Institut für Pathologie
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Institut für Pathologie Universität Hamburg Prof. Dr. med. G. Sauter EXPRESSION DES ÖSTROGENREZEPTORS α UND AMPLIFIKATION DES ESR1-GENS BEI MESENCHYMALEN NEOPLASIEN DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin dem Fachbereich Medizin der Universität Hamburg vorgelegt von Sylvia Giese geboren in Potsdam Hamburg 2012 Angenommen vom Fachbereich Medizin der Universität Hamburg am: 27. Januar 2012 Veröffentlicht mit Genehmigung des Fachbereichs Medizin der Universität Hamburg Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. Guido Sauter Prüfungsausschuss: 2. Gutachter/in: Prof. Dr. Fritz Jänicke Prüfungsausschuss: 3. Gutachter/in: PD Dr. Ronald Simon -2- INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1.1 Mesenchymale Neoplasien 1.1.1 Epidemiologie 1.1.2 Ätiologie 1.1.3 Staging und Grading 1.1.4 Therapie 1.1.5 Leiomyom 1.1.6 Leiomyosarkom 1.1.7 Gastrointestinaler Stromatumor 1.1.8 Liposarkom 1.2 Der Östrogenrezeptor 1.3 Genetische Veränderungen und Kanzerogenese 1.4 Bedeutung des Östrogenrezeptors in der Kanzerogenese 1.5 Östrogenrezeptor und mesenchymale Neoplasien 1.6 Ziele der Arbeit 4 4 4 5 7 8 9 9 11 12 14 16 17 18 19 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Zusammensetzung des Arrays: Patienten-/ Tumorkollektiv 2.2 Befunde/ Histologie-Review 2.3 Herstellung des Tissue-Micro-Arrays 2.4 Immunhistochemie (IHC) 2.5 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) 2.6 Auswertung 2.6.1 Immunhistochemie 2.6.2 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung 2.7 Statistik 20 20 22 22 26 27 29 29 30 31 3 ERGEBNISSE 3.1 Allgemein 3.2 Technische Probleme und Auswertbarkeit 3.3 Primärtumoren 3.3.1 Immunhistochemie 3.3.2 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung 3.3.3 Tumorverhalten 3.3.4 Differenzierungsgrad 3.3.5 Geschlecht 3.3.6 Lokalisation 3.3.7 Tumorgröße 3.4 Rezidive 3.5 Leiomyom 3.6 Leiomyosarkom 3.6.1 Amplifikationen bei Leiomyosarkomen 3.7 Gastrointestinaler Stromatumor 3.8 Liposarkom 3.8.1 Amplifikationen bei Liposarkomen 3.9 Immunhistochemie und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung 32 32 35 35 35 38 40 41 42 44 45 46 47 49 51 52 55 57 58 -3- 4 DISKUSSION 4.1 Proteinebene 4.1.1 Östrogenrezeptorexpression und histogenetischer Ursprung 4.1.2 Östrogenrezeptorexpression bei Leiomyomen 4.1.3 Östrogenrezeptorexpression bei Leiomyosarkomen 4.1.4 Östrogenrezeptorexpression bei Gastrointestinalen Stromatumoren 4.1.5 Östrogenrezeptorexpression bei Liposarkomen 4.1.6 Östrogenrezeptorexpression und Geschlecht 4.1.7 Mesenchymale Neoplasien und Östrogeneinfluss 4.1.8 Mesenchymale Neoplasien in Zusammenhang mit Hormontherapien 4.1.9 Östrogenrezeptorexpression und Prognose 4.2 Genebene 4.3 Therapieansätze 4.3.1 Tamoxifen 4.3.2 Therapieversuche bei mesenchymalen Neoplasien 4.4 Methode 59 59 59 60 61 62 5 ZUSAMMENFASSUNG 77 6 LITERATURVERZEICHNIS 79 7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 89 8 TABELLENVERZEICHNIS 90 9 DANKSAGUNG 91 10 CURRICULUM VITAE 92 11 ERKLÄRUNG 93 -4- 62 63 64 65 65 66 71 71 73 74 1 EINLEITUNG 1.1 MESENCHYMALE NEOPLASIEN Weichgewebstumoren (Soft Tissue Tumours) sind im Allgemeinen Neoplasien verbindender Gewebe 1. Sie bilden eine Gruppe heterogener Tumoren, die benigne, maligne und intermediär maligne (Borderline-Tumoren) Neoplasien beinhaltet 1, 2. Benigne Tumoren zeigen eine große Ähnlichkeit mit gesundem Gewebe, wohingegen maligne mesenchymale Neoplasien (Sarkome) je nach Differenzierung unterschiedlich stark normalen Zellen gleichen 1. Es gibt verschiedene Klassifizierungssysteme; die gebräuchlichsten, nach World Health Organization sowie Enzinger & Weiss, erfolgen nach dem histologischen Zelltyp, dem der Weichgewebstumor ähnelt in: adipozytäre Tumoren, fibroblastische/ myofibroblastische Tumoren, fibrohistiozytäre Tumoren, Tumoren der glatten perivaskuläre Tumoren der Tumoren, peripheren vaskuläre Tumoren, Nervenscheiden, so genannte und Skelettmuskulatur, chondro-ossäre periphere Tumoren, neuroektodermale Tumoren sowie solche unklarer Differenzierung 1-3. 1.1.1 EPIDEMIOLOGIE Der größte Anteil von Weichgewebstumoren ist benigne 3. Dessen Inzidenz lässt sich nicht genau feststellen, da gutartige Tumoren oftmals keiner chirurgischen Exzision unterliegen und in Krebsregistern nicht eingeschlossen sind 1, 2 . Vermutlich liegt das Verhältnis benigner zu maligner Weichgewebstumoren bei 100 : 1 1-3. Maligne Weichgewebstumoren sind relativ selten im Vergleich zu anderen bösartigen Neoplasien wie beispielsweise Karzinomen und machen weniger als 1% dieser aus 2, 3 . Die jährliche Inzidenz maligner mesenchymaler Neoplasien liegt bei ungefähr 3-4/ 100000 Einwohner (Europa, USA) 1, 3. Einige Entitäten sind gehäuft bei Männern (wie zum Beispiel synoviales Sarkom, nasopharyngeales Angiofibrom), andere wiederum bevorzugt bei -5- Frauen (beispielsweise Leiomyosarkome, Haemangioperizytom) nachweisbar 1, 2 . Mesenchymale Tumoren betreffen alle Altersgruppen, jedoch ist die Mehrzahl der Sarkome bei Erwachsen zu finden, das mittlere Alter beträgt 65 Jahre Spezielle Tumoren treten allerdings vorherrschend im 1-3 . Kindesalter (Neuroblastom, embryonales Rhabdomyosarkom u. a.) oder bei Jugendlichen (synoviales Sarkom, alveolares Rhabdomyosarkom u. a.) auf 1. Benigne Weichgewebstumoren liegen meist oberflächlich - dermal oder subkutan - (99%) und sind häufig kleiner als 5 cm (95%) 3. Die häufigsten Subentitäten sind Lipome (33%), fibrohistiozytäre und fibröse Tumoren (33%), dann folgen vaskuläre (10%) und Nervenscheidentumoren (5%) 3. Sarkome sind zu 75% in den Extremitäten lokalisiert und zu jeweils 10% am Rumpf oder retroperitoneal 3. Sie liegen zu zwei Drittel im tiefen Gewebe, der 3 mittlere Durchmesser beträgt hier 9 cm . Nur zu einem Drittel sind sie oberflächlich mit einem mittleren Durchmesser von 5 cm zu finden 3. Drei Viertel aller Sarkome sind Liposarkome, Leiomyosarkome, pleomorphe Sarkome (ehemals maligne fibröse Histiozytome undifferenzierte 4, 5 ), synoviale Sarkome und maligne periphere Nervenscheidentumoren. Drei Viertel sind hochmaligne (G2-3) 3. 1.1.2 ÄTIOLOGIE Die Ätiologie von malignen Weichgewebstumoren ist relativ wenig verstanden im Vergleich zu anderen malignen Erkrankungen (wie beispielsweise Lungenkarzinomen) 1, 2. Zu möglichen ursächlichen Faktoren der Kanzerogenese bei Sarkomen zählen unter anderem ionisierende Strahlung (Fibrosarkom, Angiosarkom, peripherer Nervenscheidentumor u. a.), bestimmte onkogenetische Viren (humanes Herpesvirus 8: Kaposi Sarkom, Epstein-Barr Virus: Leiomyosarkom) sowie Chemikalien 1, 2 . Immundefizienz oder therapeutische Immunsuppression werden in Zusammenhang mit dem Auftreten von Sarkomen gebracht 2. Einige Weichgewebstumoren entstehen auch im Rahmen syndromaler, -6- genetischer Erkrankungen wie zum Beispiel der Neurofibromatose Typ1 (Neurofibrom, maligner peripherer Nervenscheidentumor) oder der familiären adenomatösen Polypose (desmoide Fibromatose) 1-3. Es wird davon ausgegangen, Weichgewebstumoren allgemein dass nicht sich aus maligne deren Formen benignen von Varianten entwickeln, sondern de novo entstehen 2, 3. Sarkome sind in aller Regel genetisch instabile Tumoren. Bei etwa einem Drittel aller Sarkome sind spezifische genetische Alterationen zu finden 6 . Translokationen sind ein häufiges Phänomen wie beispielsweise bei synovialen Sarkomen (t(X;18)(p11;q11)), bei primitiven neuroektodermalen Tumoren (t(11;22)(q24;q12) und t(21;22)(q22q12)) Fibrosarkom (t(12;15)(p13;q25)) 1, 6, 7 oder auch beim kongenitalen . Die durch Translokation entstehenden Fusionsgene involvieren oft Transkriptionsfaktoren 1, 6 . Des Weiteren kann es zur spezifischen Mutation von Onkogenen kommen wie zum Beispiel c-kit bei gastrointestinalen Stromatumoren 6. Diese charakteristischen Merkmale einer Entität erlauben eine bessere Differentialdiagnose und Klassifikation der Weichgewebstumoren sowie zum Teil prognostische Aussagen 6. Bei zirka zwei Drittel aller Sarkome konnten bislang keine spezifischen wiederkehrenden genetischen Alterationen nachgewiesen werden 6. Sarkome weisen häufig vielzählige nummerische Chromosomenaberrationen (darunter Genkopienzahlverluste und -gewinne) auf 6. Die meisten adulten Spindelzellund pleomorphen Sarkome zählen zu dieser Gruppe 6 . Keine konstante Korrelation dieser Genveränderungen mit klinisch - pathologischen Parametern konnte aufgezeigt werden 6. Verschiedene Amplifikationen wurden beschrieben wie beispielsweise die der Gene MYC oder der 12q13-15 Region (welche die Gene GLI, MDM2, CHOP, CDK4, SAS und HMGIC beinhaltet) sowie anderer genetischer Regionen, dessen Zielgene bislang unbekannt sind 1, 2. -7- 1.1.3 STAGING UND GRADING Staging und Grading von malignen Weichgewebstumoren sind essentiell für die Wahl einer geeigneten Therapie sowie deren Prognose und darüber hinaus für wissenschaftliche Untersuchungen. Das Staging von Sarkomen basiert sowohl auf histologischen als auch klinischen Informationen. Gemäß American Joint Committee on Cancer (AJCC) und Union Internationale Contre le Cancer (UICC) beinhaltet die TNM Klassifizierung den histologischen Malignitätsgrad, Tumorgröße und -tiefe, regionalen Lymphknotenstatus sowie Fernmetastasen 1-3. Das Grading betrachtet histologische Parameter und ermöglicht Aussagen über den Malignitätsgrad des Tumors 2, 3 . Insbesondere die zelluläre Differenzierung, Anzahl der Mitosen und Tumornekrosen spielen hier eine Rolle (Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer - FNCLCC) 1-3. Es erfolgt eine Unterteilung der malignen Weichgewebstumoren nach dem histologischen Malignitätsgrad in „gut differenziert“ (low grade Sarkome) und „schlecht differenziert“ (high grade Sarkome), um das Risiko von Rezidiven und Metastasen abzuschätzen 2. Low grade Sarkome sind lokal aggressiv, neigen zu Lokalrezidiven, haben jedoch ein eher niedriges Metastasierungsrisiko und daher eine eher gute Prognose 1. Die Therapie ist in erster Linie chirurgisch, sofern möglich 1. High grade Sarkome hingegen tendieren sowohl zur lokalen Rekurrenz als auch zu Metastasen, so dass die Therapie chirurgisch und/oder durch Bestrahlung sowie zytostatischer Behandlung erfolgt 1. Prognostische Parameter mit statistischer Relevanz sind bei Sarkomen Größe, histologischer Malignitätsgrad sowie Staging des Tumors und tumorfreie Resektionsränder 8, 9 . Weitere prognostische Faktoren sind Lokalisation des Tumors sowie Alter, Geschlecht, Rasse des Patienten, die voneinander unabhängig mit der Überlebenszeit assoziieren 8. -8- 1.1.4 THERAPIE Die Ansprechraten von Zytostatika sind insgesamt gering (Anthrazykline, Ifosfamid 16 - 36%, andere 10 - 20%) und zahlreiche Studien zeigen keinen gesicherten Zusammenhang Radiotherapie und Überleben zwischen 7, 8, 10 zytostatischer Behandlung oder . Lediglich Rhabdomyosarkome und primitive neuroektodermale Tumoren des Weichgewebes reagieren gut auf eine zytostatische Behandlung (Vincristin, Etoposid, Actinomycin D), bei denen diese als Standardtherapie gilt 9, 10. Die Wahl der Therapie ist abhängig vom histologischen Subtyp sowie der anatomischen Lokalisation 7, 8 . Die Behandlungsoptionen insbesondere für metastasierte Sarkome sind schlecht. Die Therapie der Wahl von Sarkomen mit statistisch signifikantem Vorteil hinsichtlich Überlebenszeit besteht in erster Linie in der chirurgischen Exzision mit tumorfreien Resektionsrändern (R0 - Resektion) 7, 8, 10. Die klinische Bedeutung neuerer Therapieformen ist bislang größtenteils noch unklar. In Bezug auf neuere, spezifische Therapieansätze ist es hilfreich, Zielgene und -proteine in Schlüsselpositionen zu identifizieren 7, 11 . Denn je spezifischer der Angriffspunkt, seine Prävalenz, seine unabdingbare Rolle für das Zellüberleben und seine Aktivität in den Tumorzellen erforscht ist, desto wahrscheinlicher ist es, eine geeignete Behandlung zu finden und eine Aussage über deren Effektivität zu treffen 7. So konnte für gastrointestinale Stromatumoren (GIST) solch ein Angriffspunkt gefunden werden. Hierbei handelt es sich um die mutierte Tyrosin-Kinase c-kit, deren pathologische Aktivität mittels Imantinibmesylat (STI571/ Glivec) inhibiert 1, 7, 10 und dadurch das autonome Tumorwachstum gehemmt wird. Erste Resultate zeigen Ansprechraten von 60 - 70% und dass die Therapie zu einem verlängerten rezidivfreien Intervall sowie ebenfalls bei metastatischem Stadium zu einer besseren Prognose durch ein verlängertes krankheitsfreies Intervall führt 7, 12-14 . Die Ein-Jahres-Überlebensrate bei fortgeschrittenem Krankheitsbild lag vor Imatinib bei etwa 35% und konnte jetzt bis auf 90% angehoben werden dank auf ursächliche molekulare Anomalien zielender Therapie -9- 13 . Somit konnte bei GISTs im c-kit und dessen Sensibilität für Imatinib ein therapeutisches Schlüsselelement gefunden werden. Molekulare Analysen können Informationen liefern, die sowohl für das Verständnis der Pathogenese bedeutend sind als auch diagnostische und prognostische Relevanz haben. Im Folgenden werden die in der durchgeführten Untersuchung am häufigsten repräsentierten Entitäten kurz vorgestellt. 1.1.5 LEIOMYOME Leiomyome haben große Ähnlichkeit mit ihrem Ursprungsgewebe, der glatten Muskulatur. Sie sind der häufigste gynäkologische Tumor der Frau im reproduktiven Alter 15. Die häufigste Lokalisation dieser gutartigen Tumore ist der weibliche Genitaltrakt, insbesondere der Uterus 1, 2 . Weitere mögliche Entstehungsorte sind retroperitoneal, peritoneal, im tiefen Weichgewebe, gastrointestinal, vaskulär und dermal 1, 2. Es ist bekannt, dass auch bei Leiomyomen chromosomale Veränderungen auftreten können 16. Die Therapie besteht in der chirurgischen Resektion, sofern anatomisch bedingt durchführbar 3. Lokale Rezidive nach Entfernung sind möglich 3. 