Reinigung und Eigenschaften einer ß-N-Acetyl-D

E. BUDDECKE UND E. W ERRIES
798
Reinigung un d Eigenschaften
einer ß-N-Acetyl-D-hexosaminidase* aus Rindermilz
V on E.
B
uddecke
und E.
W
e r r ie s
Aus dem Physiologisch-Chemischen Institut der Universität Tübingen
(Direktor: Prof. Dr. Dr. G. W e i t z e l )
(Z. Naturforschg. 19 b. 798—800 [1964] ; eingegangen am 2. Juni 1964)
An exo-/?-./V-acetylhexosaminidase is purified from bovine spleen homogenate. Several synthetic
/?-A-acetylglycosaminides and natural glycosides such as oligo-saccharides from chondroitin 4-sulfate-protein, glycopeptides from ovine submaxillaris mucin and mucopeptides from E. coli are found
to be substrates for the enzyme. The mode of enzyme action, the influence of activators and com­
petitive and noncompetitive inhibitors are investigated.
Bei unseren U ntersuchungen über das Enzym ­
m uster von A rteriengew ebe w urde in der A orta des
R indes eine /?v/V-Acetyl-D-hexosaminidase nachgew ie­
sen, deren V orkom m en bisher in verschiedenen tie ri­
sc h e n 1-4 und pflanzlichen4,5 Geweben sowie in
M ik ro o rg an ism en 5> 6 beschrieben w orden w ar. Bei
ein er D urchm usterung w eiterer tierischer O rgane
w urden von uns A ktivitäten auch im K norpelgew ebe,
im G laskörper des Auges und in der Milz des Rindes
gefunden.
Im H inblick auf die mögliche F unktion dieses
Enzym s beim A bbau der stoffwechselaktiven sauren
G lykosam inoglykane m esenchym aler Gewebe erschien
eine R einigung, C harakterisierung und A bgrenzung
des Spezifitätsbereiches dieses Enzym s notw endig.
Die kürzlich beschriebene A nreicherung und Oligosaccharidase-W irkung
einer
/?-A^-Acetyl-D-hexosam inidase aus R inderleber 7 geben A nlaß, die E rg eb ­
nisse unserer U ntersuchungen an einer /?-V-AcetyID -hexosam inidase aus R inderm ilz vorzulegen.
a ) R ein igu n g
Die A ktivität (1 E inheit = diejenige A ktivität, die
bei 3 7 ° unter optim alen B edingungen in 1 Min. die
U m w andlung von 1 //M ol S ubstrat katalysiert) im
R inderm ilzhom ogenat beträgt 0,01 IE. F raktionierte
A m m onsulfatfällungen führen zu einer ca. 40-fachen
A nreicherung, liefern jedoch keine chrom atographisch
* Systematischer Name: /?-2-Acetylamino-2-deoxy-D-glucosidacetylaminodeoxy-glucohydrolase (3.2.1.30).
1 K. W a t a n a b e , J. Biochemistry [Tokyo] 24, 297 [1936].
2 J. C o n c h y , J. F i n d l a y u . G. L e w y , Biochem. J. 71, 318
[1959].
3 J. C o n c h y , J. F i n d l a y u . G. L e w y , Nature [London] 183,
615 [1959],
R einigungsschritt
ü b erstan d des
H om ogenates
C itratextrakt
p h 4,6
Fällung mit
(NH4)2S04
(1 0 -3 0 % )
Fällung m it
(N H 4)2S 0 4
(20—30%)
Chromatographie
an TEAE-Cellulose
Reehrom atographie
an TEAE-Cellulose
Chromatographie
an CM-Cellulose
% aktives
E nzym protein
A n­
reiche­
rung
spezifische
A ktivität
(Enzym ­
einheiten) *
100
1
0,01
11
7
0,069
3,7
14
0,138
0,9
42
0,427
0,18
126
1,26
1000
10**
0,024
0,0008
20000
210***
Tab. 1. Reinigung der /?-./V-y4cetyl-D-hexosaminidase aus Rin­
dermilz. * Stubstratumsatz in ^Mol freigesetzten Aglykons
(Phenol)/M in./m g Protein bei 37°. ** Unter Zusatz von
0,01% krist. Rinderserumalbumins. *** Unter Zusatz von
0,01% krist. Rinderserumalbumins und 0,01-m. KCN.
einheitlichen P rodukte. E rst die dreistufige C hro­
m ato g rap h ie an TEAE- und CM-Cellulose m it Salzg radienten-E lution erg ib t unter W iedergew innung
von ca 6 0 % der A ktivität hochgereinigte P räp arate,
die frei von F rem daktivitäten (/?-Galaktosidase, a-,
/^-Glucosidase, /^-Glucuronidase, Peptidase, Protease)
sind und deren A ktivität diejenige der reinsten bis4 J. W . W o o l l e n , P . G. W a l k e r u . R. H e y w o r t h , Biochem. J.
