Strukturelle und funktionelle Analyse der S`Region der

KfK 4307
August 1987
Strukturelle und funktionelle
Analyse der S'Region der
Albumingene von Xenopus laevis:
Identifikation eines zellspezifischen Promotor-Eie~entes
---------------------------
-----
--------
·M. Schorpp
Institut für Genetik und für Toxikologie von Spaltstoffen
Kernforschungszentrum Karlsruhe
KERNFORSCHUNGSZENTRUM KARLSRUHE
Institut für Genetik und für Toxikologie
von Spaltstoffen
KfK 4307
STRUKTURELLE UND FUNKTIONELLE ANALYSE DER 5'REGION
DER ALBUMINGENE VON XENOPUS LAEVIS:
IDENTIFIKATION EINES ZELL-SPEZIFISCHEN PROMOTOR-ELEMENTES
Marina Schorpp
Dissertation genehmigt von der Fakultät
für Bio- und Geowissenschaften
der Universität Karlsruhe
Kernforschungszentrum Karlsruhe G.m.b.H., Karlsruhe
Als Manuskript vervielfältigt
Für diesen Bericht behalten wir uns alle Rechte vor
Kernforschungszentrum Karlsruhe GmbH
Postfach 3640, 7500 Karlsruhe 1
ISSN 0303-4003
Zusammenfassung
Der
Krallenfrosch
Säugern
zwei
Albumin
Protein
der
Xenopus
laevis besitzt -
Albumingene,
die
für
im Gegensatz zu den
ein 68kd und 74kd Serum
kodieren. Beide Gene werden gewebespezifisch in
Leber exprimiert. Die Sequenzanalyse der 5'Enden beider Gene
zeigte,
daß
Homologie
beide
Gene
erstreckte
5'flankierende
sich
Region.
a-Foetoprotein-Genen
über
weite Bereiche homolog sind. Die
bis
zu
400
Sequenzvergleiche
der
bp
mit
weit
in
die
den Albumin- und
Säuger und des Huhns ergaben nur wenig
Homologie für das erste Exon.
Basierend
auf
den
5'flankierenden
Indikatorgen
Sequenzdaten
Region
des
hergestellt
Expression
Albumin/CAT-Hybridgenen
werden,
daß
konstitutive
wurde
Initiation
den
in
Promotorregion
und
der
einem
Untersuchung der regulierten
Durch
Injektion
von
von
-50
bis
+19
genügen,
zu vermitteln. Dieser minimale Promotor
transfizierten
Während
aus
in Xenopus laevis Oocyten konnte gezeigt
in
den
Maus
Hepatoma-Zellen
Oocyten
zwei
schwach
Startstellen
zur
der Transkription gebraucht werden (+1 und +2), wurde
transfizierten
Startstelle
zur
Hybridgene
Albumingens
werden.
Expression
auch
exprimiert.
in
69bp
68kd
und
eingesetzt
konnten
wie
in
Maus
der
Hepatoma-Zellen
Froschleber
die
benutzt
gleiche
(+1).
Dies
dokumentiert, daß der Albuminpromotor in den Maus Hepatoma-Zellen
im Gegensatz zu den Oocyten genauso korrekt gebraucht wird wie in
der Froschleber.
Hybridgene
mit
Albuminpromotor
5'flankierenden
wurden
in
Sequenzen
transfizierten
vor
dem
minimalen
Maus Hepatoma-Zellen
5-lOfach besser exprimiert. Durch Deletions- und Mutationsanalyse
konnte
ein 13bp großes Promotorelement zwischen Position -67 und
-53
identifiziert
Hepatoma-Zellen
vermittelt
stimuliert.
zellspezifische
Hepatoma-Zellen
aktiv.
die
das
werden,
Transkription
in
den
Dieses cis-wirkende Promotorelement
Expression,
denn
es
ist
nur
in
Ein ähnliches Sequenz-Element wurde auch
in der 5'flankierenden Region der Albumin- und a-Foetoproteingene
der Säuger gefunden.
Mit
der
Identifizierung
Promotorelementes,
das
in
dieses
zellspezifisch
wirkenden
Säuger Hepatoma-Zellen erkannt wird,
wurde ein sehr konservierter Regulationsmechanismus entdeckt,
der
möglicherweise
und
eine
wichtige
Rolle
a-Foetoprotein-Genexpression spielt.
in
der
Albumin-
ABSTRACT
STRUCTURAL AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF THE 5'REGION OF THE ALBUMIN
GENES
OF
XENOPUS
LAEVIS:
IDENTIFICATION
OF
A CELL-SPECIFIC
PROMOTER ELEMENT
The
frog
albumin
Xenopus
genes
laevis
that
in
code
for
cantrast
a
68kd
to mammals - has two
and
74kd serum albumin
protein. The sequence analysis of the 5'ends of both genes showed
an
extensive sequence homology as far as 400bp in the 5'flanking
region.
Sequence
comparisons with the albumin and a-fetoprotein
genes of mammals and chicken revealed no obvious homology for the
5'flanking
regions
and
only
weak
homology
for the first and
second exon.
By injecting albumin CAT fusion genes into Xenopus laevis oocytes
I
could
show
that a 69bp promoter region (from -50 to +19) was
sufficient to exhibit full transcriptional activity. This minimal
promoter
was
also
weakly
active after transfection into mouse
hepatoma cells (BWIJ).
Mapping
sites
the
(at
transcription
+1
transfected
Xenopus
cells
and
+12)
hepatoma
start
in
cells
site
revealed two initiation
microinjected
oocytes, whereas in
initiation at +l -
the site used in
liver - was observed. This documents that mouse hepatoma
transcribe
the
albumin
promoter
more
faithfully
than
Xenopus oocytes.
The
addition
promoter
of
leads
transfected
5'flanking
to
mouse
a
5
to
hepatoma
sequences
lOfold
to
the minimal albumin
increase
in
activity
in
cells. By deletion analysis I could
identify a 13bp promoter element located between position -67 and
-53
that
stimulates transcription at the albumin promoter.
This
cis-acting element confers cell-specific expression because it is
active only in hepatoma cells.
A similar sequence element is also
present in the 5'flanking region of the albumin and a-fetoprotein
genes of mammals.
By identifying this cell-specific promoter element of a frog gene
that is recognized in mouse hepatoma cells a conserved regulatory
mechanism
was
detected
that may play a general role in albumin
and a-fetoprotein gene expression.
AB KURZUNGEN
ABB
Abbildung
AFP
o:-Foetoprotein
ALB
Albumin
ATP
Adenosintriphosphat
bp
Basenpaare
BSA
Bovine Serum Albumin
CAT
Chloramphenicol-Acetyltransferase
Ci
Curie
cpm
counts per minute
DC
Dünnschicht-Chromatographie
dATP
Desoxyadenosin-5'-triphosphat
dCTP
Desoxycytidin-5'-triphosphat
dGTP
Desoxyguanosin-5'-triphosphat
dTTP
Desoxythymidin-5'-triphosphat
dUTP
Desoxyuridin-5'-triphosphat
dNTP
Desoxy-Nukleosidtriphosphate
ddNTP
Didesoxy-Nukleosidtriphosphate
DEPC
Diethylpyrocarbonat
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DMS
Dirnethylsulfat
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DNase
Desoxyribonuklease
DTT
Dithiothreitol
EDTA
Ethylendiamin-tetraessigsäure
EGTA
Ethylen-bis(oxyethylenenitril)-tetraessigsäure
FCS
foetales Kälberserum
GTP
Guanosintriphosphat
HEPES
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure
HSV
Herpes simplex Virus
IgH
Immunoglobulin heavy chain
kb
Kilobasenpaare
kd
Kilodalton
KTartrat
Kaliumtartrat
MES
2-N-Morpholinoethan-sulfonsäure
MS 222
3-Aminobenzoesäure-ethylester
mRNA
messenger-Ribonukleinsäure
NaAcetat
Natriumacetat
nt
Nukleotide
PEG
Polyethylenglycol
PIPES
Piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsäure)
PVP
Polyvinylpyrrolidon
RNA
Ribonukleinsäure
RNase
Ribonuklease
RNasin
RNase-Inhibitor
SDS
Sodiumdodecylsulfat
SV40
Simian Virus 40
TAB
Tabelle
tRNA
transfer-RNA
TEMED
N,N,N' ,N'-Tetramethyl-ethylendiamin
tk
Thymidinkinase
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
u
Enzymeinheit
1
Inhaltsverzeichnis
EINLEITUNG
6
MATERIALIEN
l. Chemikalien, Radioisotope und Arbeitsmittel
16
2. Bakterien und Zellen
19
3. Kulturmedien
20
METHODEN
Allgemeine Arbeitsmethoden
21
l. Bestimmung von Nukleinsäure-Konzentrationen
21
2. Extraktion von Nukleinsäuren
21
3. Fällung von Nukleinsäuren
22
DNA-Klonierungstechniken
22
1. Restriktionsverdau
22
2. Herstellung von Bal31-Deletionen
23
3. Auffüllen von 5'Uberhängen
23
4. Dephosphorylierung von DNA
23
4.1. 5'Uberhänge
23
4.2. 3'Uberhänge
24
5. Auftrennung von DNA-Fragmenten
24
5.1. Agarose-Gel
24
5.2. Polyacrylamidgel
24
6. Isolierung von DNA-Fragmenten aus Gelen
25
6.1. aus Agarose-Gelen
25
6.2. aus Polyacrylamid-Gelen
26
7. Ligation
26
7.1. in wäßriger Lösung
26
7. 2.