1.1.6 LEIOMYOSARKOME Das maligne Pendant der Leiomyome sind Leiomyosarkome. Sie sind histologisch recht ähnlich in Bezug auf ihr Ursprungsgewebe, unterscheiden sich jedoch klinisch - pathologisch erheblich von Leiomyomen 1. Vom diagnostischen und therapeutischen Standpunkt aus haben Leiomyosarkome trotz ihrer relativen Seltenheit eine große klinische Bedeutung - 10 - aufgrund ihrer unvorhersehbaren Rekurrenz sowie ihrer Möglichkeiten zur Metastasierung. Sie stellen 5 - 10% der Sarkome dar 2, sind jedoch die häufigsten malignen uterinen Tumoren nicht-epithelialen Ursprungs mesenchymalen Tumoren der Blutgefäße 15 3 , die dominierenden malignen und häufige retroperitoneale Sarkome 3. Insbesondere die Differentialdiagnose gegenüber Leiomyomen ist wichtig hinsichtlich therapeutischer Konsequenzen. Leiomyosarkome treten in Abhängigkeit von der Lokalisation häufiger bei Frauen auf (insbesondere uterin, retroperitoneal, vaskulär) Proliferation stehen in Zusammenhang 2, 3 (Schwangerschaft, Östrogenstimulation) mit 2, 3 , Wachstum und hormonellem Einfluss . Das Prädilektionsalter ist das 50. bis 60. Lebensjahr 2. Sie werden nach Lokalisation eingeteilt, da sie sich hinsichtlich Klinik und Biologie unterscheiden 1, 2 . Häufig treten sie uterin, retroperitoneal oder intraabdominell auf, andere mögliche Lokalisationen sind Weichgewebe, Extremitäten und Rumpf 2. Leiomyosarkome sind genetisch instabile Tumoren und weisen oft komplexe Karyotypen mit unbeständigen chromosomalen Aberrationen auf 3. Histologisch können Leiomyosarkome in epithelioid, myxoid, inflammatorisch und Granularzellleiomyosarkom unterschieden werden 2. Relevante prognostische Parameter sind Tumorgröße, Lokalisation, histologischer Malignitätsgrad und Invasion in Knochen und Blutgefäße 3 . Besonders günstig sind kutane Leiomyosarkome aufgrund ihrer oberflächlichen Lokalisation 2, 17 . Ungünstig hingegen sind retroperitoneale Leiomyosarkome, da sie oft wegen ihrer Größe und tiefen Lokalisation nicht im Gesunden reseziert werden können 2. Neben dem Rezidivrisiko besteht darüber hinaus die Gefahr der Metastasierung, bevorzugt in Lunge und Leber 2, 3. Die Therapie von Leiomyosarkomen ist in erster Linie chirurgisch 8. Bestrahlung und Zytostatika (Doxorubicin/Epirubicin und Ifosfamid) sind ohne gesicherten - 11 - Benefit 7, 8. Leiomyosarkome sind zwar relativ selten, jedoch aggressiv und ihre Prognose ist insgesamt im Vergleich mit anderen malignen Weichgewebstumoren eher schlecht (mittlere Überlebenszeit 21 Monate) 8. 1.1.7 GASTROINTESTINALER STROMATUMOR Gastrointestinaler Stromatumor (GIST) ist die Bezeichnung für eine Gruppe 1 spezifischer mesenchymaler Tumoren des Gastrointestinaltrakts . GISTs unterscheiden sich von anderen Tumoren der glatten Muskulatur durch klinische, histologische und molekulare Merkmale, speziell durch die Expression von c-kit (CD117) 1. Es gibt benigne und maligne Varianten 1, 18 . Sie sind bevorzugt im Erwachsenenalter (vorrangig über 50 Jahren) vorzufinden 1, 18. GISTs sind die häufigsten mesenchymalen Tumoren des Gastrointestinaltrakts (80%) und können dort überall vorkommen Magen 1, 18 1, 13, 18 . Ihre Hauptlokalisation ist der (50 - 70%), dann folgt Dünndarm und Duodenum (20 - 30%), Kolon und Rektum (10%) sowie Ösophagus (1%), mesenterial (5%) und appendikulär (<1%) 13. In der Regel treten sie unifokal auf 13. Charakterisiert sind GISTs, vor allem maligne Formen, durch Mutationen auf dem c-kit-Gen, lokalisiert auf Chromosom 4q11-q12 1. Das c-kit-Gen gehört zu Familie der Tyrosin-Kinasen (Typ 3), deren Rezeptor normalerweise Dimere bildet, dessen Tyrosin-Kinase durch Liganden aktiviert (phosphoryliert) wird und es schließlich nukleär zum Proliferationssignal kommt 1. Durch die Mutation wird c-kit ligandenunabhängig, was so zur Autophosphorylierung und damit zum autonomen Wachstum führt 1, 18. Eine starke Expression des c-kit-Gens (CD117) liegt in 85 - 95% vor 2. Des Weiteren sind andere Genkopienzahlvermehrungen sowie -Verluste bei GISTs zu finden, welche verschiedene Chromosomen betreffen 16, 18. Prognostisch relevante Parameter sind Tumorgröße, Tumornekrose, Expression von Ki67 und Aneuploidie 1, 18 . Darüber hinaus spielt die Lokalisation des - 12 - Primärtumors eine diagnostische Rolle, wobei proximale GISTs (Ösophagus, Magen) günstiger sind als distale (Dünndarm, Kolon) 13. Nach wie vor ist die chirurgische Exzision mit tumorfreiem Resektionsrand (R0 Resektion) die Therapie der Wahl 1, trotzdem besteht die Wahrscheinlichkeit von Rezidiven 18 . Darüber hinaus bildet die mutierte Tyrosin-Kinase c-kit einen Angriffspunkt, deren pathologische Aktivität durch Imantinibmesylat (STI571/ 1, 7 Glivec) inhibiert wird . Dies führt auch bei inoperablem Primärtumor oder fortgeschrittenem Stadium zu einem deutlich verlängertem krankheitsfreien Intervall 12, 13 . GISTs gelten als resistent gegenüber zytostatischen Therapien (<10% Ansprechraten auf Mono- oder Polychemotherapien mit Anthrazyklinen) und zeigen auch keine günstige Entwicklung unter Radiotherapie 13. Bei malignen Formen besteht die Gefahr, diffus intraabdominell oder peritoneal zu rezidivieren oder in die Leber, Lunge sowie Knochen zu streuen – die hauptsächlichen Lokalisationen von Metastasen 1, 13, 18 . Insbesondere bei Rezidiven oder Metastasen ist die Prognose schlecht 13. 1.1.8 LIPOSARKOME Liposarkome sind eine histologisch und genetisch heterogene Gruppe maligner mesenchymaler Neoplasien mit Fettgewebsdifferenzierung 1, 2. Insgesamt zählen sie mit mehr als 20% zu den häufigsten malignen Weichgewebstumoren im Erwachsenenalter 1, 19. Häufige Lokalisationen von Liposarkomen, die vorrangig im mittleren und späten Erwachsenenalter auftreten, sind Extremitäten und Retroperitoneum, bevorzugte Metastasierungsorte Weichgewebe, Knochen sowie Lunge. 1-3 . Klinische Parameter sind stark abhängig vom Subtyp des Liposarkoms und können daher sehr zwischen den einzelnen Tumorgruppen variieren. Folgende Subentitäten Untergliederung erfolgt werden nach unterschieden: Enzinger die und histologische Weiss in hochdifferenziert/dedifferenziert, myxoid/rundzellig und pleomorph 2. Darüber hinaus gibt es noch mixed-type Liposarkome - 13 - 2, 3 , die extrem selten auftreten 3 und in dieser Arbeit nicht vertreten sind. Dedifferenzierte Liposarkome hochdifferenzierter Liposarkomen 1 Liposarkome stellen dar, die rundzellige fortgeschrittene die von Form myxoiden . Die Subentitäten hochdifferenziert/dedifferenziert sowie myxoid/rundzellig sind auch genetisch verschieden. Die erstere Gruppe charakterisiert ein Rearrangement des Genabschnittes 12q 1-3 , wohingegen für myxoid/rundzellige Liposarkome die Translokation t(12;16)(q13;p11) typisch ist 1-3 . Genetische Aspekte pleomorpher Liposarkome sind bislang wenig verstanden 1. Hochdifferenzierte Liposarkome in subkutaner Lokalisation werden im Rahmen dieser Arbeit als atypische Lipome bezeichnet, da sie nie metastasieren und keine Progression hin zu dedifferenzierten Liposarkomen zeigen 1-3, 19, 20 . Des Weiteren sind sie aufgrund ihrer anatomischen Lage chirurgisch kurativ therapierbar 1-3, 19 hochdifferenzierten . Dadurch unterscheiden sie sich prognostisch von Liposarkomen anderer Lokalisation, beispielsweise retroperitoneal oder mediastinal, die häufig rezidivieren und deren Risiko einer Progression im Sinne einer Dedifferenzierung deutlich höher ist, so dass diese der Gruppe hochdifferenziert/dedifferenziert zugeordnet werden 1-3, 5. Die Prognose hängt stark vom histologischen Subtyp ab 19. Tabelle 1: Prognose in Abhängigkeit des histologischen Subtyps bei Liposarkomen Daten entnommen aus Miettinen „Diagnostic soft tissue pathology“ Churchill Livingstone 2003 1 und Böcker, Denk, Heitz „Pathologie“ Urban & Fischer 2004 19 SUBENTITÄT HÄUFIGKEIT 5-JAHRES-ÜBERLEBENSRATE hochdifferenziert >50% 90% dedifferenziert 5% 60-70% myxoid/rundzellig 30-40% 40-50% pleomorph 5% 20% Wie bereits oben erwähnt spielt bei Liposarkomen die Lokalisation eine entscheidende prognostische Rolle 3. Des Weiteren beeinflussen histologischer Malignitätsgrad, Nekrosen, TP53-Überexpression bei myxoid/rundzelligen sowie Tumorgröße und -Tiefe, Anzahl der Mitosen, Nekrosen bei pleomorphen Liposarkomen die Prognose 3. Therapie der Wahl mit statistisch signifikantem Benefit ist eine ausgedehnte chirurgische Exzision mit tumorfreiem Resektionsrand (R0 - Resektion), die in - 14 - Abhängigkeit von der Lokalisation nicht immer ausreichend durchzuführen ist 3, 8 . So gelten retroperitoneale hochdifferenzierte zweithäufigste Lokalisation dieser Subentität häufige unkontrollierbare Dedifferenzierung 1, 2, lokale 5 . 1, die , als schlecht therapierbar durch Rekurrenz Weitere Radiotherapie sowie Zytostatika 1-3 Liposarkome, 1, sowie therapeutische der Fähigkeit Möglichkeiten zur sind 8 , wobei hier kein gesicherter Benefit hinsichtlich der Überlebenszeit besteht 7, 8, 11 . Die zytostatischen eingesetzten Substanzen Doxorubicin/Epirubicin und Ifosfamid zeigen bei Monotherapie Ansprechraten von 10 - 30%, jedoch ohne Erwirkung einer längeren Überlebenszeit 8, 11 . Insbesondere bei Rezidiven oder fortgeschrittener Erkrankung lässt die Effektivität einer zytostatischen Therapie zu wünschen übrig 11. 1.2 DER ÖSTROGENREZEPTOR Ein besseres Verständnis von Mechanismen, die maßgeblich an der Pathogenese von Weichgewebstumoren beteiligt sind, ist notwendig, um neue und bessere therapeutische Optionen zu finden. Der Östrogenrezeptor wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit Ziel dieser Suche. Der Östrogenrezeptor gehört zur Familie der Steroidhormonrezeptoren. Diese nukleären Rezeptoren können extrazelluläre Signale in eine Transkription eines Genabschnittes überführen. Das Steroidhormon Östrogen entwickelt seine Wirkung über den Östrogenrezeptor, der bis zum Kontakt mit dem Hormon zellulär im inaktivierten Zustand vorliegt, gebunden an zytoplasmatische Proteinkomplexe – den Hitzeschockproteinen 21 . Bei der Aktivierung der Rezeptoren lösen diese sich von den Hitzeschockproteinen und bilden Dimere, die dann über zwei Mechanismen ihre Wirkung entfalten können 21 . Der Östrogenrezeptor kann einerseits direkt als regulativer Transkriptionsfaktor agieren, indem er als Dimer 21 an Zielsequenzen der Zelle bindet aktiviert als auch reprimiert werden die Transkription über . Die Transkription kann dann sowohl 21 . Andererseits kann der Östrogenrezeptor Protein-Protein-Wechselwirkungen - 15 - mit anderen Transkriptionsfaktoren forcieren, beispielsweise durch Bindung an AP-1 über Fos und Jun, die dann ihrerseits an die DNA binden 21. Abbildung 1: Funktion des Östrogenrezeptors Grafik entnommen aus Ganten, Ruckpaul „Grundlagen der Molekularen Medizin“ Springer-Verlag 2003 21 Der Östrogenrezeptor hormonabhängiger als indirekter regulativer Transkriptionsfaktor Transkriptionsfaktor 21 steht und daher im Zusammenhang mit einer Expression von Zielgenen, die den Zellzyklus beeinflussen. Östrogenrezeptorabhängig werden stimulierende Wachstumsfaktoren wie TGFα, IGF-II und PDGF sowie der inhibierende Faktor TGF-β exprimiert 22 . Auch die Produktion zellulärer Proteine wie Progesteronrezeptor und Proteasen wird durch den Östrogenrezeptor als Transkriptionsfaktor beeinflusst 22. Das ESR1-Gen (6q25.1 23 ) ist eine komplexe genomische Einheit mit zahlreichen Möglichkeiten alternativen Spleißens sowie mit Nutzung sechs verschiedener Promotoren 24 . Über die Anzahl der aktiven Promotoren in einer Zelle kann die Menge des synthetisierten Östrogenrezeptors reguliert werden 24. Der Östrogenrezeptor wird in hormonsensitiven Geweben der Frau exprimiert wie im Epithel der Brust und des Endometriums, in Stromazellen des Endometriums und im Myometrium des Uterus 1. - 16 - Die Verteilung der Subtypen α und β des Östrogenrezeptors ist unterschiedlich in verschiedenen Geweben, ebenso ihre Spezifität bezüglich der Bindung von Liganden 25, 26. 1.3 GENETISCHE VERÄNDERUNGEN UND KANZEROGENESE Es ist heute bekannt, dass genetische Veränderungen wie beispielsweise numerische Chromosomenaberationen, Translokationen, Verlust oder Zugewinn von Genabschnitten Kontrollmechanismen des zellulären Wachstums destabilisieren, eine unkontrollierte Proliferation fördern, die dann schließlich in der Entwicklung benigner und maligner Neoplasien resultieren kann 1. Amplifikation sowie auch Deletion von genetischem Material sind bei malignen Tumoren ein häufiger Mechanismus, die Expression bestimmter Zielgene zu steigern und sich so einen Wachstums- und Überlebensvorteil zu sichern 19, 24, 27- 29 . Es kommt im Rahmen einer Amplifikation zu einer Vermehrung von normalerweise zwei vorhandenen Kopien eines Gens auf bis zu mehrere tausend 24 . Die Amplifikation stellt sich zytogenetisch als homogene Struktur dar, die sich in anderen Chromosomen integrieren (intrachromosomal) oder als paarige, extrachromosomale Genpakete vorliegen kann 1, 24. Das Produkt, also das Protein, liegt bei einer Genamplifikation unverändert, aber bei entsprechender Expression in erhöhter Konzentration vor 28 . Durch die unphysiologisch erhöhten Spiegel dieses Genproduktes, beispielsweise die vermehrte Bildung unveränderter Wachstumsfaktoren, kann ein Verlust der kontrollierten Zellproliferation erfolgen 28. Die Identifikation von genetischen Veränderungen trägt zum besseren Verständnis der Kanzerogenese bei, kann diagnostisch genutzt werden und führt zur Entwicklung selektiver Therapien 1. Möglicherweise ergeben sich prognostische Assoziationen der Genveränderung 1. 