Disserstation Daniel Grimm

Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
- Abteilung Virologie Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Otto Haller
Charakterisierung der Virulenzfaktoren eines
hochpathogenen Influenza-A-Virus
INAUGURAL - DI SSERT AT I ON
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2007
von Daniel Grimm
geboren in Lahr
Dekan:
Prof. Dr. Christoph Peters
1. Gutachter:
Prof. Dr. Peter Stäheli
2. Gutachter:
Prof. Dr. Drs. h. c. Hubert Blum
Jahr der Promotion: 2009
Danksagung
Ich danke meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Peter Stäheli, herzlich für die hervorragende
Betreuung und die Vergabe des spannenden, vielschichtigen und aktuellen Themas. Seine
bereitwillige Unterstützung meiner Arbeit, die zahlreichen Ideen und nicht zuletzt seine
ständige Bereitschaft zu interessanten Diskussionen haben wesentlich zum Gelingen
beigetragen.
Ganz besonders möchte ich mich bei Herrn PD Dr. Georg Kochs bedanken. Er hatte stets ein
offenes Ohr für meine Fragen und stand mir in allen Lebenslagen mit Rat und Tat zur Seite.
Seine Begeisterungsfähigkeit, sein exzellenter Humor und die unvergleichliche Fähigkeit,
„das Kind beim Namen zu nennen“, haben mich geprägt.
Beiden danke ich dafür, dass sie mir viele Freiheiten gewährt und so meine Selbstständigkeit
gefördert haben. So konnte ich mich schnell für das wissenschaftliche Arbeiten begeistern
und bin immer gerne ins Labor gekommen.
Herrn Prof. Dr. Drs. h. c. Hubert Blum danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens.
Herrn Prof. Dr. Otto Haller möchte ich für seine wohlwollende Unterstützung und sein
Interesse für meine Arbeit danken.
Iris Körner und Silke Stertz danke ich ganz besonders für die schöne gemeinsame Zeit im und
außerhalb des Labors. Vielen Dank für eure Unterstützung und vor allem dafür, dass ich
Freud und Leid der letzten eineinhalb Jahre mit euch teilen konnte.
Danke an alle Mitglieder der „Influenza-Arbeitsgruppe“ - Daniela Kugel, Iris Körner, Nicola
Penski, Marius Cornitescu und Markus Mordstein - für die nette Atmosphäre und den
freundschaftlichen Umgang miteinander.
Außerdem danke ich allen anderen jetzigen und ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppen
Stäheli, Kochs und Weber für die ständige Hilfsbereitschaft.
Vielen Dank an meine Freunde für die schöne Zeit außerhalb des Labors.
Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern und meiner Familie für ihr Interesse an meinem
Studium und dafür, dass sie mir immer zur Seite stehen.
Beiträge zu wissenschaftlichen Tagungen
I.
Jahrestagung der Gesellschaft für Virologie
München (Deutschland), 15.-18. März 2006
Grimm, D., M. Hufbauer, O. Haller, P. Stäheli, and G. Kochs.
Influenza A virus highly virulent für mice with functional Mx1 resistence gene
Art der Präsentation:
II.
Vortrag
13th International Conference on Negative-Strand RNA Viruses
Salamanca (Spanien), 17.-22. Juni 2006
Kochs, G., D. Grimm, M. Hufbauer, A. Solórzano, L. Martínez-Sobrido, A. GarcíaSastre, O. Haller, and P. Stäheli.
Exceptional influenza A virus strain with high virulence in mice carrying a
functional Mx1 resistance gene
Art der Präsentation:
Vortrag
Veröffentlichungen
I.
Grimm, D., P. Stäheli, M. Hufbauer, L. Martínez-Sobrido, A. Solórzano, A. GarcíaSastre, O. Haller, and G. Kochs.
Evasion of innate immunity by influenza A virus: replication fitness determines high
virulence in mice carrying functional Mx1 resistance gene
Zur Publikation eingereicht bei:
„Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
1
1.1
Das Influenza-A-Virus
1
1.1.1
Partikel- und Genomstruktur des Influenza-A-Virus
2
1.1.2
Der Replikationszyklus von Influenza-A-Virus
4
1.1.3
Pathogenese und Wirtswechsel
5
1.1.3.1
Das Hämagglutinin (HA)
5
1.1.3.2
Die Neuraminidase (NA)
6
1.1.3.3
Das Nichtstrukturprotein 1 (NS1)
7
1.1.3.4
Die Polymeraseuntereinheiten
8
1.1.4
hvPR8 und lvPR8
9
1.1.5
Reverse Genetik von Influenza-A-Virus
10
1.2
Mx-Proteine
12
1.2.1
Das angeborene Immunsystem
12
1.2.2
Das Mx-Protein
13
1.3
Zielsetzung dieser Arbeit
15
2
Material und Methoden
16
2.1
Material
16
2.1.1
Enzyme, Reaktionspuffer und Chemikalien
16
2.1.2
Nukleinsäuren
16
2.1.3
Proteinmethoden
16
2.1.4
Zellkulturmaterial
17
2.1.5
Transfektionsreagenzien
17
2.1.6
Kits
17
2.1.7
Immunhistochemie
18
Inhaltsverzeichnis
II
2.1.8
Oligonukleotide
18
2.1.9
Plasmide
19
2.1.10
Antikörper
22
2.1.11
Zellen
23
2.1.12
Mausstämme
23
2.1.13
Anästhesie der Versuchstiere
24
2.1.14
Viren
25
2.1.15
Interferone und Immunmodulatoren
26
2.2
Methoden
27
2.2.1
Zellkulturarbeiten
27
2.2.1.1
Kultivierung der Zellen
27
2.2.1.2
Plaqueassay zur Virustiterbestimmung
27
2.2.1.3
Erstellung von Wachstumskurven in MDCK
29
2.2.1.4
Immunfluoreszenztest zur Virustiterbestimmung
29
2.2.1.5
Transiente Transfektion
30
2.2.1.6
Bestimmung von Typ-I-Interferon im Überstand infizierter Zellen
30
2.2.1.7
Dualer Luziferase-Reportertest
31
2.2.1.8
Minigenomassay zur Bestimmung der Replikationseffizienz
31
2.2.1.9
Minireplikonsystem zur Messung der Polymeraseaktivität
32
2.2.1.10
Herstellung rekombinanter Influenzaviren
32
2.2.2
Proteinbiochemische Methoden
34
2.2.2.1
Herstellung von Zelllysaten für Western Blot
34
2.2.2.2
Proteinelektrophorese im SDS-Polyacrylamidgel
35
2.2.2.3
Western Blot
36
2.2.2.4
IFN-β-ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
37
III
Inhaltsverzeichnis
2.2.3
Molekularbiologische Methoden
38
2.2.3.1
RNA-Isolation und Reinigung
38
2.2.3.2
Reverse Transkription mit anschließender Polymerasekettenreaktion (PCR)
38
2.2.3.3
DNA-Gelelektrophorese
39
2.2.3.4
Transformation kompetenter Bakterienzellen
40
2.2.3.5
Präparation von Plasmid-DNA
40
2.2.4
Tierexperimentelle Methoden
41
2.2.4.1
Infektion der Versuchstiere
41
2.2.4.2
Lungenentnahme
41
2.2.4.3
Gewinnung von Lungenhomogenaten
41
2.2.5
Fluoreszenzfärbungen
42
2.2.5.1
Indirekte Immunfluoreszenz zur Detektion von viralem NP in MDCK-Zellen
42
2.2.5.2
Immunhistochemie
42
3
Ergebnisse
44
3.1
Pathogenität des hochvirulenten Influenza A/PR/8/34-Virus (hvPR8)
44
3.1.1
Bestimmung der LD50 für hvPR8
44
3.1.2
Krankheitssymptomatik nach Infektion mit hvPR8
45
3.2
Mx1-Sensitivität von hvPR8
47
3.2.1
Einfluss der Vorbehandlung mit rHuIFN-αB/D und S-28463 auf das Überleben 47
3.2.2
Einfluss der Vorbehandlung mit rHuIFN-αB/D und S-28463 auf die Viruslast
48
3.2.3
Nachweis von viralem NP und Mx1 in histologischen Schnitten
50
3.3
IFN-Induktion durch hvPR8
52
3.3.1
Messung von IFN-β im Lungengewebe infizierter Mäuse
52
3.3.2
Bestimmung der Interferoninduktion in MDCK-Zellen
53
3.3.3
Nachweis von IFN im Überstand infizierter MDCK-Zellen
54
Inhaltsverzeichnis
IV
3.4
Wachstumsverhalten von hvPR8
56
3.4.1
Bestimmung von Virustitern im Lungengewebe
56
3.4.2
Viruswachstum auf MDCK-Zellen
57
3.4.3
Replikationsunterschiede von hvPR8 und lvPR8 auf zellulärer Ebene
58
3.4.4
Unterschiede in der Replikation zwischen hvPR8 und lvPR8 in L929-Zellen
60
3.4.5
Bestimmung der Polymeraseaktivität von hvPR8 und lvPR8 in L929-Zellen
61
3.5
Herstellung der rekombinanten Viren rec hvPR8 und rec lvPR8
63
3.5.1
Rescuesystem für rec hvPR8 und rec lvPR8
63
3.5.2
Pathogenität der rekombinanten Viren in Mx1+/+-Mäusen
65
3.5.3
Herstellung von rekombinanten Reassortanten zwischen hvPR8 und lvPR8
66
3.5.4
Wachstum der rekombinanten Viren in B6-Mx1- und B6-IFNAR0/0-Mäusen
68
4
Diskussion
70
4.1
Mx1-Sensitivität und IFN-Induktion
70
4.2
Replikationsgeschwindigkeit von hvPR8
73
4.3
Fazit
80
5
Zusammenfassung
81
6
Abkürzungsverzeichnis
82
7
Literaturverzeichnis
85
1
1
1.1
Einleitung
Einleitung
Das Influenza-A-Virus
Die zur Familie der Orthomyxoviridae gehörenden Influenza-A-Viren sind die Erreger der
hoch infektiösen, klassischen Virusgrippe. Der Name „Influenza“ hat seinen Ursprung im
Italien des 15. Jahrhunderts. Damals wurde eine Epidemie dem „Einfluss der Sterne“
zugeschrieben. Die erste Pandemie, die sich eindeutig auf Influenza zurückführen lässt,
fand im Jahr 1580 statt. Im 19. Jahrhundert traten mindestens vier, im 20. Jahrhundert drei
Pandemien auf (Lazzari und Stohr, 2004). Besonders verheerend waren die Auswirkungen
der „spanische Grippe“ (H1N1) von 1918, die weltweit um die 50 Millionen Menschen das
Leben kostete (Johnson und Mueller, 2002). Das Auftreten neuer humanpathogener
Influenzaviren und die damit assoziierten Epidemien und Pandemien werden hauptsächlich
auf einen Übergang von Viren vom Tier auf den Menschen zurückgeführt (Webster et al.,
1995). Die periodisch auftretenden Pandemien nehmen ihren Ursprung meist in
Südostasien oder China, da gerade dort durch das enge Zusammenleben von Tier und
Mensch die Wahrscheinlichkeit einer Übertragung des Virus extrem hoch ist. Beispiele
hierfür sind die „asiatische Grippe“ (H2N2) von 1957 und die „Hongkong-Grippe“ (H3N2)
von 1968, die beide pandemisch verliefen und denen weltweit ebenfalls Millionen
Menschen zum Opfer fielen (Schafer et al., 1993, Xu et al., 1996). Für die Entwicklung
von hochpathogenen Pandemiestämmen ist die enorme Antigenvariabilität von
Influenzaviren im Geflügelreservoir verantwortlich. Diese Variabilität erleichtert es dem
Virus, sich der Immunantwort des Wirts immer wieder zu entziehen. Hier spielen vor
allem Veränderungen innerhalb der Oberflächenproteine des Influenza-A-Virus, dem
Hämagglutinin (HA) und der Neuraminidase (NA), eine Rolle. Zwei Mechanismen für die
Entstehung neuer Virusvarianten sind wichtig: der antigenic drift, also Punktmutationen in
den Oberflächenproteinen, sowie der antigenic shift, mit dem die Bildung von
Reassortanten bei Infektion eines Wirts mit unterschiedlichen Virustypen beschrieben
wird. Heute kennt man 16 Subtypen des Hämagglutinin (H1-H16) und 9 Subtypen der
Neuraminidase (N1-N9) (Fouchier et al., 2005, Webster et al., 1992), die in vielen
verschiedenen Kombinationen miteinander vorkommen. Zu Pandemien kommt es dann,
wenn HA-Subtypen auf der Oberfläche von Viren auftreten, gegen die große Teile der
Bevölkerung keine schützenden Antikörper besitzen.
Einleitung
2
In Tabelle 1.1 wird ein Überblick über die Influenzaviren und die anderen Vertreter der
Familie der Orthomyxoviridae gegeben. Die Orthomyxoviridae teilen sich in 5
verschiedene Genera auf: Influenzavirus A, B und C, sowie Thogotovirus und Isavirus. Die
humanmedizinisch größte Bedeutung haben die Influenza-A-Viren.
Genus
Spezies
Übertragung
Reservoir
Influenzavirus A
Influenza-A-Virus
Tröpfcheninfektion,
Mensch,
Vogelexkremente
Pferd
Schwein,
und
andere
Säugetiere; Vögel
Influenzavirus B
Influenza-B-Virus
Tröpfcheninfektion
Mensch, Robbe
Influenzavirus C
Influenza-C-Virus
Tröpfcheninfektion
Mensch, Schwein
Thogotovirus
Thogotovirus
Zecken
Mensch,
Rind,
Schaf und andere
Säuge-tiere; Zecken
Dhorivirus
Zecken
Mensch,
Kamele,
evtl. andere Säugetiere; Zecken
Isavirus
Isavirus
Fisch
Tabelle 1.1: Familie der Orthomyxoviridae
1.1.1
Partikel- und Genomstruktur des Influenza-A-Virus
Influenza-A-Viren sind wie alle Mitglieder der Familie der Orthomyxoviridae behüllte
Viren mit einem segmentierten, einzelsträngigen RNA-Genom negativer Polarität (vRNA)
(Lamb und Krug, 2001). Abbildung 1.1C zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme
einzelner Viruspartikel. Das aus acht Gensegmenten bestehende Virusgenom umfasst zirka
15000 Nukleotide (Chen et al., 2001, Lamb und Krug, 2001). Jedes Gensegment trägt
regulatorische Sequenzen in den non coding regions (NCR) an den 3’-und 5’-Enden. Diese
sind hochkonserviert und enthalten die Promotorregion und das Verpackungssignal. Der
open reading frame (ORF) für die viralen Proteine befindet sich zwischen den NCRs.
Durch intramolekulare Basenpaarungen bilden die RNA-Segmente eine pfannenstielartige
Form aus, die als panhandle bezeichnet wird (Klumpp et al., 1997).
3
Einleitung
Wie in Abbildung 1.1A schematisch dargestellt, tragen die Viruspartikel eine von der
Wirtszelle stammende Lipidmembran als äußere Hülle.
A
NEP/NS2-Protein
Lipidhülle
M1-Protein
M2-Protein
PB2 PB1
Nukleoprotein
PA
NA
NP HA
#2632a
M NS
ss(-)RNA-Segmente
PB2
PB1
Neuraminidase
PA
Polymerasekomplex
B
C
Polymerasekomplex
PB1
Hämagglutinin
PA
PB2
vRNA
Nukleoprotein
Abbildung 1.1: Aufbau des Influenza-A-Viruspartikels. (A) Schematische Darstellung eines Partikels. (B)
Schematische Darstellung eines viralen Ribonukleoproteinkomplexes (vRNP), bestehend aus einem
einzelsträngigen RNA-Gensegments (vRNA), dem Nukleoprotein (NP) und den Polymeraseuntereinheiten
PB2, PB1 und PA. (C) Elektronenmikroskopische Aufnahme freigesetzter Viruspartikel (Noda et al., 2006).
In dieser Hülle befinden sich die beiden viralen Glykoproteine, das trimere Hämagglutinin
(HA) und die tetramere Neuraminidase (NA) sowie das als Protonenkanal fungierende
matrix protein 2 (M2). Die Glykoproteine ragen als Spikes aus der Hüllmembran heraus,
wobei das Verhältnis von HA zu NA bei etwa 4:1 liegt. Das Hämagglutinin sorgt für die
Adsorption der Viren an Sialinsäurereste auf der Wirtszelloberfläche. Nach der Endozytose
der Viruspartikel vermittelt es die Membranfusion mit der Wirtszelle. Die Neuraminidase
wird bei der Freisetzung neu synthetisierter Viruspartikel wichtig. Sie spaltet
Sialinsäurereste von Glykoproteinen auf der Wirtszelle ab und verhindert so ein Verkleben
der Partikel mit der Wirtszelloberfläche. Der Hülle liegt innen unmittelbar das matrix
Einleitung
4
protein 1 (M1) an. Ein weiteres Strukturprotein, das Nukleoprotein (NP), ist direkt mit der
vRNA assoziiert und bedeckt diese in voller Länge. Der virale Polymerasekomplex, der
aus dem polymerase basic protein 2 (PB2), dem polymerase basic protein 1 (PB1) und
dem polymerase acid protein (PA) besteht, lagert sich an die mit NP verbundenen
Gensegmenten an. Der gesamte Komplex wird dann als viraler RibonukleoproteinKomplex (vRNP) bezeichnet und ist in Abbildung 1.1B schematisch dargestellt (Compans
et al., 1974). Gensegment 8 kodiert für zwei Proteine, die historisch Nichtstrukturprotein 1
und 2 (NS1 und NS2) genannt werden. Auf die Funktion von NS1 wird in 1.1.3.3
eingegangen. NS2, das auch nuclear export protein (NEP) genannt wird, ist am Export neu
synthetisierter vRNPs aus dem Zellkern beteiligt (O'Neill et al., 1998). Es konnte aber
auch in aufgereinigten Viruspartikeln nachgewiesen werden, weshalb es sich vermutlich
nicht -wie ursprünglich angenommen- um ein Nichtstrukturprotein handelt (Richardson
und Akkina, 1991). Erst kürzlich wurde das PB1-F2 als elftes, von den meisten InfluenzaA-Viren kodiertes Protein gefunden. Das 87 Aminosäuren lange Polypeptid, bei dem es
sich nach heutigem Kenntnisstand um ein akzessorisches Protein mit proapoptotischer
Aktivität handelt, geht von einem überlappenden ORF nahe des 5’-Endes des PB1-Gens
aus (Chen et al., 2001, Zamarin et al., 2005).
1.1.2
Der Replikationszyklus von Influenza-A-Virus
Influenza-A-Viren binden über das virale HA an Sialinsäurereste tragende Glykoproteine
auf der Wirtszelloberfläche (siehe auch 1.1.3.1) (Weis et al., 1988). Die Viruspartikel
werden über rezeptorvermittelte Endozytose in Vesikeln in die Zelle aufgenommen (Lamb
und Krug, 2001). Durch Absinken des pH-Wertes im Endosom kommt es zu einer
Konformationsänderung im HA. Die fusogene Region von HA wird freigelegt und die
virale Lipidhülle verschmilzt mit der Endosomenmembran (Bullough et al., 1994, Yu et
al., 1994). Durch den M2-Protonenkanal kommt es zeitgleich zu einer Ansäuerung des
Virions und durch Lösen von Interaktionen zwischen NP und M1 werden die vRNPs ins
Zytoplasma freigesetzt (uncoating) (Bui et al., 1996, Helenius, 1992). Die vRNPs werden
dann in den Zellkern transportiert, wo mittels der viralen, RNA-abhängigen RNAPolymerase Transkription und Replikation stattfinden. Virale mRNAs werden ins
Zytoplasma exportiert und dort von der Proteinsynthesemaschinerie der Wirtszelle
translatiert. Nachdem die viralen Glykoproteine im Golgi-Apparat prozessiert wurden,
gelangen diese zusammen mit dem M2-Protein über Vesikeltransport zur Plasmamembran.
5
Einleitung
Die vRNPs gelangen über einen noch nicht vollständig verstandenen, wahrscheinlich M1abhängigen Mechanismus an Membranbereiche, die überdurchschnittlich viel HA, NA und
M2 enthalten (assembly). Hier wird dann der Knospungsprozess (budding) eingeleitet und
neu synthetisierte Viruspartikel werden frei.
1.1.3
Pathogenese und Wirtswechsel
Im Folgenden soll ein Überblick über die wichtigsten Faktoren gegeben werden, die
Einfluss auf Pathogenität und Wirtstropismus von Influenza-A-Virus haben.
1.1.3.1 Das Hämagglutinin (HA)
Die Rezeptorspezifität des HA spielt eine große Rolle für die Infektiosität von InfluenzaA-Virus. Sie bezieht sich auf die Art der Bindung der Neuraminsäure an Galaktose
(SAα2,6Gal-Bindung oder SAα2,3Gal-Bindung). Das HA humaner Influenzaviren erkennt
bevorzugt SAα2,6Gal-haltige Sialooligosaccharide (Rogers und Paulson, 1983), vor allem
auf den Epithelzellen der menschlichen Trachea (Couceiro et al., 1993). Das HA aviärer
Influenzaviren
hingegen
hat
eine
hohe
Affinität
zu
SAα2,3Gal-haltigen
Sialooligosacchariden (Rogers und Paulson, 1983), wie sie beispielsweise im
Gastrointestinaltrakt vieler Geflügelarten zu finden sind. Im Trachealepithel von
Schweinen kommen beide Bindungstypen vor (Ito et al., 1998). Dies erklärt, warum das
Schwein ein idealer Wirt für die Bildung von Reassortanten zwischen humanen und
aviären Viren ist. Trotz der Unterschiede in der Rezeptorspezifität können aviäre Viren
Menschen infizieren und tödliche Erkrankungen verursachen (Claas et al., 1998, Fouchier
et al., 2004, Subbarao et al., 1998). Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass im humanen
Tracheobronchialepithel auf Zilien-tragenden Zellen α2,3-gebundene Neuraminsäuren
nachgewiesen werden konnten (Matrosovich et al., 2004). Für eine effiziente Mensch-zuMensch-Übertragung muss ein HA aviären Ursprungs jedoch hauptsächlich den humanen
Rezeptor erkennen (Gamblin et al., 2004, Matrosovich et al., 2000, Stevens et al., 2004).
