In der Arbeit von NEDAMBALE et al. (2004) zeigte sich, dass konventionell
kryokonservierte Blastozysten aus einem KSOM-SOF Kultursystem signifikant
niedrigere Reexpansions- und Schlupfraten aufwiesen als vitrifizierte Blastozysten
aus demselben System. Diese Arbeit belegte eine vorangegangene Arbeit, bei der
ebenfalls signifikant niedrigere Reexpansions- und Schlupfraten bei konventionell
kryokonservierten Embryonen festgestellt werden konnten (MAHMOUDZADEH et al.
1994). Allerdings postuliert NEDAMBALE et al. (2004( für seine Arbeit, dass eine
Ursache für die niedrigen Reexpansions- und Schlupfraten ein nicht optimales
Protokoll für die konventionelle Kryokonservierung für in KSOM-SOF generierte
Embryonen gewesen sein könnte.
87
Diskussion
___________________________________________________________________
Aufgrund der ähnlichen Reexpansions- und Schlupfraten der vorliegenden Arbeit
lassen
sich
keinerlei
Rückschlüsse
darauf
schließen,
ob
eine
der
Kryokonservierungsarten sich besser für Embryonen eignet, die dem in dieser Arbeit
verwandten Kultursystem entstammen als das andere.
Die Gesamtzellzahl und die Lebend-Tot-Ratio der Blastozysten nach Auftauen und
der Weiterkultivierung bis zum Schlupf ist ein weiterer Parameter anhand dessen
externe Einflüsse auf in vitro produzierte Embryonen bemessen werden können.
Dass allein die Tatsache, ob Embryonen in vivo oder in vitro kultiviert werden, einen
Einfluss auf die Zellzahl hat, zeigt sich darin, dass In-vivo-Embryonen an Tag 9 eine
fast 3,5 mal so hohe Zellzahl aufweisen, wie ihre in vitro erstellten Gegenstücke
(USHIJIMA et al. 2008). Zusätzlich spielt die Art des Kultursystems auch hier eine
wesentliche Rolle. Die Zellzahlen schwanken in Abhängigkeit des verwandten
Kultursystems für an Tag 7,5 bzw. Tag 8 geschlüpfte Embryonen zwischen 122,1
(MUCCI et al. 2006) und 268 (NEDAMBALE et al. 2004). Die Zellzahlen der
Embryonen der Kontrollgruppe dieser Arbeit, die nicht kryokonserviert wurde,
sondern im SOF-System bis zum Schlupf kultivierten wurden, liegen bei 130,2 ± 25,6
Zellen. Auch hier
liegen die Werte – wie die Werte der Reexpansions- und
Schlupfraten im Bereich derer anderer Arbeiten.
SOMMERFELD und NIEMANN (1999) stellten beim Vergleich der Gesamtzellzahlen
der Embryonen ihrer Kontrollgruppe (137,2 Zellen) mit den Zellzahlen der
kryokonservierten Gruppen fest, dass bei Berücksichtigung der durchschnittlichen
Anzahl an degenerierten Blastozysten in einem normalen IVP-System, ihre
Methoden der Kryokonservierung eine relativ hohe Kryoprotektion gewährleisten.
Die durchschnittlichen Zellzahlen in der vorliegenden Arbeit nach Kryoprotektion
liegen bei 121,3 ± 21,2 für die vitrifizierten und 117,6 ± 20,4 für die konventionell
kryokonservierten Embryonen. Diese Werte sind zwar höher als die anderer Autoren
(MUCCI et al. 2006; 96,6 ± 2,4 nach Vitrifikation und 99,8 ± 2,2 Zellen nach
konventioneller Kryokonservierung), diese Diskrepanz ist aber wiederum durch das
differierende Kultursystem zu erklären. Zwischen beiden kryokonservierten Gruppen
bei MUCCI ist keine statistische Signifikanz zu ersehen, was darauf hindeutet, dass
88
Diskussion
___________________________________________________________________
die Art des Einfrierens keinen signifikanten Einfluss auf die Zellzahl nach dem
Auftauen hat. Dieses konnte auch in der vorliegenden Arbeit so festgestellt werden.
Das Einfrieren an sich zeigte in dieser Arbeit und für das SOF-Kultursystem keinen
Einfluss auf die Gesamtellzahl. Die Kryokonservierung zeigte keinen signifikanten
Einfluss auf die Lebend-Tot-Ratio. Dies kann bedeuten, dass das Einfrieren an sich
keinen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit der einzelnen Zelle hat und auch nicht
dazu führt, dass bei kryokonservierten Embryonen verhältnismäßig mehr Zellen
frühzeitig zugrunde gehen.
89
Diskussion
___________________________________________________________________
5.2. Genexpression nach dem Auftauen
Die Untersuchung der Expression entwicklungsrelevanter Gentranskripte erlaubt eine
weitergehende Qualitätsbeurteilung von Embryonen auf molekularer Ebene. So
konnte in der Vergangenheit die Expression ebensolcher Gentranskripte in
Abhängigkeit von der Art der Gewinnung – in vivo oder in vitro – (KNIJN et al. 2002;
RIZOS et al. 2002; MILLER et al. 2003), vom Stadium des Embryos (WRENZYCKI et
al. 1999; WRENZYCKI et al. 2002) und vom verwandten Kultursystem (WRENZYCKI
et al. 1998) dargestellt werden. Bislang wurde die Genexpression nur vereinzelt
genutzt, um die Qualität von bovinen Embryonen nach der Kryokonservierung zu
beurteilen. Wenn Untersuchungen solcher Art stattgefunden haben, so wurde jedoch
nur eine Methode zur Kryokonservierung (PARK et al. 2006; YAO et al. 2009)
untersucht und es fand kein Vergleich auf molekularer Ebene statt
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Kryokonservierung auf acht
entwicklungsrelevante Gentranskripte untersucht.
Die Ergebnisse der RT-qPCR ergaben, dass die relativen Transkriptmengen für
HSP70-1, SLC2A1 und TJP1 in der Gruppe der Embryonen, die nicht eingefroren
waren, signifikant höher waren als bei denen der kryokonservierten Gruppen. Es ist
bekannt, dass die Expression von HSP70-1 bei in vitro produzierten Embryonen
heraufreguliert ist (WRENZYCKI et al. 2001a). PARK et al. (2006) konnten in ihren
Untersuchungen feststellen, dass die Expression von HSP70-1 nach der Vitrifikation
signifikant heraufreguliert war. Als zusätzliche Stressoren, die die Expression von
HSP70-1 beeinflussen, konnten auch Zusätze zum Kultursystem identifiziert werden
(WRENZYCKI et al. 1999). Durch solche Veränderungen war es möglich, die
embryonale Qualität negativ zu beeinflussen. Allerdings sind auch diese Ergebnisse
in Abhängigkeit zum verwandten Kultursystem zu betrachten (vgl. Kapitel 5.1.), da
z.B. bei dem für diese Arbeit verwandten Kultursystem die Expression von HSP70-1
für die in vitro produzierten Embryonen ähnlich ist wie die der in vivo erzeugten
(WRENZYCKI et al. 2001a).
