HMGB1

Wenn sich der Körper selbst angreift –
die Rolle eines körpereigenen Alarmmoleküls in der Granulomatose mit Polyangiitis
Anja Kerstein, Dr. Antje Müller, Prof. Dr. Peter Lamprecht
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Poliklinik für Rheumatologie Lübeck
Frage 1: Liegt HMGB1 im Gewebe von GPA-Patienten innerhalb oder außerhalb des Zellkerns?
Granulomatose mit Polyangiitis (GPA): eine seltene Autoimmunerkrankung
• GPA als Autoimmunerkrankung:
 Antikörper (ANCA) gegen ein körpereigenes, antimikrobielles
Enzym von Abwehrzellen (Proteinase 3 der neutrophilen
Granulozyten)
 ANCA aktiviert neutrophile Granulozyten  Zerstörung der Blutgefäße
• Ursache:
Methode : Immunfluoreszenzfärbung von Nasengewebe : HMGB1 (rot), Zellkern (blau)
Antwort 1: In Zellen der Nasenschleimhaut von GPA-Patienten liegt HMGB1 überwiegend außerhalb
des Zellkerns und der Zelle vor, v.a. am Rand nekrotischer Bereiche. Dies ist im Vergleich zur CRS
statistisch signifikant.
• Ziel der Forschung:
 Krankheit genauer verstehen, um sie zu bekämpfen
 Finden neuer Krankheitsmarker
Frage 2: Welche Zellen setzen HMGB1 frei und tragen den Rezeptor RAGE?
HMGB1
HMGB1 – ein professionelles Alarmmolekül
HMGB1 –
ein Alarmmolekül
• normalerweise ein kernständiges Protein
• Freisetzung durch Nekrose oder bei Entzündungen  „Alarmin“
• bei GPA: HMGB1- Konzentration im Serum
 korreliert mit Krankheitsaktivität
 korreliert mit der Granulomlast
Infektion
Rezeptor RAGE
Makrophagen
nekrotischer
Bereich
nekrotischer
Bereich
nekrotischer
Bereich
extrazelluläres
HMGB1
Nekrose
bekannte HMGB1
Rezeptoren
(Alarmin)
Methode : Immunhistologische Färbung von Nasengewebe : Zellkerne (blau)
und verschiedene Proteinmarker
TLR2
Antwort 2: Die Zellen an der Grenze zu nekrotischen
Bereichen setzen HMGB1 frei. Bei diesen Zellen handelt
es sich um Makrophagen, die auch den Rezeptor RAGE
tragen.
HMGB1
zentraler
Genregulator
Aktivierung von
Zielgenen
Frage 3: Fehlt ein negativer Regulationsfaktor in der
HMGB1-RAGE-Wechselwirkung?
Auswertung
nekrotischer
Bereich
 unbekannt, vermutlich ungünstige Kombination genetischer Faktoren und
Umwelteinflüsse
Ziele der Doktorarbeit:
1. Untersuchung der Signalwege von HMGB1
in der GPA
2. Identifizierung von Mechanismen, die
therapeutisch relevant sein könnten
chron. Rhinosinusitis (CRS)
GPA
• 6-12 neue Krankheitsfälle pro Mio. Einwohner pro Jahr in Deutschland
• Definition:
 granulomatöse Entzündung des Atmungstraktes
 nekrotisierende Vaskulitis der kleinen Blutgefäße
NFB
Zellkern
Zielzelle
Zelle
Frage 5: Kann HMGB1 als körpereigenes Adjuvans direkt
mit dem Autoantigen Proteinase 3 wechselwirken und
dadurch die Autoimmunreaktion auslösen?
Wanderung
Aktivierung
Vermehrung
Differenzierung
Methode: Messung von sRAGE in Blutplasma von GPA-Patienten und Gesunden (HC)
mittels ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). sRAGE ist die lösliche Variante von
RAGE, die RAGE-Liganden wie HMGB1 neutralisieren kann.
Entzündung
Kontrolle
Methode: Analyse der an HMGB1 gebundenen Proteine aus Neutrophilen von GPA-Patienten
mittels Co-Immunpräzipitation und Westernblot. Signale zeigen das Vorhandensein von
Proteinase 3, die an HMGB1 gebunden ist.
