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Experimentelle Prüfung verschiedener Methoden der
quantitativen Bestimmung gesamtcoliformer und
fäkalcoliformer Bakterien (E. coli) für die qualitative Bewertung
von Wasserproben
Diplomarbeit
im Studiengang Biotechnologie
vorgelegt von
Dzevrije Sabani Serani
Hamburg
am 21.02.20006
Gutachter: Prof. Dr. Birger Anspach
Dr. Klaus Roch
Fachhochschule Hamburg
Fachamt für
Umweltuntersuchungen,
Umweltbehörde Hamburg
Die Diplomarbeit wurde betreut und erstellt
im Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg,
Marckmannstr. 129 b, 20539 Hamburg
Danksagungen
Diese Arbeit wurde erstellt mit freundlicher Unterstützung der Mitarbeiter im
Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg. Ein ganz besonderer Danke gilt
dabei Frau Keitel für ihre tatkräftige Unterstützung bei den praktischen Arbeiten
im Labor.
Für die freundliche Unterstützung bei der paktischen und theoretischen Arbeit
möchte ich mich herzlich bei Herrn Dr. Roch bedanken.
Für die umfassende Betreuung der Diplomarbeit danke ich Herrn Prof. Dr.
Anspach.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1
1.1 Bakteriologische Wasseruntersuchung
2. Material und Methoden
1
2
2.1 Definition coliformer und fäkalcoliformer Bakterien
2
2.2 Plattenmethoden
2
2.2.1 Allgemeines
2
2.2.2 Unterscheidung der Ausstriche bei den Plattenmethoden
3
2.2.3 Selektiv-Nährböden zur Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen
Bakterien (E. coli)
4
2.2.3.1 Gerätschaften und Materialien
5
2.2.3.2 Oberflächenausstrich
8
2.2.3.3 Einmischverfahren (Plattengussverfahren)
9
2.2.3.4 Membranfiltration
9
2.2.3.5 Weitere Differenzierungen von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien 10
2.3 MPN-Verfahren (Mehrfachansatz)
2.3.1 Allgemeines
11
11
2.3.2 Bestimmung von coliformen Bakterien und fäkalcoliformen
Bakterien (E. coli)
13
2.3.2.1 Durchführung der Untersuchungen
13
2.3.3 MPN-Verfahren mit Miniaturverfahren zur Erfassung von E. coli
14
2.3.3.1 Allgemeines
14
2.3.3.2 Durchführung der Untersuchungen
15
2.3.4 Colilert-18®/Quanti-Tray®-Verfahren
17
2.3.4.1 Allgemeines
17
2.3.4.2 Durchführung der Untersuchungen
17
2.3.4.3 Prüfung biochemischer Merkmale von Mikroorganismen durch
die Lange Bunte Reihe
2.3.5 Membranfiltationsverfahren
20
29
2.3.5.1 Allgemeines
29
2.3.5.2 Durchführung der Untersuchungen
32
2.3.6 Zusammenfassung der unterschiedlichen Nährböden
2.4 Mikrobiologische Referenzmaterialien
34
35
2.4.1 Durchführung der Kultivierung von Kontrollstämme
35
2.4.2 Einsatz der Gebrauchskulturen
35
2.5 Statistische Prüfverfahren
36
2.5.1 Statistik für die Qualitätssicherung in der Wassermikrobiologie
36
2.5.2 Grundberechnungen
36
2.5.2.1 Arithmetisches Mittel
36
2.5.2.2 Varianz, Standardabeichung und Variationskoeffizienten
37
3. Ergebnisse
38
3.1 Vergleich verschiedener Untersuchungsverfahren
38
3.1.1 Durchführung der Plattenmethoden
38
3.1.2 Durchführung der MPN-Verfahren
39
3.1.3 Ergebnisse der Untersuchungen auf coliformen Bakterien
mit den Plattenmethoden
39
3.1.3.1 Differenzierungen der coliformen Bakterien von ChromocultColiformen-Agar, Endo-C-Agar und Desoxycholat-Agar
40
3.1.4 Ergebnisse der Untersuchungen coliformen Bakterien mit den
MPN-Verfahren und Colilert®-18-Verfahren
43
3.1.4.1 Differenzierung der Colilert®-18-Verfahren mit der Langen
Bunten Reihe
46
3.2 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli mit den
Plattenmethoden
48
3.2.1 Differenzierung der Escherichia coli von Chromocult-ColiformenAgar, Endo-C-Agar und Desoxycholat-Agar
49
3.2.2 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli mit den
MPN-Verfahren und Coliler®-18-Verfahren
51
3.3 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli und coliformen
Bakterien mit dem Membranfiltrationsverfahren
53
3.4 Miniaturverfahren zur Zählung von Escherichia coli
55
3.5 Ergebnisse der quantitativen Erfassung von coliformen Bakterien
mit den einzelnen Verfahren
57
3.5.1 Chromocult-Coliformen-Agar
57
3.5.1.2 Endo-C-Agar
57
3.5.1.3 Desoxycholat-Agar
58
3.5.1.4 MPN-Verfahren und Colilert®-18-Verfahren
59
3.5.2 Ergebnisse der quantitativen Erfassung von Escherichia coli mit den
einzelnen Verfahren
60
3.5.2.1 Desoxycholat-Agar
60
3.5.2.2 Endo-C-Agar
61
3.5.2.3 Fluorocult-ECD-Agar
61
3.5.2.4 Chromocult-Coliformen-Agar
61
3.5.2.5 MPN-Verfahren und Colilert®-18-Verfahren
62
3.5.2.6 Membranfiltrationsverfahren zur quantitativen Erfassung von
Escherichia coli und coliformen Bakterien
3.5.2.7 Miniaturverfahren zur Zählung von Escherichia coli
3.6 Statistische Prüfverfahren zur quantitativen Erfassung der Ergebnisse
62
63
64
3.6.1 Anwendung statistischer Prüfverfahren auf die Ergebnisse der
Untersuchungen mit coliformen Bakterien
3.6.2 Ergebnisse der E. coli mit den statistischen Prüfverfahren
64
65
3.7 Untersuchungen von Umweltproben
66
3.8 Vergleich von Ergebnissen der Alster- und Elbeproben
67
3.8.1 Vergleich der Alsterproben mit den MPN-Verfahren
67
3.8.2 Vergleich der Elbeproben mit verschiedene Verfahren
68
3.8.2.1 Vergleich der Elbeproben aus der Kleine Elbe
68
3.8.2.2 Vergleich der Elbeproben aus der Großen Elbe
69
4. Schlussfolgerungen
4.1 Analytische Qualitätssicherung für coliforme Bakterien
70
70
4.2 Analytische Qualitätssicherung für fäkalcoliforme Bakterien (E. coli)
71
4.3 Bewertung der Bestimmungsmethoden
72
4.4 Zusammenfassung
74
4.5 Literaturverzeichnis
76
Kapitel 1: Einleitung
1.Einleitung
1.1 Bakteriologische Wasseruntersuchung
Die bakteriologische Untersuchung hat den Zweck, festzustellen, wie viele Bakterien einer
Wasserprobe auf einem Nährboden bestimmter Zusammensetzung zur Vermehrung zu
bringen sind.
Zur Erhaltung einer bestimmten Gewässerqualität sind nationale Gesetze und Verordnungen
sowie internationale Richtlinien erlassen worden.
Die EG-Richtlinien enthalten Qualitäts- bzw. Gewässergüteziele, die aquatische Schutzgüter
sichern, wenn die Grenzwerte eingehalten werden. In der EG-Richtlinie 76/160/EWG vom
08.12.1975 über die Qualität der Badegewässer werden z. B. für die Nutzung von natürlichen
Gewässern als Badegewässer bakteriologisch-hygienische Anforderungen gestellt (Tab. 1.1).
In Deutschland gilt auf der gesamtstaatlichen Ebene das Wasserhaushaltsgesetz (WHG). Das
WHG dient als Rahmengesetz, durch das der Bund einen Regelungsrahmen vorgibt, den die
Länder durch eigene Gesetze (Landeswassergesetze) auszufüllen haben. In den einzelnen
Bundesländern führte dies z. B. zum Erlass von Badegewässerverordnungen. Die
Überwachung des Wasserrechtes obliegt den zuständigen Behörden. [1]
Tabelle 1.1: Leit- und Grenzwerte der EG-Richtlinie über die Qualität der Badegewässer vom
08.12.1975 bei denen die Werte nicht überschritten werden dürfen.
Parameter
Volumen
Leitwert
Grenzwert
Coliforme
100 ml
500 (80)
10 000 (95)1
Fäkalcoliforme
100 ml
100 (80)
2000 (95)
Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von coliformen und fäkalcoliforme Bakterien
Escherichia coli wurden daher verschieden bewährte und neuartige Verfahren eingesetzt.
Neben verschiedenen Palettenverfahren wie zum Beispiel Desoxycholat-Agar-Verfahren,
Chromocult-Coliformen-Agar, Endo-C-Agar, Fluorocult-ECD-Agar wurde die „MostProbable-Number“-Methode (MPN) als Dreifachansatz angewendet. Darüber hinaus wurde
ein „MPN“-Miniaturverfahren der Firma BIO RAD, bei dem die Probe mit sogenannten
Mikrotiterplatten untersucht wird, eingesetzt. Ein weiteres Verfahren ist der
Membranfiltrationsverfahren, die als Alternativverfahren für das Colilert-18-Verfahren
zugelassen ist.
Die Zielsetzung dieser Arbeit umfasst somit nicht nur auf die Einführung einer anerkannten
qualitätssichernden Maßnahmen für den Bereich der bakteriologischen Wasseruntersuchung,
sonder auch den Vergleich verschiedener Methoden mit dem Ziel, die optimale
Bestimmungsmethode zu finden.
1
Probenzahlen in %
1
Kapitel 2: Material und Methoden
2. Methoden zur Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien
2.1. Definition coliformer und fäkalcoliformer Bakterien
Der direkte Nachweis von Krankheitserregern ist aufgrund der Vielzahl der Organismen und
ihrer meist geringen Dichte zeitlich und arbeitstechnisch sehr aufwendig und in den meisten
Fällen nicht durchführbar. Deshalb führt man bei der bakteriologischen
Gewässerüberwachung in der Regel nicht unmittelbar den direkten Nachweis von potentiell
pathogenen Organismen durch, sondern den von leichter erfassbaren Indikatorkeimen.
Es handelt sich dabei um Bakterien, die aus dem Darm von Menschen und warmblütigen
Tieren stammen und mit den Fäkalien bzw. dem gereinigten Abwasser in die Gewässer
gelangen. Als Fäkalindikatoren werden die coliformen Bakterien (Enterobacter, Klebsiella,
Citrobacter, Escherichia) und insbesondere fäkalcoliforme Bakterien der Art Escherichia coli
herangezogen. Das Vorkommen von coliformen Bakterien kann jedoch nur als Hinweis auf
eine fäkale Verunreinigung dienen, da Vertreter dieser Gruppe auch im Boden und im
Oberflächenwasser leben und damit nicht zwangsläufig fäkalen Ursprungs sein müssen. Eine
eindeutige Aussage kann somit nur über den Nachweis des obligaten Darmbewohners
Escherichia coli als Indikator einer fäkalen Verunreinigung gemacht werden. [1]
Escherichia coli und coliforme Bakterien gehören zur Familie der Enterobacteriaceae. Sie
sind sporenlose gramnegative Stäbchen, die Glucose und andere Kohlenhydrate unter Säureund Gasbildung metabolisieren. Die fakultativen Anaerobier sind auf den üblichen
Nährmedien leicht anzüchtbar. [4]
Die Verunreinigung von Gewässern durch Fäkalien und damit einhergehend mit
Krankheitserregern kann zu einer weitgehenden Einschränkung der Nutzung führen.
Betroffen sind dabei unter anderem die Trinkwassergewinnung oder die Landwirtschaft sowie
Freizeit und Erholung des Menschen.
2.2 Plattenmethoden
Bei der Plattenmethoden werden verschiedene Nährböden auf coliforme und fäkalcoliforme
Bakterien untersucht.
2.2.1 Allgemeines
Unter der Plattenmethode ist die Kultivierung von Bakterien in einem festen Nährmedium zu
verstehen. Dieses feste Medium besteht aus Gelatine, Agar-Gel oder Natriumsilikat, das
Nährstoffe und weitere selektive Substanzen enthält.
Je nach Untersuchungsziel werden die Bakterien auf verschiedenen Nährböden
unterschiedlich kultiviert. Man unterscheidet hauptsächlich folgende Medien:
2
Kapitel 2: Material und Methoden
Selektivmedien, die das Wachstum einer bestimmten Gattung fördern und möglichst alle
andere Arten hemmen, aber auch Anreicherungsmedien, mit denen das Wachstum einer
Bakterienart in einer Mischprobe gegenüber anderen Keimen beschleunigt wird.
Differenzierungsmedien zur Bestimmung mehrer Bakterienarten nebeneinander durch
Bildung charakteristischer Unterschiede im Koloniewachstum.
In der bakteriologischen Wasseruntersuchung sind vor allem selektive Nährböden von
Bedeutung, deren Inhaltsstoffe und Zusammensetzung das Wachstum des nachzuweisenden
Organismus fördern und gleichzeitig unerwünschte Begleitorganismen hemmen.
Das Festmedium wird üblicherweise in einer sterilen Petri-Schale angewendet. Es wird mit
einer geringen Menge an Probematerial beimpft und anschließend im Brutschrank bei einer
konstanten Temperatur bebrütet. Nach einer bestimmten Inkubationszeit entwickeln sich
durch die Vermehrung der Bakterien Kolonien. Jedes Bakterium braucht neben
verschiedenen, oft spezifischen Nährstoffen eine bestimmte Temperatur zum optimalen
Wachstum. Durch die Temperatur lassen sich bereits bestimmte Bakterien qualitativ
differenzieren. So wird bei einer Methode zur Gewässeruntersuchung beispielsweise zur
Bestimmung der coliformen Bakterien der Desoxycholat-Agar bei 37°C bebrütet, zur
Bestimmung der fäkalcoliforme Bakterien wird die Temperatur auf 44°C erhöht. Somit wird
die Tatsache genutzt, dass fäkalcoliforme Bakterien eine größere Thermotoleranz besitzen.
Die eindeutige Identifizierung eines Bakteriums erfolgt durch Form, Größe und Farbe der
Kolonien. Je nach Spezies können typische Kolonienformen entstehen. Durch den Zusatz von
chromogenen Substanzen kann ein weiteres Erkennungsmerkmal geschaffen werden, da diese
durch spezifische Stoffwechselprodukte der Bakterien in Farbkomplexe umgesetzt werden
und die Kolonien anfärben.
2.2.2 Unterscheidung der Ausstriche bei den Plattenmethoden
Bei der Plattenmethode läßt sich eine Vielzahl von unterschiedlichen Verfahren zur
Beimpfung unterscheiden.
Oberflächenausstrich
Beim Ausplattieren wird das Inokulum (0,1-0,5 ml) mit einer Impfschlinge auf dem festen
Nährboden ausgestrichen. Somit wachsen die Bakterien nur auf der Oberfläche des
Nährbodens. Diese Methode wird immer dann eingesetzt, wenn es sich um einen
Indikator-Agar handelt, bei dem eine eindeutige Farbreaktion mit den Kolonien stattfinden
muss. Abweichende Färbungen entstehen vor allem bei eingemischten Kolonien, da
beispielsweise unter der Oberfläche andere Sauerstoffverhältnisse herrschen können.
Verdünnungsausstrich (fraktionierter Ausstrich)
Benötigt man einzelne, gut isolierte Kolonien, die aus einer Probe mit hoher Keimdichte
entstehen sollen, wird das Inokulum schrittweise „verdünnt“, so dass in einigen Zonen der
Platte einzelne Kolonien zurückbleiben.
3
Kapitel 2: Material und Methoden
Einmischverfahren
Die Kolonien wachsen besser, wenn man zunächst das Inokulum in die leere Petri-Schale
pipettiert und anschließend mit zuvor verflüssigtem Nährboden übergießt. Dieses
Einmischverfahren ist vor allem bei beweglichen Bakterien anzuwenden, da diese sonst an
der Oberfläche schwärmen und einzelne Kolonien schwer zu erkennen sind. Auch bei
hoher Keimdichte der Proben bietet sich dieses Verfahren an, da die eingeschlossenen
Keime wesentlich kleinere und kompaktere Kolonien bilden als auf der Oberfläche.
Dadurch können viele Kolonien deutlich erkennbar nebeneinander wachsen, ohne dass
diese zusammentreffen und zu größeren Einheiten zusammenwachsen.
Membranfiltration
Bei der bakteriologische Untersuchungen wird das Inokulum durch einen
bakterienundurchlässigen Membranfilter (Porengröße 0,45 µm, ∅ 50mm) mittels eines
Filtrationsgerätes filtriert. Das Filter wird auf einen geeigneten Agar gelegt und inkubiert.
Aus dem Nährboden diffundieren die Nährstoffe durch die Porenstruktur des Filters, so
dass sich einzelne Organismen vermehren können. Das Auszählen der Kolonien wird
durch eine entsprechende Farbe des Filters und durch das eingedruckte Gitternetz
erleichtert.
Zur quantitativen Bestimmung der Keimzahl werden die Kolonien unter einem Keimzählgerät
mit 6-8facher Vergrößerung ausgezählt. Das Ergebnis der Koloniezählung wird in
„Koloniebildenden Einheiten pro Milliliter“ (KBE/ml) angegeben. Die Zahl der Kolonien pro
Platte sollte zwischen 30 und 300 liegen. Bei hoher Keimdichte zählt man nur einige zufällig
ausgewählte Quadrate im Sichtfeld und bestimmt mit dem Mittelwert dieser Einzelzählungen
die Gesamtzahl pro Platte. Das Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg gibt zur
Auswertung der Koloniezahl vor, dass bei starkem Bewuchs der Platte fünf zufällig
ausgewählte Quadrate (á 1 cm2) ausgezählt werden. Der aus diesen fünf Einzelzählungen
gebildete Mittelwert wird dann mit einem Faktor multipliziert, so dass man die
Gesamtkoloniezahl erhält. Ist die Keimdichte auf der Platte zu hoch (>>300/Platte) muss der
Ansatz mit höheren Verdünnungen wiederholt werden. Die Verdünnung erfolgt in der Regel
in Zehnerpotenzen.
2.2.3 Selektiv-Nährböden zur Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen
Bakterien (E.coli)
Es werden bestimmte Selektiv-Nährböden wie Desoxycholat-Agar, Endo-C-Agar,
Chromocult-Coliformen-Agar und Fluorocult-ECD-Agar für die Bestimmung von coliformen
und fäkalcoliformen Bakterien angewendet.
4
Kapitel 2: Material und Methoden
2.2.3.1 Gerätschaften und Materialien
Zur Durchführung der verschiedenen Plattenmethoden und für die Zubereitung der
Nährboden werden folgende Materialien und Geräte benötigt:
Sterile Petri-Schalen (BIOPUR, Art-Nr. 391K3660)
Elektrische Heizplatte
Wasserbad
Brutschränke Memmert, thermostatisiert, 37°C und 44°C
Eppendorf-Pipette 1 ml, 100 µl, 10 µl
Sterile Pipettenspitzen 10-1000 µl (z. B. EPPENDORF BIOPUR)
Einmal-Impfösen, steril, Standard 10 µl (VWR, Art. Nr.: 631Q2211)
Membranfilter 0,45µm ( ME 25/21, SCLEICHER & SCHUELL)
Vakuumpumpe (VACU USOG, Firma GERHARDT)
Einmalbecher
Waage (SARTORIUS BP 8100)
Kolonienzählgerät mit Lupe (Keimzählgerät WTW BZG 28)
Oxidase-Teststreifen, MERCK (Art. Nr.: 1.13300)
Kovac´s Reagenz für Indol-Test, MERCK Art. Nr.: 109293
Desoxycholat-Agar
Dieser spezielle Desoxycholat-Citrat-Nährboden der Firma OXOID (Art. Nr.: CM 163) ist zur
Isolierung und Keimzählung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien (Escherichia coli)
in Milch, Speiseeis und Wasser entwickelt. Er wird im Fachamt für Umweltuntersuchungen
Hamburg zum routinemäßigen Nachweis von coliformen und fäkalcoliformem Bakterien
(E. coli) in Oberflächengewässern verwendet.
Zusammensetzung der Bestandteile des Nährbodens in g je Liter:
Pepton
10,0
Laktose
10,0
Natriumdesoxycholat
1,0
Natriumchlorid
5,0
di-kaliumhydrogenphosphat
2,0
Eisen(III)-Citrat
1,0
Natriumcitrat
1,0
Neutralrot
0,3
Technischer Agar
15,0
5
Kapitel 2: Material und Methoden
Die Laktose dient den coliformen Bakterien als fermentierbare Kohlenstoffquelle. Der Abbau
von Laktose zu Säure wird durch einen Farbumschlag des pH-Indikators Neutralrot nach rosa
und durch einen gleichzeitigen Präzipitalhof von Gallensäure angezeigt. Die Kolonien von
Escherichia coli erscheinen somit rot und haben einen Präzipitalhof. Die Selektivität des
Agars wird durch Desoxycholat und Citrat erhöht, wodurch die grampositive Begleitflora
gehemmt wird. Die Selektivität wird bei anderen Desoxycholat-Nährböden mit größeren
Anteilen an Natriumdesoxycholat noch gesteigert.
Endo-C-Agar
Es handelt sich um einen Selektivnährboden nach ENDO(1904) zum Nachweis von
coliformen und fäkalcoliforme Bakterien (Escherichia coli) in den verschiedensten
Materialien. Der Endo-C-Agar von MERCK (Art. Nr.: 1.10684.0500) hat folgende
Zusammensetzung in g je Liter:
Pepton
10,0
Laktose
10,0
di-kaliumhydrogenphosphat
2,5
Natriumsulfit, wasserfrei
3,3
Pararosanilin (Fuchsin)
0,3
Agar-Agar
12,5
Natriumsulfit und Fuchsin hemmen grampositive Bakterien. E. coli und Coliforme verwerten
Laktose unter Bildung von Aldehyd und Säure. Aldehyd setzt Fuchsin aus der Fuchsin-SulfidVerbindung frei, welches dann die Kolonien rot anfärbt. Bei E. coli ist diese Reaktion so
intensiv, dass das Fuchsin auskristallisiert und dadurch den Kolonien einen
grünschimmernden, beständigen Metallglanz (Fuchsinglanz) verleiht. Die Coliformen zeigen
keinen Fuchsinglanz. Fuchsin gilt als potenziell krebserzeugend. Deshalb darf man Farbstoff
und Nährboden nicht mit der Haut in Berührung bringen.
Durch Sauerstoffeinwirkung wird der aufgegossene Nährboden infolge der Oxidation des
Sulfits allmählich rot und damit unbrauchbar. Selbst in Dunkelheit und bei
Kühlschranktemperaturen ist er nur wenige Tage haltbar.
Chromocult-Coliformen-Agar
Der von MERCK entwickelte Coliformen-Agar (Art. Nr.: 1.10426.0100/0500) gehört zur
Produktgruppe der Chromocult-Trockennährböden. Die Bestimmung von Bakterien durch
diese speziellen Nährböden erfolgt mittels chromogener Substrate. Sie ermöglichen eine
schnelle Identifizierung von Bakterien durch den Nachweis charakteristischer Enzyme. Beim
Chromocult-Coliformen-Agar handelt es sich um einen Selektivagar zum gleichzeitigen
Nachweis von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien (E. coli) bei der bakteriologischen
6
Kapitel 2: Material und Methoden
Untersuchung von Wasser und Lebensmitteln. Der Coliformen-Agar setzt sich wie folgt
zusammen in g je Liter:
Pepton
3,0
Natriumchlorid
5,0
di-Natriumhydrogenphosphat
2,7
Natriumpyruvat
1,0
Natrium-di-hydrogenphosphat
2,2
Tryptophan
1,0
Agar-Agar
10,0
Sorbit
1,0
Tergitol-7
0,15
Chromogenmischung
0,4
(Enthält u.a. Salmon-GAL und
X-Glucuronid)
Durch die Kombination von geeigneten Peptonen, Pyruvat, Sorbit und Phosphatpuffer wird
ein schnelles Anwachsen auch von subletal geschädigten coliformen Bakterien gewährleistet.
Der Gehalt an Tergitol-7 hemmt weitgehend das Wachstum grampositiver und einiger
gramnegativer Bakterien, ohne Einflüsse auf das Wachstum der Coliformen zu haben.
Der simultane Nachweis von Coliformen und E.coli wird durch die neue Kombination von
zwei chromogenen Substanzen möglich. Das Substrat Salmon-GAL wird durch die Coliforme
charakteristische ß-D-Galactosidase gespalten und bewirkt eine rosa-rote Färbung der
Coliformen-Kolonien. Der Nachweis der für E. coli charakteristischen ß-D-Glucuronidase
erfolgt über das Substrat X-Glucuronid, das eine Blaufärbung der positiven Kolonien bewirkt.
Da E. coli sowohl Salmon-GAL als auch X-Glucuronid spaltet, färben sie sich dunkelblauviolett. Somit sind sie leicht von den übrigen, rosaroten coliformen Bakterien zu
differenzieren.
Fluorocult-ECD-Agar
Der von MERCK für den Nachweis von E. coli entwickelte Fluorocult-ECD-Agar (Art.Nr.
1.04038.0100/0500) gehört zur Produktgruppe der Fluorocult-Trockennährböden. Der
Nährboden wird in der üblichen Weise mittels Oberflächenausstrich beimpft.
