P. aeruginosa - Biofilm

Verbundprojekt:
Erkennung und Bekämpfung von vorübergehend unkultivierbaren
Pathogenen in der Trinkwasser-Installation
Abschlussveranstaltung, Bonn, 02. April 2014
„Wie gehen hygienisch relevante Mikroorganismen in den
VBNC-Zustand über und wie werden sie wieder
kultivierbar?“
Jost Wingender, Zenyta Dwidjosiswojo, Conny Rosengarten,
Hans-Curt Flemming
BIOFILM CENTRE
AQUATISCHE MIKROBIOLOGIE
Interaktionen zwischen hygienisch relevanten Bakterien
und Kupfer in der Trinkwasser-Installation
 Planktonische Zellen und Kupferionen im Wasser.
 Bakterien und Kupferionen im Biofilm (Akkumulation
von Kupferionen in Biofilmen).
 Kontakt von Bakterien mit Kupferoberflächen.
Anheftung
Kultivierbar
Wachstum
Kupferionen
VBNC?
Freisetzung
Untersuchungsschwerpunkte
Laborversuche
 Einfluss von Kupferionen auf die Vitalität von Pseudomonas
aeruginosa und Legionella pneumophila beim Übergang der
Bakterien in den VBNC-Zustand.
 Wirkung von Kupferionen auf planktonische Zellen und Biofilme.
 Charakterisierung des kupferinduzierten VBNC-Zustands auf
physiologischer und genetischer Ebene.
 Rückkehr in die kultivierbare Form („Resuscitation“).
 Cytotoxizität und Gentoxizität der Bakterien im kultivierbaren
und VBNC-Zustand (Kooperation mit IWW).
Kultivierbarkeit von P. aeruginosa in
kupferhaltigem Wasser
Exposition von P. aeruginosa AdS (106 Zellen/mL) in Trinkwasser bzw. Deionat
± Kupfersulfat, 20 °C, 24 h, ± Kupferchelator DTTC (Natriumdiethyldithiocarbamat)
P. aeruginosa (KBE/mL)
1,0E+07
Trinkwasser-Installation aus
Kupfer
56 µg/L Cu
TrinkwasserVerteilungssystem
 2 µg/L Cu
Deionat
ohne Cu
Deionat mit Kupfer
63,5 µg/L (1 µM) Cu
1,0E+06
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
n. n.
1,0E+00
- DDTC
+ DDTC
- DDTC
0h
+ DDTC
- Cu
+ Cu
24 h
 Kupferhaltiges Trinkwasser bzw. Deionat verminderte die Kultivierbarkeit auf
Nähragar, während die Gesamtzellzahl (ca. 106 Zellen/mL) konstant blieb.
 Verlust der Kultivierbarkeit wurde durch Zugabe des Kupferchelators DDTC
aufgehoben.
Wirkung von Kupferionen auf P. aeruginosa in Wasser
 Kupferionen (10 µM) bewirken Verlust der Kultivierbarkeit von
P. aeruginosa:
- Nährmedien: Nähragar, 36 °C, 2 d; CN-Agar, 36 °C, 2 d (ISO 16266);
Pseudalert, 38 °C, 1 d
- Verlängerung der Inkubationsdauer: bis zu 21 d (CN-Agar, Nähragar), bis
zu 4 d (Pseudalert)  kein Wachstum
- Bebrütungstemperatur: 20 °C, 30 °C, 36 °C (CN-Agar)
- Spatelplattenmethode, Membranfiltration (20 mL mit ca. 2 x 107 Zellen)
- Stammunabhängig: AdS, DSM 50071 (ATCC 10145), PAO1
- Innerhalb von 10 Stunden
- In verschiedenen Testmedien: reales Trinkwasser, Deionat und
NaHCO3-Puffer (pH-Bereich 6 - 8)
- Unabhängig vom Gegenion des Kupfersalzes (Sulfat, Nitrat, Chlorid)
 Kupfer-Chelatoren verhindern den Verlust der Kultivierbarkeit: DDTC
(100 µM), EDTA (100 µM) und Bathocuproindisulfonsäure (150 µM).
Wirkung von Kupferionen auf L. pneumophila in Wasser
 Kupferionen (10 µM) bewirken den Verlust der Kultivierbarkeit von
L. pneumophila
- Nährmedium: BCYE-Agar, 36 °C, bis zu 10 d
- Stammunabhängig: AdS (SG 1), ATCC 33152 (SG 1), ATCC 33215 (SG 6)
- Innerhalb von 7 bis 8 Stunden in Deionat
 Kupfer-Chelatoren verhindern den Verlust der Kultivierbarkeit: DDTC
(100 µM), EDTA (100 µM).