26
im Agaras e-Ge 1
2
7.3.
Ligation von Linkern
26
8. Klonierung von Oligonukleotiden
27
9.
28
Transformation von Bakterien
9.1. nach Hanahan
28
9.2. nach der CaCl2-Methode
29
10. Präparation von einzelsträngiger DNA aus rekom-
29
binanten pEMBL-Plasmiden
10.1. Titration und Vermehrung der Helferphagen
30
10.2. Gewinnung der einzelsträngigen DNA
30
11. Präparation von Plasmid-DNA
32
11.1. Präparation kleiner Mengen Plasmid-DNA
32
11.2. Präparation von großen Mengen Plasmid-DNA
32
11.3
33
Spezielle Präparation von Plasmid-DNA zur
Transfektion von eukaryontischen Zellen
Versuche mit Xenopus laevis
35
1. Präparation von polyA+-RNA aus der Froschleber
35
2. Mikroinjektion von Plasmid-DNA in Xenopus
36
Oocyten-Kerne
2.1. Extraktion von RNA aus injizierten Oocyten
37
2.2. Extraktion von Proteinen
38
Zellkultur
38
1.
Trypsin-Behandlung
38
2.
Rekultivierung
39
3.
Einfrieren und Auftauen von Zellen
39
4.
Transiente Transfektion von Zellen
39
4.1.
Transfektion
39
4.2. Protein-Präparation
40
4.3
40
RNA-Präparation
Analytische Methoden
1.
Präparation von radioaktiv markierten Proben
1.1. Kinase-Markierung von RNA
41
41
41
3
1.2. Endmarkierung von DNA-Fragmenten
42
1.3. Kinasierung von Oligonukleotiden
42
2. Gelfiltration
42
2.1. Sephadex G50-Säule
42
2.2.
43
"Spin column"
2.3. Biogel P60-Säule
43
3. Elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren
44
3.1.
Auftrennung von in vitro transkribierter RNA
44
3.2. Auftrennung von Nukleinsäuren unter denaturieren-
45
den Bedingungen
4. Southern Transfer von DNA
46
5. Hybridisierung von RNA an DNA
47
6.
47
In vitro Transkription
7. Sequenzierung von Nukleinsäuren
48
7.1. von einzelsträngiger DNA nach Sanger
48
7.2. von doppelsträngiger Plasmid-DNA
49
7.3. Sequenzierung von RNA mit der Kettenabbruch-
51
Methode
7.4. Sequenzierung von DNA nach Maxam und Gilbert
51
8.
53
"primer extension"-Analyse von RNA
9. SP6-Analyse von RNA
53
9.1. Herstellung der RNA-Probe
54
9.2.
Vorbehandlung der RNA
55
9.3.
Analyse
55
10. Bestimmung der CAT-Aktivität
56
4
ERGEBNISSE
I. Strukturelle Analyse der 5'Enden der Xenopus Albumin-
58
gene
l. Subklonierung der genomischen Fragmente, die das
60
5'Ende enthalten
2. Die klonierten Subfragmente enthalten Exon-Sequenzen
62
3. Die Subklone besitzen eine Promotor-Region,
63
die von der RNA-Polymerase II erkannt wird
4. Die Sequenzierung der Subklone
66
5. Kartierung der in vivo benutzen Startstelle der
76
Transkription
5.1. SP6-Analyse der Albumin mRNAs
76
5. 2.
81
"primer extension"-Analyse der Albumin mRNAs
6. Die Sequenz der 5'Enden der Xenopus Albumingene
87
6.1. Die Sequenzen der beiden Gene zeigen große
88
Homologie
6.2. Das erste Exon der Albumingene zeigt bei Xenopus,
93
Säugern und Huhn den gleichen Aufbau
II. Funktionelle Analyse der 5'Region der Albumingene
98
des Xenopus
l. 69 bp genügen zur konstitutiven Expression in
102
Oocyten
2. Die Xenopus ALB/CAT-Hybridgene werden in den Maus
105
Hepatoma-zellen BWIJ gewebespezifisch reguliert
2.1. Ein Promotor-Element vermittelt die hepatoma-
109
spezifische Expression
2.2. Das hepatoma-spezifische Promotor-Element (HPl)
ist l3bp groß und durch Punktmutationen
inaktivierbar
113
5
DISKUSSION
121
LITERATURVERZEICHNIS
139
6
Einleitung
Die
geordnete
Entwicklung eines Lebewesens erfordert die genaue
Regulation von Zellwachstum und Differenzierung. Dazu müssen Gene
gewebespezifisch
verändert
aus
die
und
Kombination
zeitlich
werden,
denn
jede
neue Zelle geht
ihrer Vorläuferzelle hervor. Zusätzlich sind Gene
erforderlich,
antworten
aktiviert
die
dann
Fähigkeit besitzen, auf Umweltsignale zu
die aktivierten Gene regulieren können.
Die
aus aktivierenden und modulierenden Ereignissen, die
und
schließlich
räumlich
im
sich
exakt
koordiniert sein müssen, bestimmt
entwickelnden
Organismus
den endgültigen
Phänotyp einer Zelle.
Die
für
die
Entwicklung
Differenzierungszustandes
Mechanismen
greifen
Gentranskription
Aufgrund
der
Manipulation
etliche
an
(Darnell,l982;
Techniken
klonierten
Informationen
Eukaryonten
verantwortlichen
hauptsächlich
ein
neuen
Aufrechterhaltung
und
erhalten.
der
Genen
auf
des
molekularen
der
Serfling
Genklonierung
Ebene
et
der
al,l985a).
und in vitro
wurden in den letzten Jahren
über die Regulation der Transkription bei
Diese
scheint
im
Prinzip auf ähnlichen
Mechanismen zu basieren, die bereits für Prokaryonten beschrieben
wurden:
auf
der Interaktion von cis-wirkenden DNA-Elementen mit
trans-wirkenden Faktoren, Proteinen (Ptashne,l986).
Allerdings
scheint
komplexer
zu
5'flankierenden
die
Organisation
bei
den Eukaryonten viel
gewöhnlich
in
der
sein.
Zahlreiche,
für
Region
lokalisierte
cis-wirkende DNA-Elemente,
7
regulieren
Faktoren
im
die
(Serfling
mit
verschiedenen trans-wirkenden
genaue und effiziente Initiation der Transkription
et
tischen,
Zusammenspiel
al.,l985a).
Die
proteinkodierenden
Promotorregion
eines
eukaryon-
Gens besteht in der Regel aus einem
konservierten AT-reichen DNA-Sequenzmotiv, der TATA-Box, die sich
meist
5'
25-30bp
( Ubers ichtsart.
von
Serfling
der
et
mRNA-Startstelle
al., 1985a).
Durch
befindet
Promotor-
kartierungsexperimente wurden für einige eukaryontische Gene zwei
wichtige
"upstream"
Konsensus-Sequenz,
DNA-Elemente
die
CAAT-Box
GGGGcooGGc_sequenz
1
T
AAT
eine
die
definiert:
GG~CCAATCT
(Efstratiadis et al. ,1980) und
GC-Box (Benoist und Chambon,l981;
Myers et al. ,1981; Lebowitz und Ghosh,l982;
Diese
eine
Everett et al. ,1983).
Elemente befinden sich oft 40-lOObp 5' von der Startstelle
der
Transkription
und scheinen für die Effizienz der Initiation
der
Transkription
wichtig
absolut
auch
notwendig
gemeinsam
zu
sein.
Die
Elemente
sind nicht
für die Funktion eines Promotors, können aber
auftreten,
wie z.B. beim Thymidinkinase-Gen des
Herpes Simplex Virus (McKnight et al.,l984).
Bei
einigen
Genen
"Enhancer"
wird
reguliert.
DNA-Elemente,
unabhängig
die
die Transkription auch über sogenannte
Dies
bis
zu
sind
100-200bp
ebenfalls
cis-wirkende
groß
können,
sein
von der Orientierung und Entfernung die Transkription
eines benachbarten Promotors aktivieren können.
der
Fällen
ist,
In der Regel wird
nächstgelegene Promotor bevorzugt stimuliert (Ubersichtsart.
Serfling
sein.
und
et
auch
al. ,1985a).
3'
von
Enhancer
können
5'
oder in manchen
der Transkriptionsstartstelle lokalisiert
Es gibt kein Sequenzmotiv, das für alle Enhancer gemeinsam
jedoch
ist für viele Enhancer das Vorhandensein eines oder
mehrerer wiederholter Sequenzmotive charakteristisch.
8
Es
wurden
auch
etliche
DNA-Elemente
unter bestimmten Bedingungen,
die nur
in Anwesenheit eines Induktors,
klassisches
Beispiel
dafür
als
Enhancer
wirken.
