3. Biochemisches Institut der Medizinischen Fakultät

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3. Biochemisches Institut der Medizinischen Fakultät
Geschäftsf. Vorstand: Prof. Dr. med. Dipl.-Biochem. R. SCHAUER
Im Berichtszeitraum wurden die hier beschriebenen Forschungsgebiete bearbeitet.
Es wurden 11 Diplome, 13 Dissertationen und 2 Habilitationen abgeschlossen. Eine
Liste dieser Arbeiten sowie weitere Informationen sind unter der Internetadresse
des Instituts zu finden: http://www.uni-kiel.de/Biochemie/home.html
3.1
Abteilung GIESELMANN
3.1.1
Untersuchung zur Pathogenese und Therapie der metachromatischen Leukodystrophie
Die metachromatische Leukodystrophie ist eine lysosomale Speichererkrankung, die
durch die Defizienz der Arylsulfatase A hervorgerufen wird (78). Durch die Defizienz
dieses Enzyms kommt es zur Speicherung eines Lipides, wobei die Speicherung
insbesondere Zellen des ZNS betrifft (12). Bei den betroffenen Patienten kommt es zu
einer progredienten Demyelinisierung, die zu einer Vielzahl von neurologischen
Symptomen führt, an denen die Patienten letztenendes versterben. Der Zusammenhang
zwischen der Lipidspeicherung und dem Untergang der Oligodendrocyten im Nervensystem ist nicht bekannt. Es wurden weitere Untersuchungen zur Charakterisierung
von Mutationen im ASA-Gen, die zur MLD führen, untersucht (2, 12, 18, 78). Der
experimentelle Zugang, um Fragen nach dem Zusammenhang zwischen Lipidspeicherung und Demyelinisierung zu beantworten, war schwierig, da die Erkrankung ausschließlich beim Menschen beschrieben ist und es kein natürlich vorkommendes
Tiermodell gibt. Wir haben daher mit Hilfe molekularbiologischer Methoden eine
Arylsulfatase-A-defiziente Maus konstruiert, um so ein Tiermodell der metachromatischen Leukodystrophie zu erzeugen (19). Von diesen Tieren wurden anschließend
Zellinien verschiedener Zelltypen des ZNS erzeugt, und es soll versucht werden, den
Einfluß der Lipidspeicherung auf den Stoffwechsel der Zellen zu untersuchen. Zum
gegenwärtigen Zeitpunkt läßt sich festhalten, dass diese Zellen in der Kultur die
Lipidspeicherung sehr gut vertragen. Überlebensfähigkeit und Teilungsrate dieser
Zelltypen wird selbst bei zusätzlicher Belastung mit Lipid nicht beeinflußt. Man kann
bei diesen Zellen mit Hilfe von Ceramid Apoptose induzieren. Diese ceramidinduzierbare Apoptose wird durch die Lipidspeicherung nahezu vollständig gehemmt. Die
Mechanismen, die dazu führen, sind im Moment unbekannt und zur Zeit Gegenstand
des Projektes. Desweiteren versuchen wir, den Krankheitsverlauf bei den ASAdefizienten Tieren durch Transplantation von retroviral transduziertem Knochenmark
positiv zu beeinflussen (36, 55).
Projektleiter: Prof. Dr. med. V. Gieselmann
Mitarbeiter: Dipl.-Biol. M. Habetha, Dipl.-Biol. F. Schestag, Dr. rer. nat. U.
Matzner
Projektdauer: 1995-2001
Förderung: DFG, BMFT
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3.1.2
Isolierung von RNA-bindenden Proteinen aus Zellen der Spermatogenese
Bei der Reifung von Zellen in der Keimbahn ist es ein in der Natur von Pflanzen bis
zum Menschen weitverbreitetes Phänomen, dass eine Reihe von messenger-RNA‘s in
Frühphasen der Keimzelldifferenzierung gebildet werden, dann aber nicht unmittelbar
translatiert sondern in Form von Ribonucleinpartikeln gespeichert werden. Auf diese
früh synthetisierten aber gespeicherten messenger-RNA‘s wird dann in späteren
Phasen auf die Keimbahndifferenzierung zurückgegriffen. Viele messenger- RNA‘s
unterliegen somit einer translationalen Kontrolle. Dies gilt auch für die mRNA der
Arylsulfatase A, die in großen Mengen in Spermatocyten gebildet wird, dann aber
nicht translatiert wird und wahrscheinlich erst in den späten Spermatidenstadien der
Spermatogenese translatiert wird. Wir konnten zeigen, dass an die 5'- und 3'-untranslatierten Regionen der Arylsulfatase-messenger-RNA ein nur in Extrakten des Hodens
vorkommendes RNA-bindendes Protein bindet. Das Projekt fußt auf der Hypothese,
dass dieses Protein auch in vivo an die Arylsulfatase-Messenger-RNA bindet und
durch diese Bindung die Assoziation der messenger-RNA an die Ribosomen, und
damit deren Translation, verhindert. Die Bindungsregion dieses Proteins auf der
Arylsulfatase-messenger-RNA konnte bis auf wenige Nucleotide eingegrenzt werden
und eine Oktanucleotidsequenz als notwendig aber nicht ausreichend für die Proteinbindung identifiziert werden. Wir versuchen ferner seit längerer Zeit, dieses Protein
durch konventionelle Methoden aus Bullenhodenextrakten aufzureinigen. Diese Reinigungsschritte umfassen eine Reihe von konventionellen Proteinreinigungsverfahren
und haben jetzt zu einer Fraktion geführt, in der bis auf geringe Kontaminationen nur
noch ein 37-kDa-Protein vorhanden ist. Wir versuchen im Moment zu zeigen, dass
dieses 37-kDa-Protein tatsächlich für die RNA-Bindung verantwortlich ist.
Projektleiter:
Mitarbeiter:
Projektdauer:
Förderung:
3.1.3
Prof. Dr. med. V. Gieselmann
Dr. rer. nat . A. Polten (ausgeschieden), Dipl.-Biol. F. Dietz
1997-2000
DFG
Struktur der Arylsulfatase A und Charakterisierung funktionell wichtiger
Domänen
Wir konnten die Arylsulfatase A durch Expression in eukaryonten Zellen in großer
Menge erzeugen und bis zur Homogenität aufreinigen. Es ist uns gelungen, ASAKristalle zu erzeugen, und wir haben diese in Zusammenarbeit mit dem Institut für
Kristallographie der FU Berlin (Prof. Saenger) durch Röntgenstrukturanalysen untersucht. Es ist gelungen, die dreidimensionale Struktur der ASA aufzuklären (37).
Mit Hilfe monoklonaler Antikörper in Verbindung mit den Daten zur dreidimensionalen Struktur konnten wir ferner Bereiche auf der Oberfläche des Enzymes identifizieren, die für die korrekte Sortierung in die Lysosomen wichtig sind (54).