Der Nährboden besteht aus (Angaben in g/l):
Pepton aus Casein
20,0
Laktose
5,0
Natriumchlorid
5,0
7
Kapitel 2: Material und Methoden
Gallesalzmischung
1,5
di-Kaliumhydrogenphosphat
4,0
Kaliumdihydrogenphosphat
1,5
Agar-Agar
15,0
Tryptophan
1,0
4-Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronid 0,07
Die Gallesalzmischung diese E. coli-Direkt-Agars hemmt weitgehend die nicht obligat im
Darm vorkommende Begleitflora. Die Kolonien, die durch Spaltung des 4Methylumbelliferyl-ß-D-glucuronids) hellblau fluoreszieren, werden mittels einer UV-Lampe
abgelesen. Zusätzlich wird durch eine positiven Indolprobe, die eine Rotfärbung hervorruft,
die Anwesenheit von E.coli bestätigt.
Der Fluorocult-ECD-Agar wurde als Trockensubstanz geliefert und im Labor angesetzt. Es
werden 53,1 g des Pulvers eingewogen und in einem Liter destillierten Wasser gelöst. Die
Lösung wird mit Hilfe eines pH-Meters auf pH 7,0 eingestellt und 15 Minuten bei 121°C
autoklaviert. Nach dem Abkühlen (ca. 45-50°C) der Lösung im Wasserbad wird die Lösung
in sterilen Petri-Schalen gegossen.
Bei den vier verwendeten Nährböden wurden zwei unterschiedliche Beimpfungsmethoden
angewendet. Die jeweilige Methode ergibt sich aus den in der Literatur empfohlenen
Anwendungsverfahren. Bei Nährböden, für die mehrere Beimpfungsmethoden in Betracht
kommen, wurde entweder die im Labor bereits bewährte Methode übernommen oder in
Vorversuchen das geeignetste Verfahren ermittelt.
2.2.3.2 Oberflächenausstrich
Im Oberflächenausstrich wurden folgende Nährböden beimpft:
Endo-C-Agar (coliforme Bakterien bei 37°C, E. coli bei 44°C)
Chromocult-Coliformen-Agar (coliforme Bakterien und E. coli bei 37°C)
Fluorocult-ECD-Agar (E. coli bei 44°C)
Die fertigen Platten mit dem festen Nährboden für Endo-C-Agar und ChromocultColiformen-Agar werden gekühlt vorrätig gehalten.
Vor der Benutzung werden die Nährböden mit geöffnetem Deckel im Brutschrank bei 37°C
für ca. 15 Minuten vorgewärmt. Dadurch wird eventuell in den Schalen vorhandenes
Kondenswasser entfernt und der Nährboden eignet sich anschließend besser zum
Ausstreichen der Keime. Die vorgewärmten Platten werden mit einem bestimmten Volumen
der Probe befüllt.
Die geeignetste Probenmenge wurde bei den Vorversuchen ermittelt. Bei der Endo-CAgarplatte konnte kein großes Volumen gewählt werden, da der Nährboden für größere
Volumen sich nicht als „saugfähig“ festgestellt hat. Aber bei der Fluorocult-ECD-Agarplatte
8
Kapitel 2: Material und Methoden
war wiederum ein kleines Volumen als „nicht geeignet“ gefunden. Da bei den Vorversuchen
kaum Kolonien abzulesen waren. Für den Chromocult-Coliformen-Agar haben sich beide
Probenmengen als geeignet herausgestellt. Direkt im Anschluss werden die vorgewärmten
Platten mit der flüssigen Probe beimpft und mit Hilfe eines Spatels ein gleichmäßiger
Ausstrich durchgeführt. Durch Drehen der Platte im Licht kann man die Verteilung der
Flüssigkeit auf der Platte beobachten. Nachdem die ausgestrichenen Platten getrocknet sind,
werden sie mit dem Deckel nach unten in Brutschränke für 37°C (Endo-C-Agar, ChromocultColiformen-Agar) und 44°C (Endo-C-Agar, Fluorocult-ECD-Agar) gestellt.
2.2.3.3 Einmischverfahren (Plattengussverfahren)
Das Einmischverfahren wurde nur bei Desoxycholat-Agar für coliforme Bakterien bei 37°C
und fäkalcoliforme Bakterien bei 44°C angewendet.
Um die Ergebnisse besser zu präsentieren und eine Grundlage für einen Vergleich zu bilden
wurden bei diesem Verfahren Parallelansätze durchgeführt, d. h. mit eine beliebige Probe A
wurde das Einmischverfahren mit Desoxycholat-Agar, 4x als Parallelansatz durchgeführt.
Der Nährboden ist in Kulturröhrchen abgefüllt und wird kühl gelagert. Für jede Platte werden
zwei Kulturröhrchen in einem Emaillebecher auf einer elektrischen Heizplatte solange
aufgekocht, bis sich der gesamte Inhalt verflüssigt hat. Anschließend wird das Röhrchen im
Wasserbad auf 45-48°C abgekühlt. Von der gut homogenisierten, geschüttelten Probe wird
ein definiertes Volumen in eine sterile Petri-Schale gegeben. Der flüssige, auf 45-48°C
abgekühlte Agar eines Kulturröhrchens wird nun in die Petri-Schale gegossen. Durch
Bewegen der Schale wird der Agar mit der Probe sorgfältig vermischt. Nach Erstarren dieser
Mischung wird die Petri-Schale mit dem zweiten verflüssigtem Agar aufgegossen. Nach
Erstarren dieser Schicht wird die Petri-Schale mit dem Deckel nach unten gerichtet in die
Brutschränken gegeben.
2.2.3.4 Membranfiltration
Die Membranfiltration wurde beim Tergitol-7-Agar angewendet. Bei der Membranfiltrationsverfahren werden die steril gelieferten Membranfilter auf die Filtrationsanlage
gelegt. Es ist darauf zu achten, dass zwischen den einzelnen Arbeitsgängen die
Filtrationsanlage per Flammensterilisation entkeimt wird.
Das Inokulationsvolumen von 0,1 ml Referenzsuspension wird mit sterilem Wasser auf 100
ml gefüllt. Dieser Vorgang wird in einem sterilen Erlenmeyerkolben vorbereitet. Nach der
Filtration wird das Filter mit einer sterilen Pinzette auf den Agar gelegt. Die Platten werden
ebenfalls mit dem Deckel nach unten gerichtet in den Brutschrank bei 37°C gestellt (siehe
Kapitel 2.3.5.2).
9
Kapitel 2: Material und Methoden
2.2.3.5 Weitere Differenzierung von coliformen und fäkalcoliformen Bakterien
Eine weitere Bearbeitung und Bewertung der relativ schwach selektiven Desoxycholat-Platten
erfolgt durch die Identifizierung der Kolonien mit einer kleinen „Bunte Reihe“. Während der
experimentellen Tätigkeiten ist die Koloniezahl eine von den höchsten Werten, die eine
Vermutung auf falsch-positive Ergebnisse liefert. Deshalb wird für die weiteren Proben eine
Auswertung mit biochemischen Reaktionen „Bunte Reihe“ beschlossen. Diese sind bei allen 4
Parallelansätzen durchzuführen.
Die Bunte Reihe setzt sich aus Glucose-Röhrchen, Laktose-Röhrchen, Indol-Röhrchen und
Citrat-Röhrchen zusammen.
Nach der Bebrütungszeit der Desoxycholat-Agarplatten werden die Kolonien mit einen
Keimzählgerät ausgewertet und dokumentiert. Dann werden die einzelnen Kolonien
(neutralrot-rot) mit ausgeglühter Impfnadel in einem Indol-Röhrchen (Tryphtophan-Bouillon)
suspendiert und 3-6 h2 bei 36°C bebrütet. Von dieser Flüssigkeitskultur werden die zur
weiteren biochemischen Identifizierung dienenden Nährböden und Nährlösungen beimpft.
Das Glucose-Röhrchen wird bei 44°C, die anderen drei Röhrchen bei 36°C für 24 h bebrütet.
Glucose-Röhrchen
Positiv: Gasbildung und Gelbfärbung des grünen Agars, sonst negativ.
Laktose-Röhrchen
Positiv: Gasbildung und Gelbfärbung, sonst negativ.
Indol-Röhrchen
Positiv: Abbau des Tryptophans. Die farblose Lösung wird ca. 0,2 ml Kovacs-Reagenz
überschichtet. Das zugefügte Reagenz färbt rot, sonst negativ.
Citrat-Röhrchen
Positiv: Blaufärbung des grünen Agars, sonst negativ.
Oxidase-Reaktion
Mit eine sterilen Impföse wird eine kleine Menge der verdächtigen Kolonien (rot-rosa) auf der
markierten Stelle des Oxidasen-Teststreifens verrieben. Wird an der Stelle das Teststäbchen
blau bis blau-violett, ist die Reaktion positiv, sonst ist sie negativ. Dieser Oxidase-Test wurde
auch bei der Endo-C-Agarülatte durchgeführt und die Ergebnisse dokumentiert.
2
Stunden
10
Kapitel 2: Material und Methoden
Die Zusammensetzungen der Nährböden und Nährlösung werden in 2.3.4.3 dokumentiert.
Dort folgt eine „Lange Bunte Reihe“ mit 36 Komponenten.
2.3 MPN-Verfahren (Mehrfachansatz)
2.3.1 Allgemeines
Das Most-Probable-Number-Verfahren (MPN) ist eine Methode zur Keimzahlbestimmung in
Flüssigmedium, bei der das Bakterienwachstum im Mehrfachansatz bei verschiedenen
Verdünnungen Rückschlüsse über die vermeintlich in der Probe enthaltene Keimzahl zulässt.
Die Grundlage des Verfahrens ist ein flüssiges Selektivnährmedium, in dem durch bestimmte
Substrate bei Anwesenheit eines Bakteriums eine spezifische enzymatische Reaktion
stattfindet, die zu einem optischen Erkennungsmerkmal führt. Dies kann zum Beispiel ein
Farbumschlag der Nährlösung nach entsprechender Inkubationszeit oder ein fluoreszierendes
Reaktionsprodukt sein.
Zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl werden parallele Verdünnungsreihen von
einer Probe erstellt. Bei der Auswertung werden die jeweils positiven Röhrchen in den
einzelnen Verdünnungsstufen gezählt und die MPN-Kennzahl aufgestellt. Mit Hilfe einer
Statistiktabelle kann man aufgrund der vorliegenden Röhrchenkombination die
wahrscheinlichste Keimzahl ablesen. Beim MPN-Verfahren wird demnach nicht direkt die
sichtbare Koloniezahl bestimmt, sondern die wahrscheinlichste Keimzahl statistisch ermittelt.
Die statistische Sicherheit der Ergebnisse nimmt mit der Anzahl der Parallelansätze zu. Je
mehr Parallelansätze verwendet werden, desto höher ist die Genauigkeit der Tabellenwerte.
Die Anwendung der MPN-Methode kann in verschiedenen Fällen von Vorteil sein. Einerseits
gibt es Bakterien, die nicht auf festen Medien kultiviert werden können und somit nur mit
Flüssigmedien nachgewiesen werden können. Andererseits wird das Verfahren bevorzugt,
wenn die Kinetik des Wachstums verschiedener Bakterien in der Probe stark variiert. Wenn
zum Beispiel einige Keime sofort anfangen zu wachsen, sich ausbreiten und schließlich große
Kolonien bilden, können dabei die Kolonien der Bakterien, die von Interesse sind und die sich
erst später ausbilden, verdeckt werden.
MPN-Verfahren mit 3er- Ansatz
Bei z. B. 3 Parallelen führt ein Unterschied von einem positiven Röhrchen in der Kennzahl
(3-3-0 und 3-3-1) bereits zu einer Verdopplung der Keimzahl (24 und 46 KBE/ml). Damit
können Keimzahldifferenzen von weniger als 50% nicht quantitativ bestimmt werden.
Dagegen ist z. B. bei 10 Parallelen die Differenz der Tabellenwerte zweier
aufeinanderfolgender Kennzahlen wesentlich kleiner, es können Unterschiede von ca. 10%
bestimmt werden.
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgt anhand der MPN-Statistiktabellen nach MC
CRADY(siehe Anhang), die für Auswertungen von 3er- und 5er-MPN verwendet werden. Bei
diesen mathematischen Ansätzen wird die Wahrscheinlichkeit berechnet, mit einer Anzahl
11
Kapitel 2: Material und Methoden
bestimmter Volumina in verschiedenen Verdünnungsstufen eine gewisse Kombination an
positiven und negativen Röhrchen zu erhalten. Die Tabelle von MC CRADY wird zur
Auswertung der routinemäßigen Untersuchung der Oberflächengewässer mittels MPNMethode im Fachamt für Umweltuntersuchungen Hamburg verwendet.
Die Anwendung der Tabelle von MC CRADY beinhaltet genaue Vorgaben in bezug auf die
Verdünnungsstufen und Parallelansätze. Die Volumina, durch die bei gleichem Volumen der
Nährlösung die einzelnen Verdünnungen erreicht werden, sind bei MC CRADY festgelegt.
Die Tabelle gilt nur dann, wenn die erste Verdünnung (10-1) mit 1 ml, die zweite (10-2) mit
0,1 ml und die dritte(10-3) mit 0,01 ml angesetzt wird. Auch die Zahl der Parallelansätze ist
nicht frei wählbar, sondern mit 3 oder 5 ebenfalls vorgegeben.
Die Wahrscheinlichkeit für das Vorkommen einzelner Röhrchenkombinationen ist in
Kategorie zwischen 1 (am wahrscheinlichsten) und 3 (wenig wahrscheinlich) angegeben. Im
Einzelnen bedeuten die Kategorien folgendes:
Kategorie 1: Am wahrscheinlichsten vorkommende Röhrchenkombinationen. Andere
Kombinationen werden mit einer Wahrscheinlichkeit von höchstens 5% erhalten.
Kategorie 2: Weniger wahrscheinlich als in Kategorie 1 vorkommende
Röhrchenkombinationen. Andere Kombinationen als in Kategorie 1 und 2 werden mit
einer Wahrscheinlichkeit vom höchsten 1 % erhalten.
Kategorie 3: noch weniger wahrscheinlich als in Kategorie 2 vorkommende
Röhrchenkombinationen. Andere Kombinationen als in Kategorie 1 bis 3 werden mit einer
Wahrscheinlichkeit von höchstens 0,1 % erhalten.
Beispiel: Oberflächengewässer für eine beliebige Probe A
Bei einem Oberflächengewässer und einem MPN-Ansatz mit 3 Parallelansätzen d.h. 9
Kulturröhrchen, hat sich für beliebige Probe A folgendes Schema ergeben:
Tabelle 2.1: Ermittlung der MPN-Kennzahl
• = positive Röhrchen
Impfvolumen[ml] Verdünnungen
1
1:10
0,1
1:100
0,01
1:1000
1
•
•
•
Parallelansätze
2
3
•
•
•
•
-
Positive
3
3
1
Um die MPN-Kennzahl zu ermitteln, wird diejenige Verdünnungsreihe für die letzte Ziffer
der Kennzahl ausgewählt, in der noch positive Röhrchen zu finden sind. Das wäre in diesem
Fall ein MPN-Kennzahl von 3-3-1 (Tab.: 2.1). In der Statistiktabelle von MC CRADY für 3
Parallelansätze findet man die entsprechend dieser speziellen Zahlenkombination
wahrscheinlichste Keimzahl. In diesem Beispiel würde sich aus der entsprechende Tabelle ein
Wert von 4600 Keimen pro 100 ml, beziehungsweise 1 ml der Probe entsprechen 46 Keime.
12
Kapitel 2: Material und Methoden
2.3.2 Bestimmung von coliformen Bakterien und fäkalcoliformen Bakterien (E. coli)
Zur quantitativen Bestimmung der Keimzahl von Escherichia coli mit Hilfe der MPNMethode wurde Fluorocult-Laurylsulfat-Bouillon verwendet.
Der Nährboden von MERCK (Art.-Nr.: 1.12587.0100/0500) entspricht der DIN-Norm 10110
zur Untersuchung von Milch, den Vorschriften nach § 35 LMBG (06.00/36) zur
Untersuchung von Lebensmitteln und dem ISO Standard 6391 (1996) zur Untersuchung von
Milch und Milchprodukten. Weiterhin wird die MUG-Laurylsulfat-Bouillon als geeignete
Methode von Gesamtcoliformen und Fäkalcoliformen nach der Badegewässerrichtlinie
76/160/EWG empfohlen.
Zur Differenzierung der Gesamtcoliformen und der Fäkalcoliformen wird ein
fluoreszenzoptischer Test durchgeführt. Das 4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid wird nur
von den Fäkalcoliformen (E. coli) gespalten und das Spaltprodukt Methylumbelliferon
entsteht. Diese Substanz erzeugt Fluoreszenz im UV-Licht bei 366 nm. Die MUGLaurylsulfat-Bouillon wird insbesondere für die Most-Probable-Number-Methode (MPN)
eingesetzt.
Der Nährboden enthält folgende Bestandteile in g/l:
Tryptose
20,0
Laktose
5,0
Dikaliumhydrogenphosphat
2,75
Laurylsulfat-Natriumsalz
0,1
L-Tryptophan
1,0
4-Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid(MUG) 0,1
Der Gehalt an Laurylsulfat hemmt weitgehend das Wachstum von Begleitorganismen,
insbesondere Pseudomonaden. Zum Nachweis der Gesamtcoliformen werden die
Kulturröhrchen mit Gärröhrchen nach DURHAM versehen. Nach einer Inkubationszeit von
48 h bei 37° C führt die Laktosegärung der Gesamtcoliformen zur Gasbildung im DURHAMRöhrchen.
2.3.2.1 Durchführung der Untersuchungen
Bei der Durchführung der MPN-Methode wurden folgende Materialien und Geräte benötigt:
Brutschränke 37°C
Eppendorf-Pipetten 1 ml, 100µl, 10µl
Sterile Pipettenspitzen 1 ml, 100 µl (EPPENDOEF BIOPUR)
Sterile Pipettenspitzen 10µl (EPPENDORF EUROTIPS)
Reagenzständer
UV-Lampe 366 nm
13
Kapitel 2: Material und Methoden
Für das Most-Probable-Number-Verahren wurden die Kulturröhrchen für die Proben A 4x als
Parallelansatz vorbereitet, d.h. für Probe A wurde jeweils 36 Röhrchen mit der flüssigen
Bouillon in drei Verdünnungsreihen zu je 3 Röhrchen im Reagenzständer aufgestellt. Die drei
Verdünnungen wurden mit 1:10, 1:100 und 1:1000 festgelegt, dementsprechend
Probenvolumina von 1 ml, 0,1 ml und 0,01 ml pipettiert. Die Suspension wurde den drei
Verdünnungsreihen entsprechend mit drei verschiedenen Pipetten zugegeben. Für jede Reihe
wurde eine Pipettenspitze benutzt, mit deren Spitze man in die Bouillon eintaucht und die
Flüssigkeit ausdrückt. Vor jedem Pipettiervorgang muss die Probe geschüttelt werden. Nach
der Bebrütungszeit werden die Kulturröhrchen nach Gasbildung für coliforme Bakterien und
Fluoreszenz für Escherichia coli untersucht.
Die Auswertung erfolgt durch die Ermittlung der MPN-Kennzahl und das Ablesen des
Ergebnisses aus der Statistiktabelle von MC CRADY. Dann wird von den einzelnen
Parallelansätzen der Mittelwert gebildet.
2.3.3 MPN-Verfahren mit Miniaturverfahren zur Erfassung von E. coli
2.3.3.1 Allgemeines
Diese miniaturisierte Methode zur Keimzahlbestimmung in Wasserproben beruht auf
demselben Prinzip zur Ermittlung der wahrscheinlichsten Anzahl wie das herkömmliche
MPN-Verfahren.
Die Mikrotiterplatte besteht aus 96 Vertiefungen, in denen sich das Nährmedium in Form von
Trockensubstrat befindet. Die Aufteilung der Vertiefungen auf der Platte ergibt sich zu 12
Reihen mit jeweils 8 Vertiefungen. Jede einzelne Vertiefung ist aufgrund eines auf der Platte
eingravierten Planquadrates gekennzeichnet, so dass man die Einteilung in verschiedene
Verdünnungsstufen problemlos vornehmen kann. Je nach der zu erwartenden Keimzahl
werden die 96 Vertiefungen in 2, 4 oder 6 Verdünnungsstufen unterteilt. Die Wahl der
geeigneten Probenverdünnung lässt sich anhand der Probenherkunft in drei Kategorien
einteilen (Tab.: 2.2).
Tabelle 2.2: Verdünnungsstufen in Abhängigkeit der Keimzahl bei Verwendung von
Mikrotiterplatten
Art der Probe
Anzahl der
Verdünnungsstufen
Badegewässer
2
Oberflächengewässer
4
Abwässer
6
Anzahl der
Vertiefungen je
Verdünnungen
64 für 1:2
32 für 1:20
Jeweils 24 für 1:2,
1:20, 1:200 und
1:2000
Jeweils 16 für 1:2 bis
1:200 000
14
Messbereich
[Keimzahl/ml]
15∗10-2 – 3,5∗102
40∗10-2 – 3,2∗104
60∗10-2 – 6,7∗106
Kapitel 2: Material und Methoden
Zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Keimzahl in der Probe werden Statistiktabellen für
die einzelnen Anwendungsbereiche vom Hersteller BIO RAD mitgeliefert. Dabei wird zu
jeder Kennzahl zusätzlich das 95%-Intervall als Vertrauensbereich angegeben. Die Anzahl
positiver Reaktionen je Verdünnungsstufe ergibt die Kennzahl. Bei mehr als drei
Verdünnungsstufen sollte die dreistellige Kennzahl, wenn möglich in der dritten Verdünnung
keine Positiven mehr haben, also auf null enden.
Beispiel: Oberflächengewässer für eine beliebige Probe A
Bei Oberflächengewässer werden zwei Verdünnungsstufen angewendet, da dass sich jeweils
eine zweistellige Kennzahl ergibt. Zum Beispiel erhält man folgende Werte:
Verdünnung 1:2: 25 positive Vertiefungen von 64
Verdünnung 1:200: 3 positive Vertiefungen von 32
Es ergibt sich daraus die Kennzahl 25/3. Aus der Statistiktabelle für zwei Verdünnungen
lassen sich folgende Werte ablesen:
Tabelle 2.3: Darstellung der charakteristischen Zahl mit den unteren- und oberen Grenzwerten
Charakteristische
Zahl
Statistische
Tabellenwert
Untere Grenzwert
Obere Grenzwert
25/64
524
360
763
3/32
In diesem Beispiel erhält die Probe A 524 Keime/100 ml (95%-Vertrauensberiech: 360-763).
Der Nachweis der Fäkalindikatoren (E.coli) erfolgt durch eine enzymatische Reaktion der
Bakterien mit dem Substrat, das durch die Zugabe von Probe und Probenverdünnungspuffer
rekonstituiert wird. Bei positiver Reaktion wird eine fluoreszierende Substanz freigesetzt. Der
Nährboden wird als Trockensubstrat in den sterilen, gebrauchsfertigen Mikrotiterplatte der
Firma BIO RAD GmbH (Art.-Nr.: 3553785) geliefert. Bei dem Trockensubstrat in den 96
Vertiefungen der Mikrotiterplatte handelt es sich um einen Nährboden, der MUG (4Methylumbelliferyl-ß-D-Glucuronid) enthält. Das Verfahren basiert auf demselben
fluoreszenzoptischen Nachweis von E. coli, der bereits bei der MPN-Methode erläutert wurde
(Kapitel 2.3.2).
2.3.3.2 Durchführung der Untersuchungen
Für die Anwendung der Mikrotiterplatten wurden folgende Materialien verwendet:
Mikrotiterplatte E.coli (Art.-Nr.: 3553785) der Firma BIO RAD GmbH
Spezial-Probenverdünnungspuffer SDP (BIO RAD GmbH, Art.-Nr.3554280)
Abdeckfolien (Zubehör Mikrotiterplatten)
Sterile Röhrchen
Vollpipette, 10 ml
15
Kapitel 2: Material und Methoden
Eppendorf-Pipette, 1 ml
Mehrkanal- (8er)- Pipette
Sterile Pipettenspitzen 100 µl
Reagenz-Reservoirs für Mehrkanalpipetten (V-Form, 60 ml, WILKE und WITZEL, Art.Nr.: 9510027)
UV-Lampe 366 nm
Zur Bestimmung der Keimzahl in Proben aus Oberflächengewässern ist ein Ansatz mit zwei
Verdünnungsstufen ausreichend, da die zu erwartende Keimzahl im unteren Drittel des
Messbereiches für zwei Verdünnungen liegt.
Die Probe A, die zu einem besseren Vergleich der Verfahren dienen sollte, war kaum belastet,
dass diese Probe beim Mikrotiterverfahren in Parallelansätzen nicht durchgeführt werden
konnte. Deshalb sind andere beliebige Proben, die eine höhere Keimzahlwachstum haben
untersucht. Sie werden wie folgt durchgeführt:
Für jede Mikrotiterplatte werden bei zwei Verdünnungsstufen je zwei Röhrchen à 9 ml
Probenverdünnungspuffer (SDP) benötigt. Dieser Verdünnungspuffer wird fertig geliefert und
musste nicht selbst hergestellt werden. In das erste Röhrchen werden 9 ml der Probe gegeben.