(hormone
responsive element) des Maus Mammary Tumorvirus (MMTV),
das
Ein
charakterisiert,
ist das HRE
nur in Anwesenheit eines aktivierten Glucocorticoidrezeptors
Enhancer-Aktivität
ausübt
(Chandler
et
al.,l983;
Ponta
et
al.,l985)
In
letzter Zeit ist eine genaue Abgrenzung zwischen Enhancer und
"upstream"
beide
Element
nicht
strukturell
Beispielsweise
kann
Metallothioneingens
von
der
und
funktionell
die
unmittelbare
ist
losgelöst
ein
strukturelle
Einheit
ursprünglich
angenommen,
Kombination
von
möglich,
da gefunden wurde,
überlappen
5'Region
daß
können.
des
Maus
als induzierbarere Enhancer wirken, wenn sie
TATA-Box
Möglicherweise
mehr
wird
(Serfling
Enhancer
mit
gar
klar
sondern
verschiedenen
nicht
definierten
viel
eher
DNA-Motiven
et
al., l985b).
so
sehr
Grenzen,
wird
durch
eine
wie
die
ein Enhancer-Effekt
erzielt (Sassone-Corsi und Borrelli,l986).
über
Transkriptionsstudien
in
zellfreien
Extrakten konnten in
letzter Zeit einige trans-wirkende Faktoren identifiziert werden,
die
mit
wurde
spezifischen Promotorsequenzen interagieren.
der
Tjian,l983;
konnten
bindende
übersichtsart.
Faktor
Kadonaga
SPl beschrieben ( Dynan und
et
al.,l986).
Inzwischen
auch Faktoren, die an die TATA- bzw. CAAT- Box binden in
Drosophila
(Davidson
GC-Box
Als erstes
und
Säugerzellen
identifiziert
et al. ,1983; Parker und Topol,l984;
Cohen et al. ,1986;
Jones et al.,l987).
und isoliert werden
Jones et al.,l985;
9
Schließlich konnte auch die Wirkung der Enhancer-Elemente auf die
Interaktion
Dies
mit
trans-wirkenden
Faktoren zurückgeführt werden.
war zunächst durch in vitro Kompetitionsexperimente gezeigt
worden
(Schöler
und
Transkriptionssystemen
letzlieh
die
Gruss,l984)
und
(Sassone-Corsi
Möglichkeit
gegeben
et
dann
in
in
vitro
al. ,1985), womit dann
war,
solche
Faktoren
zu
isolieren. So konnte ein Faktor aus HeLa-Zellen gereinigt werden,
der
mit
einigen
Adenovirus
Gens
2
in
El-Gens
(IgH)
und
interagiert
generellen
kann
Enhancer-Elementen,
z.B.
dem
Enhancer
des
dem des Immunoglobulin schwere Kette
(Sassone-Corsi
Enhancer-bindenden
Faktor
et
gibt
al.,l985).
Einen
es jedoch nicht. So
z.B. der Polyoma Virus Enhancer nicht mit dem SV40 Enhancer
einem
Transkriptionsexperiment
kompetitieren,
beinhalten
Mittlerweile
konnten
identifiziert
Insulin
SV40
zellfreiem
Extrakt
obwohl beide Enhancer sehr ähnliche Sequenzmotive
(Sassone-Corsi
Roeder,l986),
in
werden:
et
al.,l985;
weitere
c-fos
Octamersequenz
Piette
al.,l985).
Enhancer-bindende
(Treisman,l986;
im
et
IgH-Gen
(Singh
Faktoren
Prywes
und
et al.,l986),
(Ohlsson und Edlund,l986) und der Faktor APl, der an den
Enhancer
und
den
Basal
Level
Enhancer
des
Metallothioneingens bindet (Lee et al.,l987).
Neuerdings
wurden
für
Regulationsmechanismen
viele
eukaryontische Gene auch negative
beschrieben,
die
ebenfalls
auf
dem
Zusammenspiel von cis-wirkenden DNA-Elementen und trans-wirkenden
Faktoren
beruhen.
trans-wirkenden
Das
bestcharakterisierte
Beispiel
eines
Repressors ist das große T-Antigen von SV40, das
die Synthese der frühen Virusproteine und damit auch seine eigene
reprimiert (Rio et al.,l980; Myers et al.,l981).
In den meisten
10
Fällen
jedoch,
wo
Transkription
DNA-Sequenzen
beschrieben
mit
wurden,
negativem Effekt auf die
müssen
die
die
Wirkung
vermittelnden Faktoren noch identifiziert werden.
Neben
diesen beobachteten generellen Kontrollmechanismen für die
Expression
von
Hinweise
Genen,
gibt
die
Existenz
über
Faktoren
bei
der
Zellen
Weiss,l982).
Durch
al.,l981;
und
von
gewonnen
Genen
die
gewebespezifisch
wirkenden
wurden aus genetischen Studien
(Ubersichtsart.
die
Expression
auslöschen
Mevel-Ninio
Fournier,l984;
gewebespezifische. Erste
Ephrussi,l972;
Zell-Fusionsexperimente wurden im Zytoplasma
gefunden,
exprimierten
auch
Genexpression
somatischer
Faktoren
es
oder
von
gewebespezifisch
aktivieren können (Kahn et
und Weiss,l981; Blauet al. ,1983; Killary
Petit
et
al.,l986).
Es
ist
jedoch wenig
darüber bekannt, wie diese Faktoren ihre sowohl positive als auch
negative Wirkung auf die Zielgene ausüben.
Mit
Gentransferexperimenten,
isolierten
Elemente
Gens
in
die
die
Untersuchungen
eines
vivo erlauben, konnten etliche cis-wirkende
identifiziert
werden,
die
für
die gewebespezifische
Expression eines Gens verantwortlich sind. Als erstes genetisches
Element,
des
das
eine Zellspezifität vermittelt, wurde der Enhancer
IgH-Gens
Banerji
ersten
et
von
al.,l983;
Exons
lymphoiden
IgH-Gen
noch
(Grosschedl
Maus
beschrieben
Mercola
lokalisiert
Zellen
Grosschedl
der
ist,
funktionell
weitere
et
(Gillies et al. ,1983;
al.,l983), der innerhalb des
also 3' vom Promotor und nur in
ist.
Inzwischen konnten für das
Promotorelemente
(Mason
et
al.,l985;
und Baltimore,l985) und sogar intragenische Sequenzen
und
Baltimore,l985)
identifiziert werden, die alle
zur gewebespezifischen Expression dieses Gens beitragen.
11
Weitere
gewebespezifische
folgende
Gene
et
Edlund
Immunoglobulin
et
Aktine
k
al.,l985),
et
(D'Onofrio
et
et
et
al. ,1985),
al.,l985;
und
für
al.,l985),
Mensch
al.,l986), Maus
Hühner Krystalline
Retinol
et
al. ,1986),
von
Binding
a1-Antitrypsin
(Theisen
et
Wachstumshormon
und
Shani,l986);
Mensch
Lysozym
(Godbout
Crew
et
Hayashi et al. ,1985), Maus aA-Krystallin
al.,l985);
a-Foetoprotein
Boulet
Schaffner,l984), Ratten Elastase
al.,l984;
Huhn
al.,l986),
wurden
Ratten Albumin (Ott et al.,l984), Ratten
al.,l985;
(Chepelinsky
al. ,1986;
et
(Picard
(Melloul
(Okazaki
Elemente
entdeckt: Ratten Chymotrypsin und Insulin (Walker
al.,l983;
(Ornitz
cis-wirkende
Ratte
Spindler,l986;
Protein
(Ciliberto et
al.,l986);
Maus
Maus Albumin (Gorski et
und
Mensch
Cattini
et
(Nelson
al. ,1986)
et
Und
Drosophila Dotterprotein 1 (Garabedian et al.,l986).
Einige
dieser
konnten
auf
(Insulin,
Elemente
den
Genen
besitzen
in
Chymotrypsin,
einem
Huhn
Enhancer-Eigenschaften
Bereich
a-Krystallin)
(a-Foetoprotein,Lysozym)
oder
lokalisiert
Gewebespezifität
werden.
Die
von
innerhalb
-300
oder
eines
und
bis -100
sehr weit 5'
Introns
scheint
(IgH)
bei einigen
Genen unabhängig durch Enhancer- und Promotor-Elemente vermittelt
zu
bei
werden
(IgH,
Insulin, Drosophila Dotterprotein), während sie
nur
durch die Kombination beider Elemente erreicht
anderen
wird
(a-Foetoprotein).
Bei
Promotorelement
von
100
gewebespezifisch
regulierte
vielen
bis
200
Genen
bp
ist
ein
ausreichend
kurzes
für
die
Expression (o-Krystallin, Elastase,
Albumin).
Bisher
wurden
beschrieben,
also
die
etliche
Enhancer
und
Regulationselemente
für die gewebespezifische Regulation von Genen
12
verantwortlich sind oder dazu beitragen. Allerdings konnte bisher
kein
genereller
Regulationsmechanismus
Gewebespezifität
System
aus
von
scheint
auf
einem
sehr komplexen
Faktoren und Elementen zu basieren. Ein Ansatz, mehr
Einblick
in
Analyse
eines
solche komplexe Mechanismen zu gewinnen, könnte die
Gens
gewebespezifischen
Untersuchung
in
Genen
beschrieben werden. Die
in
einem
System
der
heterologen,
darstellen,
zum
aber
dennoch
Beispiel
die
gewebespezifischen Regulation eines Froschgens
Säugerzellen.
Möglicherweise
könnten
damit
sehr
wichtige
konservierte Regulationsmechanismen entdeckt werden.
