Molekulare Ökologie/ Populationsgenetik
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Molekulare Ökologie/ Populationsgenetik SoSe 2009 Hinweise zum Praktikum Formales • • • • • • • • Tagesablauf Gruppenaufteilung, Teilnahmeliste Sicherheitsbelehrung Laborverantwortliche Protokollbögen Labortagebuch Hinweise zur Auswertung, Bewertung Literatur Themen Molekulare Ökologie: Themen • • • • • • • • Molekulare Identifikation: Arten, Individuen, Geschlecht, DNABarcoding Verhaltensbiologie: Fortpflanzungserfolg, Elternschaft, Nahrungswahl, Ausbreitung Populationsgenetik: Populationsgröße, Populationsstruktur, Fragmentierung, Wachstum, Mortalität, Migration Phylogeographie: Verbreitungsgeschichte, Verbreitungsgebiet, Hybridisierung, Herkunftsbestimmung Genetik im Artenschutz: genetische Diversität, Inzuchtdepression, Auszuchtdepression, Warenkontrolle Genetische Ökotoxikologie: Umweltselektion, Anpassung, Bioindikation Genetische Mikrobiologie: mikrobielle Gemeinschaften, Identifikation von Arten Genetisch modifizierte Organismen: Vertikaler Gentransfer, Horizontaler Gentransfer Genetik im Artenschutz (Conservation Genetics): Zielsetzungen • • • • • • • • • • • Reduzierung des Aussterberisikos durch Reduzierung von Inzucht und Verlust genetischer Diversität Identifikation von Risikopopulationen Beschreibung der Struktur einer Population Klärung des taxonomischen Status Ableitung von Managementeinheiten Entdeckung von Hybridisierungen Nicht-invasive Beprobung Beschreibung geeigneter Wiederansiedlungsgebiete Auswahl geeigneten Besatzmaterials Identifikation einer Art anhand geringer Probenmengen Besseres Verständnis der Biologie einer Art (Populationsgröße, Geschlechterverhältnis, Paarungssystem, Ausbreitung...) Taxonomic uncertainties Evolutionary genetics Understanding species biology Introgression Conservation Genetics Forensics population structure/ fragmentation Outbreeding Small populations Inbreeding Loss of genetic diversity Mutational accumulation Reproductive fitness Genetic management Extinction Identify management unit wild captive reintroduction Genetic adaptation to captivity Nach Frankham et al. 2003 Ist die Taxonomie eindeutig? Nein Ja Genetischer Vergleich der Populationen Chromosomen in identischer Zahl und Form? Nein Ja – vermutlich eine Art Unterschiede zwischen Populationen? Ja – unterschiedliche Art Ist Introgression ein Problem? Ja Nein Unbekannt Einsatz genetischer Marker Nein Unterschiede innerhalb Populationen? Nein Ja – Polymorphismen innerhalb Art Einsatz weiterer Marker Nach Frankham et al. 2003 Ist die Taxonomie eindeutig? Nein Ja Kleine Population? Ja Nein Probleme durch Inzucht oder geringe genetische Diversität? Ja Nein Population zur Kreuzung vorhanden? Fragmentierung der Population? Ja Nein Populationstruktur? Ausreichender Genfluß? Ja Nach Frankham et al. 2003 Nein Unbekannt Einsatz genetischer Marker Sind bei der Art alle relevanten Aspekte der Biologie bekannt? Ja Nein Abstammung? ja nein Paarungssystem? ja nein Genfluss? ja nein Populationsgröße? ja nein Bottlenecks? ja nein Unterliegt die Art illegaler Jagd oder Handel? Falls ja, können genetische Marker genutzt werden, um diese zu entdecken? Falls nein, können genetische Marker hierzu Informationen liefern? Nach Frankham et al. 2003 Organisation der DNA DNA im Zellkern Größe des Genoms [bp] Chromosomen Hefe 14 x 106 16 Fadenwurm 80 x 106 4 Taufliege 165 x 106 4 Krallenfrosch 3000 x 106 18 Maus 3000 x 106 20 Mensch 3000 x 106 23 Mais 5000 x 106 10 Zwiebel 15000 x 106 8 Art Knippers 1997 Vergleich Prokaryoten / Eukaryoten Prokaryot Eukaryot Bakterien, blaugrüne Algen Tiere, Pflanzen, Pilze, Protisten als dichtes Knäuel in der Zelle (Nucleoid) im Zellkern eingeschlossen, Protein-DNA-Komplex (Chromatin) Mitochondrien, (Chloroplasten) nicht vorhanden vorhanden Endoplasmatisches Reticulum nicht vorhanden vorhanden Arten Organisation der DNA Organisation des Eukaryoten-Genoms • Gene – Kodierungssequenzen (Exons) – Nichtkodiderungssequenzen (Introns) • Repetitive DNA-Elemente – Satelliten-DNA • • • • Centromer-DNA Telomer-DNA Minisatelliten Mikrosatelliten – andere repetitive Elemete • SINE-DNA (short interspersed repetitive elements) • LINE-DNA (long interspersed repetitive elements) Organisation des Eukaryoten-Genoms • Minisatelliten: Kopien von DNA-Abschnitten aus 16-64 Basenpaaren (bp) • Mikrosatelliten: 10 bis 50 Kopien von einfachen Sequenzen aus 2 bis 4 bp • SINE-DNA (short interspersed repetitive elements): Abschnitte von 100 bis 500 bp • LINE-DNA (long interspersed repetitive elements): 6000 bis 7000 bp http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/pv92/aluframeset.htm Alu-Element-Polymorphismus PV92 • Alu-Elements: – Short INterspersed Elements (SINE) – Erkennungsstelle für Alu – Transposon / „jumping gene“ (Alu→mRNA →DNA →Insertion) – Nur bei höheren Primaten (Entstehung vor 60. Mio. Jahren) ) • PV92: – für Menschen spez. Insertion eines Alu-Elements auf Chromosom 16 – 2 Allele (715 bp = „+“Allel; 415 bp = „-“Allel) www.geneticorigins.org Alu-Element PV92 Interview mit Prof. Dr. Lynn Jorde, Eccles Institute of Human Genetics, Utah: • Vererbung von Alu-Elementen und Verwendung im Studium der menschlichen Abstammung http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/jorde/usingalu.rm • Hinweise auf fortlaufende Insertionen und Entstehungsrate http://www.geneticorigins.org/geneticorigins/jorde/genetics.rm DNA-Code? Wobble-Hypothese (engl. to wobble = wackeln, schaukeln, schwanken) • durch Kombination der vier Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) bzw. Uracil (U) lassen sich 64 verschiedene Tripletts bilden • Drei Tripletts werden als Stopp-Signal interpretiert, die übrigen 61 codieren Aminosäuren • da nur 21 Aminosäuren (einschließlich Selenocystein) vorkommen, kann eine Aminosäure durch verschiedene Codon-Tripletts (Synonyma) codiert werden: – Arginin, Leucin → 6 synonyme Tripletts – übrigen Aminosäuren → 4, 2 oder eins (Methionin) (Wikipedia) Wobbles in der Primersequenz • • • • • • • • • • • R = A+G Y = C+T M = A+C K = G+T S = G+C W = A+T H = A+T+C B = G+T+C D = G+A+T V = G+A+C N = G+A+T+C Fragestellung 1: Wo sind die Ursprünge des modernen Menschen? Ausbreitungsgeschichte des modernen Menschen • Vertreter der Art Homo erectus wanderten vor 1,5 Mill. aus Afrika aus und bildeten Populationen in Europa und angrenzenden Gebieten (→ Homo neanderthalensis). Jüngste Funde sind ca. 30.000 Jahre alt. • 40.000 bis 100.000 Jahre alte Fossilfunde des „modernen“ Menschen Homo sapiens sind aus Afrika, Europa und Asien bekannt. Ausbreitungsgeschichte des modernen Menschen • Theorie 1 - Multiregionale (polyphyletische) Abstammung: Der „moderne“ Mensch entwickelte sich aus den regionalen Populationen des Homo erectus. • Theorie 2 – Monophyletische (Out-of-Africa) Abstammung: Der „moderne“ Mensch entwickelte sich in Afrika, erreichte von dort die übrigen Kontinente und verdrängte Homo erectus. Methoden • DNA-Extraktion mit Chelex • Elektrophoretischer Nachweis des Alu-ElementPolymorphismus PV92 • Sequenzanalyse eines mitochondriellen Genabschnitts Auswertung • • • • • Allelhäufigkeit Genotypenhäufigkeit Heterozygotiegrad Hardy-Weinberg-Gleichgewicht Vergleich mit anderen Gruppen → www.bioservers.org Links: https://www3.nationalgeographic.com/genographic/index.html http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1069 Fragestellung 2: Wirken Querbauwerke im Verlauf der Haardtrandbäche als Wanderungshindernisse für Gammariden (Gammarus fossarum)? Probestellen Gewässer (Probestelle) Mündung Triefenbach (oberhalb Hilschweiher) Speyerbach Modenbach (unterhalb Buschmühle) Speyerbach Hainbach (unterhalb Walddusche) Speyerbach Schwelterbach (bei Grillhütte) Queich Probestellen Triefbach Modenbach Hainbach Schwelterbach Gewässergüte Triefbach Schwelterbach Modenbach Hainbach