Antikörpernachweis (Impftiter)

Labordiagnostik Tollwut
Dr. Eveline Wodak
AGES, Geschäftsfeld Tiergesundheit, IVET Mödling, Abteilung Virologie
Österreich: 5 Jahre Tollwut-frei
Wien, 19.03.2014
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Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH
Labordiagnostik Tollwut
Zusammenfassung:
• Tollwut Situation
• Diagnostik - Material
• Diagnostik - Methoden
• Impfung - Füchse
• Überwachung
• Fallbeispiele
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Tollwut-Rabies-Lyssa
• 7 Genotypen in 2 Gruppen
-
Genotyp 1: Rabiesvirus (RABV). Dieses Virus ist das klassische Tollwutvirus.
Genotyp 2: Lagos-Fledermausvirus = Lagos bat virus (LBV)
Genotyp 3: Mokola-Virus (MOKV)
Genotyp 4: Duvenhage-Virus (DUVV)
Genotypen 5 und 6: Europäisches Fledermaus-Lyssavirus = European bat lyssavirus (EBLV 1, 2)
Genotyp 7: Australisches Fledermaus-Lyssavirus = Australian bat lyssavirus (ABLV)
• Lyssa Gruppe 1: Genotyp 1/4/5/6/7
• Lyssa Gruppe 2: Genotyp 2/3
• Außer beim Genotyp 2 sind bei allen oben
aufgezählten Genotypen Tollwutfälle beim
Menschen beschrieben.
• Je nach Genotyp unterschiedliche
Zellkulturlinien
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Foto: Dr. Susanne Richter
Tollwut – Reservoir Mitteleuropa
Foto: Dr. Armin Deutz
• Füchse (silvatische Wut)
• Fledermäuse
Foto: Dr. Armin Deutz
• Marderhund
• Stinktier
• Hund (urbane Wut)
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de.wikipedia.org
Tollwut Wild- u. Haustier
Europa 2013
www.who-rabies-bulletin.org/Queries/Maps.aspx
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Fledermaus Tollwut
Europa 2013
www.who-rabies-bulletin.org/Queries/Maps.aspx
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Tollwut Diagnostik
• klinische Anzeichen einer Enzephalitis oder Myelitis gibt es bei vielen
nervalen Erkrankungen
• Diagnose der Tollwut allein durch Laboruntersuchungen möglich
• Die ante mortem Diagnose der Tollwut beim Menschen ist schwierig.
- Mehrere Untersuchungsverfahren empfehlenswert
• In Österreich werden derartige Laboruntersuchungen am nationalen
Referenzlabor für Tollwut im Institut für veterinärmedizinischen
Untersuchungen Mödling der Österreichischen Agentur für Gesundheit
und Ernährungssicherheit GmbH (AGES), Geschäftsfeld Tiergesundheit,
durchgeführt.
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Tollwut
NRL (Nationales Referenzlabor)
• Ernennung durch Bundesministerium auf Grundlage
gemeinschaftlicher und nationaler Rechtsvorschriften
• Hoher Qualitätsstandard durch Akkreditierung (EN ISO
17025)
• Laufende Ringtests (AG, AK) durch EU-Referenzlabor
• Zusammenarbeit mit CRL und OIE
• Ansprechpartner: Abt. Pathologie: Dr. Elisabeth Vanek
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Probenmaterial
• Natives Untersuchungsmaterial (keine Formalinfixierung!) sollte
gekühlt oder bei Raumtemperatur transportiert werden.
• Antigennachweis:
- Gehirn
- Speichel, Nackenhautbioptat, Konjunktivalabstrich,
Rachenabstrich
- Liquor cerebrospinalis
- Nach Möglichkeit mehrere Proben
- Nur der positive Nachweis ist aussagekräftig!!