Das
Albumingen,
das
häufigste
Plasmaprotein
in
Vertebraten
(übersichtsart. Rosenoer et al.,l977), stellt ein gutes Modellgen
zur
Untersuchung der gewebespezifischen Regulation und der damit
involvierten
Faktoren
ausschließlich
sezerniert.
wird
im
Albumin
wird
Die
So
mRNA
wird
in
großen
Mengen
Albuminexpression
zu
Säugern
in
einigen Amphibienspezies
durch
verschiedene
Faktoren
erhöht sich während der Metamorphose die Menge an
um
das Zehnfache (Ledford und Frieden,l973); dies
wahrscheinlich durch das Schilddrüsenhormon Trijodothyronin
(T3)
ausgelöst
gezeigt
(Ryffel,
werden,
daß
reduziert (Kazmeier et
Der
Es
nur in einem Gewebe, der Leber, synthetisiert und
Gegensatz
moduliert.
dar.
Krallenfrosch
meisten
anderen
unveröffentlicht).
Östrogen
al~,l985;
Xenopus
die
Albuminsynthese
konnte
drastisch
Wolffeet al. ,1985).
laevis
Vertebraten
Weiterhin
besitzt
im Gegensatz zu den
zwei Albumingene, die für ein 68kd
und
74kd
als
Teil einer Genomduplikation, die vor ca. 30 Millionen Jahren
stattfand,
Albuminprotein kodieren.
verdoppelt
worden
Vermutlich ist das Albumingen
(Bisbee et al. ,1977). Unterstützt
wird
diese Hypothese durch die Klonierung von DNA (cDNA), die zu
zwei
engverwandten
Albumin
mRNAs
komplementär ist (Westley et
13
al.,l98l).
Außerdem
besitzt
Xenopus tropicalis, der vermutlich
dem
diploiden Vorfahren des Xenopus laevis sehr ähnlich ist, nur
ein
Albumin
mit
einem
Molekulargewicht vom 68kd (Bisbee,l977;
Westley und Weber,l982).
Nach
dieser
Gene
so
Genomduplikation haben sich die beiden entstandenen
auseinander
unterschiedlichen
exprimiert
beiden
74kd
entwickelt,
daß sie nun für zwei Proteine
Molekulargewichts kodieren und unterschiedlich
werden.
Der
Unterschied
im Molekulargewicht dieser
Proteine ist hauptsächlich darauf zurückzuführen, daß das
Albumin im Gegensatz zum 68kd Albumin glykosyliert ist. Das
Translationsprodukt
des
als
Albumins
das
des
68kd
74kd
Albumin ist nur gerigfügig größer
(Westley und Weber,l982). Das 74kd
Albumin ist im Blut des Xenopus laevis zweimal häufiger vertreten
als
das
68kd
Albumin,
was
darauf zurückzuführen ist, daß die
Leber zweimal mehr 74kd mRNA enthält (Westley et al. ,1981).
Um
die Regulation dieser Albumingene und ihre Unterschiede genau
zu
untersuchen
wurden
Elektronenmikroskopische
beide
Gene
isoliert (May et al. ,1982).
Untersuchungen
der
Gene
zeigten, daß
beide 15 Exons besitzen. Die Größen der sich entsprechenden Exons
beider Gene sind jeweils fast identisch und sehr ähnlich zu denen
der
Säugergene.
Muster
Für die Xenopus Albumingene wurde ein ähnliches
an wiederholten Exonbereichen gefunden, das bereits schon
für das Maus Albumingen entdeckt wurde (May et al. ,1983):
Albumingen
bestehen
die
mittleren
12
der
Im Maus
15 Exons aus einer
dreifachen Wiederholung von 4 Exons (Kioussis et al.,l98l). Durch
Sequenzierung
werden,
Bereiche
daß
den
(Jagodzinski
vermutet,
dieser Bereiche im Rattenalbumingen konnte gezeigt
diese
drei
aus
4
Exons bestehenden wiederholten
drei Strukturdomänen des Serumalbumins entsprechen
et
al., 1981). Aufgrund der Aminosäuresequenz wird
daß Albumin aus zwei intragenischen Duplikationen einer
14
primitiven Domäne hervorgegangen ist (Brown,l976).
Die
Albuminvorläufergene der Amphibien und der Säuger haben sich
wahrscheinlich erst nach der Evolutin der 15 Exon-Struktur weiter
auseinander
eine
entwickelt (May et al. ,1983). Bei den Säugern folgte
Genomduplikation,
a-Foetoproteingen
beim
durch
entstanden
Ur-Xenopus
die
das
heutige
Albumingen und
sind (Ingram et al. ,1981), während
eine Genomduplikation zur Entstehung der beiden
Albumingene des Xenopus laevis führte.
Bei
den
Säugern
werden
a-Foetoproteingene
Im
Foetus
die
beiden engverwandten Albumin- und
entwicklungs- und gewebespezifisch reguliert.
ist
das
a-Foetoprotein
der
Amnionflüssigkeit
das
sowohl
in
Geburt
sinkt im Serum der Anteil an a-Foetoprotein drastisch ab,
während
die
Albuminsynthese
Albumin
die
Rolle
des
als
vorherrschende Protein
auch
im Serum. Nach der
um ein Vielfaches ansteigt und das
a-Foetoproteins
als
Hauptserumprotein
übernimmt (übersichtsart. Tilghman,l985).
Beim
Xenopus
laevis
werden
die
beiden
gewebespezifisch in der Leber exprimiert.
Albumingene ebenfalls
15
Ziel
die
meiner
Dissertation
war die Definition von DNA-Elementen,
die gewebespezifische Expression der Albumingene des Xenopus
laevis vermitteln.
Um
solche
cis-wirkende
Elemente zu erfassen, mußte zunächst im
ersten Teil meiner Arbeit, das 5'Ende beider Gene charakterisiert
werden.
Durch
Untersuchungen
und
Sequenzierung
der
Exonsequenzen
sollten
und
auf
diesen Daten basierenden
Albumin mRNAs in vivo sollten Promotorregion
kartiert
werden.
Anhand
der
Sequenzdaten
auch Aussagen über die Verwandtschaft der beiden Xenopus
Albumingene
untereinander
und
zu
den
Albumin-
und
a-Foetoproteingenen der Säuger gemacht werden können.
Aufgrund
es
der erhaltenen Daten über die Feinstruktur der Gene war
schließlich
Hybridgene
möglich Albuminhybridgene zu konstruieren. Diese
wurden
dann
im
zweiten
Teil
der
Arbeit
zur
Identifizierung von Regulationselementen für die konstitutive und
gewebespezifische Expression der Gene eingesetzt.
