Mit der Geniom-Microarray-Technologie HPV

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MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
On-Chip-Virustyping
Mit der Geniom-Microarray-Technologie
HPV-Genotypen auf der Spur
JULIA SCHLIWKA 1 , JANNE PULLAT 2 , ETHEL -MICHELE DEVILLIERS 2 ,
JÖRG D. HOHEISEL 2 , MARKUS BEIER 1
1 FEBIT BIOTECH GMBH, HEIDELBERG
2 FUNKTIONELLE GENOMANALYSE, DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM,
HEIDELBERG
Gebärmutterhalskrebs, das so genannte Zervixkarzinom, ist in 99,7 % der
Fälle mit einer Infektion durch humane Papillomviren (HPV) assoziiert[1].
Diese gilt als wichtigster Faktor für die Entstehung des Zervixkarzinoms,
das heutzutage weltweit die zweithäufigste Krebserkrankung der Frau
darstellt. Aufgrund der großen Anzahl verschiedener HPV-Typen und der
variablen Kombinationsmöglichkeiten verschiedenster Genotypen bei
multiplen Infektionen, besteht ein dringender Bedarf für effiziente und
sensible Nachweismethoden in der klinischen Diagnostik.
ó Mithilfe der Geniom-Technologie will sich
das Deutsche Krebsforschungszentrum in
Heidelberg der Herausforderung stellen: Mit
HPV-spezifischen Geniom-Microarrays können die jeweiligen Virus-Genotypen für eine
frühzeitige Klassifizierung der beteiligten
Viren bestimmt werden. Durch den Einsatz
100
100% 100% 100%
95,5%
solcher HPV-Chips ist eine rasche Diagnose
und damit optimierte Behandlung von Patienten mit HPV-induzierten Tumoren möglich.
Die humanen Papillomviren bilden eine
Gruppe von DNA-Viren, von denen mittlerweile mehr als 100 verschiedene Typen
bekannt sind. Die HPV sind doppelsträngige
100%
94,5%
90,5%
90
80
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HPV type
˚ Abb. 1: Analyse gemischter HPV-Proben mit Geniom-Chips. Spezifischer Nachweis der vorhandenen HPV-Typen. Analyse von Pool I mit HPV 1, 2, 3, 4, 6, 38 und 75. Kontroll-Pool II mit HPV 8,
11, 16, 18, 53, 63, und 80 ist nicht nachweisbar. Die Werte gehen nicht über ein Hintergrundsignal
hinaus. Es wurden 15 Sonden pro HPV-Typ verwendet, jeweils ein Gemisch aus 18, 20 und 22-mer
Oligonukleotiden.
DNA-Viren (dsDNA-Viren) und gehören zur
Familie der Papillomviren. Sie befallen
Schleimhäute und Epithelzellen der Haut und
können ein unkontrolliertes, tumorartiges
Wachstum hervorrufen[2]. Die Tumore sind
meist gutartig und führen zur Warzenbildung
am Ort der Infektion. Es ist jedoch klar dokumentiert, dass einige HPV-Typen Gebärmutterhalskrebs, das Zervixkarzinom, hervorrufen[3]. Andere sind mit dem Auftreten weiterer Tumorformen assoziiert.
HPV-Typen lassen sich generell in zwei
Gruppen einteilen: Die Niedrigrisiko- und
Hochrisiko-Typen[4]..Die Hochrisiko-Typen
wurden bei über 99,7 % aller Fälle von Zervixkarzinomen identifiziert. Die Mehrheit der
Zervixkarzinome (ca. 70 %) wird durch die
Hochrisiko-Typen 16 und 18 hervorgerufen,
gefolgt von den Genotypen 31 und 33. Die
Niedrigrisiko-Typen sind selten allein an der
Entwicklung eines Zervixkarzinoms beteiligt,
können jedoch bei multiplen HPV-Infektionen (Infektionen mit mehr als einem HPVGenotyp) nachgewiesen werden.
Die Tatsache, dass in nahezu allen Tumoren
des Gebärmutterhalses Hochrisiko-HPVTypen vorkommen (HPV 16 zu 50 %, HPV 18
zu 20 %), unterstreicht die Bedeutung der
Virusinfektion für diese Tumorart, welche
weltweit die zweithäufigste Krebserkrankung
und dritthäufigste Krebstodesursache bei
Frauen ist. Die große Anzahl verschiedener
HPV-Typen und die variablen Kombinationsmöglichkeiten verschiedenster Genotypen bei
multiplen Infektionen erfordern effiziente
und sensible Nachweismethoden für die klinische Diagnostik. Dabei ist ein molekulares
Diagnoseverfahren gefragt, das eine generelle HPV-Detektion in der gegebenen Patientenprobe mit einer präzisen Genotypisierung
der vorliegenden Virustypen kombiniert.