Projektleiter: Prof. Dr. med. V. Gieselmann
Mitarbeiter: Dr. rer. nat. A. Schierau (ausgeschieden)
Projektdauer: abgeschlossen
Kooperation: Prof. Saenger, Berlin
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3.2
Abteilung HAVSTEEN
3.2.1
Zellregulation
3.2.1.1 Struktur und Funktion von Enzymen
3.2.1.1.1Kinetik komplizierter Enzymsysteme
Die Entwicklung der Biochemie fordert die Analyse von Enzymsystemen, deren
Komplexität so hoch ist, daß die mathematische Kompetenz mancher experimentell
arbeitender Biochemiker nicht ausreicht. Wir haben deshalb in langjähriger Zusammenarbeit mit den Arbeitsgruppen von Dr. R. Váron-Castellanos, Albacete, und
Prof. Dr. S. Szedlacsek, Bukarest, wichtige Enzymsysteme ausgewählt, für die die
veröffentlichten Daten bislang nicht optimal ausgewertet werden konnten. Neue
Methoden zur Analyse solcher Daten wurden entwickelt und an experimentellen
Datensätzen überprüft. In manchen Fällen konnte die neue Datenauswertungsmethode
in der Form eines Computerprogramms angeboten werden. In der Berichtsperiode
wurden mit der Gruppe in Albacete insbesondere Systeme, die instabile Reaktanten
oder Suizidsubstrate enthalten, bearbeitet (7-9, 68), während sich die Arbeit mit der
Gruppe in Bukarest auf die zeitabhängige Regulation von Stoffwechselsystemen durch
externe Effektoren konzentrierte (63).
Projektleiter: Prof. Dr. rer. nat. B. Havsteen, Dr. R. Váron-Castellanos, Prof. Dr.
rer. nat. S. Szedlacsek
Mitarbeiter: Dr. C. Garrido-del Solo, Dr. F. García-Cánovas, Dr. M. GarcíaMoreno, Dr. M. García, Dr. J. Vidal de Labra, Dr. J. Tudela, Dr.
A.R. Aricescu
Projektdauer: noch zwei Jahre
Förderung: A. v. Humboldt-Stiftung, Comisión Interministerial de Ciencia y
Tecnología (Spanien)
3.2.1.2 Das Toxin-bindende Serumprotein der chinesischen Cobraschlange
(CSAP)
Obwohl nur wenige Proteine so gründlich untersucht worden sind wie Serumalbumin,
haben wir in diesem Protein, das früh in der Evolution entwickelt wurde, eine neue
biologische Funktion gefunden: Die Fähigkeit des Cobra-Serumalbumins (CSA)
lethale, endogene Toxine spezifisch zu binden und zu entgiften. Die strukturelle
Grundlage dieser Eigenschaft wurde durch gezielte Mutagenese und begrenzte Proteolyse untersucht (72). Da das während der Evolution erhaltene Muster der Disulfidbrücken im Serumalbumin der Cobra-Schlange (Naja naja kaouthia) bei C11 und C502
eine Anomalie aufwies, die die Existenz einer einzigartigen räumlichen Struktur
andeutete, wurden diese Aminosäurenreste einzeln durch die an diesen Positionen
gewöhnlich plazierten Reste ersetzt: C11ÕF und C502ÕT. Die erstgenannte Substitution
erhöhte die spezifische Toxinbindungskapazität des CSA um den Faktor 1,7 ± 0,2,
während die zweite Substitution sie um (25 ± 2)% verringerte. Die begrenzte Proteoly-
87
se setzte die tryptischen Peptide T60, T40, T30 und T18 frei, die nach Isolation und
Reinigung durch PAGE und HPLC eine hohe Toxinaffinität aufwiesen. Die Lokalisation dieser Peptide in der Aminosäuresequenz wurde durch Edman-Abbau identifiziert
und weist auf die Reihenfolge ihrer Freisetzung hin. Diese Ergebnisse erlaubten die
Konstruktion eines Modells der Entfaltung und der Aktivitätsänderungen des CSA, die
von den strukturellen Störungen verursacht worden waren, sowie die Auswertung der
zugehörigen kinetischen Parameter. Diese unterstützen die Hypothese der Existenz
einer Struktur, die mehrere homologe Domänen und eine Disulfidbindung zwischen
C11 und C502 in der nativen CSA-Struktur enthält. Die Disulfidbindung verbindet die
Kettenenden und verdichtet die Konformation.
Projektleiter:
Mitarbeiter:
Projektdauer:
Förderung:
Kooperation:
Prof. Dr. rer. nat. B. Havsteen, Prof. Dr. J. Shao
Dr. rer. nat. X. Wang
abgeschlossen
Volkswagenstiftung
Dr. F. Buck, Hamburg
3.2.1.3 Attraktorkontrolle von Proteinfunktionen
Die im vorigen Forschungsbericht erwähnte Untersuchung des deterministischen
Chaoses bei Proteinen wurde mit Studien an einem esterolytischen Antikörper
(„Abenzym“), an Cytochrom c und an der mitochondriellen F0-F1-ATP-ase fortgesetzt.
Die H-Kette des Abenzyms wies einen regulären Attraktor von der Dimension (<d>)
3.0 ± 0.3 auf, während die L-Kette einen Attraktor von <d> = 7.5 ± 0.5 besaß (17). Das
Abenzym zeigte auch die Merkmale eines stochastischen Attraktors von der Dimension ca. 0.9. Der Attraktor der H-Kette hat im Vergleich zu denen der nativen Hydrolasen Chymotrypsin und Lysozym eine zusätzliche Dimension. Der erhöhte Freiheitsgrad
des Abenzyms liefert eine plausible Erklärung der niedrigen, spezifischen Aktivitäten
solcher künstlichen Enzyme. Die Dimension des Attraktors der L-Kette entspricht der
eines gewöhnlichen Antikörpers. Eine klare Dichotomie scheint deshalb in diesem
Abenzym zu herrschen: Die H-Kette zeigt die Vibrationseigenschaften eines Enzyms
und die L-Kette die eines Antikörpers. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese,
daß Attraktoren in biochemischen Mechanismen eine wichtige Rolle spielen: Sie
reduzieren die Anzahl der Freiheitsgraden (Entropie) der Reaktanten. Obwohl die
Konformationsänderungen, die die Oxidation von Ferrocytochrom c begleiten, klein
sind, könnten sie zur Regulation der Übertragung eines Elektrons auf Cytochrom c
durch vorübergehende Speicherung der freigesetzten Energie als mechanische Spannungen und atomare Vibrationen beitragen. Sowohl die Elektronenübertragung als
auch die Konformationsänderungen wird von einem Attraktor, d.h. einer Manifestation
eines deterministischen Chaoses, kontrolliert. Der Attraktor ist regulär und hat bei der
Reaktion des inneren Monomers des Ferricytochrom c (I) die Dimension 3,03 ± 0,03,
während das äußere Monomer die Ordnung 4,2 ± 0,2 aufweist. Die niedrige Ordnung
des Attraktors der gekoppelten Reaktionen der Elektronenübertragung und der Dimerisierung deutet an, daß 1. der Prozeß durch die Evolution optimiert wurde und 2. er für
die Elektronenübertragung in der Atmungskette essentiell ist.
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Da die Ordnung der Attraktoren anderer Proteinfunktionen, z.B. Gasbindung an
Myoglobin (1,0) und Enzymkatalyse (2,0 für Chymotrypsin und Lysozym, 3,0 für das
Abenzym) mit der vektoriellen Beschreibung der Funktion korreliert, bedeutet der
Wert 3,0 für Cytochrom c, daß nicht nur die Elektronenübertragung, sondern auch eine
zusätzliche Reaktion, z. B. eine Konformationsänderung, für die Funktion dieses
Proteins essentiell sind. Das Studium der Proteinattraktoren kann deshalb Information
über wichtige Einzelheiten liefern, die bislang nicht mit anderen Methoden zu erhalten
waren.