Durch Sequenzvergleiche und kristallographische Analysen war es möglich, Aminosäuren
zu identifizieren, die Rezeptorspezifität vermitteln: Gln-226 bestimmt die Spezifität für
SAα2,3Gal, während Leu-226 mit SAα2,6Gal-Spezifität korreliert. Dies gilt für Viren des
H2 und H3-Subtyps. Für Viren des H1-Subtyps bestimmen Asp-190 (humane und porcine
Isolate) oder Glu-190 (aviäre Isolate) die Spezifität für α2,6- bzw. α2,3-Bindungen
(Gamblin et al., 2004, Kobasa et al., 2004, Matrosovich et al., 2000, Stevens et al., 2004).
Einleitung
6
Große Bedeutung für die Pathogenität von Influenzaviren hat die Spaltbarkeit des HA.
Das HA wird als Vorläuferprotein (HA0) synthetisiert und dann von Wirtszellproteasen in
zwei Untereinheiten, das HA1 und das HA2, gespalten. Dies ist unerlässlich für die Fusion
von viraler und endosomaler Membran (vgl. 1.2.1) und somit Voraussetzung für die
Infektiosität des Virus (Garten und Klenk, 1999).
Niedrigvirulente aviäre Influenzaviren tragen ein einzelnes Arginin in der Nähe der
Spaltstelle. Diese wird von extrazellulären, trypsinähnlichen Proteasen erkannt, die von
Zellen des Respirationstraktes und des Gastrointestinaltraktes sezerniert werden. Somit
bleibt die Infektion auf diese Organe beschränkt. Hochpathogene aviäre Influenzaviren
besitzen hingegen eine multibasische Proteasespaltstelle. Diese kann von ubiquitär
vorkommenden intrazellulären, subtilisin-ähnlichen Proteasen erkannt werden. Durch die
erleichterte Spaltbarkeit kann es zu einer systemischen Infektion mit Organausbreitung
kommen. Durch Mutationen in Richtung einer multibasischen Schnittstelle kann ein
niedrigvirulentes Influenzavirus hochvirulent werden. Dies wurde beispielsweise für ein
2004 in Kanada aufgetretenes Virus des H7N3-Subtyps (Pasick et al., 2005) beschrieben.
Durch die Abhängigkeit der Spaltung des HA0 von zellulären Proteasen und deren
Vorkommen im Organismus wird der Aufbau der Spaltstelle als Hauptdeterminante des
Gewebstropismus von aviären Influenzaviren angesehen (Horimoto und Kawaoka, 1994).
Die Vermutung, dass dieser Effekt auch auf den Menschen zutrifft, liegt nahe, da alle
aviären Influenzaviren, die bei der Infektion von Menschen eine hohe Virulenz zeigten,
eine multibasische Spaltstelle trugen (Claas et al., 1998, Fouchier et al., 2004, Subbarao et
al., 1998). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass ein hochvirulentes H5N1-Virus mit
multibasischer Spaltstelle nach Mutation der Spaltstelle in Mäusen attenuiert war (Hatta et
al., 2001, Neumann und Kawaoka, 2006).
1.1.3.2 Die Neuraminidase (NA)
Der Neuraminidase, dem zweiten Glykoprotein des Influenza-A-Virus, kommen zwei
wesentliche
Aufgaben
zu:
erstens
beim
Durchdringen
der
Muzinschicht
des
respiratorischen Epithels vor der Infektion und zweitens bei der Abspaltung der
Neuraminsäuren von der Zelloberfläche zur Freisetzung neu synthetisierter Viruspartikel
am Ende des Replikationszyklus.
Für ein aviäres Virus mit einer Neuraminidase des N2-Subtyps konnte gezeigt werden,
dass nach dem Übergang des Virus auf den Menschen die Spaltaktivität für α2,6-
7
Einleitung
gebundene Neuraminsäuren gestiegen ist (Baum und Paulson, 1991, Matrosovich et al.,
2001). Dies legt nahe, dass eine Adaptation der NA an die humane, α2,6-gebundene
Neuraminsäure stattgefunden hat. Weiter weiß man, dass die NA aviärer H1N1-Viren,
verglichen mit H1N1-Viren humanen Ursprungs, unempfindlicher gegen das saure Milieu
im oberen Verdauungstrakt von Vögeln ist, was in einer höheren enzymatischen Aktivität
resultiert (Takahashi et al., 2001). Passend zu dieser Beschreibung der Säureresistenz als
Pathogenitätsfaktor ist, dass hochpathogene H5N1-Viren auch im menschlichen
Gastrointestinaltrakt replizieren können und in großen Mengen ausgeschieden werden (de
Jong et al., 2005), niedrigvirulente Viren jedoch nicht.
Die Stielregion der NA, die die enzymatisch aktive Region mit der Transmembrandomäne
und dem zytoplasmatischen Rest verbindet, scheint ebenfalls Einfluss auf die Pathogenität
von Influenzaviren zu haben. Sie variiert je nach Virusisolat in Länge und Sequenz (Blok
und Air, 1982). Kurze Stielregionen korrelieren demnach mit einer ineffizienteren
Freisetzung von Virus (Luo et al., 1993). Allerdings wurde erst kürzlich gezeigt, dass die
meisten hochpathogenen H5N1-Viren, die aus Geflügel isoliert wurden, ebenfalls kurze
Stielregionen aufweisen (Li et al., 2004). Eine lange Stielregion ist also keine unbedingte
Voraussetzung für die hohe Virulenz.
1.1.3.3 Das Nichtstrukturprotein 1 (NS1)
Das NS1-Protein spielt eine zentrale Rolle bei der Suppression und Umgehung der
zellulären Immunantwort. Dies geschieht zum einen durch Bindung von NS1 an die
Proteinkinase R (PKR), wodurch die PKR-abhängige antivirale Aktivität gehemmt wird
(Li et al., 2006). Ein zweiter Mechanismus ist die Bindung an Splicing-Faktoren, um so
den mRNA-Export zu inhibieren (Lu et al., 1995). Erst kürzlich konnte gezeigt werden,
dass die RIG-I-vermittelte IFN-Induktion durch Komplexbildung von NS1 mit RIG-I
supprimiert wird (Hornung et al., 2006, Pichlmair et al., 2006). Der genaue Mechanismus
von NS1 ist jedoch noch nicht abschließend geklärt. Es ist aber bekannt, dass sich die NS1Proteine verschiedener Stämme in ihren Eigenschaften unterscheiden. Das NS1 der
Spanischen Grippe von 1918 blockierte die Expression IFN-regulierter Gene effektiver als
das NS1 von A/PR/8/34 (H1N1) (Geiss et al., 2002). Dies könnte bedeuten, dass die NS1Proteine hochvirulenter Stämme die IFN-Antwort stärker inhibieren als die von
niedrigvirulenten Stämmen. Weiter wurde beschrieben, dass Viren, die das NS1-Gen des
hochpathogenen H5N1-Virus von 1997 tragen, besonders stark proinflammatorische
Einleitung
8
Zytokine wie TNF-α und IFN-β induzieren (Cheung et al., 2002). Entsprechend wurden in
H5N1-infizierten Patienten besonders hohe Chemokinmengen gemessen. Dies könnte die
starken Symptome und den Schweregrad der Erkrankung erklären. Jedoch lösen
hochpathogene H5N1-Viren nicht nur eine überschießende Zytokinantwort aus. Sie sind
im Gegenzug auch resistent gegen die durch IFN und TNF-α hervorgerufenen antiviralen
Effekte. Vorbehandlung von porcinem Lungenepithel mit IFN-α, IFN-γ oder TNF-α hat
keinen Einfluss auf die Replikation eines rekombinanten H1N1-Virus, welches das NS1Gen des H5N1-Virus von 1997 trägt. Das parentale H1N1-Virus wird durch diese
Vorbehandlung hingegen komplett gehemmt (Seo et al., 2002, Seo et al., 2004).
1.1.3.4 Die Polymeraseuntereinheiten
Auch die Polymeraseuntereinheiten (PB2, PB1 und PA) tragen zum Wirtstropismus und
zur Pathogenität von Influenzaviren bei. Man geht jedoch davon aus, dass der Beitrag der
einzelnen Proteine stark abhängig ist vom Wirt und dem Virussubtyp. Wie bei Hatta et al.
(2001) beschrieben, konnte für PB2 eines H5N1-Isolates nachgewiesen werden, dass ein
Lysin an Position 627 (v.a. bei humanen Isolaten vorhanden) mit einer hohen Pathogenität
im Mausmodell korreliert. Glutamin an Position 627 (bei aviären Isolaten) führt zu einer
niedrigen Virulenz im Mausmodell. Die humanmedizinische Relevanz der Aminosäure an
Position 627 zeigte sich 2003 am Fall eines an einer H7N7-Infektion verstorbenen
Patienten aus den Niederlanden. Das aus dem Verstorbenen isolierte Virus trug ein Lysin
an Position 627, wohingegen Isolate aus Patienten, die die Infektion überlebten, kein Lysin
an dieser Stelle aufwiesen (Fouchier et al., 2004). Für PB1 ist beschrieben, dass
Minireplikonsysteme, die ein aviäres PB1 enthalten, eine höhere Aktivität zeigten als
Referenzsysteme ohne aviäres PB1 (Naffakh et al., 2000). Interessanterweise konnte in den
Viren, die die Pandemien von 1957 und 1968 ausgelöst haben, zusätzlich zu HA und/oder
NA immer auch PB1-Gene aviären Ursprungs nachgewiesen werden, was auf einen
Einfluss des PB1 in vivo hinweist (Kawaoka et al., 1989, Scholtissek et al., 1978).
9
1.1.4
Einleitung
hvPR8 und lvPR8
Für diese Arbeit wurden zwei Influenza A/PR/8/34-Viren des Serotyps H1N1 verwendet.
Die Viren wurden von Prof. Dr. Otto Haller durch mehrere Passagen an Mäuse adaptiert.
Das eine Virus -genannt highly virulent PR8 (hvPR8)- wurde an Mäuse des Stamms A2G
(Mx1+/+) adaptiert. Es zeichnet sich durch eine unerwartet hohe Virulenz in den ansonsten
gegen Infektion mit Influenza-A-Viren sehr resistenten A2G-Mäusen aus. Das andere
Virus, genannt low virulent PR8 (lvPR8), wurde an Mäuse eines Stamms ohne
funktionelles Mx1-Gen adaptiert. Die Pathogenität von lvPR8 entspricht in etwa der von
anderen A/PR/8/34-Viren (Haller, 1981). Die beiden Viren wurden vollständig sequenziert.
Sequenzvergleiche zeigten, dass es Basen- und Aminosäureunterschiede zwischen den
beiden Viren gibt. In Tabelle 1.2 sind die Aminosäureaustausche in hvPR8 im Vergleich
zu lvPR8 angegeben.
Genprodukt
Aminosäureaustausche, lvPR8 gegen hvPR8
PB2
I105M, I504V
PB1
M174I, M205I, K208R, S216N, V587A
PB1-F2
R59K, R60Q
PA
Q193H, I550L
HA
A65T, P86L, N144T, N146T, ∆147R, E156A, P200S, E204D, N207K,
T220S, I266V, M269R, Y309F, Y343S, H369Q, T398S, I405T
NP
L353V, N430T
NA
L15M, K128R, S131N, E314K, K371E, M403I, S451T
M1
N82T
M2
T27A, T39I
NS1
D101E
NS2
I89V
Tabelle 1.2: Aminosäureaustausche in hvPR8 im Vergleich zu lvPR8. (∆ zeigt das Fehlen von 3
Nukleotiden in lvPR8 an)
Einleitung
1.1.5
10
Reverse Genetik von Influenza-A-Virus
Mit der Reversen Genetik für Influenza-Viren wurde ein wichtiges Werkzeug für die
Beantwortung vieler offener Fragen geschaffen. Mit dieser Methode wurde es möglich,
rekombinante Viren herzustellen und gezielt Mutationen ins Virusgenom einzufügen. Nach
verschiedenen Entwicklungsschritten in den Laboren von Peter Palese und Adolpho
García-Sastre in New York, bei denen noch die Verwendung von Helferviren und
anschließende Selektion nötig war (Enami et al., 1990, Garcia-Sastre et al., 1998), wurde
1999 ein System publiziert, das die Generierung rekombinanter Influeza-A-Viren
ausschließlich von klonierter cDNA möglich machte (Fodor et al., 1999, Neumann et al.,
1999).
B
A
PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M1, M2, NS1, NS2/NEP-Proteine
10 Proteine
mRNA
Splicing
Translation
RNA-Polymerase II
10 (+) mRNAs
Transfektion
RNA-Polymerase II (pol II)
(Splicing)
pII β-Aktin (Huhn)
RNA-Polymerase I
aII
vRNA
virale cDNA
tI
pIh
vRNP
RNA-Polymerase I (pol I)
mRNA
virale Polymeraseproteine
virale Polymeraseproteine
Splicing
8 (-) vRNAs
Proteine
PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M, NS-vRNAs
Abbildung 1.2: Reverse Genetik von Influenza-A-Virus. (A) Schematische Darstellung des Aufbaus der
bidirektionalen Expressionskonstrukte für die Synthese von vRNA und mRNA. (B) Übersicht über das aus
acht bidirektionalen Vektoren bestehende polI-polII- System zur Herstellung von rekombinantem InfluenzaA-Virus. Acht Expessionsplasmide, die virale cDNA unter der Kontrolle eine polI- und polII- Promotors
tragen, werden in humane 293T-Zellen transfiziert. Es entstehen vRNA, mRNA und virale Proteine. Durch
assembly und budding werden rekombinante Viren freigesetzt (Adaptiert nach Hoffmann et al., 2000).
Für diese Arbeit wurde ein 8-Plasmid System genutzt (Hoffmann et al., 2000), in dem die
genetische Information für jedes der jeweils acht vRNA-Segmente von hvPR8 und lvPR8
in den bidirektionalen pDZ-Vektor kloniert wurde. Humane 293T-Zellen wurden mit
diesen Expressionsvektoren transfiziert. Abbildung 1.2A zeigt den schematischen Aufbau
der Konstrukte.
11
Einleitung
Die virale cDNA ist in diesen Konstrukten flankiert von einem humanen RNA-Polymerase
I-Promotor (pIh) und einem RNA-Polymerase I-Terminator (tI). Von der zellulären RNAPolymerase I (polI) wird vRNA in negativer Orientierung synthetisiert. Die so hergestellte
vRNA trägt non coding regions (NCR) sowohl im 3’- als auch im 5’-Ende. Das polISystem ist wiederum flankiert von einem polII-System, bestehend aus einem konstitutiv
aktiven
β-Aktin-Promotor
aus
dem
Huhn
und
einem
Polyadenylierungssignal.
Transkription durch die RNA-Polymerase II generiert hier mRNA mit einem 5’-Cap und
einer Polyadenylierung am 3’-Ende. Von der mRNA, die im Fall von M2 und NS2/NEP
noch gespleißt wird, werden durch die zelluläre Translationsmaschinerie 11 virale Proteine
synthetisiert. Wie in Abbildung 1.2B dargestellt, lagern sich die synthetisierten viralen
Proteine an die im polI-System generierte vRNA an und es entstehen vRNPs. Von diesen
vRNPs können durch die virale Polymerase wiederum mRNAs transkribiert werden, die
ebenfalls der Synthese von viralen Proteinen dienen. Analog zum assembly und budding
im natürlichen Replikationszyklus von Influenza-A-Virus kommt es auch in diesem
artifiziellen System zur Entstehung neuer Virionen.
Einleitung
12
1.2
Mx-Proteine
1.2.1
Das angeborene Immunsystem
Das angeborene, nicht adaptive Immunsystem der Vertebraten spielt eine sehr wichtige
Rolle bei der Erkennung und Abwehr von Krankheitserregern. Schon unmittelbar nach
Eindringen in den Organismus können Pathogene, d.h. Viren und Mikroorganismen,
erkannt und ihre Ausbreitung verhindert werden. Es überbrückt die Zeit, bis der Schutz
durch das spezifische, adaptive Immunsystem zum Tragen kommt. Zur angeborenen
Immunität tragen viele verschiedene Zelltypen bei. Alle diese Zellen verfügen über pattern
recognition receptors (PRR), mit denen sie pathogenspezifische Strukturen, die pathogen
associated molecular patterns (PAMP), erkennen. Prominente Vertreter der Gruppe der
PRRs sind die Toll-like-Rezeptoren (TLRs), RIG-I und MDA5. Sie vermitteln die
Ausschüttung von Zytokinen, die den antimikrobiellen Status der Zelle über Bindung an
spezifische Rezeptoren induzieren. Hierbei kommt dem Interferon (IFN)-System
besondere Bedeutung zu. Alick Isaacs und Jean Lindenmann gelang 1957 als Ersten der
Nachweis des IFN als eine Substanz, die das Potential hatte, die Ausbreitung von Virus im
Zellkultursystem zu verhindern (Isaacs und Lindenmann, 1957). Heute kennt man drei
Typen von IFN. Zu den Typ-I-IFN gehören das IFN-α und das IFN-β. Von fast allen
menschlichen Zellen ist bekannt, dass sie Typ-I-IFN bilden können. Dadurch wird in den
benachbarten Zellen ein antiviraler Status induziert und diese so vor einer letalen Infektion
geschützt. Typ-I-IFN nehmen eine zentrale Rolle bei der Hemmung von Viren ein. Das
IFN-γ ist das einzige Mitglied der Gruppe der Typ-II-IFN. IFN-γ wird hauptsächlich von
Zellen des Immunsystems gebildet. Es dient der Regulation des adaptiven Immunsystems.
Im Jahr 2003 wurde eine neue Gruppe von IFN beschrieben, die Typ-III-IFN. Zu dieser
Gruppe gehören das IFN-λ1, -λ2 und -λ3 (Kotenko et al., 2003). Synonym werden diese
auch als IL-28A, IL-28B und IL-29 bezeichnet (Sheppard et al., 2003). Interessanterweise
sind die λ-Interferone selbst IFN-induziert (Ank et al., 2006). IFN-λ1 ist das Potenteste der
drei λ-Interferone. Derzeit geht man jedoch davon aus, dass Typ-III-IFN eine weitaus
geringere antivirale Aktivität vermitteln als Typ-I-IFN (Ank et al., 2006).
Der klassische Weg für die Induktion von Typ-I-IFN ist die Aktivierung einer
Signalkaskade durch Doppelstrang-RNA (dsRNA). Diese entsteht als Intermediat bei der
viralen Replikation. In uninfizierten Zellen kommt sie hingegen nicht vor. Das von der
infizierten
Zelle
produzierte
Typ-I-IFN
bindet
autokrin
und
parakrin
an
13
Einleitung
Interferonrezeptoren (IFNAR) auf der Zellmembran. Durch die Bindung kommt es zur
Auslösung einer Signalkaskade (Samuel, 2001), die in der Transkription von mehr als 300
interferon stimulated genes (ISGs) resultiert (Der et al., 1998). Die ISGs stehen unter der
Kontrolle von interferon stimulated regulatory elements (ISRE) in deren Promotorregion.
Die synthetisierten Genprodukte tragen zum antiviralen Status der Zelle bei (Staeheli,
1990). Besonders wichtig sind hier die Mx-Proteine. Daneben sind noch zwei weitere ISGs
mit antiviraler Aktivität, die dsRNA-aktivierte Proteinkinase R (PKR) und die 2’,5’Oligoadenylat-Synthetase (OAS), gut charakterisiert (Samuel, 2001). Zum Mechanismus
der PKR ist bekannt, dass sie die Translation durch Phosphorylierung des
Translationsinitiationsfaktors eIF2α hemmt (Katze, 1995), wobei die OAS den Abbau
einzelsträngiger RNA (ssRNA) durch die unspezifische RNase initiiert (Silverman, 1994).
Das gemeinsame Ziel der PKR und der OAS ist somit die Hemmung der Proteinsynthese.
Collins et al. konnten im Jahr 2004 zeigen, dass zumindest bei einigen behüllten Viren das
Eindringen des Virus in die Zelle genügt, um die Transkription von ISGs einzuleiten
(Collins et al., 2004). Somit ist beweisen, dass es nicht unbedingt der Synthese von
Interferon bedarf, um einen durch ISGs vermittelten antiviralen Status der Zelle zu
erreichen.