Negativkontrolle
Zellkerne
Antwort 3: Kein Unterscheid der sRAGE-Konzentration im Plasma zwischen aktiven und inaktiven GPAPatienten bzw. zwischen GPA-Patienten und Gesunden, d.h. schwächere Gegenregulation der HMGB1RAGE-Wechselwirkung bei GPA-Patienten.
GPA
Nekrose
induzieren
Zellfreier
Überstand
ZellStimulation
pro-IL1-beta
Reaktion ?
HMGB1
Frage 4: Welchen Einfluss hat HMGB1 auf Makrophagen?
IL1-beta
7
HMGB1 Knock-out
Makrophagenähnliche Zelllinie
(THP-1)
Proteinase 3
5
4
3
2
1
0
AB
PBS
HMGB1-/-
HMGB1+/+
ATP 5mM
Methode : In vitro Untersuchung der Effekte von HMGB1 auf Makrophagen. (A) Makrophagen-ähnliche Zelllinie (THP-1)
wurde mit Zellüberstand von nekrotischen Wildtyp und HMGB1 Knock-out Fibroblasten (embryonale Mausfibroblasten)
stimuliert. Sekretierte Zytokine (Entzündungsmediatoren) der THP-1 Zellen wurden gemessen. (B) Bestimmung des
freigesetzten, zentralen Entzündungsmediators IL-1β mittels SDS-Gelelektrophorese und Westernblot
Antwort 4: HMGB1 fördert die Freisetzung des Entzündungsmediators IL-1β und führt damit zu einer
verstärkten Entzündungsreaktion.
Überlagerung
?
HMGB1 Wildtyp
relative Expression
6
Methode: Immunfluoreszenz-Doppelfärbung von GPA Nasengewebe, Analyse mittels Konfokalmikroskopie.
Repräsentative Beispiele für Neutrophile, die HMGB1 (rot) und Proteinase 3 (grün) zusammen auf der Oberfläche tragen.
Antwort 5: HMGB1 und Proteinase 3 können in Neutrophilen wechselwirken. Ihre Kombination
(körpereigenes Adjuvans HMGB1 + Autoantigen Proteinase 3) könnte zur Autoimmunreaktion gegen
Proteinase 3 führen.
Zusammenfassung:




Makrophagen in nekrotischen Läsionen der Nasenschleimhaut sezernieren HMGB1 und tragen den Rezeptor RAGE
die Gegenregulation der HMGB1-RAGE-Wechselwirkung durch sRAGE ist in der GPA gestört
HMGB1 führt zur Freisetzung von IL-1β und damit zu einer sich selbst verstärkenden Entzündungsreaktion
HMGB1 könnte durch direkte Wechselwirkung mit dem Autoantigen Proteinase 3 auf Neutrophilen zur Autoimmunreaktion beitragen
Fazit:
HMGB1 spielt in der GPA eine zentrale Rolle sowohl bei Entzündungsprozessen als auch in den ersten Schritten zur Entstehung der Autoimmunreaktion gegen das
Autoantigen Proteinase 3. Damit stellt HMGB1 ein therapeutisches Ziel für die Behandlung der GPA in der Zukunft dar.
Referenzen:
1. Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P. & Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual review of pathology 8, 139–60 (2013).
2. Henes, F. O. et al. Correlation of serum level of high mobility group box 1 with the burden of granulomatous inflammation in granulomatosis with polyangiitis (Wegener’s). Annals of the rheumatic diseases 70, 1926–9 (2011).
3. Wibisono, D. et al. Serum HMGB1 levels are increased in active Wegener’s granulomatosis and differentiate between active forms of ANCA-associated vasculitis. Annals of the rheumatic diseases 69, 1888–9 (2010).
4. Schmidt, A. M., Yan, S. D., Yan, S. F. & Stern, D. M. The multiligand receptor RAGE as a progression factor amplifying immune and inflammatory responses. The Journal of clinical investigation 108, 949–55 (2001).
5. Rovere-Querini, P. et al. HMGB1 is an endogenous immune adjuvant released by necrotic cells. EMBO reports 5, 825–30 (2004).