• Antikörpernachweis (Impftiter):
- Serum
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Untersuchungsmethoden
• Antigennachweis:
• Fluorescent Antibody Test (FAT) - Gehirnabklatsch
• Zellkulturtest (rabies tissue culture inoculation test; RTCIT)
• Real-Time RT-PCR, RT-PCR, Sequenzierung und Phylogenie
• Immunhistologie
• (Histologie: Nachweis von Negri Körperchen im Zytoplasma von Neuronen
(geringe Sensitivität))
• (Tierversuch mit Baby-Mäusen (mouse inoculation test; MIT)) – nicht Routine!
• Antikörpernachweis (Impftiter):
• Fluorescent Antibody Virusneutralisationtest (FAVNT)
• Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
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Virusnachweis- FAT
Fluorescent Antibody Test (FAT)
WHO und OIE Goldstandard
sensitiv, spezifisch, billig
• Abklatschproben
• Zellkultur
• Gewebeproben
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Foto: Dr. Z. Bago
Tollwut: Abklatschprobe vom
Gehirn
Gehirn: in Routinefall Stammhirn und Ammonshorn
Foto: Dr. Z. Bago
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Virusnachweis-Immunhistochemie
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Dr. Z. Bago
Foto: Dr. Z. Bago
Virusnachweis-Histologie
• Nachweis von Negri Körperchen im Zytoplasma
von Neuronen (geringe Sensitivität)
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Virusnachweis-RTCIT
Rabies Tissue Culture Inoculation Test (RTCIT)
Virusanzucht in der Zellkultur
• OIE Methode für Proben von
Tieren die einen Menschen
gebissen haben
• Virusisolierung von FAT
positiven Proben
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Peter Kalaus
Virusnachweis- FAT in Zellkultur
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Foto: Peter Kalaus
Virusnachweis- FAT in Zellkultur
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Virusnachweis- FAT in Zellkultur
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Foto: Peter Kalaus
Virusnachweis-RT-PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR)
• Ante mortem Diagnose
• Klassifikation von Isolaten
in Kombination mit RTICT
Tollwut Virus RT-PCR Nachweis in
menschlicher Hautbiopsie und
Rachentupfer
• Schnelles Nachweisverfahren
• Nicht als Einzeldiagnostik empfohlen
Dr. S. Revilla-Fernandez
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Peter Kalaus
Virusnachweis-RT-PCR
• 1) Screening mit 3 Real-Time RT-PCRs: GT1, GT5 und GT6
(Nukleokapsidprotein)
• 2) (nicht in der Routine) ABLV-GT7 Real-Time RT-PCR
• 3) Bestätigung mit 3 konv. Pan-Tollwut nested RT-PCRs (NP):
-hemin. RT-PCR nach Heaton (1F, 6R)
-n.RT-PCR mit EBLV- Primer nach Echevarria (3F, 3R)
-n.RT-PCR nach Vazquez-Morón (2F, 2R)
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Antikörpernachweis-FAVNT
Fluoreszenz Antikörper Virusneutralisationstests (FAVNT)
• Zur Ermittlung des Immunstatus
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Foto: Peter Kalaus
Serumneutralisationstest-Prinzip
• Verdünnungsreihe von Test-Seren
• Zugabe von bekannter Menge Tollwut Virus
• Erste Inkubation = Neutralisationsphase
• Zugabe von bestimmter Menge an virusempfänglichen
Zellen
• Zweite Inkubation = Zellwachstumsphase
• Bei zytopathischem Effekt – Zellzerstörung oder
Immunfluoreszenz-Färbung der Viren
• Ablesung (wenn Ak- kein Virus- keine IF;
wenn keine AK -Virus vermehrt sich, wird sichtbargemacht)
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Antikörpernachweis-FAVNT
Ablesung:
• WHO legte 1985 fest: 0,5 IU (international Units)/ml ist
die mindeste Antikörpermenge für einen Infektionsschutz
• WHO Standard Serum von Mensch als Referenz
• gilt für Mensch und Tier (Hund, Katze,…)