Die Analyse der molekularen Vibrationen der Komplexe der "- und $-Ketten der
ATPase mit ATP und ADP, sowie für die Hydrolyse von ATP zu ADP, zeigte die
Anwesenheit von mehreren Attraktoren von niedriger Ordnung: 3 für die Komplexe
der "- und $-Ketten mit ATP, 4-5 für beide Ketten während der Reaktion: ATP + H2O
º ADP + P, 3-5 für die Komplexe der "- und $-Ketten mit ADP.
Projektleiter: Prof. Dr. rer. nat. B. Havsteen
Projektdauer: noch 2 Jahre
Kooperation: Dipl.-Phys. A. Isvoran, Timisoara
3.2.1.4 Eine Genom-weite Suche nach Schizophrenie-disponierenden Genen
Das langjährige Projekt, dessen Endziel die Positionsklonierung der Gene ist, die für
die Schizophrenie verantwortlich sind, wurde in der Berichtsperiode fortgesetzt. In
einer Untersuchung isländischer Familien wurde keine Kopplung zwischen den
Transportergenen für Dopamin und der Schizophrenie gefunden. Dagegen wurde ein
potentielles Kopplungsungleichgewicht zwischen dem Lokus D22S278 auf dem
langen Arm des Chromosoms 22 und der Schizophrenie festgestellt (40).
Projektleiter:
Mitarbeiter:
Projektdauer:
Förderungen:
PD. Dr. med. H. Moises
Prof. Dr. rer. nat. B. Havsteen, Dr. rer. nat. X. Wang
abgeschlossen
DFG, Österreichischer Forschungsrat
3.2.2
Oszillatorische Stoffwechselwege
Die Regulation vieler Stoffwechselwege ist nur unzureichend geklärt. Geregelte
vernetzte Reaktionswege neigen zu nichtlinearem Verhalten wie z.B. Oszillationen,
die wiederum, wenn ihr Reaktionsmechanismus geklärt ist, Aufschluß über die
Regelmechanismen geben. Es wurde die Regelung des Stoffwechsel der Glycolyse als
Modellsystem untersucht. Im Berichtzeitraum wurde eine Anordnung aufgebaut, mit
der es nunmehr möglich ist, über einen langen Zeitraum (durch kontinuierliche
Substrat- und Enzymzufuhr) Oszillationen in der Glycolyse aufrechtzuerhalten.
Außerdem wurde die komplexe Ermittlung von Reaktionsmechanismen aus nichtlinearen Oszillationen vorangetrieben, indem die "Signalanalyse mit Wavelets"
angewandt wurde (42).
Projektleiter: Prof. Dr. rer.-nat. H.-G. Busse
Mitarbeiter: Dr. K. Nielsen, Dipl.-Phys. A. Krämer, TA W. Meinert
Kooperation: Prof. K. Hynne, Prof. P. Sörensen, beide Kopenhagen
89
3.2.3
Neuronale Entwicklung
3.2.3.1 Einfluß von Pyrethroiden auf die neuronale Entwicklung
Im Zentrum dieser Thematik steht die Entwicklung des primären olfaktorischen
Neuropils, untersucht am Modellsystem der Insekten. Hierbei konnte gezeigt werden,
daß die subletale Applikation von Pyrethroiden (neurotoxische Insektizide) während
der Metamorphose von holometabolen Insekten die Neubildung sowie die Umgestalltung der primären olfaktorischen Gehirnareale (antennale Loben) stark beeinflußt. So
konnten Prozesse der Musterbildung im Gehirn unterdrückt werden. Selbst wenn nur
geringe Konzentrationen während der Entwicklung appliziert wurden, die eine Musterbildung nur partiell unterdrückten, waren die im Verhaltenstest untersuchten Riechsinnesleistungen gestört. Durch vergleichende Studien mit Drosophila Mutanten
konnte gezeigt werden, das diese neuronalen Entwicklungsstörungen von der Funktion
des spannungsabhängigen Natriumkanals beeinfußt werden (74-77).
Projektleiter: Dr. rer. nat. R. Wegerhoff
Mitarbeiter: Dipl.-Biol. H. Gäthje, Dipl.-Biol. A. Schepsky (ausgesch.) MTA B.
Hansen
Projektdauer: noch ein Jahr
Förderung: Human Frontier Science Program, Hensel-Stiftung Kiel, Olympus
Akademie Hamburg
Kooperation: Prof. L. Tolbert, Tucson, Dr. T. Roeder, Hamburg
3.2.3.2 Entwicklungsmorphologische Darstellung von MAG- und SMP- immunoreaktiven Neuonen im Tektum des Hühnchens
Mittels immunohistochemischer Methoden wurden für das Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG) sowie für das "Schwann cell myelin protein" (SMP) eine entwicklungsmorphologische Charakterisierung im Gehirn von Hühnchen ausgearbeitet. Diese
wurde vergleichend in vivo sowie in vitro zu dem Auftreten von Entwicklungsmarkern
der Synaptogenese und der neuronalen Plastizität ausgewertet. Für beide Proteine
konnte eine zeitlich sowie räumlich distinkte Verteilung während der Entwicklung des
Tektums aufgezeigt werden.
Projektleiter:
Mitarbeiter:
Projektdauer:
Förderung:
Kooperation:
3.2.4
Dr. rer. nat. R. Wegerhoff
Dipl.-Biol. M.Z. Khan, cand. biol. F. Lehmann, MTA B. Hansen
abgeschlossen
Olympus Akademie Hamburg
PD Dr. S. Kelm, Kiel
Immunbiochemie
3.2.4.1 Regulation der Expression des lymphozytären Aktivierungsmarkers
CD30
Der lymphozytäre Aktivierungsmarker CD30 ist für zelluläre Wechselwirkungen wichtig und seine lösliche im Serum erscheinende Form (sCD30) hat diagnostische Bedeu-
90
tung (71). Die Freisetzung des CD30-Protein geschieht durch zinkabhängige Metalloproteinasen, deren Expression und Aktivität durch Komponenten des intrazellulären
`second messenger pathways’ beeinflußt wird, wobei auch intranucleäre Proteinkinase
Ki-1/57 aktiviert wird (29). Weiterhin wurde gefunden, daß Inhibitoren der zellständigen Metalloproteinasen eine verbesserte Internalisierung von Antikörpern und
Immuntoxinen erlauben, wodurch Immuntoxine eine verstärkte cytotoxische Wirkung
gegen Tumorzellen in vitro entfalten können. Einkettige (`single-chain') Immuntoxine
wurden hergestellt und auf ihre Wirksamkeit getestet. Gegenwärtig konstruieren wir
neue Immuntoxine, welche die induzierbare Toxizität der Barnase ausnutzen. Diese
Immuntoxine basieren auf einem Vektor, der neu von uns konstruiert wurde.
Projektleiter:
Mitarbeiter:
Projektdauer:
Förderung:
Prof. Dr. rer. nat. H. Lemke
Dr. rer. nat. H. Hansen
noch mehrere Jahre
Deutsche Krebshilfe, BMBF, Hensel-Stiftung
3.2.4.2 Beeinflussung des Immunsystems von Neugeborenen durch das mütterliche Immunsystem
Immunglobuline (Ig) werden von der Mutter auf das Neugeborene übertragen und
bieten nicht nur Schutz, sondern haben eine aktiv immunisierende Wirkung. Da die
IgG Antikörper des Muttertieres durch somatische Mutationen entstanden sind,
profitiert das Neugeborene von der immunologischen Erfahrung der Mutter.
Unsere Untersuchungen haben gezeigt (34):
1.) Maternale Antikörper, ohne Beteiligung von Antigen, beschleunigen und verbessern die Qualität der primären Immunantwort in der F1- und F2-Generation. 2.)