1.4 BEDEUTUNG DES ÖSTROGENREZEPTORS IN DER KANZEROGENESE - 17 - Der Einfluss von Östrogen sowie Östrogenrezeptorblockern (trans- hydroxytamoxifen) auf die Wachstumsrate von Zellen ist in vitro nachgewiesen 30 . Zelllinien von ER-positiven Mammakarzinomen reagieren auf das Fehlen von Östrogen unmittelbar mit einer verringerten Wachstumsrate 30 . Diese kann nach kurzfristigem Entzug von Östrogenen durch Gabe von Östradiol gesteigert werden 30 . Östrogenrezeptorblocker wirken dosisabhängig als vollständiger Antagonist bei einer durch Östradiol stimulierten Proliferation und führen zu einem verminderten Zellwachstum 30. Es konnte ein Zusammenhang zwischen Anwesenheit von Östrogen und Expression des Östrogenrezeptors in Form einer Up-/Down-Regulation nachgewiesen werden 30 . Zellen unter östrogenfreien Bedingungen zeigen höhere Östrogenrezeptorspiegel 30. Im Tiermodell wurde gezeigt, dass Östrogen und sein Rezeptor auch bei primär östrogenunabhängigem Wachstum über andere Mechanismen proliferationsfördernd wirken 31. Des Weiteren wurde an Tiermodellen dargestellt, dass es unter Östrogeneinfluss zu einer erhöhten Inzidenz von Neoplasien (u. a. Liposarkom) sowie zu einem hormonstimulierten Tumorwachstum kommt 32, 33. Das Vorliegen einer Östrogenrezeptorexpression bei Mammakarzinomen gilt als prognostischer Faktor und ist Ziel einer Antiöstrogenrezeptor-Therapie mit Tamoxifen 34, 35 . Hierdurch kann eine statistisch signifikante Verlängerung des krankheitsfreien sowie des rezidivfreien Intervalls erreicht werden, was sich insgesamt in einer verlängerten Überlebenszeit widerspiegelt 34-36. Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass ESR1-Amplifikationen in 20% und eine geringe Vermehrung Mammakarzinomen der vorliegen. Genkopienzahl In fast allen in weiteren Fällen sind Amplifikationen mit einer Östrogenrezeptorexpression assoziiert 15% die bei ESR1- 27 . Außerdem scheinen Patientinnen mit ESR1-Amplifikation und Östrogenrezeptorexpression mehr von einer Therapie mit Tamoxifen zu profitierten als Patientinnen ohne Amplifikation 27. 1.5 ÖSTROGENREZEPTOR UND MESENCHYMALE NEOPLASIEN Für einige Entitäten mesenchymaler Neoplasien wurde eine Expression des - 18 - Östrogenrezeptors α beschrieben. Dies gilt insbesondere für uterine und retroperitoneale Leiomyome weiblicher Patienten 1, uterine Leiomyosarkome 1, Angiomyofibroblastome, aggressivem Angiomyxome sowie genitale Stromatumore der Frau (wie Stromasarkome des Endometriums) 1. Trotz der früher durchgeführten Untersuchungen geben die publizierten Studien in ihrer Gesamtheit nur ungenügende Aufschlüsse über die tatsächliche Häufigkeit von Östrogenrezeptorexpressionen bei Weichgewebstumoren. Auffällig sind große Diskrepanzen zwischen den Resultaten der einzelnen Studien. So variieren die angegebenen Häufigkeiten beispielsweise bei Leiomyosarkomen zwischen 0% und 100%, bei Liposarkomen zwischen 0% und 60%. Die Beurteilung ist durch diese doch recht unterschiedlichen Aussagen stark erschwert. Einige Entitäten wie zum Beispiel atypische Lipome oder Rhabdomyome wurden bislang keiner Analyse unterzogen, sodass das Wissen über Östrogenrezeptorexpressionen bei Weichgewebstumoren zudem unvollständig ist. Interessant ist die Tatsache, dass in einigen Studien und Fallberichten die Entstehung von Sarkomen (u. a. Liposarkom, Leiomyosarkom, StromazellSarkom) unter Tamoxifen-Therapie geschildert wurde 37-39. Mechanismen die für eine Östrogenrezeptorexpression ursächlich sind, wurden bislang an mesenchymalen Tumoren nicht entdeckt. Eine mögliche Ursache wäre eine Genkopienzahlvermehrung des ESR1-Gens, welches den Östrogenrezeptor α ü kodiert, wie dies bei Mammakarzinomen kürzlich beschrieben wurde 27. - 19 - 1.6 ZIELE DER ARBEIT Da bislang noch keine gezielte Untersuchung an Weichgewebstumoren hinsichtlich Östrogenrezeptoren sowohl auf Protein- als auch auf Genebene an einer größeren Tumorpopulation, die zahlreiche Subentitäten repräsentiert, durchgeführt wurde, ist dies Ziel der vorliegenden Arbeit. Eine standardisierte Analyse unter Verwendung der gleichen Methode, des gleichen Protokolls sowie identischer Materialien soll eine bessere Vergleichbarkeit der Daten realisieren. Dies wird hier mittels Tissue-Microarray-Technik erreicht. Im Fokus stehen die Entitäten Leiomyome, Leiomyosarkome und Liposarkome, bei denen Expressionen des Östrogenrezeptors sowie teils auch Genkopienzahlveränderungen des ESR1-Gen gezeigt wurden, jedoch keine einheitlichen Angaben in der Literatur zu finden sind. Insbesondere Zusammenhänge zwischen Genveränderung und Proteinexpression wurden bei mesenchymalen Tumoren nur unzureichend untersucht. Die Rolle einer ESR1-Amplifikation für die Expression des Östrogenrezeptors wurde bei 743 Proben mesenchymaler Neoplasien von 632 Patienten analysiert. Es erfolgte die Konstruktion eines Tissue Microarrays (TMA), der verschiedene mesenchymale Neoplasien enthielt sowie eines TMAs, der unterschiedliche Fettgewebstumoren beinhaltete. Diese wurden hinsichtlich der Expression des Östrogenrezeptors immunhistochemisch und bezüglich der ESR1-Amplifikation mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung analysiert. Die durchgeführten Untersuchungen sollen dazu beitragen, die Pathogenese von Weichgewebstumoren besser zu verstehen. Bekannte Proteinexpressionen oder Genveränderungen könnten bei der Differentialdiagnose der Subentitäten hilfreich sein. Letztlich könnte die Expression des Östrogenrezeptors einen neuen gezielten Therapieansatz ermöglichen. - 20 - 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 ZUSAMMENSETZUNG DER ARRAYS: PATIENTEN-/ TUMORKOLLEKTIV Für die Untersuchung standen zwei verschiedene Weichgewebstumor-TMAs zur Verfügung. Freundlicherweise konnte auf einen durch E. von Friderici und M. Hochreiter im Rahmen ihrer Doktorarbeit hier im Institut gefertigten Array zurückgegriffen werden. Ein weiterer TMA mit Fettgewebstumoren wurde eigens für diese Arbeit zusammengestellt. Die Multitumorarrays beinhalten verschiedene Entitäten von Weichgewebstumoren sowie standardisiertes Kontrollgewebe. Insgesamt sind 20 Tumortypen vertreten. Tabelle 2: Übersicht Entitäten 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 012 Angiosarkome 010 Chondrosarkome (extraskelettal) 008 Dermatofibrosarkoma protuberans 022 desmoide Fibromatose 012 primitive neuroektodermale Tumoren des Weichgewebes (PNET) 003 Fibrosarkome 072 gastrointestinale Stromatumoren (GIST) 021 Granularzelltumoren 014 Haemangioperizytome 077 Leiomyome 001 Rhabdomyom 072 Leiomyosarkome 120 Liposarkome 012 atypische Lipome 035 maligner peripherer Nervenscheidentumor (malignes Schwannom) 074 Non Specified Sarkome (NOS) 007 Osteosarkome (extraskelettal) 007 Rhabdomyosarkome 003 Synovialsarkome 050 Lipome 000 Standardkontrollgewebe Das Standardkontrollegewebe setzte sich aus Gewebe von Herz, Niere, Lunge, Kolon, Endometrium, Prostata, Lymphknoten, quergestreifter Muskulatur, Haut, Fett, Mamma-, Lungen-, Kolon- und Prostatakarzinomen zusammen. - 21 - Abbildung 2: Schema des TMA Angiosarkom Chondrosarkom Dermatofibrosarkoma protuberans Desmoide Fibromatosis PNET Fibrosarkom GIST Granularzelltumor Haemangioperizytom Leiomyom Rhabdomyom Leiomyosarkom Liposarkom Atypisches Lipom Malignes Schwannom Standardkontrollgewebe NOS Osteosarkom PNET Rhabdomyosarkom Synovialsarkom Standardkontrollgewebe Lipom Atypisches Lipom Liposarkom Standardkontrollgewebe - 22 - 2.2 BEFUNDE/ HISTOLOGIE-REVIEW Aus den Berichten des Instituts für Pathologie Hamburg Eppendorf wurden Angaben zur Diagnose und Lokalisation der Tumoren entnommen, bezüglich der Sarkome ebenfalls Größe (pT-Stadium), Differenzierungsgrad (Grading), Lymphknotenstatus (pN-Stadium) und Metastasierungsgrad (pM-Stadium). Allgemeine Daten wie Operationsdatum, Alter und Geschlecht der Patienten sowie Angaben über rezidivierendes Auftreten des Tumors gehörten ebenso dazu. Des Weiteren wurden alle histologischen Präparate des Fettgewebstumorarrays noch einmal hinsichtlich der Entität sowie eventuell genaue Charakterisierung 3 von Untergruppen nach aktuellen Kriterien der World Health Organization befundet. 2.3 HERSTELLUNG DES TISSUE MICROARRAYS Das Tissue-Micro-Array-Verfahren ermöglicht die Untersuchung eines großen Gewebekollektivs auf Proteinebene (Immunhistochemie) sowie mittels molekularer Methoden (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung). Zunächst erfolgt die Rekrutierung potentiell verwendbarer Fälle aus der Datenbank des Instituts für Pathologie des Universitätsklinikums Hamburg Eppendorf. Entsprechende histologische Schnitte werden aus den Archiven herausgesucht und von einem erfahrenen Pathologen beurteilt. Auf dem hematoxylin-eosin-gefärbten Objektträger werden repräsentative Anteile des Gewebes markiert. Anschließend werden die korrespondierenden Gewebeparaffinblöcke aus den Archiven zu den Objektträgern sortiert. Ein Datenfile wird erstellt, der folgende patientenbezogene Informationen aus den pathologischen Befunden beinhaltet: Geburtsdatum, Geschlecht, jeweiliges Datum der Probenentnahme, Lokalisation sowie Angaben zum Staging und Grading. Nach Erstellung eines Datenfiles (Punch-File) beginnt das Stanzen des Arrays: aus dem repräsentativen Areal eines Gewebeparaffinblocks (DonorBlock) werden Gewebezylinder (Durchmesser 0,6 mm, Höhe 3 - 4 mm mittels einer Hohlnadel entnommen. Die Gewebezylinder vorgefertigte Löcher im Empfängerparaffinblock eingebracht. - 23 - 40, 41 werden ) in Abbildung 3: Herstellung des TMA entnommen aus „Human Molecular Genetics“ 2001, Vol.10, 658 42 Abbildung 4: Stanzgerät und dessen Funktion entnommen aus „Nature reviews drug discovery“ 2003, Vol. 2, 964 43 - 24 - Abbildung 5: Übersichtsaufnahme des Stanzgerätes Abbildung 6: Detailaufnahme des Bohrers Abbildung 7: Detailaufnahme der Stanze Mittels eines selbst hergestellten X-Y-Achsen-Präzisionsinstruments werden die einzelnen Gewebezylinder im Empfängerblock (45 x 20mm) eingebettet; der Abstand zwischen den einzelnen Spots beträgt 0,8 mm. Auf diese Art können bis zu 1000 Gewebestanzen hochpräzise in einen einzigen Empfängerblock angeordnet werden 41, 42. - 25 - Abbildung 8: Beispiel eines Tissue Microarrays Der Array wird mit einem Mikrotom in histologische Schnitte mit einer variablen Dicke von 4 - 8 µm geschnitten und mit Hilfe eines adhesive-coated tape sectioning system (Instrumedics, Hackensack, NJ/USA) auf einen Objektträger aufgebracht 40, 44. Abbildung 9: Gefärbte HE-Schnitte der TMAs - 26 - 2.4 IMMUNHISTOCHEMIE (IHC) Für die immunhistologische Färbung wurde das standardisierte indirekte Immunoperoxidase-Verfahren (ABC-Elite, Vector Laboratories, Berlingame, CA, USA) angewandt. MATERIALIEN45 ER pharmDx-Kit von DAKO (Glostrup, Dänemark): Mix aus Antikörper-Klone 1D5 und ER-2-123 Waschpuffer (code S3006) Dual Endogenous Enzyme Block (code S2003) Target Retrieval Solution (code S1699) kalibrierter Dampfkocher EnVision+ Mouse, HRP (code K4000) DAB+ (Diaminobenzidin, code K3468) Haemalaun • entparaffinieren und rehydrieren der Probe • eintauchen in Target Retrieval Solution • kalibrierter Dampfkocher: 5 min bei 125°C inkubieren 30 min abkühlen lassen (keine Zugluft) Druck ablassen und Objektträger entnehmen abgießen der Target Retrieval Solution und spülen mit Waschpuffer 5 min einweichen der Objektträger in frischem Waschpuffer • Färbung im DAKO-Färbeautomat (DAKO-Autostainer) • Gegenfärbung mit Haemalaun 15 s • trocknen, reinigen und eindeckeln der Objektträger Für die Negativkontrolle wurde der primäre Antikörper weggelassen. Die Positivkontrolle wurde durch Färbung von Standardkontrollgewebe auf dem Array mit bekannter Östrogenrezeptor-Expression (Mammakarzinome) erzielt. - 27 - 2.5 FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG (FISH) TAG I MATERIALIEN Pretreatment Solution (Vysis VP 2000 Pretreatment Reagent #30-801250, Abbott Molecular Inc., IL/USA): NaSCN, pH 5,4, 50 ml, auf 80°C erwärmt Protease Solution (1 L Vysis VP 2000 Protease Buffer #30-801255 (0,01 N HCl, pH 2,0) + Vysis Protease I #32-801260 (Pepsin 250 mg), Abbott Molecular Inc., IL/USA): auf 37°C erwärmt Sonden-Hybridisierungsmix für 20 µl: 14,0 µl Basismix 2,0 µl COT-DNA (1 µg/µl) 3,5 µl ESR1-Sonde DNA (0,03µg/µl) (BAC RP11-450E24, RZPD) 0,5 µl CEP6-Sonde Spektrum Orange (Abbott Molecular Inc., IL/USA) • Paraffinschnitt des Gewebearrays auf Superfrost plus TM über Nacht bei 40°C backen, anschließend mit einem Diamantschreiber das Areal markieren • 3 x 10 min Xylol, 2 x 5 min in 96% Ethanol entparaffinieren • 3 min Lufttrocknung auf Heizplatte, Alkohol entfernen • 15 min Pretreatment bei 80°C • 2 min in demineralisiertem Wasser waschen • 150 min in Proteaselösung bei 37°C andauen • 2 min Wasserspülung (demineralisiertes Wasser) • 3 min 70% Ethanol in Küvette gießen • 3 min 80% Ethanol in Küvette gießen • 3 min 96% Ethanol in Küvette gießen • 3 min Lufttrocknung auf Heizplatte (48°C) • 10 µl Sonden-Hybridisierungsmix auf den Gewebearray pipettieren und mit Deckgläschen eindeckeln, mit Rubbercement versiegeln • 5 min bei 72°C im ThermoBrite (Abbott Molecular Inc., IL/USA) - 28 - denaturieren • über Nacht Schnitt im HYBrite bei 37°C inkubieren TAG II MATERIALIEN Waschpuffer-Küvette: 2 x SSC (Saline-Trinatriumcitrat: 0,14M NaCl, 0,015M Trinatriumcitrat; 4 x 66 g auf 1 L = 20 x SSC, dann 1:10 verdünnen) (Abbott Molecular Inc., IL/USA), 0,3% NP40 (Octylphenoxypolyethoxyethanol; Abbott Molecular Inc., IL/USA), pH 7,25 (pH 7-7,5), auf 72°C erwärmen Fluorescent Antibody Enhancer Set (Roche, Basel/Schweiz) Waschpuffer: 1 x PBS (Phopshate-Buffered saline), 0,2% Tween20, auf 37°C aufwärmen 1 x Blocking-Lösung 500 µl + 3 x 50 µl/Objektträger (10 x Blocking aus KitFlasche #4 auftauen und mit PBS 1:10 verdünnen) DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol) - Antifade 1000 mg/ml (Abbott Molecular Inc., IL/USA) Antikörperaliquots vor Verdünnung mit Blocking-Lösung 5 min bei circa 10000 rpm zentrifugieren • Kleber und Deckgläschen vorsichtig entfernen • Objektträger in den Waschpuffer bei Raumtemperatur