16
MATERIALIEN
1. Chemikalien, Radioisotope und Arbeitsmittel
Acetyl Coenzym A
Pharmacia,
Acrylamid
Serva, Heidelberg
Actinomycin D
Sigma, München
Agarose Typ II,
Typ IV
Freiburg
Sigma, München
Alkalische Phosphatase (CIP)
Boehringer, Mannheim
Ammoniumperoxodisulfat
BioRad, München
Ampicillin
Sigma, München
Bacto-Agar
Difco Laboratories, Detroit
Bacto-Hefeextrakt
Difco Laboratories, Detroit
Bacto-Trypton
Difco Laboratories, Detroit
Bakterienplatten (9cm)
Greiner,
Bal31-Exonuklease
Gibco-BRL, Karlsruhe
Biogel P60
BioRad, München
Caesiumchlorid
Biomol,
Diethylpyrocarbonat
Sigma, München
desoxy-Nukleosidtriphosphate
Boehringer, Mannheim
didesoxy-Nukleosidtriphophate
Boehringer, Mannheim
Dimethyldichlorsilan
Fluka, Neu-Ulm
Dimethylsulfoxid
Fluka, Neu-Ulm
Dithiothreitol
Gibco-BRL, Karlsruhe
DNA Sequencing Kit
New England Nuclear, Dreieich
DNase (RQl, RNase frei)
Genofit, Heidelberg
DNA Polymerase I
New England Biolabs, Schwalbach
(Klenow)
Nürtigen
Ilvesheim
Ethidiumbromid
Sigma, München
Eucaryotic Transcription System
Gibco-BRL, Karlsruhe
17
Gibco, Karlsruhe
FCS
Fluka, Frankreich
Folin-Reagenz
Merck, Darmstadt
Glasplatten für Elektrophorese
Renner, Dannstadt
Haftsilan
Wacker Chemie, München
Harnstoff
BioRad, München
HE PES
Sigma, München
Kieselgel-DC-Platten
Machery und Nagel, Düren
Lachs-Spermien DNA, Typ III
Sigma, München
Linker-DNA
New
Lysozym
Boehringer, Mannheim
Mikrotiterplatten
Greiner, Nürtingen
M-MLV Reverse Transkriptase
Gibco-BRL, Kerlsruhe
Ml3-Pentadecamer (Primer)
New England Biolabs, Schwelbach
MS 222
Sigma, München
NACS-Prepac-Säulen
Gibco-BRL, Kerlsruhe
Nitrozellulose-Filter
Schleicher
N,N'-Methylen-bisacrylamid
BioRad, München
Nukleosidtriphosphate
Boehringer, Mannheim
Penicillin/Streptomycin
(lOU/~1)
England Biolabs, Schwelbach
~
Schüll, Dassel
Gibco, Kerlsruhe
Polyethylenglycol
Sigma, München
PIPES
Sigma, München
Proteinase K
Merck, Darmstadt
PVP
Sigma, München
Quickszint
Zinsser, Frankfurt
Restriktionsendonukleasen
ABL, Basel
Boehringer, Mannheim
Gibco-BRL, Kerlsruhe
Promega Biotec, Heidelberg
Pharmacia, Freiburg
18
RNase A
Boehringer, Mannheim
RNase T1
Sigma, München
RNasin
Promega Biotec, Heidelberg
transfer-RNA (Kalbs-Leber)
Boehringer, Mannheim
SP6 RNA-Polymerase
New England Biolabs,Schwalbach
T4 DNA-Ligase
Boehringer, Mannheim
T4 Polynukleotid-Kinase
New England Biolabs,Schwalbach
TEMED
BioRad, München
Tris
Sigma, München
Trypsin
Gibco, Karlsruhe
Whatman GF/C-Filter
Bender und Hobein, Karlsruhe
Whatman 3MM Papier
Bender und Hobein, Karlsruhe
Zellkulturschalen
Falcon, Becton u. Dickinson,
Heidelberg
D-threo-(dichloroacetyl-l-l4C)-
Amersham Buchler,Braunschweig
Chloramphenicol(7.4MBq/ml,
1.96 GBq/mmol)
~-32p
ATP(370MBq/ml,>l85 TBq/mmol) Amersham Buchler,Braunschweig
a-32p
GTP(370MBq/ml,>l5 MBq/mmol)
a-32p
UTP(370MBq/ml,>llO MBq/mmol) Amersham Buchler,Braunschweig
a-35SdATP(296MBq/ml,>l4.8TBq/mmol)
Amersham Buchler,Braunschweig
Amersham Buchler,Braunschweig
19
2. Bakterien und Zellen
Bakterien und Phagen
E. coli RRl Ml5
F-, hsd 820, ara-14, pro A2, lac Yl, ton A21,
sup E44,
,_-;
erhalten von U. Rüther, Heidelberg
E. coli 71/18
F' ,
lacJ,
lacz,
Ml5, pro+, sup E;
erhalten von R. Cortese, Heidelberg
Phage IR-I
erhalten von R. Cortese, Heidelberg
Eukaryontische Zellen
BWIJ
Subklon
der Maus Hepatoma-Zellinie BW (Szpirer
und Szpirer,l975), isoliert von Cassio und
Weiss (1979)
erhalten von M.C. Weiss, Paris
Maus-L-Zellderivat, Thymidinkinase-Defekt,
tumorigen
erhalten von N. Hynes, Bern
NIH 3T3
entspricht der 3T3-Zelle der American Type
Culture Collection; zeigt Dichte-abhängige
Wachstumskontrolle
erhalten von P. Gruss, Heidelberg
20
3. Kulturmedien
L-Broth:
2% Bacto-Trypton, 0.5% Bacto-Hefeextrakt, l% NaCl
SOB-Medium:
0.5% Bacto-Hefeextrakt, 2% Bacto-Trypton,
2.5mM KCl,
10 mM MgCl2,
lOmM NaCl,
lOmM MgS04
SOC-Medium:
SOB mit 20mM Glucose
EMB-Agar:
1% Bacto-Trypton, 0.1% Bacto-Hefeextrakt, 0.5% NaCl,
2%
Lactose, 0.05% K2HP04, 0.1% Eosin Y, 0.0016% Methylen-
blau, 1.5% Bacto-Agar
Minimal-Platten:
l% K2HP04
1
0.45% KH2P04, 0.1% (NH4)2S04, 1.05%
NaCitratx2H20; 0.02% MgS04, 0.0005% Vitamin B1,
0.01% Casaminoacids, 0.1% Glycerin, 1.5% Bacto-Agar
Bakterien-Selektionsmedium:
L-Broth mit
lOO~g/ml
Ampicillin
Kulturmedium für BWIJ-Zellen:
modifiziertes Ham Fl2 Medium (Coon and Weiss,l969) mit
5% FCS,
l% Penicillin/Streptomycin
Kulturmedium für LTK-- und NIH3T3-Zellen:
DMEM, 10% FCS,
1% Penicillin/Streptomycin
21
METHODEN
ALLGEMEINE ARBEITSMETHODEN
1. Bestimmung von Nukleinsäurekonzentrationen
Die
Konzentration
wurde
über
Spektrum
deren
von
entsprechen
von
320
50~g/ml
Oligonukleotid
DNA.
Verunreinigung
der
Nukleinsäuren
optische
Dichte
bis
nm
220
in
bestimmt.
aufgenommen.
doppelsträngige DNA,
Aus
dem
einer wäßrigen Lösung
Verlauf
Nukleinsäurelösung
Dazu
wurde
ein
Einer
OD2eo
=1
40~g/ml
des
RNA oder
Spektrums
ersichtlich:
20~g/ml
wird die
die
OD2ao
sollte höchstens 70% der OD2eo betragen.
2. Extraktion von Nukleinsäuren
Zur
Trennung
der
Nukleinsäuren
von
Proteinen
führt man eine
Phenol/Chloroform-Extraktion durch.
Das
Extraktionsvolumen
sollte
Volumen
nukleinsäurehaltige
Volumen
Phenol
5mM
EDTA)
(24:1)
und
mindestens
Lösung
wurde
50~1
mit
betragen.
einem
Ein
gleichen
(gesättigt mit lOOmM Tris-HCl pH7.5 ,lOOmM NaCl,
einem gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol
kräftig
nukleinsäurehaltige
durchgemischt
Oberphase
und
wurde
kurz
noch
Volumen Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert.
zentrifugiert.
Die
zweimal mit gleichem
22
3. Fällung von Nukleinsäuren
Die nukleinsäurehaltige Lösung wurde mit NaAc pH4.8 oder mit NaCl
auf
eine
Volumen
Endkonzentration
absolutem
versetzt.
-80°C
Nach
oder
Ethanol
0.2M gebracht und mit 2.5fachem
Ethanol oder mit gleichem Volumen Isopropanol
einer angemessenen Inkubationszeit von 30min bei
über
Nukleinsäuren
von
Nacht
lOmin
bei
bei
-20°C
8800xg
wurden
die
ausgefallenen
abzentrifugiert,
in
80%igem
gewaschen, nochmals zentrifugiert und anschließend unter
Vakuum getrocknet.
DNA KLONIERUNGSTECHNIKEN
1. Restriktionsverdau
Eine
Enzymeinheit
Lambda
Phagen
~g
ist
DNA
in
wurde
pro
einen
vollständigen
Ausnahmen
O'Farrells
KAcetat,
BSA)
einer
2-~facher
Verdau
für
die
lOmM
bei
MgAcetat,
37°C
DNA.
individuell
eingehalten.
als
die Menge Enzym, die
zu
überschuß an Enzym verwendet, um
gewährleisten.
meisten
(3.3mM
Enzyme
~erwendet.
Das
als
Bis
lO~g/ml
Volumen
auf wenige
Reaktionspuffer
TrisAcetat
0.05mM DTT und
Ansonsten
l~g
Stunde vollständig verdaut. Meist
Universalpuffer
verdauender
Enzym
DNA ein
wurde
definiert
pH7.9,
6.6mM
nuklease-freies
betrug
10~1/~g
zu
wurden die vom Hersteller für jedes
empfohlenen
Puffer- und Reaktionsbedingungen
23
2. Herstellung von Bal3l-Deletionen
25~g
geschnittene
und
gereinigte
Bal3l-Puffer
(l2mM CaCl2,
Tris-HCl
8.1)
pH
30s-Abständen
diese
wurden
wurden
mit
versetzt.
Auf
erhalten,
deren
Variation
der
große
mit
wurde in
300~1
lmM EDTA, 20mM
6 Einheiten Bal3l bei 37°C inkubiert.
EGTA
Reaktionsgemisch
zu
Weise
Größen
einer
je
75~1
Endkonzentration
In
entnommen;
von
20mM
wurden Deletionen von 4 Zeitpunkten
sich
um ca.
lOOBp unterschieden. Durch
Zeitabstände konnten entsprechend unterschiedlich
Deletionen
wurden
DNA
l2mM MgCl2, 600mM NaCl,
dem
diese
Plasmid
erzielt
anschließend
werden. Die deletierten DNA-Fragmente
durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion und
nachfolgende Ethanolfällung gereinigt.
3.
Auffüllen von 5'Uberhängen
l~g
gereinigte Plasmid-DNA wurde in
MgCl2,
50mM
NaCl,
(Klenow-Fragment)
anschließend
mit
Raumtemperatur
pH8.0
lmM
für
DTT
5min
0.5~1
mit
bei
dNTP-Mix
10~1
7mM Tris-HCl pH7.5, 7mM
0.2-0.5U
DNA-Polymerase
Raumtemperatur
(lOmM
Durch
vorinkubiert,
dNTPs). Nach 30min bei
wurde die Reaktion durch Zugabe von
abgestoppt.
I
Phenol-Extraktion
und
1~1
0.2M EDTA
anschließende
Extraktion mit Ether wurde die DNA gereinigt, und schließlich mit
Ethanol ausgefällt.
4.