Unter den frühen primäre Antikörpern sind schon solche, deren Affinität 7-25-mal
höher liegt als die normalerweise höchstaffinen Antikörper. Diese Antikörper sind (a)
idiotypisch keine Ox1-Antikörper, (b) durch Gene und Genkombinationen exprimiert,
die entweder neu oder für die anti-PhOx-Immunantwort neu sind oder (c) in „normalen" Tieren erst in späteren Phasen der Immunreifung nach sekundärer oder tertiärer
Immunisierung zu beobachten (34). 4.) Wir nehmen an, daß maternale Antikörper eine
immunologische Prägung im Jungtier bewirken, die entscheidend für die ontogenetische Entwicklung des Repertoires und für die Isotypregulation im Immunsystem ist.
Dadurch würde die durch somatische Mutation entstandene immunologische Erfahrung der Mutter für die folgende Generation nutzbar. Die weiteren Arbeiten sollen die
Mechanismen der zugrunde liegenden molekularen Prozesse aufklären.
Projektleiter: Prof. Dr. rer. nat. H. Lemke
Mitarbeiter: Dr. rer. nat. H. Lange, Dr. rer. nat. S. Yazynin
Projektdauer: noch mehrere Jahre
3.2.4.3 Mechanismus der Suppression der IgE-Immunantwort durch monoklonale
Antikörper maternaler Herkunft
Eine Immunisierung von Muttertieren (Ratten) bewirkt, daß in den Jungtieren eine
IgE-Immunantwort gegen das verwendete Antigen nicht induziert werden kann. Diese
91
IgE-Suppression wird durch IgG-Antikörper vermittelt, die vom Muttertier auf die
Nachkommen übertragen wurden. Die IgE-Suppression hielt bis zum Alter von 14
Wochen an, obwohl die maternalen Antikörper nur bis zur 6. Woche im Serum
nachweisbar waren. Wir haben diese Versuche an Mäusen mit dem Allergen Phospholipase A2, der Hauptkomponente des Bienengifts, wiederholt und konnten die an
Ratten gewonnenen Ergebnisse voll bestätigen. Außerdem konnten wir zeigen, daß
auch monoklonale anti-Phospholipase A2-Antikörper in der Lage waren, eine vollständige und lang anhaltende IgE-Suppression bis zu einem halben Jahr zu induzieren
(56), wodurch formal bewiesen ist, daß die IgE-Suppression durch IgG-Antikörper
allein und nicht durch Antigen, welches möglicherweise vom Muttertier übertragen
sein könnte, verursacht wird.
Projektleiter:
Mitarbeiter:
Projektdauer:
Förderung:
Prof. Dr. rer. nat. H. Lemke
Dr. H. rer. nat. Lange, Dr. rer. nat. S. Yazynin
noch mehrere Jahre
DFG
3.2.4.4 Beteiligung idiotypisch-anti-idiotypischer Wechselwirkungen an der Regulation der Immunantwort
Es wurde die anti-idiotypische Immunantwort gegen einen IgM-anti- Phenyloxazolon
(PhOx) Antikörper aus der frühen Anti-PhOx-Immunantwort, der idiotypisch Ox1 ist,
untersucht und es wurden syngene, monoklonale Anti-IdOx1 gegen diesen Idiotypen
hergestellt. Ihre Reaktion mit Anti-PhOx-Antikörpern der frühen Immunantwort
zeigte, daß nur private Idiotope der einzelnen Antikörper erkannt werden, welche in
der 3. hypervariablen Region der H-Kette (VHCDR3) lokalisiert sind (35). Dies
Reaktionsmuster führte zu der Hypothese, daß die Reifung der Immunantwort durch
anti-idiotypische Antikörper getrieben sein könnte (35). Diese Annahme wurde weiter
überprüft, indem monoklonale anti-idiotypische Antikörper auch gegen IdOx1 der
Klasse IgG hergestellt wurden (Diplomarbeiten K. Jost und O. Annacker). Diese
reagierten ebenfalls allein mit privaten Idiotopen der VHCDR3-Region, wenn auch ein
konformatorischer Einfluß anderer Bereiche der V-Regionen festzustellen war. Der
weitere Vergleich der serologischen Reaktivitäten und der genetischen Analyse der
anti-idiotypischen Antikörper gegen den IgM-IdOx1 und zwei IgG-IdOx1 hat unterstützende Hinweise für unsere Hypothese erbracht, daß es eine Korrelation zwischen
Immunreifung und idiotypischer Erkennung gibt.
Weiterhin werden in diesem Zusammenhang die anti-PhOx Antikörperrepertoires nach
Stimulation mit dem thymus-abhängigen Antigen PhOx-CSA oder dem thymusunabhängigen Antigen PhOx-Ficoll untersucht und mit dem Repertoire der PhOxreaktiven natürlichen Antikörper (also diejenigen, die IgM-Antikörper ohne Antigenstimulation sezernieren) verglichen.
Projektleiter:
Mitarbeiter:
Projektdauer:
Förderung:
Prof. Dr. rer. nat. H. Lemke
Dr. H. rer. nat. Lange, Dr. rer. nat. S. Yazynin
noch mehrere Jahre
DFG
92
3.2.4.5 Identifizierung und Charakterisierung von Serummarkern sowie Antigenen
für Anti-Endothelzell-Autoantikörper bei Autoimmun-Vaskulitiden
Bei Autoimmun-Vaskulitiden sind im Serum der Patienten Anti-Endothelzell-Auto-Antikörper (AECA) beschrieben worden, von denen man annimmt, daß sie mit entsprechenden
Auto-Antigenen auf Endothelzellen reagieren. Trotz umfangreicher Bemühungen haben
wir bisher keine AECA-Antigene nachweisen können. Es wurde aber gefunden, daß im
Serum von Vaskulitis-Patienten Immunkomplexe in größerer Menge vorkommen, welche
Fibronectin oder Vitronectin enthalten (Diplomarbeit K. Mähnß). Diese FN- und VNImmunkomplexe enthalten beide Komponenten aber nicht als Autoantigen, d.h. die IC sind
quasi unspezifisch bzw. das spezifische Antigen konnte bisher noch nicht bestimmt
werden. Die Zusammensetzung und die Entstehung dieser IC sollen analysiert werden.
In einem anderen Teil unserer Untersuchungen haben wir gefunden, daß die lösliche Form
des lymphozytären Aktivierungsmarkers CD30 als Aktivitätsmarker für das Krankheitsgeschehen bei Patienten mit Wegener’scher Granulomatose dienen kann (71). Die Herkunft und die Entstehung dieses sCD30 sollen aufgeklärt werden.
Projektleiter:
Mitarbeiter:
Projektdauer:
Förderung:
Kooperation:
3.3
Prof. Dr. rer. nat. H. Lemke
Dr. rer. nat. H. Hansen, Dipl.-Biol. K. Mähnß, Dipl.-Biol. C. Pisot
noch 1 Jahr
BMBF
Prof. Gross, Rheumaklinik, Bad Bramsted
Abteilung SCHAUER
3.3.1
Vorkommen von Sialinsäuren in biologischen Materialien
Um weitere Einblicke in die Natur verschiedener Sialinsäuren und die Expression der
zugehörigen Enzyme zu erhalten, vor allem aus evolutionärer, funktioneller und differenzierungsbiologischer Sicht, werden entsprechende Analysen in Organen vom Schwein,
Meerschweinchen, Igel, Huhn, Truthahn, Platypus, Schaumzikade (Philaenus spumarius)
und in verschiedenen Echinodermata sowie Muttermilch durchgeführt. Aus der Unterkieferspeicheldrüse des Rindes wurden verschiedene, hauptsächlich O-acetylierte Sialinsäuren
im größeren Maßstab isoliert, um Standards für Sialinsäurenanalysen und Substrate für
enzymatische Umsetzungen zu erhalten. Gleicherweise wurde aus Kuhcolostrum Siayllaktose präpariert.