Konzentrationsabhängige Wirkung von Kupfer auf
P. aeruginosa AdS und L. pneumophila AdS
Cu-Exposition: 24 h, 20 °C, ca. 106 Zellen/mL
P. aeruginosa und L. pneumophila
(Zellen bzw. KBE/mL)
1,0E+07
1,0E+06
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
0
0.01
0.1
1
10
100
Cu (µM)
P. aeruginosa, Gesamtzellzahl
P. aeruginosa, Koloniezahl
L. pneumophila, Gesamtzellzahl
L. pneumophila, Koloniezahl
Kupferexponierte Zellen von P. aeruginosa und L. pneumophila: Übergang in
den VBNC-Zustand?
Wirkung von Kupferionen auf die Vitalität von
P. aeruginosa und L. pneumophila
Exposition von P. aeruginosa AdS und L. pneumophila AdS (106 Zellen/mL), 20 °C,
24 h in Deionat ± Kupfersulfat (10 µM)
1,0E+06
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+01
n. n.
1,0E+02
n. n.
P. aeruginosa & L. pneumophila
(Zellen bzw. KBE/mL)
1,0E+07
1,0E+00
- Cu
+ Cu
P. aeruginosa
Gesamtzellzahl
Koloniezahl
- Cu
+ Cu
L. pneumophila
Zellen mit intakter Membran
FISH-positiv
 Kupferionen bewirken Verlust der Kultivierbarkeit.
 Kupferionen bewirken keine Abnahme der Konzentration membranintakter Zellen
(LIVE/DEAD-Kit, Fluoreszenzmikroskopie) und FISH-positiver Zellen.
 Planktonische P. aeruginosa- und L. pneumophila-Zellen im VBNC-Zustand.
Relative Intensität roter Fluoreszenz (Propidiumiodid,
membrangeschädigte/tote Zellen)
Q: 0,05
Q: 0,16
3,6 x 103
7,3 x 103
6,8 x 104
4,6 x 10 4
Unbehandelt (ohne Cu)
Cu 10 µM
Verteilungsmuster und Verhältnis (Q) membrangeschädigter/membranintakter Zellen
(P. aeruginosa AdS, LIVE/DEAD-Kit und Durchflusszytometrie)
Q: 25,00
1,3 x 103
3,3 x 104
Isopropanol
(70 %, 24 h)
Q: 54,17
Q: 24,33
6,5 x
1,2 x 103
104
H2O2
(1 g/L, 24 h)
4,1 x 104
1,5 x 103
Hitze
(60 °C, 1 h)
Relative Intensität grüner Fluoreszenz (SYTO 9, membranintakte Zellen)
Kupferwirkung auf etablierte Biofilme von P. aeruginosa
(Mikrotiterplatten-Assays)
1,0E+10
1,0E-18
1,0E+09
1,0E-19
1,0E+08
1,0E-20
1,0E+07
1,0E+06
1,0E-21
1,0E+05
1,0E-22
1,0E+04
1,0E+03
1,0E-23
ATP (mol/Zelle)
P. aeruginosa (Zellen bzw. KBE/Kavität)
Exposition von Biofilmen in Deionat für 24 h, ± Kupfersulfat
GZZ
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
0
0,1
0,5
1
5
10
50
100
Cu (mM)
1,0E-24
KBE
1,0E-25
FISH
membranintakt
ATP
 Verlust der Kultivierbarkeit zwischen 50 mM Cu und 100 mM.
 Biofilme sind toleranter gegenüber Cu-Ionen als planktonische Zellen (ab 5 mM
vollständiger Verlust der Kultivierbarkeit).
 Konzentration membranintakter Zellen, FISH-positiver Zellen und ATP-Gehalt bleibt
nahezu unverändert.
 Kupferexponierte Zellen auch im Biofilm im VBNC-Zustand.