1.2.2
Das Mx-Protein
Im Jahr 1962 wurde von Jean Lindenmann erstmals berichtet, dass sich Mäuse des
Inzuchtstammes A2G als resistent gegen Infektion mit mausadaptierten Influenzaviren
zeigten (Lindenmann, 1962). Infektionen bei anderen Labormausstämmen verliefen
tödlich, während die A2G-Tiere auch bei hohen Dosen asymptomatisch blieben. Nach
weiteren Untersuchungen ließ sich die Resistenz auf ein einzelnes Gen zurückführen, das
autosomal dominant vererbt wird (Lindenmann, 1964). Da dieses Gen Mäuse resistent
gegen eine Infektion mit Orthomyxoviren machte, wurde es Myxovirus resistance (Mx)Gen genannt. Später konnte dann gezeigt werden, dass die Mx-vermittelte Resistenz mit
Typ-I-IFN in Zusammenhang steht (Haller, 1981, Haller et al., 1979, Haller et al., 1980).
Man fand, dass das Mx-Gen für ein 72kDa großes Protein codiert, das bei murinen Zellen
im Kern lokalisiert ist (Dreiding et al., 1985, Staeheli und Haller, 1985). Nachdem
genetische Analysen durchgeführt worden waren, konnte gezeigt werden, dass das
Vorhandensein des Mx-Gens dem Wildtyp von in freier Wildbahn lebenden Mäusen
Einleitung
14
entspricht. Laborstämme haben durch Mutationen und Deletionen im Mx-Gen die
Resistenz gegen Orthomyxoviren verloren (Haller et al., 1987, Staeheli et al., 1988). Das
Mx-Gen konnte auf Chromosom 16 lokalisiert werden. Weiter gelang es auch, ein ISRE in
der Promotorregion des Mx-Gens nachzuweisen (Hug et al., 1988, Reeves et al., 1988,
Staeheli et al., 1986). Das murine Mx-Gen wurde Mx1 genannt. Staeheli und Sutcliffe
beschrieben noch ein weiteres murines Mx-Gen, das Mx2 genannt wurde (Staeheli und
Sutcliffe, 1988). Mx2 ist antiviral aktiv gegen Bunyaviren und das Vesikuläre
Stomatitisvirus (VSV) (Sandrock et al., 2001). Mx-Gene konnten noch bei verschiedenen
anderen Vertebraten, bei Fischen und bei Vögeln identifiziert werden. Auch der Mensch
verfügt über zwei Mx-Gene (Aebi et al., 1989). Diese wurden MxA und MxB genannt und
sind auf Chromosom 21 lokalisiert. Das zytoplasmatische MxA-Protein zeigt antivirale
Aktivität u.a. gegen Influenza-A-Virus, Influenza-B-Virus, Bunyaviren, Masernviren und
gegen das Hepatitis B-Virus (Haller und Kochs, 2002). Für das im Kern und im Zytolasma
lokalisierte MxB-Protein konnte keine antivirale Aktivität nachgewiesen werden.
Ein genereller Mechanismus für die antivirale Wirkung der Mx-Proteine, die zur
Superfamilie der dynamin-ähnlichen großen GTPasen gehören, ist noch nicht bekannt.
Allerdings weiß man, dass die antivirale Aktivität von Mx1 im Fall von Influenza-A-Viren
auf der Inhibition der Primärtranskription beruht. MxA hemmt hingegen nicht die
Primärtranskription, sondern einen späteren Schritt der Replikation (Pavlovic et al., 1992).
Für die Untersuchungen in dieser Arbeit wurden hauptsächlich Mäuse des Stamms
B6.A2G-Mx1, genannt B6-Mx1, verwendet. Sie entstanden durch Rückkreuzung des Mx1Allels aus Stamm A2G auf C57BL/6-Hintergrund. Da C57BL/6 und B6.A2G-Mx1 kongen
sind, bieten sie ein besonders gutes System, um Mx1-spezifische Effekte zu untersuchen
(Horisberger et al., 1983).
15
1.3
Einleitung
Zielsetzung dieser Arbeit
Warum Influenza-A-Viren einen hochpathogenen Phänotyp in immunkompetenten Wirten
zeigen, ist immer noch nicht ausreichend verstanden. Ziel dieser Dissertation war es, ein
hochpathogenes A/PR/8/34-Virus (hvPR8) sowohl in vitro als auch in vivo zu
charakterisieren und auf diese Weise virale Pathogenitätsfaktoren zu definieren. Mit Hilfe
der Reversen Genetik sollten rekombinante Viren hergestellt werden, um so die
Genprodukte von hvPR8 zu finden, die die extreme Virulenz im immunkompetenten Wirt
vermitteln.
Ein besseres Verständnis der Pathogenese von Influenza-A-Viren ist hinsichtlich der
großen Gefahr neuer Pandemien und des trotz Impfung und antiviraler Medikation immer
noch unzulänglichen Schutzes gegen hochvirulente Stämme sehr wichtig.
Material und Methoden
2
Material und Methoden
2.1
Material
16
Im Folgenden sind die Materialien aufgeführt, die neben den Standardreagenzien und
-materialien der AG Stäheli und der AG Haller bei dieser Arbeit zum Einsatz kamen und
einen besonderen Stellenwert besitzen.
2.1.1
Enzyme, Reaktionspuffer und Chemikalien
Taq-DNA-Polymerase
Eppendorf, Hamburg
Restriktionsendonukleasen und Restriktionspuffer
Fermentas, St. Leon-Rot
2.1.2
Nukleinsäuren
peqGOLD TrifastTM
PEQLAB Biotech, Erlangen
Desoxyribonukleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)
Fermentas, St. Leon-Rot
DNA-Größenmarker GeneRulerTM
Fermentas, St. Leon-Rot
100 bp-DNA-Ladder plus
1 kbp-DNA-Ladder
Plasmid Midi Prep Kit NucleoBond
Machery-Nagel, Düren
DNA-Gel-Kammer Wide Mini Sub Cell
Biorad, München
2.1.3
Proteinmethoden
Proteingel-Kammern PROTEAN II
Biorad, München
Nassblot-System PROTEAN II
Biorad, München
Immobilion-P Transfer Membran
Millipore, Schwalbach
ECL Western-Blot Detektionsreagenz
Amersham, Freiburg
17
Material und Methoden
Prestained SDS-PAGE Standard (low range)
Biorad, München
Whatman-Papier
Whatman, Dassel
2.1.4
Zellkulturmaterial
DMEM ‚high-glucose’
Invitrogen, Carlsbad
fetales Rinderserum
Biochrom, Berlin
Glutamin
Life Technologies, Wiesbaden
Penicillin/Steptomycin
Life Technologies, Wiesbaden
Trypsin-Versen-Lösung
Gibco BRL, Wiesbanden
Trypsin, TPCK gereinigt
Sigma-Aldrich, München
HEPES
Roth, Karlsruhe
2.1.5
Transfektionsreagenzien
Optimem
Gibco, Wiesbaden
Lipofectamin 2000
Invitrogen, Carlsbad
Metafectene
Biontex, Martinsried
2.1.6
Kits
CAT-ELISA Kit
Roche, Mannheim
IFN-β-ELISA Kit
PBL Biomedical Laboratories,
Piscataway
Dual-Luziferase Reporter Assay System
Promega, Mannheim
Material und Methoden
2.1.7
18
Immunhistochemie
Tissue Tek®
Sakura Finetek, Heppenheim
Mowiol
Sigma-Aldrich, München
Mowiol-Lösung:
2.1.8
10%
Mowiol
25%
Glycerin
100mM
Tris/HCL, pH 8,5
2,5%
DABCO
Oligonukleotide
In Tabelle 2.1 sind die in dieser Arbeit für die PCR verwendeten Primer aufgeführt.
Name
Nr.
Sequenz
canines IFN-β Forward-Primer
#463
5’-gag atg gta ata ggt gag act c-3’
canines IFN-β Reverse-Primer
#464
5’-ctt cag ttc tgg aga taa tct g-3’
canines β-Aktin Forward-Primer
#524
5’-caa ggc caa ccg tga gaa gat gac-3’
canines β-Aktin Reverse-Primer
#525
5’-acc gct cgt tgc caa tag tga tga c-3’
Influenza NP Forward-Primer
#512
5’-gca ggt gct gca gtc aaa gga-3’
Influenza NP Reverse-Primer
#513
5’-aaa gct tcc gtc ttg gg-3’
Tabelle 2.1: Diagnostikprimer
19
2.1.9
Material und Methoden
Plasmide
In Tabelle 2.2 sind die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide aufgeführt.
Plasmid
Nr.
Beschreibung
Referenz
pHL1104
#1385
AmpR; CAT-Reportergen mit
G. Neumann/
modifizierten Enden der HA-vRNA,
G. Hobom
Pol I-Promotor
pcDNA3-RFP-MxA #2153
AmpR; RFP-MxA,
S. Stertz
CMV-Promotor
pGL3-Mx1P
#2046
AmpR, Firefly-Luziferase-Reportergen,
G. Kochs
Mx1-Promotor
pRL-SV40
#1851
AmpR, Renilla-Luziferase-Reportergen,
Promega
SV40-Promotor
pDZ-Seg1 (hvPR8)
#3151.I14
AmpR, PB2-Gen von hvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg2 (hvPR8)
#3149.M8
AmpR, PB1-Gen von hvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg3 (hvPR8)
#3147.I4
AmpR, PA-Gen von hvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg4 (hvPR8)
#3121.9
AmpR, HA-Gen von hvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg5 (hvPR8)
#3127.S2
AmpR, NP-Gen von hvPR8,
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
G. Kochs
Material und Methoden
pDZ-Seg6 (hvPR8)
#3125.2
20
AmpR, NA-Gen von hvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg7 (hvPR8)
#3117.1
AmpR, M-Gen von hvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg8 (hvPR8)
#3113.5.1
AmpR, NS-Gen von hvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg1 (lvPR8)
#3152.K13 AmpR, PB2-Gen von lvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg2 (lvPR8)
#3150.H34 AmpR, PB1-Gen von lvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg3 (lvPR8)
#3148.K14 AmpR, PA-Gen von lvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg4 (lvPR8)
#3122.13
AmpR, HA-Gen von lvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg5 (lvPR8)
#3128.5
AmpR, NP-Gen von lvPR8,
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg6 (lvPR8)
#3126.6
AmpR, NA-Gen von lvPR8,
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
G. Kochs
21
pDZ-Seg7 (lvPR8)
#3118.11
AmpR, M-Gen von lvPR8,
Material und Methoden
G. Kochs
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
pDZ-Seg8 (lvPR8)
#3114.15.5 AmpR, NS-Gen von lvPR8,
pol I- und pCAGGS- Promotor
(bidirektional)
Tabelle 2.2: Plasmide
G. Kochs
Material und Methoden
2.1.10
22
Antikörper
In Tabelle 2.3 sind die in dieser Arbeit verwendeten Antikörper aufgeführt.
Name
Nr.
Beschreibung
Verdünnung
Referenz
anti-FLU-Turkey
#84
polyklonal, Kaninchen
1:1000
J. Pavlovic
anti-FLUAV-NP
#191
polyklonal, Kaninchen
1:5000
S. Gruber
anti-FLUAV-NS1
#209
polyklonal, Kaninchen
1:2000
A. Solorzano
anti-Aktin
#172
polyklonal, Kaninchen
1:2000
Sigma
polyklonal, Schaf,
1:2000
Amersham
1:2000
Amersham
1:400
Dianova
Flohr et al., 1999
anti-Maus-HRP
Sekundärantikörper
anti-Kaninchen-
polyklonal, Esel,
HRP
Sekundärantikörper
anti-Kaninchen-Cy3 #1008 polyklonal, Esel,
Sekundärantikörper
anti-Mx M143
#147
monoklonal, Maus
1:100
anti-Influenza
#979
polyklonal, Mensch
1:100
anti-Maus-DTAF
#42
polyklonal, Ziege,
1:100
Dianova
1:50
Dianova
Sekundärantikörper
anti-Human-TRITC #1040 polyklonal, Ziege,
Sekundärantikörper
Tabelle 2.3: Primär- und Sekundärantikörper
23
2.1.11
Material und Methoden
Zellen
In Tabelle 2.4 sind die in dieser Arbeit verwendeten Zellinien aufgeführt. Alle Zellen
wurden bei 37°C und 95% Luftfeuchtigkeit mit 5% CO2 inkubiert.
Zellen
Spezies
Zelltyp
Referenz
MDCK
Canis familiaris (Hund)
Epitheliale Nierenzellen
Madin
und
Darby,
1958
L929
Mus musculus (Maus)
Fibroblasten
293T
Homo sapiens (Mensch)
Epitheliale Nierenzellen
Tabelle 2.4: Zellen
2.1.12
Mausstämme
In Tabelle 2.5 sind die in dieser Arbeit verwendeten Mausstämme aufgeführt.
Stamm
Beschreibung
Quelle
C57BL/6
natürlicher
(B6)
Mx1-Allel
B6.A2G-Mx1
durch
(B6-Mx1)
Mx1-Allels aus Stamm A2G
BALB-Mx1
durch
Knockout
Rückkreuzung
Rückkreuzung
Referenz
im Harlan, Borchen
des Peter Stäheli
Staeheli et al., 1985
des Peter Stäheli
Mx1-Allels
B6-IFNAR0/0
natürlicher
Knockout
Mx1-Allel
und
IFNAR1-Allel
Tabelle 2.5: Mausstämme
im Peter Stäheli
defektes
Müller et al., 1994
Material und Methoden
2.1.13
24
Anästhesie der Versuchstiere
für Infektionen:
Ketamin-Rompun-Anästhesie (5ml):
500µl
10%
Ketavet®
Essex Tierarznei, München
125µl
2%
Rompun®
Bayer AG, Leverkusen
4375µl
0,9% NaCl-Lösung
für Finalversuche:
Trapanal® (Thiopental-Natrium)
Altana, Konstanz
Forene®
Abbott, Wiesbaden
25
2.1.14
Material und Methoden
Viren
In Tabelle 2.6 sind die in dieser Arbeit verwendeten Influenzaviren (Orthomyxoviridae)
aufgeführt.
Virus
Stock Nr.
Referenz
A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (hvPR8)
#837
Otto Haller
A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (lvPR8)
#844
Otto Haller
recFLUAV PR8 – rec PR8∆NS1
#111
García-Sastre et al., 1998
recFLUAV PR8 – rec lvwt
#141
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hvwt
#142
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv2,3,4,5,6,7,8lv1
#143
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv1,3,4,5,6,7,8lv2
#144
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv1,2,4,5,6,7,8lv3
#145
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv1,2,3,5,6,7,8lv4
#146
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv1,2,3,4,6,7,8lv5
#147
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv1,2,3,4,5,7,8lv6
#148
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv1,2,3,4,5,6,8lv7
#149
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv1,2,3,4,5,6,7lv8
#150
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv4,6lv1,2,3,5,7,8
#153
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv1,2,3,5,7,8lv4,6
#154
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv4lv1,2,3,5,6,7,8
#161
diese Arbeit
recFLUAV PR8 – rec hv6lv1,2,3,4,5,7,8
#162
diese Arbeit
Tabelle 2.6: Influenzaviren
Material und Methoden
2.1.15
26
Interferone und Immunmodulatoren
In Tabelle 2.7 sind die in dieser Arbeit verwendeten Interferone und Immunmodulatoren
aufgeführt.
Name
Quelle
rekombinantes humanes
Gangemi et al., 1989
hybrid-Interferon-αB/D
S-28463 (Resiquimod)
Tabelle 2.7: Interferone und Immunmodulatoren
3M Pharmaceuticals
27
2.2
Methoden
2.2.1
Zellkulturarbeiten
Material und Methoden
2.2.1.1 Kultivierung der Zellen
Alle Zellen wurden unter den in 2.1.11 genannten Bedingungen gehalten. Als Medium
wurde Dulbecco’s modified essential medium (DMEM) mit 10% fetalem Kälberserum
(FCS), 525,6 mg/l Glutamin, 50 000E/l Penicillin und 50mg/l Streptomycin verwendet, im
Folgenden Zellkulturmedium genannt. Zum Waschen der Zellkultur wurde Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ohne Ca++ und Mg++ nach einem Protokoll von Mayr et al.
verwendet, im folgenden Zellkultur-PBS genannt (Mayr et al., 1974). Die Zellen mit einer
1:4-Mischung
aus
Trypsin-Versen
(0,05%
Trypsin
1:250;
0,16%
EDTA
Dinatriumsalzdihydrat) von der Kulturschale abgelöst. Die Kultivierung sowie das
Auftauen und Einfrieren der Zellen erfolgte nach den von Doyle beschriebenen Techniken
für die Zellkultur (Doyle et al., 1996).
2.2.1.2 Plaqueassay zur Virustiterbestimmung
24 Stunden vor Infektion wurden MDCK-Zellen im Verhältnis 1:3 in 6-Loch-Platten
ausgesät. Mit den zu untersuchenden Proben wurde eine logarithmische Verdünnungsreihe
in PBS mit 0,3% BSA durchgeführt. Die konfluenten Zellen wurden mit Zellkultur-PBS
gewaschen und dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 800µl der Virusverdünnung
infiziert. Dann wurde das Inokulum abgesaugt und der Zellrasen mit Agarmedium
folgender Zusammensetzung überschichtet:
für 50ml:
25,0ml
2-fach DMEM mit Glutamin, Penicillin, Streptomycin
0,5ml
10% bovines Serumalbumin (BSA)
0,5ml
1% DEAE-Dextran
1,0ml
5% NaHCO3
7,0ml
Aqua bidest.
1,0ml
1M HEPES, pH 7,3
15,0ml
2% Oxoidagar in Aqua bidest.
50µl
Trypsin, TPCK-gereinigt (1mg/ml)
Material und Methoden
28
Die Zellen wurden dann im Brutschrank bei 37°C, 95% relativer Luftfeuchtigkeit und 5%
CO2 inkubiert, bis Plaques zu sehen waren (zirka 48 Stunden nach Infektion). Die
Fixierung der Zellen erfolgte für 15 Minuten mit 3% Formaldehydlösung. Nachdem der
Agar entfernt war, wurden die Zellen für 10 Minuten mit 1% Kristallviolettlösung gefärbt.
Kristallviolett:
1%
Kristallviolett
3,6%
37% Formaldehydlösung
1%
Methanol
20%
Ethanol
in PBS
Der Virustiter der Probe konnte durch Auszählen der Plaques als plaque forming units
(pfu) pro Mililiter bestimmt werden.
pfu/ml
y:
=
Anzahl der Plaques x 10y x 1,25
Positiver Exponent der Virusverdünnung, mit der die Zellen in diesem Loch
infiziert wurden.
29
Material und Methoden
2.2.1.3 Erstellung von Wachstumskurven in MDCK
MDCK-Zellen wurden 24 Stunden vor Infektion im Verhältnis 1:3 in 25cm2Zellkulturflaschen ausgesät. Der konfluente Zellrasen wurde dann nach Waschen mit PBS
für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einer multiplicity of infection (MOI) von 0,001 der
Viren hvPR8 bzw. lvPR8 infiziert. Das bedeutet, dass mit einem infektiösen Partikel pro
1000 Zellen inokuliert wurde. Dann wurde das Inokulum abgenommen und die Zellen
sechsmal mit PBS gewaschen. Zur weiteren Kultivierung der infizierten Zellen wurde
Infektionsmedium genutzt. Dieses wurde 3 Stunden nach Infektion noch einmal
gewechselt.
Infektionsmedium:
5ml
DMEM mit Glutamin und Penicillin/Streptomycin
0,2%
BSA
20mM
HEPES
2,5µl
Trypsin (1µg/ml)
12, 24 und 36 Stunden nach Infektion wurden Proben aus dem Überstand entnommen und
der Virustiter mittels Immunfluoreszenztest bestimmt.
2.2.1.4 Immunfluoreszenztest zur Virustiterbestimmung
MDCK-Zellen wurden 24 Stunden vor Infektion im Verhältnis 1:3 in eine 96-Loch-Platte
eingesät (100µl pro Loch). Mit der zu untersuchenden Probe wurde eine logarithmische
Verdünnungsreihe in PBS mit 0,3% BSA (900µl PBS + 0,3% BSA und 100µl Probe)
durchgeführt. Die Zellen wurden dann einmal mit Zellkultur-PBS gewaschen und für eine
Stunde bei Raumtemperatur mit je 50µl der Virusverdünnungen pro Loch infiziert. Nach
einer Stunde wurde die Verdünnung abgesaugt und der Zellrasen mit Zellkulturmedium
überschichtet und bei 37°C inkubiert.
16
Stunden
nach
Infektion
wurden
die
Zellen
für
15
Minuten
mit
3%
Paraformaldehydlösung in PBS fixiert, dreimal gewaschen mit PBS und danach für weitere
15 Minuten mit 0,5% Triton X-100 in PBS permeabilisiert und wieder dreimal gewaschen.
Als Primärantikörper wurde das polyklonale Kaninchenserum #84 anit-FLU-Turkey in
einer Verdünnung von 1:1000 in 1% Milchpulver verwendet. Als Sekundärantikörper
Material und Methoden
30
diente das Esel-anti-Kaninchenserum #1008 in einer Verdünnung von 1:400 in 1%
Milchpulver. Beide Inkubationsschritte wurden bei Raumtemperatur, die Inkubation mit
dem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper zusätzlich bei Dunkelheit durchgeführt. Die
Auswertung fand an einem Polyvar 2-Mikroskop (Leica) statt. Durch Auszählen der
infizierten Zellen konnte der Virustiter der Probe in focus forming units (ffu) pro Milliliter
bestimmt werden.
ffu/ml
y:
=
Anzahl der Foci x 10y x 20
positiver Exponent der Virusverdünnung, mit der die Zellen in diesem Loch
infiziert wurden
2.2.1.5 Transiente Transfektion
Die Transfektion von 293T- und MDCK-Zellen wurde mit dem Transfektionsreagenz
Lipofectamine 2000 durchgeführt. Die Transfektion von L929-Zellen erfolgte mit dem
Transfektionsreagenz Metafectene. Die zu transfizierenden Zellen wurden so in 6-LochPlatten eingesät, dass sie am Tag der Transfektion zu 80% konfluent waren. Die zu
transfizierende DNA wurde in 50µl Optimem verdünnt. Parallel dazu wurden in einem
Polystyrolröhrchen weitere 250µl Optimem mit dem Transfektionsreagenz vorbereitet.