Die zytoprotektiven Eigenschaften des HSP70-1 liegen in der Fähigkeit Proteine, die
durch thermischen Stress geschädigt wurden, neu zu falten (DUNCAN u. HERSHEY
90
Diskussion
___________________________________________________________________
1989). Ist die Expression, so wie in den kryokonservierten Embryonen der
vorliegenden Arbeit signifikant herabgesetzt, so kann dies bedeuteten, dass die
Fähigkeit der Embryonen thermischen Stress zu bewältigen, ebenfalls herabgesetzt
ist und diese herabgesetzte Expression mit einer herabgesetzten zytoprotektiven
Eigenschaft einhergeht.
SLC2A1 hat als Hauptaufgabe den Transport von Glukose entlang von basolateralen
Membranen. Er gewinnt bei Embryonen im Stadium der Morula an Bedeutung, da
dies das Stadium ist, in dem der Embryo von Glukose als Ernährungsquelle
abhängig wird (RIEGER et al. 1992). Er wird bei in vivo produzierten Embryonen im
Stadium der Morula signifikant mehr exprimiert als bei in vitro produzierten Morulae
(WRENZYCKI et al. 1999; WRENZYCKI et al. 2001a), gleichzeitig geht eine gute
morphologische Qualität in vitro produzierter Embryonen mit einer höheren
Expression von SLC2A1 einher (LOPES et al. 2007). Dies kann bedeuten, dass der
Metabolismus in vitro produzierter Embryonen nicht ausreichend Glukose umsetzen
kann (im Vergleich zu in vivo produzierten Embryonen). Für die kryokonservierten
Embryonen der vorliegenden Arbeit kann dies bedeuten, dass die herabgesetzte
Expression von SLC2A1 bei den Embryonen beider kryokonservierten Gruppen
bedeutet, dass die Qualität der Embryonen nach dem Einfrieren schlechter ist als
vorher und der Metabolismus nach dem Auftauen weniger Glukose zur Verfügung
hat als vorher. Da zwischen beiden Gruppen kein signifikanter Unterschied in der
Expression von SLC2A1 festzustellen ist, liegt die Vermutung nahe, dass nicht die
Art der Kryokonservierung sondern die Kryokonservierung an sich entscheidend für
die Qualitätsminderung ist.
Auch die Transkripte von TJP1 wurden in den Embryonen der vorliegenden Arbeit
nach der Kryokonservierung in beiden Einfriergruppen signifikant weniger exprimiert
als in der Kontrollgruppe. Bei Embryonen des gleichen Entwicklungsstadiums und
der gleichen Entwicklungsgeschwindigkeit, ist es bekannt, dass sich die Expression
von TJP1 in vivo und in vitro produzierten Blastozysten nicht signifikant
unterscheidet. Wohl aber gibt es einen signifikanten Unterschied in der Expression
91
Diskussion
___________________________________________________________________
von TJP1 bei in vitro produzierten Embryonen, deren Kompaktierungsphase kurz ist
und solchen deren Kompaktierungsphase lang ist. So ist bei Blastozysten, bei denen
im Morulastadium eine verkürzte Kompaktierungszeit festzustellen war, eine
signifikant niedrigere Expression von TJP1 festzustellen (MILLER et al. 2003). Für
die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bedeutet dies, dass durch beide Formen der
Kryokonservierung Veränderungen in der Expression von TJP1 hervorgerufen
werden, die letztlich bedeuten, dass es zu Veränderungen/Störungen in der
Ausdifferenzierung von Zellen kommen könnte. Inwiefern dieses tatsächlich auch
Auswirkungen
auf
die
Menge
der
umgesetzten
Proteine
hat,
müsste
in
weitergehenden Untersuchungen geklärt werden.
Die Gentranskripte von SLC2A3 und DNMT3A wurden bei der Gruppe der
konventionell kryokonservierten Embryonen signifikant niedriger exprimiert als bei
der Kontrollgruppe. Zwischen der Gruppe der vitrifizierten Embryonen und denen der
konventionell kryokonservierten sowie der Kontrollgruppe war kein statistisch
signifikanter Unterschied in der Expression festzustellen.
SLC2A3, dessen Hauptaufgabe der Transport von Glukose an neuronalem Gewebe
ist, hat sich in der Vergangenheit als sehr sensitiver Marker für suboptimale
Kulturbedingungen bei der IVP herausgestellt (LAZZARI et al. 2002). Dadurch dass
die Expression nur bei in vitro produzierten Embryonen signifikant erhöht war, kann
davon ausgegangen werden, dass diese qualitativ nicht denen, die in vivo generiert
wurden, entsprechen. (LAZZARI et al. 2002). In Anlehnung an diese Arbeit bedeutet
dies für die vorliegende Arbeit, dass die Embryonen, die nach der konventionellen
Kryokonservierung untersucht wurden, in ihrem mRNA-Gehalt eher denen in vivo
erstellter Embryonen ähneln. Fraglich ist allerdings, ob die Herunterregulierung der
Expression von SLC2A3 nach In-vitro-Kultur und konventioneller Kryokonservierung
im Vergleich zur Expression nach Vitrifikation nicht auch einen negativen Einfluss der
konventionellen Kryokonservierung widerspiegeln könnte.
WRENZYCKI und NIEMANN (2003) konnten keinen Unterschied in der relativen
Transkriptmenge von DNMT3A in Abhängigkeit zur Produktionsart (in vivo oder in
92
Diskussion
___________________________________________________________________
vitro) der Embryonen nachweisen. Allerdings konnte in späteren Arbeiten festgestellt
werden, dass sich je nach Stadium (10-16 Zeller, Morula, Blastozyste) doch
Signifikanzen in Bezug auf die Expression von DNMT3A-Transkripten (HÖFFMANN
et al. 2006) sowie auch auf Proteinebene nachweisen ließen (HÖFFMANN et al.
2006; DRALLMEYER 2008; DRALLMEYER et al. 2009). Dieses könnte durch die
Tatsache bedingt sein, dass in den späteren Arbeiten andere Kultursysteme zur IVP
der Embryonen benutzt wurden. Zusätzlich konnte festgestellt werden, dass
signifikante Unterschiede im Proteingehalt und der Proteinlokalisierung der DNMT3A
in den Blastomeren auf einen Einfluss der In-vitro-Kultur auf die De novoMethylierung vor, während und nach der Aktivierung des embryonalen Genoms
hindeuten (DRALLMEYER 2008). Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen einen Einfluss
der konventionellen Kryokonservierung im Vergleich zur Kontrollgruppe nach. Der
Ablauf der De novo-Methylierung könnte hier zeitlich verzögert oder aber generell
weniger stattfinden. Um das eine oder das andere gegebenenfalls auszuschließen,
wäre hier eine Proteinanalyse nötig, da die Proteine der DNMT3A lediglich zu
solchen Zeitpunkten in der Zelle nachgewiesen werden können, zu denen tatsächlich
eine Methylierung stattfindet (LEES-MURDOCK et al. 2005).