Wirkung von Kupfer- und Silberionen auf P. aeruginosa
(„Spiderweb“-Diagramm)
Cu (Kupfersulfat): 5 mM
Ag (Silbernitrat): 0,23 mM
Gesamtzellzahl
0
Gesamtzellzahl
0
-2
-2
-4
Planktonisch
ATP
-6
Koloniezahl
-4
ATP
-6
-8
membranintakte
Zellen (LIVE/DEAD)
-8
Zellen mit 16S
rRNA (FISH)
membranintakte
Zellen (LIVE/DEAD)
Gesamtzellzahl
0
-2
-4
-6
Koloniezahl
-4
ATP
-6
-8
Biofilm
membranintakte
Zellen (LIVE/DEAD)
Achse: Log CCu/Ag/C0
Zellen mit 16S
rRNA (FISH)
Gesamtzellzahl
0
-2
ATP
Koloniezahl
Koloniezahl
-8
Zellen mit 16S rRNA
(FISH)
membranintakte
Zellen (LIVE/DEAD)
Zellen mit 16S
rRNA
BMBF-Projekt, „Nanosilberpartikel“
(Alexa Pillen)
Rückkehr („Resuscitation“) der VBNC-Zellen von P. aeruginosa
in den kultivierbaren Zustand
DDTC-Zugabe
P. aeruginosa (Zellen bzw. KBE/mL)
1,0E+07
1,0E+06
1,0E+05
unbehandelt + DDTC (Zellen/mL)
1,0E+04
Cu-behandelt (Zellen/mL)
Cu-behandelt + DDTC (Zellen/mL)
1,0E+03
unbehandelt + DDTC (KBE/mL)
Cu-behandelt (KBE/mL)
1,0E+02
Cu-behandelt + DDTC (KBE/mL)
1,0E+01
1,0E+00
0h
24 h
4d
7d
14 d
Expositionsdauer (d)
 Nach Zugabe des Chelators DDTC (100 µM) und 14 d Inkubation (20 °C) in Wasser
wurden kupferinduzierte VBNC-Zellen wieder vollständig in den kultivierbaren
Zustand gebracht  Hinweis auf „Resuscitation“.
 Keine „Resuscitation“: Zugabe von EDTA, Natriumthiosulfat, Natriumthioglycolat
oder Waschen der Bakterien mit Deionat.
Literatur: Kupferinduzierter VBNC-Zustand bei Bakterien
Spezies
Vitalitätsmarker
Resuscitation
Referenz
Agrobacterium
tumefaciens
Membranintegrität
Nicht untersucht
Erwinia amylovora
Membranintegrität
+
Ordax et al., 2006
Escherichia coli
Membranintegrität
+
Grey und Steck, 2001
Escherichia coli
EHEC/EAEC O104:H4
Membranintegrität
+
Aurass et al., 2011
Pseudomonas
aeruginosa
Membranintegrität,
rRNA
+
Dwidjosiswojo et al.,
2011
Ralstonia
solanacearum
Membranintegrität
+
Grey und Steck, 2001
Rhizobium
leguminosarum
Membranintegrität
-
Alexander et al., 1999
Xanthomonas
axonopodis
Atmungsaktivität
Nicht untersucht
Del Campo et al., 2009
Xanthomonas
campestris
Membranintegrität
Nicht untersucht
Ghezzi und Steck, 1999
Alexander et al., 1999
Zusammenfassung
 Kupferionen bewirken bei P. aeruginosa und bei L. pneumophila den
Verlust der Kultivierbarkeit, während die Gesamtzellzahl, die Anzahl der
Zellen mit intakter Zellmembran und intakter 16S rRNA sowie der ATPGehalt (P. aeruginosa) nahezu konstant bleiben.
 Kupferionen induzieren VBNC-Zustand sowohl von planktonischen Zellen
als auch von Zellen im Biofilm (P. aeruginosa).
 Induktion des VBNC-Zustands von P. aeruginosa und L. pneumophila
durch Kupferionen.
 Rückführung von P. aeruginosa im kupferinduzierten VBNC-Zustand in den
kultivierbaren Zustand durch Kupferchelator DDTC möglich.
 Zytoxizität und Gentoxizität von P. aeruginosa und L. pneumophila
gegenüber humanen Bronchialephitelzellen wird durch Kupferionen
beeinflusst  nächster Vortrag.
 Untersuchungen zur Gen- und Proteinexpression von P. aeruginosa im
kultivierbaren und VBNC-Zustand in Arbeit (Microarray-, Proteom- und
MALDI-TOF-Analysen in Kooperation mit Universitätsklinikum Essen).
Mögliche Konsequenzen des kupferinduzierten VBNCZustands für die Praxis
 P. aeruginosa und L. pneumophila können in kupferhaltigem Trinkwasser
der Trinkwasser-Installation im VBNC-Zustand vorliegen.
 Trinkwasserbiofilme können ein Reservoir für kupferinduzierte VBNCZellen darstellen.
 Bei negativen Befunden nach kulturellen Methoden gemäß TrinkwV ist
die Anwesenheit von VBNC-Zellen nicht unbedingt auszuschließen
 mögliche Untererfassung der Organismen
 Zugabe von Chelatoren zu kupferhaltigen Trinkwasserproben möglich
ISO 19458 (Probenahme für mikrobiologische Untersuchungen): „Chelatbildner werden
empfohlen, um Bakterien vor der Toxizität der Schwermetalle wie Kupfer oder Zink zu
schützen“; z. B. EDTA, 50 mg/l.
 In Problemfällen: Ergänzung der routinemäßigen Kulturverfahren durch
kulturunabhängige Methoden (FISH, PCR-basierte Methoden).