stellen bis Wasserbad aufgeheizt, 2 min bei 72°C Objektträger in den Waschpuffer ins Wasserbad stellen • Objektträger nach der Post-Hybridisierung kurz in 1 x PBS (100 ml in Objektträger-Küvette) waschen • Objektträger mit 500 µl Blocking-Solution eindecken, 30 min bei Raumtemperatur inkubieren • Blocking-Solution abkippen • 50 µl Maus-Anti-DIG-Antikörper-Lösung (2 µl Antikörper-Lösung aus KitTube #1 in 48 µl 1 x Blocking) auf Objektträger-Küvette pipettieren, mit Parafilm abdecken, 1 h bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren • 3 x mit 100 ml Waschpuffer (1x PBS, 0,2% Tween20) bei 37°C jeweils etwa 1 min kurz nacheinander waschen (3 Küvetten), zwischendurch etwas - 29 - schütteln • 50 µl Anti-Maus-Antikörper-DIG-Lösung (2 µl Antikörper-Lösung aus KitTube #2 in 48 µl 1 x Blocking) auf Objektträger pipettieren, mit Parafilm abdecken, 1 h bei 37°C in feuchter Kammer inkubieren • 3 x mit 100 ml Waschpuffer (1x PBS, 0,2% Tween20) bei 37°C jeweils etwa 1 min kurz nacheinander waschen (3 Küvetten), zwischendurch etwas schütteln • 50 µl Anti-DIG-Fluorescein-Lösung (2 µl Antikörper-Lösung aus Kit-Tube #3 in 48 µl 1 x Blocking) auf Objektträger pipettieren, mit Parafilm abdecken, 1 h bei 37°C in feuchter, dunkler Kammer inkubieren • 3 x 5 min mit 100 ml Waschpuffer (1 x PBS, 0,2% Tween20) waschen, Küvetten dunkel halten • lufttrocknen der Objektträger im Dunkeln bei Raumtemperatur • eindecken der luftgetrockneten Objektträger mit 50 µl DAPI (4',6-Diamidino2-Phenylindol) - Antifade, mit Deckgläschen (24x32 mm) abdecken, möglichst dunkel halten 2.6 AUSWERTUNG 2.6.1 IMMUNHISTOCHEMIE Die Auswertung erfolgt nach dem Allred-Score 35 . Der Anteil der positiven Tumorzellen wird zunächst geschätzt und ein Proportionsscore ermittelt Anschließend wird ein Intensitätsscore vergeben, der sich an 35 . der durchschnittlichen Färbeintensität positiver Zellen orientiert 35. Tabelle 3: Definition des Allred-Scores 35 SCORE PROPORTIONSSCORE 0 negativ 1 < 1% 2 1-10% 3 10-33% 4 33-66% 5 > 66% INTENSITÄTSSCORE negativ schwach positiv mittelstark positiv stark positiv Proportions- und Intensitätsscore werden addiert, so dass ein Gesamtscore von 0 bis 8 erreicht werden kann 35. Tabelle 4: Interpretation des Allred-Scores 35 ALLRED-SCORE AUSSAGE - 30 - 0–2 3–8 ER-negativ ER-positiv Bei allen immunhistochemisch positiven Tumoren wird die Untersuchung an Schnitten der Großfläche des Tumors wiederholt. 2.6.2 FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG Die Auswertung erfolgt manuell. Die Zellkerne werden mit DAPI blau gefärbt. Als Vergleich wird eine ZentromerSonde (Cep6) verwendet, so dass eine ESR1-Amplifikation vorliegt, wenn das Verhältnis von grünen (ESR1) zu roten (Cep6) Signalen >2 ist. Im Falle intrachromosomaler ESR1-Amplifikationen stellen sich diese als grüne Cluster dar. Bei einer Ratio zwischen 1 und 2 handelt es sich um eine Polysomie. Entspricht die Anzahl der ESR1-Gen-Signale denen der Centromersonde, so liegt keine spezifische Veränderung des ESR1-Gens vor. Ist die Ratio kleiner 1 kann von einer Deletion des ESR1-Gens ausgegangen werden. Die Evaluierung basiert auf dem etablierten Scoring-System für HER2- Amplifikationen beim Test-Kit PathVysion (akzeptiert durch US Food and Drug Administration (FDA)) 46. Amplifikationen und Polysomien werden im Rahmen dieser Arbeit als FISHpositiv bezeichnet. Deletionen wie auch normale Genkopienanzahlen des ESR1-Gens werden hier als FISH-negativ eingeordnet. Tabelle 5: Definition und Interpretation der FISH-Ergebnisse RATIO AUSSAGE >2 Amplifikation 1–2 Polysomie 1 normal <1 Deletion BEZEICHNUNG FISH-positiv FISH-positiv FISH-negativ FISH-negativ Bei allen FISH-positiven Neoplasien wird ebenfalls an weiteren Schnitten der Großfläche nochmals eine FISH-Analyse sowie mehrfach Immunhistochemie durchgeführt. - 31 - 2.7 STATISTIK Mittels Kontigenztabellen-Analyse Zusammenhänge zwischen und klinisch - Chi-Quadrat-Test pathologischen werden Daten und Östrogenrezeptorexpression sowie ESR1-Amplifikation dargestellt. Lediglich der erste Spot eines Patienten wird bei Vorhandensein mehrerer Gewebeproben (Primarius/Rezidiv/Metastase) für die statische Analyse genutzt. - 32 - 3. ERGEBNISSE 3.1 ALLGEMEIN Es wurden 743 Tumoren von 632 Patienten untersucht. Davon sind 313 Patienten männlich (49,50%) und 319 weiblich (50,50%). Das durchschnittliche Alter liegt bei 55,32 Jahren, der Median bei 57,25 Jahren; der jüngste Patient war 1 Jahr, der älteste 98 Jahre alt. Es ergibt sich folgende zu untersuchende Gesamttumorpopulation: Tabelle 6: Übersicht der Gesamttumorpopulation ENTITÄT ANZAHL ANZAHL ANZAHL PATIENTEN PRIMÄRREZIDIVE TUMOREN ADIPOZYTÄRE TUMOREN Lipom 50 50 Atypisches Lipom 12 11 Liposarkom 120 112 FIBROBLASTISCH/MYOFIBROBLASTISCHE TUMOREN Desmoide 22 20 Fibromatose Haemangioperizytom 14 9 Fibrosarkom 3 1 FIBROHISTIOZYTÄRE TUMOREN Dermatofibrosarkoma 8 6 protuberans GLATTMUSKULÄRE TUMOREN Leiomyom 77 77 Leiomyosarkom 72 48 GIST 72 64 SKELETTMUSKULÄRE TUMOREN Rhabdomyom 1 1 Rhabdomyosarkom 7 4 VASKULÄRE TUMOREN Angiosarkom 12 9 CHONDRO-OSSÄRE TUMOREN Chondrosarkom 10 6 Osteosarkom 7 4 PERIPHERE NERVENSCHEIDENTUMOREN Granularzelltumor 21 21 malignes Schwannom 35 20 PERIPHERE NEUROEKTODERMALE TUMOREN PNET 12 8 TUMOREN UNKLARER DIFFERENZIERUNG Synovialsarkom 3 1 NOS 74 54 TOTAL 632 526 ANZAHL METASTASEN 1 25 7 5 - 3 1 4 2 5 1 1 12 1 26 14 2 1 4 2 3 2 4 3 1 11 12 3 3 18 2 12 98 93 Die Entität Malignes Fibröses Histiozytom (MFH) wurde des Öfteren als solche - 33 - in Frage gestellt, so dass diese Tumoren im Rahmen dieser Arbeit als pleomorphe undifferenzierte high grade Sarkome bezeichnet werden und der Gruppe „Non-other-specified-Tumoren (NOS)“ zugeordnet sind 4, 5. Von 38 Patienten konnten sowohl Primarius als auch Rezidiv untersucht werden, bei weiteren 3 Patienten war es möglich Primarius, Rezidiv und Metastase zu analysieren. Tabelle 7: Übersicht Entität, Primarius, Rezidiv und Metastase ENTITÄT PRIMARIUS UND PRIMARIUS, REZIDIV REZIDIV UND METATASE Liposarkom 16 Desmoide Fibromatose 3 Dermatofibrosarcoma 3 protuberans Leiomyom 2 Leiomyosarkom 2 GIST Angiosarkom 2 Chondrosarkom 1 Osteosarkom Granularzelltumor 1 malignes Schwannom 2 PNET 1 NOS 6 TOTAL Nach Enzinger und Weiss 38 2 PRIMARIUS UND METASTASE 1 - 4 - 1 1 - 5 7 1 1 1 3 3 3 25 erfolgt eine Einteilung der Tumoren in benigne, intermediär (so genannte Borderline-Tumoren) und maligne: • benigne: Lipom, Leiomyom, Rhabdomyom, Granularzelltumor • intermediär: atypisches Lipom, desmoide Fibromatose, Dermatofibrosarcoma protuberans • maligne: Liposarkom, Haemangioperizytom, Fibrosarkom, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Angiosarkom, Chondrosarkom, Osteosarkom, malignes Schwannom, PNET, Synovialsarkom, NOS. GISTs werden entsprechend ihrer pathologischen Parameter wie Tumorgröße, Nekrosen, Mitosenanzahl etc. eingeordnet. Insgesamt konnten 174 Tumoren als benigne, 61 als intermediär und 397 als maligne eingeordnet werden. Bei 297 malignen Primärtumoren konnte die Tumorgröße ermittelt werden: 98 (33,00%) Weichgewebstumoren waren kleiner als fünf Zentimeter (entspricht - 34 - pT1) und 199 (67,00%) größer (entspricht pT2). Die Lokalisationstiefe konnte bei 290 malignen Primarii bestimmt werden: wobei 45 (15,52%) Weichgewebstumoren suprafaszial (entspricht pTa) und 245 (84,48%) tief (d.h. unterhalb der Muskelfaszie, entspricht pTb) auftraten. Die einzelnen Neoplasien waren wie folgt lokalisiert: Tabelle 8: Übersicht Lokalisation LOKALISATION PRIMARII Kopf/Hals Rumpfwand Lunge Mediastinum Gastrointestinaltrakt intraperitoneal retroperitoneal obere Extremität untere Extremität Genitaltrakt Skelettsystem andere Lokalisation ohne Angabe REZIDIVE METASTASEN 43 68 7 2 115 38 42 26 88 38 2 1 56 12 17 3 2 12 12 2 14 2 22 2 12 28 2 3 30 4 1 1 3 7 Bei 351 malignen Tumoren konnte anhand der eingesandten Präparate ein Lymphknotenstatus erhoben werden; bei 22 (6,27%) malignen Weichgewebstumoren wurden Lymphknotenmetastasen nachgewiesen (pN1). Das Grading konnte bei 304 der malignen Tumoren aus den Unterlagen entnommen werden, wobei 46 Primarii G1, 87 G2 und 171 G3 klassifiziert wurden. Bei Liposarkomen konnten folgende Subentitäten untersucht werden: Tabelle 9: Übersicht Subentität bei Liposarkomen SUBENTITÄT ANZAHL DER FÄLLE hochdifferenziert/ dedifferenziert myxoid/ rundzellig pleomorph unklar - 35 - 62 40 15 3 3.2 TECHNISCHE PROBLEME UND AUSWERTBARKEIT Immunhistochemisch konnten insgesamt 665 von 743 (89,50%) untersuchten Gewebeproben ausgewertet werden. Fehlende Resultate sind dem Mangel an Gewebe im Spot oder dem Fehlen des Spots geschuldet (78 = 10,50%). Die FISH-Analyse war in 532 von 743 (71,60%) untersuchten Gewebeproben erfolgreich. Fehlende Resultate sind dem Mangel an Gewebe im Spot oder dem Fehlen des Spots geschuldet (211 = 28,40%). 3.3 PRIMÄRTUMOREN 3.3.1 IMMUNHISTOCHEMIE 466 von 526 Primarii (88,59%) waren im immunhistochemischen Verfahren interpretierbar. Es wiesen 62 Primärtumoren (13,30%) ein positives immunhistochemisches Ergebnis auf. Davon waren 38 (8,16%) schwach und 24 (5,15%) stark positiv anfärbbar (Allred – Score s. S. 29). Die Ergebnisse sind tabellarisch auf der folgenden Seite dargestellt. Insbesondere bei glattmuskulären Tumoren (Leiomyom, Leiomyosarkom und GIST trat häufig eine Expression des Östrogenrezeptors auf). Bei der überwiegenden Zahl von östrogenpositiven Tumoren handelt es sich um Leiomyome und Leiomyosarkome, größtenteils aus dem Uterus stammend. Daneben war bei Haemangioperizytomen, malignen peripheren Nervenscheidentumoren häufig sowie Liposarkomen und NOS - Tumoren gelegentlich ein Vorhandensein des Östrogenrezeptors darstellbar. - 36 - Tabelle 10: Übersicht der IHC-Ergebnisse bei Primärtumoren ENTITÄT ANZAHL IHC NEGATIV IHC SCHWACH POSITIV ADIPOZYTÄRE TUMOREN Lipom 50 50 100% Atypisches Lipom 11 11 100% Liposarkom 108 102 6 94% 6% FIBROBLASTISCH/ MYOFIBROBLASTISCHE TUMOREN Desmoide 13 13 Fibromatose 100% Haemangioperizytom 7 5 1 71% 14% FIBROHISTIOZYTÄRE TUMOREN Dermatofibrosarkom 4 4 protuberans 100% GLATTMUSKULÄRE TUMOREN Leiomyom 59 31 8 52% 14% Leiomyosarkom 47 39 5 83% 11% GIST 56 45 11 80% 20% SKELETTMUSKULÄRE TUMOREN Rhabdomyom 1 1 100% Rhabdomyosarkom 3 3 100% VASKULÄRE TUMOREN Angiosarkom 7 7 100% CHONDRO-OSSÄRE TUMOREN Chondrosarkom 4 4 100% Osteosarkom 4 4 100% PERIPHERE NERVENSCHEIDENTUMOREN Granularzelltumor 17 17 100% malignes Schwannom 19 15 4 79% 21% PERIPHERE NEUROEKTODERMALE TUMOREN PNET 5 5 100% TUMOREN UNKLARER DIFFERENZIERUNG Synovialsarkom 1 1 100% NOS 50 47 3 94% 6% TOTAL 466 404 87% - 37 - 38 8% IHC STARK POSITIV 1 14% 20 34% 3 6% 24 5% Abbildung 10: IHC mit schwach positiver Östrogenrezeptorexpression in einem Liposarkom Abbildung 11: IHC mit schwach positiver Östrogenrezeptorexpression in einem Liposarkom 3.3.2 FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG - 38 - Mittels FISH-Analyse waren 375 von 526 (71,29%) der Primarii interpretierbar. 32 (8,53%) Primärtumoren wiesen eine Genkopienveränderung auf. Davon waren 25 (6,67%) Polysomien, 6 (1,60%) Amplifikationen sowie 1 Deletion (0,27%) nachweisbar. Die Ergebnisse sind tabellarisch auf der folgenden Seite dargestellt. Genkopienzahlveränderungen nachweisbar. Darüber waren hinaus am stellen häufigsten sich diese bei NOS-Tumoren bei Liposarkom, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Granularzelltumoren sowie malignen periphereren Nervenscheidentumoren dar. Die Amplifikationen Leiomyosarkoms betrafen sowie ein 2 Liposarkome, Rezidiv und 3 ein Primärtumor NOS-Tumoren. eines Detaillierte Informationen und Fallbeschreibungen sind weiter unten aufgeführt. Abbildung 12: FISH ESR1-Amplifikation bei einem Liposarkom Bla u: Nuklei, grün: ESR1, rot: Centromer 6. Die ESR1-Amplifikation ist als Cluster grüner Signale zu sehen bzw. wenn das Verhältnis von grünen zu roten Signalen >2 ist. - 39 - Tabelle 11: Übersicht der FISH-Ergebnisse bei Primärtumoren ENTITÄT ANZAHL FISH NEGATIV POLYSOMIE ADIPOZYTÄRE TUMOREN Lipom 44 44 100% Atypisches Lipom 9 9 100% Liposarkom 93 81 10 87% 11% FIBROBLASTISCH/ MYOFIBROBLASTISCHE TUMOREN Desmoide 12 12 Fibromatose 100% Haemangioperizytom 5 5 100% FIBROHISTIOZYTÄRE TUMOREN Dermatofibrosarkom 4 4 protuberans 100% GLATTMUSKULÄRE TUMOREN Leiomyom 37 37 100% Leiomyosarkom 39 36 2 92% 5% GIST 50 50 100% SKELETTMUSKULÄRE TUMOREN Rhabdomyom 1 1 100% Rhabdomyosarkom 2 1 1 50% 50% VASKULÄRE TUMOREN Angiosarkom 7 7 100% CHONDRO-OSSÄRE TUMOREN Chondrosarkom 3 3 100% Osteosarkom 1 1 100% PERIPHERE NERVENSCHEIDENTUMOREN Granularzelltumor 11 10 1 91% 9% malignes 17 16 1 Schwannom 94% 6% PERIPHERE NEUROEKTODERMALE TUMOREN PNET 4 4 100% TUMOREN UNKLARER DIFFERENZIERUNG Synovialsarkom 1 1 100% NOS 35 22 10 63% 29% TOTAL 375 344 92% - 40 - 25 7% AMPLIFIKATION 2 2% 1 3% 3 9% 6 2% 3.3.3 TUMORVERHALTEN Benigne Tumoren exprimierten den Östrogenrezeptor in unserem Kollektiv generell häufiger und stärker als intermediäre oder maligne Weichgewebsneoplasien. Dies ist statistisch hochsignifikant (p < 0,001) und gilt auch bei alleiniger Betrachtung glattmuskulärer Tumoren. Eine ER-Positivität war hier signifikant häufiger bei Leiomyomen (28 von 59 positiv, 47,46%) als bei Leiomyosarkomen (8 von 47 positiv, 17,02%) (p = 0,001). Eine definitive Aussage zu uterinen Tumoren ist nicht möglich aufgrund der geringen Anzahl maligner Neoplasien in dieser Region. benigne PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv PRIMÄRTUMOR IHC stark positiv TOTAL Tumorverhalten intermediär 115 40 79,86% 95,24% 9 2 6,25% 4,76% 20 13,89% 144 42 TOTAL maligne 248 88,89% 27 9,68% 4 1,43% 279 403 38 24 465 Abbildung 13: IHC Primärtumoren und Tumorverhalten Genkopienzahlveränderungen traten vor allem bei malignen Tumoren, selten oder gar nicht bei benignen oder intermediären Neoplasien