Dephosphorylierung von DNA
4.1. 5'Uberhänge
Restriktionsverdaute,
alkalischer
Phosphatase
gereinigte
aus
DNA
Kälberdarm
wurde
in
mit
50~1
4
Einheiten
50mM Tris-HCl
24
pH9.0,
lmM
inkubiert.
MgCl2,
Nach
O.lmM
ZnCl2,
lmM
Spermidin 60min bei 37°C
der Hälfte der Inkubationszeit wurden weitere 4
Einheiten Enzym zugegeben.
4.2. 3'überhänge und blunt end DNA (DNA mit stumpfen Enden)
Die
Inkubation
nach
erneuter
erfolgte l5min bei 37°C gefolgt von l5min 56°C
Enzymzugabe
wurde
dies
noch einmal wiederholt.
Sonst waren die Bedingungen wie oben beschrieben.
5. Auftrennung von DNA-Fragmenten
Zur
Auftrennung
(Fragmente
je nach Größe der Fragmente Agarosegele
wurden
größer
als
0.6kb) oder Polyacrylamidgele (Fragmente
kleiner alß 0.6kb) verwendet.
5.1. Agarosegel
0.8% bis 2% Agarose Typ II oder Typ VII (low gelling temperature)
wurden in 50ml Laufpuffer (40mM Tris-HCl,
pH8.2)
durch
Ethidiumbromid
große
zum
Kammer
Auftrag
überschichtet.
Erhitzen
lmM EDTA,
20mM NaAcetat
gelöst und der Gellösung wurden
0.3~g/ml
zugesetzt. Die Gellösung wurde in eine 7.5xl3.5cm
gegossen und mit Hilfe eines Kammes wurden Taschen
der Proben ausgespart. Das Gel wurde mit Laufpuffer
Die
Auftrennung erfolgte bei 50-lOOV. über einem
UV-Lichtkasten (320nm) konnten die DNA-Fragmente sichtbar gemacht
und photographiert werden.
5.2. Polyacrylamidgel
Es
wurden 6%ige Acrylamidgele aus einer Stammlösung mit 29 Gew.%
Acrylamid
und l Gew.% N,N'-Methylenbisacrylamid hergestellt.
Endkonzentrationen
EDTA
pH
im Gel waren:
90mM Tris,
Die
90mM Borsäure, 2.5mM
8.3 , 0.03% TEMED und 0.07% Ammoniumperoxodisulfat. Die
25
Gele
waren
groß
l2xl5cm
Gelapparatur
entsprach
Elektrophorese
der
und
O.lcm
Vorschrift
dick.
Die
verwendete
von Studier (1972). Die
in 90mM Tris, 90mM Borsäure, 2.5mM EDTA
erfolgte
pH8.3 bei l20-300V. Nach der Elektrophorese wurden die Gele l5min
in
l~g/ml
Laufpuffer mit
Ethidiumbromid gefärbt, um dann die DNA
im UV-Licht sichtbar zu machen.
Für
beide
Gelarten
wurden die DNA-Proben in 10% Glycerol,
lOmM
EDTA, 0.1% SDS und 0.02% Bromphenolblau aufgetragen.
6.
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Gelen
6.1. aus Agarosegelen
Die
DNA
wurde
temperature)
in
einem
aufgetrennt.
Agarosegel
Das
Typ
VII
(low
gelling
Gelstück mit dem zu isolierenden
Fragment wurde ausgeschnitten und lOmin bei 68°C geschmolzen, mit
dem
4fachen
EDTA)
versetzt
Anschließend
NACS
in
und
wurde
nochmals
die
lOmin
bei
68°C
lmM
inkubiert.
Lösung auf 42°C abgekühlt und über eine
Prepac Säule geschickt. Die Säule war zuvor mit 3ml 2M NaCl
TE
hydratisiert
worden.
von
und
mit
5ml
Bindungspuffer
äquilibriert
Der Bindungspuffer bestand für doppelsträngige Fragmente
weniger als lkb Größe aus 0.2M NaCl in TE und bei Fragmenten
größer
über
als lkb aus 0.5M NaCl in TE. Die DNA-Lösung wurde zweimal
die
Säule
reinigende
wurde.
100~1
geschickt,
Fragment
Anschließend
Bindepuffer
mit
Volumen 0.25M NaCl in TE (lOmM Tris-HCl pH 8.0,
800~1
sicherzustellen,
daß
das
zu
möglichst quantitativ an die Säule gebunden
wurde
gewaschen.
Elutionspuffer
um
die
Säule
mit
5x
lml 42°C warmem
Das gebundene Fragment wurde dann mit 4x
(lM
NaCl oder 2M NaCl in TE) abgelöst und
Isopropanol gefällt.
26
6.2. aus Polyacrylamidgelen
Die
DNA wurde über Nacht bei 50°0 (Oligonukleotide bei 37°0) aus
dem
Gelstück
anschließend
in
0.2M
über
NaCl
eine
in
NACS
TE
oder
in
H20
eluiert und
Prepac Säule wie oben beschrieben
gereinigt.
7.
Ligation
7.1.
in wäßriger Lösung
Die
DNA-Fragmente
gemischt
und
mit
wurden
0.1
in
einem
Einheiten
T4
versetzt. Die Inkubation erfolgte in
lOmM
7.2.
MgCl2,
250~g/ml
molaren Verhältnis von 1:1
DNA Ligase pro pmol Enden
20-50~1
20mM Tris-HCl pH7.5,
BSA und 3mM ATP bei 15°0 für mindestens 3h.
im Agarosegel
Häufig
wurden die DNA-Fragmente nicht erst aus dem Gel isoliert,
sondern
noch im Gel ligiert.
Dazu wurden die DNAs in Agarose Typ
VII (low gelling temperature) aufgetrennt, ausgeschnitten und die
miteinander
zu
ligierenden
Fragmente
zusammengegeben.
Anschließend wurden die Gelstücke lOmin bei 68°0 geschmolzen, auf
42°0
abgkühlt,
versetzt.
wie
mit
Reaktionspuffer
und
mit
T4
DNA
Ligase
Die Reaktion erfolgte unter sonst gleichen Bedingungen
oben
beschrieben
nur
in
einem
etwas
größeren
Volumen
(50-150~1).
7.3.
l~g
Ligation von Linkern
Linker
Anwesenheit
in
10~1
wurden
mit
5
Einheiten
Polynukleotidkinase
in
von lOmM ATP phosphoryliert. Die Inkubation erfolgte
70mM Tris-HCl pH7.6,
lOmM MgCl2 über 60min bei 37°0.
27
2~1
dieser phophorylierten Linker wurden zu l~g gereinigter blunt
end
DNA
10~1
70mM Tris-HCL pH 7.5, 7mM MgCl2, 0.07mM ATP mit 1 Einheit T4
DNA
gegeben.
Ligase.
Die
Um
Reaktionsmischung
einen
doppelte
die
Dazu
Enzym
anschließend
zu
inaktivieren,
lOmin
die
abgekühlte
die
bei 68°0 inkubiert. Durch
Restriktionsverdau
wurde
wurde
wurden die Linkerketten
Reaktionslösung
auf das
Volumen gebracht und mit konzentriertem Enzympuffer auf
für
das
jeweilige
Salzkonzentration
40-60
das
nachfolgenden
getrimmt.
Ligation erfolgte über Nacht bei 15°0 in
gebracht.
Restriktionsenzym
Der
Restriktionsverdau
notwendige
wurde
mit
Einheiten Enzym über 3h durchgeführt. Auf einem Agarosegel
wurde die DNA von den überschüssigen Linkern abgetrennt.
8. Klonierung von Oligonukleotiden
Die Oligonukleotide wurden auf einem Gene Assembler von Pharmacia
nach
Gebrauchsanweisung
Olignukleotide
Kassette
wurden
losgelöst.
synthetisiert.
über
Je
Nacht
in
1~1
Oligonukleotidlösungen
Vakuumzentrifuge
getrocknet
3mM
MgCl2
gelöst.
und in
synthetisierten
lml 25% Ammoniak aus der
der
ammoniakalischen
Die
100~1
beiden
komplementären
wurden
zusammen in der
6.25mM Tris-HCl pH8.5,
Davon wurde eine 1:50 Verdünnung im gleichen
Puffer zur Annealing-Reaktion auf 100°0 gebracht und anschließend
langsam auf 30°0 abkühlen lassen.
wurden
ligiert.
mit
lOOng
Vektor in
40~1
2~1
von diesem Annealing-Ansatz
Volumen nach Standardprotokoll
28
9. Transformation von Bakterien
Je
nach
Klonierungsabsicht
Bakterienstamm
protokolle
erwiesen
als
sich
optimal.
Zur
Transformationseffizienz
Deletionen)
und
dem
entsprechend
verwendeten
unterschiedliche TransformationsErzielung
(z.B.
zur
einer
besonders hohen
Klonierung
von
Bal3l-
wurden Bakterien des Stammes E.coli RRI Ml5 nach dem
Protokoll
von
Hanahan
Transformation
von
einzelsträngiger
(1983)
transformiert.
sauberer Plasmid DNA (z.B.
Während
zur
zur Gewinnung von
DNA) Bakterien des Stammes E.coli 71/18 mit der
CaCl2-Methode (Cohen et al. ,1973) transformiert wurden.
9.1.