Die Vermischung der Flüssigkeiten im Röhrchen erfolgt durch mehrmaliges Aufziehen mit
der Vollpipette. Von dieser ersten Verdünnungsstufe (1:2) wird 1 ml mit der EppendorfPipette entnommen und in das zweite SDP-Röhrchen gegeben (Verdünnung 1:20) Mit diesen
Verdünnungen wird die Mikrotiterplatte beimpft. Mit der Acht-Kanal-Pipette werden z.B. die
ersten 64 (8∗8) Vertiefungen mit je 200 µl der ersten Verdünnung befüllt, die letzten 32 (4∗8)
Vertiefungen mit der zweiten Verdünnung. Anschließend wird die Platte mit einer
Abdeckfolie überklebt und in den Brutschrank für 48 h bei 44°C gestellt. Ausgehend von 10
ml Probensuspension werden 9 ml mit 9 ml SDP vermischt und ergeben damit die erste
Verdünnungsstufe für die Mikrotiterplatten (Verdünnung 1:2, 64 Vertiefungen). Von dieser
ersten Verdünnung ausgehend wird 1 ml erneut mit 9 ml Probenverdünnungspuffer vermischt
und es ergeben sich 10 ml der Verdünnung 1:20 für die zweite Verdünnungsstufe (32
Vertiefungen). Die Aufteilung der Proben in die Mikrotiterplatte mit der Mehrkanalpipette
bereitet keine Schwierigkeiten, da die speziellen Reagenz-Reservoirs eine V-Form besitzen
und dadurch selbst bei kleinen Flüssigkeitsmengen einen ausreichend hohen
Flüssigkeitsspiegel gewährleisten.
Tabelle 2.4: Vergleich von vorhandenem und benötigtem Suspensionsvolumen zur
Beimpfung der Mikrotiterplatten
Mikrotiterplatten:
Vorhandenes Volumen
Benötigtes Volumen
9 ml Suspension + 9 ml SDP
64∗0,2 ml
= 18 ml
1. Verdünnung
= 12,8 ml
-1 ml für die 2. Verdünnung
= 17 ml
1 ml Suspension (aus der
32∗0,2 ml
1.Verdünnung)
+
9
ml
SDP
2. Verdünnung
= 6,4 ml
= 10 ml
16
Kapitel 2: Material und Methoden
2.3.4 Colilert-18®/Quanti-Tray®-Verfahren
2.3.4.1 Allgemeines
Der Colilert 18/Quanti-Tray-Verfahren ist ein Schnellverfahren für Wasserproben. Das
Verfahren ermöglicht den endgültigen Nachweis von coliformen Bakterien und Escherichia
coli in einem einzigen Anreicherungsschritt innerhalb von 18 Stunden.
Die qualitative als auch die quantitative Auswertung erfolgt über die Beurteilung der
Gelbfärbungen bzw. der Fluoreszenz.
Verfahrensprinzip:
Coliforme Bakterien metabolisieren innerhalb von 18 Stunden bei 36°C das farblose orthoNitrophenol-ß-D-Galaktopyranosid (ONPG), einen Indikatornährstoff, unter Abspaltung des
gelben ortho-Nitrophenols.
Escherichia coli ist zusätzlich in der Lage, 4-Methyl-Umbelliferyl-ß-D-Glukuronid (MUG),
einen weiteren Indikatornährstoff, unter Abspaltung des fluoreszierenden 4-MethylUmbelliferons zu metabolisieren. Bei Anwesenheit von E. coli wird durch die Aktivität der ßGlucuronidase aus dem Substrat Methyl-umbelliferyl-ß-D-Glukuronid (MUG) das
fluoreszierende 4-Methylumbelliferon freigesetzt. Die Fluoreszenz wird mittels einer UVLampe sichtbar gemacht.
2.3.4.2 Durchführung der Untersuchungen
Für die Anwendung der Colilert-18/Quanti-Tray-Verfahren wurden folgende Materialien
verwendet:
IDEXX-Geräte, -Nährböden und –Testreagenzien
Reaktionsgefäß mit Antifoam IDEXX-Bestellnr. 98 06160 00
Quanti-Tray-Sealer IDEXX-Bestellnr. 98 10896 00
Quanti-Tray-Einwegtrays IDEXX- Bestellnr. 98 21378 00
Quanti-Tray-2000 Einwegtrays (MPN=2419) IDEXX-Bestellnr. 98 21675 00
UV-Sichtkasten der Fa. IDEXX-Bestellnr. 98 21322 00
Gummimatte Quanti Tray IDEXX- Bestellnr. 98 21322 00
Gummimatte Quanti Tray 2000 IDEXX-Bestellnr. 98 09226 00
Quanti-Tray-/2000 Comperator IDEXX-Bestellnr. 98 09227 00
Colilert 18/200 Blisterpacks für 100 ml Wasserprobe Bestellnr. 98 21373 00
Einmal-Impfösen, steril, Standard 10 µl (VWR, Art. Nr.: 631Q2211)
Steriles demineralisiertes Wasser, falls Verdünnungen erforderlich
17
Kapitel 2: Material und Methoden
Brutschrank Memmert, thermostatisiert, (36±1)°C
Kühlschrank
Wasserfester Stift
Die 100 ml Wasserprobe wird unter sterilen Bedingungen in das versehene 100 ml-ColilertKulturgefäß überführt. Unter dem Abzug wird der Inhalt einer Packung Colilert-18 (Pulver)
vorsichtig dazugegeben. Nach Auflösen des Pulvers (ca. 15 Min.) wird der Ansatz in einen
leeren, sterilen Quanti-Tray-Behälter überführt. Hierbei wird der Quant-Tray mit einer Hand
angefasst und senkrecht gehalten, wobei die Seite mit den Vertiefungen zur Handfläche
zeigen soll. Der obere Teil des Trays wird zusammengedrückt, so dass sich der Träger zur
Handfläche hinbiegt. Der Tray wird geöffnet, indem die Folienlasche von der Seite mit den
Vertiefungen abgezogen wird. Die vorbereitet Mischung aus Probe und Reagenzien wird
direkt in den Tray gegossen, dabei ist eine Berührung der Folienlasche unbedingt zu
vermeiden. Somit wird die Sterilität gesichert.
Die mit der Probe gefüllten Tray wird auf die Gummi-Trägerunterlage das Quanti-TrayVersiegelungsgerät gestellt. Die Seite mit den Vertiefungen muss dabei nach unten weisen,
damit sie in die Unterlage passt. Die Trägerunterlage wird in das Versiegelungsgerät
geschoben bis es vom Transportmechanismus erfasst und ins Gerät gezogen wird. Innerhalb
von 15 Sekunden wird der Tray versiegelt und auf der Rückseite des Gerätes ausgeworfen.
Der Tray wird aus der Trägerunterlage entnommen und 18 h im Brutschrank bei 36 ± 1 °C
inkubiert.
Hauptsächlich wurde die Verdünnung von 1:10 gewählt. Nur für die Abwasserproben war die
Verdünnungsstufe 1:100 sinnvoller. Die Verdünnungen wurden mit sterilem Wasser
durchgeführt.
Auswertung:
Die Proben müssen exakt nach 18 Stunden ausgewertet werden. Nach Ablauf von 18 Stunden
können andere heterotrophe Keime das Hemmsystem von Colilert-18 überwinden. Wenn
dann eine Gelbfärbung bzw. Gelbfärbung und Fluoreszenz beobachtet wird, gilt dies nicht als
positives Ergebnis. Um positive Reaktionen eindeutig von negativen unterscheiden zu
können, wird als Referenz die Komparator-Lösung mit dem Ansatz verglichen. Falls bei
einem Ansatz ohne Gelbfärbung eine Fluoreszenz auftreten sollte, ist dieser Ansatz als
negativ zu betrachten, es handelt sich auf keinen Fall um Escherichia coli.
Für Keimzahlen bis zu 200 wird ein Tray mit 51 großen Vertiefungen verwendet, für
Keimzahlen bis 2000 ein Tray mit 97 Vertiefung (Quanti-Tray-2000). Die Quanit-Tray-2000
enthält 49 große Vertiefungen und 48 kleine Vertiefungen. Bei einer hohen Keimbelastung
wird die Probe, vor der Zugabe des Pulvers, verdünnt. Nach der Bebrütungszeit wird die
Keimzahl anhand der Anzahl gelber bzw. fluoreszenter Vertiefungen ermittelt.
18
Kapitel 2: Material und Methoden
Tabelle 2.5: Qualitativer Nachweis von coliformen und fäkalcoliforme Bakterien (E. coli)
Eigenschaften des Ansatzes
Ergebnis
Farblos oder leichte Verfärbung (geringer Escherichia coli:
n.n.3
als Komparator-Lösung)
Coliforme Bakterien:
n.n.
Gelbfärbung gleich oder intensiver als die Escherichia coli:
n.n.
Komparator-Lösung, ohne Fluoreszenz
Coliforme Bakterien:
pos.
Gelbfärbung gleich oder intensiver als die Escherichia coli:
pos.
Komparator-Lösung, mit Fluoreszenz
Coliforme Bakterien:
pos.
Die gelben, positiven Vertiefungen werden für die Coliforme und zusätzlich den
fluoreszierenden Vertiefungen für E. coli entsprechend gezählt. Die aus der Anzahl der
positiven Reaktionen in den Wells4 sich ergebende wahrscheinliche Zahl (MPN) wird in der
„MPN-Tabelle für Quanti-Tray mit 51 Vertiefungen“(siehe Anhang) abgelesen. Die erste
Spalte beinhaltet die positiven Vertiefungen bei einer 100 ml Probe. Man sucht die Zeile der
positiven Vertiefungen und liest den dazugehörigen Wert in der zweiten Spalte ab. Die MPNTabelle weist eine obere und untere Vertrauensgrenze von 95% auf.
Für die Auswertung des Quanti-Tray 2000 benutzt man die „Quanti-Tray 2000 MPN-Tabelle“
(siehe Anhang). In der ersten Spalte waagerecht sucht man den Zahlenwert der positiven
großen Vertiefungen und in der ersten horizontalen Spalte den Wert der positiven kleinen
Taschen. Dort wo sich die Spalten treffen, kann die wahrscheinliche Zahl (MPN) abgelesen
werden. Falls der Ansatz davor verdünnt wurde, muss der Verdünnungsfaktor mit
eingerechnet werden.
Beispiel: Oberflächengewässer für eine beliebige Probe A
Tabelle 2.6: Darstellung der charakteristischen Zahl für Colilert-18
Positiven großen
Positiven kleinen
Charakteristische
Vertiefungen
Vertiefungen
Zahl
49
44
49/44
Statistische
Tabellenwert
1553,1
In diesem Beispiel lautet der statistische Tabellenwert 1553,1/100 ml Wasserprobe. Da in
diesem Beispiel eine Verdünnung von 1:10 vorgenommen wurde, ist das Ergebnis 15531/100
ml Wasserprobe oder 1 ml der Probe entsprechen 155,31 Keime.
Absicherung der Befunde:
Eine weitere Untersuchung der Colilert-18 zur Identifizierung von coliformen und
fäkalcoliformen Bakterien ist die Weiterbearbeitung der Anreicherungsflüssigkeit nach der
Bebrütungszeit der Colilert-18. Die leichte Verfärbung der Vertiefungen, die nicht geringer
sind als der Komparator-Lösung, sollen unter sterilen Bedingungen auf Endo-C-Agar-Platten
ausgestrichen werden.
3
4
Nicht Nachweisbar
Vertiefungen
19
Kapitel 2: Material und Methoden
Die Unterseite der versiegelten Trays wird mit Desinfektionsmittel gereinigt und mit sterilen
Impfnadeln gestochen. Die hellgelbe Anreicherungsflüssigkeit wird mit Hilfe einer sterilen
Impföse auf Endo-C-Agar-Platte ausgestrichen und bei 37°C bebrütet. Die fluoreszierende
Anreicherungsflüssigkeit auch ausgestrichen aber bei 44°C bebrütet.
Es war bei früheren Untersuchungen der Verdacht aufgetaucht, dass das Verfahren Colilert-18
falsch-positive Ergebnisse liefert. Die Ergebnisse der Endo-C-Agar-Platten waren negativ.
Dieses Ergebnis stellt die These auf, dass das Colilert-18-Verfahren falsch-positive
Ergebnisse liefert. Um diese These zu bestätigen, wird eine „Lange Bunte Reihe“
durchgeführt.
2.3.4.3 Prüfungen biochemischer Merkmale von Mikroorganismen durch die Lange
Bunte Reihe
Die „Lange Bunte Reihe“ ist die Prüfung biochemischer Merkmale von Mikroorganismen.
Sie besteht aus 36 Komponenten wie zum Beispiel Malonat-Test, Nitrat-Test, Citrat-Test etc.
und dient zur Identifizierung der einzelnen Kolonien anhand der positiven bzw. negativen
Reaktionen der einzelnen Nährböden. Die Auswertung der „Lange Bunte Reihe“erfolgt
anhand der „Table of Biochemical reaction“(Biochemical reaction of the nemed species,
biogroups, and Enteric Groups of the family Enterobacteriaceae).
Indolbildung
Gewisse Bakterien haben die Fähigkeit, aus dem Tryptophan abgebauter Eiweiße, Indol zu
bilden. Diese Substanz lässt sich im Medium mit einer Testlösung nachweisen. Hierfür
verwendete Reagenz ist das KOVACS´Reagens. Dieses Reagenz ist z. B. von „Merck“
erhältlich. Das tryptophanreiche Nährmedium wird von der Nährbodenküche geliefert.
Technik:
Nach Beimpfung wird das Röhrchen 24-48 h bei 36 °C bebrütet. Dann setzt man einige
Tropfen (ca. 1 ml) KOVACS´Reagenz zu.
Bewertung:
Positiv: Das zugesetzte Reagenz verfärbt sich an der Oberfläche rot.
Negativ: Keine Verfärbung des zugesetzten Reagenzes.
Nachweis der Kohlenhydrate
Die beim Abbau von Kohlenhydrate entstehende Säure wird durch den Umschlag eines dem
Testsubstrat zugesetzten Indikators sichtbar. Der meist hierfür benutzte Farbstoff
Bromthymolblau schlägt dabei von blaugrün nach gelb um; Alkalisierung führt zum
Umschlag nach blau. Die Reaktion kann nach 24 h Bebrütung abgelesen werden, wenn auch
die Säurebildung eingetreten ist.
20
Kapitel 2: Material und Methoden
Reagenzien und Testsubstrat:
Bromthymolblau-Lösung (2%ig Fertiglösung z. B. OXOID)
Grundsubstrat:
Fleischextrakt (OXOID)
5,0 g
Pepton
10,0 g
NaCL
3,0 g
Na2HPO4
2,0 g
Aqua dest.
1000,0 ml
Monosaccharide sowie gewisse Alkohole, sind z. B. Dextrose, Mannit, Inosit, Maltose, Sorbit,
Adonit, Salicin, Arabinose und Dulcit. Sie können dem Grundsubstrat in eine Konzentration
von 0,5 – 2,0 % vor der Sterilisation zugesetzt werden. Die Nährmedien werden von der
Nährbodenküche geliefert.
Technik:
Kohlenhydratmedien mit geringer Mengen Kulturmaterial 20 h bei 37°C bebrüten.
Bewertung:
Positiv (Säurebildung):Farbumschlag nach gelb (Bromthymolblau), unter diffuser Trübung
des Substrates.
Negativ: Kein Indikatorumschlag; Trübung des Nährbodens.
Nachweis der Gasbildung:
Der Abbau der Kohlenhydrate kann mit oder ohne Bildung von Gas vor sich gehen. Die
Gasbildung wird mittels kleiner, in die kohlenhydrathaltigen Röhrchen eingebrachter
Gärröhrchen nach Durham nachgewiesen. Außerdem kann die Gasbildung wie bei KliglerAgar durch das Auftreten von Gasblasen, Rissen in der Agarsäule oder Zersprengen des
Nährbodens erkannt werden (siehe Kligler-Zweizucker-Eisen-Agar).
Oxidase-Reaktion
Oxidasen sind Enzyme, die Oxidationsvorgänge im Bakterienstoffwechsel katalysieren. Sie
finden sich vor allem bei obligaten Aeroben wie Pseudomonas. Zum Nachweis der Oxidasen
bedient sich gewisser Redox-Farbstoffe z.B. N,N-Dimethyl-p-phenylendiaminhydrochlorid.
Durch Einwirkung der Bakterien-Oxidase nehmen diese im reduzierten Zustand farblosen
Reagenzien eine schwarzbraune bzw. blauviolette Farbe an.
Technik:
Heutzutage verwendet man Teststreifen, die mit Oxidase-Reagenz getränkt sind. Die zu
prüfende Kolonie wird mit einer Platinöse auf dem Teststreifen eingerieben.
21
Kapitel 2: Material und Methoden
Bewertung:
Oxidase-positiv: Teststreifen verfärbt sich in blauviolett, z. B. Pseudomonas, Aeromonas,
Neisserien.
Oxidase-negativ: Teststreifen verfärbt sich in gelb bzw. farblos, z. B. E. coli, coliforme
Bakterien.
ß-Galaktosidase-Test (ONPG-Test)
Das Enzym ß-Galaktosidase spaltet Laktose, in Dextrose und Galaktose. Bei verzögertem
Laktoseabbau kann der Nachweis der ß-Galaktosidase die Diagnostik beschleunigen. Das
Ferment muss jedoch zunächst durch Tuluol aus dem Zellinneren der Bakterien freigesetzt
werden, bevor es mit o-Nitrophenyl-ß-Galaktopyranosid (ONPG) nachgewiesen werden kann.
ONPG wird dabei in Galaktose und o-Nitrophenol, das eine kräftige gelbe Farbe besitzt,
gespalten.
Die beiden Lösungen:
Lösung 1(Pufferlösung, pH 7,0):
NaH2PO4 ∗2H2O
6,9 g
Aqua dest.
45,0 ml
pH-Wert mit konz. NaOH auf 7 einstellen und auf 50,0 ml Aqua dest. auffüllen.
Lösung 2(ONPG-Lösung):
o-Nitrophenyl-ß-Galaktopyranosid
0,08 g
Aqua dest.
15,0 ml
Technik:
Die Pufferlösung (Lösung 1) vorher einige Minuten im Brutschrank zur Lösung der
Phosphatkristalle anwärmen. Beide Lösungen werden zu gleichen Teilen gemischt. Das
Röhrchen nach beimpfen 18 h, bei 37°C bebrüten. Die Anreicherungskultur in 0,25 ml NaClLösung aufschwemmen und 1 Tropfen Toluol zusetzen. Dann 10 Min. in den Brutschrank
(37°C) stellen. Anschließend 0,25 ml Reagenzlösung 2 zufügen.
Bewertung:
Ablesung nach 20 Minuten.
Positiv: Gelbfärbung (z. B. Hafnia, meiste Colistämme).
Negativ: Keine Farbänderung.
22
Kapitel 2: Material und Methoden
Methylrot-Reaktion
Bei Spaltung von Dextrose wird unter geeigneten Bedingungen auf etwa 4,5 erniedrigter pHWert (Umschlagspunkt des Methyl-Rot-Indikators) durch bestimmte Mikroorganismen ein
längerer Zeitraum aufrechterhalten. Der Nachweis erfolgt durch Zugabe weniger Tropfen
Methyrotindikatorlösung zum Testssubstrat.
Reagenz: Methylrotlösung (0,1 g Methylrot in 300 ml 96%igem Äthylalkohol lösen, dann 200
ml Aqua. dest. zusetzen).
Testsubstrat ( z. B. OXOID):
Pepton
7,0 g
K2HPO4
5,0 g
Glukose
5,0 g
Aqua dest.
1000,0 ml
Technik:
Nährboden nach Beimpfung 48 h bei 36 °C bebrüten, dann 5 Tropfen Reagenz zusetzen und
kurz schütteln.
Bewertung:
Positiv: Rotfärbung des Mediums nach Zugabe der Indikatorlösung.
Negativ: Gelbfärbung.
Voges-Proskauer-Reaktion
Während einigen Bakterien (z. B. E. coli) aus kohlenhydrathaltigen Medien Säuren bilden
(Methylrot-Reaktion: pos.), kommt es durch Einwirkung anderer Keime (z.B.
Enterobacteriaceae) zur Bildung von Acetylmethylcarbinol, einem Zwischenprodukt des
Kohlenhydratstoffwechsels.
Reagenzien: (Barrit-Methode)
1. 5%ige Lösung von α-Naphthol in absolutem Äthylalkohol
2. 40%ige wässrige Lösung von KOH.
Testsubstrat: Wie bei Methylrotreaktion.
Technik:
1 ml einer mindestens 2 Tage bebrüteten Bouillonkultur werden zunächst 0,6 ml α-NaphholLösung (5%ig in absolutem Alkohol) und 0,2 ml einer 40%igen KOH-Lösung zugefügt. Das
Gemisch wird geschüttelt und über der Flamme leicht erwärmt.
23
Kapitel 2: Material und Methoden
Bewertung:
Positive Reaktion: Rote Farbe (in wenigen Minuten).
Negative Reaktion: Gelblich-bräunliche-Farbe bzw. Niederschlag.
Phenylalanindeaminase-(PAD)-Test
Phenylalanindeaminase, ein bei Bakterien der Proteus-Providencia-Gruppe vorkommendes
Ferment, spaltet Phenylalanin unter Bildung von Phenylbrenztraubensäure. Diese reagiert mit
Eisen III-Salzen, wobei Grünfärbung entsteht.
Reagenz: 10%ige FeCl3-Lösung
Testsubstrat:
Hefeextrakt
3,0 g
DL-Phenylalanin
1,0 g
Na2HPO4
1,0 g
NaCl
5,0 g
Agar Oxoid Nr.3
12,0 g
Aqua. dest
1000,0 ml
Technik:
Schrägfläche des Nähbodens kräftig beimpfen, 24 h bei 36°C bebrütet, dann einige Tropfen
10%ige FeCl3-Lösung auftropfen und über die Schrägfläche laufen lassen.
Bewertung:
Positiv: Grüne Verfärbung der aufgetropften Flüssigkeit und zum Teil auch des Nährbodens.
Negativ: Keine Verfärbung.
Lysin- und Ornithindecarboxylase-, Arginindihydrolase-Test
Durch das Fermentsystem bestimmter Bakterien werden unter anaeroben Bedingungen
(Versuchsröhrchen mit Paraffin abdichten) die Aminosäure L-Lysin und L-Ornithin
decarboxyliert, wobei die entsprechenden Amine und CO2 entstehen. Durch die
Arginindihydrolase von gewissen Bakterien wird Arginin zu CO2 und NH3 abgebaut. Die
Folge ist ein Anstieg des pH-Wertes. Dieser Vorgang wird jedoch erst durch einen
erniedrigten pH-Wert ausgelöst. Das heißt, zunächst muss die im Nährboden vorhandene
Dextrose abgebaut werden; durch die sauren Abbauprodukte erniedrigt sicht der pH-Wert: es
kommt zum Farbumschlag nach gelb. Erst jetzt setzt die Decarboxylierung ein und es erfolgt
(oft erst nach 2-4 Tagen der Farb(rück) Umschlag nach violett. Ein stets mitzuführender
Kontrollröhrchen ohne Aminosäurezusatz bleibt in diesem Fall gelb. Die Röhrchen werden
von der Nährbodenküche fertig geliefert, die mit Paraffin beschichtet sind.
24
Kapitel 2: Material und Methoden
Testsubstrate:
Fleischextrakt
5,0 g
Pepton
5,0 g
Pyridoxal
0,005 g
Dextrose
0,5 g
Bromkresolpurpurlösung
2,5 ml
Aqua dest.
1000,0 ml
Technik:
Die Kulturröhrchen und ein Kontrollröhrchen werden mittels Platinnadel durch die
Paraffinschicht hindurch geimpft. Sie werden 4 Tage bei 37°C bebrütet; (täglich auf
Indikatorumschlag prüfen).
Bewertung:
Positiv: Farbumschlag nach violett.
Negativ: Gelbe Farbe bleibt bestehen. Das Kontrollröhrchen (ohne Aminosäure-Zusatz) soll
die gelbe Farbe behalten.
Schwefelwasserstoff-Bildung/Kligler-(Zweizucker-)Eisen-Agar
Durch den Gehalt an Glukose, Laktose und im Dreizucker-Agar zusätzlich Saccharose sowie
Phenolrot und Eisen-II-Sulfat ermöglicht dieser Test die gleichzeitige Erkennung mehrer
biochemischer Leistungen. H2S-Bildung kann aus Eiweißkörpern bzw. den beim Abbau
entstehenden schwefelhaltigen Aminosäuren erfolgen. Die Intensität der H2S-bildung ist von
der Menge der vorhandenen Schwefelverbindungen und von der untersuchten Bakterienart
abhängig.
Testsubstrate:
Hefeextrakt-Cystein-Basalmedium
1000,0 ml
FeSO4 ∗ 7H2O
0,2 g
Na2SO3
0,3 g
Na2S2O3 5H2O (Na-Thiosulfat)
0,1 g
Substrat in Röhrchen (12/13x100) bis zu 5 ml abfüllen und mit Schrägschicht erstarren lassen,
so dass ein etwa gleich langer Hoch- und Schrägschichtteil entsteht. Sie werden fertig von der
Nährbodenküche geliefert.
Technik:
Material mit Nadel auf Schrägschicht deponieren, dann in den Hochschichtteil einstechen und
anschließend das deponierte Material auf der Schrägfläche verteilen, 18 h bei 36 ° bebrüten.
25
Kapitel 2: Material und Methoden
Bewertung:
Schrägfläche rot, Hochschicht gelb; Abbau von Glukose.
Schrägfläche gelb, Hochschicht gelb: Abbau von Glukose und Laktose(und/oder
Saccharose beim Dreizuckeragar).
Schrägfläche rot, Hochschicht rot: keine fermentativer Glukose-, Laktose- und
Saccharoseabbau.
Schwarzfärbung der Hochschicht: Bildung von H2S.
Blasen- und Rissbildung: Gasbildung beim Glukoseabbau.
Beweglichkeitsprüfung
Es handelt sich um halbfeste Medien, denen nur eine geringe Menge Agar-Agar zur
Gliederung beigesetzt wurde. Begeißelte Mikroorganismen können sich sichtbar in den Agar
hineinbewegen (Trübung des Agars von Stichkanal ausgehen = Stichagar). Eine von vielen
Nährmedien ist der SIM-Nährboden.