Dazu wurde ein Verhältnis von 2µl Lipofectamine 2000/1µg DNA bzw. von 8µl
Metafectene/1µg DNA gewählt. Das DNA-Optimem-Gemisch wurde nach 5 Minuten in
das Polystyrolröhrchen getropft und die DNA-Liposomen-Lösung leicht durchmischt.
Nach 20-30 Minuten Inkubationszeit, die der Bildung von DNA-Liposomen-Komplexen
dienten, wurde der Transfektionsansatz zu den zuvor gewaschenen und mit 700µl
Optimem überschichteten Zellen getropft. Nach 4 Stunden erfolgte ein Mediumwechsel.
2.2.1.6 Bestimmung von Typ-I-Interferon im Überstand infizierter Zellen
MDCK-Zellen wurden mit einer multiplicity of infection (MOI) von 0,5 infiziert. Nach 16
Stunden wurde der Überstand abgenommen und in einem Dialyseschlauch zweimal 5
31
Material und Methoden
Stunden gegen 0,1M Glycin pH 2 dialysiert. Dann erfolgte eine zweimalige Dialyse gegen
PBS mit Penicillin und Streptomycin für 12 Stunden.
Das Dialysat wurde im Verhältnis 1:1 mit Zellkulturmedium gemischt. Infektiöse Partikel
wurden durch die Säure deaktiviert. Interferone, im Folgenden als IFN abgekürzt, konnten
aufgrund ihrer großen Stabilität in ihrer Struktur erhalten werden.
2.2.1.7 Dualer Luziferase-Reportertest
Die Stimulation des Mx1-Promotors durch Interferon wurde mit Hilfe eines Dualen
Luziferase Reportertests gemessen. MDCK-Zellen wurden wie unter 2.2.1.5 beschrieben
mit 0,5µg des Reporterkonstrukts pGL3-Mx1P-Luc (#2046) transfiziert. Um Unterschiede
in der Transfektionseffizienz und im Zelltod während des Versuchs auszugleichen, wurde
zusätzlich 0,1µg des durch den konstitutiven SV40-Promotor kontrollierten RenillaLuziferase-Reporterplasmids pRL-SV40 (#1851) transfiziert. Zur Kontrolle wurde ein
separates Loch mit 0,5µg eines Expressionsvektors mit unter dem immediate early genePromotor des humanen Cytomegalievirus stehenden GFP-Gen transfiziert. 12 Stunden
nach Transfektion konnte am Fluoreszenzmikroskop der Transfektionserfolg kontrolliert
werden. Der Mx1-Promotor wurde durch IFN im nicht infektiösen Überstand
virusinfizierter Zellen (vgl. 2.2.1.6) für 20 Stunden stimuliert. Die Zellen wurden mit
200µl passivem Lysepuffer lysiert und für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Danach wurden
die
Zelltrümmer
kurz
abzentrifugiert.
20µl
Lysat
wurden
in
einem
4ml
Luminometerröhrchen vorgelegt und nach Zugabe von 100µl Firefly-Luziferase-AssayReagenz die der Firefly-Luziferase-Aktivität entsprechende Chemilumineszenz gemessen.
Mit 100µl Stop&Glo-Substrat wurde die Aktivität der Firefly-Luziferase inhibiert und
dann die Aktivität der Renilla-Luziferase gemessen.
2.2.1.8 Minigenomassay zur Bestimmung der Replikationseffizienz
Zur Bestimmung der Replikationseffizienz von Viren wurden konfluente L929-Zellen in
150cm2-Platten mit 10µg des CAT-Reportergens (#1385) transfiziert. Dieses Minigenom
enthält den Leserahmen des Reportergens in negativer Polarität, flankiert von den 5’- und
3’-NCRs des vierten viralen Genomsegments (HA) unter Kontrolle eines RNAPolymersase-I-Promotors. Das RNA-Transkript gleicht einem viralen Gensegment. Als
Material und Methoden
32
Transfektionsreagenz dienten 70µl Metafectene. 12 Stunden später wurden die Zellen
abgelöst und in 6-Loch-Platten ausgesät. Durch diesen Schritt konnte eine gleichmäßige
Transfektionseffizienz in allen Ansätzen gewährleistet werden. Weitere 12 Stunden später
wurden die Zellen mit einer MOI von 0,5 infiziert. 8, 12, 16 und 20 Stunden nach Infektion
wurden die Zellen in 500µl des CAT-Lysepuffers für 25 Minuten bei Raumtemperatur
unter Schütteln lysiert. Nach Zentrifugation der Lysate (10 Minuten bei 15000upm)
wurden die Mengen an CAT-Protein entsprechend der Herstellerangaben mit dem CATELISA-Kit gemessen.
2.2.1.9 Minireplikonsystem zur Messung der Polymeraseaktivität
Hierzu wurden L929-Zellen wie unter 2.2.1.5 beschrieben mit Expressionsvektoren, die für
die viralen Polymeraseuntereinheiten PB2, PB1 und PA sowie für das NP codieren,
transfiziert. Es wurden 0,3µg der Expressionskonstrukte für die Polymeraseuntereinheiten,
0,6µg der Expressionskonstrukte für das NP und 0,4µg des CAT-Minigenoms (#1385)
transfiziert. Zur internen Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden 0,4µg des konstitutiv
aktiven Reporterkonstrukts pRL-SV40 (#1851) kotransfiziert, das für Renilla-Luziferase
kodiert. Nach 16 Stunden wurden die Zellen in 500µl des CAT-Lysepuffers für 25
Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln lysiert. Nach Zentrifugation der Lysate (10
Minuten bei 15000upm) wurden die Proben entsprechend der Herstellerangaben mit dem
CAT-ELISA-Kit gemessen und die Aktivität der Renilla-Luziferase luminometrisch
bestimmt.
2.2.1.10 Herstellung rekombinanter Influenzaviren
Im Rahmen dieser Arbeit wurden rekombinante Influenzaviren auf Basis der Influenza
A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)-Viren hvPR8 (#837) und lvPR8 (#844) hergestellt. Es wurden
acht bidirektionale Expressionsvektoren, die acht virale cDNAs unter Kontrolle zweier
Promotoren enthalten, eingesetzt. Die Vektoren wurden in eine Kokultur von 293T- und
MDCK-Zellen transfiziert. Von jedem Plasmid wurden 0,5µg eingesetzt, sodass sich bei 8
Plasmiden pro Ansatz eine DNA-Menge von 4µg ergab. Die Plasmide wurden in 50µl
Optimem zu einem DNA-Mix zusammengeführt.
Parallel wurden 250µl Optimem in einem Polystyrolröhrchen mit 8µl Lipofectamine 2000
angesetzt. Nach 5 Minuten wurden beide Ansätze im Polystyrolröhrchen gemischt und für
33
Material und Methoden
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bildung von DNA-LiposomenKomplexen zu gewährleisten.
Die 293T- und MDCK-Zellen wurden zunächst in insgesamt 10ml Zellkulturmedium
aufgenommen und dann 5 Minuten bei 900 upm abzentrifugiert. Das so gewonnene
Zellpellet wurde daraufhin in 3,5ml DMEM mit 0,1% FCS, 0,3% BSA, Glutamin,
Penicillin und Streptomycin resuspendiert.
Nach abgelaufener Inkubationszeit wurden 250µl der Zellsuspension zu jedem
Transfektionsansatz in das Polystyrolröhrchen gegeben, kurz durchmischt und dann in eine
3,5cm-Schale mit 1ml des BSA enthaltenden Mediums gegeben.
Der Ansatz wurde für 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurde das Medium
abgenommen und 1,5ml DMEM mit 0,3% BSA, 10µM Hepes, 1µg/ml TPCK-gereinigtem
Trypsin, Penicillin und Streptomycin zugefügt.
48 Stunden nach Transfektion konnte das Medium, das nun rekombinantes Virus enthielt,
abgenommen und kurz abzentrifugiert werden.
150µl des Überstands wurden daraufhin in die Allantoishöhle von 8-9 Tagen bebrüteten
Hühnereiern injiziert, um das Virus zu hohen Titern heranwachsen zu lassen. Weitere 48
Stunden später konnten die Embryonen durch Kälte abgetötet und die Allantoisflüssigkeit
geerntet werden.
Die gewonnene Flüssigkeit wurde nach der in 2.2.1.2 beschrieben Methode per
Plaqueassay titriert. Dieser Schritt diente auch dazu, die rekombinanten Viren zu reinigen.
Dazu wurden einzelne Plaques gepickt und in 600µl PBS mit 0,3% BSA gelöst. Von dieser
Lösung wurden nochmals 150µl in die Allantoishöhle 8-9 Tage bebrüteter Hühnereier
injiziert und diese wieder für 48 Stunden bei 37°C bebrütet.
Die aus dieser Eipassage gewonnene Allantoisflüssigkeit diente als Virusstock. Der Titer
des Virusstocks wurde per Immunfluoreszenztest (vgl. 2.2.1.4) bestimmt.
Material und Methoden
2.2.2
34
Proteinbiochemische Methoden
2.2.2.1 Herstellung von Zelllysaten für Western Blot
Adhärente Zellen wurden in 6-Loch-Platten mit PBS gewaschen, mit 100µl Lysepuffer
bedeckt und für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wurden die Zellen mit einem
Zellschaber vollständig gelöst, in ein Eppendorfhütchen überführt und für weitere 10
Minuten auf Eis inkubiert. Die Lagerung der Lysate erfolgte bei –20°C.
Lysepuffer:
50mM
Tris/HCL, ph 7,5
280mM
NaCl
0,5%
NP-40
0,2mM
EDTA
2mM
EGTA
20%
Glycerin
0,5%
Triton
→
als Stocklösung angesetzt, Lagerung bei 4°C
1mM
DTT
100U/ml
Benzonase
1 Tabl./50ml Proteaseinhibitor
→
vor Gebrauch zu 1ml Stocklösung zugegeben
35
Material und Methoden
2.2.2.2 Proteinelektrophorese im SDS-Polyacrylamidgel
Zur elektrophoretischen Auftrennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht wurde die
Methode nach Lämmli (Laemmli, 1970) angewendet. Dazu wurden ein 10% Trenngel und
ein 5% Sammelgel verwendet. Vor dem Auftragen wurden die Proteine für 5 Minuten bei
95°C in Lämmli-Probenpuffer denaturiert und in einer Mini-Proteingel-Kammer in 1x
Laufpuffer bei 120 Volt für etwa 1 Stunde aufgetrennt.
Trenngelpuffer:
10% Trenngel:
Sammelgelpuffer:
5% Sammelgel:
1,5M
Tris/HCL, ph 8,8
0,4%
SDS
2,5ml
Trenngelpuffer
3,3ml
30% Acrylamid mit 0,8% Bisacrylamid
4,1ml
Aqua bidest.
50µl
10% Ammonium-Persulfat (APS)
5µl
TEMED
0,5M
Tris/HCL, ph 6,8
0,4%
SDS
1,25ml
Sammelgelpuffer
0,82ml
30% Acrylamid mit 0,8% Bisacrylamid
2,8ml
Aqua bidest.
25µl
10% Ammonium-Persulfat (APS)
5µl
TEMED
Material und Methoden
4x Lämmlipuffer:
10x Laufpuffer :
36
400mM
Tris/HCL, ph 6,8
40%
Glycerin
8%
SDS
0,004%
Bromphenolblau
20%
β-Mercaptoethanol
250mM
Tris/HCL, ph 8,3
14,4%
Glycin
1%
SDS
2.2.2.3 Western Blot
Um die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine nachzuweisen, wurden diese mit Hilfe
einer Elektroblotting-Apparatur auf eine Polyvinyliden-Fluorid (PVDF)-Membran
transferiert. Das Gel wurde hierzu auf eine entsprechend große Membran aufgelegt, die
zuvor mit Methanol aktiviert und in Transferpuffer äquilibriert worden war. Gel und
Membran wurden daraufhin zwischen zwei mit Transferpuffer getränkte Whatman-Papiere
und Schwämmchen gelegt. Der Aufbau wurde so in die Apparatur eingebracht, dass die
negativ geladenen Proteine in Richtung der Anode auf die Membran transferiert wurden.
Der Transfer fand für 2 Stunden bei 150mA unter ständiger Kühlung statt.
Abbildung 2.1: Aufbau der Elektroblotting-Apparatur
37
Material und Methoden
Daraufhin wurde die Membran über Nacht in PBS mit 4% SlimFast geblockt. Nach dem
Blocken
wurde
die
Membran
mit
geeigneter
Verdünnung
eines
spezifischen
Primärantikörpers in PBS mit 0,1% Tween 20 und 1% SlimFast für 1-2 Stunden inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen mit PBS mit 0,1% Tween 20 wurden die Antigen-AntikörperKomplexe mit einer geeigneten Verdünnung eines an Meerrettich-Peroxidase (horseradish
peroxidase, HRP) gekoppelten Anti-IgG-Antikörpers in PBS mit 0,1% Tween inkubiert.
Für diese Arbeit wurden anti-Maus- und anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in einer
Verdünnung von 1:2000 verwendet. Die Detektion der gebundenen HRP-gekoppelten
Antikörper erfolgte mit ECL-Reagenz nach Anleitung des Herstellers (Amersham).
Transferpuffer:
25mM
Tris/HCL
186mM
Glycin
20%
Methanol
2.2.2.4 IFN-β-ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Zur Quantifizierung des IFN-β in Lungengewebe von infizierten Mäusen wurden Lungen
10 Stunden nach Infektion entnommen und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Danach
wurden die Lungen in flüssigem Stickstoff gemörsert. Ein Drittel des Homogenats wurden
in 300µl PBS aufgenommen, kräftig durchmischt, abzentrifugiert und der Überstand für
den ELISA eingesetzt. Die verbleibenden zwei Drittel wurde für eine RNA-Isolation in
PeqGold bei -80°C eingelagert.
Zur Messung des IFN-β-Gehalts des Proben wurde das „Mouse IFN-β ELISA Kit“ von
PBL Biochemical Laboratories entsprechend der Angaben des Herstellers verwendet.
Material und Methoden
2.2.3
38
Molekularbiologische Methoden
2.2.3.1 RNA-Isolation und Reinigung
Die Isolation von Gesamt-RNA aus Zellen erfolgte unter Verwendung von Trifast
PeqGOLD (PEQLAB Biotechnologie GmbH). Dabei wurde entsprechend der Angaben des
Herstellers vorgegangen.
2.2.3.2 Reverse Transkription mit anschließender Polymerasekettenreaktion (PCR)
Zunächst wurde die RNA-Konzentration der Proben photometrisch bestimmt und in der
RNA verbleibende DNA mit DNase bei 37°C für 30 Minuten verdaut. Die DNase wurde
anschließend mit 1µl 25mM EDTA für 10 Minuten bei 65°C inaktiviert.
DNA-Verdau
1µg
RNA
1µl
10fach Reaktionspuffer für DNase
1µl
DNase
ad 11µl Aqua bidest.
Nach DNase-Inaktivierung wurde dem Ansatz 1µl Random-Hexamer-Primer zugegeben,
zum Aufschmelzen von Sekundärstrukturen 5 Minuten bei 65°C inkubiert und
anschließend kurz auf Eis gestellt. Nach Zugabe von Transkriptasepuffer, dNTPs und
RNase-Inhibitor wurde der Ansatz für 5 Minuten bei 25°C inkubiert und dann 1µl Reverse
Transkriptase zugefügt.
Der vollständige RT-Ansatz wurde nach folgendem Schema weiterinkubiert:
10 Minuten
25°C
60 Minuten
42°C
10 Minuten
70°C
39
Material und Methoden
1-2µl dieses RT-Ansatzes wurden dann für die Polymerasekettenreaktion (PCR)
eingesetzt. Für die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde folgender Ansatz gewählt:
23,7µl
Aqua bidest.
1µl
Template (RT-Ansatz)
1µl
Forward-Primer [25µM]
1µl
Reverse-Primer [25µM]
3µl
Taq-Puffer (Eppendorf, Hamburg)
0,3µl
Taq-Polymerase (Eppendorf, Hamburg)
1µl
10mM dNTPs
Für alle diagnostischen PCR-Ansätze wurde die Taq-Polymerase verwendet, da hier auf
ein Proofreading verzichtet werden konnte.
Durchgefüht wurde die Reaktion in einem Thermocycler. Ausgehend von einer für die
Taq-Polymerase üblichen Syntheserate von 1000 Basen pro Minute wurde die Synthesezeit
in
Abhängigkeit
von
der
Länge
des
erwarteten
Produkts
ermittelt.
Die
Annealingtemperatur ergab sich aus dem GC-Gehalt und der Länge der eingesetzen
Primer.
2.2.3.3 DNA-Gelelektrophorese
Zur gelelektrophoretischen Auftrennung der PCR-Produkte wurde ein 1,0% Agarosegel
mit 0,5µg/ml Ethidiumbromid in 1x TAE-Puffer verwendet.
Die Proben wurden vor dem Auftragen mit 6x Probenpuffer versetzt. Ausgewertet wurden
die Gele unter UV-Licht bei einer Wellenlänge von 312nm. Im Detail ist diese Methode
bei Sambrook et al. beschrieben (Sambrook et al., 1989).
Material und Methoden
40
2.2.3.4 Transformation kompetenter Bakterienzellen
50µl kompetenter XL-1 Blue-Bakterien wurden auf Eis aufgetaut, mit 0,5µl Plasmid-DNA
versetzt und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wurde der gesamte Ansatz
auf antibiotikahaltigen LB-Agar-Platten ausgestichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
2.2.3.5 Präparation von Plasmid-DNA
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienkulturen erfolgte mit dem NucleoBond-PC
100 Midi Prep Kit (Machery-Nagel) entsprechend der Anleitung des Herstellers.
41
2.2.4
Material und Methoden
Tierexperimentelle Methoden
2.2.4.1 Infektion der Versuchstiere
Die Versuchstiere wurden intranasal mit 50µl einer Virussuspension inokuliert. Das Virus
wurde dazu in PBS mit 0,3% BSA auf die gewünschte Infektionsdosis verdünnt. Vor
Infektion wurden die Tiere durch intraperitoneale Injektion von 10µl der unter 2.1.13
beschriebenen Rezeptur pro Gramm Körpergewicht anästhesiert.
Bei einem Gewichtsverlust von mehr als 25% oder deutlichen Krankheitszeichen wie
einem stark gekrümmtem Rücken, struppigem Fell, trockenen Augen und Apathie wurden
die Tiere durch eine Überdosis eines Inhalationsnarkotikums oder durch intraperitoneale
Injektion einer letalen Dosis Thiopental-Natrium (Trapanal®) getötet. „Überleben“
bedeutet also, dass die Tiere nicht aus den genannten Gründen getötet werden mussten.
2.2.4.2 Lungenentnahme
Die Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von Thiopental-Natrium (Trapanal®)
anästhesiert. Dann wurden die Tiere durch Eröffnung der Vasa subclaviae und der Vasa
femorales ausgeblutet.
Nach einigen Minuten wurden die Lungen für die Virustiterbestimmung und den IFN-βELISA entnommen, in Eppendorfhütchen gegeben und in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Für einige Versuche wurden die Lungen auch in kleine Stücke geschnitten
und in Tissue Tek® eingebettet, um histologische Schnitte anfertigen zu können. Die
Lagerung erfolgte bei -80°C.
2.2.4.3 Gewinnung von Lungenhomogenaten
Für die Bestimmung des Virustiters in den Lungen wurden gefrorene Mauslungen (vgl.
2.2.4.2) in auf Trockeneis vorgekühlten Mörsern mit etwas Quarzsand in 1ml PBS
homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 4°C für 5 Minuten bei 2000upm abzentrifugiert,
der
Überstand
abgenommen
und
bis
zur
Bestimmung
Immunfluoreszenztest (vgl. 2.2.1.4) bei -80°C gelagert.
des
Virustiters
per
Material und Methoden
2.2.5
42
Fluoreszenzfärbungen
2.2.5.1 Indirekte Immunfluoreszenz zur Detektion von viralem NP in MDCK-Zellen
MDCK-Zellen wurden im Verhältnis 1:5 auf Deckgläschen in 6-Loch-Platten ausgesät. 8
Stunden später wurden die Zellen mit 0,2 MOI der parentalen Viren hvPR8 und lvPR8
infiziert. 14 Stunden nach Infektion wurden die Zellen für 5 Minuten mit 3%
Paraformaldehydlösung in PBS (1ml/Loch) fixiert und nach dreimaligem Waschen mit
PBS für 5 Minuten mit Triton X-100 permeabilisiert. Hierauf folgte wiederum ein
Waschschritt. Als Primärantikörper diente ein 1:600 verdünntes, polyklonales antiInfluenza-Kaninchenserum (#84). Die Verdünnung erfolgte in 4% Fischgelatine in PBS.