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Virusnachweis-ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
• Nützlich für große epidemiologische Untersuchungen
• In Kombination mit anderen Untersuchungsmethoden
Nicht zugelassen für
Impftiterkontrollen
Eingesetzt für
Impfkontrolle bei der
Fuchsimpfung->
ja/nein Aussage
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Foto: Peter Kalaus
Tollwut Impfgebiete Fuchs 2012
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Fuchs Tollwutuntersuchung
Foto:
Dr. Z. Bago
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Fuchs Tollwutuntersuchung
Foto: Dr. Z. Bago
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Tollwut Fuchs-Impfung
Köder mit attenuiertem Lebendimpfstoff
Köderaufnahme wird überprüft mittels
Fluoreszenz von Tetrazyklinen im Knochen
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Foto: Dr. Z. Bago
Foto: Dr. Z. Bago
Tollwut Überwachung, Impfung
• 1986 – 1991: Bundesländerprogramme (außer Wien und
NÖ)
• Ab 1991: BGBl II Nr. 358/1991; bundeseinheitliche
Koordination
• Seit 1992: Umstellung auf Flugzeugauslage der Impfköder
• 2003: letzter Tollwutfall in Österreich
• 2008: Offizielle Erklärung der Tollwutfreiheit
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Tollwut Überwachung, Impfung
Seit 2013:
• keine ORV (orale Vakzinierung der Füchse)
mehr
• Monitoring von Verdachts- und
Indikatortieren:
Füchse, Dachse, Marderhunde, Waschbären, tot
aufgefunden im Straßenverkehr, tot gefunden
oder verhaltensauffällig getötet
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Tollwut-Untersuchungen
Anzahl der FAT-Untersuchungen von Tieren
zwischen 1999 – 2013 am IVET MOE
Jahr
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
Anzahl der Untersuchungen Tollwutfälle
23.366
5
22.661
2
19.597
1
14.120
24
11.598
1
10.087
2 (1 Mensch)
10.087
0
8.241
1
9.297
0
9.478
0
8.837
0
2.620
0
2.642
0
3.043
0
597
0
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Positiv getestete Tiere zwischen 1985 und
2011
Tollwut Fuchsimpfung Kosten
• 1991 bis 2011: € 16 Millionen
• Kofinanzierung: € 3 Millionen
• Kostenaufteilung 2011:
• Kosten pro Fuchs 2013: 54,26€
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Tollwut Fuchs Impfvirus-Nachweis
2 Füchse (Juni 2004 und August 2006):
- Gehirnprobe RT-PCR positiv (IF-positiv)
- Aufnahme vom Impfvirus (attenuierte Lebendvakzine)
-
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Virus 99.9% ident zum verwendeten Impfstamm
Tollwut Fallbericht
Infektion bei einem Mensch (Graz, Sept. 2004)
- Infektion nach einem Hundebiss in Marocco
- Hautbiopsie und Rachentupfer positiv in RT-PCR
-
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Virus 97% ident zu Viren aus Nordafrika (Agadir)
Tollwut
Therapie: keine möglich!
Prophylaxe:
• Schutzimpfung! – Mensch und Haustier
• Fuchsimpfungen
• (Reduktion der Fuchspopulation)
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Danksagung
AGES:
Abteilung Pathologie: Dr. Zoltán Bagó, Dr. Elisabeth Vanek, Dr. Hubert
Weinberger
Abteilung Molekularbiologie: Dr. Sandra Revilla-Fernández, Dr. Adolf
Steinrigl, Dr. Maria Fink
Abteilung Elektronenmikroskopie und Virologie: Dr. Susanne Richter
Labormitarbeitern
Geschäftsfeldleiter Tiergesundheit und Institutsleiter IVET MOE
Prof. Dr. Friedrich Schmoll
BMG:
Dr. Ulrich Herzog, CVO
Dr. Elisabeth Marsch
Dr. Andrea Höflechner-Pölt
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Danke für die Tollwutfreiheit
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Foto: Dr. Armin Deutz
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