Projektleiter: Prof. Dr. R. Schauer
Mitarbeiter: Dipl.-Ing. agr. H. Schmid, Dipl.-Biol. M. Gollub, Dipl.-Chem. M.
Iwersen, Dr. rer. nat. Y.N. Malykh, Chem.-Lab. M. El Madani
Projektdauer: noch mehrere Jahre
Förderung:
Fonds der Chem. Ind., Ges. z. Erforschung der Sialinsäuren e.V. Kiel
Kooperation: Prof. M. v. Itzestein, Melbourne, Dr. U. Hubl, Lower Hutt (NZ), T. Suguri, Tokyo, Prof. J.P. Kamerling, Utrecht
93
3.3.2
Biosynthese und Funktionen O-acetylierter Sialinsäuren in Pro- und Eukaryoten
O-Acetylierte Sialinsäuren sind im Tierreich bis hin zum Menschen weit verbreitet und
kommen auch in einigen, vor allem pathogenen Bakterien vor. Oft sind sie an der Regulation der Stoffwechselprozesse einer Zelle und an ihrer Interaktion mit anderen Zellen
eines Gewebes oder der extrazellulären Matrix oder mit Pathogenen (z.B. Influenza-C
Viren) beteiligt. Freie und an Glycoconjugate gebundene 4-O-acetylierte Sialinsäuren
konnten als natürliches Substrat der Esterase eines Maus Hepatitis Virus ermittelt werden.
Beim Menschen ist die Konzentration O-acetylierter Sialinsäuren in Tumoren im Vergleich
zu normalem Gewebe verändert. Für die enzymatische O-Acetylierung sind zwei Enzymsysteme verantwortlich: eine Acetyl CoA:Sialat-7(9)-O-Acetyltransferase und eine Acetyl
CoA:Sialat-4-O-Acetyltransferase. Letzteres konnte in den Golgimembranen aus der
Meerschweinchenleber charakterisiert werden (23). Das in der Unterkieferspeicheldrüse
des Rindes vorkommende Enzym katalysiert den Einbau von Acetylgruppen in die
Position C7 der Sialinsäuren und ist ebenfalls hauptsächlich in Membranfraktionen
lokalisiert (67). Da das membrangebundene Enzym zahlreiche Schwierigkeiten bei seiner
Reinigung und Charakterisierung birgt, wurde auch das nicht-membrangebundene Enzym
auf seine Eigenschaften hin untersucht und als möglicherweise bessere Enzymquelle zur
Reinigung analysiert. Das Studium des entsprechenden Enzyms in humanen Leukocyten
wurde über die bereits unternommenen Untersuchungen an weißen Blutzellen aus Spenderblut hinaus auf humane Leukocyten-Tumorzellinien ausgeweitet. Die Biosynthese Oacetylierter Sialinsäuren in humanen Darmtumoren ist ein weiteres Forschungsprojekt.
Hier konnte u.a. gezeigt werden, daß durch den Verlust von O-Acetylgruppen von
Sialinsäuren in Metastasen humaner Darmtumoren das Tumor-assoziierte Antigen SialylLewisx demaskiert wird (39). Auch in Tumoren der Haut, in Basaliomen und Melanomen,
wurden ein erhöhter Gehalt an O-acetylierten Gangliosiden mit Hilfe der Bindung von
Influenza C Viren nachgewiesen werden. O-Acetylierte Sialinsäuren kommen auch im
Tränensack und den ableitenden Tränenwegen des Menschen vor (44).
In einem weiteren Projekt wurde das Enzymsystem zur O-Acetylierung von Sialinsäuren
im Lipopolysaccharid (LPS) bei Bakterien, speziell von E. coli-Stämmen, untersucht.
Hierbei konnten verschiedene monoklonale Antikörper entwickelt werden, die ausschließlich O-acetyliertes bzw. de-O-acetyliertes LPS erkennen. Mit Hilfe dieser Antikörper wurden nach Mutageneseexperimenten Bakterienstämme isoliert, die O-acetyliertes
bzw. de-O-acetyliertes LPS exprimieren. Durch Vergleiche der genetischen Ausstattung
der Bakterienstämme soll das für die Acetyl CoA:Sialat-O-Acetyltransferase kodierende
Gen der Prokaryonten kloniert und sequenziert werden, um Ähnlichkeiten und Unterschiede zu den Sequenzen der Eukaryonten zu analysieren.
Projektleiter: Prof. Dr. R. Schauer, Dr. rer. nat. G. Kohla, PD Dr. rer. nat. P. Roggentin (ausgesch.)
Mitarbeiter: Dr. rer. nat. U. Hubl, M.Sc. K. Stedronski , Dr. rer. nat. R. Stiller, Dr.
rer. nat. V. Vandamme-Feldhaus, Dr. rer. nat. Karl Dahmen (alle ausgesch.), cand. med. C. Fahr, cand. biol. A. Lrhorfi, Dipl. Agr. Ing. H.
Schmid, Dipl.-Chem. M. Iwersen, Dipl.-Biol. J. Pommerencke, TA D.
Leisner (ausgesch.)
94
Projektdauer: noch mehrere Jahre
Förderung:
DFG, Ges. z. Erforschung der Sialinsäuren e.V. Kiel, Mizutani Foundation, Tokyo, Fonds der Chem. Ind.
Kooperation: Prof. A.P. Corfield, Bristol, PD Dr. C. Hanski, Berlin, Prof. G. Herrler,
Hannover, Dr. B. Kniep, Dresden, Dr. F. Paulsen, Kiel, T. Suguri, Tokyo, Prof. R. Vlasak, Salzburg
3.3.3
Biosynthese der N-Glykolylneuraminsäure
Die N-Glykolylneuraminsäure (Neu5Gc) kommt in Zelloberflächen-Glykokonjugaten von
Stachelhäutern bis zu den Menschenaffen vor und ist an der Regulation vieler
Zellerkennungs- und Zelladhäsionsvorgänge beteiligt. Beim Menschen wurde sie nur als
Bestandteil von tumorassozierten Antigenen nachgewiesen. Unsere bisherige Forschungstätigkeit hat gezeigt, daß die N-Glykolylneuraminsäure durch die Hydroxylierung des
Zuckernukleotids Cytidin-5'-monophosphat-N-acetylneuraminsäure (CMP-Neu5Ac)
entsteht. Die für die Katalyse verantwortliche CMP-Neu5Ac Hydroxylase aus Maus und
Schwein ist eine zytosolische, Cytochrom b5-abhängige Monooxygenase, die ein RieskeEisen-Schwefel-Zentrum besitzt. Im Berichtszeitraum konnte mittels verbesserter
enzymatisch-immunologischer Nachweisverfahren an verschiedenen Geweben des
Schweins gezeigt werden, daß eine Korrelation zwischen dem Vorkommen von Neu5Gc,
der Hydroxylaseaktivität und der Menge des Enzyms in den untersuchten Geweben besteht
und somit der CMP-Neu5Ac Hydroxylase eine wichtige Rolle in der Regulation der
Biosynthese Neu5Gc-haltiger Glykokonjugate zukommt (38). Untersuchungen an der
Hydroxylase aus dem Seestern Asterias rubens und anderen Stachelhäutern zeigten, daß
das Enzym im Gegensatz zu dem aus Säugetieren membrangebunden ist. Darüberhinaus
konnte die Beteiligung von Cytochrom b5 an der Hydroxylierungsreaktion von CMPNeu5Ac auch im Seestern nachgewiesen werden (13). Um Aufschluß über die evolutionsbedingten strukturellen Änderungen zu bekommen, wurde mit der Klonierung und
Bestimmung der Nukleotidsequenz der CMP-Neu5Ac Hydroxylase aus A. rubens begonnen. Erste Untersuchungen haben gezeigt, daß die cDNA für die Hydroxylase aus der
Maus in E.coli exprimiert werden kann. Das so erzeugte, rekombinante Protein konnte in
aktiver Form gewonnen werden und stellt somit eine Basis für weitere enzymatische
Studien dar.