Eine
nach Hanahan (1983)
Einzelkolonie
überimpft
und
inkubiert.
verdünnt
Dann
Ml5
Nacht
bei
37°C unter konstantem Schütteln
über
und
wurde
in
lOml SOB-Medium
bis zu einer ODsso von 0.45-0.55 wachsen gelassen.
die
Bakterien
abzentrifugiert.
pH6.2,
HexaminCoCl3)
erneutem
Das
lOOmM
RbCl,
resuspendiert
und
weiterhin
wurden
die
28~1
und weiteren
in lOml Portionen bei 4°C und 670xg
Bakteriensediment wurde in 3.3ml TFB (lOmM
Abzentrifugieren
aufgenommen
Abständen
RRI
Am nächsten Tag wurden davon O.lml in 50ml SOB-Medium
wurden
K-MES
E.coli
45mM
MnCl2,
und
3mM
und l0-l5min auf Eis gehalten.
Nach
wurden
auf
Eis
Zellen mit je
die
lOmM
CaCl2
Zellen
in
0.8ml
inkubiert~
In
5minütigen
28~1
DTT -(2.25M)
28~1
DMSO,
TFB
DMSO versetzt.
210~1
dieser
eines
Ligationsansatzes ( mit höchstens lOOng DNA ) versetzt und
30m in
auf
42°C
Eis
nun
kompetenten
Bakterienzellen wurden mit
2-5~1
gestellt. Anschließend wurde das Gemisch 90s bei
und l-2min bei 37°C inkubiert. Dann wurden 0.8ml SOB-Medium
29
zugegeben
und
konstant
der
Transformationsansatz
geschüttelt.
Bakterienzellen
SOB-Medium
wurde
60min bei 37°C
Nach Zugabe von 2ml SOC-Medium wurden die
5min
bei
resuspendiert
670xg
abzentrifugiert,
in
0.2ml
und auf Selektivagarplatten über Nacht
bei 37°C inkubiert.
9.2. nach der CaCl2-Methode
Eine
Einzelkolonie
hochwachsen
LB-Medium
von
1500xg
gelassen.
verdünnt
0.2
wurde
über Nacht in lOml LB-Medium bei 37°C
lml dieser Obernachtkultur wurde in lOOml
und anschließend bei 37°C bis zu einer ODsso
inkubiert. Die Bakterienzellen wurden lOmin bei 4°C mit
abzentrifugiert,
in
eiskaltem lOOmM CaCl2 resuspendiert
und 30min auf Eis stehen gelassen. Nach erneutem Abzentrifugieren
wurden
die
Bakterienzellen
in
lml
eiskaltem
lOOmM
CaCl2
aufgenommen.
Zur
Transformation
10-lOOng
eines
100~1
der
transformierenden
kompetenten
Zellen
mit
DNA oder mit 10 und 40 Vol%
15min auf Eis inkubiert. Dann wurde der
2min auf 37°C erwärmt, mit 0.5ml LB-Medium versetzt, 2min
42°C
Top-Agar
auf
zu
Ligationsansatzes
Ansatz
bei
der
wurden
und schließlich 45min bei 37°C inkubiert. Mit Hife von
(0.8% Agar in H20) wurden die transformierten Bakterien
Selektivagarplatten
aufgebracht
und
über
Nacht
bei 37°C
inkubiert.
10. Präparation von einzelsträngiger DNA aus rekombinaten
EMBL-Plasmiden (Dente et al. ,1983)
Bakterien
des
Stammes E.coli Kl2 71/18 wurden mit den Plasmiden
nach dem oben beschriebenen Protokoll transformiert,
bei
der
Herstellung
der
kompetenten
Zellen
jedoch wurde
von
einer
30
Einzelkolonie
ausgegangen,
gewachsen
war.
wachsen,
die
Auf
noch
Prolinsynthese
gespeichert.
die
zu
diese
auch
das
Gen
die
Glucose/Minimalagarplatten
können
Plasmid
nur solche Bakterien
besitzen,
das
ein
trägt.
Auf
diesem
Information
für
die
für
die
Plasmid
ist
F-Pili-Synthese
Durch die Vorselektion wird also gewährleistet, daß
transformiereden
F-Pili
können
mit
deren
werden,
auf
Minimalmedium
nötiges
gleichzeitig
die
pEMBL-Plasmiden
Bakterien
die
Bakterien
Hilfe
von
DNA
von Messing,
F-Pili besitzen. über
mit Helferphagen infiziert
dann
einzelsträngige
(siehe übersichtsart.
alle
den
transformierten
synthetisiert
werden kann
1983).
10.1 Titration und Vermehrung der Helferphagen
Eine
Stocklösung
LB-Mediurn
Kultur,
von
IR-I
Phagen
wurde
in lOer Schritten in
verdünnt und mit 0.2ml einer frischen E.coli Kl2 71/18
die
bis
EMB-Agarplatten
zu
einer
(Marvin
and
ODsso
von
Hohn,
0.2
gewachsen war, auf
1969) ausgestrichen. Dieser
farbstoffenthaltende Agar erwies sich als besonders geeignet, die
kleinen trüben Phagenplaques besser sichtbar zu machen.
Zur
Herstellung
Plaque
(auf
inkubiert
und
eines größeren Phagenstocks wurde ein einzelner
E.coli
Kl2
71/18)
anschließend
in
mit
200ml
lml LB-Mediurn 3h bei 37°C
LB-Medium verdünnt.
Nach
einer Übernachtinkubation bei 37°C wurden die Bakterienzellen bei
3500xg
abzentrifugiert,
der
die
Phagen
enthaltende überstand
titriert und schließlich bei 4°C aufbewahrt.
10.2. Gewinnung der einzelsträngigen DNA
Von
einer
rekombinanten
Bakterienkolonie
wurde
eine
5ml
31
Obernachtkultur in LB-Medium mit lOO~g/ml Antibiotikum angesetzt.
Davon
wurden
verdünnt
wurden
20
und
die
mit
und
bis
auf 5ml LB-Medium mit
lOO~g/ml
Antibiotikum
zu einer ODsso von 0.2 wachsen gelassen. Dann
Zellen mit einer MOI (multiplicity of infection) von
dem
6h
Ansatz
O.lml
Helferphagen IR-I infiziert ( ca. 4xl09 Phagen/ml )
unter Schütteln weiterinkubiert. Anschließend wurden pro
je
2x
l.5ml
Bakterien-
und
Phagensupension lOmin bei
8800xg zentrifugiert, der überstand wurde abgenommen, ein zweites
Mal
zentrifugiert
20%
PEG,
2.5M
Raumtemperatur
150~1
und l.2ml dieses Oberstandes wurden mit
NaCl
versetzt.
wurden
die
Nach
lOmin
Phagen
Inkubation
lOmin
bei
bei
8800xg
abzentrifugiert, der Überstand wurde vorsichtig abgekippt und die
präzipitierten Phagenpartikel wurden nochmals kurz zentrifugiert.
Mit
einer
ausgezogenen
überstand
vorsichtig
Tris-HCl
pH
8.0,
Raumtemperatur
lOmM
EDTA)
die
einzelsträngige
Chloroform
O.lmM
100~1
wurde
der
restliche
entfernt. Das Sediment wurde in 200~1 lOmM
lösen
Extraktion mit
Pasteurpipette
EDTA
aufgenommen
gelassen.
Anschließend
und
30-60min
wurde
bei
durch eine
Phenol (gesättigt mit lOOmM Tris-HCl pH 9.0,
Proteinhülle
DNA
der Phagen entfernt. Die wäßrige,
enthaltende,
Oberphase
wurde 2x mit
200~1
extrahiert. Die einzelsträngige DNA wurde schließlich
in Gegenwart von 0.4M LiCl mit 2.5 Volumen Ethanol über Nacht bei
-20°0
DNA
ausgefällt. Nach lOmin Zentrifugation mit 8800xg wurde die
noch
einmal
dann in 30
~l
mit
80%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und
lOmM Tris-HCl
p~R.O,
O.lmM EDTA aufgenommen. Um die
Ausbeute an einzelsträngiger DNA und deren Qualität abzuschätzen,
wurden
5~1
der
DNA-Lösung
auf
einem
l%igem
Agarosegel
aufgetrennt. Das Verhältnis der produzierten einzelsträngigen DNA
zur Helferphagen DNA sollte 2:1 betragen.
32
11. Präparation von Plasmid-DNA aus rekombinanten Bakterien
11.1. Präparation kleiner Mengen Plasmid-DNA
1.5ml
einer
wurden
mit
100~1
Tris-HCl
Anschließend
SDS)
Plasmid-DNA
200~1
wurden
und
8800xg
Ampicillin)
50mM Glucose,
lOmM EDTA und
pH8.0) resuspendiert und 30min auf Eis inkubiert.
zugegeben,
versetzt
35~g/ml
8800xg zentrifugiert. Das Bakteriensediment wurde in
Lysozymlösung (2mg/ml Lysozym,
25mM
mit
Übernachtkultur (in L-Broth mit
5min
alkalische SDS-Lösung (0.2M NaOH,
stehen
gelassen,
60 min auf Eis inkubiert.
wurde
der
überstand
150~1
mit
l%
3M NaAcetat
Nach 5min Zentrifugation
mit lml Ethanol versetzt, die
30min bei -80°C ausgefällt und schließlich lOmin mit
8800xg abzentrifugiert. Das Sediment wurde in
100~1
50mM Tris-HCl
pH8.0,
lOOmM NaAcetat aufgenommen und erneut mit Ethanol gefällt.