Nach gründlichem Waschen wurde als Sekundärantikörper ein Cy3-gekoppeltes,
polyklonales Esel-anti-Kaninchenserum (#1008) in einer Verdünnung von 1:100
verwendet. Jedes Deckgläschen wurde für jeweils eine Stunde bei Raumtemperatur mit
einem Tropfen der Antikörperverdünnungen inkubiert, der Sekundärantikörper zusätzlich
unter Lichtausschluß. Zwischen Primär- und Sekundärantikörper sowie nach der Färbung
wurde nochmals mit PBS gewaschen und die Deckgläschen dann mit Aqua bidest. gespült.
Die Deckgläschen wurden mit einem Tropfen Mowiol auf Objektträgern fixiert. Die
indirekte Immunfluoreszenz wurde mit Hilfe eines konfokalen Laser-ScanningMikroskops (Leica) ausgewertet.
2.2.5.2 Immunhistochemie
In
Tissue
Tek
eingebettete
Lungenstückchen
(vgl.
2.2.4.2)
wurden
vor
der
Schnittanfertigung in zirka 30 Minuten von -80°C auf -28°C erwärmt. So konnte
verhindert werden, dass das Probenmaterial beim Schneidevorgang zu spröde war und
zerbrach.
Anschließend
wurden
mit
Hilfe
des
Kryostaten
bei
einer
Schneidekammertemperatur von ebenfalls -28°C Schnitte einer Dicke von 7µm angefertigt
und auf Objektträger transferiert. Diese wurden nach kurzem Antrocknen bei
Raumtemperatur bei -20°C eingelagert.
Die gefrorenen Lungenschnitte wurden vor der Färbung für zirka 30 Minuten zum
Auftauen bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schnitte wurden mit 3% Paraformaledhyd für
7 Minuten fixiert. Zur Permeabilisierung der Zellmembranen wurden die Schnitte für 2
Minuten in 0,5% Triton X-100 eingetaucht. Nach dreimaligem Waschen mit PBS (jeweils
43
Material und Methoden
für 5 Minuten) wurden das monoklonale Maus-anti-Mx-Serum M143 (#147) und das
polyklonale anti-Influenza-Humanserum (#979) hinzugefügt, welche beide 1:100 in 5%
Ziegenserum verdünnt worden waren. Nach 90-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur
wurden die Schnitte erneut dreimal für je 5 Minuten mit PBS gewaschen. Danach erfolgte
die Färbung der Schnitte mit einem DTAF-gekoppelten, polyklonalen Ziege-anti-MausSerum (#42) und einem TRITC-gekoppelten, polyklonalen Ziege-anti-Human-Serum
(#1040)
für
30
Minuten
bei
Raumtemperatur
unter
Lichtausschluss.
Die
Sekundärantikörper waren 1:100 bzw. 1:50 in 5% Ziegenserum verdünnt. Nach einer
letzten Waschrunde wurden die Objektträger kurz in Aqua bidest. gehalten. Schließlich
wurden die Deckgläschen mit einem Tropfen Mowiol auf Objektträgern fixiert.
Ergebnisse
44
3
Ergebnisse
3.1
Pathogenität des hochvirulenten Influenza A/PR/8/34-Virus (hvPR8)
3.1.1
Bestimmung der LD50 für hvPR8
Um ein Maß für die hohe Virulenz von hvPR8 in Mäusen zu erhalten, wurde zunächst die
LD50, also die Dosis, bei der 50% der infizierten Tiere sterben bzw. getötet werden
müssen, sowohl für B6- als auch für B6-Mx1-Mäuse bestimmt. Als Referenz diente das
Virus lvPR8. Dazu wurden Gruppen von Mäusen im Alter von 6-8 Wochen nach
Anästhesie mit einem Ketamin-Rompun-Gemisch mit aufsteigenden Dosen der beiden
Viren infiziert. Der Infektionsverlauf wurde durch tägliche Gewichtsmessung und
Erfassung der Krankheitssymptomatik beobachtet. Bei einem Gewichtsverlust von mehr
als 25% oder starker Symptomatik wurden die Tiere getötet.
In Tabelle 3.1 sind die nach der Methode von Reed und Muench (Reed and Muench, 1938)
ermittelten LD50-Werte dargestellt.
Mx1-/-
Mx1+/+
lvPR8
3x103
7x106
hvPR8
6
6
Tabelle 3.1: LD50-Werte für Mx1-/-- und Mx1+/+-Mäuse. Angegeben in ffu (focus forming units).
Für das Virus lvPR8 lag die LD50 in Mx1-/--Mäusen bei 3x103ffu. Um 50% der mit lvPR8
infizierten Mx1+/+-Mäuse zu töten bedurfte es einer Erhöhung der Infektionsdosis um mehr
als das 2000-fache auf 7x106ffu.
Im Gegensatz hierzu betrug die LD50 für hvPR8-infizierte Mäuse 6ffu, unabhänig davon,
ob Mx1+/+- oder Mx1-/--Tiere infiziert wurden.
Somit war die LD50 von lvPR8 verglichen mit hvPR8 in Mx1-/--Tieren 500-fach und in
Mx1+/+-Tieren sogar 106-fach höher.
45
3.1.2
Ergebnisse
Krankheitssymptomatik nach Infektion mit hvPR8
Um die durch das Virus hvPR8 ausgelöste Krankheitssymptomatik in Mx1+/+-Mäusen zu
untersuchen, wurden Tiere mit einer Dosis von 1000ffu intranasal infiziert. Zum Vergleich
wurde eine Kontrollgruppe mit der gleichen Dosis des Virus lvPR8 infiziert. Die Tiere
wurden nach Infektion täglich auf Krankheitssymptome hin untersucht und ihr
Körpergewicht aufgezeichnet. Bei den hvPR8-infizierten Tieren waren bereits 72 Stunden
nach Infektion deutliche Krankheitssymptome zu erkennen. Zeichen der Erkrankung waren
im Einzelnen eine kauernde, gebeugte Körperhaltung, struppiges Fell, rasselnde
Atemgeräusche, trockene Augen und Apathie. Die Tiere der mit lvPR8 infizierten Gruppe
waren frei von Symptomen und zeigten keinen Gewichtsverlust. Abbildung 3.1 zeigt eine
lvPR8- (A) und eine hvPR8- infizierte (B) Mx1+/+-Maus im Vergleich 96 Stunden nach
Infektion. Zu diesem Zeitpunkt musste das Experiment aus Gründen des Tierschutzes
abgebrochen werden, da die mit dem hochvirulenten Virus infizierten Mäuse mehr als 25%
an Gewicht verloren hatten.
A
B
Abbildung 3.1: Krankheitssymptomatik lvPR8- bzw. hvPR8- infizierter Mx1+/+-Mäuse. B6-Mx1-Mäuse
wurden mit 1000ffu von lvPR8 (A) und hvPR8 (B) infiziert. Die Abbildung zeigt die Tiere 96 Stunden nach
Infektion. Bei Maus B sind die charakteristischen Zeichen schwerer Erkrankung wie struppiges Fell,
gebeugte Körperhaltung und trockene Augen zu sehen. Die Lungen dieser Tiere sind in Abbildung 3.2
dargestellt.
Ergebnisse
46
Um Aufschluss darüber zu erhalten, welche Auswirkungen die Infektion auf die Lunge als
primären Infektionsort hatte, wurden die Mäuse 96 Stunden nach Infektion durch Injektion
einer Überdosis Trapanal (vgl. 2.2.4.1) getötet. Durch Inzision der Axillar- und der
Femoralgefäße wurden die Tiere ausgeblutet. Die Lungen wurden herauspräpariert.
Abbildung 3.2 zeigt die Lungen der in Abbildung 3.1 dargestellten Tiere. Während die
Lunge der lvPR8-infizierten Maus makroskopisch keine Zeichen einer Infektion aufwies,
war bei der Lunge der hvPR8-infizierten Maus als makropathologisches Korrelat der
schweren Infektionskrankheit eine massive Gewebsdestruktion zu erkennen. In beiden
Lungenflügeln dieses Tieres zeigten sich ödematöse Veränderungen und ausgedehnte
Hämorrhagien.
A
B
Abbildung 3.2: Makropathologie der Lungen infizierter Mäuse. Die Abbildung zeigt die Lungenpräparate
der in Abbildung 3.1 dargestellten B6-Mx1-Mäuse. Die Mäuse waren für 96 Stunden mit 1000ffu von lvPR8
(A) oder hvPR8 (B) infiziert worden.
47
3.2
Ergebnisse
Mx1-Sensitivität von hvPR8
Um zu untersuchen, ob und in welchem Ausmaß das Virus hvPR8 sensitiv gegenüber der
antiviralen Aktivität Mx1 ist, wurden Mäuse durch intranasale Gabe von 5x105 Units
rHuIFN-αB/D
bzw.
Negativkontrolle
100µg
dienten
mit
des
Immunmodulators
Wasser
behandelte
S-28463
Tiere,
da
vorbehandelt.
Als
Wasser
als
auch
Verdünnungsmedium genutzt wurde. 10 Stunden später wurden die Mäuse mit 1000ffu des
parentalen Virus hvPR8 infiziert. Dies war eine sowohl für Mx1-/-- als auch für Mx1+/+Mäuse letale Dosis. Um abzusichern, dass die gesehenen Effekte Mx1-spezifisch waren,
wurde das Experiment parallel in B6-Mäusen (Mx1-/-) und in B6-Mx1+/+-Mäusen
durchgeführt.
3.2.1
Einfluss der Vorbehandlung mit rHuIFN-αB/D und S-28463 auf das Überleben
In Abbildung 3.3 ist die Überlebenskurve der infizierten Mäuse dargestellt. Aufgrund
starker Symptome und eines Gewichtsverlusts von mehr als 25% mussten die mit Wasser
behandelten Tiere beider Gruppen (B6 und B6-Mx1) am Tag 4 nach Infektion getötet
werden. Bei den mit dem TLR7-Agonisten S-28463 als Immunmodulator vorbehandelten
Tieren zeigte sich bei den Mx1-/--Mäusen kein Unterschied im Überleben verglichen mit
den Tieren der entsprechenden Negativkontrollgruppe. Bei den Mx1+/+-Mäusen war zu
beobachten, dass die mit dem Immunmodulator vorbehandelten Tiere erst später als die
Tiere der Negativkontrollgruppe symptomatisch wurden. Allerdings entwickelten auch die
Mx1+/+-Mäuse eine starke Symptomatik, sodass sie zwischen Tag 7 und Tag 9 nach
Infektion ebenfalls getötet werden mussten.
Bei den mit rHuIFN-αB/D vorbehandelten Tieren war der Effekt zwischen beiden Gruppen
am deutlichsten. Die rHuIFN-αB/D-vorbehandelten Mx1-/--Mäuse mussten gleichzeitig mit
den Tieren der Negativkontrolle getötet werden. Die Mx1+/+-Mäuse hingegen waren auch
am Tag 13 nach Infektion frei von Krankheitssymptomen.
Nachdem in der Gruppe der Mx1+/+-Tiere ein deutlicher Effekt der Vorbehandlung mit
rHuIFN-αB/D und ein intermediärer Effekt der S-28463-Behandlung auf das Überleben
festzustellen war, stellte sich nun die Frage, ob sich die protektive Wirkung auch in der
Viruslast im Lungengewebe widerspiegeln würden.
Ergebnisse
48
100
Überleben [%]
75
Mx1+/+ IFNα
Mx1+/+ S-28463
Mx1+/+ mock
50
Mx1-/Mx1
-/-
Mx1-/-
25
IFNα
S-28463
mock
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13
Zeit nach Infektion [d]
Abbildung 3.3: Einfluss der Vorbehandlung mit rHuIFN-αB/D bzw. dem Immunmodulator S-28463 auf
das Überleben hvPR8-infizierter Mäuse. B6- und B6-Mx1-Mäuse wurden mit rHuIFN-αB/D (5x105U), dem
Immunmodulator S-28463 (100µg) oder Wasser vorbehandelt (jeweils n=5). Die Mäuse wurden 10 Stunden
später intranasal mit 1000ffu hvPR8 infiziert und dann täglich auf Krankheitssymptome hin untersucht und
ihr Körpergewicht überwacht. Bei starker Symptomatik oder einem Gewichtsverlust von mehr als 25%
wurden die Tiere getötet.
3.2.2
Einfluss der Vorbehandlung mit rHuIFN-αB/D und S-28463 auf die Viruslast
Mit rHuIFN-αB/D, S-28463 oder Wasser vorbehandelte und mit hvPR8 infizierte Mäuse
(Mx1-/- und Mx1+/+) wurden 24 Stunden nach Infektion getötet. Die Lungen dieser Tiere
wurden entnommen und die Viruslast im Gewebe bestimmt (vgl. Abbildung 3.4).
In den Organen der Mx1-/--Tiere konnten hohe Titer um 108ffu unabhängig von der Art der
Vorbehandlung gemessen werden. Es zeigte sich, dass für die Wasserkontrollen der
Mx1+/+-Gruppe bereits eine leichte Reduktion des Virustiters um zirka Faktor 5 im
Vergleich zur Mx1-/--Gruppe bestand. Für die S-28463-behandelten Tiere war in der
Gruppe der Mx1+/+-Tiere eine deutliche Reduktion des Virustiters in den Lungen um einen
Faktor von zirka 470 verglichen mit den Mx1-/--Tieren der gleichen Behandlungsgruppe zu
verzeichnen.
49
Ergebnisse
8
Virustiter pro Lunge [log10 ffu]
7
6
5
4
3
2
1
0
IFNα
+
-
-
+
-
-
S-28463
-
+
-
-
+
-
mock
-
-
+
-
-
+
Mx1+/+
Mx1-/-
Abbildung 3.4: Einfluss der Vorbehandlung mit rHuIFN-αB/D bzw. dem Immunmodulator S-28463 auf
das Viruswachstum im Lungengewebe hvPR8-infizierter Mäuse. B6- und B6-Mx1- Mäuse wurden mit
rHuIFN-αB/D (5x105U), dem Immunmodulator S-28463 (100µg) oder Wasser vorbehandelt. Die Mäuse
wurden 10 Stunden später intranasal mit 1000ffu hvPR8 infiziert. 24 Stunden nach Infektion wurden die
Tiere getötet und die Lungen entnommen. Es erfolgte die Bestimmung des Virustiters pro Lunge mit Hilfe
eines Immunfluoreszenztests. Die gestrichelte Linie markiert das untere Detektionslimit.
Am deutlichsten war die Reduktion der Viruslast jedoch in den Tieren zu sehen, die mit
rHuIFN-αB/D vorbehandelt waren. Hier war der Virustiter im Lungengewebe der Mx1+/+Mäuse im Mittel um mehr als das 32000-fach geringer als in den Vergleichstieren ohne ein
funktionales Mx1-Gen. Bei drei der sieben Versuchstiere der Mx1+/+-Gruppe lag der
Virustiter sogar unter der Nachweisgrenze des Testverfahrens.
Um zu überprüfen, wie die Titerreduktion mit der Mx1-Expression im Gewebe korreliert,
wurden histologische Schnitte untersucht.
Ergebnisse
3.2.3
50
Nachweis von viralem NP und Mx1 in histologischen Schnitten
Gleichzeitig mit der Lungenentnahme für die Titration wurden infizierten Mx1+/+-Mäusen
aller drei Vorbehandlungsgruppen (rHuIFN-αB/D, S-28463 und Wasser) Lungen
entnommen, die ich immunhistochemisch auf die Expression des murinen Mx1-Proteins
und gleichzeitig auf das Vorhandensein von viralem NP untersucht habe. Dazu wurden
Kryoschnitte (vgl. Abbildung 3.5) angefertigt, die mit Hilfe eines anti-InfluenzaHumanserums (#979) und eines monoklonalen anti-Mx1-Mausantikörpers (#147) gefärbt
wurden. Als Sekundärantikörper dienten ein TRITC-gekoppelter Ziege-anti-HumanAntikörper (rot) und ein DTAF-gekoppelter Ziege-anti-Maus-Antikörper (grün).
Bei Tieren, die mit Wasser vorbehandelt worden waren, waren in der Färbung gegen NP
starke rot leuchtende Foci über das gesamte Präparat verteilt sichtbar. Diese Foci
entsprechen Zellen, die infiziert sind und in denen das Virus repliziert. Die Färbung gegen
das Mx1-Protein fiel negativ aus. Bei mit dem Immunmodulator S-28463 behandelten
Tieren waren kleinere rot leuchtende Virusfoci zu sehen, jedoch weitaus weniger als bei
den wasserbehandelten Tieren. In der Mx-Färbung waren vereinzelt grüne Foci mit einer
typischen nukleären Mx1-Expression zu erkennen.
In den Lungenschnitten der Tiere, die mit rHuIFN-αB/D vorbehandelt wurden, waren in
der Virusfärbung keine spezifischen Signale zu sehen. Es zeigte sich hier jedoch ein stark
ausgedehntes Mx-Signal mit über das gesamte Präparat verteilten Foci. Die Mx-Expression
in diesen Lungen war sehr viel intensiver als in den Lungen der S-28463-behandelten
Tiere.
Nun stellte sich die Frage, welche Eigenschaften hvPR8 als IFN-Induktor hat. So sollte
überprüft werden, ob der unzulängliche Schutz durch das IFN-induzierte Mx1 gegen eine
Infektion mit hvPR8 auf eine schlechte IFN-Induktion durch das Virus zurückgeht.
51
NP
Ergebnisse
Mx1
IFN-α
S-28463
mock
uninfizierte
Kontrolle
Abbildung 3.5: Nachweis von viralem NP und IFN-induziertem Mx1 in Lungenschnitten vorbehandelter
Mäuse nach hvPR8-Infektion durch indirekte Immunfluoreszenz. B6-Mx1-Mäuse wurden mit rHuIFNαB/D (5x105U), dem Immunmodulator S-28463 (100µg) oder Wasser vorbehandelt und 10 Stunden später
intranasal mit 1000ffu des parentalen Virus hvPR8 infiziert. 24 Stunden nach Infektion wurden die Tiere
getötet, die Lungen entnommen und Kryoschnitte angefertigt. Die Schnitte wurden mit anti-InfluenzaHumanserum und monoklonalem anti-Mx-Antikörper gefärbt. Als Sekundärantikörper diente ein TRITCgekoppelter Ziege-anti-Human-Antikörper (rot) und ein DTAF-gekoppelter Ziege-anti-Maus-Antikörper
(grün).
Ergebnisse
52
3.3
IFN-Induktion durch hvPR8
3.3.1
Messung von IFN-β im Lungengewebe infizierter Mäuse
B6-Mäuse wurden mit einer Dosis von 105ffu der parentalen Viren hvPR8 bzw. lvPR8
infiziert. Rekombinantes PR8∆NS1 wurde bei der gleichen Infektionsdosis als
Positivkontrolle genutzt. Es handelt sich dabei um ein PR8-Virus, dem das Gen für den
viralen IFN-Antagonisten, das NS1, fehlt (García-Sastre et al., 1998). Als Negativkontrolle
dienten mit PBS behandelte Tiere. Die Tiere wurden 10 Stunden nach Infektion getötet, die
Lungen entnommen und wie in 2.2.2.4 beschrieben aufbereitet und der Gehalt an IFN-β
mittels ELISA bestimmt. Es zeigte sich, dass in den Lungen der mit dem rekombinanten
PR8∆NS1 infizierten Tiere 641 pg/ml IFN-β zu detektieren waren (Abbildung 3.6). In den
uninfizierten Tieren waren IFN-β-Titer von zirka 46pg/ml zu messen. Für die beiden
A/PR/8/34-ähnlichen Viren hvPR8 und lvPR8 zeigten sich keine signifikanten
Unterschiede in der IFN-β-Induktion (48pg/ml vs. 51pg/ml) im Vergleich zur
unbehandelten Kontrolle.
In einem nächsten Experiment wurde die IFN-Induktion von hvPR8 und lvPR8 auch in
einem Zellkultursystem untersucht.
900
800
IFNIFNβ
beta[pg/ml]
[pg/ml]
700
600
500
400
300
200
100
0
lvPR8
lvPR8
hvPR8
hvPR8
PR8delNS1
rec PR8ΔNS1
mock
mock
Abbildung 3.6: Messung von IFN-β im Lungengewebe infizierter Mäuse. B6-Mäuse wurden mit 105ffu
hvPR8 und lvPR8 infiziert (n=5). Rekombinantes PR8ΔNS1 wurde bei gleicher Infektionsdosis als
Positivkontrolle genutzt. Die Mäuse wurden 10 Stunden nach Infektion getötet und IFN-β im Lungengewebe
mit Hilfe eines ELISA bestimmt.
53
3.3.2
Ergebnisse
Bestimmung der Interferoninduktion in MDCK-Zellen
Konfluente MDCK-Zellen wurden mit einer MOI von 0,5 der Viren hvPR8 bzw. lvPR8
infiziert. Als Kontrollen diente erneut die Infektion der Zellen mit rekombinantem
PR8∆NS1 oder eine PBS-Behandlung der Zellen. 13 Stunden nach der Infektion wurden
die Zellen fixiert und die Gesamt-RNA wurde isoliert. Nach einer reversen Transkription
wurde eine PCR durchgeführt. Dabei wurden Primer eingesetzt, mit deren Hilfe
Transkripte von IFN-β und β-Aktin sowie des viralen NP nachweisbar waren. Abbildung
3.7 zeigt das zugehörige Agarosegel. In PR8∆NS1-infizierten Zellen wurde ein starkes
IFN-β-Signal beobachtet, während in der Negativkontrolle keine Bande erschien. Die IFNβ-Banden für hvPR8- und lvPR8-infizierte Zellen waren in Größe und Intensität nahezu
mock
rec PR8ΔNS1
lvPR8
hvPR8
gleich. Die NP-PCR diente dem Nachweis der Infektion.