Projektleiter: PD Dr. L. Shaw, Prof. Dr. R. Schauer
Mitarbeiter: Dipl.-Biol. M. Gollub, Dipl.-Humanbiol. I. Martensen, Dr. rer. nat.
Y.N. Malykh, cand. biol. A. Niederhofer
Projektdauer: seit 1986, noch mehrere Jahre
Förderung:
DFG, Volkswagenstiftung, Ges. z. Erforschung der Sialinsäuren e.V.
Kiel
Kooperation: Prof. A. X. Trautwein, Lübeck, Dr. T. King, Aberdeen, Prof. M.
Spindler, Kiel, Prof. A. Suzuki, Tokyo, T. Warner, USA.
3.3.4
Biosynthese 8-O-methylierter Sialinsäuren
Die Methylierung der Hydroxylgruppe an Position 8 von Sialinsäuren ist eine ungewöhnliche Modifikation, die bisher nur in einigen Seesternen gefunden wurde. Da von dieser Mo-
95
difikation zu erwarten ist, daß sie Einfluß auf verschiedene metabolische Reaktionen und
biologische Funktionen sialylierter Glykane hat, wurde der Biosyntheseweg weiter
untersucht. Das besondere Interesse gilt dabei der 8-O-Methyltransferase, einem Enzym,
das Methylgruppen von S-Adenosylmethionin auf Sialinsäuren überträgt. Aus dem
Seestern Asterias rubens, der in der Nord- und Ostsee weitverbreitet vorkommt, wurde
über verschiedene chromatographische Schritte eine Enzympräparation isoliert, die zwei
Proteine enthält, die beide mit der enzymatischen Aktivität korrelieren (24). Die ersten
Ergebnisse über die Spezifität des Enzyes haben gezeigt, daß die Hydroxylgruppen an den
Positionen 8 und 9 der Sialinsäure benötigt werden, damit diese als Substrat fungieren
kann. In einem Folgeprojekt ist geplant, die Primärsequenz dieses interessanten Enzyms
aufzuklären, um einen genaueren Einblick in den molekularen Mechanismus der Reaktion
sowie die von dieser Modifikation betroffenen biologischen Prozesse zu erhalten.
Projektleiter:
Mitarbeiter:
Projektdauer:
Förderung:
Kooperation:
Prof. Dr. R. Schauer, PD Dr. L. Shaw
Dr. rer. nat. A. Kelm
seit 1992, noch mehrere Jahre
DFG
Prof. R. Brossmer, Heidelberg, Prof. M. Kiso, Gifu, Japan
3.3.5
Eigenschaften, Struktur und Verwandtschaft von Sialidasen, Trans-Sialidasen
und Sialat-Pyruvat-Lyasen
Sialidasen (EC 3.2.1.18) spalten als Schlüsselenzyme des Sialinsäureabbaus Sialinsäuren
ab, die sich in terminaler Stellung an Zuckerketten auf Zellen und Molekülen befinden. Die
freien Sialinsäuren können dann von den Sialat-Pyruvat-Lyasen (EC 4.1.3.3) in Pyruvat
und Acylmannosamin gespalten werden. Ziel der Forschung an diesen beiden Enzymen
ist es, Erkenntnisse über ihre Evolution und Verwandtschaft, den Reaktionsmechanismus,
sowie ihre Regulation zu gewinnen.
Es wurde ein fluoriertes Derivat des fluorogenen Sialidasesubstrates Methylumbelliferyl-αN-Acetylneuraminsäure entwickelt, mit dem auch schwach exprimierte Sialidasen nachweisbar sind (6), ebenso ein luminogenes Substrat, das einen wesentlich empfindlicheren
Enzymnachweis als herkömmliche Substrate erlaubt und bei dem das Luciferin der
Feuerfliege an Sialinsäure gekoppelt ist. Das kleine Sialidaseisoenzym aus Clostridium
perfringens wurde in E.coli exprimiert und gereinigt (32). Durch einen computergestützten
Vergleich mit homologen Sialidasesequenzen wurde ein Modell des Proteins entwickelt
und mit Hilfe einer spektroskopischen Methode (Laser Photo CIDNP NMR) wurden die
Auswirkungen des Austausches bestimmter Aminosäuren der Moleküloberfläche auf die
Konformation bestimmt (57, 59). Die Untersuchung von Mutanten dieses Sialidaseisoenzyms, bei denen jeweils einer der vier Cysteinreste durch Serin ersetzt war, erhellte die
Ursache für seine Empfindlichkeit gegenüber Quecksilberionen, wohingegen keine Beteiligung von Cystein an der Katalyse gefunden wurde (33). Verfahren zum immunologischen Nachweis dreier clostridieller Sialidasen wurden entwickelt, die eine schnelle
Diagnose des von diesen Arten hervorgerufenen Gasbrandes ermöglichen (47). Die
Sialidase aus Clostridium tertium wurde angereichert und das entsprechende Gen kloniert
und sequenziert. Das Enzym zeichnet sich durch seine Quecksilbertoleranz und die nur
96
mäßige Verwandtschaft mit anderen bakteriellen Sialidasen aus. Dagegen wurde eine
große Ähnlichkeit zur Sialidase aus dem Blutegel Macrobdella decora festgestellt (14).
116 Stämme von Dermatophyten erwiesen sich bei einer Untersuchung als sialidasenegativ, weswegen eine Beteiligung des Enzyms am Pathomechanismus dieser Hautpilze
ausgeschlossen werden kann (31). Außerdem wird an der Isolierung membrangebundener
Sialidaseisoenzyme aus der Pferdeleber gearbeitet. In diesem Gewebe kommen 4-Oacetylierte Sialinsäuren vor, die von Sialidasen nicht spaltbar sind, so daß die vorangehende Entfernung der Acetylgruppen durch eine 4-O-Acetylesterase zu fordern ist.
Eine Untergruppe der Sialidasen stellen die Trans-Sialidasen dar, die die abgespaltene
Sialinsäure nicht auf Wasser, sondern einen Akzeptorzucker übertragen. Sie wurden bisher
nur bei Arten der Gattung Trypanosoma gefunden und sind an der Pathogenese der
Schlafkrankheit bzw. der Naganaseuche beteiligt. In unserem Labor wird die TransSialidase aus T. congolense isoliert und charakterisiert. Geplant sind die Kristallisation und
Röntgenstrukturanalyse sowie NMR-Studien des Enzyms in Kombination mit Substraten
und Substratanaloga, um den Reaktionsmechanismus klären und dadurch einen Beitrag zur
Entwicklung von Medikamenten leisten zu können.