auf. Dieser Zusammenhang ist statistisch hoch signifikant (p < 0,001). benigne PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL Tumorverhalten intermediär maligne 106 41 195 99,06% 100% 86,28% 1 31 0,94% 13,72% 107 41 226 - 41 - TOTAL 342 32 374 Abbildung 14: FISH Primärtumoren und Tumorverhalten 3.3.4 DIFFERENZIERUNGSGRAD Die ER-Expression der malignen Weichgewebsneoplasien zeigt geringe Assoziationen zum Differenzierungsgrad (statistisch nicht signifikant, p = 0,494). Grading G1 PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv PRIMÄRTUMOR IHC stark positiv TOTAL G2 29 82,86% 4 11,43% 2 5,71% 35 TOTAL G3 53 86,89% 7 11,48% 1 1,64% 61 98 89,09% 11 11,00% 1 0,91% 110 Abbildung 15: IHC Maligne Primärtumoren und Differenzierungsgrad - 42 - 180 22 4 206 Jedoch zeigten insbesondere niedrig differenzierte Neoplasien Genkopienzahlveränderungen des ESR1-Gens. Der Zusammenhang zwischen Differenzierungsgrad des Tumors und Genveränderung ist statistisch signifikant (p = 0,030). Grading G1 PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL G2 29 96,67% 1 3,33% 30 TOTAL G3 43 84,31% 8 15,69% 51 69 79,31% 18 20,69% 87 141 27 181 Abbildung 16: FISH Maligne Primärtumoren und Differenzierungsgrad 3.3.5 GESCHLECHT Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Geschlecht und Expression des Östrogenrezeptors ist darstellbar (p < 0,001). Neoplasien weiblicher Patienten exprimieren den ER-Rezeptor deutlich häufiger als bei männlichen Patienten. GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv PRIMÄRTUMOR IHC stark positiv TOTAL TOTAL männlich 194 81,86% 20 8,44% 23 9,71% 237 210 91,70% 18 7,86% 1 0,44% 229 - 43 - 404 38 24 466 Abbildung 17: IHC Primärtumoren und Geschlecht Es besteht ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Geschlecht sowie Genkopienzahlveränderung (p = 0,008). Diese treten deutlich häufiger bei Männern als bei Frauen auf. Eine Hypothese zu diesem unerwarteten Ergebnis findet sich im Diskussionsteil. GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL TOTAL männlich 178 95,70% 8 4,30% 186 166 87,83% 23 12,17% 189 344 31 375 Abbildung 18: FISH Primärtumoren und Geschlecht Der anhand des Alters angenommene Menopausenstatus weiblicher Patienten (jünger als 45 Jahre = prämenopausal, 45 - 55 Jahre = menopausal, älter als 55 Jahre = postmenopausal 47, 48 ) weist weder einen statistisch signifikanten Zusammenhang zur ER-Expression noch zur Genkopienzahlveränderung auf. - 44 - 3.3.6 LOKALISATION In einigen Geweben kommt es häufiger und stärker zu einer Östrogenrezeptorexpression. Dies gilt insbesondere für den Genitaltrakt. Tabelle 12: IHC ER-Expression und Tumorlokalisation LOKALISATION ANZAHL IHC NEGATIV Kopf/ Hals Rumpfwand Lunge Mediastinum Gastrointestinaltrakt intraperitoneal retroperitoneal obere Extremität untere Extremität Genitaltrakt Skelettsystem ohne Angabe 38 61 07 02 92 32 36 24 86 35 02 51 38 57 07 02 79 25 28 23 84 12 02 100% 93% 100% 100% 86% 78% 78% 96% 98% 34% 100% IHC SCHWACH POSITIV 004 7% 0013 14% 04 13% 06 17% 01 4% 01 1% 06 17% 0- IHC STARK POSITIV 0000003 9% 02 6% 001 1% 17 49% 0- Zwischen FISH-Ergebnis und Lokalisation des Tumors lässt sich eine deutliche Assoziation herstellen. Tabelle 13: FISH Genkopienzahlveränderung und Tumorlokalisation PolyLOKALISATION ANZAHL FISH FISH somie NEGATIV POSITIV 1 Kopf/ Hals 31 30 97% 1 3% 2 Rumpfwand 47 44 3 6% 1 Lunge 6 5 83% 1 17% Mediastinum 2 2 100% Gastrointestinaltrakt 76 75 99% 1 1% 1 intraperitoneal 22 20 91% 2 9% 4 retroperitoneal 33 28 85% 5 15% 3 obere Extremität 21 17 81% 4 19% 8 untere Extremität 64 55 86% 9 14% Genitaltrakt 26 26 100% Skelettsystem 1 1 100% ohne Angabe 46 - 45 - Amplifikation 1 1 1 1 1 1 - Deletion 1 - 3.3.7 TUMORGRÖßE Häufiger exprimierten maligne Tumoren den Östrogenrezeptor, die größer als 5 Zentimeter waren (entspricht pT2). Dies ist allerdings ohne statistische Signifikanz (p = 0,538). T-STADIUM pT1 PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC positiv TOTAL TOTAL pT2 81 91,01% 8 8,99% 89 155 87,57% 22 12,43% 177 236 30 266 Abbildung 19: IHC Primärtumoren und Tumorgröße Auf Genebene jedoch, stellt die Tumorgröße eine statistisch signifikante Einflussgröße dar (p = 0,130). Eine Genkopienzahlveränderung ist insbesondere bei malignen Tumoren größer als 5 Zentimeter zu finden. T-STADIUM pT1 PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL TOTAL pT2 64 92,75% 5 7,25% 69 132 85,16% 23 14,84% 155 - 46 - 196 28 224 Abbildung 20: FISH Primärtumoren und Tumorgröße 3.4 REZIDIVE In 38 Fällen wurden Primärtumoren und zugehörige Rezidive untersucht, diese waren hinsichtlich des Östrogenrezeptors in 36 Fällen identisch (p = 0,013). REZIDIV IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC positiv TOTAL TOTAL IHC positiv 34 97,14% 1 2,86% 35 1 33,33% 2 66,67% 3 35 3 38 In 28 Fällen konnten Primärtumor und zugehöriges Rezidiv mittels FISH analysiert werden. Dabei fanden sich Unterschiede bezüglich Amplifikationoder Polysomiestatus im zeitlichen Verlauf. REZIDIV FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL TOTAL FISH positiv 18 90,00% 2 10,00% 20 7 87,50% 1 12,50% 8 25 3 28 Im Folgenden werden die im Fokus stehenden Entitäten Leiomyom, Leimoysarkom sowie Liposarkom näher dargestellt. Ein Kapitel zu Gastrointestinalen Stromatumoren bietet sich ebenfalls an aufgrund der überraschenden Ergebnisse in der Immunhistochemie. - 47 - 3.5. LEIOMYOM 59 Primärtumoren konnten immunhistochemisch analysiert werden, von denen 28 (47,46%) positiv waren. Eine stark positive Färbung war bei 20 (34,90%) Leiomyomen zu finden. 11 Leiomyome stammten von männlichen Patienten, die keine Expression des Östrogenrezeptors (0%) zeigten; 28 von 48 (58,33%) Leiomyomen weiblicher Patienten waren ER-positiv. Die Assoziation von ER-Expression und Geschlecht ist bei Leiomyomen hoch signifikant (p = 0,002). GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv PRIMÄRTUMOR IHC starkpositiv TOTAL TOTAL männlich 20 41,67% 8 16,67% 20 41,67% 48 11 100% - 31 - 20 11 59 Abbildung 21: IHC Leiomyom Primärtumoren und Geschlecht - 48 - 8 Die Lokalisation des Leiomyoms ist ein statistisch hoch signifikanter Faktor in Bezug auf das Vorhandensein des Östrogenrezeptors (p < 0,001). Leiomyome exprimieren diesen bevorzugt im weiblichen Genitaltrakt. Tabelle 14: IHC Leiomyom und Tumorlokalisation LOKALISATION ANZAHL IHC SCHWACH POSITIV Kopf/ Hals 01 0Lunge 01 0Mediastinum 01 0Gastrointestinaltrakt 20 01 5% intraperitoneal 05 0retroperitoneal 03 01 33% untere Extremität 03 0Genitaltrakt 25 06 24% davon Uterus 021 0 5 24% IHC STARK POSITIV 000003 60% 01 33% 0016 64% 0 13 62% Abbildung 22: IHC Leiomyom Primärtumoren und Lokalisation - 49 - IHC NEGATIV 01 01 01 19 02 01 03 03 03 100% 100% 100% 95% 40% 33% 100% 12% 14% 3.6 LEIOMYOSARKOM Es waren 47 Primärtumoren immunhistochemisch auswertbar, von denen 8 (17,02%) positiv, davon 3 (6,38%) stark positiv, anfärbbar waren. Bei 3 von 39 (7,69%) interpretierbaren Primärtumoren traten Genkopienzahlveränderungen auf; dabei handelt es sich um 2 Polysomien (5,13%) und um 1 Amplifikation (2,56%). Das Geschlecht war in unserem relativ kleinen Kollektiv nicht signifikant mit der Östrogenrezeptorexpression assoziiert (p = 0,269). GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC positiv TOTAL TOTAL männlich 20 76,92% 6 23,08% 26 19 90,48% 2 9,52% 21 39 8 47 Abbildung 23: IHC Leiomyosarkom Primärtumoren und Geschlecht Ebenso sind keine Assoziationen zwischen einer Genkopienzahlveränderung und Geschlecht bei Leiomyosarkomen darstellbar (p = 1,000). - 50 - Die Lokalisation ist keine statistisch signifikante Einflussgröße in Bezug zur ERExpression (p = 0,313). Tabelle 15: IHC Leimyosarkom und Tumorlokalisation LOKALISATION ANZAHL IHC SCHWACH POSITIV Kopf/ Hals 03 0Rumpfwand 01 01 100% Lunge 02 0Gastrointestinaltrakt 07 0intraperitoneal 06 01 17% retroperitoneal 9 02 22% obere Extremität 02 0untere Extremität 08 0Genitaltrakt 03 0Skelettsystem 01 0ohne Angabe 05 IHC STARK POSITIV 000000001 12% 01 33% 0- IHC NEGATIV 03 002 07 05 07 02 07 02 01 100% 100% 100% 83% 78% 100% 88% 67% 100% Die Polysomien waren bei Primarii der Lunge und der unteren Extremität, die Amplifikation intraperitoneal zu finden. Es besteht keine statistische Signifikanz zwischen Genkopienzahlveränderung und Lokalisation des Tumors (p = 0,385). Der Differenzierungsgrad von Leiomyosarkomen zeigte eine Tendenz zur quantitativen ESR1-Veränderungen ohne statistische Signifikanz. Grading G1 PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL G2 7 100% 7 TOTAL G3 16 94,12% 1 5,88% 17 13 86,67% 2 13,33% 15 Abbildung 24: FISH Leiomyosarkom Primärtumoren und Differenzierungsgrad - 51 - 36 3 39 3.6.1 AMPLIFIKATIONEN BEI LEIOMYOSARKOMEN Das erste amplifizierte Leiomyosarkom stammt von einer 63-jährigen Patientin. Der Primärtumor war im Mesenterium lokalisiert und ist vermutlich auf dem Boden einer peritonealen Leimyomatose entstanden. Er ist als pT2b N0 M0 und G2 zu klassifizieren. Die Amplifikationsratio beträgt 4 bei 8 ESR1- zu 2 Centromer-6-Kopien. Die Immunhistochemie erbrachte in diesem Fall ein schwach positives Ergebnis. Im zweiten Fall handelt es sich um ein Leimoysarkom einer 50-jährigen Frau mit peritonealer Lokalisation im Sinne einer peritonealen Karzinose, klassifiziert als pTx N0 M1 G3. Es wurden 5 ESR1-/ 2 Centromer-6-Kopien mit einer Ratio von etwa 3 gefunden. Die immunhistochemische Untersuchung ergab ein stark positives Resultat bezüglich einer Östrogenrezeptorexpression. Die Patientin verstarb 9 Monate später an nach klinischen Angaben dialysepflichtiger Niereninsuffizienz, bei Zustand nach beidseits, uterines Leiomyosarkom sowie Peritonealkarzinose. - 52 - Mammakarzinom 3.7 GASTROINTESTINALER STROMATUMOR Es konnten 56 Primärtumoren immunhistochemisch aufgearbeitet werden, von denen 11 (19,64%) schwach positiv waren. Die Expression des Östrogenrezeptors scheint in Beziehung zum Tumorverhalten zu stehen. Maligne GISTs exprimierten den ER häufiger als benigne. Dies erreicht jedoch kein statistisches Signifikanzniveau (p = 0,087). TOTAL benigne PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv TOTAL intermediär 17 94,44% 1 5.56% 18 maligne 12 85,71% 2 14,29% 14 16 66,67% 8 33,33% 24 45 11 56 Abbildung 25: IHC GIST Primärtumoren und Tumorverhalten Das Geschlecht scheint kein statistisch signifikanter Einflussfaktor zu sein (p = 0,181). Bei Tumoren männlicher Patienten trat eine Expression des Östrogenrezeptors interessanterweise häufiger auf als bei Frauen. Bei allen 3 Patientinnen mit positivem ER-Status ist ein postmenopausales Alter anzunehmen. GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC positiv TOTAL TOTAL männlich 24 82,76% 3 10,35% 29 21 77,78% 8 29,63% 27 - 53 - 45 11 56 Abbildung 26: IHC GIST Primärtumoren und Geschlecht Sowohl im Gastrointestinaltrakt als auch außerhalb lokalisierte GISTs weisen vereinzelt eine Expression des Östrogenrezeptors auf. Innerhalb des Verdauungstrakts treten positive GISTs in allen untersuchten Abschnitten auf, jedoch mit statistisch signifikant unterschiedlicher Häufigkeit (p = 0,040). LOKALISATION ANZAHL gastrointestinal Ösophagus Magen Dünndarm Colon/ Rektum extragastrointestinal 53 01 40 11 01 03 IHC SCHWACH POSITIV 10 19% 01 100% 06 15% 02 18% 01 100% 01 33% IHC STARK POSITIV 000000- Abbildung 27: IHC GIST Primärtumoren und Lokalisation - 54 - IHC NEGATIV 43 81% 034 85% 09 82% 002 67% Die Tumorgröße ist eine statistisch signifikante Einflussgröße (p = 0,028); insbesondere bei GISTs größer als 5 Zentimeter lag ein positiver ER-Status vor. T-Stadium pT1 PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC positiv TOTAL TOTAL pT2 29 90,63% 3 9,38% 32 12 63,16% 7 36,84% 19 Abbildung 28: IHC GIST Primärtumoren und Tumorgröße - 55 - 41 10 51 3.8 LIPOSARKOM In der Immunhistochemie konnte bei 6 von 108 Primärtumoren ein schwach positives Ergebnis erzielt werden (5,56%). Tabelle 16: IHC Liposarkom nach verschiedenen Subentitäten Anzahl ENTITÄT 108 Liposarkom 57 hochdifferenziert/ dedifferenziert 36 myxoid/ rundzellig 15 pleomorph IHC - POSITIV 6 6% 3 5% 1 3% 2 14% Auffällig ist, dass alle 3 ER-positiven hoch-/dedifferenzierten Liposarkome nur im hochdifferenzierten Anteil den Östrogenrezeptor exprimierten. Der Differenzierungsgrad der Liposarkome scheint im Allgemeinen jedoch kein signifikanter Einflussfaktor bezüglich des ER-Status zu sein (p = 0,337). Bei 13 (13,98%) von 93 interpretierbaren Primärtumoren wurden Genkopienzahlveränderungen dargestellt: 10 (10,75%) Polysomien, 2 (2,15%) Amplifikationen und 1 (1,08%) Deletion. Genkopienzahlveränderungen sind in unterschiedlicher Häufigkeit bei den jeweiligen Subentitäten zu finden. Dies verfehlt knapp das statistische Signifikanzniveau (p = 0,083). Tabelle 17: FISH Liposarkom nach verschiedenen Subentitäten Anzahl ENTITÄT 93 Liposarkom 48 hochdifferenziert/ dedifferenziert 31 myxoid/ rundzellig 14 pleomorph FISH - POSITIV 13 14% 9 19% 1 3% 3 21% Abbildung 29: FISH Liposarkom Primärtumoren und Subentitäten - 56 - Kein statistisch signifikanter Zusammenhang lässt sich zwischen Geschlecht und Rezeptorpositivität herstellen (p = 1,000). Bei allen Patientinnen mit ERpositiven Tumoren ist ein postmenopausaler Status anzunehmen, dies ist statistisch nicht signifikant (p = 0,751). ESR1-Vermehrungen waren bei weiblichen Patienten häufiger zu finden, allerdings ohne statistische Signifikanz (p = 0,373). GESCHLECHT weiblich PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL TOTAL männlich 39 90,70% 4 9,30% 43 42 84,00% 8 16,00% 50 81 12 93 Abbildung 30: FISH Liposarkom Primärtumoren und Geschlecht Ein statistischer signifikanter Bezug zur Lokalisation ist weder auf Protein- noch auf Genebene nachweisbar. Es ist kein eindeutiger Einfluss des Tumordifferenzierungsgrads auf die