IFN-β
NP
β-Aktin
Abbildung 3.7: Bestimmung der IFN-Induktion in MDCK-Zellen. Konfluente MDCK-Zellen wurden mit
einer MOI von 0,5 der Viren hvPR8, lvPR8 oder rec PR8∆NS1 infiziert. 13 Stunden nach Infektion wurde die
IFN-β-Induktion mittels RT-PCR bestimmt.
Ergebnisse
3.3.3
54
Nachweis von IFN im Überstand infizierter MDCK-Zellen
Zur Ermittlung der von den infizierten Zellen sezernierten IFN-Menge wurden konfluente
MDCK-Zellen mit einer MOI von 0,5 der Viren hvPR8, lvPR8 oder PR8∆NS1 infiziert
(vgl. Abbildung 3.8 A). Nach 16 Stunden wurden die Überstände abgenommen und gegen
Säure dialysiert, um das Virus abzutöten. IFN ist hingegen säurestabil (vgl. 2.2.1.6). Das
Dialysat wurde im Verhältnis 1:1 mit Zellkulturmedium versetzt. Dieses Gemisch wurde
auf MDCK-Zellen gegeben, die zuvor mit Expressionsvektoren für Firefly-Luziferase und
Renilla-Luziferase transfiziert wurden. Die Firefly-Luziferase stand in dem verwendeten
Konstrukt unter Kontrolle des Mx1-Promotors, die Renilla-Luziferase unter Kontrolle
eines konstitutiven Promotors. Da IFN den Mx1-Promotor induziert, konnte je nach
Aktivität der Firefly-Luziferase der IFN-Gehalt des Überstands abgeschätzt werden. Nach
20 Stunden wurde die Luziferaseaktivität in den Zelllysaten gemessen. Die FireflyLuziferaseaktivität wurde durch Verrechnung mit der Renilla-Luziferaseaktivität
normalisiert. Die nicht infizierte Kontrolle wurde hier gleich 1 gesetzt (vgl. Abbildung 3.8
B).
Abbildung 3.8 C zeigt den zugehörigen Western Blot. Hier wurde zur Infektionskontrolle
virales NP und das NS1-Protein mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen. Als
Ladekontrolle diente ein Antikörper, der spezifisch an das zelluläre Tubulin bindet.
Auch in den MDCK-Zellen war kein signifikanter Unterschied in der IFN-Induktion durch
die Viren zu sehen. Die IFN-Induktion in den Zellen, die mit dem Überstand der
PR8∆NS1-infizierten Zellen behandelt wurden, war hingegen um ein Vielfaches erhöht.
Nachdem das Verhalten von hvPR8 als IFN-Induktor bestimmt wurde, wollte ich weiter
das Wachstumsverhalten dieses Virus untersuchen.
55
A
1.
3.
Infektion mit hvPR8 oder
lvPR8 oder rec PR8ΔNS1
Transfektion mit FireflyLuciferasekonstrukt unter
Kontrolle des Mx1 Promotors
Ergebnisse
B
8
7
Virusinaktivierung im
Überstand
6
x-fach Aktivierung
x-fache Aktivierung
2.
4.
MDCK
Behandlung der
transfizierten MDCKZellen mit inaktiviertem
Überstand
MDCK
Luciferaseaktivität
5
4
3
2
1
rec PR8ΔNS1
lvPR8
hvPR8
C
lvPR8
hvPR8
hvPR8
hvPR8
hvPR8
lvPR8
rec
rec PR8delNS1
PR8ΔNS1
mock
mock
mock
0
IFN im
Überstand
NP
NS1
Tubulin
Abbildung 3.8: Bestimmung der Interferoninduktion in MDCK-Zellen. (A) Konfluente MDCK-Zellen
wurden mit einer MOI von 0,5 der Viren hvPR8, lvPR8 oder PR8ΔNS1 infiziert (1). Nach 16 Stunden wurde
der Überstand abgenommen und in einem Dialyseschlauch zwei mal 5 Stunden gegen 0,1M Glycin pH 2
dialysiert. Daraufhin erfolgte zweimalige Dialyse gegen PBS mit Penicillin und Streptomycin für 12 Stunden
(2). Das Dialysat wurde im Verhältnis 1:1 mit Zellkulturmedium versetzt und das Gemisch auf MDCK-Zellen
gegeben (4), die mit Expressionsvektoren für Firefly-Luziferase und Renilla-Luziferase transfiziert worden
waren. Die Firefly-Luziferase steht unter Kontrolle des Mx1-Promotors, die Renilla-Luziferase unter
Kontrolle eines konstitutiven Promotors (3). Nach 20 Stunden wurde die Luziferaseaktivität in den
Zelllysaten gemessen. Die Firefly-Luziferaseaktivität wurde durch Verrechnung mit der RenillaLuziferaseaktivität normalisiert. (B) Aktivierung des Mx1-Promotors durch IFN im Überstand der MDCKs.
Die Steigerung der Luziferaseaktivität wird im Vergleich zur uninfizierten Kontrolle angegeben. (C) In den
Lysaten der infizierten Zellen wurden die viralen Proteine NP, NS1 und das zelluläre Tubulin mit Hilfe
spezifischer Antikörper im Western-Blot nachgewiesen.
Ergebnisse
56
3.4
Wachstumsverhalten von hvPR8
3.4.1
Bestimmung von Virustitern im Lungengewebe
B6- und B6-Mx1-Mäuse wurden intranasal infiziert mit 1000ffu der parentalen Viren
lvPR8 bzw. hvPR8. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Tiere getötet, die Lungen
entnommen und der Virustiter im Gewebe mittels Immunfluoreszenztest bestimmt. Wie in
Abbildung 3.9 dargestellt, zeigte sich, dass der Virustiter von lvPR8 in Lungen von Mx1-/-Mäusen innerhalb von 24 Stunden im Durchschnitt auf 1x105ffu anstieg. Das Virus hvPR8
hingegen war in der gleichen Zeit durchschnittlich auf fast 108ffu pro Lunge gestiegen, was
einem rund 1000-fachen Unterschied entsprach.
Bei Durchführung des gleichen Experiments in Mx1+/+-Mäusen konnte beobachtet werden,
dass der Organtiter für das Virus lvPR8 im Vergleich zu den Titern in Mx1-/--Tieren im
Schnitt um Faktor 5 niedriger war, während das Virus hvPR8 jedoch auch in Mx1+/+Tieren zu etwa gleichen Titern wie in Mx1-/-- Tieren herangewachsen war.
8
Virustiter pro Lunge [log10 ffu]
7
6
5
4
3
2
1
0
lvPR8
hvPR8
Mx1-/-
lvPR8
hvPR8
Mx1+/+
Abbildung 3.9: Bestimmung der Virustiter in Lungengewebe. B6- bzw. B6-Mx1-Mäusen wurden 24 Stunden
nach intranasaler Infektion mit je 1000ffu lvPR8 oder hvPR8 die Lungen entnommen und der Virustiter im
Gewebe bestimmt. Die gestrichelte Linie markiert das untere Detektionslimit.
57
3.4.2
Ergebnisse
Viruswachstum auf MDCK-Zellen
Konfluente MDCK-Zellen wurden für 1 Stunde mit einer MOI von 0,001 der Viren hvPR8
oder lvPR8 infiziert. Zu den in Abbildung 3.10 gezeigten Zeitpunkten wurden Proben aus
den Überständen genommen und der Virustiter bestimmt. 12 Stunden nach Infektion war
der Titer im Überstand der hvPR8-infizierten Zellen im Vergleich zu dem der lvPR8infizierten Zellen um zirka das 22-fache höher, nach 24 Stunden war der Titer noch um
etwa Faktor 17 höher. Zum spätesten Zeitpunkt betrug der Unterschied im Mittel noch
Faktor 5.
hvPR8
Virustiter im Überstand [log10 ffu/ml]
Virustiter im Überstand [ffu/ml]
1,E+09
1,E+088
lvPR8
1,E+07
1,E+066
1,E+05
1,E+044
1,E+03
1,E+022
1,E+01
1,E+000
0
12
24
36
Zeit nach Infektion [h]
Abbildung 3.10: Viruswachstum in MDCK-Zellen. Konfluente Zellen wurden mit einer MOI von 0,001 der
Viren lvPR8 bzw. hvPR8 infiziert und die Virustiter im Überstand zu den angegebenen Zeitpunkten bestimmt.
Die dargestellten Werte sind das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten.
Das Wachstumsverhalten der beiden Viren sollte auch auf zellulärer Ebene mit
Immunfluoreszenz untersucht werden.
Ergebnisse
3.4.3
58
Replikationsunterschiede von hvPR8 und lvPR8 auf zellulärer Ebene
Abbildung 3.11 zeigt MDCK-Zellen, die 14 Stunden zuvor mit einer MOI von 0,1 der
Viren hvPR8 bzw. lvPR8 infiziert wurden. Die Zellen wurden fixiert, permeabilisiert und
gefärbt. Zur Färbung wurde ein polyklonales anti-Influenza-Kaninchenserum (#84)
verwendet. Als Sekundärantikörper diente ein Cy3-gekoppelter, polyklonaler Esel-antiKaninchen-Antikörper. Die Bilder wurden mit Hilfe eines konfokalen Laser-ScanningMikroskops aufgenommen.
Bei den hvPR8-infizierten Zellen war 14 Stunden nach Infektion ein zytoplasmatisch
lokalisiertes, rot leuchtendes NP-Signal vorhanden. Die Kerne hingegen erschienen leer.
Im Gegensatz dazu wiesen die lvPR8-infizieren Zellen ein nukleär lokalisiertes NP-Signal
auf. Nur vereinzelt waren Übergänge in die zytoplasmatische Phase zu sehen. Da das
Influenza-A-Virus im Kern repliziert und die RNPs am Ende des Replikationszyklus ins
Zytoplasma transportiert werden, lässt sich aus dieser Beobachtung ableiten, dass hvPR8
auch auf zellulärer Ebene schneller replizieren kann.
59
Ergebnisse
mock
hvPR8
lvPR8
Abbildung 3.11: Vergleich der Replikationsgeschwindigkeit der Viren hvPR8 und lvPR8 auf zellulärer
Ebene. MDCK-Zellen wurden mit einer MOI von 0,1 infiziert. 14 Stunden nach Infektion wurden die Zellen
fixiert, permeabilisiert und gefärbt. Zur Färbung wurde ein polyklonales anti-Influenza-Kaninchenserum
(#84) verwendet, als Sekundärantikörper diente ein Cy3-gekoppelter, polyklonaler Esel-anti-KaninchenAntikörper. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen.
Ergebnisse
3.4.4
60
Unterschiede in der Replikation zwischen hvPR8 und lvPR8 in L929-Zellen
Murine L929-Zellen wurden mit einer MOI von 0,5 der Viren hvPR8 bzw. lvPR8 infiziert.
Bei L929-Zellen handelt es sich um eine Zelllinie, die kein produktives Viruswachstum
zulässt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen lysiert und die Lysate durch
ein 10%iges SDS-Gel aufgetrennt. Virales NP wurde mit Hilfe spezifischer Antikörper
durch Western-Blot-Analyse detektiert. Das zelluläre β-Aktin diente als Ladekontrolle.
Abbildung 3.12 zeigt den zugehörigen Blot. Da aufgrund des nicht produktiven
Viruswachstums in L929-Zellen nur geringe Mengen an NP vorhanden waren, musste eine
relativ große Menge von 35µl an konzentriertem Lysat (1x105 Zellen in 30µl Lysepuffer)
auf das SDS-Gel aufgetragen werden, um das NP gut nachweisen zu können. Es war
deutlich zu erkennen, dass in den mit hvPR8 infizierten Zellen früher virales NP
nachweisbar war als in den Zellen, die mit lvPR8 infiziert waren.
In den Lysaten der hvPR8-infizierten Zellen zeigte sich im Western-Blot bereits nach 8
Stunden eine leichte NP-Bande. 12 Stunden nach Infektion war das NP-spezifische Signal
schon sehr deutlich zu erkennen. In den Lysaten der lvPR8-infizierten Zellen war erst 16
Stunden nach Infektion ein eindeutiges NP-Signal zu sehen.
mock
20
16
12
8
Zeit nach Infektion [h]
NP
hvPR8
β-Aktin
NP
lvPR8
β-Aktin
Abbildung 3.12: Unterschiede in der Replikation zwischen hvPR8 und lvPR8. L929-Zellen wurden mit
einer MOI von 0,5 der Viren hvPR8 bzw. lvPR8 infiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkten nach Infektion
wurden die Zellen lysiert und die Lysate durch ein 10%iges SDS-Gel aufgetrennt. Virales NP wurde mittels
Western-Blot-Analyse detektiert. Als Ladekontrolle diente das zelluläre β-Aktin.
61
3.4.5
Ergebnisse
Bestimmung der Polymeraseaktivität von hvPR8 und lvPR8 in L929-Zellen
Mit einer zweiten Methode sollte die Replikationsgeschwindigkeit der beiden Viren weiter
untersucht werden. Hierzu wurden L929-Zellen mit einem Plasmid transfiziert, das für ein
RNA-Minigenom unter Kontrolle des murinen PolI-Promotors kodiert. Das RNAMinigenom kodiert für das Chloramphenicolazetyltransferase(CAT)-Gen in antisense
Orientierung, flankiert von den non coding regions von Segment 4. Dieses wird in vRNA
umgeschrieben und dann in mRNA transkribiert. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der
Transfektion mit einer MOI von 0,5 der Viren hvPR8 bzw. lvPR8 infiziert. Zu den in
Abbildung 3.13 angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen lysiert und die Menge an
CAT-Enzym im Zelllysat mit Hilfe eines CAT-ELISA-Kits bestimmt. 8 Stunden nach
Infektion war noch keine CAT-Expression zu detektieren. 12 Stunden nach Infektion war
die Menge an CAT-Enzym in dem mit hvPR8 infizierten Ansatz gut nachweisbar, in dem
mit lvPR8 infizierten Ansatz kam es hingegen erst nach 16 Stunden zu einem signifikanten
Anstieg der Menge an CAT-Enzym. Ebenfalls waren die absoluten Mengen an CATEnzym zwischen den beiden Ansätzen sehr unterschiedlich. Während in den mit dem
niedrigvirulenten lvPR8 infizierten Zellen nach 20 Stunden eine maximale Menge von
zirka 0,2ng/ml CAT-Enzym zu detektieren war, war die CAT-Menge in den hvPR8infizierten Zellen nach 20 Stunden mit zirka 0,9ng/ml um mehr als das Vierfache höher.
Zur Untersuchung von Unterschieden in der Polymeraseaktivität zwischen hvPR8 und
lvPR8 wurde ein für Influenza-A-Viren etabliertes Minireplikonsystem genutzt. Es beruht
auf der Rekonstitution der minimalen viralen Transkriptions- und Replikationseinheit, des
Ribonukleoprotein-Komplexes (RNP), durch Expression aller notwendigen Komponenten
von klonierten cDNAs. Anstelle der viralen RNA-Genom-Segmente wird als
Genomäquivalent ein Reporterkonstrukt in die RNPs eingebaut (Minigenom). Dieses
ermöglicht eine Quantifizierung der viralen Transkriptions- und Replikationsaktivität in
Zellkultur. Hierzu wurden L929-Zellen mit Expressionskonstrukten transfiziert, die für die
viralen Polymeraseuntereinheiten (PB2, PB1 und PA) und das NP von hvPR8 oder lvPR8
kodieren. Zusätzlich wurden die Zellen mit dem Expressionskonstrukt für das CATMinigenom transfiziert. 16 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen lysiert und durch
Messung von CAT-Protein die relative Aktivität der Polymerase ermittelt. Es konnte
gezeigt werden, dass der Polymerasekomplex von hvPR8 im Minireplikonsystem etwa
zweimal so aktiv war wie der Polymerasekomplex von lvPR8 (vgl. Abbildung 3.13 B).
Ergebnisse
62
A
1,2
lvPR8
hvPR8
CAT-Enzym [ng/ml]
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
8
12
16
20
Zeit nach Infektion [h]
x-fache Aktivität
B
3
2
1
0
lvPR8
hvPR8
Abbildung 3.13: Replikations- und Polymeraseaktivität von hvPR8 und lvPR8. (A) L929-Zellen wurden mit
einem Plasmid, das für ein CAT-Minigenom unter Kontrolle des Pol I-Promotors kodiert, transfiziert. 24
Stunden nach Transfektion wurden die Zellen mit 0,5 MOI der Viren hvPR8 oder lvPR8 infiziert. Zu den
angegebenen Zeitpunkten wurden die Zellen lysiert und die Menge an CAT-Enzym im Zelllysat bestimmt. (B)
L929-Zellen wurden mit einem CAT-Minigenom und Expressionsvektoren, die für die viralen
Polymeraseuntereinheiten PB2, PB1 und PA sowie für das NP kodieren, transfiziert. 16 Stunden nach
Transfektion wurden die Zellen lysiert, die Menge an CAT-Enzym im Zelllysat bestimmt und so die relative
Aktivität der viralen Polymerase ermittelt. Die Messwerte wurden mit einer internen Transfektionskontrolle
normalisiert. Die dargestellten Werte sind das Mittel aus drei unabhängigen Experimenten.
63
3.5
Ergebnisse
Herstellung der rekombinanten Viren rec hvPR8 und rec lvPR8
Um virale Faktoren zu identifizieren, die für die hohe Virulenz von hvPR8 verantwortlich
sind, wurden Reassortanten zwischen hvPR8 und lvPR8 mit Hilfe der Reversen Genetik
generiert.
3.5.1
Rescuesystem für rec hvPR8 und rec lvPR8
Ein erstes Ziel war es, sowohl rekombinantes hvPR8 als auch rekombinantes lvPR8
herzustellen. Dazu wurde (wie unter 2.2.1.10 beschrieben) virale cDNA in bidirektionale
Expressionsvektoren kloniert. Diese Expressionsvektoren kodieren sowohl für vRNA als
auch für mRNA. Durch Transfektion von 8 Plasmiden, die alle für eines der Gensegmente
von hvPR8 bzw. lvPR8 kodieren, war es möglich, rekombinante Viren zu generieren und
so rekombinantes hvPR8 (rec hvPR8) und rekombinantes lvPR8 (rec lvPR8) herzustellen.
Abbildung 3.14 zeigt den Plaquephänotyp der parentalen Viren hvPR8 und lvPR8 im
direkten Vergleich zu den rekombinanten Viren. Sowohl hvPR8 als auch das zugehörige
rekombinante Virus rec hvPR8 bildeten beim Plaquetest auf MDCK-Zellen deutlich
sichtbare Plaques. Jedoch kam es weder bei Infektion mit lvPR8 noch bei Infektion mit
dem rekombinaten Virus rec lvPR8 zu einer gut sichtbaren Plaquebildung.
Ergebnisse
64
parental
rekombinant
hvPR8
lvPR8
hv4,6lv1,2,3,5,7,8
hv1,2,3,5,7,8lv4,6
Abbildung 3.14: Vergleich des Plaquephänotyps zwischen parentalen und rekombinanten Viren.
Konfluente MDCK-Zellen wurden mit geeigneten Verdünnungen der parentalen Viren hvPR8, lvPR8 sowie
der rekombinanten Viren rec hvPR8, rec lvPR8 und der Reassortanten hv4,6lv1,2,3,5,7,8 bzw. hv1,2,3,5,7,8lv4,6
infiziert. 48 Stunden nach Infektion wurden die Zellen fixiert und mit Kristallviolettlösung gefärbt.
65
3.5.2
Ergebnisse
Pathogenität der rekombinanten Viren in Mx1+/+-Mäusen
Es war wichtig zu überprüfen, ob sich die für diese Arbeit neu geschaffenen
rekombinanten Wildtypviren im Mausmodell wie die parentalen Viren verhielten. Dazu
wurden Mx1+/+-Mäuse mit einer Dosis von 1000ffu der rekombinanten Viren rec hvPR8
und rec lvPR8 intranasal inokuliert. Diese Dosis wurde gewählt, da das Verhalten der
infizieren Mäuse bei dieser Dosis durch eine Vielzahl von Experimenten mit den
parentalen Viren bekannt war. Die Tiere, die mit rec hvPR8 infiziert waren, mussten am
Tag 5 nach Infektion getötet werden. Die lvPR8-infizierten Tiere hingegen zeigten keine
Symptomatik und überlebten. Die zugehörige Überlebenskurve zeigt Abbildung 3.15.
Überleben
100%
50%
rec lvPR8
rec hvPR8
0%
0
1
2
3
4
5
6
Zeit nach Infektion [d]
Abbildung 3.15: Pathogenität der Viren rec lvPR8 und rec hvPR8 in BALB-Mx1-Mäusen. Die Mäuse
(je n=3) wurden mit 1000ffu der beiden rekombinanten Viren infiziert. Die Tiere wurden täglich auf
Krankheitssymptome hin untersucht und ihr Körpergewicht überwacht. Bei starker Symptomatik oder einem
Gewichtsverlust von mehr als 25% wurden die Tiere getötet.
Ergebnisse
3.5.3
66
Herstellung von rekombinanten Reassortanten zwischen hvPR8 und lvPR8
Es wurden mit Hilfe der Reversen Genetik Reassortanten zwischen hvPR8 und lvPR8
hergestellt.