79, 294 [1961],
5 B. H e l f e r i c h u . A. I l o f f , Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem.
2 2 1 , 252 [1933].
0 D . M a a s s , H . P e l z e r u . W . W e i d e l , Z. Naturforschg. 1 9 b .
413 [1964].
7 B. W e i s s m a n n , S. H a d j i i o a n n o u u . J. T o r n h e i m , J. biol.
Chemistry 2 3 9 . 59 [1964].
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/S-TV-ACETYL-d-HEXOSAMINIDASE AUS RINDERMILZ
her beschriebenen P rä p a ra te 7 aus O rganen m it ver­
gleichbarer A ktivität im H om ogenat um das etwa
6-fadie übertrifft. Die bei den einzelnen R einigungs­
schritten erhaltene A ktivitätsanreicherung ist in
T ab. 1 zusam m engestellt.
b ) S p ezifitä t u n d W irk u n g sb ed in g u n g en
D as gereinigte Enzym spaltet verschiedene synthe­
tische und natürliche /?-./V-Acetylglykosaminide, wo­
bei die Spezifität bezüglich der G lykosidkom ponente
streng auf die A m inozucker G lucosam in und Galaktosam in, bezüglich der anom eren K onfiguration aus­
schließlich auf /?-glykosidische B indungen beschränkt
ist. D agegen bestehen fü r die S tru k tu r des A glykons
b reite V ariationsm öglichkeiten.
799
S paltprodukte un ter der E inw irkung an d e rer Enzym e
entstehen und durch /f-A'-Acetyl-D-hexosaminidase
w eiter abgebaut w erden können.
a)
C h o n d ro itin su lfatp ro te in 8, die chemisch und
physikochem isch definierte native Z ustandsform des
C hondroitin (4) -sulfats erg ib t nach A bbau m it Testes­
h yaluronidase und /^-Glucuronidase O ligosaccharide,
aus denen durch hochgereinigte /?-./V-Acetyl-D-hexosam inidase freies A'-A cetylgalaktosam in (II) abge­
spalten w ird und zusam m en m it G lucuronsäure
chrom atographisch von O ligosacchariden (I) des I n ­
k ubationsansatzes abg etren n t und identifiziert w er­
den kann (Abb. 1 ). D ie absolute anom ere Spezifität
des Enzym s erlau b t den Schluß ü b er das V orliegen
einer /?-./V-Acetylgalaktosaminidischen B indung im
1. S yn th etisch e S u b stra te
Die fü r die geprüften synthetischen S ubstrate am
hochgereinigten Enzym erm ittelten M i c h a e l i s K onstanten betrugen fü r /?-Phenyl-/V-Acetylglucosam inid
2,0 • 1 0 ~ 3-m.,
y^-p-Nitrophenyl-A^-Acetylglucosam inid l,4 * 1 0 - s -m. u n d fü r /?-Phenyl-/VA cetyl-galaktosam inid 1,1 • 1 0 _3-m.
N eben der /J-A^-Acetyl-D-hexosaminidase ist in
R inderm ilz eine a-V -A cetylhexosam inidase nachw eis­
bar, die das a-Phenyl-./V-Acetylglucosaminid spaltet.
D er A ktivitätsquotient b etru g im H om ogenat 3 0 0 :1 ,
in der zweiten A m m onsulfatfraktion 3 0 0 0 :1 . In den
säulenchrom atographisch gereinigten F rak tio n en ist
eine
a-/V-Acetyl-D-hexosaminidase-Aktivität nicht
m ehr nachw eisbar.
D urch P rü fu n g w eiterer a- und /^-Glykoside
[G lc (l-4 )G lc , G a l(1 - 6 ) G lc (1 -2) /?-Fr, G lc (l-2 )£ -F r,
/?-p-N itrophenylglucosid, S alicin, Gal ß ( 1-4) Glc und
/?-P henolphthaleinglucuronid] konnte ausgeschlossen
w erden, daß das hochgereinigte Enzym a- bzw.
/?-glucosidische, galaktosidische oder /?-glucuronidische W irkung besitzt.