Bei der Analyse der Expression des Trächtigkeit erhaltenden IFNτs ergab sich eine
statistisch signifikante Erhöhung der relativen Transkriptmenge für die Gruppe der
konventionell kryokonservierten Embryonen. IFNτ wird in der vorliegenden Arbeit als
Qualitätsmerkmal genutzt, da eine Korrelation zwischen früher und hoher Expression
und schlechter Qualität ausgemacht werden konnte (LEPPENS-LUISIER et al. 2001;
WRENZYCKI et al. 2001a). Generell liegt der Expressionsspiegel von IFNτ bei in
vitro produzierten Embryonen höher als bei ihren in vivo erzeugten Gegenstücken,
was
für die
in
vitro
produzierten
Embryonen
die Wahrscheinlichkeit
der
Trächtigkeitsetablierung vermindert (KUBISCH et al. 2004). Da die relative
Transkriptmenge der konventionell kryokonservierten Embryonen signifikant über
dem der Kontrollgruppe liegt, ist es wahrscheinlich, dass sich konventionelle
Kryokonservierung in Bezug auf die relative Transkriptmenge von IFNτ negativ auf
die Embryonen auswirkt. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu einer Arbeit,
93
Diskussion
___________________________________________________________________
deren Autoren in Bezug auf die Expression von IFNτ nach dem Auftauen nach
konventioneller Kryokonservierung keinen Unterschied zwischen in vivo und in vitro
produzierten Embryonen feststellen konnten (YAO et al. 2009).
Dieses ist
wahrscheinlich auf die Verwendung anderer Maturations-, Fertilisations- und
Kulturmedien als in der vorliegenden Arbeit zurückzuführen.
Die hohe Expression von IFNτ bei der Gruppe der konventionell kryokonservierten
Embryonen in dieser Arbeit spricht für eine niedrigere Wahrscheinlichkeit der
Etablierung einer Trächtigkeit im Falle eines Transfers.
Bei der Expression von CDH1 waren keinerlei Signifikanzen zwischen den
Embryonen der beiden Einfrier- und denen der Kontrollgruppe feststellbar. Die
relative Transkriptmenge der Embryonen beider Einfriergruppen lag jedoch unter der
der Embryonen der Kontrollgruppe. Es scheint als habe die Kryokonservierung an
sich wenig Einfluss auf die Expression von CDH1 und damit auf die E-cadherin
vermittelten Zell-Zell-Verbindungen des Trophektoderms. Dieses bedeutet, dass die
Kryokonservierung keinen signifikanten Einfluss die E-cadherin vermittelten Zell-ZellVerbindungen hat. Untersuchungen, bei denen gezeigt werden konnte, dass CDH1
bei Tag 8 Blastozysten signifikant mehr exprimiert wird als bei Tag 7-Blastozysten
(WRENZYCKI et al. 2003) könnten jedoch einen Hinweis darauf geben, dass sich
das Expressionsmuster verändern könnte, würden Tag 8-expandierte Blastozysten
kryokonserviert.
Dies
könnte
ebenso
wie
die
Frage,
inwieweit
sich
die
Kryokonservierung auf das Verteilungsmuster von CDH1 am Trophektoderm des
Embryos auswirkt,
durch gesonderte Untersuchungen (Immunfloureszenz und
Genexpressionsanalyse an Tag 8 kryokonservierter Embryonen) geklärt werden.
In der vorliegenden Arbeit ist die relative Transkriptmenge von DSC2 der vitrifizierten
Blastozysten nach dem Auftauen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant
herabgesetzt.
DSC2 wird von in vitro produzierten Embryonen signifikant weniger exprimiert als von
in vivo gewonnenen (WRENZYCKI et al. 2001a; KNIJN et al. 2002). Dies könnte eine
Erklärung für die z.T. verzögerte Entwicklung in vitro produzierter Blastozysten
darstellen, da DSC2 eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung des Blastocoels spielt.
94
Diskussion
___________________________________________________________________
Ist die relative Transkriptmenge nach der Vitrifikation noch weiter reduziert, stellt sich
die Frage, ob sich die Entwicklung der vitrifizierten Blastozysten ebenfalls
verschlechtert. Dieses wäre gegebenenfalls durch weitere Untersuchungen, wie
Immunfloureszenzuntersuchungen zur Darstellung von interzellulären Verbindungen
zu klären.
95
Diskussion
___________________________________________________________________
5.3. Schlussfolgerungen
Die Kryokonservierung hat einen maßgeblichen Einfluss auf die Qualität der
Embryonen. Dieses wird in den Ergebnissen der morphologischen Untersuchungen
in
Bezug
auf
die
Gesamtzellzahl
im
Rahmen
der
vorliegenden
Arbeit
widergespiegelt. Die Zellzahlen beider Gruppen, die zuvor kryokonserviert worden
waren,
waren
ähnlich
denen
der
Kontrollgruppe.
Unterschiede
in
den
Gesamtzellzahlen können dadurch bedingt sein, dass bisweilen beobachtet werden
kann, dass einzelne Zellen beim Schlupf der Blastozyste der Innenseite der Zona
Pellucida anhaften und vom Embryo abgehen. Zwischen den beiden Einfriergruppen
konnten keine Unterschiede bezüglich der Zellzahlen und der Reexpansions- und
Schlupfraten
festgestellt
werden,
was
dafür
spricht,
dass
die
Art
der
Kryokonservierung keinen wesentlichen Einfluss auf die Qualität der Embryonen hat.
Werden nicht nur die morphologischen, sondern auch die molekulargenetischen
Untersuchungen in Betracht gezogen, so ist jedoch in Abhängigkeit vom
untersuchten Gentranskript ein Unterschied zwischen den beiden Arten der
Kryokonservierung festzustellen.
Die Untersuchung des Transkriptes für das HSP70-1 konnte zunächst einen
generellen Einfluss der Kryokonservierung auf in vitro produzierte Embryonen
aufzeigen.
Bei Betrachtung der Gentranskripte, die an Zell-Zell-Verbindungen beteiligt sind
(TJP1, DSC2 und CDH1), lässt sich bei der relativen Transkriptmenge von DSC2 ein
nachteiliger Effekt der Vitrifikation auf die Embryonen feststellen.
Die Ergebnisse für die ausgewählten Gentranskripte, die bei der Etablierung der
Trächtigkeit und bei der De-novo-Methylierung von Bedeutung sind, legen die
Vermutung nahe, dass sich das Verfahren der konventionellen Kryokonservierung
nachteilig auf die Expression dieser Transkripte und somit auch auf die Qualität des
Embryos auswirkt.
Gentranskripte, deren Produkte am embryonalen Metabolismus beteiligt sind
(SLC2A1 und SLC2A3), sind ebenfalls durch die Kryokonservierung beeinflusst. Das
Transkript von SLC2A3 ist bei der Gruppe der konventionell kryokonservierten
96
Diskussion
___________________________________________________________________
Embryonen signifikant herabgesetzt, was eine unzureichende Versorgung des
embryonalen Organismus zur Folge haben könnte.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Vitrifikation das zu
präferierende Verfahren zur Kryokonservierung in vitro produzierter Embryonen, die
aus einem SOF-Kultursystem stammen, darstellt. Um dieses abschließend zu
bestätigen
wären
weitere
Untersuchungen
nötig,
wie
z.B.