Ein Ziel war es, rekombinante Viren zu schaffen, die 7 Segmente des hvPR8 tragen und
denen jeweils das noch fehlende Segment von lvPR8 eingesetzt wurde. So sollte geprüft
werden, ob es möglich ist, die Pathogenität von hvPR8 durch den Austausch eines
einzelnen Gensegments abzuschwächen. Die hergestellten Viren sind in Tabelle 3.2
aufgelistet. Ihre Nomenklatur ergab sich aus den Segmenten, die von hvPR8 bzw. lvPR8
stammten. Das Virus hv2,3,4,5,6,7,8lv1 trug beispielsweise das PB2-Segment von lvPR8 und
die übrigen sieben Segmente von hvPR8. Um auszuschließen, dass spontan auftretende
Mutationen das Ergebnis verfälschen, wurden die rekombinanten Viren jeweils zweimal
unabhängig voneinander hergestellt und überprüft, ob die Ergebnisse reproduzierbar
waren.
Die Reassortanten mit einem Einzelsegmentaustausch wurden daraufhin im Mx1+/+Mausmodell auf ihre Pathogenität hin untersucht. Hierzu wurden Mäuse mit
unterschiedlichen Dosen der Reassortanten infiziert und die LD50 nach der Methode von
Reed und Muench ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass Reassortanten, bei denen PB1,
PB2, HA oder NA ersetzt wurden, die LD50 im Vergleich zum rekombinanten
Wildtypvirus hvPR8 anstieg. Für das Virus hv1,2,3,5,6,7,8lv4 war dieser Effekt am stärksten.
Hier musste die Virusdosis um mehr als das 10-fache gesteigert werden, um die Hälfte der
infizierten Tiere zu töten. Für das Virus hv1,2,3,4,5,7,8lv6 konnte ein ähnlicher, aber nicht so
starker Effekt nachgewiesen werden. Ein gleichzeitiger Austausch beider Segemente 4 und
6 führte zu einer stärkeren Reduktion der Virulenz auf das Niveau eines völlig
apathogenen Virus.
Um zu untersuchen, ob die Virulenz von lvPR8 steigen kann, wenn Glykoproteine von
hvPR8 einbezogen werden, wurden in einem zweiten Ansatz Viren auf der Basis von
lvPR8 generiert, die entweder nur HA oder NA bzw. sowohl HA als auch NA von hvPR8
tragen. Dies waren die Viren hv4lv1,2,3,5,6,7,8, hv6lv1,2,3,4,5,7,8 und hv4,6lv1,2,3,5,7,8. Auch für
diese Reassortanten wurde eine LD50 ermittelt. Diese lag für hv4lv1,2,3,5,6,7,8 bei 5x104ffu,
für hv6lv1,2,3,4,5,7,8 hingegen war sie größer als 106ffu. Für das Virus hv4,6lv1,2,3,5,7,8 ergab
sich eine LD50 von 5x104ffu.
67
Ergebnisse
Infektionsdosis [ffu]
rec A/PR/8/34
LD50 [ffu]
10
2
10
3
4
5
6
10
10
10
lv1,2,3,4,5,6,7,8
0/5
0/6
-
0/6
5/6
6x105
hv1,2,3,4,5,6,7,8
5/5
9/9
-
-
-
<102
hv2,3,4,5,6,7,8lv1
0/3
6/6
-
-
-
3x102
hv1,3,4,5,6,7,8lv2
1/3
6/6
-
-
-
1x102
hv1,2,4,5,6,7,8lv3
3/3
6/6
-
-
-
<102
hv1,2,3,5,6,7,8lv4
0/6
3/6
3/3
-
-
1x103
hv1,2,3,4,6,7,8lv5
3/3
6/6
-
-
-
<102
hv1,2,3,4,5,7,8lv6
1/9
8/9
2/3
-
-
6x102
hv1,2,3,4,5,6,8lv7
3/3
6/6
-
-
-
<102
hv1,2,3,4,5,6,7lv8
2/2
6/6
-
-
-
<102
hv1,2,3,5,7,8lv4,6
0/8
0/6
0/6
0/6
0/6
>106
hv4lv1,2,3,5,6,7,8
-
-
0/3
5/6
3/3
5x104
hv6lv1,2,3,4,5,7,8
0/3
-
-
0/6
0/3
>106
hv4,6lv1,2,3,5,7,8
0/6
0/6
1/9
7/7
6/6
5x104
Tabelle 3.2: Liste der rekombinant hergestellten Reassortanten zwischen hvPR8 und lvPR8 mit
entsprechender LD50 in Mx1+/+-Mäusen.
Ergebnisse
3.5.4
68
Wachstum der rekombinanten Viren in B6-Mx1- und B6-IFNAR0/0-Mäusen
Um das Wachstumsverhalten der rekombinanten Viren in Mäusen zu untersuchen, wurden
zunächst B6-Mx1-Mäuse mit 1000ffu der Viren rec hvPR8, rec lvPR8 sowie der
Reassortanten hv4,6lv1,2,3,5,7,8 und hv1,2,3,5,7,8lv4,6 infiziert. 72 Stunden nach der Infektion
wurden die Tiere getötet und der Virustiter bestimmt (vgl. Abbildung 3.16 A).
Rekombinantes hvPR8 wuchs in dieser Zeit bis auf einen Titer von etwa 8x107ffu/Lunge
heran, wobei für das rekombinante lvPR8 nur ein Virustiter von etwa 2x105ffu/Lunge zu
messen war. Dies entsprach einem Unterschied von zirka Faktor 400. Die Reassortanten
hv4,6lv1,2,3,5,7,8 und hv1,2,3,5,7,8lv4,6 wuchsen in der gleichen Zeit zu einem Titer von 8x106
ffu/Lunge bzw. 2x104ffu/Lunge heran. Diese Titerunterschiede korrelieren gut mit der
Pathogenität der Viren.
Es war nun interessant und wichtig, das Wachstum der oben genannten Viren auch in
Mäusen zu untersuchen, die keinen funktionalen IFNAR-Rezeptor tragen. Somit ist das
IFN-I-System in diesen Tieren ausgeschaltet. Dies erlaubte es, den Einfluss des Typ-I-IFN
auf das Wachstum der Viren in vivo abzuschätzen. Hierzu wurden B6-IFNAR0/0-Mäuse mit
der gleichen Infektionsdosis und den gleichen Viren wie die B6-Mx1-Mäuse infiziert (vgl.
Abbildung 3.16B) und nach 24 Stunden getötet. Dabei war für rec hvPR8 ein Organtiter
von etwa 3x107ffu/Lunge, für rec lvPR8 ein Organtiter von zirka 9x104ffu/Lunge zu
messen, was einem Unterschied von ungefähr Faktor 330 entsprach. Die Reassortanten
hv4,6lv1,2,3,5,7,8 und hv1,2,3,5,7,8lv4,6 wuchsen zu einem Titer von 1x105ffu/Lunge bzw.
2x103ffu/Lunge heran. Hier ergab sich ein etwa 50-facher Unterschied in der Viruslast im
Lungengewebe.
69
A
1.0×10 3
1.0×10
2
1.0×10 1
4
3
2
1
0
hv4,6lv1,2,3,5,7,8
7
6
6
05
5
04
4
0
3
3
0
2
2
01
1
0
0
0
rec lvPR8
153
154
lvPR8
153
154
8
07
0
rec lvPR8
8
Virustiter pro Lunge [log10 ffu]
B0
rec hvPR8
rec hvPR8
rec hvPR8
1.0×10
0
5
hv1,2,3,5,7,8lv4,6
1.0×10 4
6
hvPR8
hv1,2,3,5,7,8lv4,6
1.0×10
5
hv4,6lv1,2,3,5,7,8
1.0×10 6
7
rec lvPR8
1.0×10 7
8
Virustiter pro Lunge [log10 ffu]
virus titer [ffu/lung]
1.0×10 8
Ergebnisse
Abbildung 3.16: Virustiter im Lungengewebe. (A) B6-Mx1- bzw. B6-IFNAR0/0-Mäuse wurden mit 1.000ffu
der rekombinanten Viren rec hvPR8, rec lvPR8 und der Reassortanten hv4,6lv1,2,3,5,7,8 und hv1,2,3,5,7,8lv4,6
intranasal infiziert. Die B6-Mx1-Mäuse (A) wurden 72 Stunden nach Infektion, die B6-IFNAR0/0- Mäuse (B)
24 Stunden nach Infektion getötet. Die Lungen wurden entnommen und der Virustiter pro Lunge mittels
Immunfluoreszenztest bestimmt.
Diskussion
4
70
Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit habe ich das hochpathogene Influenza-A-Virus A/PR/8/34
(hvPR8) sowohl in vitro als auch in vivo charakterisiert und nach viralen Faktoren gesucht,
welche
die
besonders
hohe
Virulenz
vermitteln.
Die
Identifikation
viraler
Pathogenitätsfaktoren ist hier von großem Interesse, da gezeigt werden konnte, dass
Infektionen mit hvPR8 auch für Mäuse, die ein funktionales Mx1-Gen tragen und somit
eine voll funktionsfähige angeborene Immunität besitzen, tödlich verlaufen. Dies war sehr
überraschend und zunächst nicht mit der bisher beobachteten hohen Resistenz von Mx1Mäusen gegen eine Infektion mit Influenza-A-Virus vereinbar (Haller, 1981, Haller et al.,
1979).
4.1 Mx1-Sensitivität und IFN-Induktion
Da hvPR8 sowohl in normalen Labormäusen (z.B. C57BL/6) als auch in Mx1+/+-Tieren
hochvirulent war und die LD50 jeweils unter 10ffu lag, stellte sich die Frage, ob hvPR8
eine Resistenz gegen das antiviral aktive Mx1-Protein entwickelt hat. Dies war eine nahe
liegende Vermutung, da hvPR8 durch wiederholte Lungenpassagen an Mx1+/+-Mäuse des
Stamms A2G adaptiert wurde (Haller, 1981). Durch Behandlung von Mäusen mit IFN-α
bzw. mit dem Imiquimod-ählichen Immunmodulator und TLR7-Liganden S-28463 (Tomai
et al., 1995), wurde das Immunsystem von Mäusen (Mx1-/- und Mx1+/+) stimuliert. Erst
Stunden nach der Stimulation wurden die Tiere infiziert. So konnten zelluläre Faktoren, die
eine antivirale Aktivität gegen Influenza-A-Virus besitzen, schon vor der Infektion
exprimiert werden. Wichtig sind hier das 2’-5’-Oligoadenylatsynthetase (OAS)/RNase LSystem (Min und Krug, 2006), die Proteinkinase R (PKR) (Bergmann et al., 2000, Hatada
et al., 1999) und bei den Mx1+/+-Tieren vor allem die Mx1-Proteine (Haller und Kochs,
2002). Es zeigte sich, dass Vorbehandlung mit IFN oder S-28463 das Überleben von Mx1-/-Tieren nicht verlängert (siehe Abbildung 3.3). Die Vorbehandlung von Mx1+/+-Tieren
resultierte jedoch in einem zirka vier Tage längeren Überleben nach S-28463-Behandlung
bzw. in einem vollständigen Schutz der Tiere bei einer Behandlung mit IFN-α.
Die Untersuchung der Viruslast im Lungengewebe der vorbehandelten Mx1-/--Tiere zeigte,
dass eine immunstimulatorische Behandlung allenfalls marginale Effekte brachte (vgl.
Abbildung 3.4). Bei den Mx1+/+-Tieren hingegen resultierte die Vorbehandlung v.a. mit
IFN-α
in
einer
drastischen
Reduktion
der
Viruslast
im
Lungengewebe.
Immunhistochemische Untersuchungen von Lungenschnitten der vorbehandelten Mx1+/+-
71
Diskussion
Mäuse bestätigten eine starke Expression von Mx1 und nur wenige virusinfizierte Zellen
im Lungengewebe. Diese Daten zeigen, dass Mx1 auch gegen Infektion mit einem
hochvirulenten Influenza-A-Virus wie hvPR8 einen starken Schutz vermittelt.
Weiterhin demonstriert dieses Experiment das enorme antivirale Potential von Mx1. Die
vorbehandelten Mx1-/--Mäuse in der Kontrollgruppe sind kongen. Der geringe Effekt einer
Behandlung mit IFN-α bzw. S-28463 in Mx1-/--Mäusen zeigt deutlich, dass OAS/RNase L
und PKR eine untergeordnete Rolle spielen. Dies unterstreicht einmal mehr, dass Mx1 das
entscheidende,
die
Abwehr
von
Influenza-A-Virus-Infektionen
vermittelnde
Effektormolekül ist (Staeheli und Haller, 1987).
Auch der Mensch besitzt ein Mx-System, das antivirale Aktivität gegen Influenza-A-Virus
aufweist (Pavlovic et al., 1992). Die Ergebnisse der IFN-Vorbehandlungsexperimente sind
besonders interessant hinsichtlich der Gefahren, die von immer wieder auftretenden
Grippewellen ausgehen. Trotz Impfung und der Möglichkeit einer antiviralen Medikation
mit Neuraminidaseinhibitoren und M2-Antagonisten besteht heute mehr denn je der
Bedarf, große Teile der Bevölkerung beim plötzlichen Auftreten einer Pandemie effizient
zu schützen. Auf der Suche nach neuen Behandlungsmöglichkeiten ist die IFN-vermittelte
Induktion des Mx-Systems sicher ein vielversprechender Ansatz. Zielgerichtete Forschung
hinsichtlich möglicher Applikationswege (per oralem, subkutan, intranasal etc.) und
Applikationsformen (Lösung, Aerosol etc.) sowie der Dosierung sollte erfolgen, wobei hier
sicher die Mx1+/+-Maus und das hochpathogene hvPR8 eines der praktikabelsten Modelle
wäre.
Da nun klar war, dass die hohe Pathogenität von hvPR8 nicht auf eine Resistenz gegenüber
Mx1 zurückgeht, habe ich untersucht, ob das Virus das IFN-System des Wirts besonders
effizient unterdrücken kann. Verschiedene Studien zeigen, dass das virale NS1-Protein als
IFN-Antagonist fungiert und einer der wichtigsten Virulenzfaktoren ist (Garcia-Sastre,
2001, Krug et al., 2003, Seo et al., 2002). Die NS1-Proteine verschiedener Virusstämme
unterscheiden sich jedoch stark in ihrem IFN-antagonistischen Potential (Geiss et al.,
2002). Mit Infektionsversuchen im Mausmodell und anschließender Bestimmung von IFNMengen im Lungengewebe konnte ich zeigen, dass sowohl hvPR8 als auch lvPR8
schlechte IFN-Induktoren sind. Auch 10 Stunden nach Infektion lagen die IFN-Level im
Lungengewebe infizierter Tiere noch auf Hintergrundniveau (vgl. Abbildung 3.6).
Infizierte Zellkulturen zeigten ein ähnliches Bild (vgl. Abbildung 3.8).
Diskussion
72
Nach Infektion von MDCK-Zellen konnten für beide Viren gleiche, geringe Mengen an
IFN-β-mRNA nachgewiesen werden (vgl. Abbildung 3.7). Somit konnte ich zeigen, dass
die Unterschiede in der Virulenz der beiden PR8-Viren nicht in der Induktion von Typ-IIFN liegen. Wie bei Österlund et al. beschrieben, trägt zumindest in myeloiden
dendritischen Zellen auch IFN-λ zur Reduktion der Influenza-A-Virustiter bei (Osterlund
et al., 2005). Allerdings blieb der Einfluss von IFN-λ im Zusammenhang mit meinen
Experimenten mangels entsprechender Modellsysteme unklar.
Solorzano et al. zeigten, dass die Menge an in vitro induziertem Typ-I-IFN mit der Fitness
des Influenza-A-Virus in vivo korreliert (Solorzano et al., 2005). Weiterhin konnten
Cauthen et al. zeigen, dass NS1 auch über das Mausmodell hinaus ein wichtiger
Virulenzfaktor ist (Cauthen et al., 2006). Im Falle des von mir untersuchten Influenza-AVirus ist dies jedoch, wie meine oben diskutierten Daten zeigen, nicht so. Auch in vivoStudien mit rekombinanten Viren deuten auf eine untergeordnete Relevanz von NS1 für
den hochpathogenen Phänotyp hin. Mit einer zweiten Methode, bei der mittels eines
Reporterassays IFN-Protein im Überstand infizierter Zellen gemessen wurde, konnten
ebenfalls keine Unterschiede in der Expression des Zytokins gezeigt werden. Wie zu
erwarten war, lagen auch in diesem Experiment die absoluten Mengen an sezerniertem IFN
auf Hintergrundniveau.
Zusammengenommen sprechen diese Daten dafür, dass die hohe Pathogenität von hvPR8
nicht durch eine besonders gute Suppression der IFN-Antwort des Wirtsorganismus zu
erklären ist. Das NS1 trägt nicht messbar zur erhöhten Pathogenität der beiden Viren bei.
Sequenzanalysen ergaben, dass sich die NS1-Proteine von hvPR8 und lvPR8 nur durch
einen Aminosäureaustausch an Position 101 unterscheiden. Dass die NS1-Proteine sehr
ähnlich sind und beim einzigen Aminosäureaustausch ein Aspartat gegen ein Glutamat
ausgetauscht wurde, also eine Aminosäure mit geladenen polaren Seitenketten durch eine
andere Aminosäure mit den gleichen Eigenschaften ausgetauscht wurde, unterstreicht
zusätzlich, dass eine zentrale Rolle von NS1 nicht zu erwarten ist.
73
Diskussion
4.2 Replikationsgeschwindigkeit von hvPR8
Nachdem eine Resistenz gegen Mx1 und eine besonders effiziente Suppression der IFNInduktion im Wirt nun als prominente Virulenzfaktoren von hvPR8 ausgeschlossen waren,
legten weitere Untersuchungen nahe, dass die Replikationsgeschwindigkeit einen
maßgeblichen Einfluss auf die Pathogenität von hvPR8 hat. Wachstumskinetiken in
MDCK-Zellen (siehe Abbildung 3.10) zeigten ein im Vergleich zu lvPR8 signifikant
schnelleres Wachstum von hvPR8 besonders zu frühen Zeitpunkten nach Infektion.
Passend dazu konnte ich mit Immunfluoreszenzuntersuchungen zeigen, dass in hvPR8infizierten MDCK-Zellen 14 Stunden nach Infektion fast kein virales NP mehr in den
Zellkernen nachweisbar war, während in lvPR8-infizierten Zellen noch die nukleäre
Replikationsphase vorherrschte und nur vereinzelt eine allmähliche Translokation von NP
ins Zytoplasma stattfand. Da das Influenza-A-Virus im Kern repliziert und NP am Ende
des Zyklus ins Zytoplasma transloziert, ist die zelluläre Lokalisation ein indirektes Maß für
die Geschwindigkeit, mit der Transkription und Replikation eines Virus stattfinden (Palese
und Shaw, in press). Besonders eindrücklich waren die Wachstumsunterschiede jedoch in
Lungen infizierter Mäuse zu sehen. Hier war innerhalb der ersten 24 Stunden ein etwa
1000-fach schnelleres Wachstum von hvPR8 zu extrem hohen Virustitern von etwa 108ffu
pro Lunge zu beobachten, unabhängig davon, ob Mx1-/-- oder Mx1+/+-Tiere infiziert
wurden (vgl. Abbildung 3.9). Interessanterweise gab es jedoch auch keine Unterschiede in
der Viruslast zwischen lvPR8-infizierten Mx1-/-- und Mx1+/+-Mäusen. Eine mögliche
Erklärung hierfür ist, dass es nach Infektion eine gewisse Zeit dauert, bis Mx1 exprimiert
wird und ein effektiver Schutz vorhanden ist. Hierfür scheinen 24 Stunden zu kurz zu sein.
Gerade vor diesem Hintergrund ist es wichtig, Kinetikexperimente durchzuführen, bei
denen der früheste Zeitpunkt und die Quantität der exprimierten Proteine im murinen
Lungengewebe nach Infektion bzw. Stimulation des Immunsystems mit IFN oder anderen
Immunmodulatoren bestimmt wird.
Diskussion
74
Um herauszufinden, welche Gensegmente von hvPR8 für die hohe Virulenz verantwortlich
sind, habe ich rekombinante Influenza-A-Viren hergestellt. Neben den rekombinanten
Wildtypviren (rek hvPR8 und rek lvPR8) verwendete ich Viren, die zunächst je 7
Gensegmente von hvPR8 und je ein Gensegment von lvPR8 trugen. Diese Viren wurden
mit der Fragestellung, ob durch Wegnahme eines Gensegments von hvPR8 die Virulenz
abgeschwächt werden kann, im Mx1+/+-Mausmodell charakterisiert. Eine ähnliche
Strategie zur Suche nach Virulenzfaktoren wurde auch von Hatta et al. verfolgt, die die
molekulare Basis von A/Hong Kong/483/97 untersuchten (Hatta et al., 2001). Die Virulenz
konnte dort v.a. auf HA und PB2 zurückgeführt werden. Ich konnte zeigen, dass die viralen
Gensegmente, die für die Oberflächenproteine HA und NA kodieren, für den virulenten
Phänotyp unbedingt notwendig sind. Weiterhin konnte ich zeigen, dass die viralen
Polymeraseuntereinheiten PB2 und PB1 ebenfalls zur Virulenz beitragen. Sie scheinen
jedoch weniger relevant zu sein als die Glykoproteine. Nachdem die Wichtigkeit der
Glykoproteine durch mehrere Experimente deutlich geworden war, untersuchte ich, wie
sich ein Virus verhält, das die für die Oberflächenproteine kodierenden Segmente von
hvPR8 und die restlichen Segmente von lvPR8 trägt (hv4,6lv1,2,3,5,7,8). Ich konnte zeigen,
dass durch die Oberflächenproteine von hvPR8 die Virulenz von lvPR8 gesteigert wird.