SIM-Nährboden
Testsubstrat: Im Handel erhältlich (z. B. von Merck)
Technik:
Den in Hochschicht erstarrten Nährboden mit Platinnadel beimpfen und 18-24 h bei 37°C
bebrüten.
Bewertung:
Positiv: Diffuse Trübung des Mediums.
Negativ: Wachstum nur entlang dem Stichkanal.
Nitratreduktionstest
Bei Vorhandensein des Enzyms Nitratreduktase und Anwesenheit eines geeigneten
Wasserstoffdonators wird Nitrat zu Nitrit und ggf. weiter zu Ammoniak oder molekularen
Stickstoff reduziert.
Testsubstrat:
KNO3 (nitritfrei)
0,2 g
Pepton
5,0 g
Aqua dest.
1000,0 ml
26
Kapitel 2: Material und Methoden
Technik:
Nach Beimpfung bis 4 Tage bei Optimaltemepatur bebrüten, dann 0,1 ml einer Mischung aus
beiden Teilen folgender Lösung zusetzen (Griess-Iiosvay-Reagenz zu Nachweis von Nitrit):
Lösung A:
Sulfanilsäure
1,0 g
5 M Essigsäure
125,0 ml
Lösung B:
α-Naphthylamin
1,0 g
5 M Essigsäure
200,0 ml
Bewertung:
Positiv: Rotfärbung (Nitritnachweis).
Negativ: Keine Rotfärbung nach Zugabe von Lösung A und B.
Gelatinasetest
Das Enzym Gelatinase bewirkt einen hydrolytischen Abbau der Gelatine. Durch Gelatine zur
Erstarrung gebrachtes Substrat wird dabei verflüssigt.
Testsubstrat:
Fleischextrakt
7,5 g
Pepton
25,0 g
NaCl
5,0 g
Aqua dest.
1000,0 ml
Gelatine
80,0 g
Nähragar
1000,0 ml
Technik:
Die verdächtige Einzelkolonie strichförmig auf der Platte ausimpfen unter Mitführung eines
positiven und eines negativen Kontrollstammes, 48 h bei 36°C bebrüten. Anschließend die
strichförmig gewachsenen Kulturen mit einem HgCl2-Lösung getränkten Tupfer abwischen
und die Platte mit HgCl2-Lösung übergießen (HgCl2-Lösung: 15 g HgCl2 in 20 ml konz. HCL
mit 100 ml Aqua dest. lösen).
Bewertung:
Positiv: Substrat im Bereich des Impfstriches klar durchscheinende (unveränderte Gelatine
wird durch die Lösung getrübt).
Negativ: Nährboden im Strichbereich unverändert.
27
Kapitel 2: Material und Methoden
Tartrat-, Mukat- und Zitrat - Test
Ähnlich der Zuckerspaltung können gewisse Bakterien auch die organischen Säuren Tartrat,
Mukat und Zitrat abbauen, wobei saure Abbauprodukte entstehen, die mit einem Indikator
wie Bromthymolblau nachgewiesen werden können. Die Verdeutlichung der Tartratreaktion
kann noch mit gesättigter Bleiacetatlösung erfolgen.
Reagenz: Bleiacetat, 50%ige wässrige Lösung, kräftig schütteln. Vor Gebrauch 30 Min.
absetzen lassen.
Testsubstrat:
Bacto-Pepton (z. B. Difco)
10,0 g
M/10 NaOH-Lösung
8,5 ml
Aqua. dest
1000,0 ml
Bromthymolblaulösung, 0,2%
12,0 ml
Organische Säuren:
d-Tartrat, Zitrat und Mukat werden in 1%iger Konzentration dem Substrat zugefügt.
Technik:
Je 2 Röhrchen werden die Röhrchen beimpft und 48 h bei 36 °C bebrütet.
Bewertung:
Positiv: Farbumschlag über grüngelb nach weiß, dann zum Teil wieder zurück nach blau.
Die Ablesung erfolgt beim Tartrat nach Zugabe von 0,5 ml gesättigter Bleiazetatlösung und
beim Mukatsubstrat wird nur die Farbreaktion beurteilt.
Positiv: Farbumschlag über grüngelb nach weiß, dann zum Teil wieder zurück nach blau.
Negativ: Keine Färbung.
Präzipitatbildung nach Bleiazetatzusatz (bei Tartrat und Zitrat zu prüfen):
Positiv: Der bei Zugabe des Reagenz entsehende Niederschlag sinkt innerhalb 30 Min. auf
eine sehr geringe Menge ab.
Negativ: Der entstehende, kräftige Niederschlag bleibt im Röhrchen weitgehend bestehen und
nimmt nach 24 h noch mehr als die Hälfte der Flüssigkeit ein.
Malonat-Test
Na-Malonat wird von verschiedenen Bakterienarten unter Bildung alkalischer
Stoffwechselprodukte verwertet. Die Alkalisierung führt zum Umschlag dem dem
Testsubstrat zugesetzten Bromthymolblau nach blau.
Testsubstrat:
Hefeextrakt
1,0 g
28
Kapitel 2: Material und Methoden
(NH4)2 SO4
2,0 g
K2HPO4
0,6 g
KH2PO4
0,4 g
NaCl
2,0 g
Na-Malonat
3,0 g
Glukose
0,25 g
Bromthymolblau-Lösung
12,5 ml
Aqua dest.
1000,0 ml
Technik:
Substrat mit Material von einer Einzelkolonie beimpfen, 24-48 h bebrüten bei 36 °C.
Bewertung:
Positiv: Farbumschlag von grün nach blau.
Negativ: Keine Farbänderung.
Harnstoff-(Urease-)Reaktion nach Christensen
Durch das in verschiedenen Bakterienarten vorkommende Ferment Urease wird sie
hydrolysiert unter Bildung von Ammoniak und CO2. Wobei sich der pH-Wert zur alkalischen
Seite verschiebt. Die pH-Änderung wird durch den Indikator Phenolrot angezeigt. Außer der
sehr intensiven Alkalibildung aus Harnstoff tritt noch eine weitere Alkalisierung infolge
Eiweiß- bzw. Peptonabbaus auf. Um dies zu neutralisieren, setzt man Glucose hinzu, aus
deren Spaltung Säure hervorgeht. Wird im Medium nur Eiweiß gespalten, so überwiegt bei
glukosepositiven Keimen die Säurefermentation. Es wird zusätzlich Harnstoff abgebaut und
die Reaktion ist alkalisch.
Testsubstrat: (z. B. Oxoid)
Pepton
1,0 g
NaCl
5,0 g
Glukose
1,0 g
KH2PO4
2,0 g
Phenolrot
(0,2%Lösung in 50%Äthylalkohol)
6,0 ml
Agar (Oxoid)
15,0 g
Aqua dest.
1000,0 ml
29
Kapitel 2: Material und Methoden
Technik:
Schrägfläche mit steriler Impföse beimpfen, 1-4 Tage bei 36 °C bebrüten.
Bewertung:
Positiv: deutliche rotviolette Färbung des ganzen Mediums.
Negativ: keine Farbänderung.
Kaliumcyanid (KCN)-Test
Bei einem KCN-Gehalt des Nährbodens von 0,0075% können die meisten Bakterien nicht
mehr wachsen, wohl aber Keime der Klebsiellagruppe und Citrobactergruppe.
Testsubstrat:
Pepton
10,0 g
NaCl
5,0 g
KH2PO4
225,0 mg
Na2HPO4 ∗ H2O
5,64 g
Aqua dest.
1000,0 ml
Technik:
Röhrchen mit einer Impföse beimpfen, 2 Tage bei 36 °C bebrüten unter Mitführung eines in
gleicher Weise beimpften Röhrchens mit Basissubstrat (ohne KCN Zusatz).
Bewertung:
Positiv: Wachstum (Trübung) im KCN-haltigen und im KCN-freien Substrat.
Negativ: Kein Wachstum im KCN-hatigen aber Wachstum im KCN-freien Substrat.
2.3.5 Membranfiltrationsverfahren (Verfahren nach ISO 9308)
2.3.5.1 Allgemeines
Die Membranfiltrationsverfahren dienen zur Nachweis und Zählung von Escherichia coli und
coliformen Bakterien. Sie wird mit Hilfe einer Vakuumfiltrationsanlage durchgeführt. Dieses
Verfahren beinhaltet mehrer Arbeitsschritte, um den Nachweis von coliforme und
fäkalcoliforme Bakterien zu bestätigen. Hier werden 100 ml Probe über ein Membranfilter mit
0,45 µm Porengröße filtriert. Das Filter wird auf Laktose-TTC-Agar mit Tergitol-7 gelegt und
bei 36°C bebrütet.
Laktoseverwertende Bakterien, zu denen die coliformen Bakterien zählen, wachsen auf
diesem Medium als gelbe bis gelb-orange Kolonien, erzeugen eine entsprechende Verfärbung
des Mediums uns sind coliformverdächtig. Weisen diese im Oxidase-Test eine negative
Reaktion auf, gelten sie als coliforme Bakterien. Sind die verdächtigen Kolonien in der Lage
30
Kapitel 2: Material und Methoden
zusätzlich auf Tryptophan bei 44 °C Indol zu bilden, gilt der Nachweis für E. coli als
erbracht.
Das Colilert-Verfahren ist eine alternative zur Membranfiltrationsverfahren. Das
Membranfiltrationsverfahren ist besonders für Trinkwasser und technische Bäder geeignet,
die eine niedrige Keimzahlbelastung aufweisen. Für die Oberflächengewässer muss die Probe
unbedingt verdünnt werden. Hierfür gibt es keine konkreten Anweisungen aus der
Standardarbeitsanweisung des Fachamts für Umweltuntersuchungen Hamburg. Es wird durch
Durchführung mehrer Proben, der richtige Verdünnungsfaktor bestimmt.
Beispiel: Oberflächengewässer für eine beliebige Probe A
Zuerst erfolgt die Bebrütung bei der Laktose-TTC-Agar mit Tergitol 7. Dann werden die
gewachsenen Kolonien auf Oxidase und Indolbildung geprüft.
Das Ergebnis der coliformen und fäkalcoliformen Bakterien setzt sich auf mehreren Schritten
zusammen.
Als Beispiel wird eine beliebige Probe A bei folgender Koloniezahl ermittelt: Es wird der
Gesamtzahl der gewachsenen Kolonien, die Zahl der verdächtigen Kolonien, die Zahl der
gelb-orange Kolonien dokumentiert. Wichtig sind die Ergebnisse der Oxidase-Test und IndolTest. Als coliformen Bakterien werden Laktose-positiven Kolonien mit negativer OxidaseReaktion gezählt. Die E. coli gelten als Laktose-positiven Kolonien mit negativer OxidaseReaktion und positivem Indol-Test.
Diese Parameter bilden ein gesamtes Ergebnis der coliformen und fäkalcoliformen Bakterien.
Bei einer Anzahl verdächtiger Kolonien auf dem Membranfilter müssen mindestens ca. 10
Kolonien auf Oxidase und Indolbildung geprüft werden. Das Ergebnis der 10 verdächtigen
Kolonien) Untersuchungen wird auf die Gesamtheit der Anfangs gezählten, verdächtigen
Kolonien hochgerechnet.
Tabelle 2.7: Beispiel für Rechnung der verdächtigen Kolonien
Anzahl der verkeine Coliforme
Coliforme
dächtiger Kolonien auf
Bakterien
Bakterien
dem Membranfilter:
140 Kolonien
2 Kolonien
6 Kolonien
E. coli
2 Kolonien
Gesamtkolonienzahl / 10 verdächtige Kolonien = Umrechnungswert
d. h. 140/10 = 14 Kolonien
Insgesamt Kolonienzahl:
Nicht identisierbar
6∗14=84
2∗14=28
Somit enthält die Probe A, 84 Kolonien für coliforme Bakterien und 28 Kolonien für E. coli.
Diese Probe wurde am Anfang der Membranfiltration mit einer Verdünnung (1:1000)
verdünnt, d. h. die Probe A enthält 840 Coliformen Keime pro 100 ml Wasserprobe.
31
Kapitel 2: Material und Methoden
2.3.5.2 Durchführung der Untersuchungen
Die Zusammensetzung der Nährböden und Nährlösungen:
Laktose-TTC-Agar mit Tergitol-7
(OXOID CM 793, hergestellt in der Nährbodenküche) in g/l:
Laktose
20,0
Pepton
10,0
Hefeextrakt
6,0
Fleischextrakt
5,0
Bromthymolblau
0,05
Agar
15,0
Zusätzlich wird ein Gemisch aus 2,3,5-Triphenyl-Tetrazoliumchlorid 0,05 g/100ml und
Natriumheptadecylsulfat 0,2g/100ml, je 5 ml, als Grundmedium zugegeben.
Tryptose-Soja-Agar(TSA)
(nichtselektiver Nähragar für Oxidase-Test, DIFCO 236950, hergestellt in der
Nährbodenküche) in g/l:
Casein
15,0
Sojapepton
5,0
Natriumchlorid
5,0
Agar
15,0
Tryptophan-Bouillon
(Trypton-Wasser, DIFCO 264410, hergestellt in der Nährbodenküche) in g/l:
Pepton aus Casein
10,0
Natriumchlorid
5,0
Die Durchführung der Membranfiltration erfordert folgende Materialien:
Laktose-TTC-Agar mit Tergitol®7
Tryptose-Soja-Agar (TSA)
Röhrchen mit Tryptophanbouillon
Kovac´s Reagenz für Indol-Test MERCK Art. Nr.: 109293
Oxidase-Teststäbchen MERCK Art. Nr.: 1.13300
Membranfiltrationsgerät mit sterilen Einwegtrichtern (MBSI System mit Trichterspender;
Schleicher & Schüll, 37568 Dassel)
Membranpumpe ME 4R (Vacuubrand GmbH, 97866 Wertheim)
32
Kapitel 2: Material und Methoden
Membranfilter (ME2521 STL, Porengröße 0,45 Ø 50 mm)
Demineralisiertes Wasser
Brutschrank Memmert, thermostatisiert, (36 ±2)°C und (44 ±0,5)°C
Einmal-Impfösen, steril, 10 µl, Art. Nr.: 631Q2211
Pinzetten
Bunsenbrenner
Die Wasserproben werden durch ein steriles Membranfilter filtriert. Das Membranfilter wird
mit einer sterilen Pinzette blasenfrei auf den Laktose-TTC-Tergitol-7-Agar in einer
Petrischale gelegt und bis zu (21±3) °C aerob bebrütet. Die Keimbelastung der Wasserproben,
die bearbeitet wurden, war sehr hoch. Die Abbildung 2.1 zeigt eine Probe mit hohe
Keimbelastung, indem eine Keimzählung nicht möglich ist. Deshalb mussten sehr hohe
Verdünnungsstufen angesetzt werden.
Abbildung 2.1: Bebrütete Laktose-TTC-Tergitol-7-Agar
Die meist angesetzte Verdünnungsstufen waren:
Tabelle 2.8: Die Verdünnungsstufen für verschiedene Gewässern
Gewässer
Oberflächengewässer
Elbe
Abwasser
Verdünnungsstufen
1:500
1:1000 bzw. 1:500
1:10 000
Nach Abschluss der Bebrütungszeit werden die verdächtigen Kolonien gezählt. Als
verdächtige Kolonien gelten, ungeachtet ihrer Größe, gelbe bzw. gelb-orange Kolonien, die
unter dem Membranfilter im Agar einen gelben Hof aufweisen. Diese Kolonien zählen als
Laktose-positive Bakterien. Die Ergebnisse der auf dem Laktose-TTC-Agar gewachsenen
verdächtigen Kolonien und die Zahl der auf TSA-Agar ausgestrichenen Kolonien werden
dokumentiert. Die Koloniezahl wird auf 100 ml des untersuchten Wassers bezogen. Bei
Verdünnungen wurde der Verdünnungsfaktor berücksichtigt.
Differenzierung/Absicherung
Für Oxidase-Test und der Indol-Test wird die repräsentative Anzahl von Kolonien auf
nichtselektiven TSA Agar, fraktioniert ausgestrichen und in Tryptophan-Bouillon angelegt.
Der Oxidase-Test und die Indolprüfung werden wie in Kapitel 2.2.4.3 „Lange Bunte Reihe“
durchgeführt.
33
Kapitel 2: Material und Methoden
2.3.6 Zusammenfassung der unterschiedlichen Nährböden
In diesem Abschnitt sind alle Nährböden, die verwendet wurden, zusammengefasst.
Tabelle 2.9: Zusammenfassung der unterschiedlichen Nährböden
Gesamtcoliforme Bakterien
Anwendung
Zubereitung
Bebrütung
Einmischverfahren
Oberflächenausstrich
Oberflächenausstrich
Geliefert in
Kulturröhrchen: Hygieneinstitut
Gelieferte Platten;
Hygieneinstitut
Gelieferte Platten;
Hygieneinstitut
24 h bei
37°C
24 h bei
37°C
24 h bei
37°C
Merck
MPN-Verfahren
Gelieferte
Kulturröhrchen;Hygieneinstitut
44 h bei
37°C
Idexx
MPN-Verfahren
18 h bei
37°C
Laktose-TTCAgar mit
Tergitol®7
Oxoid Cm 793
MembranFiltration
Gelieferte Pulver (Nährboden)
mit Probe vermischen und in
eine Quanti-Tray luftblasenfrei
geben. Zum Schluss mit eine
Quanti-Tray Sealer verließen
Gelieferte Platten;
Hygieneinstitut
Colilert 18Testkitt
Idexx
MPN-Verfahren
Gelieferte Pulver mit Probe
vermischen und in eine QuantiTray luftblasenfrei geben. Zum
Schluss mit eine Quanti-Tray
Sealer verließen.
18 h bei
37°C
Laktose-TTCAgar mit
Tergitol®7
Tryptose-SojaAgar
TryptophanBouillon
Oxoid Cm 793
MembranFiltration
Gelieferte Platten;
Hygieneinstitut
21 h bei
37°C
Gelbfärbung und
Fluoreszenz;der
Ver-tiefunge;
Kennzahl zur
Auswertung
Gelbe bzw. gelborange Kolonien
Gelieferte Platten;
Hygieneinstitut
Gelieferte
Kulturröhrchen; Hygieneinstitut
21 h bei
37°C
21 h bei
44°C
Auf Oxidase
überprüfen
Auf Indolbildung
untersuchen
Nährboden
Desoxycholat-Agar
Endo-CAgar
ChromocultColiformenAgar
MPN-Methode
LaurylsulfatBouillon
Colilert 18Testkit
Hersteller
Oxoid
Merck
Merck
Auswertung
Rote Kolonien
mit Präzipitalhof
Rote Kolonien
Rosa-rote
Kolonien
Gasbildung;Kenn
zahl zur
Auswertung
Gelbfärbung der
Ver-tiefungen;
Kennzahl zur
Auswertung
21 h bei
37°C
Gelbe bzw. gelborange
Kolonien→
weitere
Bearbeitung mit
TSA-Agar
Difco
Gelieferte Platten;
21 h bei
Tryptose-SojaAuf Oxidase
Hygieneinstitut
37°C
Agar (TSA)
überprüfen
Difco
Gelieferte
21 h bei
TryptophanAuf Indolbildung
Kulturröhrchen; Hygieneinstitut 44°C
Bouillon
untersuchen
Auswertung der Membranfiltration: Coliforme Bakterien: Oxidase-negativ und Indol-negativ
Escherichia coli
Nährboden
Hersteller
Anwendung
Zubereitung
Bebrütung Auswertung
Oxoid
EinmischGeliefert in
24 h bei
DesoxyRote Kolonien
verfahren
Kulturröhrchen; Hygieneinstitut 44°C
cholat-Agar
mit Präzipitalhof
Merck
OberflächenGelieferte Platten;
24 h bei
Endo-CRote Kolonien
ausstrich
Hygieneinstitut
44°C
Agar
Merck
OberflächenGelieferte Platten;
24 h bei
ChromocultDunkelblauausstrich
Hygieneinstitut
44°C
Coliformenviolette Kolonien
Agar
Merck
MPN-Verfahren Gelieferte
44 h bei
MPN-Methode
Gasbildung und
Kulturröhrchen;
Hygieneinstitut
37°C
LaurylsulfatFluoreszenz;
Bouillon
Kennzahl zur
Auswertung
Difco
Difco
Auswertung der Membranfiltration: E. coli: Oxidase-negativ und Indol-positiv
34
Kapitel 2: Material und Methoden
2.4 Mikrobiologische Referenzmaterialien
2.4.1 Durchführung der Kultivierung von Kontrollstämme
Vom Kontrollstamm aus der Kulturensammlung (DSMZ-Referenzstamm5) wird eine
Mehrfachkonserve (Stammkultur, Subkultur des Kontrollstammes) für das Labor hergestellt.
Von dieser Stammkultur des Kontrollstammes werden nach Bedarf eine oder mehrere
Gebrauchskulturen (weitere Subkulturen) für den einmaligen Einsatz bei der Qualitätsprüfung
angelegt. Die Gebrauchkulturen waren frisch aus den gefriergetrockneten Kontrollstämme
angesetzt und konnten somit für die Prüfung der Verfahren verwendet werden.
2.4.2 Einsatz der Gebrauchskulturen
Von der Gebrauchskultur wird Material des Kontrollstammes auf bzw. in das bei dem
jeweiligen Untersuchungsverfahren angewendete erste Anreicherungs- bzw.
Nachweismedium eingebracht. Danach werden der jeweiligen SOP entsprechend sukzessive
alle weiteren Selektions-, Differenzierungs- und Nachweisprozeduren bis zum Endergebnis
vorgenommen. Dies gilt in gleicher Weise für die Kontrollstämme der nachzuweisenden
Bakterien (Positiv-Kontrolle) wie auch für die Kontrollstämme der Negativ-Kontrolle.
Die Plattenmethode beinhaltet folgende Nährböden:
Desoxycholat-Agar
Chromocult-Coliformen-Agar
Endo-C-Agar
Fluorocult-ECD-Agar
Für den Nachweis der thermophilen fäkalcoliforme Bakterien bei allen Nährböden wurde
Escherichia coli (DSMZ 30083) als Positivkontrolle verwendet. Die durchgeführten
Untersuchungsverfahren wie zum Beispiel Membranfiltrationsverfahren, Colilert-18Verfahren werden in Tabelle 2.10 mit den entsprechenden Referenzstämmen dokumentiert.
Tabelle 2.10: Einsatz von verschiedenen Gebrauchskulturen
Coliforme Bakterien
Untersuchungsverfahren:
MPN-Verfahren
Fäkalcoliforme Bakterien
Positivkontrolle
Negativkontrolle
Positivkontrolle
Negativkontrolle
Miniaturverfahren
E. coli
Pseudomonas
aeruginosa
Aeromonas
hydrophila
Aeromonas
hydrophila
Aeromonas
hydrophila
E. coli
Colilert-18-Verfahren
Citrobacter
freundii
E. coli
Citrobacter
freundii
Aeromonas
hydrophila
Aeromonas
hydrophila
Citrobacter
freundii
Membranfiltrationsverfahren E. coli
5
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
35
E. coli
E. coli
E. coli
Kapitel 2: Material und Methoden
Die qualitative Bestimmung der Referenzstämme mit Positiv-, wie auch Negativkontrollen,
wurde bei diesen Untersuchungsverfahren erfolgreich durchgeführt.
2.5 Statistische Prüfverfahren
2.5.1 Statistik für die Qualitätssicherung in der Wassermikrobiologie
Die Validierung mikrobiologischer Methoden und die Interpretation ihrer Ergebnisse sind
insofern kompliziert, als sie einen gewissen Grund an Variabilität aufweisen. Diese
Variabilität kann gleichermaßen systematischen Effekten aber auch der Zufallsvariation bei
der Probenentnahme und der Durchführung von analytischen Verfahren zugeschrieben
werden. Um diese zu berücksichtigen, ist es notwendig, vielseitige Informationen zu
sammeln. Das erreicht man durch wiederholtes Zählen, paralleles Ausplattieren und
mehrfache Verfahren.
In solchen Fällen können die einzelnen Ergebnisse zu einer Auswertung zusammengefasst
werden, die die Hauptmerkmale der Analyse bereibt und den Einfluss der Zufallsvariabilität
verringert. Dazu wurden wichtige statistische Methoden mit folgender Zielsetzung entwickelt:
Zusammenfassung der Hauptmerkmale von Mehrfachproben und Schätzung des
Einflusses der Zufallsvariation
Verallgemeinerung der Probenergebnisse für die Gesamtheit oder die Umwelt, auf der sie
entnommen wurden
Vergleich der Resultate von verschiedenen Methoden unter Berücksichtigung der
Zufallsvariation, sodass sich systematische und zufallsbedingte Abweichungen
unterscheiden lassen
2.5.2 Grundberechnungen
Zwei Hauptmerkmale bei einer Serie von Beobachtungen zum Beispiel bei einer Reihe von
Parallelplattenzählungen sind ihre Lage und ihre Streuung.
Im Fall von quantitativen Bestimmungen wird in der Statistik das arithmetische Mittel zur
Beschreibung der Lage verwendet und die Varianz, die Standardabweichung oder der
Variationskoeffizient als Maße der Dispersion.
2.5.2.1 Arithmetisches Mittel
Das arithmetische Mittel oder der Durchschnitt x wird definiert als die Summe aller
Einzelmessungen xi, geteilt durch die Anzahl der Werte n.