Das Lyasegen aus Clostridium perfringens wurde sequenziert und mit bekannten Lyasesequenzen anderer Mikroorganismen verglichen. Die gefundenen Verwandtschaftsbeziehungen widersprechen z.T. dem Stammbaum, der auf Grund von 16 S rRNA-Sequenzen der
Arten erstellt wurde, was auch schon für Sialidasen gefunden wurde, so daß vielleicht auch
hier ein horizontaler Gentransfer stattgefunden hat (64). Stromabwärts vom Sialidasegen
aus Clostridium tertium wurde ein partieller offener Leseraster gefunden, der signifikante
Homologie zu Lyasen aufweist (14). Dies ist auf Primärstrukturebene der erste Hinweis
darauf, daß bei Clostridium diese Gene als Operon organisiert sind. Die Lyase aus der
Schweineniere wurde ebenfalls isoliert und charakterisiert (53, 60). Die Daten bestätigten
die Beobachtung, daß Lyasen eine homogene Gruppe darstellen (ähnliche Größe, pH- und
Temperatur-Optima, thermostabiler Charakter, Reaktionsmechanismus). Die Sequenz
mehrerer Peptide wurde ermittelt; sie stellt die erste authentische Information über die
Primärstruktur einer Säugerlyase dar und erhärtet die Annahme, daß es sich bei zwei ESTSequenzen aus Mensch und Maus mit Homologie zu mikrobiellen Lyasen tatsächlich um
Genfragmente dieser Enzyme handelt.
Projektleiter: Prof. Dr. R. Schauer, Dr. C. Traving, PD Dr. rer. nat. P. Roggentin
(ausgesch.)
Mitarbeiter: Dr. rer. nat. U. Sommer, Dr. rer. nat. S. Kruse , Dr. J. Nok Andrew,
Dr. rer. nat. R.G. Kleineidam, Dr. rer. nat. H. Rehmke , Dr. med. dent.
G. Krug, Dr. rer. nat. R. Kleineidam, cand. pharm. H. van Unen (alle
ausgesch.), Dipl.-Biol. D. Krüger, Dipl.-Chem. R. Krebber, Mag.-Sci
K.P. Candra, cand. biol. P. Bruse
Projektdauer: noch mehrere Jahre
Förderung:
DFG, A. v. Humboldt-Stiftung, Ges. z. Erforschung d. Sialinsäuren
Kiel e.V., BMBF, Dr.-Helmut-Robert-Gedächtnisstiftung, DAAD
Kooperation: Dr. H.-C. Siebert, München, Prof. G. Taylor, Bath, R. Kleineidam,
Oldenburg, Prof. J. Brasch, Kiel
97
3.3.6
Regulation der Transkription eines eukaryotischen Sialyltransferasegens
Sialyltransferasen sind eine Familie von Enzymen, die Sialinsäuren auf Glykane übertragen. Mittlerweile konnten fast 20 Gene für diese Enzyme durch Klonieren von cDNAs
identifiziert werden. Die Gene scheinen dabei einer gewebe- und zellspezifischen Regulation zu unterliegen. In diesem Projekt wurde die Expression einer "2,3-Sialyltransferase
untersucht, die zuerst in humaner Plazenta identifiziert wurde und für deren Gen unterschiedliche Transkripte beschrieben wurden. Ziel war es, die Regulation der vier verschiedenen Transkripte, die in zirkulierenden Granulozyten und in Leukämiezellen vorkommen,
zu charakterisieren. Bei der Analyse des Promotors dieses Gens wurden zwei potentielle
Bindungsstellen für Regulatorproteine der AP1-Familie identifiziert. In der Leukämiezelllinie THP1 wurden AP1-Proteine nachgewiesen, die mit erhöhter Affinität an diese Bindungsstellen binden, während die AP1-Proteine in der Zellinie HL60 eine verringerte Affinität haben (10). Somit ist dieses Gen der "2,3-Sialyltransferase ein geeignetes Modell, das
Vorkommen verschiedener AP1-Proteine in Krebszellen zu untersuchen.
Projektleiter:
Mitarbeiter:
Projektdauer:
Förderung:
PD Dr. rer. nat. S. Kelm, Prof. Dr. R. Schauer
Dr. rer. nat. U. Gassen (ausgesch.)
abgeschlossen
Universität Kiel, Frauenförderung aus dem
Hochschulsonderprogramm II, Ges. z. Erforschung der Sialinsäuren
e.V. Kiel
3.3.7
Sialinsäuren in zellulären Wechselwirkungen
Sialinsäuren sind nicht nur interessante Komponenten vieler biologisch bedeutender Makromoleküle. In zunehmendem Maße werden die Funktionen der Sialinsäuren bei Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zellen eines Organismus sowie bei der Anheftung
von Krankheitserregern an ihre Wirtszellen erkannt (26).
3.3.7.1 Familie der Siglecs
In diesem Projekt werden die Eigenschaften und die biologischen Funktionen einer Familie
Sialinsäure-bindender Proteine untersucht, die Siglecs genannt werden (4). Der Name
entstand durch Zusammenziehen von Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins. Die
bisher bekannten Siglecs vermitteln zelluläre Wechselwirkungen im Immunsystem, dem
Nervensystem und bei der Entwicklung der Blutzellen. Sie haben eine Reihe gemeinsamer
Strukturmerkmale, die sie von anderen Immunglobulin-artigen Proteinen unterscheiden
und zu der Spezifität für Sialinsäuren beitragen (4, 26, 27). Anhand dieser Merkmale ist
es möglich, mit der zunehmenden Aufklärung eukaryotischer Genome weitere Siglecs zu
identifizieren.
Ein wesentliches Ziel der Experimente war es, die strukturellen Grundlagen und molekularen Mechanismen der Sialinsäure-Erkennung aufzuklären. Dazu wurden mit Kooperationspartnern aus Deutschland, Japan und Russland verschiedene synthetische Sialinsäure-Analoga untersucht. Zusammenfassend haben die Ergebnisse gezeigt, daß die Siglecs, obwohl
sie alle Sialinsäuren binden, sich in ihren Spezifitäten gegenüber Sialinsäuremodifikationen
98
deutlich unterscheiden (25, 61). Diese Befunde werden derzeit dazu ausgenutzt, spezifische
Inhibitoren zu entwickeln, die besser als natürliche Sialinsäuren an bestimmte Siglecs
binden, wie beispielsweise das Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG). Mittels zielgerichteter Mutagenese werden die Beiträge bestimmter Strukturmerkmale des MAG
beziehungsweise einzelner Aminosäuren zu der Sialinsäurebindung untersucht.
MAG ist ein Protein, das in vivo ausschließlich an den Kontaktstellen des Myelins mit
Neuronen vorkommt. Für MAG werden Funktionen in der Entstehung und Aufrechterhaltung der Myelinscheiden diskutiert. Ferner soll MAG auch einen Einfluß auf das Wachstum von Neuriten ausüben. Wir haben Glykoproteine aus Neuroblastomazellen (62) und
aus Primärneuronen isoliert. Das nächste Ziel dieses Projekts wird sein, die einzelnen
Glykoproteine anhand ihrer Primärsequenzen zu identifizieren, ihre Glykane zu charakterisieren und ihre Funktionen bei den Wechselwirkungen zwischen dem Myelin und der
Nervenzellen aufzuklären. Diese Untersuchungen sollen nicht nur zu einem besseren
grundlegenden Verständnis dieser Interaktionen beitragen, sondern auch mögliche Wege
zu der Behandlung neurodegenerativer Krankheiten aufzeigen.