http://www.geoportal-wasser.rlp.de/geoportal/html/geoportal_homepage.html Strukturgüte Querbauwerke Hypothesen? Methoden • • • • DNA-Extraktion Allozymanalyse RAPD, ISSR PCR-RFLP DNA-Extraktion • Konzentrationsbestimmung mittels Agarosegel Allozymanalyse Allozymanalyse negative anode Well Protein migrates positive anode Wie variable sind Proteine? Anteil polymorpher Proteine (häufigstes Allel < 99 %): Säugetiere Vögel Insekten Pflanzen 15% 22% 33% 25% Allozymanalyse Vorteile: kostengünstig; Marker sind co-dominant Nachteile: erfasst nur kleinen Anteil von DNA-Variationen. Viele DNA Varianten führen nicht zu einer Änderung der Aminosäuresequenz (z.B. synonyme Substitutionen) bzw einer Änderung der Mobilität im Gel. Anwendungen: Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung Interpretation des Bandenmusters Bandenmuster für a) ein monomeres Enzym, b) ein dimeres Enzym und c) ein tetrameres Enzym. Die Homozygoten werden durch 11 und 22 repräsentiert, die Heterozygoten durch 12. Interpretation des Bandenmusters • monomere Quartärstruktur • 6 Alloenzyme Interpretation des Bandenmusters • 3 Genorte → Isoenzyme • dimere Quartärstrukrur DNA-Variationen RFLP PCR-basierte Methoden RFLP (restriction fragment length polymorphism) Restriktionsenzyme • Restriktionsenzyme schneiden an spezifischen Erkennungssequenzen. Diese Sequenzen sind oft Palindrome: 6-cutter: GAATTC 4-cutter: TCGA CTTAAG AGCT http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/restriction.html RFLP-Analyse PCR-Analyse: 1) PCR-Reaktion 2) Restriktionsverdau 3) Gelelektrophorese Southern-Analyse: 1) Restriktionsverdau 2) Gelelektrophorese 3) Hybridiserung ? ? ? RFLP-Analyse Vorteile: Marker sind co-dominant. Genetische Variationen werden direkt auf Ebene der DNASequenz festgestellt. Nachteile: hoher Arbeitsaufwand, benötigt viel Probenmaterial Anwendungen: Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung RFLP-Analyse Aufgabe: • Fragmentgröße 1800 bp • Schnittstellen: – Allel A – 400bp & 800bp – Allel B – 400bp →Fragmentmuster für AA, AB, BB? PCR-basierte Methoden RAPD AFLP VNTR Sequenzierung PCR (polymerase chain reaction) http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcas e/index.html?id=1017 RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) Analyse der Fragmentmuster Fragmentlänge [bp] 1500 1000 500 Monomorphe Bande Polymorphe Bande Analyse der Fragmentmuster RAPD Vorteile: schnell, kostengünstig, hochvariabel. Nachteile: Marker sind dominant. Geringe Reproduzierbarkeit. Anwendungen: Populationsstrukturierung, geograph. Variationen, Genfluss, Artunterscheidung AFLP (amplified fragment length polymorphism) Digestion of DNA with two enzymes Ligation of adapters Primers complementary to adapters and to 3’ region of some of the fragments AFLP AFLP Vorteile: schnell, kostengüstig, hochvariabel, gute Reproduzierbarkeit. Nachteile: Marker sind dominant. Anwendungen: Populationsstrukturierung, geograph. Variationen, Genfluss, Artunterscheidung Minisatelliten / Mikrosatelliten (VNTR) → http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1074 Mikrosatelliten Mikrosatelliten 6cSQ_S0005.F11_07050703Z8 10000 9000 8000 Größenmarker 212 bp-Peak 216 bp-Peak 7000 6000 215.86 5000 200 211.67 220 4000 240 213.77 3000 210.70 209.65 2000 214.89 2 1 2. 7 9 Dye Signal 208.63 1000 216.85 2 07 . 5 5 0 195 200 205 210 215 Size (nt) 220 225 230 235 Fragmentlängenbestimmung mit Hilfe eines Sequencers 240 Mikrosatelliten Vorteile: hochvariabel, co-dominant Nachteile: kostenintensiv, lange Entwicklungszeit Anwendungen: Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Forensik Sequenzanalyse Sequenzanalyse • Sequenzierung nach Sanger (Anfang 1970er Jahre) http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowcase/index.html?id=1189 • Automatische Sequenzierung http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/cycseq.html Sequenzanalyse Vorteile: hochvariabel, co-dominant Nachteile: kostenintensiv Anwendungen: Populationsstruktur, geograph. Variationen, Heterozygotie, Genfluss, Artunterscheidung, Phylogenetik Hardy-Weinberg-Gleichgewicht • • Beschrieben vom britischen Mathematiker G. H. Hardy und dem deutschen Arzt Wilhelm Weinberg. HWG gilt unter den Bedingungen einer idealen Population: – – – – – Sehr große Individuenzahl Panmixie Keine Selektion Keine Mutationen Keine Migration Hardy-Weinberg-Gleichgewicht p+q=1 p2 + 2pq + q2 = 1 • • • • • p: relative Häufigkeit des Auftretens des Allels A q: Allelfrequenz des (zu A komplementären) Allels a p² = h(AA) 2pq = h(Aa) q² = h(aa) Hobs = Hexp ? AA BB AA AB BB AB AB AB p = 0,5; q = 0,5 Æ p² = h(AA) = 0,25 Æ 2pq = h(Aa) = 0,5 Æ q² = h(aa) = 0,25 Hobs = Hexp ? AA AA AB BB BB AA AB BB Wahlund-Effekt: Separation von Teilpopulationen führt zu einem Rückgang der Heterozygotie Hardy-Weinberg-Gleichgewicht • • Beschrieben vom britischen Mathematiker G. H. Hardy und dem deutschen Arzt Wilhelm Weinberg. HWG gilt unter den Bedingungen einer idealen Population: – – – – – Sehr große Individuenzahl Panmixie Keine Selektion Keine Mutationen Keine Migration Grundlagen der genetischen Vielfalt Inzucht: H0 − H F= H0 F = Inzuchtkoeffizient H0 = erwartete H H = beobachtete H Conner & Hartl 2004 Grundlagen der genetischen Vielfalt • Zunahme der genetischen Vielfalt durch: Mutation 1. Generation Migration 2. Generation →http://www.dnalc.org/ddnalc/mediashowc ase/index.html?id=1073 Grundlagen der Populationsgenetik • Mutation Conner & Hartl 2004 Grundlagen der Populationsgenetik • Migration: Inselmodell des Genflusses pt = pt −1 (1 − m) + pm ∆ p = pt − pt −1 = m( p − p t −1 ) Grundlagen der genetischen Vielfalt • Migration Conner & Hartl 2004 Grundlagen der genetischen Vielfalt Selektion: wirkt über Unterschiede in der individuellen Überlebensrate und im Fortpflanzungserfolg 1. Generation 2. Generation Grundlagen der genetischen Vielfalt • Selektion (gerichtet) Conner & Hartl 2004 Grundlagen der genetischen Vielfalt • Selektion (gerichtet) Conner & Hartl 2004 Grundlagen der genetischen Vielfalt • Selektion (stabilisierend) Conner & Hartl 2004 Grundlagen der genetischen Vielfalt Genetische Drift: nur ein Teil der Population reproduziert sich erfolgreich; hierdurch können sich Merkmalshäufigkeiten zufällig ändern 1. Generation 2. Generation Grundlagen der genetischen Vielfalt • Genetische Drift: Inzuchtkoeffizient ∆F = 1 / 2Ne (Wright 1931) Ft = 1 - (1 - 1/(1/2 Ne)t Primack 1995 Grundlagen der genetischen Vielfalt • Migration vs. Drift 1 FST = 1 + 4Nem FST = Fixierungsindex Conner & Hartl 2004 Grundlagen der genetischen Vielfalt Flaschenhals-Effekt (bottleneck effect) Gründer-Effekt (founder effect) 1. Generation 1. See 2. Generation 2. See 1. Generation 3. Generation 2. See 2. Generation Grundlagen der genetischen Vielfalt Ebene der Variation Beobachtete Differenzierung Heterozygotie zwischen Teilpopulationen (FST) innerhalb von Teilpopulationen (HI) Effekt auf all Loci? Mutation ↑ ↑ Nein Genfluss (Migration) ↑ ↓ Ja Gendrift ↓ ↑ Ja Selektion ↑↓ ↑↓ Nein Grundlagen der genetischen Vielfalt Inzucht: Paarung nahverwandter Tiere kann zur Kombination von zwei defekten Genen an einem Genort führen Zunahme von Erbkrankheiten, verminderte Überlebens- und Fortpflanzungsrate (Inzuchtdepression) Grundlagen der genetischen Vielfalt Hybridisierung: die Kreuzung bereits differenzierter Populationen oder (Unter-)Arten kann die genetische Vielfalt erhöhen oder zu einem Verlust der genetischen Identität führen (Auszuchtdpression) 1. See 2. See 3. See Projekte Laufend/ abgeschlossen: • Nicht-invasive Bestandsschätzung von Wildschweinen (Kolodziej, Thometzek, Eckert) • Phylogenetik von Bachforellenpopulationen des Pfälzerwaldes (Holzhäuser) • Erfolgskontrolle von Fischwanderhilfen (Wolf) • Sozialstruktur bei Waschbären (Peter) • Warenkontrolle von Heilpflanzen (Süß) Geplant: • Phylogenetik von Edelkrebspopulationen • Genfluss zwischen Fischbeständen der Rheinaltarme