2 . N atü rlich e S u b stra te
N eben den bisher als natürliche S u b strate bek an n ­
ten O ligosacchariden aus H y alu ro n at, C hondroitin(4)sulfat und C hondroitin (6) -sulfat, u n ter denen das
n äh e r untersuchte T risaccharid aus H yaluronat
(A-U-A) eine K m von 1 5 ,4 - 1 0 _3-m. b e s itz t7, fanden
w ir drei w eitere natürliche S ubstrate, die p rim ä r als
8 E. B u d d e c k e , W. K r ö z u. E. L a n k a , Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem. 331, 196 [1963].
Abb. 1. Trennung enzymatischer Abbauprodukte von Chon(lroitinsulfatprotein (Inkubationsansatz: 5 mg Chondroitin­
sulfatprotein, 300 E Testeshyaluronidase, 120 Fishman E ßGlucuronidase, 0,1 IE /?-./V-Acetyl-D-hexosaminidase in 2 ml
Acetatpuffer, 37°, 96 Stdn.) an Sephadex G 25 med. (Säulen­
volumen 35 ml = 1,2-30 cm ). I = ChondroitinsulfatproteinOligosaccharide, II = freies A^-Acetylgalaktosamin und Glu­
curonsäure. Ordinate: Extinktionswerte der Carbazolreaktion.
C hondroitin ( 4 ) -sulfat, die bisher n u r in d irek t auf
G rund der negativen optischen D rehung angenom ­
m en w urde. Das E rgebnis w eist fern er auf die m ög­
liche biologische B edeutung der /?-V-Acetyl-D-hexosam inidase beim A bbau des C h o n d ro itin ( 4 ) -sulfatP ro tein hin, dessen biologische H albw ertszeit im
R ippenknorpel der R atte ca. 5 T age b e tr ä g t9.
* J. I. G r o s s , M . B . M a t h e w s
mistry 235, 2889 [1960].
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u.
A.
D o rfm a n ,
J. biol. Che-
800
/?-iV-ACETYL-D-HEXOSAMINIDASE AUS RINDERM ILZ
b) Aus dem S ubm axillarism ucin vom Schaf (OSM
) 10 lassen sich durch proteolytischen A b­
bau und nach B ehandlung der S paltprodukte m it
N eu ram inidase (R D E ) G lykopeptide gew innen, die
als prosthetische G ruppe lediglich V-Acetylgalaktosam in in O -glykosidischer B indung an Seryl- bzw.
T hreonylreste enthalten. U nter p ro tra h ie rte r E inw ir­
kung (6 Tage) der /?-V-Acetyl-D-hexosaminidase
(zweite A m m onsulfatfraktion) w ird V-Acetylgalaktosam in aus solchen G lykopeptiden nahezu q u an ti­
tativ (94,7% ) abgespalten, doch ist h ie rfü r die M it­
w irkung von (in der A m m onsulfatfraktion v o rh an ­
denen) P eptidasen erforderlich. Im Gegensatz zu den
b isher bekannten synthetischen und natürlichen S ub­
straten handelt es sich beim A glykon hier nicht um
ein K ohlenhydrat, sondern um eine A m inosäure. Das
Enzym ist also in der Lage, die zwischen K ohlen­
h y d rat und P eptidkette bestehende glykosidische B in­
dung bei O SM -G lykopeptiden zu lösen n * *.
c) U nter den nach L ysozym abbau von B akterien­
zellw änden (E scherichia c o li) anfallenden M uco­
p eptiden w urde ein V-Acetylglucosam inyl- (1-4) NA cetylm uram insäurepeptid ( C5 ) 12 als S ub strat ge­
p rü ft. In n erh alb 5 Stdn. w urden m it hochgereinigter
/?-V-Acetyl-D-hexosaminidase ca. 30% des V-Acetylglucosam ins abgespalten und m it der M o r g a n E l s o n - R eaktion nachgew iesen **.
Die V ersuche m it den natürlichen Substraten zei­
gen, daß die isolierte /?-V-Acetyl-D-hexosaminidase
als Exoenzym an O ligosacchariden fungiert. P oly ­
m eres C hondroitin 4-sulfat und H yalu ro n at w erden
von /?-V-Acetyl-D-hexosaminidase auch bei sim ul­
tan er E inw irkung von /^-Glucuronidase nicht ange­
griffen, ebenso das G lykopeptid aus Schafsubm axillarism ucin nicht, solange S ialin säu re m it V-Acetylg alaktosam in glykosidisch verknüpft w ar.