Wenn Wechselwirkungen zwischen Zellen Signale übermitteln, müssen entsprechende
Signaltransduktionswege existieren. In der Diplomarbeit von Birgitta G. Ásgrímsdóttir
wurde die Tyrosinphosphorylierung von MAG als möglicher Mechanismus untersucht.
Ihre Ergebnisse haben gezeigt, daß in der Oligodendrozytenzellinie Oli-neu MAG
phosphorylierte Tyrosinreste trägt und daß deren Menge durch ein Vernetzen von MAG
erhöht wird. Eine solche Vernetzung würde man durch die Bindung von Zellen erwarten.
Die Regulation der Tyrosinphosphorylierung von MAG durch die Bindung von Sialinsäuren auf Neuronen und darunter liegende Signaltransduktionswege sollen im weiteren
Verlauf dieses Projekts untersucht werden.
Projektleiter: PD Dr. rer. nat. S. Kelm
Mitarbeiter: Dipl.-Biol. B. G. Ásgrímsdóttir, Dipl.-Biol. I. Thordsen (beide ausgesch.), Dipl.-Biol. K. Strenge, Dipl.-Biol. H. Gäthje, cand. biol. S.
Resemann, PTA M. Rusch, Prof. Dr. R. Schauer
Projektdauer: noch mehrere Jahre
Förderung:
DFG, Human Frontier Science Program Organisation (Koordination:
S. Kelm), BMBF, Technologiestiftung Schleswig-Holstein
Kooperation: Dr. N. Bovin, Moskau, Prof. R. Brossmer, Heidelberg, P.R. Crocker,
Dundee, Prof. M. Filbin, New York, PD Dr. H.-J. Groß, Ulm, Dr. Y.
Jones, Oxford, Prof. M. Kiso, Gifu, Dr. L. Nitschke, Würzburg, Dr. P.
A. van der Merwe, Oxford, Prof. M. Schachner, Hamburg.
3.3.7.2 Sialinsäure-bindende Proteine aus Helicobacter pylori
Das Bakterium Helicobacter pylori wird als wesentliche Ursache für bestimmte Typen von
Gastritis, Magengeschwüren und sogar Magenkrebs angesehen. In Zusammenarbeit mit
der Arbeitsgruppe von Prof. T. Wadstöm vom Institut für medizinische Mikrobiologie der
Universität Lund, Schweden, haben wir die Sialinsäure-bindenden Eigenschaften dieses
Bakteriums untersucht. Alle Stämme von H. pylori, die das untersuchte Sialinsäurebindende Adhäsin (SAL) exprimieren, binden ausschließlich an "2,3-verknüpfte Sialinsäu-
99
ren (21), wobei die Art der Sialinsäure nicht von Bedeutung zu sein scheint. Das SAL
konnte mittels Affinitätschromatographie gereinigt werden. Obwohl Muzine der Magenschleimhaut relativ wenig Sialinsäuren enthalten, sind diese bedeutend für die Anbindung
SAL-exprimierender H. pylori-Stämme (20). Diese Befunde lassen vermuten, daß die
Sialinsäure-spezifische Adhäsion einen Beitrag zu der Pathogenese der Infektion mit
diesen Bakterien leistet. Berichte aus der Literatur, daß H. pylori Stämme neben dem Adhäsin auch eine Sialidase enthalten, konnten nicht bestätigt werden (22).
Projektleiter:
Mitarbeiter:
Projektdauer:
Kooperation:
Prof. Dr. T. Wadström, Prof. Dr. R. Schauer, PD Dr. rer. nat. S. Kelm
Dipl.-Biochem. S. Hirmo, Lund
noch mehrere Jahre
S. Suguri, Tokyo, Prof. K. Hotta, Sagamihara
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HABILITATIONEN
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KELM, S.; PD Dr.: Die Sialoadhäsin-Familie - Sialinsäure-erkennende Zelladhäsionsproteine.
Med. Fakultät, Universität Kiel, 1997 (Prof. Dr. R. Schauer)
SHAW, L.; PD Dr.: Die Biosynthese von N-Glykolylneuraminsäure. Med. Fakultät, Universität
Kiel, 1997 (Prof. Dr. R. Schauer)
DISSERTATIONEN
1.
2.
3.
4.
5.
ANNACKER, O.; Dipl.-Biol.: Herstellung syngener anti-idiotypischer monoklonaler Antikörper.
Math.-Nat. Fakultät, Universität Kiel, 1997 (Prof. Dr. H. Lemke)
DE FREESE, A.; Dr. rer. nat.: Isolierung und Charakterisierung der Sialat-8-O-methyltransferase
aus dem Seestern Asterias rubens. Math.-Nat. Fakultät, 1996 (Prof. Dr. R. Schauer)
DRAUS, E.; Dr. rer. nat.: Kinetik der Äthanolaminkinase aus der humanen Leber. Math.-Nat.
Fakultät, 1998 (Prof. Dr. B. Havsteen)
GASSEN, U.; Dr. rer. nat.: Studien zur Expression des Gens der
Galß1,4(3)GlcNAc/Galß1,3GalNAc-α2,3-Sialyltransferase des Menschen. Math.-Nat.
Fakultät, Universität Kiel, 1997 (Prof. Dr. R. Schauer)
HUNDT, P.; Dr. med.: Toxische Wirkungen von Chlorkohlenwasserstoffen auf Zellinien in vitro.
Med. Fakultät, Universität Kiel, 1999 (Prof. Dr. H. Lemke)
104
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
KERSTEN, C.; Dr. med.: Immunphänotypische Charakterisierung der das CD30
Aktivierungsantigen exprimierenden normalen Lymphozyten nach mitogener und allogener
Aktivierung in vitro. Med. Faktultät, Universität Kiel, 1998 (Prof. Dr. H. Lemke)
KISSELEWA, T.; Dr. med.: Regulation of the CD30 expression on tumor cell lines and normal
activated peripheral lymphocytes by a zinc metalloproteinase. Med. Fakultät, Universität Kiel,
1996 (Prof. Dr. H. Lemke)
KRUG, G.; Dr. med. dent.: Untersuchungen zur Sialidasebildung von sechs Dermatophyten- und
zwei Candida-Arten. Med. Fakultät, Universität Kiel, 1999 (Prof. Dr. R. Schauer)
KRUSE, S.; Dr. rer. nat.: Untersuchungen zu Struktur-Funktionsbeziehungen am Beispiel der
intrazellulären Sialidase aus Clostridium perfringens. Math.-Nat. Fakultät, Universität Kiel,
1996 (Prof. Dr. R. Schauer)
LANGE, H.; Dr. rer. nat.: Das idiotypische Netzwerk: Strukturen der syngenen Erkennung,
Eigenschaften und Funktionen. Math.-Nat. Fakultät, Universität Kiel, 1997 (Prof. Dr. H.
Lemke)
PREUSS, M.; Dr. med.: Biochemische Charakterisierung eines panleukozytären ZellmembranAntigens. Med. Faktultät, Universität Kiel, 1998 (Prof. Dr. H. Lemke)
REHMKE, H.; Dr. rer. nat.: Synthese und Darstellungsversuche neuartiger, luminogener
Sialidasesubstrate. Math.-Nat. Fakultät, Universität Kiel, 1998 (Prof. Dr. R. Schauer)
SOMMER, U.; Dr. rer. nat.: Isolierung und Charakterisierung der Sialat-Pyruvat-Lyase aus
Schweinenieren und Einblicke in das katalytische Zentrum. Math.-Nat. Faktultät, Universität
Kiel, 1998 (Prof. Dr. R. Schauer)