Immunfloureszenzuntersuchungungen, die Untersuchung von Gentranskripten, die
im Zusammenhang mit der Apoptose stehen, Transfers von kryokonservierten
Embryonen auf Empfängertiere und Untersuchung der Trächtigkeitsraten und/oder
die Untersuchung von Nachkommen aus zuvor kryokonservierten Embryonen.
Immunfloureszenzuntersuchungen
könnten
einen
Aufschluss
über
das
Verteilungsmuster von CDH1-Protein bei Embryonen beider Kryogruppen und deren
Abweichungen von nicht kryokonservierten Embryonen geben. Dass ein Einfluss auf
Transkripte von Zell-Zell-Verbindungsgenen vorhanden sein muss, ist in der
vorliegenden Untersuchung der Expression von TJP1 und DSC2 zu sehen.
Auch Transfers wieder aufgetauter Embryonen sind sinnvoll, um zum einen
Trächtigkeitsraten für die jeweilige Gruppe zu erheben und zum anderen, um zu
überprüfen, ob die Kryokonservierung an sich Auswirkungen auf die Nachkommen
hat. Hier wäre es denkbar, kryokonservierte in vivo gewonnene Embryonen zu
untersuchen, um so einen „goldenen Standard“ auch für die Kryokonservierung zu
etablieren.
Bei der Interpretation der Ergebnisse ist jedoch zu beachten, dass äußere Einflüsse
wie z. B. das Medium, in dem in vitro produzierte Embryonen kultiviert werden,
entscheidende Faktoren für die Qualität der Embryonen nach dem Auftauen
darstellen. Die Medien, mit denen hohe Blastozystenraten in vitro erzeugt werden,
sind nicht unbedingt dieselben, aus denen Embryonen mit einer erhöhten
Kryotoleranz hervorgehen.
97
Zusammenfassung
___________________________________________________________________
6. Zusammenfassung
Hanna Stinshoff
Vergleich in vitro produzierter Embryonen hinsichtlich ihrer Qualität nach dem
Kryokonservieren durch Vitrifikation oder konventionelle Kryokonservierung
Das
Ziel
der
vorliegenden
Arbeit
war
es,
den
Einfluss
zweier
Kryokonservierungsverfahren auf die Qualität in vitro produzierter Embryonen
darzulegen. Hierzu wurden zunächst in 28 IVP-Sitzungen 3981 Eizellen gewonnen,
aus denen an Tag sieben insgesamt 738 Blastozysten (18,5 %) generiert werden
konnten.
Die
expandierten
Blastozysten
wurden
entweder
konventionell
kryokonserviert (mit 1,5M Ethylenglycol als Kryoprotektivum) oder vitrifiziert (durch
ein kommerziell erhältliches Vitrifikationskit der Fa. Gynemed, Lensahn). Nach dem
Auftauen und anschließender Kultur für 48 Stunden wurden die Reexpansions- und
Schlupfraten beurteilt. An einem Teil der geschlüpften Blastozysten wurde eine
Differentialfärbung mit Ethidium homodimer und Hoechst 33342 zur Ermittlung der
Gesamtzellzahl und der Lebend-Tot-Ratio durchgeführt. Der andere Teil der
geschlüpften Embryonen wurde mittels einer RT-qPCR bezüglich der mRNAExpression acht entwicklungsrelevanter Gene (SLC2A1, SLC2A3, DNMT3A,
HSP70-1, CDH1, TJP1, DSC2 und IFNτ) untersucht.
Es konnten folgende Ergebnisse erzielt werden:
1. Die durchschnittliche Teilungsrate nach In-vitro-Produktion im SOF-Kultursystem
betrug 52,8 % (n = 2056 / 3981). Die durchschnittliche Entwicklungsrate bis zur
Blastozyste lag bei 18,5 % (n = 738 / 3981).
2. Die Reexpansionsrate der vitrifizierten Blastozysten (n = 106) betrug nach dem
Auftauen 81,1 % (n = 86); die Schlupfrate der vitrifizierten Blastozysten lag bei 63,2
% (n = 67). Für die konventionell kryokonservierten Blastozysten (n=131) lagen diese
Werte bei 79,4 % (Reexpansionsrate; n = 104) bzw. 63,2 % (Schlupfrate; n = 80).
98
Zusammenfassung
___________________________________________________________________
3. Nach Zellfärbung durch Ethidium homodimer und Hoechst 33342 konnte eine
Durchschnittszellzahl von 121,3 ± 21,2 für die zuvor vitrifizierten Blastozysten (n=22)
ermittelt werden. Die
Durchschnittszellzahl der konventionell kryokonservierten
(n=23) Blastozysten lag bei 117,6 ± 20,4. Die Färbung und Auszählung der Zellen
geschlüpfter Blastozysten (n = 25), die zuvor nicht kryokonserviert wurden, ergab
eine Durchschnittszellzahl von 130,2 ± 25,6. Zwischen den beiden Einfriergruppen
und der Kontrollgruppe gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede bezüglich
der Zellzahl. Bei der Auswertung der Lebend-Tod Ratio konnte kein signifikanter
Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden.
4. Die Analyse der relativen Häufigkeit der Gentranskripte für SLC2A1, HSP70-1 Und
TJP1 ergab, dass in Embryonen beider Kryokonservierungsgruppen signifikant
weniger an relativer Transkriptmenge vorhanden war als in Embryonen der
Kontrollgruppe mit geschlüpften Blastozysten, die zuvor nicht kryokonserviert worden
waren. Zwischen den Embryonen beider Einfriergruppen gab es keine Signifikanzen
bezüglich der Expression dieser drei Gentranskripte.
5. Die relative Transkriptmenge des SLC2A3- und des DNMT3A-Gens war bei den
konventionell kryokonservierten Blastozysten im Vergleich zur Kontrollgruppe
signifikant herabgesetzt. Die Gruppe der vitrifizierten Blastozysten unterschied sich
weder signifikant von der Gruppe der konventionell kryokonservierten Blastozysten
noch von der Kontrollgruppe.
6. IFNτ wurde von den Embryonen der Gruppe der konventionell kryokonservierten
Blastozysten signifikant mehr exprimiert als von beiden anderen Gruppen.
7. Für das CDH1-Gen konnten weder zwischen den Embryonen der Einfriergruppen
untereinander noch zur Kontrollgruppe signifikant Unterschiede in der Expression
festgestellt werden.
99
Zusammenfassung
___________________________________________________________________
8. Die Gruppe der zuvor vitrifizierten Blastozysten exprimierte signifikant weniger
DSC2 als die Kontrollgruppe. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der
Gruppe der konventionell kryokonservierten Blastozysten und der Gruppe der
vitrifizierten Blastozysten. Ebenso unterschied sich die Gruppe der konventionell
kryokonservierten
Blastozysten
nicht
signifikant
von
der
Expression
der
Kontrollgruppe.