G
o ttsc h a lk
des am pn-O ptim um gem essenen W ertes. A ktivitäts­
m essungen bei 3 7 ° ergeben um 30 —40% höhere
W erte als bei 2 5 ° . D as Enzym ist bei 3 7 " ü b er eine
Stde. beständig, w ird jedoch im V erlaufe von
48 Stdn. in ak tiv iert. Bei einer S u b stratk o n zen tratio n
von 10 mM ol /?-Phenyl-V -A cetylglucosam inid im
Testansatz ak tiv iert R in d erseru m alb u m in in einer
E n dkonzentration von 0,01% um ca. 180 —200% .
Das A usm aß der A ktivierung steigt m it zunehm en­
der S u b stratk o n zen tratio n . Gleiche A ktivierungs­
effekte zeigen C yanid und das synthetische P olykation
Oligo - N - m ethyl - m o rp h o lin iu m - propylenoxid.
Bei
gleichzeitiger E in w irk u n g m eh rerer A ktivatoren fin­
det eine ü ber die E inzelw irkung eines A ktivators
hinausgehende ad ditive A ktivierung statt, die fü r
K alium cyanid (0,01-m .) und R in d erseru m alb u m in
(0,01% ) bei den rein sten E nzym fraktionen ca. 600%
beträgt.
4. In h ib ito ren
3. p ti-O ptim u m , T em peratu rein flu ß und A k tiva to ren
N eben den b ekannten In h ib ito ren V-Acetylglucosam inolacton, yV-Acetylglucosamin, A cetam id und
A cetat fanden w ir u n ter den sau ren Glycosaminoglykanen eine R eihe w irksam er kom petitiver H em ­
m er, fü r die folgende A j-W erte (m M ol) berechnet
w u rd en : H y alu ro n at 4, P en tosanpolysulfat 4 ,2 ,
H ep arin 8, D erm atan su lfat 9, C h o n d roitinpolysulfat
4,1. F ü r C h o n d ro itin ( 4 ) -sulfat, C h o n d ro itin ( 6 ) -sulfat, K eratan su lfat und P o ly g alak tu ro n säu re lagen
die W erte zwischen 10 und 14. U nter den nicht­
kom petitiven In h ib ito ren fanden sich folgende K\W erte (mM ol) : Schw erm etalle: H g 2® 0 ,002, F e3®
0,8, Cu2® 1.0, A l3® 3,8, Zn2® 7,5, N i2® 7,6, M n2®
9,0, Co2® 20,0. T h io lg ru p p en h altig e V erb in d u n g en :
Cystein 1,0, G lutathion 2,6, Ä D TA 6,8, G lucuronsäure 39. A m a d o r i - u n d H e y n s - V erb in d u n ­
gen: F ructoseglycin 45, F ru cto seasp arag in säu re 3,1,
1-A m ino-l-desoxy-tolyl-fructose 6,7.
D as in 0,05-m . C itratpuffer gem essene pn-O ptim um
gereinigter /?-V-Acetyl-D-hexosaminidase liegt bei
P h 4,4, bei pn-W erten von 3,4 bzw. 5,8 b eträg t die
A ktivität noch 50%, bei pn 2,7 bzw. 6,5 noch 12%
Die Arbeit wurde durch Mittel der D e u t s c h e n
F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t und des F o n d s
d e r C h e m i s c h e n I n d u s t r i e in dankenswerter
Weise unterstützt.
10 E. R. B. G r a h a m u . A. G o t t s c h a l k , Biochim. biophysica
Acta [Amsterdam] 3 8,513 [I960].
11 V. P. B h a v a n a n d a n , E. B u d d e c k e , R. C a r u b e l h u . A. G o t t ­
s c h a l k , B i o c h e m . b i o p h y s i c . R e s . C o m m u n . 16, 353 [1964].
12 J. P r i m o s i g k , H. P e l z e r , D. M a a s s u . W . W e i d e l , Biochim.
biophysica Acta [Amsterdam] 46, 68 [1961].
* Diese Versuche wurden in den Laboratorien von Prof. Dr.
A. G o t t s c h a l k (Tübingen, Max-Planck-Institut für Virus­
forschung) durchgeführt, dem wir auch für wertvolle An­
regung danken möchten.
** Herrn Prof. Dr. W . W e i d e l (Max-Planck-Institut für Bio­
logie, Tübingen) danken wir für die Überlassung einer
Probe des Mucopeptids.
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