Die effiziente Transkription des viralen EBER 2-RNA

5. Zusammenfassung
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5. Zusammenfassung
Die Transkriptionsregulation des EBER 2-RNA-Gens wurde in vitro und in vivo
untersucht. Punktmutationen, die allerdings kein Promotorelement des Gens betrafen,
führten zu
einer stark
reduzierten Transkriptionseffizienz
und
konnten
durch
kompensatorische Mutationen im gegenüberliegenden RNA-Strang wieder ausgeglichen
werden.
Deletionsmutanten
des
EBER 2-Gens
zeigten,
daß
neben
den
genexternen
Promotoranteilen der interne Bereich bis +80 Promotorelemente enthält. Chimäre
Konstrukte aus der 5’-Hälfte der EBER 2-Sequenz bis zur Position +80 und den letzten
60 Nukleotiden der humanen 7S K-Sequenz, die einschließlich des Terminationssignals
eine 3’-terminale RNA stem-loop Struktur ausbilden, wiesen eine stark verringerte
Transkriptionsaktivität in vitro und in vivo auf. Die Zerstörung des 3’-terminalen 7S KRNA-Stamms führte jedoch wieder zu einer Verbesserung der Transkriptionsleistung
in vitro. Wurde zusätzlich auch noch die Komplementarität zwischen der 7S K-Sequenz
direkt vor dem Terminationssignal und dem 5’-Ende der EBER 2-RNA hergestellt,
bewirkte dieses einen großen Anstieg der Transkriptionsaktivität in vivo und in vitro. Ein
ähnlicher Anstieg der Transkriptionsaktivität konnte durch das Einfügen einer
Rückfaltungssequenz für das 5’-Ende der EBER 2-RNA direkt vor dem 3’K-Stamm
erreicht werden. Wurden diese beiden resultierenden Stämme jedoch durch ein
Sequenzelement getrennt, wurde das vormals aktive Konstrukt wieder fast vollständig
inhibiert. Stabilitätskinetiken zeigten darüber hinaus, daß geänderte Transkriptstabilitäten
die beobachteten Transkriptionseffekte nicht erklären können. Insgesamt wiesen alle
Beobachtungen auf die Bedeutung einer direkten räumlichen Nachbarschaft des 5’- und
des 3’-Endes der RNA für eine effiziente Transkription durch die RNA Polymerase III hin.
Dazu passend lieferten kinetische Untersuchungen der in vitro Transkription von Wildtyp
und Mutante Hinweise darauf, daß die synthetisierte RNA bei der Reinitiationsreaktion
eine Rolle spielt. Aufbauend darauf wurde ein Modell entwickelt, wie ein solcher
Transkriptionsmechanismus aussehen könnte.