Erstmals wurde in dieser Arbeit ein direkter Vergleich auf molekularer Ebene
zwischen Embryonen, die durch zwei Unterschiedliche Verfahren kryokonserviert
wurden, gezogen.
Schlussfolgernd lässt sich festhalten, dass sich – obwohl auf morphologischer Ebene
nicht erkennbar – die Vitrifikation besser für die Kryokonservierung von Tag sieben
expandierten Blastozysten aus dem SOF-Kultursystem geeignet erscheint als die
konventionelle Kryokonservierung. Die signifikanten Unterschiede in der Expression
der einzelnen Gentranskripte weisen jedoch darauf hin, dass sich die quantitativen
Unterschiede in Abhängigkeit zum untersuchten Gen darstellen. Um feststellen zu
können, inwiefern diese auf molekulargenetischer Ebene gefundenen Unterschiede
auch einen Einfluss auf die fetale und neonatale Entwicklung haben, wäre eine
Untersuchung von Trächtigkeiten, die sich nach dem Transfer von kryokonservierter
Embryonen etablieren und auch die Untersuchung so entstandener Kälber nötig.
100
Summary
___________________________________________________________________
7. Summary
Hanna Stinshoff
Effects of different cryopreservation techniques on the quality of in vitro
produced bovine embryos
The objective of the present study was to analyse the influence of two different
cryopreservation methods on the quality of in vitro produced bovine embryos. In 28
IVP-sessions 3981 oocytes could be obtained. These were cultured with the result
that 738 blastocysts could be gained on day 7. Blastocysts that had reached the
stage of an expanded blastocyst on day 7 were either cryopreserved conventionally
(using 1.5 M ethylene glycol and a programmable freezer) or vitrified (using a
commercially available kit, Gynemed, Lensahn, Germany). Reexpansion rates and
hatching rates were assessed following thawing and culture for 48 hours. Cell
staining was performed on one part of the hatched blastocysts using ethidium
homodimer and Hoechst 33342 stain. The total cell number was assessed as well as
the ratio of live and dead cells.
Other blastocysts that had hatched post thawing were analysed using a RT-qPCR
regarding eight gene transcripts (SLC2A1, SLC2A3, DNMT3A, HSP70-1, CDH1,
TJP1, DSC2 und IFNτ) that are known to be of developmental significance.
The following results could be obtained:
1.
The average cleavage rate following in vitro maturation and fertilisation was
52.8 % (n = 2057 / 3981). The developmental rates up to blastocyst stage averaged
at 18.5 % (n = 738).
2. 81.1 % (n = 86) of the previously vitrified blastocysts (n = 106) reexpanded after
thawing, their hatching rate being at 63.2 % (n = 67). The blastocysts that were
cryopreserved conventionally (n = 131) had a reexpansion rate of 79.4 % (n = 104)
and a hatching rate of 63.2 % (n = 80) post thawing
101
Summary
___________________________________________________________________
3. The average cell number that could be obtained following cell staining was 121.3
± 21.2 for the blastocysts (n=22) previously vitrified. The blastocysts that were
cryoconserved conventionally (n=23) prior to staining had an average cell number of
117.6 ± 20.4. Cell staining of the embryos belonging to the control group (n =25)
averaged in 130.2 ± 25.6 cells per blastocyst. The assessment of live and dead cells
resulted in no significant difference between all three groups.
4. The analysis of the gene transcripts for SLC2A1, HSP70-1 and TJP1 resulted in a
significantly reduced amount of transcripts in both groups of cryopreserved embryos
in comparison to the embryos that were not cryopreserved prior to culture until
hatching. There was significant difference in the relative amount of transcript in
between embryos of both cryopreservation groups.
5. The relative amount of transcripts for the genes of SLC2A3 and DNMT3A were
significantly reduced – in comparison to the embryos belonging to the control group in the group of blastocysts that were cryopreserved conventionally prior to analysis.
The relative amount of gene transcripts for these two genes did not differ significantly
in vitrified blastocysts in comparison to embryos of both other groups.
6. IFNτ was expressed at a significantly higher level in the embryos that were
cryopreserved conventionally than embryos of both other groups.
7. No significant differences in the expression of CDH1 could be detected between
embryos of all three groups.
8. A significantly higher level of DSC2 transcripts could be detected in the vitrified
blastocysts in comparison to the control blastocysts. There were no significant
differences between the conventionally cryoconserved blastocysts and the embryos
belonging to the control group as well as between the vitrified blastocysts and the
blastocysts that were cryoconserved conventionally.
102
Summary
___________________________________________________________________
For the first time a comparison between embryos that were cryopreserved using two
different cryopreservation methods was drawn on molecular level. In conclusion it
may be said that although not visible in the results of the morphological comparison
vitrification may be more suitable for the cryopreservation of day seven bovine
embryos obtained from a SOF culture system. The significant differences in the
results of the RT-qPCR indicate that these distinctions are dependant on the
analysed gene transcript. In order to obtain the level up to which these molecular
differences have an influence on fetal and neonatal development transfers of
embryos cryopreserved by both methods will have along with assessment of
pregnancy rates and examination of the descendants.
103
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
8. Verzeichnisse
8.1.Verzeichnis der Tabellen
Tabelle 1: Übersicht über Medienzusätze zur Verbesserung der Kryotoleranz in vitro
produzierter Embryonen ............................................................................. 8
Tabelle 2: Übersicht über Überlebensraten in vitro produzierter Embryonen nach
Vitrifikation oder konventioneller Kryokonservierung ................................ 28
Tabelle 3: Durchschnittliche Zellzahlen nach Kryokonservierung durch Vitrifikation
oder konventionelle Kryokonservierung oder ohne Kryokonservierung.... 29
Tabelle 4: Trächtigkeitsraten in vivo und in vitro generierter Embryonen nach
Kryokonservierung durch Vitrifikation oder konventionelle
Kryokonservierung.................................................................................... 30
Tabelle 5: Entwicklungsrelevante Gentranskripte in vitro produzierter Blastozysten im
Vergleich zu in vivo Blastozysten ............................................................. 32
Tabelle 6: Klassifizierung gefundener Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) ............. 48
Tabelle 7: Protokoll zur Vitrifikation von bovinen Blastozysten (Fa. Gynemed)........ 55
Tabelle 8: Protokoll zum Auftauen von vitrifizierten Blastozysten ( Fa. Gynemed).. 57
Tabelle 9: Lysis/Bindingpuffer................................................................................... 62
Tabelle 10: Wasch-Puffer A...................................................................................... 62
Tabelle 11: Wasch-Puffer B...................................................................................... 62
Tabelle 12: Tris-HCl.................................................................................................. 62
Tabelle 13: Zusammensetzung des Master-Mixes (MM) für die Reverse
Transkription .......................................................................................... 63
Tabelle 14: Übersicht über die verwendeten Primer................................................. 65
Tabelle 15: Eingesetzte Embryonenäquivalente bezogen auf das zu untersuchende
Gentranskript ......................................................................................... 66
Tabelle 16: Zusammensetzung des Reaktionsgemisches für die RT- qPCR ........... 67
Tabelle 17: Teilungs- und Entwicklungsraten der IVP-Sitzungen ............................. 71
Tabelle 18: Reexpansions- und Schlupfraten der kryokonservierten Embryonen nach
dem Auftauen ........................................................................................ 72
Tabelle 19: Gesamtzellzahlen .................................................................................. 74
104
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
Tabelle 20: Lebend-Tot-Zellratio vitrifizierter und konventionell kryokonservierter
Embryonen sowie der Embryonen der Kontrollgruppe.......................... 75
Tabelle 21: Einfluss von Zusätzen zum Kulturmedium auf die Kryotoleranz in vitro
produzierter Embryonen ........................................................................ 84
105
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
8.2. Abkürzungsverzeichnis
aa
mit Aminosäurenzusatz (amino acids)
ANOVA
Varianzanalyse (Analysis of variance)
bp
Basenpaare
BSA
bovines Serumalbumin
bTP
bovine Trophoblast Protein
BVD
bovine Virus Diarrhoe
BVDV
bovines Virus Diarrhoe Virus
bzw.