1 n
x = ∑ xi
n i =1
36
Kapitel 2: Material und Methoden
Diese statistische Kenngröße bezüglich der Lage vermittelt jedoch nur dann den richtigen
Eindruck der Datenreihe, wenn die Einzelwerte symmetrisch um den Mittelwert verteilt sind,
weil jede Messung denselben Beitrag zum Durchschnitt leistet. Bei schiefen asymmetrischen
Verteilungen würde der Einfluss der höchsten bzw. niedrigsten Werte Durchschnitte ergeben,
die außerhalb der Mehrheit der Beobachtungen liegen.
2.5.2.2 Varianz, Standardabweichung und Variationskoeffizient
Das entsprechende Maß der Dispersion ist die Varianz s2, die aus den Differenzen der
Einzelmessungen xi und deren Durchschnitt x errechnet wird. Diese Differenzen werden
quadriert, um die Richtung der Abweichung auszuschalten, zusammengezählt und dann deren
Summe durch die Anzahl der Messungen minus eins dividiert.
1 n
s =
( xi − x ) 2
∑
n − 1 i =1
2
Ein Nachteil beim Beschreiben der Variation innerhalb einer Datenreihe als Varianz besteht
jedoch darin, dass dieser Wert wegen der quadrierten Abweichungen, die in der Berechnung
verwendet werden, nicht so einfach zu interpretieren ist. Daher wird die Standardabweichung
s angeführt.
2
1 n
s= s =
(
x
−
x
)
∑ i
n −1 i=1
2
Ein Vergleich der Variation in zwei oder mehr Messreihen mit unterschiedlichen Mittelwerten
muss auf einer dritten statischen Größe für die Abweichung basieren, die man durch Division
der Standardabweichung durch den Mittelwert erhält.
Diese nennt man den relativen Standardabweichung v = s / x. Sie stellt die Variation der
Messungen im Verhältnis zu deren Mittelwert dar.
Die Standardabweichung, Varianz und der Variationskoeffizient werden in den
Parallelansätzen der Plattenmethode für die coliformen und fäkalcoliformen Bakterien
durchgeführt.
37
Kapitel 3: Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1 Vergleich verschiedener Untersuchungsverfahren
Die experimentelle Bestimmung der E. coli und coliformen Bakterien erfolgte mit Proben von
Oberflächengewässern und Abwasser. Insgesamt wurden an vier Proben unterschiedlicher
Herkunft intensiv untersucht. Es ging darum, aufzuzeigen inwieweit das Ergebnis von den
gewählten Methoden abhängt.
Die Verfahren wurden nach Anleitung von der SOP Standardarbeitsanweisung durchgeführt.
Bei den einzelnen Verfahren sollte vier Proben, die drei, vier und fünf Parallelansätze pro
Versuchsreihe enthalten durchgeführt werden, und der sich daraus ergebende Mittelwert für
die Auswertung herangezogen werden. Die Proben wurden mit folgenden Parallelansätzen
durchgeführt:
Oberflächengewässer; Regensiel:
3 Parallelansätze
Oberflächengewässer; Alster-Haselknick:
4 Parallelansätze
Oberflächengewässer; Alster-Wulksfelde:
5 Parallelansätze
Kläranlage; Dradenau:
4 Parallelansätze
Die Ergebnisse der Keimzahlbestimmung für E. coli und coliforme Bakterien werden im
Folgenden mit der Einheit KBE/ml als Mittelwerte angegeben. Die Wahl der Probenvolumen
bzw. Verdünnungsreihen wurde mit Vorversuchen bestimmt.
3.1.1 Durchführung der Plattenmethode
Bei der Plattenmethoden wurden mit folgenden Nährböden gearbeitet:
Desoxycholat-Agar
Chromocult®-Coliformen-Agar
Fluorcult®-ECD-Agar
Endo-C-Agar
Bei den Untersuchungen mit Desoxycholat-Agar und Chromocult-Coliformen-Agar wurden
zum Teil sehr hohe Werte erzielt. Deshalb wurde bei den Proben Regensiel, Haselknick und
Dradenau eine weitere Untersuchung zur Differenzierung der Bakterien vorgenommen (z. B.
Bunten Reihe für Desoxycholat-Agar und ein Oxidase-Test für Chromocult-Coliformen-Agar
und Endo-C-Agar durchgeführt).
Das Membranfiltrationsverfahren gehört zwar auch zu den Plattenmethoden wird aber separat
mit der Bestimmung von E. coli und coliformen Bakterien bearbeitet (siehe Kapitel 3.3).
38
Kapitel 3: Ergebnisse
3.1.2 Durchführung der MPN-Verfahren
Bei dem MPN-Ansatz wurde nur eine 3er MPN, in drei Parallelansätzen mit drei
Verdünnungsreihen 0,1 ml, 0,01 ml und 0,001 ml, wie auch bei der Untersuchungen von
Badegewässern üblich ist, durchgeführt. Alle vier Proben wurden mit diesem
Verdünnungsreihen bearbeitet.
Andere Verfahren, die auf dem MPN-Verfahren beruhen, sind Colilert-18 und
Miniaturverfahren. Das Colilert-18-Verfahren wurde bei allen Proben durchgeführt. Aber das
Miniaturverfahren wurde nur bei der ersten Probe (Regensiel) angewendet. Hier konnte kein
Ergebnis erzielt werden, da die Keimzahlbelastung der E. coli bei dieser Probe nicht hoch
genug war. Das Miniaturverfahren konnte bei den Paralleluntersuchungen nicht durchgeführt
werden, weil die Keimzahlbelastung der E. coli sehr gering waren.
3.1.3 Ergebnisse der Untersuchungen auf coliformen Bakterien mit den
Plattenmethoden
Bei der Plattenmethode wurden das Einmischverfahren bei der Desoxycholat-Agar und der
Oberflächenausstrich bei Chromocult-Coliformen-Agar und Endo-C-Agar verwendet.
Tabelle 3.1: Coliformenzahlen der Regensielprobe
Plattenmethode
Desoxycholat-Agar
Chromocult-Agar
Endo-C-Agar
Probe
Regensiel
Regensiel
Regensiel
Keimzahl in KBE/ml
1.Platte
2.Platte
111
103
500
400
135
130
Tabelle 3.2: Coliformenzahlen der Haselknickprobe
Probe
Plattenmethode
Keimzahl in KBE/ml
1.Platte 2.Platte 3.Platte
Desoxycholat-Agar
Haselknick
65
102
111
Chromocult-Agar
Haselknick
205
300
295
Endo-C-Agar
Haselknick
40
45
25
3.Platte
74
490
110
4.Platte
54
255
45
Mittelwert
96
463
125
Mittelwert
83
264
39
Tabelle 3.3: Coliformenzahlen der Wulksfeldeprobe
Probe
Plattenmethode
Keimzahl in KBE/ml
1.Platte 2.Platte 3.Platte 4.Platte 5.Platte Mittelwert
Desoxycholat-Agar Wulksfelde
504
470
460
426
336
439
Chromocult-Agar
Wulksfelde
420
305
340
290
320
355
Endo-C-Agar
Wulksfelde
25
20
20
40
50
31
Tabelle 3.4: Coliformenzahlen der Dradenauprobe
Probe
Plattenmethode
Keimzahl in KBE/ml
1.Platte 2.Platte 3.Platte
Desoxycholat-Agar
Dradenau
55
45
50
Chromocult-Agar
Dradenau
30
20
75
Endo-C-Agar
Dradenau
20
25
55
39
4.Platte
35
105
20
Mittelwert
46
58
30
Kapitel 3: Ergebnisse
Im Labor wurde die Information erteilt, dass die Desoxycholat-Agar-Methode erhöhte
Keimzahlbelastungen zeigt. Bei den experimentellen Untersuchungen wurden alle
Parallelverfahren auch den Chromocult-Coliformen-Agar eingesetzt. Dabei zeigte das
Desoxycholat-Agar die zweithöchste Keimbelastung.
Die Proben Regensiel, Haselknick und Dradenau (Tab. 3.1, 3.2 und 3.4) beim ChromocultColiformen-Agar waren am meisten belastet. Die Ergebnisse deuten auf ein schnelles
Anwachsen von Coliformen hin, auch wenn sie möglicherweise subletal geschädigt waren.
Der Nährboden wurden bei den Vorversuchen auf die Empfindlichkeit der Temperatur
geprüft, d.h. mit eine beliebige Probe A wurde Platten ausgestrichen, die davor im
Brutschrank bei 37°C erwärmt wurden, aber auch Platten, die direkt aus dem Kühlschrank
entnommen wurden. Daraus ergab sich, dass die Keimzahl der beiden Platten identisch war.
Da keine weitere Fehlerquelle entdeckt wurde, ist anzunehmen, dass das Anwachsen der
subletal geschädigten Coliformen eine hohe Keimzahlbelastung hervorruft.
In der Probe Wulksfelde (Tab. 3.3) zeigte Chromocult-Coliformen-Agar einen niedrigeren
Mittelwert, als der Desoxycholat-Agar. Es könnte sein, dass Fehler während der Vorbereitung
des Nährbodens gemacht wurden. Der niedrige Mittelwert der Proben Regensiel, Haselknick
und Dradenau ließen vermuten, dass der größte Teil der Bakterien durch eine zu hohe
Temperatur des flüssigen Agars abgetötet wurden. Diese These kann nicht bestätigt werden,
weil der Nährboden nach dem Aufkochen über mehrere Stunden im Wasserbad temperiert
wurde. Darauf wurde sehr geachtet, da im Labor diese Vorinformation über diesen Verfahren
bekannt war. In der Abbildung 3.1 sind die Ergebnisse der coliformen Bakterien übersichtlich
dargestellt.
3.1.3.1 Differenzierungen der coliformen Bakterien von Chromocult-Coliformen-Agar,
Endo-C-Agar und Desoxycholat-Agar
Die experimentelle Untersuchung mit dem Nährboden Chromocult-Coliformen-Agar zeigte
die höchsten Ergebnisse. Deshalb wurde anschließend bei allen Proben ein Oxidase-Test
durchgeführt. Durch den Oxidase-Test wurden die coliforme Bakterien differenziert. Sie sind
Oxidase-negativ. (Oxidase-Reaktion: Kapitel. 2.3.4.3).
Die höchste Keimzahl zeigte die Probe Regensiel. Sie hatte einen Mittelwert von 463
Kolonien pro ml, davon sind 315 Kolonien (Tab. 3.5) keine coliforme Bakterien.
Bei der Probe Haselknick waren von 264 Kolonien, 209 Kolonien (Tab. 3.5) keine coliformen
Bakterien. Prozentual gesehen, besteht eine 79%ig niedrigere Keimzahlbelastung, als
angegeben.
Die Probe Wulksfelde hatte 330 Kolonien, die nicht zu den coliformen Bakterien gehörten,
d.h. 93% weniger Wachstum, als beim Mittelwert.
Auch die Kläranlage Dradenau zeigte auch ein niedrigeres Koloniewachstum, als der
ermittelte Wert. Hier wurden 58 Kolonien ermittelt, wobei der Oxidase-Test 48 Kolonien
weniger anzeigte und damit eine Abweichung von 83% ergab.
40
Kapitel 3: Ergebnisse
Tabelle 3.5: Differenzierung der coliformen Bakterien nach Chromocult-Agar mit
Oxidase-Test
Coliforme Bakterien
Chromocult-Agar
(KBE/ml)
∑ der untersuchten Kolonien
Oxidase-positiv
(KBE/ml)
Oxidase-negativ
(KBE/ml)
falsch-positive Abweichung (%)
Tatsächlicher Wert
(KBE/ml)
Regensiel
463
25
17
8
68
148
Haselknick
264
14
11
3
79
55
Wulksfelde
355
27
25
2
93
25
Dradenau
58
18
15
3
83
10
Der Endo-C-Agar lieferte bei der Plattenmethode den niedrigsten Wert. Da hier mit den
gewachsenen rosa-roten Kolonien ein Oxidase-Test durchgeführt wurde, reduzierten sich
auch hier die Mittelwerte.
Bei genaueren Nachforschungen stellte sich heraus, dass der Endo-C-Agar möglicherweise zu
lange gelagert worden war, denn der Agar gilt als sehr empfindlich und wenige Tage haltbar.
Dadurch konnten die Ergebnisse beeinflusst worden sein. Im weiteren Verlauf der Arbeit
wurde versucht möglichst frischen Nährboden zu verwenden. Aber es konnte aus technischen
Gründen der Nährbodenküche leider nicht immer berücksichtigt werden. Der Agar wurde im
Dunkeln aufbewahrt.
Die Proben Haselknick, Wulksfelde und Dradenau lagen zwischen 11 – 16 Kolonien pro ml.
Damit zeigte der Oxidase-Test Falsch-positive im Bereich von 52 – 63 %. Bei der Probe
Regensiel wurde frisch gegossenes Agar direkt zum Einsatz gebracht. Deshalb waren die
Ergebnisse am höchsten. Der Mittelwert lag bei 125 Kolonien pro ml, die durch einen
Oxidase-Test einen Wert von 31 Kolonien pro ml enthielt (Tab. 3.6).
Tabelle 3.6: Differenzierung der coliformen Bakterien nach Endo-Agar mit Oxidase-Test
Coliforme Bakterien
Regensiel
Haselknick Wulksfelde Dradenau
125
39
31
30
Endo-C-Agar
(KBE/ml)
20
15
19
21
∑ der untersuchten Kolonien
15
9
10
13
Oxidase-positiv
(KBE/ml)
5
6
9
8
Oxidase-negativ
(KBE/ml)
75
60
52
63
Falsch-positive Abweichung (%)
Tatsächlicher Wert
(KBE/ml)
31
16
15
11
Im Gegensatz zum Endo-C-Agar wurde bei den Proben der Desoxycholat-Agar-Verfahren zur
Differenzierung der coliformen Bakterien eine kleine Bunte Reihe durchgeführt.
Die Röhrchen mit D-Glucose-, Laktose-Pepton-Bouillou, Indol- und Citrat-Agar wurden mit
den dunkelroten Kolonien, die auf dem Desoxycholat-Agar gewachsen waren, beimpft.
Daraus ergab sich, dass die tatsächlichen coliformen Bakterien der Probe Regensiel und
Haselknick um 33%, und die Probe Wulksfelde um 40% geringer war, als mit dem
Desoxycholat-Agar erschien. Bei der Probe Dradenau betrug die prozentuale Abweichung
46%.
41
Kapitel 3: Ergebnisse
Tabelle 3.7: Differenzierung der coliformen Bakterien nach Desoxycholat-Agar durch die
Bunte Reihe
Coliforme Bakterien
Regensiel
Haselknick Wulksfelde Dradenau
96
83
439
46
Desoxycholat-Agar
(KBE/ml)
15
12
15
13
∑ der untersuchten Kolonien
10
8
9
7
Bunte Reihe: positiv
(KBE/ml)
33
33
40
46
Falsch-positive Abweichung (%)
Tatsächlicher Wert
(KBE/ml)
64
56
263
25
Die Differenzierung ergab, dass die tatsächliche Anzahl der coliformen Bakterien erheblich
geringer war, als mit den verschieden Agarplatten festgestellt wurde. Die Abbildungen 3.1
und 3.2 stellt ein Vergleich zwischen den ermittelten Anzahlen der coliformen Bakterien mit
und ohne die Differenzierung dar.
Abbildung 3.1: Ermittelte Anzahl der coliformen Bakterien nach der Differenzierung
500
KBE/ml
400
300
263
200
100
148
64
31
56
55
25
16
25
15
10
0
Regensiel
Haselknick
Wulksfelde
Desoxycholat-Agar
Chromocult-Agar
11
Dradenau
Endo-Agar
Abbildung 3.2: Ermittelte Anzahl der coliformen Bakterien ohne die Differenzierung
500
463
439
KBE/ml
400
355
264
300
200
100
96
125
83
39
31
46
58
30
0
Regensiel
Haselknick
Desoxycholat-Agar
Wulksfelde
Chromocult-Agar
42
Endo-Agar
Dradenau
Kapitel 3: Ergebnisse
3.1.4 Ergebnisse der Untersuchungen auf coliformen Bakterien mit den MPN-Verfahren
und Colilert®18-Verfahren
Die Mittelwerte des Colilert-18 (Tab. 3.8 - 3.15) liegen eindeutig über dem Mittelwerte der
MPN-Verfahren. Für Colilert-18 wurde die Probe mit sterilem Leitungswasser (1:10),
verdünnt.
Tabelle 3.8: MPN-Verfahren für Coliformenzahlen in der Regensielprobe
Positive Röhrchen
Charakteristische
Statistischer
MPN
Volumen
Probe:
Nr.
Regensiel 1
2
3
1:10
3
3
3
1:100
3
3
3
1:1000
0
1
1
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
3/3/0
3/3/1
3/3/1
2400
4600
4600
Mittelwert
(KBE/ml)
39
Bei den MPN-Verfahren ergab sich eine Koloniezahl von 39 KBE/ml (Tab. 3.8). Hier wurde
die Vorverdünnung mit berücksichtigt.
Im Gegensatz dazu lagen die Ergebnisse des Colilert-18 (Tab. 3.9) weit über den MPNKeimzahlen. Dies ist auch bei den anderen Proben (Tab. 3.11-3.15) zu beobachten.
Tabelle 3.9: Colilert-Verfahren für Coliformenzahlen in der Regensielprobe
Große
Kleine
Statistischer
Verdünnung Mittelwert
Colilert-18
Wells
Wells
Charakteristische
Tabellenwert
(KBE/ml)
Zahl
(KBE/100ml)
Nr. Positive Reaktion
1:10
Probe:
1
49
46
49/46
1986,3
1:10
Regensiel 2
170
49
44
49/44
1553,1
1:10
3
49
44
49/44
1553,1
Tabelle 3.10: MPN-Verfahren für Coliformenzahlen in der Haselknickprobe
Positive Röhrchen
Charakteristische
Statistischer
MPN
Volumen
Probe:
Haselknick
Nr.
1
2
3
4
1:10
3
2
2
1
1:100
0
0
0
0
1:1000
0
0
0
0
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
3/0/0
2/0/0
2/0/0
1/0/0
230
90
90
40
Mittelwert
(KBE/ml)
1
Die Probe Haselknick zeigte eine Keimzahl von 1 Kolonie pro ml und beim Colilert®18 –
Verfahren war die Keimzahl 9 Kolonien pro ml (Tab. 3.11). Dies zeigt eine 9-fache Erhöhung
der Keimzahl.
43
Kapitel 3: Ergebnisse
Tabelle 3.11: Colilert-Verfahren für Coliformenzahlen in der Haselknickprobe
Große
Kleine
Statistischer
Colilert-18
Wells
Probe:
Haselknick
Nr.
1
2
3
4
Wells
Positive Reaktion
41
1
36
4
45
2
40
9
Charakteristische
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
Verdünnung
41/1
36/4
45/2
40/9
80,5
67,7
105,8
95,9
1:10
1:10
1:10
1:10
Mittelwert
(KBE/ml)
9
Bei der Probe Wulksfelde wurden fünf Paralleluntersuchungen durchgeführt. Hier war der
Vergleich zwischen MPN-Verfahren und Colilert-18-Verfahren übereinstimmend (Tab. 3.12
und 3.13) mit den vorherigen Untersuchungen.
Tabelle 3.12: MPN-Verfahren für Coliformenzahlen in der Wulksfeldeprobe
Positive Röhrchen
Charakteristische
Statistischer
MPN
Volumen
Probe:
Wulksfelde
Nr.
1
2
3
4
5
1:10
3
3
3
3
3
1:100
3
3
2
3
2
1:1000
0
0
1
2
1
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
3/3/0
3/3/0
3/2/1
3/3/2
3/2/1
2400
2400
1500
11000
1500
38
Tabelle 3.13: Colilert-Verfahren für Coliformenzahlen in der Wulksfeldeprobe
Große
Kleine
Statistischer
Colilert-18
Wells
Probe:
Wulksfelde
Nr.
1
2
3
4
5
Wells
Positive Reaktion
49
43
49
41
49
39
48
42
49
48
Mittelwert
(KBE/ml)
Charakteristische
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
Verdünnung
Mittelwert
(KBE/ml)
49/43
49/41
49/39
48/42
48/49
1413,6
1203,3
1046,2
755,5
691
1:10
1:10
1:10
1:10
1:10
102
Bei der Probe Dradenau, war die Keimzahlbelastung sehr niedrig (Tab. 3.14 - 3.15). Trotzdem
waren hier die Ergebnisse der Colilert-18 höher als beim MPN-Verfahren. Diese Probe ist
eine Abwasserprobe und müsste eigentlich höhere Ergebnisse liefern.
Diese Ergebnisse wurden mit den jährlichen Untersuchungsergebnissen verglichen. Es stellte
sich heraus, dass die jährlichen Untersuchungsergebnisse der Kläranlage deutlich über den
ermittelten Wert lagen. Dies war darauf zurückzuführen, dass die Probe Dradenau erst nach
vier Wochen untersucht wurde.
44
Kapitel 3: Ergebnisse
Tabelle 3.14: MPN-Verfahren für Coliformenzahlen in der Dradenauprobe6
Positive Röhrchen
Volumen
MPN
Probe:
Nr.
Dradenau
1
2
3
4
1:10
3
3
3
3
Charakteristische
Zahl
Statistischer
Tabellenwert
(KBE/100ml)
3/2/1
3/1/0
3/2/0
3/1/0
1500
430
930
430
1:100 1:1000
2
1
1
0
2
0
1
0
Mittelwert
(KBE/ml)
8
Tabelle 3.15: Colilert-Verfahren für Coliformenzahlen in der Dradenauprobe
Große
Kleine
Statistischer
Colilert-18
Probe:
Dradenau
Nr.
1
2
3
4
Wells
Wells
Charakteristische
Zahl
Positive Reaktion
44
44
43
47
3
4
7
10
44/3
44/4
43/7
47/10
Tabellenwert
(KBE/100 ml)
Verdünnung
102,0
105,4
108,1
160,7
1:10
1:10
1:10
1:10
Mittelwert
(KBE/ml)
12
Bei allen Proben war zu beobachten, dass das Colilert-18-Verfahren höhere Werte als das
MPN-Verfahren lieferte. Die Proben Regensiel und Wulksfelde zeigten die höchsten
Keimzahlbelastungen mit 170 – 102 KBE/ml.
Die anderen Proben Haselknick und Dradenau hatten eine recht niedrige Keimbelastung von
12 - 9 KBE/ml, die aber auch über den Ergebnissen mit dem MPN-Verfahren lagen.
Abbildung 3.3: MPN-Verfahren und Colilert-18-Verfahren für coliforme Bakterien
200
170
KBE/ml
150
102
100
50
39
38
9
8
1
0
Regensiel
Haselknick
Wulksfelde
MPN-Verfahren
6
abgestandene Probe
45
Colilert 18
12
Dradenau
Kapitel 3: Ergebnisse
Durch erhöhte Werte der Colilert-18-Verfahren sollte eine Differenzierung mit dem Endo-CAgar und eine Identifizierung der Bakterien mit der „Langen Bunten Reihe“ durchgeführt
werden. Beim Colilert-18 wurden die gelben und die fluoreszierenden Vertiefungen, unter
sterilen Bedingungen, entnommen und auf Endo-C-Agar ausgestrichen.
Die qualitative Differenzierung der coliformen Bakterien wurde bei 37°C und E. coli bei
44°C, bei einer Bebrütungszeit von 24 h, durchgeführt. Als Ergebnis lieferte Endo-C-Agar
Kolonien, die nicht rosa-rot bzw. kein grünschimmernden, beständigen Metallglanz
(Fuchsinglanz) hatten, die in der Abbildung 3.4 zu beobachten ist.
Abbildung 3.4: Beimpfte Endo-C-Agarplatte mit Colilert-18-Flüssigkultur.
Aufgrund dieses Ergebnisses wurde die These aufgestellt, dass das Colilert-18-Verfahren
falsch-positive Coliforme oder E. coli Ergebnisse liefern kann.
3.1.4.1 Differenzierung der Colilert®18-Verfahren mit der Langen
Bunte Reihe
Die Lange Bunte Reihe prüft die Stoffwechselleistungen der Bakterien. Sie wurde mit 36
Komponenten wie zum Beispiel Voges Proskauer-Reaktion, Malonat-, Methylrot-,
Gelatinase-Test etc. (Kapitel 2.2.4.4) durchgeführt. Diese Komponenten zeigen die
biochemischen Merkmale von Mikroorganismen, die der weiteren Identifizierung dienen.
Zuerst wurden neue Endo-C-Agar-Platten fraktioniert ausgestrichen. Somit bestand die
Möglichkeit, die Lange Bunte Reihe mit einzeln gewachsenen Kolonien durchzuführen.
Bei der Durchführung der Differenzierung wurden folgende Proben untersucht:
Oberflächengewässer; Bille 61
Oberflächengewässer; Bille 4
Oberflächengewässer; Alster-Haselknick
Die einzeln gewachsenen Kolonien wurden mit Hilfe einer sterilen Impföse auf die
entsprechenden Nährböden ausgestrichen und die Nährboulliouns wurden beimpft.
Nach einer Bebrütungszeit von 24 – 48 h wurden die Röhrchen nach positiven bzw. negativen
Reaktionen ausgewertet. Hierzu ergab sich aus den 36 Komponenten eine Liste
(Ablaufprotokoll) mit positiven und negativen Reaktionen. Danach wurde diese Liste mit der
46
Kapitel 3: Ergebnisse
Identifizierungstabelle (Biochemical reactions of the named species, biogroups, and Enteric
Groups of the familiy Enterobacteriaceae, siehe Anhang) verglichen.
Dieser Identifizierungsbogen für Enterobacteriaceae enthält 31 Gruppen der Organismen wie
Citrobacter, Cedecea, Enterobacter, Salmonella, Escherichiae, Hafnia etc. und deren
Untergruppen, wie zum Beispiel, Escherichiae mit der Untergruppe von E. coli inaktiv, E.
blattae. Außerdem enthält die Identifizierungstabelle Angaben über prozentuelle Anteile
positiver und negativer Reaktionen.