Die LD50 für dieses Virus war mit 5x104ffu etwa 10-fach niedriger als die LD50 des
rekombinanten lvPR8. Dies untermauert wiederum die These, dass HA und NA, die für
Bindung, Membranfusion und Freisetzung der Viren verantwortlich sind, eine wichtige
Rolle für die Virulenz spielen. Warum allerdings das Virus, bei dem der Segmentaustausch
in die andere Richtung vollzogen wurde, also hv1,2,3,5,7,8lv4,6, extrem stark attenuiert war,
kann im Moment nicht vollständig erklärt werden. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, dass
es Interaktionen zwischen den einzelnen viralen Genprodukten gibt und diese bei der
Segmentkombination dieses Virus nicht ideal sind. Ebenfalls ist denkbar, dass die
reduzierte Virulenz von hv1,2,3,5,7,8lv4,6 auf nicht optimal passende regulatorische
Nukleotidsequenzen zurückgeht (Muramoto et al., 2006). Dadurch könnte die Effizienz
des intrazellulären Transports und der Verpackung der Gensegmente beeinträchtigt sein.
75
Diskussion
Die Auswirkungen des Austauschs von HA und NA wurden zusätzlich noch anhand von
Virustitern in infizierten Mäusen untersucht. So konnte ich überprüfen, wie sich der
Austausch von Oberflächenproteinen auf die Replikation auswirkte. Ich konnte
nachweisen, dass in Mx1+/+-Mäusen das Virus hv4,6lv1,2,3,5,7,8 schneller als das rek lvPR8
und langsamer als rek hvPR8 wächst. Dieses Virus zeigte also nicht nur hinsichtlich der
LD50, sondern auch in den Virustitern im Lungengewebe ein intermediäres Verhalten. In
diesem Zusammenhang konnte ich auch für das reziproke Virus, also hv1,2,3,5,7,8lv4,6,
zeigen, dass die Attenuierung dieses Virus mit reduzierten Virustitern korreliert (vgl.
Abbildung 3.16A). Interessanterweise waren die Ergebnisse aus der Bestimmung der
Viruslast im Lungengewebe infizierter Mx1+/+-Mäuse, also Tieren, die ein vollständiges
IFN-System tragen, nicht wesentlich verschieden von den Ergebnissen, die bei der
Bestimmung der Viruslast in Lungen von IFNAR0/0-Mäusen erzielt wurden. Da die
IFNAR0/0-Mäuse aufgrund eines knock-out des IFNAR1-Gen auf Chromosom 16 keinen
funktionalen IFNα/β-Rezeptor tragen, ist ihr IFN-System ausgeschaltet (Müller et al.,
1994). Dies untermauert die These, dass Unterschiede in der IFN-Induktion der beiden
Viren nicht als Erklärung für die deutlichen Unterschiede in der Pathogenität der beiden
Viren dienen können.
Da das angeborene Immunsystem im Wirt erst nach Virusinfektion aktiviert wird, scheint
der Erfolg des hochpathogenen Erregers hvPR8 zumindest teilweise darin begründet zu
sein, dass eine effiziente Virusreplikation noch vor Einsetzen der angeborenen antiviralen
Abwehr erfolgt.
Unklar ist noch, welche Schritte des viralen Replikationszyklus zu diesem schnellen
Wachstum beitragen. Erstens kann die Durchdringung der Muzinschicht im murinen
Respirationstrakt und die Bindung des Virus an Sialinsäuren auf der Wirtszelloberfläche
besonders effizient sein. Somit wären der Kontakt zur Wirtszelle und das entry von hvPR8
die Schritte, die überdurchschnittlich schnell ablaufen und so die Aggressivität des Virus
vermitteln. Diese Schritte stehen direkt mit der Funktion der Glykoproteine in Verbindung.
Zweitens wäre denkbar, dass die Polymerase von hvPR8 besonders schnell arbeitet und so
dem Virus einen Vorteil verschafft. Eine dritte denkbare Möglichkeit wäre ein besonders
effizientes budding am Ende des Replikationszyklus.
Diskussion
76
Ich habe zuerst untersucht, wie sich die Replikation von hvPR8 verhält, wenn ein
Zellkultursystem gewählt wird, das keine Sekundärinfektion zulässt. Dies bedeutet, dass
das Virus zwar Zellen infizieren kann, es jedoch nicht möglich ist, dass infizierte Zellen
Virus freisetzen. So können Unterschiede in der Wachstumsgeschwindigkeit auf das entry
und die intrazelluläre Replikation beschränkt werden. Aus Vorversuchen wussten wir, dass
L929-Zellen (murine Fibroblasten) ein geeignetes System hierfür sind. Mit der
Untersuchung der Menge an viralem NP zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion
mittels Western Blot-Analyse konnte ich zeigen, dass in Zellen, die mit hvPR8 infiziert
waren, wesentlich früher virales Protein nachweisbar war als in Zellen, die mit lvPR8
infiziert waren. Auch die absoluten Mengen an viralem Protein waren hier wesentlich
höher (vgl. Abbildung 3.13). Mit einer zweiten Methode, einem Minigenomassay, bei dem
L929-Zellen vor Infektion mit einem CAT-Minigenom transfiziert wurden, konnten diese
Ergebnisse durch Messung der Reporteraktivität bestätigt werden (Abbildung 3.14A).
Diese Daten deuten darauf hin, dass ein besonders effizientes entry und/oder die
intrazelluläre Replikation zu dem extrem schnellen Wachstum von hvPR8 beitragen. In
diesem Jahr wurde für ein hochpathogenes aviäres A/Vietnam/1203/04-Isolat (H5N1)
beschrieben, dass die Polymerasegene zur hohen Virulenz beitragen (Salomon et al.,
2006). Den Einfluss der Polymerasegene auf die Virulenz beschreiben auch Gabriel et al.,
die zeigten, dass Punktmutationen in den Polymerasegenen entscheidend dazu beitragen,
ob ein Influenza-A-Virus des H7N7-Subtyps in der Maus zu hohen Titern repliziert und
letal (SC35M) oder aber apathogen ist (SC35) (Gabriel et al., 2005).
Um auch für hvPR8 zu untersuchen, inwiefern sich die Aktivität der viralen Polymerase
von hvPR8 von der Polymeraseaktivität eines gewöhnlichen PR8-Virus unterscheidet, habe
ich Minireplikonassays ebenfalls in L929-Zellen durchgeführt. Hier zeigte sich, dass die
Polymerase von hvPR8 aktiver war als die von lvPR8 (vgl. Abbildung 3.14B). Der
Unterschied betrug jedoch nur etwa Faktor 2, wohingegen Salomon et al. für die
beschriebenen
H5N1-Stämme
einen
etwa
4,5-fachen
Unterschied
in
der
Polymeraseaktivität zeigten (Salomon et al., 2006). Dies deutet darauf hin, dass die virale
Polymerase zur Pathogenität von hvPR8 beiträgt, aber aufgrund des nicht allzu großen
Aktivitätsunterschieds nicht als alleinige Ursache wahrscheinlich ist. Alle diese Ergebnisse
bekräftigen die Theorie, dass das virale HA eine zentrale Bedeutung als Virulenzfaktor hat.
77
Diskussion
Wie kann nun HA als Pathogenitätsfaktor mechanistisch erklärt werden? In diesem
Zusammenhang wäre es interessant, die Rezeptorspezifität des HA genauer zu untersuchen
mit der Frage, ob vornehmlich α2,3- oder α2,6-glykosidische Bindungen auf der
Wirtszelloberfläche erkannt werden. Matrosovich et al. konnten in einer 2004
veröffentlichten Arbeit zeigen, dass der Übergang hochpathogener, aviärer Influenza-AViren auf den Menschen nicht nur -wie ursprünglich angenommen- von einer schlechten
Rezeptorbindung und extrazellulären Inhibitoren des humanen Respirationstraktes, sondern
von den verschiedenen Zielzellen abhängig ist, die von aviären und humanen Viren
infiziert werden (Matrosovich et al., 2004). Es konnte gezeigt werden, dass humane
Influenza-A-Viren präferentiell nicht-zilientragende Zellen, aviäre und an Eier adaptierte
Viren hingegen hauptsächlich zilientragende Zellen infizieren. Sequenzanalysen ergaben,
dass lvPR8 dem Mount Sinai-Stamm (kurz: Mount Sinai-PR8) von A/PR/8/34, hvPR8 dem
Cambridge-Stamm (kurz: Cambridge-PR8) sehr ähnlich ist. Vom Mount Sinai-Stamm von
A/PR/8/34 ist bekannt, dass er durch häufige Passagen in bebrüteten Hühnereiern an das
Wachstum in Eiern adaptiert ist (Mikhail Matrosovich, persönliche Mitteilung) (Kilbourne
und Murphy, 1960). Deshalb sollte im Rahmen weiterführender Untersuchungen der Frage
nachgegangen werden, ob hvPR8 und lvPR8 präferentiell unterschiedliche Zielzellen
infizieren.
Man weiß von anderen Influenza-A-Viren, dass es Unterschiede in der Geschwindigkeit
und Effizienz bei der von HA vermittelten Membranfusion gibt. Jüngst wurde eine neue
Methode publiziert, die eine hochsensitive Analyse der HA-Aktivität durch die
Visualisierung der viralen Fusion mit der Zelle erlaubt (Sakai et al., 2006). Ebenfalls sollte
die pH-Abhänigkeit der HA-vermittelten Membranfusion näher untersucht werden, da aus
früheren Studien ein Zusammenhang des pH-Spektrums, bei dem Membranfusion
stattfindet, mit der Infektiosität des Virussubtyps bekannt ist (Wharton et al., 1986).
Diskussion
78
Ebenfalls hängt die Spaltbarkeit des HA mit der Virulenz von Influenza-A-Virus
zusammen (Kawaoka und Webster, 1988, Rott et al., 1976, Webster und Rott, 1987). Das
Vorhandensein einer multibasischen Proteasespaltstelle im HA erhöht die Virulenz eines
aviären Influenza-A-Virus, da so das Spektrum an intra- und extrazellulären Proteasen, die
das Vorläuferprotein HA0 spalten können, größer ist (Horimoto und Kawaoka, 1994). Vor
allem hochpathogene aviäre Viren haben eine multibasische Spaltstelle, was ihnen bei
Infektion eines Vertebraten die Möglichkeit einer systemischen Ausbreitung bietet (Palese
und Shaw, in press). In diesem Kontext werden auch die Resultate der Arbeit von Hatta et
al. (2001) diskutiert, die als Virulenzfaktoren v.a. das multibasische HA beschreiben. Auch
dort wird eine systemische Ausbreitung des Virus beobachtet (Hatta et al., 2001).
Aufgrund der extrem schnellen Replikation im Lungengewebe von Mäusen und der damit
einhergehenden massiven Gewebsdestruktion stellt sich die Frage, ob auch hvPR8 zu einer
systemischen Ausbreitung mit Infektion peripherer Organe fähig ist. In ersten
Vorversuchen, bei denen ich die Viruslast in Organen wie Leber, Milz, Herz, Nieren und
Hirn zusätzlich zur Viruslast im Lungengewebe bestimmt habe, konnte ich Virus in
peripheren Organen nachweisen. Allerdings ist nicht klar, ob es sich hierbei um eine
Kontamination bei der Organentnahme handelt. Zudem konnte die Frage, ob es zu einer
Virämie kommt, noch nicht abschließend geklärt werden. Die Beantwortung dieser Frage
gäbe Aufschluss darüber, auf welchem Weg eine potentielle Ausbreitung der Infektion in
periphere Organe stattfindet. Aus Sequenzanalysen kann man jedoch ersehen, dass das HA
von hvPR8 ebenso wenig wie das von lvPR8 eine multibasische Schnittstelle trägt.
Deshalb ist für ein Viruswachstum in Zellkultur die Zugabe einer extrazellulären Protease
(z.B. Trypsin) notwendig. Allerdings ergaben Sequenzvergleiche einen einzelnen
Aminosäureunterschied nahe der Proteasespaltstelle. Dort ist ein Tyrosin gegen ein Serin
ausgetauscht (Stelle 343). Inwiefern dieser Sequenzunterschied zu erhöhter Spaltbarkeit
führt, muss Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Von den beschriebenen 17 Aminosäureunterschieden zwischen den HA-Proteinen von
hvPR8 und lvPR8 lassen sich durch Vergleich mit der Literatur zumindest noch zwei
weitere Austausche abgrenzen, von denen man weiß, dass sie sich auf die Pathogenität von
Influenza-A-Virus auswirken. Dabei handelt es sich um Aminosäureunterschiede im
Bereich der Rezeptorbindungstasche. Im Einzelnen sind dies die Aminosäureaustausche an
Stelle 204 (E204D) (Glaser et al., 2005) und 207 (N207K) (Yamada et al., 2006). Ziel der
weiterführenden Arbeiten in diesem Projekt sollte es sein, diejenigen Aminosäuren zu
79
Diskussion
finden, die hohe Virulenz vermitteln. In diesem Zusammenhang erscheint es als sinnvoll,
die LD50 in Mx1-/-- und in Mx1+/+-Mäusen sowohl für den Mount Sinai-Stamm von
A/PR/8/34 als auch für den Cambridge-Stamm zu ermitteln. Da die Sequenzen dieser
beiden Viren ebenfalls bekannt sind, kann bei einem von lvPR8 bzw. hvPR8 verschiedenen
Verhalten der Viren im Mausmodell auf Aminosäuren geschlossen werden, die Einfluss
auf die Virulenz haben.
Diskussion
80
4.3 Fazit
Zusammengefasst zeigen die Daten dieser Arbeit eine überraschend einfache und effiziente
Strategie auf, wie sich ein Virus der angeborenen Immunität eines Wirtes entziehen kann.
Es scheint, als umgehe hvPR8 die angeborene antivirale Abwehr des Wirts durch eine
extrem hohe Replikationsgeschwindigkeit. Das Virus zieht seinen Nutzen daraus, dass das
angeborene Immunsystem des Wirts nicht permanent aktiv ist, sondern erst nach
Erkennung von pathogen-associated molecular patterns durch zelluläre patternrecognition receptors aktiviert wird. Dies dauert eine gewisse Zeit, in der hvPR8 schon zu
solch extrem hohen Virustitern heranwächst, dass die spätere Aktivierung der antiviralen
Faktoren keinen ausreichenden Effekt mehr hat. Dies ist ein neues Konzept und
unterscheidet sich von den bisher beschrieben Virulenzmechanismen. In Bezug auf HA
wurden als Strategien für die Vermittlung einer hohen Virulenz vor allem das
Vorhandensein einer multibasischen Proteasespaltstelle bei den aviären Isolaten genannt.
Bei den humanen Isolaten konnte ein Zusammenhang zwischen dem Viruswachstum in
Zellkultur ohne Zugabe einer Protease wie Trypsin und hoher Virulenz, wie z.B. für das
Influenza-A-Virus von 1918, gezeigt werden (Tumpey et al., 2005). Andere kürzlich
beschriebene Mechanismen, wie sich Influenza-A-Viren der Immunantwort des Wirtes
entziehen, beruhen hauptsächlich auf der Rolle der Polymerase beim Wirtswechsel und bei
der Steigerung der Virulenz (Gabriel et al., 2005, Salomon et al., 2006) sowie auf der
Aktivität des NS1-Proteins (Fernandez-Sesma et al., 2006, Li et al., 2006, Opitz et al.,
2006).
Da in jüngster Zeit auch für andere hochpathogene Influenza-A-Virus-Stämme wie
beispielsweise das Virus, das die Spanische Grippe von 1918 ausgelöst hat, eine hohe
Replikationsgeschwindigkeit beschrieben wurde (Tumpey et al., 2005), kann man
spekulieren, dass die hier beschriebene Strategie, sich der angeborenen Immunität zu
entziehen, auch von anderen Influenza-A-Viren inklusive des Erregers der Spanischen
Grippe und den beschriebenen hochpathogenen H5N1-Isolaten genutzt wird.
81
5
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das IFN-induzierte Mx1-Protein ist ein entscheidender Effektor der angeborenen
Immunität gegen das Influenza-A-Virus in der Maus. Mausstämme, die ein funktionelles
Mx1-Gen (Mx1+/+) tragen, unterscheiden sich von gewöhnlichen Labormäusen (Mx1-/-)
durch eine hohe Resistenz gegen Infektionen mit Influenza-A-Virus. Im Rahmen dieser
Arbeit wurde ein hochpathogenes Influenza A/PR/8/34-Virus untersucht, das auch in
Mx1+/+-Mäusen ungewöhnlich virulent ist. Dieses Virus wurde highly virulent PR8, kurz
hvPR8, genannt. Ich konnte nachweisen, dass die Replikation von hvPR8 in Mx1+/+Mäusen, nicht aber in Mx1-/--Mäusen, gut kontrolliert werden konnte, sofern die Tiere mit
IFN vorbehandelt wurden. Dies zeigt, dass hvPR8 sensitiv gegenüber der antiviralen
Aktivität von Mx1 ist. Auch die Analyse der IFN-Induktion durch hvPR8 erbrachte keinen
Unterschied zu einem gewöhnlichen PR8-Virus.
Worin liegt also die Ursache für den hochvirulenten Phänotyp von hvPR8?
Untersuchungen des Wachstums von hvPR8 in Zellkultur und in Mäusen zeigten eine
effiziente Expression viraler Gene und verstärkte Bildung von Viruspartikeln zu frühen
Zeitpunkten nach Infektion. Im Minireplikonassay konnte nachgewiesen werden, dass die
virale Polymerase von hvPR8 eine erhöhte Aktivität zeigt. Dies weist darauf hin, dass die
frühe Expression viraler Gene die hohe Virulenz von hvPR8 ausmacht. In Untersuchungen
mit rekombinant hergestellten Reassortantenviren, die bestimmte Genomsegmente von
hvPR8 in Kombination mit Segmenten eines niedrigvirulenten PR8-Virus tragen, wurde
deutlich, dass neben den Untereinheiten der viralen Polymerase und der Neuraminidase vor
allem das Hämagglutinin entscheidend zur Virulenz beiträgt.
Zusammengenommen
zeigen
diese
Daten
einen
überraschend
einfachen
Virulenzmechanismus eines hochpathogenen Influenza-A-Virus auf. Durch ein extrem
schnelles Wachstum zu frühen Zeitpunkten der Infektion kann die angeborene antivirale
Abwehr des Wirtes effektiv umgangen werden.
Abkürzungsverzeichnis
6
82
Abkürzungsverzeichnis
AMPR
Ampicillin-Resistenz
AS
Aminosäuren
bidest
bidestilliert
bp
Basenpaare
BSA
bovines Serumalbumin
CAT
Chloramphenicol-Acetyltransferase
cDNA
complementary DNA
CMV
Cytomegalievirus
DABCO
Triethylendiamin,1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan
DMEM
Dulbecco’s modified essential medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
dNTP
Desoxynukleotidtriphosphat
dsRNA
doppelsträngige RNA
DTAF
Dichlorotriazinylaminofluorescein
DTT
1,4-Dithiothreitol
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EtOH
Ethanol
FCS
fetales Kälberserum
FF
Firefly (Photinus pyralis)
FITC
Fluorescein-Isothiocyanate
GFP
green fluorescent protein
GTP
Guanosintriphosphat
h
Stunde
HA
Hämagglutinin
HEPES
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-Ethansulfonsäure
83
HRP
horseradish peroxidase
IFN
Interferon
ISG
interferon stimulated gene
ISRE
interferon stimulated response element
kb
Kilobasen
kDa
Kilodalton
LB-Medium Luria-Bertani-Medium
Luc
Luziferase
M
Matrixprotein
MDA-5
melanoma differentiation-associated gene-5
MOI
multiplicity of infection
mRNA
messenger RNA
Mx
myxovirus resistance
NA
Neuraminidase
NaCl
Natriumchlorid
NCR
non coding region
NEP
nuclear export protein
NP
Nukleoprotein
NP-40
Nonidet P-40
NS
Nichtstrukturprotein
nt
nucleotides
OAS
2’, 5’-Oligoadenylatsynthetase
ORF
open reading frame
PA
polymerase acidic protein
PAMP
pathogen associated molecular pattern
PB1
polymerase basic protein 1
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
84
PB2
polymerase basic protein 2
PCR
polymerase chain reaction
pfu
plaque forming unit
p.i.
post infection
PKR
Proteinkinase R
PRR
pattern recognition receptor
Ren
Renilla reniformis
RFP
red fluorescent protein
RIG-I
retinoic acid inducible gene I
RNA
ribonucleic acid
RNP
Ribonukleoprotein
SA
Sialinsäure
SDS
Natriumdodecylsulfat
SV40
simian vacuolating virus 40
TAE
Tris-Acetat-EDTA
Taq
Thermus quaticus
TEMED
N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin
TLR
Toll-Like-Rezeptor
TPCK
Tosyl-L-phenylalaninchloromethylketon
Tris
Tris(hydroximethyl)aminomethan
TRITC
Tetramethylrhodamine-Isothiocyanate
upm
Umdrehungen pro Minute
UV
ultraviolett
vRNA
virale RNA
v/v
Volumen pro Volumen
w/v
Gewicht pro Volumen
85
7
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