beziehungsweise
°C
Grad Celsius
CDH1
E-cadherin (Bos taurus)
Cdh1
E-Cadherin (Mus musculus)
CLA
konjugierte Linolsäure
CO2
Kohlenstoffdioxid
Ca.
cirka
DSC2
Desmocollin 2 (Bos taurus)
Dsc2
Desmocollin 2 (Mus musculus)
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Deoxyribonucleic acid
DNMT1A
Cytosin-5-methyltransferase1A (Bos taurus)
DNMT3A
Cytosin-5-methyltransferase 3A (Bos taurus)
Dnmt3a
Cytosin-5-methyltransferase 3a (Homo sapiens)
Dnmt3a
Cytosin-5-methyltransferase 3a (Mus musculus)
dNTP
Desoxyribonukleosidtriphosphat
EÄ
Embryonenäquivalente
E-cad
E-Cadherin
ECS
Estrus Cow Serum
EG
Ethylen Glykol
EMG
Electron microscope grid
et al.
et alii (und andere)
Fa.
Firma
106
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
FAF
Fatty Acid Free (ohne Fettsäuren)
FBS
Fetal Bovine Serum (fetales Rinderserum)
FCS
Fetal Calf Serum (fetales Kälberserum)
g
Gramm
g
Erdschwerebeschleunigung
GLUT1
Glukose Transporter Typ 1 (Bos taurus)
GLUT3
Glukose Transporter Typ 3 (Bos taurus)
h
Stunde (hora)
HCl
Salzsäure
HECM
Hamster Embryo Culture Medium
HHE
Hypotaurin-Heparin-Epinephrin
HHP
High hydrostatic pressure
HSA
Humanes Serum Albumin
HSP70-1
Heat Shock Protein 70 (Bos taurus)
Hsp70
Heat Shock Protein 70 (Mus musculus)
H2O
Wasser
IBR
infektiöse bovine Rhinotracheitis
ICM
Inner Cell Mass
I.E.
Internationale Einheiten
IETS
International EmbryoTransfer Society
IFNτ
Interferon τ
IGF
Insulin Growth Factor
IVC
In vitro culture (In vitro Kultur)
IVF
In-vitro-Fertilisation
IVM
In-vitro-Maturation
IVP
In-vitro-Produktion
KOK
Kumulus-Oozyten-Komplex
KSOM
KCL-angereichertes Simplex Optimisation Medium
Lfd. Nr.
laufende Nummer
LOS
Large Offspring Syndrome
M
Molar/e
107
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
mg
Milligramm
min
Minuten
ml
Milliliter
MM
Master Mix
mm
Millimeter
Mod.
modifiziert
mOPS
modified open pulled straw
MPa
Megapascal
MPC
Magnetic particle counter
mRNA
Messenger Ribonucleic Acid
MSD
minimum size drop
NCBS
New Born Calf Serum
N2
Stickstoff
O2
Sauerstoff
OPS
Open pulled straw
OPU
Ovum Pick-Up
P
Propabilität, Irrtumswahrscheinlichkeit
PBS
Phosphate Buffered Saline
PCR
Polymerase Chain Reaktion (Polymerase Kettenreaktion)
PES
Phenazin Ethosulfat
pg
Pikogramm
PVA
Polyvinylalkohl
PVP
Polyvinylpyrrolidon
RNA
Ribonucleic Acid (Ribonukleinsäure)
RT-qPCR
Reverse Transkriptase quantitative PCR
Sek
Sekunden
SEM
Standardfehler des Mitelwertes
SLC2
Solute Carrier Familie 2
SLC2A1
Solute Carrier Familie 2 Member 1 (Bos taurus)
SLC2A1
Solute Carrier Familie 2 Member 1 (Homo sapiens)
Slc2a1
Solute Carrier Familie 2 Member 1 (Mus musculus)
108
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
SLC2A3
Solute Carrier Familie 2 Member 3 (Bos taurus)
Slc2a3
Solute Carrier Familie 2 Member 3 (Mus musculus)
SOF
Synthetic Oviduct Fluid
SSV
Solis Surface Vitrification
TALP
Tyrode’s Albumin Laktat Pyruvat
TCM
Tissue Culture Media
TE
Trophektoderm
TG-Embryo
Tiefgefrierembryo
TJ
Tight Junction
TJP1
Zona occludens 1 (Bos taurus)
Tjp1
Zona occludens 1 (Mus musculus)
u.
und
u.a.
unter anderem

Mittelwert
z.B.
zum Beispiel
ZO-1
Zona occludens 1 (Mus musculus)
z.T.