Die Wahrscheinlichkeit der Organismen hängt von der Zusammenstellung der ausgewerteten
Liste (Ablaufprotokoll; siehe Anhang), die von einer fraktioniert ausgestrichenen Kolonie
bearbeitet wurde. Als Beispiel wird die Billeprobe 61 aufgeführt. Diese Probe hatte beim
Colilert-18-Verfahren, gelbe Vertiefungen, die als coliforme Bakterien zu beurteilen waren.
Vom positiven (gelben) Wells wurde Flüssigkeit auf Endo-C-Agar ausgestrichen. Die
Ergebnisse der Endo-C-Agar schienen atypisch zu sein, d.h. es wuchsen keine rot-rosa
Kolonien bzw. war kein grünschimmernder Metallganz zu sehen. Um sicher zu gehen wurden
einzeln gewachsenen Kolonien erneut auf eine neue Endo-C-Platte ausgestrichen und mit
einzeln gewachsene Kolonien die Nährböden und Nährbouillons der Langen Bunten Reihe
beimpft. Nach der Bebrütungszeit wurden sie ausgewertet und die positiven, sowie auch die
negativen Reaktionen dokumentiert. Somit war eine Liste erstellt, die mit der
Identifizierungstabelle verglichen wurde.
Die Identifizierungstabelle enthält prozentuelle Werte, wie zum Beispiel 100%, 80%, 50%
ect., die als positive und negative Reaktion zugeordnet werden.
Bei der Billeprobe 61 wurde eine Liste zusammengestellt, wo zum Beispiel die D-Glucose als
positiv bewertet wurde und dementsprechend ein 100%iger Anteil auf der
Identifizierungstabelle abzulesen war. Diese Vorgehensweise wurde bei allen 36
Komponenten durchgeführt.
Bei der Tabelle 3.16 werden die Mikroorganismen dargestellt, die durch die Differenzierung
mit der Langen Bunten Reihe ermittelt wurden.
Tabelle 3.16: Differenzierung durch die Lange Bunte Reihe
Proben
Probenbezeichnung
Lange Bunte Reihe
Mikroorganismen
1. Probe
2. Probe
3. Probe
Oberflächengewässer; Bille 61
Oberflächengewässer; Bille 4
Oberflächengewässer; Alster-Haselknick
E. coli inaktiv
Enterobacter eloacae
Klebsiella pneumoniae
Bei der Differenzierung wurde festgestellt, dass die Billeprobe 61 mit E. coli, inaktiv belastet
war. Außerdem war bei der Billeprobe 4 Organismen wie Enterobacter eloacae zu
identifizieren. Die letzte Probe war die Alster-Haselknick, die mit dem Organismen Klebsiella
pneumoniae belastet war. Die Differenzierung durch die Lange Bunte Reihe bewies, dass das
Colilert 18-Verfahren kein falsch-positive Ergebnis geliefert hat. Denn alle untersuchten
Wells ergaben bei der Langen Bunten Reihe einen positiven Coliformen-Befund.
47
Kapitel 3: Ergebnisse
3.2 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli mit den Plattenmethoden
Die Untersuchungen auf Escherichia coli werden in der gleichen Reihenfolge wie die der
coliformen Bakterien gezeigt, d. h. zuerst wird die Plattenmethode mit allen Proben und dann
das MPN-Verfahren vorgestellt. Zusätzlich wird das Fluorocult-ECD-Agar-Verfahren, das
nur als fluoreszenzoptischer Nachweis von E. coli dient, aufgenommen.
Tabelle 3.17: Plattenmethoden für E. coli-Keimzahlen der Regensielprobe
Plattenmethode
Desoxycholat-Agar
Chromocult-Agar
Endo-C-Agar
Fluorocult-ECD-Agar
Probe
Regensiel
Regensiel
Regensiel
Regensiel
1.Platte
20
10
5
5
Keimzahl in KBE/ml
2.Platte
3.Platte
25
25
0
0
5
5
5
5
Mittelwert
23
3
5
5
Bei der Plattenmethode hatte der Desoxycholat-Agar die höchsten E. coli-Zahlen bei den
Proben Regensiel und Dradenau. Regensiel hatte 23 Kolonien pro ml (Tab. 3.17) und
Dradenau mit 21 Kolonien pro ml (Tab. 3.18).
Tabelle 3.18: Plattenmethoden für E. coli-Keimzahlen der Haselknickprobe
Plattenmethode
Desoxycholat-Agar
Chromocult-Agar
Endo-C-Agar
Fluorocult-ECD-Agar
Probe
Haselknick
Haselknick
Haselknick
Haselknick
1.Platte
11
0
20
10
Keimzahl in KBE/ml
2.Platte 3.Platte 4.Platte
15
8
7
0
5
0
25
5
10
0
5
0
Mittelwert
10
1
15
4
Bei der Probe Haselknick wurde die größte E. coli-Zahlen der Endo-C-Agar mit 15 Kolonien
pro ml beobachtet (Tab. 3.18). Dann folgte die Probe Wulksfelde mit 10 Kolonien pro ml
(Tab. 3.19).
Die Probe Haselknick wurde mit frisch gegossener Endo-C-Agar durchgeführt. Deshalb war
nur hier der höchste E. coli-Zahl zu ermitteln. Bei den anderen Proben konnte aus technischen
Gründen kein frisch gegossener Endo-C-Agar aus der Nährbodenküche geliefert werden.
Deshalb konnten sie nicht sofort durchgeführt werden.
Tabelle 3.19: Plattenmethoden für E. coli-Keimzahlen der Wulksfeldeprobe
Plattenmethode
Probe
Desoxycholat-Agar
Chromocult-Agar
Endo-C-Agar
Fluorocult-Agar
Wulksfelde
Wulksfelde
Wulksfelde
Wulksfelde
Keimzahl in KBE/ml
1.Platte 2.Platte 3.Platte 4.Platte 5.Platte Mittelwert
5
15
10
15
5
10
0
0
10
0
0
2
6
7
6
6
4
6
5
10
5
0
5
5
Das Fluorocult-ECD-Agar hatte bei allen Probe fast gleiche E. coli-Zahlen. Die Ergebnisse
waren übereinstimmend, d. h. sie lagen zwischen 4 – 5 Kolonien pro ml. Dies ist darauf
zurückzuführen, dass der Fluorocult-ECD-Agar ein Selektivagar ist.
48
Kapitel 3: Ergebnisse
Zusätzlich zur Bestätigung des Befundes wurden die fluoreszierenden Kolonien auf
Indolbildung geprüft. Außerdem wurde das Volumen der Proben bei den Vorversuchen
bestimmt. Es zeigte sich, dass ein kleines Volumen, wie z. B. 10 - 100 µl für den FluorocultAgar zu niedrig war. Es wuchsen nur vereinzelte Kolonien, die jedoch im UV-Licht nicht
sichtbar waren. Deshalb wurde bei den weiteren Untersuchungen ein Volumen von 200 µl
gewählt und bei der Auswertung die Verdünnung berücksichtigt.
Tabelle 3.20: Plattenmethoden für E. coli-Keimzahlen der Dradenauprobe
Probe
Keimzahl in KBE/ml
Plattenmethode
1.Platte 2.Platte 3.Platte 4.Platte
Desoxycholat-Agar
Dradenau
25
20
10
30
Chromocult -Agar
Dradenau
5
0
5
5
Endo-C-Agar
Dradenau
5
0
0
0
Fluorocult-ECD-Agar
Dradenau
5
5
0
5
Mittelwert
21
4
1
4
Der Chromocult-Coliformen-Agar hatte bei allen Proben die niedrigsten Mittelwerte. Hier
lagen die Keimbelastungen zwischen 1 – 4 Kolonien pro ml. Die dunkelblau-violett gefärbten
Kolonien auf dem hellen Chromocult-Agar waren sehr gut zu identifizieren.
3.2.1 Differenzierung der Escherichia coli von Chromocult-Coliformen-Agar, Endo-CAgar und Desoxycholat-Agar
Die Differenzierung der E. coli für Chromocult-Agar mit einem Oxidase-Test bewies, dass
alle dunkelblau-violett gewachsenen Kolonien coliforme Kolonien waren. Da die getesteten
Kolonien die Reaktion Oxidase-negativ zeigten (Tab. 3.21).
Tabelle 3.21: Differenzierung der E. coli für Chromocult-Agar mit Oxidase-Test
E. coli
Regensiel
Haselknick Wulksfelde Dradenau
3
1
2
4
Chromocult-Agar
(KBE/ml)
3
1
2
4
∑ der untersuchten Kolonien
0
0
0
0
Oxidase-positiv
(KBE/ml)
3
1
2
4
Oxidase-negativ
(KBE/ml)
0
0
0
0
Falsch-positive Abweichung (%)
Tatsächliche Wert
(KBE/ml)
3
1
2
4
Bei der Differenzierung für Endo-C-Agar durch einen Oxidase-Test zeigten sich keine großen
prozentuellen Abweichungen, da die untersuchten Kolonien Oxidase-negativ waren.
Die Probe Haselknick enthielt eine Abweichung von 20% und die Dradenauprobe zeigte eine
100% Abweichung. Bei der Probe Dradenau konnte aber nur eine Kolonie auf Oxidase
untersucht werden. Somit ist die Wahrscheinlichkeit zu gering, um eine Aussage treffen zu
können (Tab. 3.23).
49
Kapitel 3: Ergebnisse
Tabelle 3.23: Differenzierung der E. coli für Endo-Agar mit dem Oxidase-Test
Escherichia coli
Regensiel
Haselknick
Wulksfelde
5
15
6
Endo-C-Agar
(KBE/ml)
0
3
0
Oxidase-positiv
(KBE/ml)
5
12
6
Oxidase-negativ
(KBE/ml)
0
20
0
Prozentuale Abweichung (%)
Tatsächliche Wert (KBE/ml)
5
12
6
Dradenau
1
1
0
100
0
Bei der Überprüfung des Desoxycholat-Agars wurde die Differenzierung der E. coli mit den
Bunten Reihen durchgeführt. Das Desoxycholat-Agar-Verfahren zeigten die höchsten
Keimzahlen, weil der Nährböden die thermotoleranten Bakterien wachsen lassen.
Bei der Probe Haselknick und Wulksfelde lagen die Keimbelastungen zwischen 80 – 83 %
(Tab. 3.22) weniger als mit der Bestimmung von Desoxycholat-Agar.
Der Mittelwert der E. coli bei der Probe Dradenau war zu 71% weniger vorhanden, als in der
Tat die Probe enthielt. Die geringste prozentuale Abweichung zeigte die Probe Regensiel mit
65%.
Tabelle 3.22:Differenzierung der E. coli-Zahlen nach Desoxycholat-Agar durch die
Bunte Reihe
Escherichia coli
Regensiel
Haselknick Wulksfelde Dradenau
23
10
6
21
Desoxycholat-Agar
(KBE/ml)
8
5
6
7
∑ der untersuchten Kolonien
3
1
1
2
Bunte Reihe: positiv
(KBE/ml)
63
80
83
71
Falsch-positive Abweichung (%)
Tatsächliche Wert
(KBE/ml)
8
2
1
6
Die Abbildungen 3.5 und 3.6 stellt ein Vergleich zwischen den ermittelten Anzahlen der
Escherichia coli mit und ohne die Differenzierung dar.
Abbildung 3.5: Ermittelte Anzahl der E. coli nach der Differenzierung
25
KBE/ml
20
15
12
10
5
8
5
3
6
5
4
2
6
5
1
1
4
4
2
0
0
Regensiel
Haselknick
Desoxycholat-Agar
Wulksfelde
Chromocult-Agar
50
Endo-Agar
Dradenau
Fluorocult-Agar
Kapitel 3: Ergebnisse
Abbildung 3.6: Ermittelte Anzahl der E. coli ohne die Differenzierung
25
23
21
20
KBE/ml
15
15
10
10
10
5
5
6
5
4
3
5
4
2
1
4
1
0
Regensiel
Haselknick
Desoxycholat-Agar
Wulksfelde
Chromocult-Agar
Dradenau
Endo-Agar
Fluorocult-Agar
3.2.2 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli mit den MPN-Verfahren und
Colilert®18-Verfahren
Die Ergebnisse der MPN-Verfahren und der Colilert-18-Verfahren waren übereinstimmend.
Die Probe Regensiel hatte bei dem MPN-Verfahren weniger als 0,3 Kolonien pro ml (Tab.
3.24) und mit dem Colilert-18-Verfahren lag die Koloniezahl bei 0,3 Kolonien pro ml
(Tab. 3.25).
Tabelle 3.24: Ergebnisse der Probe Regensiel mit MPN-Verfahren
Positive Röhrchen
Charakteristische
Statistischer
MPN
Volumen
Probe:
Nr.
Regensiel 1
2
3
1:10
0
0
0
1:100
0
0
0
1:1000
0
0
0
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
0/0/0
0/0/0
0/0/0
<30
<30
<30
Tabelle 3.25: Ergebnisse der Probe Regensiel mit Colilert-18
Große
Kleine
Statistischer
Colilert-18
Wells
Probe:
Regensiel
Nr.
1
2
3
Wells
Positive Reaktion
3
1
3
0
3
0
Mittelwert
(KBE/ml)
<0,30
Charakteristische
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100 ml)
Verdünnung
Mittelwert
(KBE/ml)
3/1
3/0
3/0
4,1
3,1
3,1
1:10
1:10
1:10
0,30
Die Probe Haselknick (Tab. 3.26 und 3.27) zeigte bei beiden Verfahren die gleiche Keimzahlbelastung. Hier wurden 0,5 Kolonien pro ml ermittelt.
51
Kapitel 3: Ergebnisse
Tabelle 3.26: Ergebnisse der Probe Haselknick mit MPN-Verfahren
Positive Röhrchen
Charakteristische
Statistischer
MPN
Volumen
Probe:
Haselknick
Nr.
1
2
3
4
1:10
2
1
0
0
1:100
0
0
0
1
1:1000
0
0
0
0
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
2/0/0
1/0/0
0/0/0
0/1/0
90
40
<30
30
Tabelle 3.27: Ergebnisse der Probe Haselknick mit Colilert-18
Große
Kleine
Charakteristische
Statistischer
Colilert-18
Wells
Probe:
Haselknick
Nr.
1
2
3
4
Wells
Positive Reaktion
2
0
7
0
5
0
3
1
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
2/0
7/0
5/0
3/1
2,0
7,4
5,2
4,1
Mittelwert
(KBE/ml)
0,50
Verdünnung
1:10
1:10
1:10
1:10
Mittelwert
(KBE/ml)
0,50
Die Probe Wulksfelde zeigte einen Unterschied beim MPN-Verfahren. Sie zeigte eine
Keimzahl von 13 Kolonien pro ml (Tab. 3.28) und bei Colilert-18 lag sie bei 2 Kolonien pro
ml.
Tabelle 3.28: Ergebnisse der Probe Wulksfelde mit MPN-Verfahren
Positive Röhrchen
Charakteristische
Statistischer
MPN
Volumen
Probe:
Wulksfelde
Nr.
1
2
3
4
5
1:10
3
3
3
3
3
1:100
3
2
2
1
1
1:1000
0
1
0
1
1
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
3/3/0
3/2/1
3/2/0
3/1/1
3/1/1
2400
1500
930
750
750
Tabelle 3.29: Ergebnisse der Probe Wulksfelde mit Colilert-18
Große
Kleine
Statistischer
Colilert-18
Wells
Probe:
Wulksfelde
Nr.
1
2
3
4
5
Wells
Positive Reaktion
11
5
12
6
10
4
15
4
11
4
Mittelwert
(KBE/ml)
13
Charakteristische
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
Verdünnung
Mittelwert
(KBE/ml)
11/5
12/6
10/4
15/4
11/4
17,9
20,4
15,5
22,3
16,8
1:10
1:10
1:10
1:10
1:10
2
Der Wert der E. coli-Zahlen bei der Probe Dradenau enthielt bei beiden Verfahren die gleiche
Keimzahlbelastung. Sie lag bei 1 Kolonie pro ml (Tab. 3.30 und 3.31).
52
Kapitel 3: Ergebnisse
Tabelle 3.30: Ergebnisse der Probe Dradenau mit MPN-Verfahren
Positive Röhrchen
Charakteristische
Statistischer
MPN
Volumen
Probe:
Dradenau
Nr.
1
2
3
4
1:10
2
1
2
2
1:100
0
0
0
1
1:1000
0
0
0
0
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
2/0/0
1/0/0
2/0/0
2/1/0
90
40
90
150
Tabelle 3.31: Ergebnisse der Probe Dradenau mit Colilert-18
Große
Kleine
Charakteristische Statistischer
Colilert-18
Wells
Probe:
Dradenau
Nr.
1
2
3
4
Wells
Positive Reaktion
8
0
7
1
11
0
12
0
Zahl
Tabellenwert
(KBE/100ml)
8/0
7/1
11/0
12/0
8,6
8,5
12,2
13,5
Mittelwert
(KBE/ml)
1
Verdünnung
Mittelwert
(KBE/ml)
1:10
1:10
1:10
1:10
1
3.3 Ergebnisse der Untersuchungen auf Escherichia coli und coliformen Bakterien mit
dem Membranfiltrationsverfahren
Das Membranfiltrationsverfahren wird mit E. coli und coliformen Bakterien gemeinsam
präsentiert. Von den verdächtigen Kolonien auf dem Membranfilter wurden bis zu 10
Kolonien weiter untersucht und der Befund auf das Endergebnis hochgerechnet.
Das Membranfiltrationsverfahren wurde mit sehr großen Verdünnungen vorbereitet. Die
Standardarbeitsanweisung des Umweltamtes Hamburg beschreibt, dass dieses Verfahren mit
einem Volumen von 100 ml durchgeführt werden soll.
Während den Vorversuchen wurde festgestellt, dass die Durchführung des Verfahrens mit 100
ml Wasserprobe, ohne Verdünnung, zu keinen Ergebnissen führt. Dann wurden
Verdünnungen von 1:100 gewählt.
Die Identifizierung und Differenzierung der gelben bzw. gelb-orange Kolonien auf dem
Membranfilter konnte kaum ausgewertet werden, da die Kolonien meist aufeinander
gewachsen waren. Dies wurde nach 18 h Bebrütung bei 37°C beobachtet.
Bei den ersten drei Paralleluntersuchungen wurde eine Verdünnung von 1:1000 gewählt und
die Abwasserprobe wurde mit einer Verdünnung von 1:10000 durchgeführt. Erst mit diesen
Verdünnungen konnten Ergebnisse erzielt werden.
Die coliformen Bakterien waren bei der Probe Regensiel zu 90 Kolonien pro ml vorhanden.
Dies ist die meist belastete Probe beim Membranfiltrationsverfahren. Die fäkalcoliforme
Bakterien waren nicht vorhanden (Tab. 3.32).
53
Kapitel 3: Ergebnisse
Tabelle 3.32:Membranfiltrationsverfahren für E. coli und Coliformenzahlen der
Regensielprobe
Membran- Verdächtige UmrechnugsKolonien auf
wert
filtration Membranfilter
Nr.
28/47=7
Probe: 1
28
Regen20/4=5
2
20
siel
28/4=7
3
28
Coliforme der
untersuchten
Kolonien
Coliforme
Bakterien
E. coli
3
1
0
21
5
28
0
0
0
Mittelwert
(KBE/ml)
Coliforme: 90
E. coli: 0
Der Mittelwert der Probe Haselknick lag bei 53 Kolonien pro ml. Hier konnten auch keine
fäkalcoliforme Bakterien ermittelt werden (Tab. 3.33).
Tabelle 3.33:Membranfiltrationsverfahren für E. coli und Coliformenzahlen der
Haselknickprobe
Membranfiltration
Nr.
Probe: 1
Hasel2
knick
3
4
Verdächtige
Kolonien auf
Membranfilter
Umrechnugswert
45
41
34
22
45/6=7,5
41/6=6,83
34/6=5,6
22/6=3,6
Coliforme der
untersuchten
Kolonien
Coliforme
Bakterien
E. coli
2
1
3
1
15
6,83
17
3,6
0
0
0
0
Mittelwert
(KBE/ml)
Coliforme: 53
E. coli: 0
Die Probe Wulksfelde hatte die zweithöchste Keimzahlbelastung mit 73 Kolonien pro ml. Der
Mittelwert der E. coli lag bei 5 Kolonien pro ml (Tab. 3.34).
Tabelle 3.34:Membranfiltrationsverfahren für E. coli und Coliformenzahlen der
Wulksfeldeprobe
Membranfiltration
Nr.
Probe: 1
2
Wulks3
felde
4
5
Verdächtige
Kolonien auf
Membranfilter
Umrechnugswert
28
30
35
48
82
28/6=4,6
30/6=5
35/6=5,8
48/6=8
82/6=13,6
Coliforme der
untersuchten
Kolonien
Coliforme
Bakterien
E. coli
4
1
2
3
1
18,6
5
12
24
13,6
4,6
0
0
0
0
Mittelwert
(KBE/ml)
Coliforme: 73
E. coli: 5
Die Probe Dradenau hatte einen Mittelwert von 49 Kolonien und die E. coli-Keimzahl lag bei
5 Kolonien pro ml (Tab. 3.35).
7
Anzahl der untersuchten Kolonien
54
Kapitel 3: Ergebnisse
Tabelle 3.35:Membranfiltrationsverfahren für E. coli und Coliformenzahlen der
Dradenauprobe
Membran- Verdächtige UmrechnugsKolonien auf
wert
filtration Membranfilter
Nr.
11/7=1,57
Probe: 1
11
Dra13/6=2,16
2
13
denau
11/7=1,57
3
11
12/6=2
4
12
Coliforme der
untersuchten
Kolonien
Coliforme
Bakterien
E. coli
3
1
3
4
4,71
2,16
4,71
8
0
0
0
2
Mittelwert
(KBE/ml)
Coliforme:49
E. coli:5
Alle coliformen Bakterien lagen zwischen 50 – 90 Kolonien pro ml und bei den E. coli lies
sich ein Mittelwert von 0 - 5 Kolonien pro ml feststellen. Diese Proben enthielten große
Verdünnungen.
3.4 Miniaturverfahren zur Zählung von Escherichia coli
Es konnten keine Ergebnisse für die Proben Regensiel, Haselknick, Wulksfelde und Dradenau
bestimmt werden. Da diese Proben für ein Miniaturverfahren zu geringe E. coli-Keimzahlen
hatten. Deshalb wurde beschlossen Proben mit höheren E. coli-Keimzahlen für dieses
Verfahren einzusetzen.
Es wurden noch 7 zusätzliche Proben genommen. Diese Proben wurden sowohl mit dem
Miniaturverfahren (Mikrotiterplatten) als auch mit den anderen Verfahren untersucht.
Tabelle 3. 36: Miniaturverfahren und Colilert-18-Verfahren für E. coli
Escherichia coli: in KBE/ml
Nr. Proben:
Datum:
Colilert-18
Miniaturverfahren
19.10.05
1 Schlemmer Bach, Billstedt
2
3
19.10.05
2 AS Billstedt
5
6
25.10.05
2
3 Winterhuder Brücke, Alster
17
25.10.05
3
4 Ammersbek, Bürgkamp
65
07.11.05
5 Moorfleet, Autobahn 24
3
4
07.11.05
6 Waltershof Autobahn
12
22
14.11.05
7 Georgswerder Bogen
2
3
Mittelwert in (KBE/ml)
15
6
Der Vergleich bei den Einzelwerten dieser 7 Proben, zwischen dem Colilert-18 und dem
Miniaturverfahren ergab, dass das Colilert-18 in 3 von 7 Fällen drastisch unterschiedliche
Ergebnisse liefert.
Der Mittelwert für das Verfahren Colilert-18 für 7 Proben betrug 15 Kolonien pro ml. Im
Gegensatz dazu erhielt das Miniaturverfahren einen Mittelwert von 7 Kolonien pro ml.
Damit zeigte das Colilert-18 mehr als 2-fachen Belastungen der E. coli.
55
Kapitel 3: Ergebnisse
Die Plattenmethoden für E. coli werden in Kolonienbildende Einheiten pro ml angegeben.
Damit eine bessere Übersicht entsteht, ist das Desoxycholat-Agar-Verfahren, die höchsten
Zahlen lieferte.
Tabelle 3. 37: Zusammenfassung der Plattenmethoden für E. coli
Plattenmethoden: KBE/ml bei Escherichia coli
DesoxycholatEndo-C- Chromocult- FluorocultNr. Proben:
1
2
3
4
5
6
7
Georgsweder Bogen
Schlemmer Bach, Billstedt
AS Billstedt
Moorfleet, Autobahn 24
Waltersdorf Autobahn
Winterhuder Brücke, Alster
Ammersbek, Bürgkamp
Mittelwert in KBE/ml
Agar
Agar
Agar
Agar
75
10
35
15
40
40
70
41
15
8
25
20
20
25
50
23
5
5
10
10
30
45
40
21
5
5
7
5
5
10
15
7
Mit dem Desoxycholat-Agar wurden höhere Belastungen festgestellt als mit den anderen
Nährböden. In nur 1 von 7 Fällen zeigte der Desoxycholat-Agar einen niedrigeren Wert (Tab.
3.37). Der Endo-C-Agar liefert geringe Anzahl der E. coli, als der Chromocult-Agar. Bei der
Fluorocult-ECD-Agar wuchsen die wenigsten Keimzahlen.
Im Zusammenhang mit Miniaturverfahren waren die Ergebnisse der Plattenmethode erheblich
höher, als der des Miniaturverfahrens. Bei sechs Verfahren, die in diesem Abschnitt behandelt
wurden, lag das Miniaturverfahren an der letzten Stelle mit den Keimzahlen (Abb. 3.6).