Häufigkeit der ER-Expression noch einer nachweisbar. - 57 - Genkopienzahlveränderung Die Tumorgröße zeigt geringe Assoziationen zum positivem FISH-Status, ohne statistische Signifikanz (p = 0,325). T-STADIUM pT1 PRIMÄRTUMOR FISH negativ PRIMÄRTUMOR FISH positiv TOTAL TOTAL pT2 7 100% - 37 78,72% 10 21,27% 47 7 44 10 54 Abbildung 31: FISH Liposarkom Primärtumoren und Tumorgröße 3.7.1 AMPLIFIKATIONEN BEI LIPOSARKOMEN Der erste amplifizierte Tumor ist ein dedifferenziertes Liposarkom von einer 86jährigen Patientin, war am Unterarm subkutan sowie muskulär lokalisiert und pT2 M0 N0 G3 klassifiziert. Die FISH-Ratio beträgt etwa 5 bei 10-12 ESR1- zu 2-3 Centromer-6-Kopien. Das Ergebnis der Immunhistochemie bezüglich einer Östrogenrezeptorexpression fiel negativ aus. Es handelt sich im zweiten Fall um ein dedifferenziertes Liposarkom, einer 64jährigen Frau, das im Verlauf rezidivierte. Sowohl der Primärtumor als auch die Rezidive wiesen in der Kontrolle am Großflächenschnitt eine ÖstrogenrezeptorAmplifikation auf. Die FISH-Ratio des Primarius ist mit 10-20 ESR1- zu 2 Centromer-6-Kopien größer als 5. Der Tumor war retroperitoneal lokalisiert und pT2b M0 N0 G2 klassifiziert. Es lag bei diesem Liposarkom keine Expression des Östrogenrezeptors vor (Immunhistochemie negativ). - 58 - 3.8 IMMUNHISTOCHEMIE UND FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG In 368 von 526 (69,96%) Fällen konnten sowohl ein immunhistochemisch als molekular-genetisch werden. Es interpretierbares Ergebnis des Primärtumors erzielt sind keine eindeutigen Zusammenhänge zwischen Genveränderung und Expression des Proteins darstellbar (p = 0,733). PRIMÄRTUMOR IHC negativ PRIMÄRTUMOR IHC schwach positiv PRIMÄRTUMOR IHC stark positiv TOTAL PRIMÄRTUMOR FISH negativ Polysomie 285 23 84,60% 92,00% 32 2 9,50% 8,00% 20 5,94% 337 25 Abbildung 32: IHC und FISH - 59 - TOTAL Amplifikation 5 83,33% 1 16,67% - 313 6 368 35 20 4. DISKUSSION 4.1 PROTEINEBENE Eine Östrogenrezeptorexpression Liposarkom, konnte Haemangioperizytom, in dieser Leiomyom, Untersuchung Leiomyosarkom, bei GIST, Rhabdomyosarkom, malignen peripheren Nervenscheidentumor, PNET und NOS-Tumoren nachgewiesen werden. Einige Studien haben an verhältnismäßig kleinen Populationen Untersuchungen zur Expression des Östrogenrezeptors α bei mesenchymalen Neoplasien durchgeführt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass einige Tumoren, wie beispielsweise Leiomyome Liposarkome mit 37, 62, 63, 66-69 biochemischen 1, 17, 49-60 , Leiomyosarkome 1, 17, 49-52, 56, 60-66 oder auch diesen exprimieren. Diese Studien arbeiteten vorrangig Assays (Dextran-coated Charcoal Method) oder Immunhistochemie. 4.1.1 ÖSTROGENREZEPTOREXPRESSION UND HISTOGENETISCHER .URSPRUNG Unter den benignen Weichgewebstumoren wurde die Expression des Östrogenrezeptors bei Leiomyomen bestätigt. Bei allen anderen untersuchten gutartigen Entitäten konnte dies nicht dargestellt werden. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass unter den malignen mesenchymalen Tumoren bei den Entitäten Liposarkom, Haemangioperizytom, Leiomyosarkom, GIST, Rhabdomyosarkom, maligner peripherer Nervenscheidentumor, PNET und NOS-Tumoren eine insgesamt eher seltene, wenn vorhanden meist schwache Positivität der ER-Expression darstellbar ist. Die Rezeptorverteilung scheint mit dem histogenetischen Ursprung des Tumorgewebes zu korrelieren 63, 69. Wiederholt wird über eine hohe Inzidenz der Östrogenrezeptorexpression bei malignen Tumoren des Fettgewebes, der glatten Muskulatur sowie vaskulären Ursprungs berichtet, wohingegen dies bei malignen fibrösen (Fibrosarkom, - 60 - ehemals MFH) und synovialen Neoplasien keine oder eine fragliche Rolle zu 62, spielen scheint 63, 69 . Bezüglich maligner adipozytärer Neoplasien und Tumoren der glatten Muskulatur konnte dies in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Allerdings lag bei allen hier untersuchten vaskulären, fibrösen und synovialen Neoplasien ein negativer ER-Status vor. Einigen weiteren Entitäten wie beispielsweise dem juvenilen nasopharyngealem Angiofibrom oder auch der desmoiden Fibromatose wird eine starke Assoziation zum Hormonstatus nahe gelegt 62, 69 . Die hier untersuchten Fälle der desmoiden Fibromatose wiesen keine Expression des Östrogenrezeptors auf. Bei den Entitäten Angiomyofibroblastom, aggressivem Angiomyxom sowie genitale Stromatumoren der Frau (bspw. Stromasarkom des Endometriums) – die hier nicht analysiert wurden – ist eine Östrogenrezeptorexpression bekannt 49, 50, 70 . 4.1.2 ÖSTROGENREZPTOREXPRESSION BEI LEIOMYOMEN Am häufigsten und stärksten liegt bei den untersuchten mesenchymalen Tumoren eine Östrogenrezeptorexpression bei uterinen Leiomyomen vor – 86% waren positiv (62% stark positiv). Die in der Literatur berichteten Frequenzen bezüglich uteriner Leiomyome sind in der gleichen Größenordnung bei etwa 76% - 100% 49-55. Extrauterine Leimoyome wiesen in 26% der 38 untersuchten Primärtumoren einen positiven ER-Status auf. Die Literatur bezüglich insgesamt seltener extrauteriner Leiomyome ist variabel, Häufigkeiten der ER-Expression von 0% 100% 54, 56-59, 71 sind vorzufinden. Dies ist wohl in erster Linie auch auf kleine Fallzahlen der Studien zurückzuführen. Die Auffassung, dass das Wachstum von uterinen Leiomyomen, die den Östrogenrezeptor typischerweise exprimieren, hormonabhängig erfolgt, ist allgemein akzeptiert 15, 17, 49 . Dabei erfolgt die Proliferation der Neoplasien proportional zum Östrogenspiegel im Serum 15. - 61 - Es wurde in der hier untersuchten Tumorpopulation bestätigt, dass auch bei extrauterinen Leiomyomen – wie zum Beispiel in tiefem peripherem Weichgewebe, retroperitoneal, 17 intraperitoneal – ein positiver Hormonrezeptorstatus vorliegen kann 17, 58, 59. Liegt ein positiver Hormonrezeptorstatus bei uterinen Leiomyomen vor, kann eine Therapie mit Gonadotropin-releasing-Hormon-Analoga (GnRH-Agonisten) in Erwägung gezogen werden 17, 28, 49, 52. Prinzipiell ist ebenfalls eine Tamoxifen-Behandlung möglich, insbesondere bei chirurgisch schwer zugänglichen Tumoren wie beispielsweise im Falle einer disseminierten peritonealen Leiomyomatose. Allerdings muss bei uterinen Tumoren der partiell agonistische Effekt von Tamoxifen bedacht werden 34, 38, 39, 72, 73 . 4.1.3 ÖSTROGENREZPTOREXPRESSION BEI LEIOMYOSARKOMEN Frühere Studien an Leiomyosarkomen zeigten im Durchschnitt eine häufigere Frequenz einer Östrogenrezeptorexpression, jedoch auch eine große Varianz von 0 - 100% (26 – 100% bei uteriner Lokalisation 40% bei extrauterinen Leiomyosarkomen 58, 49-52, 56, 60, 61, 64, 65 65, 74 ). Die sowie 0 – untersuchten Leiomyosarkome waren vorrangig Tumoren des Uterus 17. Die hier durchgeführte Studie zeigt, dass eine Östrogenrezeptorexpression auch bei extrauterinen Leiomyosarkomen vorliegt (12,82%). Dies scheint vor allem mit dem Geschlecht des Patienten (Frauen) assoziiert zu sein. 80% der extrauterinen ER-positiven Leiomyosarkome sind von weiblichen Patienten. Ähnliche Assoziationen sind in anderen Studien mit extrauterinen Leiomyosarkomen berichtet 57, 65, 74, 75. Es scheint nachvollziehbar, dass Tumoren mit starker Östrogenrezeptorexpression am meisten von einer Umgebung mit hohem Östrogenlevel profitieren. Es wurde gezeigt, dass es bei erhöhtem endogenen Östrogenspiegel (Adipositas) vermehrt zum Auftreten von uterinen Sarkomen, unter anderem Leiomyosarkomen, kommt 76 . Des Weiteren sind uterine Leiomyosarkome mit - 62 - der Zufuhr exogener Hormone, beispielsweise bei oraler Kontrazeption, assoziiert 76. Es wurde angenommen, dass der Hormonrezeptorstatus bei Leiomyosarkomen zur Differenzialdiagnose gegenüber Leiomyomen, die im wesentlichen auf den Kriterien der nukleären Atypien sowie mitotischer Aktivität beruht, zusätzlich hilfreich sein könnte 17, 51, 53, 58, 77 . Es konnte hier gezeigt werden, dass beide Entitäten eine ER-Expression aufweisen, diese zwar bei Leiomyomen wesentlich häufiger und stärker vorzufinden ist sowie vorrangig hochdifferenzierte (G1) Leiomyosarkome zur ER-Expression neigen, jedoch insgesamt keine Diskriminierung dieser beiden Entitäten per IHC zu empfehlen ist. Ebenfalls muss in Frage gestellt werden, ob die Möglichkeit besteht, zwischen Leiomyosarkomen des Genitaltrakts sowie deren Metastasen, die sehr häufig ER-positiv sind, und Leiomyosarkomen anderen Ursprungs, die in geringerer Frequenz den Östrogenrezeptor exprimieren sollen 17, 54 , immunhistochemisch zu unterscheiden. 4.1.4 ÖSTROGENREZPTOREXPRESSION BEI GASTROINTESTINALEN .STROMATUMOREN Eine Östrogenrezeptorexpression fand sich hier bei 11 von 56 (19,64%) GISTs. Die zwei bislang durchgeführten Studien, durch Brodsky et al. und Lam et al., mit insgesamt 25 GISTs haben keine Östrogenrezeptorexpression nachgewiesen 71, 78. 4.1.5 ÖSTROGENREZPTOREXPRESSION BEI LIPOSARKOMEN Wir fanden eine Östrogenrezeptorexpression bei 6 von 107 (5,61%) untersuchten Liposarkomen. Die Literatur bezüglich Östrogenrezeptorexpression bei Liposarkomen ist sehr variabel. Chaudhuri et al. untersuchten im Rahmen mehrerer Studien bei einem Kollektiv von insgesamt 41 Liposarkomen die ER-Expression mit der Dextran-coated - 63 - Charcoal-Methode und fanden eine Positivität in 41%, 43% und 60% der Fälle 63, 68, 69 . Weiss et al. wiesen mittels Dextran-coated Charcoal-Methode und Enzyme Immunoassay in 50% von vier Fällen eine Östrogenrezeptorexpression nach . Li et al. zeigten eine ER α - Expression in 50% der 28 analysierten 62 Liposarkome 66. Eine weitere Analyse von sieben Liposarkomen durch Ockner et al. ergab in keinem der Fälle ein positives immunhistochemisches Ergebnis 70. Hier konnte nur in einem kleinen Anteil der Liposarkome (5,61%) eine Östrogenrezeptorexpression per Immunhistochemie dargestellt werden. Bei allen Subentitäten war es möglich, den Östrogenrezeptor immunhistochemisch nachzuweisen. Levine et al. berichteten über die Entwicklung eines pleomorphen Liposarkoms des Uterus unter Tamoxifen-Therapie (nach Mammakarzinom), bei dem immunhistochemisch eine starke ER-Expression nachweisbar war bekannt, dass Tamoxifen in Abhängigkeit von der Dosis 73 30 37 und Wirkort . Es ist 34, 38, 39, 72, als partieller Agonist/ Antagonist wirkt . 4.1.6 ÖSTROGENREZPTOREXPRESSION UND GESCHLECHT Unsere Daten zeigen einen klaren statistischen Zusammenhang zwischen ERExpression und Geschlecht des Patienten. Von insgesamt 24 stark positiven Weichgewebstumoren stammen 23 (96%) von weiblichen Patienten. Es handelt sich sowohl um Neoplasien mit genitaler als auch extragenitalen Lokalisation. Dies lässt annehmen, dass Sarkome auch außerhalb des Genitaltrakts vor allem in östrogenreicher Umgebung den entsprechenden Rezeptor exprimieren. In der Literatur ist wiederholt darüber berichtet worden, dass eine Östrogenrezeptorexpression vor allem mit dem weiblichen Geschlecht assoziiert ist 58, 63, 69. - 64 - 4.1.7 MESENCHYMALE NEOPLASIEN UND ÖSTROGENEINFLUSS Schwangerschaft, Menstruationsstatus und exogene Östrogenzufuhr können das Wachstum mesenchymaler Tumoren beeinflussen 17. Ein Einfluss einer östrogen- und progesteronreichen Umgebung auf mesenchymale Tumoren wurde bereits früh durch Beobachtungen von Schwangerschaft und Menopausenstatus in Beziehung zum Krankheitsverlauf vermutet 79 . Des Weiteren lassen klinische Beobachtungen Zusammenhänge zwischen Prävalenz, Wachstum, Prognose und dem Hormonstatus des Patienten annehmen 62. Darüber hinaus wurde ein Zusammenhang zwischen Zyklusphase und -Frequenz bei Sarkomen im Tierversuch gezeigt 80 . Eine zyklusabhängige Expression des Östrogenrezeptors bei uterinen Sarkomen des Menschen konnte bislang nicht nachgewiesen werden 53. Bei Leiomyomen ist eine Assoziation des Tumorwachstums mit dem Östrogenspiegel bekannt 15, 17, 49, 69 . Dies ist passend zur Beobachtung, dass eine Expression der Östrogenrezeptors bei Leiomyomen nur bei weiblichen Patienten auftrat. Es konnte ein erhöhtes Risiko für das Auftreten von uterinen Leimyosarkomen sowohl bei Einnahme von Östrogenen, wie beispielsweise im Rahmen oraler Kontrazeption, als auch bei endogen erhöhtem Östrogenspiegel durch Adipositas nachgewiesen werden 76. Im Zusammenhang mit dem Östrogenrezeptor ist es daher interessant, den Menopausenstatus der Patientinnen zu betrachten. In der hier vorliegenden Untersuchung konnte Menopausenstatus und kein eindeutiger Zusammenhang Östrogenrezeptorexpression aufgezeigt zwischen werden. Gehäuft ist dieser bei perimenopausalen sowie postmenopausalen Frauen positiv. Verschiedene Publikationen haben bei Sarkomen keinen statistisch signifikanten Zusammenhang von Östrogenrezeptorexpression gezeigt 81, 82. - 65 - Menopausenstatus und 4.1.8 MESENCHYMALE NEOPLASIEN IN ZUSAMMENHANG MIT .HORMONTHERAPIEN Jautkze et al. schilderten den Fall einer Patientin mit Lungenmetastasen eines gut differenzierten uterinen Leiomyosarkoms mit Östrogenrezeptorexpression, welches nach der Menopause regressierte und anschließend unter Hormonersatztherapie (wegen klimakterischen Beschwerden) wieder an Größe zunahm 57. Des Weiteren wurde über ein Spätrezidiv eines immunhistochemisch ERpositiven Rhabdomyosarkoms nach Hormonbehandlung (Östrogen, Progesteron) berichtet, welches sehr wahrscheinlich mit dieser assoziiert ist 83. In der Literatur wurde das Auftreten von uterinen Sarkomen nach TamoxifenBehandlung mehrfach beschrieben. Der dominierende Effekt von Tamoxifen ist unter anderem abhängig vom Verhältnis zwischen zirkulierendem Östrogen und Tamoxifen 22, 84 sowie dem Zielorgan 22, 34, 73. Es wird davon ausgegangen, dass partiell agonistische Effekte von Tamoxifen auf den Uterus überwiegen 34, 38, 39, 72, 73 und dadurch die Kanzerogenese uteriner Sarkome fördern, wahrscheinlich über den Östrogenrezeptor. Mit einer Tamoxifen-Therapie assoziiert sind unter anderem uterine Leiomyosarkome, Liposarkome sowie Stromazell-Sarkome 37-39. 