zum Teil
µl
Mikroliter
%
Prozent
109
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
8.3. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung der In-vitro-Produktion (mod. nach
NIEMANN u. MEINECKE 1993b).......................................................... 5
Abbildung 2: Schematische Darstellung der physikalischen Prozesse beim Einfrieren
von lebenden Zellen (mod. nach Mazur 1977) ................................... 10
Abbildung 3: Aufziehen des Embryos in einer Paillette mit Saccharose als HoldingMedium, das zum direkten Ausverdünnen nach dem Auftauen verwandt
werden kann........................................................................................ 12
Abbildung 4: Durchführung der OPS-Methode nach Vajita (1999) ........................... 22
Abbildung 5: Straw-in-Straw Model mit OPS (Isachenko 2005)................................ 24
Abbildung 6: Solid Surface Vitrification, modifiziert nach DINNYÉS (2000).............. 26
Abbildung 7: IVP-taugliche Kumulus-Oozyten-Komplexe ......................................... 49
Abbildung 8: KOK nach 24-stündiger Reifung .......................................................... 49
Abbildung 9: Expandierte Blastozyste nach siebentägiger In-vitro-Kultur................. 51
Abbildung 10: Aufbau des gefüllten Straws vor der Kryokonservierung ................. 52
Abbildung 11: Programm 0 Einfrierautomat CL-5500, Herabsenken der Temperatur
von -6°C in 0,5 °C-Schritten auf eine Endtemperatur von -35°C 68
Minuten nach Beginn des Programms ................................................ 53
Abbildung 12: Vitriplug und Straw............................................................................. 54
Abbildung 13: Spitze des Vitriplug ............................................................................ 54
Abbildung 14: Strukturformel Ethidium homodimer .................................................. 59
Abbildung 15: Strukturformel Bisbenzimid ................................................................ 59
Abbildung 16: Schematischer Überblick über die Versuchsanordnung .................... 70
Abbildung 17: Konventionell Kryokonservierte Blastozyste nach Auftauen und
Schlupf mit Ethidium homodimer und Hoechst 33342 gefärbt ............ 73
Abbildung 18: Vitrifizierte Blastozyste nach dem Auftauen und Schlupf mit Ethidium
homodimer und Hoechst 33342 gefärbt .............................................. 74
Abbildung 19: Analyse 8 entwicklungsrelevanter Gentranskripte einer bovinen
Blastozyste durch RT-qPCR jeweils im Doppelansatz ........................ 77
110
Verzeichnisse
___________________________________________________________________
Abbildung 20: Relative Transkriptmenge von HSP70-1, SLC2A1 und TJP1 in
präimplantatorischen Blastozysten nach dem Auftauen (P a:b <0,05) 78
Abbildung 21: Relative Transkriptmenge von SLC2A3 und DNMT3A in
präimplantatorischen Blastozysten nach dem Auftauen (P a:b < 0,05)79
Abbildung 22: Relative Transkriptmenge von IFNττ in präimplantatorischen
Blastozysten nach dem Auftauen (P a:b < 0,05) ................................ 80
Abbildung 23: Relative Transkriptmenge von CDH1 in präimplantatorischen
Blastozysten nach dem Auftauen (P > 0,05) ....................................... 81
Abbildung 24: Relative Transkriptmenge von DSC2 in präimplantatorischen
Blastozysten nach dem Auftauen (P a:b < 0,05) ................................. 82
111
Anhang
___________________________________________________________________
9. Anhang
9.1. Einzeldaten der Zellzahlzählung nach Differentialfärbung
LFD
VITRIFIZIERTE
NR.
KONVENTIONELL
KRYOKONSERVIERTE
Gesamtzellzahl
Tote
Gesamtzellzahl
Zellen
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
KONTROLLE
126
104
144
128
128
132
156
97
86
142
146
133
150
100
128
85
79
107
98
134
132
134
15
11
15
13
20
13
16
13
8
5
7
6
17
9
17
3
3
12
8
3
10
3
Tote
Gesamtzellzahl
Zellen
106
139
114
131
83
102
112
141
82
114
113
131
132
110
142
136
149
110
70
108
119
130
130
112
11
21
16
10
15
7
12
14
7
4
9
6
4
22
2
8
8
14
7
3
16
3
7
Tote
Zellen
127
114
115
115
87
134
138
137
136
109
108
165
143
129
190
182
123
157
125
111
112
121
134
122
120
4
15
2
4
5
4
12
8
16
12
8
11
4
12
8
5
6
17
7
11
8
12
10
9
21
Anhang
___________________________________________________________________
9.2. Einzeldaten der RT-qPCR
Vitrifiziert
Konventionell
Kontrolle
Kryokonserviert
Gen
n

SEM
n

SEM
n

SEM
DNMT3
12
0,3
0,05
12
0,14
0,02
13
0,42
0,08
SLC2A1
12
0,41
0,08
12
0,32
0,05
13
0,72
0,09
SLC2A3
12
1,02
0,14
12
0,68
0,11
13
1,38
0,19
HSP70-
12
0,22
0,03
12
0,23
0,03
13
0,35
0,05
IFNτ
12
0,24
0,06
12
0,54
0,09
13
0,3
0,05
TJP1
12
0,15
0,03
12
0,14
0,03
13
0,28
0,04
CDH1
12
0,38
0,06
12
0,36
0,07
13
0,54
0,07
DSC2
12
0,22
0,04
10
0,27
0,05
13
0,49
0,11
A
1
113
Anhang
___________________________________________________________________
9.3. Medien IVP
1. Phosphate Buffered Saline Gebrauchslösung
(Sigma D-5773)
PBS-Pulver
Stocklösung
Aqua bidest
Hersteller
Sigma D-5773
1l
9,65g
10ml
Ad 1l
2l
19,3g
20ml
Ad 2l
PBS-Stocklösung:
Natrium-Pyruvat
Streptomycinsulfat
D-Glukose
CaCl2 x H2O
Penicillin G
Hersteller
Sigma P 3662
Sigma S 6501
Riedel-de-Haen 16301
Sigma C 7902
Sigma PENK
G/500ml
1,80 g
2,50 g
50,00 g
6,65 g
3,00 g
Hersteller
Sigma D 5773 +
Stocklösung
Serva 24900
500 ml
Sigma A 9647
0,5 g
Hersteller
Sigma M 2520
Sigma G 3632
Sigma P 3662
Riedel-de Haen 31437
Ampuwa® Fresenius
0,453 g
0,0015 g
0,00066mg/ml
0.066g
Ad 30 ml
Sigma A 7030
0,03 g
PBS-Complete
PBS-Gebrauchslösung
Heparin
Bovines Serum Albumin
(Frak.V)
5,6 mg
Tissue Culture Media
TCM 199
Gentamycinsulfat
Natrium-Pyruvat
NaHCO3
H2O
BSA, Fatty acid Free
(FAF)
114
Anhang
___________________________________________________________________
5. Fert.-Talp Stocklösung
Hersteller
NaCl
KCl
NaHCO3
NaH2PO4 x
H2O
CaCl2 x 2H2O
MgCl2
Phenolrot
Penicillamine
Natrium-Laktat
(60%)
Ampuwa
Sigma
S 5886
Sigma
P 5405
Sigma
P 3662
Sigma
S 5761
Sigma
C 7902
Sigma
M 2643
Sigma
P 5530
Sigma
P 4875
Sigma
L 4263
Fresenius
Konzentration
mM
g/mol
g/100ml
114,0
58,44
0,6658
3,2
74,60
0,0239
25,0
84,01
0,02100
0,3
137,99
0.0041
2,0
147,02
0,0294
0,5
95,22
0,0048
0,01µl/ml
0,0010
20,0
149,20
0,0003
10,0
112,10