Abbildung 3.7: Ermittelte Anzahl der Escherichia coli
50
41
KBE/ml
40
30
23
21
20
15
7
10
6
0
Desoxycholat-Agar
Colilert-18Verfahren
Endo-C-Agar
Fluorocult-Agar
Chromocult-Agar
Miniaturverfahren
Insgesamt betrachtet ist die Reihenfolge der Einzelwerte dieser Proben ähnlich der
Reihenfolge der Ergebnisse der Parallelansätze, die im Kapitel 3.2 ermittelt wurden. Außer
einige Werte, die man als Ausreißer bezeichnen könnte.
56
Kapitel 3: Ergebnisse
3.5 Ergebnisse der quantitativen Erfassung von coliformen Bakterien mit den einzelnen
Verfahren
Beim Vergleich der Verfahren mit den Plattenmethoden werden die Endergebnisse, die durch
die Differenzierung und ohne die Differenzierung ermittelt wurden, dargestellt. Anschließend
folgt der Vergleich zwischen MPN-Verfahren und Colilert-18-Verfahren.
3.5.1 Chromocult-Coliformen-Agar
Mit diesem Agar wurde die höchste Keimzahl nach der Differenzierung mit der Oxidase-Text
erreicht. Insgesamt waren 225 Kolonien pro ml, die durch einen Oxidase-Test als falschpositive Bakterien ermittelt wurden. Dies entspricht einen prozentualen Anteil von 81% (siehe
Tab. 3.5).
Zur Identifizierung der Kolonien bietet der Coliformen–Agar von allen verwendeten
Nährböden eindeutig den besten Farbkontrast (Abb. 3.8). Auf dem hellen, transparenten
Nährboden sind die rosa-roten Coliformen deutlich zu erkennen. Die Aufnahme der Volumen
von dem Nährboden ist einwandfrei, da das Aufsaugen der Probe mit kleinen und großen
Volumen mit dem Oberflächenausstrich problemlos war.
Abbildung 3.8: Kolonien von coliformen Bakterien auf Chromocult-Coliformen-Agar
3.5.1.2 Endo-C-Agar
Mit dem Endo-C-Agar war im Verlauf der Untersuchungen ein durchgehend geringes
Koloniewachstum, mit Ausnahme einer Probe, festzustellen. In nur 1 von 4 Fällen wuchsen
auf Endo-C-Agar mehr Kolonien als bei den anderen Plattenmethoden. Mit dem Oxidase-Test
wurde ein Anteil von 63% an falsch positiven Nachweisen festgestellt (siehe Tab. 3.6).
Das Ausplattieren und Auszählen der Kolonien auf dem Endo-C-Agar erwies sich als
problematisch. Beim Ausplattieren mit dem Oberflächenausstrich durfte kein großes Volumen
eingesetzt werden. Die Flüssigkeit wurde schlecht von den Nährböden aufgesaugt. Auf dem
hellroten Nährboden wachsen die Kolonien in einem roten Farbton, so dass sie sehr schlecht
zu erkennen sind. Teilweise waren die Nährboden, die aus der Nährbodenküche geliefert
wurden, eher rot bis dunkelrot. Somit wurde die Identifizierung der Kolonien noch
schwieriger. Deshalb wurde eine Lampe zu Hilfe genommen, um die roten Kolonien und den
57
Kapitel 3: Ergebnisse
grünschimmernden Metallglanz besser überprüfen zu können. Ein beständiger,
grünschimmernder Metallglanz (Fuchsinglanz) der Kolonien war bei einigen Parallelansätzen
meist nicht zu erkennen (Abb. 3.9).
Abbildung 3.9: Kolonien von coliformen Bakterien auf Endo-C-Agar
3.5.1.3 Desoxycholat-Agar
Während der experimentellen Untersuchungen, ohne die Differenzierung, hatte das
Desoxycholat-Agar-Verfahren die zweithöchste Keimzahl. In der Abbildung 3.10 sind zwei
Ansätze für die Bunte Reihe aufgestellt. Der linke Ansatz ist eine bearbeitete Bunte Reihe und
zeigt die Gasbildung bei den Laktose und Glucose Röhrchen. Die Indolbildung ist durch die
violette Färbung zu erkennen und der Citrat-Röhrchen ist positiv. Der rechte Ansatz ist
unbehandelt und macht den Unterschied deutlich.
Abbildung 3.10: Die Bunte Reihe mit einem behandelten und unbehandelten Ansatz
Insgesamt war durch die Differenzierung mit einer Bunten Reihe ein Anteil von 38% an
falsch-positiven Bakterien (siehe Tab. 3.7). Dies ist darauf zuführen, dass der DesoxycholatAgar ein Nährboden ist, die thermotoleranten Bakterien wachsen lässt. Trotzdem zeigten die
Platten eine gute Aufteilung der Kolonien, die auf eine richtige Durchmischung der
Flüssigkeit mit Nährboden hindeutet.
58
Kapitel 3: Ergebnisse
Der helle Nährboden ermöglicht eine problemlose Identifizierung der dunkelroten Kolonien
mit dem Keimzählgerät (Abb. 3.11).
Abbildung 3.11: Kolonien von coliformen Bakterien auf Desoxycholat-Agar
3.5.1.4 MPN-Verfahren und Colilert®18-Verfahren
Die Ergebnisse der Keimzahlen von MPN-Ansätzen lagen deutlich unter den der Colilert-18Verfahren. In zwei Fällen wurde mit Colilert-18 sogar das 9 - 4fache als beim MPNVerfahren beobachtetBei dem MPN-Verfahren wurde keine weitere Differenzierung
vorgenommen und beim Colilert-18 wurde die Identifizierung der Bakterien durchgeführt.
Die Durchführung der MPN-Verfahren ist
problemlos. Die Durchführung nimmt nicht viel Zeit in Anspruch. Aber die Bebrütungszeit ist
im Gegensatz zu Colilert-18 doppelt so lang. Um ein schnelles Ergebnis zu erzielen ist der
Colilert-18 vorteilhafter. Bei Colilert-18-Verfahren ist die Bebrütungszeit 18 Stunden und der
Test muss exakt nach 18 Stunden ausgewertet werden. Nach Ablauf von 18 Stunden können
andere heterotrophe Keime das Hemmsystem von Colilert-18 überwinden und könnten zu
falsche Ergebnisse führen (Abb. 3.12).
Abbildung 3.12: Colilert-18-Verfahren für coliforme Bakterien
59
Kapitel 3: Ergebnisse
Die Auswertung der MPN-Röhrchen und der Colilert-18-Trays ist eindeutig. Die Gasbildung
in den Durham-Röhrchen ist klar zu erkennen. Die Beurteilung der gelben Vertiefungen beim
Colilert-18-Verfahren bereitet auch keine Probleme. Hierfür wird als Referenz die
Komparator-Lösung mit dem Ansatz verglichen.
Abbildung 3.13: MPN-Röhrchen für coliforme Bakterien
3.5.2 Ergebnisse der quantitativen Erfassung von Escherichia coli mit den einzelnen
Verfahren
Beim Vergleich der Verfahren mit den Plattenmethoden werden die Endergebnisse, die durch
die Differenzierung ermittelt wurden, dargestellt. Zusätzlich wird noch der Fluorocult-ECDAgar eingesetzt, der nur für die Bestimmung von E. coli dient.
Anschließend folgt der Vergleich zwischen MPN-Verfahren und Colilert-18-Verfahren.
3.5.2.1 Desoxycholat-Agar
Mit diesem Agar hatten 3 Proben die höchsten Keimzahlen. Somit hatte der DesoxycholatAgar die höchsten Keimzahlen vor der Differenzierung mit der Bunten Reihe.
Durch die Differenzierung wurde festgestellt, dass darunter die meisten falsch-positive Keime
waren. Das Desoxycholat-Agar-Verfahren zeigte ein Anteil von 74% (siehe Tab. 3.22). In der
Abbildung 3.14 sind die E. coli Bakterien auf den hellen Nährboden zu erkennen.
Abbildung 3.14: Kolonien von E. coli auf dem Desoxycholat-Agar
60
Kapitel 3: Ergebnisse
3.5.2.2 Endo-C-Agar
Die Koloniezahlen, die mit Endo-C-Agar durch die Differenzierung erreicht wurde, liegen an
zweiter Stelle. In nur 1 von 4 Fällen wuchsen auf Endo-C-Agar mehr Kolonien als auf
Desoxycholat-Agar. Der Anteil an falsch-positiven Keimen bei dem Endo-C-Agar liegt bei
30% (siehe Tab. 3.23)
3.5.2.3 Fluorocult-ECD-Agar
Beim Fluorocult-Agar wurde die Differenzierung durch die Indolprüfung durchgeführt.
Dieser Agar zeigt den nächstkleinsten Keimzahlen. Die E. coli-Keimzahlen blieben selbst
durch die Indolprüfung unverändert (siehe Tab. 3.17-3.20).
Die Saugfähigkeit der Fluorocult-Agar war begrenzt. Im Gegensatz dazu erwies sich nur ein
Ansatz mit geringem Probenvolumen, als ungenügend. Deshalb müsste das gewählte
Volumen lange mit dem Spatel gerieben werden. Zusätzlich wurde der Agar, bei 37°C ca. 5
Minuten erwärmt und sofort behandelt.
Als vorteilhaft ist der helle Nährboden (Abb. 3.15) für die Identifizierung der hellblau
fluoreszierenden Kolonien sehr geeignet.
Abbildung 3.15: Fluorocult-ECD-Agar ohne Fluoroszenz
61
Kapitel 3: Ergebnisse
3.5.2.4 Chromocult-Coliformen-Agar
Der Chromocult-Coliformen-Agar zeigte die niedrigsten E. coli-Keimzahlen vor der
Differenzierung an. Hier ergaben sich bei allen 4 Untersuchungen geringe Keimzahlen außer
bei einer Probe. Da der Chromocult-Coliformen-Agar ein Selektiv-Nährboden ist, waren bei
der Differenzierung mit dem Oxisase-Test keine Unterschiede zu beobachten. Hier wurden
keine falsch-positiven Ergebnisse ermittelt (siehe Tab. 3.21).
Aufgrund der geringen Keimzahldichte auf den Platten hatten die Kolonien generell
optimalen Wachstumsraum und es kam nicht zu Anhäufungen von mehreren Kolonien.
Hier besteht kein Bedarf für die Nutzung eines Keimzählgerätes Dies zeigt auch die
Abbildung 3.16.
Abbildung 3.16: Kolonien von E. coli auf Chromocult-Coliformen-Agar
3.5.2.5 MPN-Verfahren und Colilert®18-Verfahren
Die ermittelten Keimzahlen mit dem MPN-Verfahren und dem Colilert-18-Verfahren für E.
coli waren übereinstimmend. In nur 1 von 4 Fällen lag das Ergebnis mit dem MPN-Verfahren
höher als das Colilert-18-Verfahren. Bei den anderen 3 Untersuchungen waren die Ergebnisse
der Keimzahlen identisch. Bei diesen Ergebnissen wurde keine Differenzierung
vorgenommen.
Die Auswertung der MPN-Röhrchen und der Colilert-18-Trays mit Hilfe einer UV-Lampe
zeigte eindeutig gut unterscheidbare positive und negative Reaktionen (Abb. 3.17).
62
Kapitel 3: Ergebnisse
Abbildung 3.17: MPN-Röhrchen mit Fluoreszenz
3.5.2.6 Membranfiltrationsverfahren zur quantitativen Erfassung von Escherichia coli
und coliformen Bakterien
Bei dem Membranfiltrationsverfahren wurden nur die laut DIN vorgeschriebenen
Differenzierungen durchgeführt. Die Keimzahlbestimmung bei den coliformen Bakterien
sowie der E. coli-Keimzahlen durch dieses Verfahren ist niedrig.
Die Durchführung des Verfahrens ist einwandfrei. Aber es ist ein Verfahren, das erst nach 48
Stunden Ergebnis liefert. Außerdem müssen sehr große Verdünnungen gewählt werden. Bei
der Abbildung 3.18 ist eine Membranfiltrationsanlage dargestellt.
Abbildung 3.18: Membranfiltrationsanlage
3.5.2.7 Miniaturverfahren zur Zählung von Escherichia coli
Das Miniaturverfahren wurde mit 7 verschiedenen Proben durchgeführt. Das Verfahren ergab
sehr niedrige E. coli-Keimzahlen. Der Nachweis von E. coli durch Fluoreszenz im UV-Licht
war eindeutig und die Durchführung des Miniaturverfahrens lief einwandfrei.
Das Pipettieren mit der 8-Mehrkanal-Pipette wurde vor der Durchführung der Proben auf ihre
Volumen geprüft. Somit wurde diese Fehlerquelle von Anfang an ausgeschlossen.
Bei dem Miniaturverfahren sollten Proben gewählt werden, die höhere E. coliKeimzahlbelastung besitzen. Durch den Einsatz kleiner Probenvolumina ist dieses Verfahren
63
Kapitel 3: Ergebnisse
insbesondere für die Untersuchung von Abwasser- und Oberflächengewässern geeignet. Bei
der Abbildung 3.19 ist eine Mikrotiterplatte dargestellt.
Abbildung 3.19: Mikrotiterplatte für ein Miniaturverfahren
3.6. Statischtische Prüfverfahren zur quantitativen Erfassung der Ergebnisse
In diesem Abschnitt werden die Plattenmethoden für die coliformen und fäkalcoliformen
Bakterien mit dem statischen Prüfverfahren untersucht. Es wurden die Mittelwerte der
Verfahren ohne die Differenzierung d.h. die Gesamt-Keimzahlen inklusive falsch-positiven
Ergebnisse betrachtet. Die Anzahl falsch-positiver Kolonien wurde auf die Gesamtheit der
Koloniezahlen aller Platten bezogen. Damit ist die Bestimmung der Koloniezahl falschpositiver Kolonien der einzelnen Platten nicht gewährleistet.
Aufgrund der Vielfalt der Bestimmungsmethoden wurde beschlossen nur die Ergebnisse der
Plattenmethoden mit statistischen Prüfverfahren zu analysieren.
3.6.1 Anwendung statistischer Prüfverfahren auf die Ergebnisse der Untersuchungen
mit coliformen Bakterien
Bei der quantitativen Analyse der Plattenmethoden beobachtet man eine Variabilität und
damit eine Streuung der Ergebnisse. Insgesamt wurden vier Proben mit verschiedenen
Parallelansätzen durchgeführt und das sich daraus ergebende arithmetische Mittel bzw. der
Mittelwert wurde für die Auswertung der Parallelansätze herangezogen.
Die Tabelle 3.38 ermöglicht eine besseren Übersicht über die Plattenmethoden und den
jeweiligen statistischen Größen. Die statistischen Größen setzen sich aus arithmetischem
64
Kapitel 3: Ergebnisse
Mittelwert, Varianz, Standardabweichung und Variationskoeffizienten zusammen. Die
Formeln für diese Größen sind im Kapitel 2.5.2.1 dargestellt.
Tabelle 3.38: Coliformenzahlen mit dem statischen Prüfverfahren
x
Plattenmethoden Proben
s2
s
DesoxycholatAgar
ChromocultAgar
Endo-C-Agar
Regensiel
Haselknick
Wulksfelde
Dradenau
Regensiel
Haselknick
Wulksfelde
Dradenau
Regensiel
Haselknick
Wulksfelde
Dradenau
96
83
439
46
463
264
355
58
125
39
31
30
379
770
4084
73
3033
1940
3100
1575
175
89,67
180
150
19,46
27,75
63,90
8,54
55,07
44,04
55,67
39,69
13,23
9,47
13,42
12,25
v
0,20
0,33
0,15
0,19
0,12
0,17
0,16
0,68
0,11
0,24
0,43
0,40
V*100%
20
33
15
19
12
17
16
68
11
24
43
40
Der Variationskoeffizient ist eine Kenngröße für das Ausmaß der zufälligen Fehler und damit
ein Maß für die Ungenauigkeit der verwendeten Bestimmungsmethode. Durch die
Bestimmung der Standardabweichung konnten die Variationskoeffizienten berechnet werden.
In 7 von 12 Fällen ist der Variationskoeffizient unter 20%. Je kleiner der Zahlenwert der
Variationskoeffizienten, desto größer ist die Präzision der Bestimmungsmethode. In 7 Fällen
ist die Genauigkeit der Bestimmungsmethode noch zu akzeptieren.
Die größeren Abweichungen über 20% hängen mit der Streuung der Einzelwerte um ihren
Mittelwert zusammen. In 5 Fällen sind diese Streuungen zu beobachten, in denen der
Variationskoeffizient in einem Bereich von 33 bis 63% liegt. Die Einzelwerte der
Plattenmethoden sind im Kapitel 3.2.3 nachzusehen.
3.6.2 Ergebnisse der E. coli mit dem statistischen Prüfverfahren
Bei den Ergebnissen der E. coli wurden auch arithmetischer Mittelwert, Varianz,
Standardabweichung und Variationskoeffizienten berechnet.
Tabelle 3.39: E. coli-Keimzahlen mit dem statischen Prüfverfahren
x
Plattenmethoden Proben
s2
s
DesoxycholatAgar
ChromocultAgar
Regensiel
Haselknick
Wulksfelde
Dradenau
Regensiel
Haselknick
Wulksfelde
Dradenau
23
10
10
21
3
1
2
4
8,5
13
25
73
33,5
6,33
20
6,3
65
2,91
3,61
5
8,54
5,79
2,51
4,47
2,51
v
V*100%
0,13
0,36
0,50
0,40
1,93
2,51
2,23
0,63
13
36
50
40
193
251
223
63
Kapitel 3: Ergebnisse
Endo-C-Agar
Fluorocult-Agar
Regensiel
Haselknick
Wulksfelde
Dradenau
Regensiel
Haselknick
Wulksfelde
Dradenau
5
15
6
1
5
4
5
4
-8
58,3
1,25
6,3
23
12,5
6,3
7,64
1,12
2,51
4,79
3,5
2,51
0,50
0,18
2,51
1,19
0,70
0,63
50
18
251
119
70
63
Die Ergebnisse der Variationskoeffizienten zeigen, dass nur die Bestimmungsmethode in nur
2 von 15 Fällen präzise ist mit einem Variationskoeffizient unter 20%. Bei den anderen Fällen
wurden sehr große Ungenauigkeiten ermittelt, obwohl die Streuung der Einzelwerte um ihren
Mittelwert teilweise gering war. Aber der arithmetische Mittelwert ist bei den E. coliKeimzahlen sehr gering und dementsprechend die einzelne Kolonienzahl der Platten. Dies
könnte ein Grund für die höheren Variationskoeffizienten sein. Ein weiterer Grund dafür ist
die geringe Anzahl der Proben. Diese Faktoren beeinflussen die Ermittlung der
Variationskoeffizienten für die E. coli-Keimzahlen. Durch diese Vorgehensweise ist
festzuhalten, dass die Standardabweichung, Varianz und der Variationskoeffizienten mit
geringer Anzahl der Kolonien und der Proben nicht zu bewerten ist.
In der Tabelle sind Bemerkungen wie „keine“ angeführt. Hier konnte die
Variationskoeffizienten nicht ermittelt werden, da die Streuung der Einzelwerte gleich dem
arithmetischen Mittelwert war. Somit ist ein statisches Prüfverfahren nicht durchführbar.
3.7 Untersuchungen von Umweltproben
Zusätzlich zu den Hauptuntersuchungen mit den Parallelansätzen (4 Proben) wurden
Untersuchungen mit verschiedenen Wasserproben durchgeführt. Insgesamt wurden 107
Proben aus der Bille, Elbe, Alster, einige Sonderproben und dem Ablauf der Kläranlage
Dradenau, untersucht. Die Proben wurden parallel vom Amt für Umweltuntersuchungen mit
den routinemäßigen Methoden analysiert.
Coliforme Bakterien und Escherichia coli
Bei der Untersuchung natürlicher Umweltproben tritt beim Endo-C-Agar, im Vergleich zu
den Paralleluntersuchungen, zum Teil ein wesentlich stärkerer Bewuchs der Platten auf. Hier
wurde möglichtst frische Nährböden verwendet. Das Auszählen der Kolonien von coliformen
Bakterien und E. coli auf Endo-C-Agar wird dadurch erschwert. Obwohl eine Lampe zur
Identifizierung der Kolonien genommen wurde, könnten viele Kolonien nicht eindeutig als
coliforme Bakterien bzw. E. coli identifiziert werden.
Zur Sicherheit wurde ein Oxidase-Test durchgeführt. Durch die Oxidation von Sulfit wird der
Nährboden rot gefärbt. Da die Kolonien von coliformen Bakterien und E. coli jedoch durch
8
nicht berechenbar
66
Kapitel 3: Ergebnisse
eine Rotfärbung identifiziert werden, ist der Farbkontrast zwischen Kolonien und Nährboden
gering. Zudem bilden Begleitorganismen zum Teil farblich ähnliche Kolonien. Der
theoretisch grünschimmernde Fuchsinglanz bei Kolonien von E. coli war nicht immer
festzustellen.
Der Chromocult-Coliformen-Agar ermöglicht den simultanen Nachweis von coliformen
Bakterien und E. coli. Die Kolonien coliformer Bakterien sind theoretisch rosa-rot gefärbt, die
von E. coli dunkelblau-violett. Bei der Untersuchung der Gewässerproben war dieser
Farbunterschied nicht in allen Fällen deutlich zu erkennen. Einige Kolonien waren weder
eindeutig rosa-rot noch eindeutig dunkelblau-violett gefärbt. Zur Identifizierung der Kolonien
wurde auch ein Oxidase-Test vorgenommen.
Das Auszählen der Kolonien auf Desoxycholat-Agar sowie die Auswertung der MPNVerfahren und Colilert-18-Verfahren ergab dagegen keine gravierenden Unterschiede zu den
Parallelansätzen. Im Anhang (CD-Rom) sind die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung
von coliformen Bakterien und E. coli der verschiedenen Gewässerproben dargestellt. Die
Ergebnisse aller Proben zeigen eine sehr gute Übereinstimmung mit den Werten, die vom
Fachamt für Umweltuntersuchungen ermittelt wurden. Zudem liegen die Werte dicht
zusammen, es gibt keine signifikanten Abweichungen. Insgesamt sind die Keimzahlen der
Plattenmethoden vor allem Chromocult-Coliformen-Agar und Desoxycholat-Agar deutlich
über denen der MPN-Verfahren.
Auffallend sind die Minimalwerte beim Miniaturverfahren. Die Ergebnisse dieser Proben sind
im Anhang (CD-Rom) zu entnehmen.
3.8 Vergleich von Ergebnisse der Alster- und Elbeproben
In der Hygiene Institut Hamburg wird der Alster und die Elbe regelmäßig auf bestimmte
Parameter wie zum Beispiel E. coli, Coliforme Bakterien, Salmonellen, etc. untersucht. Hier
werden die Proben vom 2003 bis 2005 mit den Bestimmungsmethoden Desoxycholat-AgarVerfahren und Colilert-18-Verfahren ausgewertet.
3.8.1 Vergleich der Alsterproben mit den MPN-Verfahren
In diesem Abschnitt werden Vergleiche von den alten Proben aus Alster und Elbe
vorgenommen.
Zuerst werden die Proben aus der Alster 2003 – 2005 verglichen. Insgesamt werden 273
Proben, die während der Jahre 2003-2005 im Hygiene Institut Hamburg untersucht wurden,
behandelt.
Im Jahr 2003 wurden 44 Proben mit den MPN-Verfahren und dem Colilert-18-Verfahren
durchgeführt. Beim Vergleich zwischen den beiden Verfahren stellte sich heraus, dass das
Colilert-18-Verfahren bei den coliformen Bakterien geringfügigen Wert lieferte als das MPN67
Kapitel 3: Ergebnisse
Verfahren. Das Colilert-18-Verfahren zeigte einen Mittelwert von 3 KBE/ml und das MPNVerfahren einen Mittelwert von 2 KBE/ml.
Bei den fäkalcoliformen Bakterien lieferten beide Verfahren Ergebnisse unter 1 KBE/ml.
Diese Proben hatten keine Richtwertüberschreitungen gem. EG-Badegewässerrichtlinie. Es
wurden Informationen aus der Wetterdienststelle9 zur Wetterbeobachtung für das Jahr 2003
beschafft. Hier wurden die Wetterdaten vom April bis September ausgewertet. Auffallend
sind die Ergebnisse bei den Wettereigenschaften wie Regen und erhöhte Temperaturen. Es ist
festzuhalten, dass erhöhte Werte bei diesen Parametern häufiger auftraten. Da beide
Verfahren gleichzeitig durchgeführt wurden, sind die Ergebnisse der MPN-Verfahren und
Colilert-18-Verfahren kaum zu unterscheiden.
Im Jahr 2004 und 2005 wurde nur das MPN-Verfahren durchgeführt. Insgesamt waren, im
Jahr 2004, 149 Proben und im Jahr 2005, 80 Proben bearbeitet worden. Die Ergebnisse von
2004 bei den coliformen Bakterien zeigten einen Mittelwert von 15 KBE/ml und bei den
fäkalcoliformen Bakterien von 3 KBE/ml. In diesem Jahr sind die Ergebnisse deutlich höher
als im Jahr 2003. Der Grund dafür ist, dass im Jahr 2004 sehr hohe Temperaturen zwischen
den Monaten Juni bis Mitte September zu beobachten waren. Die Temperaturen lagen
teilweise über 30°C, was die starke Vermehrung der Bakterien erklären könnte. Außerdem
waren häufig auftretende Regenfälle ein Grund für die Grenzwertüberschreitungen gem. EGBadegewässerrichtlinien, die während 2004 zu verfolgen waren.