4.1.9 ÖSTROGENREZEPTOREXPRESSION UND PROGNOSE Möglicherweise ist die Expression von Hormonrezeptoren (Östrogen und Progesteron) bei mesenchymalen Tumoren mit einer besseren Prognose assoziiert. In der Literatur wird über uterine Sarkome (insbesondere Leiomyosarkome) berichtet, die bei immunhistochemisch nachweisbarer Hormonrezeptorexpression einen deutlich besseren Verlauf (bezüglich Rezidive und Überlebensrate) zeigten als Tumoren ohne Expression 64, 77, 82 . Andere Studien hingegen konnten dies nicht darstellen 49, 52, 61, 81, 85, wiesen aber zum Teil einen leicht positiven Einfluss bei starker Östrogenrezeptorexpression auf das - 66 - Überleben nach 85. Die Präsenz von zytoplasmatischen Östrogenrezeptorspiegeln bei einigen Entitäten mesenchymaler Neoplasien lässt vermuten, dass diese Tumoren möglicherweise auf hormonelle Therapien ansprechen. 4.2 GENEBENE Es konnten mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung sieben Amplifikationen des ESR1-Gens (6q25.1 23 ), welches den Östrogenrezeptor α kodiert, bei 743 analysierten mesenchymalen Neoplasien von 632 Patienten nachgewiesen werden. Jedoch sind diese in der Mehrzahl nicht mit einer erhöhten Expression des Östrogenrezeptors assoziiert (lediglich 2 von 7 - 28,57%). Möglicherweise spielen Mechanismen, die den Östrogenrezeptor involvieren, bei Mammakarzinomen die wichtigste Rolle bezüglich Tumorentstehung und -progression 27. Es wird vermutet, dass die Amplifikation von ESR1 ein häufiger Mechanismus bei gutartigen proliferativen Brusterkrankungen und eine frühe genetische Alteration bei einem großem Anteil maligner Tumoren der Brust ist 27. Eine ESR1-Amplifikation ist insgesamt selten (1,60%) bei den hier untersuchten mesenchymalen Primärtumoren zu finden und diese ist lediglich in zwei von sieben Fällen mit einer Östrogenrezeptorexpression assoziiert. Das heißt, das Resultat einer ESR1-Amplifikation, eine gesteigerte Expression des Östrogenrezeptors, wie meist bei Mammakarzinomen, liegt nicht vor. Somit ist die Frage aufzuwerfen, zu welchem Zweck eine ESR1-Amplifikation im Weichgewebstumor erfolgt. Insgesamt wurden bislang nur wenige Studien durchgeführt, die das ESR1-Gen bei mesenchymalen Neoplasien untersucht haben und diese fanden vorrangig im Rahmen groß angelegter Suche nach Genveränderungen statt Sowohl Östrogenrezeptorexpression als auch 53, 67, 86, 87 . 6q25 Genkopienzahlveränderungen wurden bei verschiedenen mesenchymalen - 67 - Neoplasien (Leiomyosarkom, Liposarkom) beschrieben 53, 67, 88-92 . Es gab jedoch bisher wenige Studien, die eine Genveränderung und möglicherweise gesteigerte Proteinexpression des ESR1-Gen analysierten 53, 67. Zur molekularen Analyse wurde meist die Methode der vergleichenden genomischen Hybridisierung (CGH) verwendet. Hier liegt die Nachweisgrenze 21, 24 von Amplifikationen bei 10 Mbp . Das 6q25.1-Amplikon ist zumindest beim Mammakarzinom relativ klein, weshalb es selbst bei Verwendung von highresolution-CGH-Arrays schwer identifizierbar ist 27 . Das Amplikon umfasst beim Mammakarzinom 600 kb (RP3-443C3-RP1-130E4), enthält ESR1 sowie eine 100-200 kb aufwärts liegende Region, welche in der Mehrheit der Fälle kein Gen kodiert 27. Rieker et al. wiesen bei 12 von 23 Liposarkomen per CGH eine hohe Frequenz von Amplifikationen im Bereich 6q25 nach 89. Fritz et al. wandten das Verfahren der matrix-CGH an und beschrieben ebenfalls eine Amplifikation im Genabschnitt 6q25 bei 5 von 16 Liposarkomen 93 . Basierend auf diesen beiden Studien war eine deutlich höhere Frequenz von ESR1-Amplifikationen bei Liposarkomen zu erwarten. Verschiedene andere Studien berichten von molekularen Veränderungen im Sinne einer Genkopienzahlvermehrung 53, 90, 91 oder aber auch -verlust 92, 94 bei 6q25. Die cytogenetische Analyse von 46 pleomorphen Weichgewebstumoren durch Mertens et al. (CHAMP Study Group) brachte keinen Hinweis auf Chromosomenaberrationen bei 6q25, lediglich Chromosomenbanden bei 6q21, q27 (Methode Karyotyping) 87 . Ebenso wenig berichteten Mertens et al. (CHAMP Study Group) im Rahmen einer Studie bezüglich prognostisch relevanter Chromosomen Aberrationen bei mesenchymalen Neoplasien über molekulare Anomalien, die 6q betreffen (Methode Karyotyping) 86 . In Fallberichten konnten ebenfalls keine Genveränderungen im Bereich von 6q25 dargestellt werden 88, 95. Li et al. analysierten 120 Weichgewebstumoren - 68 - hinsichtlich des Östrogenrezeptor-Proteins α und β (Immunhistochemie), 16 derer auch bezüglich der mRNA (in-situ-Hybridisierungs-Assay) und 42 dieser Neoplasien in Hinblick auf die ER α und β kodierenden Genabschnitte (Reverse Transcription Polymerase-Ketten-Reaktion) 66 . Hier wurden zehn amplifizierte Neoplasien (unter anderem vier Leiomyosarkome, jeweils ein myxoides MFH, PNET, synoviales Sarkom, Haemangioperizytom) ohne Expression des Östrogenrezeptors gefunden 66 . Bei vier (drei Leiomyosarkome, ein synoviales Sarkom) dieser zehn Fälle wurde ebenfalls eine Analyse der mRNA durchgeführt, die in allen vier Tumoren negativ ausfiel 66 . Dies würde die These stützen, dass bei mesenchymalen Neoplasien zwar Amplifikationen im Bereich der ER α und β kodierenden Genabschnitte auftreten, diese jedoch nicht zwingend mit einer Expression korreliert sind. - 69 - Tabelle 18: Literaturübersicht Genkopienzahlveränderung bei mesenchymalen Neoplasien STUDIE JAHR METHODE FÄLLE KOMMENTAR Sauter et 2007 FISH/ TMA 743 STT - 9,77% Polysomien, al. IHC/ TMA 1,32% Amplifikationen, 0,19% Deletion - keine Korrelation von Genveränderung und ERExpression Wa et al. 2005 array-CGH 2 Leiomyosarkome - 6q25: kein Gewinn oder 95 (extrauterin) Verlust von Genzahlkopien Weng et 2004 CGH, array1 MFH - 6q: Zugewinn, high-levelal. 88 CGH, Amplifikationen 6q21-23 Karyotyping Li et al. 66 2003 RT-PCR, RT-PCR: 42 STT - 69% GenkopienzahlverISH, ISH: 16 STT änderung für ER α, genaue IHC IHC: 120 STT Zahl der Amplifikationen? - keine Übereinstimmung von Amplifikation und ERExpression Fritz et al. 2002 matrix-CGH, 16 Liposarkome - 31% Amplifikationen (5) 93 cDNA microarrays, RQ-PCR Mertens 2002 Karyotyping 460 STT - keine Relevanz von 6q25 et al. 86 Rieker et 2002 CGH 23 Liposarkome - 22%: Zugewinne bei 6q25 (5) al. 89 - 6q23-24: high-levelAmplifikationen Otano2000 CGH 14 Leiomyosarkome - 21% Zugewinne bei 6q25 (3) Joos et al. 90 Zhai et al. 1999 RT-PCR, 14 Leiomyosarkome - PCR und IHC-Ergebnisse 53 IHC 46 Leiomyome kompatibel (Leiomyom, 8 STUMP Leiomyosarkom: Zugewinn) El-Rifai et 1998 CGH 29 Leiomyosarkome - 35% Zugewinne bei 6q22-25 al. 91 (10) Iliszko et 1998 cytogenetic 8 uterine Sarkome - 6q25: kein Zugewinn, al. 92 analysis Deletion Mertens 1998 Karyotyping 46 pleomorphe STT - 6q25: kein Zugewinn et al. 87 - 6q21, q27: Zugewinne Altungoz 1995 Karyotyping 3 Liposarkome - Deletion 6q12-22 et al. 94 (STT: Soft Tissue Tumour, STUMP: smooth muscle tumour of uncertain malignancy) - 70 - Abbildung 33: Literaturübersicht Weichgewebstumoren Genkopienzahlenvermehrung bei 6q25 bei Es ist zu spekulieren, dass Amplifikationen im Bereich des Genabschnittes 6q25 bei mesenchymalen Neoplasien auf andere Gene als ESR1 abzielen. Möglicherweise ist die Amplifikation von ESR1 hier nur Ausdruck einer Amplifikation eines größeren Genabschnittes auf Chromosom 6. So befinden sich beispielsweise das MYB-Onkogen oder auch AAS1 in der Nachbarschaft von ESR1 (beide 6q24). Dies ist anzunehmen, da es selten zu einer gleichzeitigen Expression des Östrogenrezeptors kommt und mesenchymale Tumoren daher keinen Vorteil aus einer ESR1-Amplifikation hinsichtlich ihres Überlebens ziehen. Die bereits oben geschilderten Untersuchungen durch Li et al. an Sarkomen würden für diese Hypothese sprechen 66. Die Hypothese wird gestärkt durch die Tatsache, dass die Amplifikationen nur bei männlichen Patienten auftraten, somit also nicht von einer östrogenreichen Umgebung (wie zum Beispiel beim weiblichen Geschlecht, oraler Kontrazeption) profitieren. Auch der häufige Nachweis von 6q23 Amplifikationen in CGH Studien passen zu dieser Hypothese. Schließlich sind in der CGH nur langchromige Amplifikationen, die viele Gene enthalten, nachweisbar. - 71 - 4.3 THERAPIEANSÄTZE Da es noch nicht möglich ist, eine Tumorzelle wieder in eine normale, gesunde Zelle zu überführen, bestehen therapeutische Alternativen darin, einen malignen Tumor in seinem Wachstum zu hemmen oder ihn zu eliminieren 28. Behandlungsoptionen unterlägen auch einer Kosten-Nutzen-Analyse, die sich an der verbleibenden Lebenserwartung des Patienten, der Art und dem Stadium des Tumors und deren Folgen sowie der Wirksamkeit und Verträglichkeit einer Therapie orientiert 28. Prinzipiell kann man einen soliden Tumor, zum Beispiel ein Sarkom, operativ entfernen, bestrahlen oder mit zytostatischen Medikamenten behandeln 28 . Problematisch sind die erheblichen unerwünschten Nebenwirkungen sowie die geringe Spezifität dieser Therapiemöglichkeiten 28. Bei Neoplasien mit Expression des Östrogenrezeptors, der das Wachstum des Tumors fördert, ist es erstrebenswert, in östrogenvermittelte Mechanismen einzugreifen. Daher wurden selektive Therapien entwickelt. So hat der Nachweis einer erhöhten Expression des Östrogenrezeptors potentiell prädiktive Relevanz, da die Möglichkeit einer gezielten Therapie besteht. Verschiedene Studien haben die Wirksamkeit von selektiven Östrogenrezeptor-Modulatoren (SERM: Tamoxifen 22 , Raloxifen), Downregulatoren (Fulvestrant) sowie Aromatasehemmern (Anastozol, Letrozol, Exemestan) bei Mammakarzinomen 27 als Alternative zur bilateralen Oophorectomie belegt 28. 4.3.1 TAMOXIFEN Tamoxifen bindet konkurrierend mit Östrogen an den Östrogenrezeptor 22, 28. Der antiproliferative Effekt von Tamoxifen kommt in erster Linie über Östrogenrezeptor vermittelte Mechanismen zu Stande 22 . So wird ein östrogeninduziertes Wachstum gebremst, indem die Dauer der Phasen des Zellzyklus beeinflusst wird 84. Tamoxifen führt dosisabhängig auch zur Blockade des Zellzyklus und auf diesem Wege zum dominierenden zytostatischen Effekt - 72 - 84 . Es wurden klare Zusammenhänge zwischen Östrogenrezeptorexpression und Erfolg einer Therapie mit Tamoxifen aufgezeigt, so dass die immunhistologische Bestimmung des Rezeptorstatus heute zur Routine der Diagnostik von Mammakarzinomen gehört. Bei einer Überexpression des Östrogenrezeptors ist eine Behandlung mit Tamoxifen bei 48% - 60% der Patienten Östrogenrezeptornegativität lediglich in 5% - 10%) erfolgreich 36, (bei 96 , was zu einer Verlängerung des rezidivfreien Intervalls, der Lebenszeit nach Rekurrenz sowie der Überlebenszeit insgesamt führt Östrogenrezeptoren korreliert Antiöstrogenrezeptor-Therapie 35, mit 36 . Die Höhe der Expression von dem Ansprechen auf eine 96 . Die Expression des Östrogenrezeptors dient als prädiktiver Faktor, um den Erfolg einer adjuvanten Hormontherapie wie zum Beispiel mit Tamoxifen abzuschätzen 35. Inzwischen wurde gezeigt, dass Patientinnen mit ESR1-Amplifikation und Östrogenrezeptorexpression mehr von einer Therapie mit Tamoxifen hinsichtlich Überlebenszeit profitierten als Patientinnen mit lediglich positivem oder negativem Östrogenrezeptorstatus 27 . Es kann deswegen für das Mammakarzinom angenommen werden, dass insbesondere Tumoren mit ESR1-Amplifikation abhängig sind von Mechanismen, die den Östrogenrezeptor involvieren, im Gegensatz zu nicht amplifizierten Tumoren, die den Östrogenrezeptor neben vielen anderen Wachstumsfaktoren exprimieren. In Annahme dieser Hypothese könnte der Nachweis einer ESR1-Amplifikation bei gleichzeitiger ER-Expression zu einem noch gezielteren und somit erfolgreicheren Einsatz von Hormontherapien wie Tamoxifen führen. Nach Tamoxifen, dem ersten selektivem Östrogenrezeptor-Modulatoren (SERM), wurden weitere Wirkstoffe mit dem therapeutischen Ansatz am Östrogenrezeptor entwickelt wie beispielsweise Raloxifen 34, 73. Darüber hinaus ist es möglich, bei Frauen mit hohem Risiko, ein Mammakarzinom zu entwickeln, einen selektiven Östrogenrezeptor-Modulator präventiv zu geben, was zu einer Senkung der Inzidenz um 50% führt 34. - 73 - 4.3.2. THERAPIEVERSUCHE BEI MESENCHYMALEN NEOPLASIEN In der Literatur ist über Therapieversuche mit Tamoxifen bei uterinen Sarkomen berichtet worden 81, 82. Wade et al. behandelten mit Tamoxifen, Medroxyprogesteronacetat oder einer Kombination und konnten in einem von 28 (3,57%) Fällen (u. a. uterine Leiomyosarkome und Stromazell-Sarkome, 48% der analysierten Tumoren wiesen einen ER-Rezeptor auf) ein Ansprechen eines Leiomyosarkoms erzielen 81 . . Hier konnte kein statistisch signifikanter Erfolg einer adjuvanten Hormontherapie hinsichtlich Überlebenszeit nachgewiesen werden 81. Sutton et al. konnten bei einem von 11 (9,09%) uterinen Sarkomen (darunter ebenfalls Leiomyosarkome und Stromasarkome, bei 55,5% der analysierten Tumoren lag ein positiver ER-Status vor) einen Therapieerfolg mit Tamoxifen bei sowohl beim Primärtumor eines Leiomyosarkoms als auch dessen pulmonalen Lymphknotenmetastasen einer Patientin erzielen 82 . Wie bereits oben erwähnt, hat Tamoxifen einen partiell agonistischen Effekt auf den Uterus, so dass Misserfolge dem geschuldet sein könnten. Es gibt bisher keine Publikation über den Versuch einer AntiöstrogenrezeptorTherapie bei Liposarkomen. Ebenso wenig bei GISTs, da bei dieser Entität bislang keine Expression des Östrogenrezeptors bekannt war, so auch keine gezielte Blockade dessen in Erwägung gezogen wurde. Somit ist die Frage aufzuwerfen, ob eine Bestimmung des Östrogenrezeptorstatus bei einigen mesenchymalen Tumoren (wie Leiomyooder Liposarkomen) mit anschließendem Versuch einer AntiöstrogenrezeptorTherapie eine Behandlungsalternative, insbesondere bei Entitäten mit wenig therapeutischen Optionen und schlechter Prognose, darstellt. - 74 - 4.4 