0,1860
ad 100ml
6. Gentamycin-Stocklösung
25mg Gentamycin/0,5ml Ampuwa
7. Hypotaurin-Heparin-Epinephrin(HHE)-Stock
1. Epinephrinstocklösung:
Epinephrin
Lösungsmittel
Hersteller
Sigma E 4250
1,83 mg
40 ml
Lösungsmittel:
Natriummetabisulfit
Natriumlaktat
Apuwa
Fluka 71928
Sigma L-4263
Fresenius
115
50 mg
165 mg
50ml
Anhang
___________________________________________________________________
2. Hypotaurinstocklösung:
Hypotaurin
H2O
Hersteller
Sigma H 1384
Ampuwa, Fresenius
1,09 mg
10 ml
3. Heparinstocklösung:
Hersteller
Heparin
Serva Kat.nr.24590
2,82 mg
H2O
Ampuwa, Fresenius
10 ml
4. Hypotaurin-Epinephrin-Arbeitslösung:
Hypotaurinstocklösung
Epinephrinstocklösung
H2O
10ml
4 ml
26 ml
Ampuwa, Fresenius
5. HHE-Arbeitsmedium
Hypotaurin-Epinephrin-Arbeitslösung
Heparinstocklösung
80 µl
40 µl
8. SpermFilter® Arbeitsmedium
SpermFilter, Gynemed 3SF0010
900µl
Fert.Talp-Medium
100µl
116
Anhang
___________________________________________________________________
9. Synthetic Oviduct Fluid (SOF)
1. SOF-Stocklösung A
Hersteller
Sigma
g/Mol
50ml
NaCl
S 5886
58,44
3,145
KCL
P 5405
74,55
0,267
KH2PO4
P 5655
136,1
0,081
MgSO4
M 2643
120,4
0,091
H2O
W 1503
Natriumlaktat
L 4263
49,20
112,1
0,300
g/Mol
50 ml
84,01
376,4
1,05
0,005
50
g/mol
5 ml
110
0,04
5
g/mol
5 ml
147,0
0,131
5 ml
2. SOF-Stocklösung B
NaHCO3 (g)
Phenolrot (g)
H2O (ml)
Hersteller
Sigma
S 4019
P 5530
W 1503
3. SOF-Stocklösung C
Hersteller
Sigma
P 3662
W 1503
Natriumpyruvat (g)
H2O(ml)
4. SOF-Stocklösung D
CaCl2 x 2 H2O
H2O (ml)
Hersteller
Sigma
C 7902
W 1503
117
Anhang
___________________________________________________________________
5. Glutamine-Stocklösung
Hersteller
Sigma
G 6392
W 1503
Glutamine (g)
H2O (ml)
0,292
10,0
6. SOFaa(m) Kulturmedium
Myo-Inositol (g)
Trinatriumcitrat (g)
Gentamycin (g)
H2O (ml)
GlutamineStocklösung (µl)
SOF-Stock A (ml)
SOF-Stock B (ml)
SOF-Stock C (ml)
SOF-Stock D (ml)
BME (ml)
MEM (ml)
Hersteller
Sigma
I 7508
S 4641
G 3632
W 1503
g/mol
25 ml
180,2
294,1
136,1
0,0125
0,0025
0,00125
19,5
G 6392
25,0
B 6766
M 7145
2,5
2,5
0,25
0,25
0,8
0,3
(HOLM et al. 1999)
10. NaCl Complete
Hersteller
Aqua bidest
NaCl
Penicillin
Sigma S-5886
Sigma P-3414
118
1l
9,0 g
0,06 g
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Auszüge der vorliegenden Arbeit wurden bereits der Öffentlichkeit vorgestellt:
35. Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Embryotransfer deutschsprachiger Länder
(AET-d) am 19./20. Juni 2008 in Dipperz- Friesenhausen:
H. Stinshoff, K. Höffmann, A. Hanstedt, D. Müller und C. Wrenzycki:
„Einfluss eines Vitrifikations- und eines kontrollierten Kryokonservierungsverfahrens
auf die Qualität in vitro produzierter Rinderembryonen“
36. Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft Embryotransfer deutschsprachiger Länder
(AET-d) am 18./19. Juni 2009 in Landshut:
H. Stinshoff, K. Brüning, A. Hanstedt, D. Müller, S. Wilkening, C. Wrenzycki:
„Vergleich in vitro produzierter Embryonen hinsichtlich ihrer Qualität nach dem
Einfrieren durch Vitrifikation oder konventionelle Kryokonservierung“
Society for Low Temperature Biology (SLTB) Annual Scientific Meeting, AGM and
Symposium, 7. - 9. September 2009 in Hannover:
H. Stinshoff, K.Brüning, A. Hanstedt, D. Müller, S.Wilkening, C. Wrenzycki:
“Effects of different cryopreservation techniques on the quality of bovine embryos”
DANKSAGUNG
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Frau Prof. Dr. Christine Wrenzycki danke ich für die Überlassung des Themas
und die ständige freundlich-energische Unterstützung beim Anfertigen der
vorliegenden Arbeit. Vielen Dank für die ständige Bereitschaft „mal eben“ zu
helfen, zu korrigieren und bei tausend anderen Dingen gleichzeitig zu
unterstützen!
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Ein weiterer Dank geht an die Firma Gynemed für die freundliche Überlassung
der Vitrifikationsmedien.
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Danke an Sandra Wilkening und Doris Müller, ohne die die Arbeit im IVPLabor und RNA-Labor nicht möglich gewesen wäre.
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Den Belegschaften der Schlachthöfe in Gleidingen, Bremen und Bad
Bramstedt danke ich für ihre Geduld und Rücksichtnahme, wenn es ans
Sammeln der Ovarien ging.
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Ein großes Danke geht an Jörn Dettmer, der mit seinen magischen Fingern
scheinbar jeden Computer vor dem vollständigen Aus bewahren kann
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Vielen Dank an meine Arbeitskollegen Ana Hanstedt und Eike Onnen-Lübben,
durch die während der letzten zweieinhalb Jahre auch unmögliche Situationen
wieder möglich wurden. Weiterhin danke ich ihnen für die sehr unterhaltsame
Zeit in unserer Büro-WG.
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Ana danke ich außerdem für die Hilfe im Krieg gegen meine persönlichen
Feinde Excel und Word.
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Meinen Mädels aus dem Studium und dem Mittwochabends-Club danke ich
dafür, dass sie mir regelmäßig gezeigt haben, dass eine Dissertation nicht das
Ende alle Freu(n)de bedeutet, und dass es bei ihnen auch manchmal einfach
nicht läuft.
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Anna, Imke, Karla und Maike danke ich für ihre andauernde moralische
Unterstützung, dass ich sie zu jeder Tages- und Nachtzeit mit meinen
Problemen belästigen darf und dass sie mir immer gute Ratschläge geben.
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Pierre danke ich für seine Geduld mit mir - vor allem in den letzten Wochen
des Anfertigens dieser Arbeit. - , dafür, dass er mir andere Sichtweisen auf
vieles eröffnet, fürs Giraffen füttern und dafür, dass er da ist.
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Meinen Mädels aus dem Stall danke ich dafür, dass sie mir hin und wieder
gezeigt haben, dass es außer Tiermedizin auch noch andere Dinge auf dieser
Welt gibt.
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Meiner Familie danke ich für all ihre Unterstützung, die sie mir im Verlauf des
Promotionsstudiums (und natürlich auch auf dem Weg dahin) gegeben haben
und dafür, dass sie immer für mich da sind.