Im Gegensatz dazu waren die Ergebnisse im Jahr 2005 niedriger. Die coliformen Bakterien
lagen mit einem Mittelwert von 7 KBE/ml und die fäkalcoliformen Bakterien waren unter
einer Kolonie pro ml.
Der Vergleich bei den Alsterproben von 2003 bis 2005 beim MPN-Verfahren macht deutlich,
dass im Jahr 2004 die höchsten Werte an Koloniebildenden Einheiten zu finden sind. Wenn
andere Bestimmungsmethoden parallel zu den MPN-Verfahren durchgeführt worden wären,
würde man bessere und sichere Aussagen über die erhöhten Ergebnisse machen können.
3.8.2 Vergleich der Elbeproben mit verschiedenen Verfahren
Die Elbeproben werden in zwei Bereiche unterteilt. Der erste Bereich ist die „Kleine Elbe“
und der zweite die „Große Elbe“. Die „Kleine Elbe“ besteht aus den Probenahmestellen
Zollenspieker und Seemannshöft und die „Große Elbe“ aus 36 Probenahmestellen wie zum
Beispiel Cuxhaven Kugelbake, Hallerwettern, Glückstadt Nebenelbe etc.
3.8.2.1 Vergleich der Elbeproben aus der „Kleine Elbe“
Bei der Probenahmestellen Zollenspieker und Seemannshöft wurde das MPN-Verfahren und
das Desoxycholat-Agar-Verfahren durchgeführt.
9
Quelle: www.wetteronline.de
68
Kapitel 3: Ergebnisse
Im Jahr 2003 wurden insgesamt 9 Untersuchungen auf coliforme und fäkalcoliforme
Bakterien mit den beiden Bestimmungsmethoden für die Probe Zollenspieker vorgenommen.
Das Desoxycholat-Agar-Verfahren für diese Probestelle bei den coliformen Bakterien hatte
einen Mittelwert von 71 KBE/ml und bei den fäkalcoliformen Bakterien von 5 KBE/ml
geliefert.
An der Probenahmestelle Seemannshöft wurden im Jahr 2003 insgesamt 11 Proben
entnommen. Davon wurden 9 Proben auf coliforme und fäkalcoliforme Bakterien und 2
Proben nur auf fäkalcoliforme Bakterien untersucht. Der Anzahl der coliformer Bakterien
liegt beim Desoxycholat-Agar-Verfahren bei 39 KBE/ml und bei der Anzahl fäkalcoliformer
bei 6 KBE/ml. Mit dem MPN-Verfahren wurden Mittelwerte von 25 KBE/ml und bei den
fäkalcoliformen von 4 KBE/ml ermittelt. Hier ist festzustellen, dass der Desoxycholat-Agar
die höchsten Ergebnisse liefert.Bei der Auswertung der Wetterdaten für 2003 wurde
festgestellt, dass die Temperaturen zwischen Juni bis September recht hoch waren. Sie lagen
zwischen 20 – 35°C.
Die Proben, die im Jahr 2004 und 2005 untersucht wurden, zeigen die gleiche Rangordnung
der Verfahren. Das Desoxycholat-Agar-Verfahren zeigte immer die höheren Mittelwerte.
Teilweise sind die Mittelwerte der Desoxycholat-Agar-Verfahren 5-7fach höher als die der
MPN-Verfahren. Der Grund dafür ist, dass auf Desoxycholat-Agar auch weitere
thermotolerante Bakterien wachsen.
Bei diesen Proben wurde auch beobachtet, dass bei Regenwetter höhere Keimzahlen zu
ermitteln waren. Der Regen verursacht eine zusätzliche Nährquelle für Bakterien, die diese
Nährstoffe in ihrem Stoffwechsel aufnehmen. Die Temperaturen im Jahr 2004 und 2005 lagen
zwischen 20 – 32°C, die auch eine Begünstigung für die Vermehrung der coliformen
Bakterien darstellt. Teilweise wurde sogar in einigen Tagen die Erhöhung der Temperaturen
über 30°C beobachtet, die sich bei den Ergebnissen der Desoxycholat-Agar-Verfahren
widerspiegeln.
Allgemein betrachtet liegen die coliformen sowie auch die fäkalcoliformen Bakterien unter
den Leit- und Grenzwerten der EG-Richtlinien.
3.8.2.2 Vergleich der Elbeproben aus der „Große Elbe“
Im Jahr 2004 wurden vier Untersuchungen10 und 2005 wurden fünf Untersuchungen der
„Große Elbe“ mit 36 Proben durchgeführt.
Diese Untersuchungen wurden mit dem Colilert-18-Verfahren bearbeitet. Bei diesen Proben
werden für 2004 und 2005 vier Untersuchungen aus den Stellen von Vogelsand Norderelbe
bis zur Oberhalb Elbstorf, Geesthacht Proben ausgewertet.
Die Keimzahlen der coliformen und fäkalcoliformen Bakterien sind in diesen Jahren sehr
gering. Deshalb wird die Koloniebildende Einheiten in 100 ml Wasserprobe angegeben.
10
Summe der bearbeitende Proben
69
Kapitel 3: Ergebnisse
Die Ergebnisse im Jahr 2004 liefern im Vergleich zu 2005 höhere Mittelwerte. Im Jahr 2004
liegen beim Colilert-18-Verfahren die coliformen Bakterien bei 2314 KBE pro 100 ml und die
fäkalcoliformen Bakterien bei 42 KBE pro 100 ml. Der Mittelwert der coliformen Bakterien
ist erheblich höher als der von fäkalcoliformen Bakterien.
Der Sommer 2004 hatte hohe Temperaturen von 25-35 °C, die optimale Bedingungen für die
Vermehrung der coliformen Bakterien hindeutet. Die fäkalcoliformen Bakterien hatten nicht
dieselben Bedingungen wie von den coliformen Bakterien. Deshalb könnte keine Vermehrung
stattfinden.
Die Ergebnisse im Jahr 2005 waren niedriger als im Jahr 2004. Aber die fäkalcoliformen
Bakterien waren im Gegensatz zu den Fäkalcoliformen im Jahr 2004 sehr hoch. Der
Mittelwert der fäkalcoliformen Bakterien beträgt 104 KBE pro 100 ml und der von
coliformen Bakterien 1392 pro 100 ml.
Allgemein betrachtet liegen die Ergebnisse der coliformen und fäkalcoliformen Bakterien
unter den Leit- und Grenzwerten der EG-Richtlinien.
70
Kapitel 4: Schlussfolgerungen
4. Schlussfolgerungen
4.1 Analytische Qualitätssicherung für coliforme Bakterien
Bei der quantitativen Analytik von biologischen Parametern sind bislang nur wenige
Maßnahmen zur analytischen Qualitätssicherung im Einsatz. Als grundlegendes Element der
statistischen Datenkontrolle quantitativer Bestimmungen gelten Kontrollkarten. Die
Verwendung der Kontrollkarten zur analytischen Qualitätssicherung mit Hilfe von
Referenzmaterial, führt zu einer übersichtlichen Darstellung der Ergebnisse. Während der
experimentellen Untersuchungen wurden nur Referenzmaterial für die qualitative
Bestimmung der Verfahren verwendet. Aufgrund dessen konnte keine Anwendung der
Kontrollkarten stattfinden.
Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von coliformen und fäkalcoliformen
Bakterien wurden daher verschiedene bewährte Verfahren eingesetzt. Es wurden SelektivNährböden, wie zum Beispiel Desoxycholat-Agar, Chromocult-Coliformen-Agar, Endo-CAgar und Fluorocult-ECD-Agar angewendet. Zusätzlich wurde das MPN-Verfahren als
Dreifachansatz, MPN-Miniaturverfahren, Colilert-18-Verfahren und das
Membranfiltrationsverfahren eingesetzt.
Die Vorgehensweise dieser experimentellen Untersuchung beruht auf statistischen Verfahren.
Die einzelnen Verfahren werden mit vier Proben, die drei, vier und fünf Parallelansätze pro
Versuchsreihe enthalten, durchgeführt. Die sich daraus ergebenden Mittelwerte, Varianzen,
Standardabweichungen, sowie Variationskoeffizienten werden für die Auswertung
herangezogen. Aufgrund der auftretenden Streuung und damit einer oft beträchtlichen
Variabilität, finden die statistischen Verfahren bei den quantitativen Untersuchungen eine
Anwendung. Es ist zu bemerken, dass aus der Vielfalt der Bestimmungsmethoden nur bei den
Plattenmethoden eine statistische Auswertung durchgeführt wird.
Insgesamt betrachtet ist der Chromocult-Coliformen-Agar der Nährboden, der das höchste
Koloniewachstum zeigt. Als zweites kommt das Desoxycholat-Agar für die coliformen
Bakterien. Das Colilert-18-Verfahren zeigt die nächstkleinste Keimzahlbelastung. Dann folgt
das Membranfiltrationsverfahren mit den coliformen Bakterien. Anschließend kommt das
Endo-C-Agar und zum Schluss das MPN-Verfahren.
Die Ermittlung der Varianzkoeffizienten bei den einzelnen Proben zeigt, dass das
Desoxycholat-Agar-Verfahren die geringsten zufälligen Fehler hervorruft. Hier ist die
Streuung der Einzelwerte um ihren Mittelwert gering und damit ist die Präzision der
Bestimmungsmethode bedeutend. Dies spiegelt sich bei den Ergebnissen nach der
Differenzierung der Plattenmethoden wieder. Hier zeigt das Desoxycholat-Agar-Verfahren
prozentual die niedrigsten falsch-positiven Anteile, im Gegensatz zu dem ChromocultColiformen-Agar und dem Endo-C-Agar. Der Desoxycholat-Agar steht an erster Stelle mit
einem Anteil von 38% (Tab. 3.7). Die Differenzierung der coliformen Bakterien wird durch
einen Oxidase-Test, für Endo-C-Agar sowie Chromocult-Coliformen-Agar, und eine Bunte
Reihe für Desoxycholat-Agar durchgeführt. Bei der Differenzierung mit dem Oxidase-Test
70
Kapitel 4: Schlussfolgerungen
steht der Endo-C-Agar an zweiter Stelle. Er zeigt einen falsch-positiven Anteil an coliformen
Bakterien von 63% (Tab. 3.6).
Der Chromocult-Coliformen-Agar ist ein Nährboden, der die höchsten falsch-positiven
Ergebnisse mit einem Anteil von 81 % anzeigt. Die prozentualen Anteile sind als Mittelwert
der einzelnen Verfahren zusammengefasst.
4.2 Analytische Qualitätssicherung für fäkalcoliforme Bakterien (E. coli)
Die E. coli-Keimzahlen unterscheiden sich von den Keimzahlen der coliformen Bakterien.
Der Desoxycholat-Agar zeigt das höchste Koloniewachstum von allen Verfahren. Die
zweithöchste Keimzahl liefert der Endo-C-Agar. Dann folgt der Fluorocult-ECD-Agar, der
nur für die Bestimmung von E. coli dient. Als nächstes folgt das MPN-Verfahren, dem der
Chromocult-Coliformen-Agar und das Membranfiltrationsverfahren, mit den gleichen
KBE/ml, folgen. Das Colilert-18-Verfahren zeigt die kleinste Keimzahlbelastung von E. coli
an.
Die Validierung der Plattenmethoden mit statistischen Prüfverfahren und die Interpretation
ihrer Ergebnisse sind kompliziert, da sie bei den fäkalcoliformen Bakterien einen erheblichen
Grund an Variabilität aufweisen. Hier ist nur das Desoxycholat-Agar-Verfahren, das einen
prozentuellen Mittelwert der Variationskoeffizienten von 35% liefert. Bei den anderen
Plattenmethoden sind sehr große Abweichungen, die teilweise bis zu 100% erreichen, zu
beobachten. Der Grund für große Abweichung ist die geringe Anzahl der Proben sowie auch
der vorhandenen Kolonien auf den Nährböden. Daraus ergibt sich, dass ein statistisches
Prüfverfahren nur mit höherer Anzahl von Proben durchzuführen ist.
Der Chromocult-Coliformen-Agar zeigt kein Unterschied durch die Differenzierung mit
einem Oxidase-Test. Dies macht deutlich, dass der Chromocult-Agar bei den fäkalcoliformen
Bakterien keine falsch-positiven Ergebnisse liefert. Bei der Differenzierung der Endo-C-Agar
mit dem Oxidase-Test liefert das Verfahren einen Anteil von 30% (Tab. 3.23). Der
Desoxycholat-Agar zeigt durch die Differenzierung einen Anteil an falsch-positiven Kolonien
von 74% (Tab. 3.22).
Das Miniaturverfahren wird gesondert in 7 Wasserproben mit dem Colilert-18-Verfahren und
den verschiedenen Plattenmethoden verglichen. Der Vergleich zwischen Colilert-18Verfahren und Miniaturverfahren macht deutlich, dass der Colilert-18 höhere Ergebnisse
liefert. Hier ist eine Verdopplung der festgestellten E. coli-Keimzahlen zu beobachten (Tab.
3.36). Bei den Plattenmethoden ist der Desoxycholat-Agar an erster Stelle mit den E. coliKeimzahlen (Tab. 3.37). Die Reihenfolge der Plattenmethoden, bei den 7 Wasserproben,
haben die gleiche Reihenfolge der E. coli-Keimzahlen der Hauptuntersuchung11.
Insgesamt liefert das Miniaturverfahren niedrigere E. coli-Keimzahlen. Es liegt an letzter
Stelle bei allen Verfahren.
11
Parallelansätze von 4 Proben
71
Kapitel 4: Schlussfolgerungen
4.3 Bewertung der Bestimmungsmethoden
Die Ergebnisse der Keimzahlbestimmung mit den Parallelansätzen bei coliformen Bakterien
und anschließend die statistische Auswertung (Kapitel 3.5 3) führen zu der Erkenntnis, dass
die Anwendung des Desoxycholat-Agar-Verfahrens von Oxoid bei den Plattenmethoden die
zuverlässigste Methode darstellt. Die Durchführung sowie die Auswertung auf dem hellroten
Nährboden sind einwandfrei. Im Vergleich dazu kann der Chromocult-Coliformen-Agar für
coliforme Bakterien nicht empfohlen werden. Dieses Verfahren liefert keine ausreichend
präzisen Ergebnisse, wie durch die Differenzierung mit einem Oxidase-Test und die
statistische Auswertung ermittelt wurde. Im Gegensatz dazu zeigte das ChromocultColiformen-Agar bei den fäkalcoliformen Bakterien präzise Ergebnisse, die durch die
Differenzierung bestätigt wurde. Die Durchführung sowie die Auswertung der Ergebnisse auf
dem hellen Nährboden erfolgten dagegen problemlos.
Der Fluorocult-ECD-Agar bewies, dass sie zuverlässige Ergebnisse liefert. Die E. coliKeimzahlen blieben selbst durch die Indolprüfung unverändert. Als vorteilhaft ist der helle
Nährboden für die Identifizierung der hellblau fluoreszierenden Kolonien sehr gut geeignet.
Im Gegensatz dazu ist die Saugfähigkeit der Fluorocult-Agar begrenzt und somit besitzt das
Verfahren einen erheblich großen Arbeitsaufwand sowie auch Materialaufwand.
Die Verwendung von Endo-C-Agar kann aufgrund der unbefriedigenden Ergebnisse, die sich
auch während der ersten Differenzierung der Colilert-18-Verfahren bewiesen hat, sowie der
Schwierigkeit beim Auszählen der Kolonien nicht empfohlen werden. Generell sollte dieser
Nährboden wegen seiner gesundheitlich bedenklichen Wirkstoffe nicht für den täglichen
Gebrauch eingesetzt werden.
Bei den Colilert-18-Verfahren, MPN-Verfahren, Miniaturverfahren und
Membranfiltrationsverfahren wurden keine statistischen Prüfverfahren angewendet.
Die Ergebnisse der Keimzahlbestimmung mit den Parallelansätzen führen zu der Erkenntnis,
dass die Anwendung des Colilert-18-Verfahrens von Idexx die zuverlässigste Methode
darstellt. Bei der Auswertung der Ergebnisse des Colilert-18 ist ein Verdacht auf falschpositive Ergebnisse entstanden. Durch die zweite Differenzierung mit der „Langen Bunten
Reihe“ wurde bestätigt, dass die untersuchten Kolonien coliforme und auch fäkalcoliforme
Bakterien sind. Das Verfahren ermöglicht den endgültigen Nachweis der coliformen und
fäkalcoliforme Bakterien in einem Anreicherungsschritt innerhalb von 18 Stunden.
Die Durchführung sowie die Auswertung der MPN-Verfahren (Mehrfachansatz) mit 3
Parallelansätzen können nicht empfohlen werden. Dieses Verfahren liefert keine ausreichend
präzisen Ergebnisse. Hinzu kommt der erheblich höhere Arbeits- und Materialaufwand. Für
das miniaturisierte MPN-Verfahren mit Mikrotiterplatten hingegen ist eine ausreichende
statistische Sicherheit durch die hohe Zahl an Parallelansätzen gewährleistet. Die Beimpfung
der Mikrotiterplatten mit Hilfe des speziellen Zubehörs lässt sich wesentlich schneller und
übersichtlicher als das Pipettieren bei einem MPN-Mehrfachansatz durchführen. Die optische
Auswertung der bebrüteten Mikrotiterplatten ist problemlos. Dieses Verfahren zeigt bei allen
Untersuchungsverfahren die niedrigste E. coli-Keimzahlen. Deshalb ist das Verfahren für
72
Kapitel 4: Schlussfolgerungen
Proben mit Vorinformation auf die Keimbelastung bzw. für die Untersuchung von
Abwasserproben geeignet.
Die Verwendung der Membranfiltrationsverfahren kann nur für Proben mit Vorinformation
empfohlen werden. Die Durchführung ohne den geeigneten Verdünnungsfaktor liefert keine
Ergebnisse aufgrund des massenhaften Koloniewachstums. Hierzu kommt noch der erheblich
größere Zeitaufwand des Verfahrens. Die Tabelle 4.1 zeigt eine Übersicht über den
Materialaufwand für die einzelnen Verfahren.
Tabelle 4.1: Materialkosten der unterschiedlichen Flüssig- und Festnährböden
Methode
Plattenverfahren:
Desoxychoalt-Agar
Chromocult-Coliformen-Agar
Endo-C-Agar
Fluorocult-ECD-Agar
MPN-3er Ansatz
Colilert-18-Verfahren
Miniaturverfahren mit
Mikrotiterplatten
Membranfiltrationsverfahren
Materialkosten in € für einen Bestimmungstest
(1 Platte)
0,72
0,35
0,35
1,19
5,4
(9 Röhrchen)
5,65
11,12
(1 Platte)
1,15
Beim Vergleich aller Verfahren zur Bestimmung von Coliformen lässt sich feststellen, dass
das Einmischverfahren mit Desoxycholat-Agar nach der Differenzierung mit der Bunten
Reihe, und der Colilert-18-Verfahren die besten Resultate liefert.
Beim Vergleich der Verfahren zur Bestimmung von E. coli lässt sich feststellen, dass der
Oberflächenausstrich mit Fluorcult-ECD-Agar, Chromocult-Coliformen-Agar, Colilert-18Verfahren und das Miniaturverfahren die präzisen Ergebnisse liefern.
Die Tabelle 4.2 und 4.3 zeigen eine Zusammenfassung über die Bewertung der einzelnen
Verfahren.
Tabelle 4.2 Zusammenfassung über die Bewertung der Bestimmungsmethoden für coliforme
Bakterien
Bestimmungsmethoden für coliformen Bakterien
BestimmungsDurchführung Oxidase- Bunte Bebrütungs- MaterialMethoden:
Test
Reihe
zeit
aufwand
12
Chromocult-Agar
++
x
++
++
Desoxycholat-Agar
+
x
++
+
Endo-C-Agar
-x
++
++
MPN-Verfahren
Colilert-18-Verfahren
+
x
++
Membranfiltationsx
-+
verfahren
Zuverlässigkeit
-+
-++
0
Bewertungsmerkmale: sehr schlecht:“ -- „ schlecht:“ - „ trifft nicht zu:“ 0 „ gut:“ + „ sehr gut:“++ „
12
durchgefüht
73
Kapitel 4: Schlussfolgerungen
Tabelle 4.3 Zusammenfassung über die Bewertung der Bestimmungsmethoden für
fäkalcoliforme Bakterien
Bestimmungsmethoden für fäkalcoliforme Bakterien
BestimmungsDurchführung Oxidase- Bunte Bebrütungs- MaterialMethoden:
Test
Reihe
zeit
aufwand
Chromocult-Agar
++
x
++
++
Desoxycholat-Agar
+
x
++
+
Endo-C-Agar
-x
++
++
Fluorocult-ECD-Agar
++
+
MPN-Verfahren
Colilert-18-Verfahren
+
x
++
Miniaturverfahren
++
-Membranfiltationsx
-+
verfahren
Zuverlässigkeit
++
-++
++
++
0
Bewertungsmerkmale: sehr schlecht:“ -- „ schlecht:“ - „ trifft nicht zu:“ 0 „ gut:“ + „ sehr gut:“++ „
74
Kapitel 4: Zusammenfassung
Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg
Fachbereich Naturwissenschaftliche Technik
Sabani Serani, Dzevrije
Studiengang: Biotechnologie
Zusammenfassung der Diplomarbeit
Thema: „Experimentelle Prüfung verschiedener Methoden der quantitativen Bestimmung
gesamtcoliformer und fäkalcoliformer Bakterien (E. coli) für die qualitative Bewertung von
Wasserproben“.
Zur Optimierung der analytischen Qualitätssicherung bei der quantitativen Bestimmung von
gesamtcoliformen und fäkalcoliformen Bakterien in Wasserproben, wurden im
Hygieneinstitut Hamburg, Untersuchungen mit mehreren Bestimmungsmethoden
durchgeführt. Neben verschiedenen Plattenmethoden wurde das MPN-Verfahren als
Dreifachansatz, MPN-Miniaturverfahren mit Mikrotiterplatten, Colilert-18-Verfahren und das
Membranfiltrationsverfahren eingesetzt. Die einzelnen Verfahren wurden mit vier Proben, die
drei, vier und fünf Parallelansätze pro Versuchsreihe (Hauptuntersuchung) enthielten,
durchgeführt.
Die Auswertung der Ergebnisse der Plattenmethode erfolgte mit Hilfe von weiteren
Differenzierungen und von statistischen Prüfverfahren. Die Differenzierung wurde durch ein
Oxidase-Test, für Endo-C-Agar sowie Chromocult-Coliformen-Agar und einer Bunte Reihe
für Desoxycholat-Agar durchgeführt. Eine weitere Differenzierung wurde bei dem Colilert18-Verfahren mit der Langen Bunten Reihe vorgenommen.
Bei der statistischen Prüfverfahren wurden die arithmetischen Mittelwerte, Varianzen,
Standardabweichungen, sowie Variationskoeffizienten zur Auswertung der Ergebnisse
herangezogen. Es ist zu bemerken, dass aus der Vielfalt der Bestimmungsmethoden nur bei
den Plattenmethoden eine statistische Auswertung durchgeführt wurde.
Es stellt sich heraus, dass ein statistisches Prüfverfahren mit geringer Anzahl von Proben in
der bakteriologischen Wasseruntersuchung nicht zu empfehlen ist. Deshalb sind die
Differenzierungen der experimentellen Untersuchungen von Bedeutung.
Die quantitative Bestimmung von coliformen Bakterien ergibt, dass das Desoxycholat-AgarVerfahren der Firma Oxoid und das Colilert-18-Verfahren der Firma Merck die quantitativ
besten Ergebnisse liefern. Für den Nachweis von E. coli eignet sich vor allem der FluorocultECD-Agar, Chromocult-Coliformen-Agar, sowie Colilert-18-Verfahren der Firma Merck.
Das Miniaturverfahren der Firma Bio Rad GmbH ist ebenfalls geeignet.
Der Vergleich zwischen realen Umweltproben und Parallelansätzen der Hauptuntersuchung
stimmen überein. Diese Feststellung bestätigt, dass die empfohlenen Bestimmungsmethoden
die optimalen Verfahren zur quantitativen Bestimmung der gesamtcoliformen und
fäkalcoliformen Bakterien sind.
75
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Zählung von Escherichia coli und coliformen Bakterien (Entwurf prEN ISO 9308-1),
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method für determining Escherichis coli counts in surface waters – MU/EC methos,
Marnes-La-Coquette, 1991
Anhang:
FREIE UND HANSESTADT HAMBURG
Behörde für Umwelt und Gesundheit
Hygiene Institut
Hamburg
Abteilung Mikrobiologischer Verbraucherschutz- Nationales Referenzzentrum
Probenaufbereitung: Ablaufprotokoll
EDV-Dateneingabe: keine
Proben-Bearbeitung: Sabani Serani
Probenaufkleber: Oberflächengewässer; Billeprobe 4
Salmonella/Enterobateriaceae
Indol
negativ
Lactose
positiv
Glucose/Gas
positiv/ positiv
Saccharose
positiv
Harnstoff
negativ
Adonit
negativ
Salicin
positiv
Arabinose
positiv
Dulcit
negativ
Inosit
positiv
Rhamnose
positiv
Trehalose
positiv
Xylose
positiv
Maltose
positiv
Mannit
positiv
Sorbit
positiv
Kligler/H2S
negativ/negativ
Beweglichkeit
negativ
Citrat
positiv
Voges Proskauer
positiv
Methylrot
negativ
LDC
negativ
ODC
positiv
ADH
positiv
L(+) d-Tartrat
negativ
Mucat
positiv
Malonat
positiv
ONPG
positiv
KCN
positiv
Gelatinase
positiv
PAD
negativ
Nitrat
positiv
Oxidase
negativ
Cellobiose
positiv
Melibiose
positiv
Raffinose
positiv
Ergebnis: Enterobacter eloacae
77
Datum: 26.10.2005