In einer Zusammenarbeit zwischen dem
Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ)
in Heidelberg und der febit biomed GmbH
wurde ein microarraybasiertes Diagnoseverfahren entwickelt, das HPV-Infektionen
schnell und sicher nachweist, sowie eine eindeutige Zuordnung der vorhandenen GenoBIOspektrum | 01.07 | 13. Jahrgang
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HPV6
HP V 80
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HP V 75
HP V 74
HP V 53
HP V 38
HP V 18
HPV74
HP V 16
HP V 11
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HP V 4
HP V 3
HP V 2
HP V 1
HPV11
HP V 63
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2
0
˚ Abb. 2: Virus-Genotyping mit Geniom-Microarrays. Sogar stark homologe HPV-Typen werden eindeutig unterschieden. Es finden keine Kreuzhybridisierungen statt.
typen ermöglicht. Ziel war es, einen spezifischen Biochip zu generieren, der die simultane Detektion von Infektionen mit jedem bislang sequenzierten HPV-Typ erlaubt. Dabei
sollte eine leichte Handhabung, hohe Reproduzierbarkeit und Sensitivität gewährleistet,
sowie eine Automatisierung und hoher Probendurchsatz möglich sein. Die flexible
Geniom-Microarray-Plattform der febit biomed GmbH vereint die Optimierung von
Design, Produktion und Analyse individueller
Microarrays in einem Gerät[5, 6].
Im Falle der HPV-Genotypisierung konnten neueste Sequenzinformationen über HPVTypen herangezogen und unmittelbar für den
Entwurf der entsprechenden Oligonukleotide verwendet, sowie die Sonden aufgrund
erster Ergebnisse neu kombiniert und optimiert werden. Die Genome von Papillomviren sind etwa 8 kb groß und enthalten sechs
frühe (early; E1 – E7) und zwei späte (late;
L1 und L2) Gene. Da der L1-ORF (open
reading frame, ORF) der am meisten konservierte ORF ist, erfolgen formale Klassifizierungen standardisiert durch Analysen dieser
Sequenz-Region des HPV-Genoms. Für jeden
HPV-Typ wurden spezifische Oligonukleotide entworfen und diese, mit dem Ziel einer
gesteigerten Spezifität, experimentell optimiert. Die Flexibilität der Geniom-Plattform
ermöglichte die direkte Umsetzung erzielter
Ergebnisse in optimierende Maßnahmen wie
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Änderungen der Sondensequenzen in ihren
Längen oder Zusammenstellungen. Somit
konnte zeiteffizient ein Biochip entwickelt
werden, der für die parallele Analyse gemischter HPV-Proben herangezogen wurde. Mit 15
Sonden unterschiedlicher Länge und Spezifität pro HPV-Typ, konnten Gemische aus verschiedenen Virus-Genotypen analysiert, und
die einzelnen Virustypen eindeutig nachgewiesen und bestimmt werden (Abb. 1). Für
den Einsatz als molekulares Diagnostik-Werkzeug bedeutet dies eine Sensitivität und Präzision, die es erlaubt, selbst bei multiplen
Virusinfektionen jeden einzelnen Virustyp
zu identifizieren und klassifizieren, und
damit eine sofortige Zuordnung der beteiligten Viren zur Niedrigrisiko- bzw. HochrisikoGruppe vorzunehmen. Der rasche, praktikable und sichere Nachweis in der Routinediagnostik ist besonders wichtig im Hinblick
auf die Prävention von HPV-induzierten Zervixkarzinomen. Ein routinemäßiges VirusScreening ermöglicht bei Patienten mit auffälligen Befunden eine frühzeitige und gezieltere Behandlung, sodass eine eventuell drohende Entartung befallenen Gewebes verhindert werden kann. Die Spezifität der
Geniom-Microarrays wird bei der Analyse
stark homologer Virustypen deutlich (Abb. 2).
Der Nachweis eines einzelnen spezifischen
Virus in einem Virus-Gemisch erfolgt hochspezifisch, und es finden keine Kreuzhybri-
disierungen mit Sonden statt, die spezifisch
für andere, homologe Virustypen sind. Das
DKFZ nutzt die Vorteile der Geniom-Technologie, um HPV-Chips für den routinemäßigen
Einsatz in der molekularen Diagnostik
zugänglich zu machen[7].
ó
Literatur
[1] Walboomers, J. M., Jacobs, M. V., Manos, M. M., Bosch, F.
X., Kummer, J. A., Shah, K. V., Snijders, P. J., Peto, J., Meijer,
C. J., Munoz, N. (1999): Human papillomavirus is a necessary
cause of invasive cervical cancer worldwide. J. Pathol. 189(1):
12–19.
[2] Galloway, D. A., McDougall, J. K. (1989): Human papillomaviruses and carcinomas. Adv. Virus Res. 37: 125–171.
[3] zur Hausen, H. (2002): Papillomaviruses and cancer: from
basic studies to clinical application. Nat. Rev. Cancer. 2(5):
342–350.
[4] zur Hausen, H. (1986): Intracellular surveillance of persisting viral infections. Human genital cancer results from deficient cellular control of papillomavirus gene expression.
Lancet. 2(8505): 489–491.
[6] Mund, C., Beier, V., Bewerunge, P., Dahms, M., Lyko, F.,
Hoheisel, J. (2005): Array-based analysis of genomic DNA
methylation patterns of the tumour suppressor gene p16INK4A
promoter in colon carcinoma cell lines. Nucleic Acids Res. 33
(8): e73.
[7] Pullat et al., zur Veröffentlichung eingereicht
Korrespondenzadresse:
Dr. Julia Schliwka
febit biotech GmbH
Im Neuenheimer Feld 519
D-69120 Heidelberg
Tel.: 06221-6510-300
Fax: 06221-6510-329
[email protected]
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