METHODE Aufgrund der teilweise aufgetretenen Diskrepanzen zwischen den hier ermittelten Ergebnissen und denen anderer Studien, soll hier noch einmal kurz auf die verwendete Methode des Tissue Microarrays eingegangen werden. Die Gewebearraytechnik ist heute eine etablierte Methode zur epidemiologischen Untersuchung molekularer Veränderungen in Bezug auf Epidemiologie hinsichtlich diagnostischer, prognostischer und therapeutischer Relevanz 40-42, 97. Sie erlaubt es, ein großes Gewebekollektiv rasch mit allen molekularen Methoden zu analysieren (high-through-put analysis), sowohl auf DNA- (FISH), RNA- (mRNA-ISH) als auch Protein-Ebene (IHC) 40. Seit Beginn der TMA-Technik wurde immer wieder die Frage aufgeworfen, ob trotz der kleinen Gewebestanzen (Durchmesser 0,6 mm) ausreichend repräsentative Aussagen erzielt werden können. Dies wurde Gegenstand mehrerer Studien, die die Repräsentativität verschiedener Tumoren in TMASpots mit Ergebnissen von konventionellen Schnitten verglichen und insgesamt eine hohe Konkordanz belegten 43. Zahlreiche Studien zeigten, dass mittels der TMA-Methode Ergebnisse erzielt werden können, die sich mit Daten aus der Literatur decken 42 . Des Weiteren verglich man Ergebnisse aus TMA-Untersuchungen mit konventionellen histologischen Schnitten in mehr als 20 Studien und konnte meistens eine hohe Konkordanzrate finden 98, 99. Beim Vergleich von Replika-TMA wurde gezeigt, dass die Ergebnisse der einzelnen Spots fast identisch sind 100 . Einige Studien lassen vermuten, dass vor allem bei heterogener Ausprägung eines zu untersuchenden Merkmals die kombinierte Aussage von zwei bis drei Spots repräsentativer ist, jedoch mehr als vier bis fünf Spots diesbezüglich nicht sinnvoll sind 98, 99 . Camp et al. wiesen eine Konkordanz von 95% bei Kombination zweier Spots nach 101 . In Abhängigkeit vom zu untersuchenden Marker kann mit steigender Anzahl der Spots die gleiche Repräsentativität wie bei konventionellen Schnitten erhalten werden 43, 100, 102 . Wobei zu vermuten ist, dass bereits ein Spot alle - 75 - prognostischen Informationen einer Tumorentität wiedergibt, die Entnahme mehrerer Proben zusätzlich die Einteilung des einzelnen Tumors in positiv/ negativ/ heterogen erlaubt 102 . Die Entnahme und Kombination mehrerer Spots aus einem Tumor ist eine Möglichkeit, dem Effekt einer potentiellen Heterogenität entgegenzuwirken 103. Eine Probe mit einem Durchmesser von 0,6mm kann selbstverständlich nicht zwingend alle Informationen eines größeren Tumors aufzeigen, jedoch stellt ein einzelner Spot alle klinisch - pathologischen relevanten Assoziationen mit molekularen Veränderungen dar 41, 42, 102, 104. Abhängig vom Grad der Heterogenität einer Tumorentität besteht die Möglichkeit, dass die absolute Frequenz (Prävalenz) von molekularen Markern mittels der TMA-Technik unterschätzt wird (Wahrscheinlichkeit des Fehlers ist für alle untersuchten Proben gleich), die Darstellung klinisch-pathologischer Korrelationen wird jedoch nicht signifikant beeinflusst 42, 97, 104, 105 sind Weichgewebstumoren relativ homogene Neoplasien . Darüber hinaus 106 . Andererseits spiegelt ein konventioneller Schnitt (0,004 x 10 x 10mm), der momentane „Goldstandard“, auch nur einen kleinen Anteil des Tumors wieder (bspw. 0,05% eines 1cm³ großen Tumors 101) 98, 102. Es wurde dargestellt, Wahrscheinlichkeit steigt, dass die in für Abhängigkeit diesen von der Tumortyp Fallzahl die charakteristischen Amplifikationen zu finden und die potentielle Heterogenität eines Gewebes durch hohe Fallzahlen im TMA kompensiert wird 44, 102, 104. Die Analyse von zentralen und peripheren Regionen eines Tumors ergab bezüglich der Lokalisation der Probe identische Resultate 102. Letztlich muss festgehalten werden, dass die TMA-Methode der epidemiologischen Untersuchung (Angabe relativer Häufigkeiten) dient und nicht der Diagnostik einzelner, individueller Gewebe 41, 42, 44, 104. Prognostische Assoziationen werden sogar besser durch die TMA-Methode wiedergegeben 100 , da man annimmt, dass Zielgene mit therapeutischer Signifikanz relativ gleichmäßig im Tumorgewebe exprimiert sind 42, 100, 102. - 76 - Der Fortschritt im diagnostischen Bereich der Genomanalyse sowie neue Therapieoptionen (wie bspw. ST1571/ Glivec, Rituximab, Transtuzumab/ Herceptin) erfordern eine gezielte Analyse von Tumoren hinsichtlich der Expression bestimmter Zielgene. Um dies mit hoher Geschwindigkeit und in erforderlicher Anzahl zu untersuchen, ist die TMA-Methode ein hervorragend geeignetes Verfahren 42, 43, 103 . Es können bis zu 1000 Gewebeproben in einen einzigen Paraffinblock eingebracht und simultan untersucht werden 40 . So ist es überhaupt erst möglich geworden, sehr große Gewebekollektive 40, 44 zu screenen, die auch seltene Tumoren, wie Weichgewebstumoren, beinhalten 44. Im TMA-Verfahren wird ein hohes Maß an Standardisierung erreicht. Alle Proben eines Schnittes werden mit derselben Methode unter exakt gleichen Bedingungen (bspw. Alter des Objektträgers, Schnittdicke, Fixierung, Färbung, Antikörper, Sonde, Protokoll) untersucht identischen Kriterien interpretiert 44, 102 den untersucherbezogenen Fehler 44, 97, 105 . Die Ergebnisse werden mit , die Auswertung in kurzer Zeit vermindert 104 . Dadurch ist die Reliabilität (innere Konsistenz) der Methode gegeben, die Wahrscheinlichkeit der Verzerrung der Ergebnisse ist geringer 44, 102 . Durch Kontrollgewebe kann die Qualität der Färbungen hinsichtlich Sensitivität und Spezifität verifiziert werden 42, 97. Die TMA-Methode ist zeit-, kosten- und materialeffizient 41, 98 . Die Microarray- Technik ist mehr als 100fach schneller durchführbar als die Untersuchung der Gewebe auf herkömmliche Art und Weise 42. Ein weiterer Vorteil der Methode liegt darin, dass, selbst bei Entnahme mehrerer Stanzen, der Donor-Block nicht zerstört wird und somit Tumorgewebe für eventuell zukünftig anfallende Schnittgröße) zur Verfügung steht 40, 105 Untersuchungen (konventionelle . Dies ist vor allem in Bezug auf seltene Tumorentitäten, wie Weichgewebsneoplasien, interessant 41. - 77 - 5. ZUSAMMENFASSUNG Die Pathogenese von mesenchymalen Neoplasien ist bislang unzureichend verstanden. Sowohl Östrogenrezeptorexpression als auch Amplifikationen im Bereich 6q25 wurden bei verschiedenen mesenchymalen Tumoren beschrieben. Das den Östrogenrezeptor α kodierende Gen ESR1, ist auf 6q25 lokalisiert und wurde bereits bei ER-positiven Mammakarzinomen als amplifiziert nachgewiesen. Insgesamt wurden 743 Weichgewebstumoren von 632 Patienten untersucht. Die Rolle von ESR1-Amplifikationen und deren eventuelle Konsequenz bezüglich einer ER-Expression konnte bei 368 Primärtumoren analysiert werden. Es wurde auf das Verfahren des Tissue-Microarray zurückgegriffen um ein möglichst großes Kollektiv zu untersuchen. Die TMA-Schnitte wurden per Immunhistochemie bezüglich einer ER-Expression sowie per Fluoreszenz-insitu-Hybridisierung in Hinblick auf ESR1-Genkopiezahlenvermehrung untersucht. Eine Östrogenrezeptorexpression konnte bei 62 (13%) der Primärtumoren aufgezeigt werden. Hierbei handelte es sich vorrangig um glattmuskuläre Tumoren - 48% der Leiomyome, 17% der Leiomyosarkome sowie 20% der GIST, aber auch 28% der Haemangioperizytome, 21% der malginen peripheren Nervenscheidentumoren, 6% der Liposarkome und 6% der NOS-Tumoren. Bei weiblichen Patienten lag deutlich häufiger ein positiver ER-Status vor als bei Männern. Eine Amplifikation von ESR1 konnte in 7 Fällen (2% der Primärtumoren) dargestellt werden; diese betrafen 2 Liposarkome, 2 Leiomyosarkome und 3 NOS-Tumoren. In beiden Fällen der Leiomyosarkome konnte eine positive ERExpression nachgewiesen Genkopienzahlvermehrungen werden. bei 11% Darüber der hinaus Liposarkome, konnten 5% der Leiomyosarkome, 50% der Rhabdomyosarkome, 9% der Granularzelltumoren, 6% der malignen Schwannome, 29% der NOS-Tumoren aufgezeigt werden. Es besteht kein signifikanter Zusammenhang zwischen ER-Expression und ESR1Genvermehrung. Wir schlussfolgern, dass erhöhte Level des Östrogenrezeptors bei mesenchymalen Neoplasien nicht durch eine ESR1-Amplifikation verursacht - 78 - werden. ESR1-Amplifikationen treten selten bei Weichgewebstumoren auf und führen nicht zwangsläufig zu einer erhöhten Östrogenrezeptorexpression. Die Amplifikation des Bereichs 6q25.1 scheint anderen Zielgenen zu dienen. - 79 - 6. LITERATURVERZEICHNIS 1. Miettinen M. Diagnostic soft tissue pathology. Philadelphia: Churchill Livingstone; 2003. 2. Enzinger FM, Weiss, S.W., Goldblum J.R. Enzinger and Weiss's Soft Tissue Tumors. 4 ed. St. Louis: Mosby; 2001. 3. Fletcher DM, Unni, K.K., Mertens, F. World Health Organization Calssification of Tumours. Pathology & Genetics Tumours of Soft Tissue and Bone. Lyon (Frankreich): International Agency for Research on Cancer Press; 2002. 4. Fletcher CD. Pleomorphic Malignant Fibrous Histiocytoma: Fact or Fiction? The American Journal of Surgical Pathology 1992;16(3):213-28. 5. Fletcher CDM. 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ABBILDUNGSVERZEICHNIS SEITE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 16 21 23 23 24 24 24 25 25 37 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Funktion des Östrogenrezeptors Schema der TMAs Herstellung des TMAs Stanzgerät und dessen Funktion Übersichtsaufnahme des Stanzgeräts Detailaufnahme des Bohrers Detailaufnahme der Stanze Beispiel eines Tissue Microarrays Gefärbte HE-Schnitte der TMAs IHC Schwach positive Östrogenrezeptorexpression in einem Liposarkom IHC Schwach positive Östrogenrezeptorexpression in einem Liposarkom FISH ESR1-Amplifikation bei einem Liposarkom IHC Primärtumoren und Tumorverhalten FISH Primärtumoren und Tumorverhalten IHC Maligne Primärtumoren und Differenzierungsgrad FISH Maligne Primärtumoren und Differenzierungsgrad IHC Primärtumoren und Geschlecht FISH Primärtumoren und Geschlecht IHC Primärtumoren und Tumorgröße FISH Primärtumoren und Tumorgröße IHC Leiomyom Primärtumoren und Geschlecht IHC Leiomyom Primärtumoren und Lokalisation IHC Leiomyosarcom Primärtumoren und Geschlecht FISH Leiomyosarcom Primärtumoren und Differenzierungsgrad IHC GIST Primärtumoren und Tumorverhalten IHC GIST Primärtumoren und Geschlecht IHC GIST Primärtumoren und Lokalisation IHC GIST Primärtumoren und Tumorgröße FISH Liposarcom Primärtumoren und Subentitäten FISH Liposarcom Primärtumoren und Geschlecht FISH Liposarcom Primärtumoren und Tumorgröße IHC und FISH Literaturübersicht Genkopienzahlvermehrung bei 6q25 bei Weichgewebstumoren - 90 - 37 38 40 41 41 42 43 43 45 46 47 48 49 50 52 53 53 54 55 56 57 58 70 8. TABELLENVERZEICHNIS SEITE 1 13 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Prognose in Abhängigkeit des histologischen Subtyps bei Liposarkomen Übersicht Entitäten der TMAs Definition des Allred-Scores Interpretation des Allred-Scores Definition und Interpretation der FISH-Ergebnisse Übersicht der Gesamttumorpopulation Übersicht Entität, Primarius, Rezidiv und Metastase Übersicht Lokalisation Übersicht Subentität bei Liposarkomen Übersicht der IHC-Ergebnisse bei Primärtumoren Übersicht der FISH-Ergebnisse bei Primärtumoren IHC ER-Expression und Tumorlokalisation FISH Genkopienzahlveränderung und Tumorlokalisation IHC Leiomyom und Tumorlokalisation IHC Leiomyosarcomen und Tumorlokalisation IHC Liposarkom nach verschiedenen Subentitäten FISH Liposarkom nach verschiedenen Subentitäten Literaturübersicht Genkopienzahlveränderung bei mesenchymalen Neoplasien - 91 - 20 29 29 30 32 33 34 34 36 39 44 44 48 50 55 55 69 9. DANKSAGUNG Dr. Alexander Quaas und Dr. Uta Reichelt sowie dem Institut für Pathologie und seinen Mitarbeitern, Marcel Hochreiter Elisa von Friderici und Julia Huber im Besonderen meiner Familie Janka Schmeißer, Nelly Schröder und Rene Beiler - 92 - 10. CURRICULUM VITAE Sylvia Giese 16 Square Alain Fergent 35000 Rennes - France Tel: 0033 6 59556597 [email protected] Geburtsdatum: Geburtsort: Nationalität: Ausbildung 06.11.1982 Potsdam deutsch 11/2008 Beginn der Facharztausbildung Allgemeinmedizin 11/2010 Beginn der Zusatzausbildung Notfallmedizin Faculté de Médecine Université de Rennes Frankreich 2011 Diplôme universitaire „Kindernotfälle“ 2002 – 2008 Studium Medizin Universität Hamburg 10/2008 Staatsexamen Deutschland (Note 1) 06/2008 Staatsexamen Frankreich 1995 – 2002 „Dathe - Oberschule (Gymnasium) Berlin“ Abschluss mit dem Abitur (Note 1,5) 1991 – 1995 „Justus - von - Liebig - Grundschule Berlin“ 1990 – 1991 „Heinrich - Zille - Oberschule Berlin“ 1989 – 1990 „Polytechnische Oberschule Potsdam“ Erfahrung 08/2011 Assistenzärztin Gynäkologie Centre Hospitalier de St. Brieuc 05/2011 Assistenzärztin Kindernotaufnahme Centre Hospitalier de St. Brieuc 11/2010 Assistenzärztin Chirurgische Intensivstation Centre Hospitalier Universitaire de Rennes 05/2010 Assistenzärztin Notaufnahme Centre Hospitalier de Lorient 11/2009 Assistenzärztin Allgemeinarztpraxis Dr. Brujean (Guer) und Dr. Colson (Caro) 05/2009 Assistenzärztin Neurologie Centre Hospitalier Universitaire de Rennes 11/2008 Assistenzärztin Hepatogastroenterologie Centre Hospitalier de Redon 04/2008 PJ Innere Medizin Hôpital Universitaire Strasbourg (Frankreich) und Klinikum Eilbek (Hamburg) 12/2007 PJ Dermatologie Krankenhaus St. Georg (Hamburg) 08/2007 PJ Chirurgie: Kinder- und Viszeralchirurgie Hôpital Universitaire Strasbourg (Frankreich) Sprachkenntnisse Französisch Englisch Italienisch sehr gute Kenntnisse (DELF B2 07/2007) gute Kenntnisse Grundkenntnisse - 93 - 11. ERKLÄRUNG EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des benutzten Werkes kenntlich gemacht habe. Ferner versichere ich, dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an einer anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um Zulassung zur Promotion beworben habe. Rennes, den - 94 -