Nach
lOmin
Inkubation
abzentrifugiert,
Tris-HCl pH8.0,
unter
bei
-80°C
Vakuum
wurde
getrocknet
die
und
Plasmid
in
DNA
50~1
lOmM
O.lmM EDTA aufgenommen.
11.2. Präparation von großen Mengen Plasmid DNA (Birnboim und
Doly,l979)
200ml
einer
Bakterien Übernachtkultur wurden bei 4°C mit 3600xg
abzentrifugiert.
aufgenommen,
SDS-Lösung
15ml
3M
Das
30min
Zellsediment
auf
Eis
wurde
inkubiert,
in lOml Lysozymlösung
mit
20ml
alkalischer
versetzt, 5min weiterinkubiert und schließlich wurden
NaAcatat pH4.8 zugegeben. Nach 60min Inkubation auf Eis
wurden die Zellfragmente und die hochmolekulare DNA lOmin bei 4°C
mit
16800xg
Ethanol
abzentrifugiert.
Der
überstand
versetzt und 30min bei -80°C inkubiert.
wurde
mit
lOOml
Die ausgefallene
33
Plasmid
in
DNA
lOml
wurde lOmin bei 4°C mit 10800xg abzentrifugiert und
50mM
Nochmals
Tris-HCl
wurde
schließlich
DNA-Lösung
die
in
50mM
wurde
pH8.0,
lOOmM
Plasmid-DNA
Tris-HCl
CsCl
NaAcetat
mit
pH8.0,
resuspendiert.
Ethanol
gefällt
lmM EDTA aufgenommen.
und
Zur
zu einer Endkonzentration 4.2M und 0.5ml
einer Ethidiumbromidlösung (lOmg/ml) gegeben . Diese Lösung wurde
in
einem
Beckman
zentrifugiert.
aus,
Vertikalrotor
Durch
das
CsCl
Typ
65
16h
mit
55000rpm
bildete sich ein Dichtegradient
in dem die Plasmid-DNA von der verbliebenen genemischen DNA
entsprechend ihrer verschiedenen Auftriebsdichten getrennt wurde.
Die
plasmidhaltige
erneut
wurde
unter
die
verdünnt,
Bande
denselben
wurde mit einer Spritze abgezogen und
Bedingungen
plasmidhaltige
Bande
6h zentrifugiert. Wiederum
abgezogen,
mit
2 Volumen HzO
dreimal mit HzO gesättigtem Butanol extrahiert und ohne
Salzzugabe mit Ethanol gefällt.
11.3. Spezielle Präparation von Plasmid-DNA zur Transfektion von
eukaryontischen Zellen (Maniatis et al. ,1982)
0.5ml einer Übernachtkultur wurden in 500ml LB-Medium mit
35~g/ml
Antibiotikum angeimpft und .bis zu einer ODsoo von 0.6-0.7 wachsen
gelassen.
Dann
Tetrazyklin
zugegeben.
wurde,
für
um die Plasmide zu amplifizieren,
CAT-Plasmide
Nach
Inkubation
170~g/ml
oder
bei
37°C
über
lO~g/ml
Chloramphenicol
Nacht
wurde
Bakteriensuspension lOmin bei 4°C mit 3600xg abzentrifugiert.
Sediment
wurde
aufgenommen,
mit
5ml
in
5ml
lOmin
70°C
wurden
Tris-HCl
pH8.0,
25%
Das
Saccharose
in ein Polyallomer-Zentrifugenröhrchen überführt und
2mg/ml Lysozym,
Nach
50mM
die
lOOmM EDTA,
0.1% Triton X-100 versetzt.
Inkubation bei Raumtemperatur und weiteren lOmin bei
Zentrifugation
die
Zellfragmente
von der Plasmid-DNA durch 60min
im Heckmanrotor SW40 oder SW40.1 bei 40000rpm und
34
4°C
getrennt.
Aus
20%
PEG,
bei
Raumtemperatur
1M NaCl in TE (lOmM Tris-HCl pH8.0,
zentrifugiert.
lösen
dem überstand wurde die Plasmid-DNA mit lOml
Das
gelassen.
ausgefällt
Sediment
Nach
Zugabe
Ethidiumbromidlösung
und anschließend 5min bei 2400xg
wurde in 3ml TE 30-60 min bei 37°C
von
(lOmg/ml)
Dichtegradienten-Zentrifugation
führt.
Nach
Plasmid-DNA
solange
(ca.
den
zwei
lmM EDTA) 30-90min
wie
4.2g
CsCl
wurde
oben
und
250~1
ebenfalls
beschrieben
Zentrifugations-Schritten
einer
eine
durchgewurde
die
mit gleichem Volumen Butanol (gesättigt mit 1M NaCl)
extrahiert, bis alles Ethidiumbromid entfernt worden war
4-5x).
Dann
wurde
die
Plasmid-Lösung gegen 1 Liter lOmM
Tris-HCl pH8.0, O.lmM EDTA 16-24h dialysiert. Der Puffer wurde 2x
gewechselt. Wenn das Volumen nach der Dialyse zu groß war, wurden
die Plasmide mit Ethanol gefällt.
35
VERSUCHE MIT XENOPUS LAEVIS
Die
Tiere
wurden
von
der South African Snake Farm (Fish Hoek,
Cape Province, Südafrika) bezogen
1. Präparation von polyA+-RNA aus der Froschleber
Zur
Isolierung
(1:200)
von
RNA
narkotisiert.
wurde
Die
ein
Leber
Xenopus-Männchen
wurde herauspräpariert und in
einer Petrischale mit etwas Homogenisationsmedium (HM:
lOmM
Tris-HCL
Leber
20ml
wurde
HM
wurde
Glycerin
lOmM NaCl,
1.5mM MgCl2, 50% Glycerin) überführt. Die
in kleine Stücke zerschnitten und je eine Hälfte in
mit
kurz
pH8.0,
in MS222
40mg Hefe-RNA in Eis kurz homogenisiert. Bei -20°C
weiter
100~1
homogenisiert,
10%
Triton
X-100 in
zugegeben und noch einmal homogenisiert. Die Suspension
wurde lOmin bei -20°C bei 10800xg zentrifugiert, um die Zellkerne
zu
sedimentieren.
(0.15mM
40ml
Tris-HCl
Phenol
30-120min
50ml
pH9.0, 5mM EDTA, 0.1% SDS) gegeben, sofort mit
(gesättigt
bei
4°C
mit
abgesaugt
Die
und
geschüttelt.
Phase
abzentrifugiert.
5min
Tris-HCl pH8.0) versetzt und
Die Lösung wurde dann auf zwei
verteilt
wäßrige
erneut
Nach
0.5M
geschüttelt.
Zentrifugenröhrchen
zentrifugiert.
wäßrige
Der überstand wurde zu 30ml Extraktionspuffer
mit
Phase
und
wurde
5min
mit
bei
2700xg
einer
Spritze
80ml Phenol/Chloroform lOmin bei 4°C
Zentrifugation
bei
2700xg
wurde
die
erneut mit 40ml Phenol/Chloroform geschüttelt und
Anschließend wurde die wäßrige Phase mit lml 5M
NaCl versetzt und die RNA mit 2 Volumen Ethanol ausgefällt.
36
Zur
Isolierung der polyA+-haltigen RNA wurde die, nach der obigen
Methode
präparierte
RNA
über
eine
Säule
mit polyU-Sepharose
mit
lml
O.lM
NaCl, lOmM Tris-HCl pH7.4, lOmM EDTA,
geschickt.
Die
Säule
wurde
Bindungspuffer
0.5%
SDS)
(BB:
gepackt
mindestens
lOml
gequollener
polyU-Sepharose
in
und mit BB gespült. Dann wurde die Säule mit
Elutionspuffer
gewaschen
(EB:
1
Vol.
lOmM
Tris-HCl pH7.4, lOmM EDTA und 9 Vol. umkristallisiertes Formamid)
und anschließend wieder mit BB äquilibriert.
Die
ausgefällte
getrocknet.
Das
vorbereitete
polyA--RNA
gesammelt.
Sobald
Spülen
wurde
Durchfluß
Die
wurde
wurde
Diese
Tris-HCl
ausgefällt.
Der
die
Durchfluß
RNA-Lösung
in
wurde
die
als
Säule
war, wurde mit einem halben Bettvolumen BB gespült.
Dann
lOmM
bei 10800xg sedimentiert und
RNA-Sediment wurde in 7ml BB gelöst und auf die
gewaschen.
gesammelt.
lOmin
aufgetragen.
erneutem
der
wurde
Säule
eingedrungen
Nach
RNA
sie
als
Lösung
pH7.4
die Säule 3x mit einem Bettvolumen
mit ca. 1.5ml EB überschichtet. Nun
polyA+-haltige RNA in Plastikröhrchen
wurde sofort mit 1/10 Volumen 1M NaCl,
versetzt
gefällte
und
die
polyA+-RNA
RNA mit 3 Vol. Ethanol
wurde
30min
bei 4°C und
16700xg abzentrifugiert, in 80% Ethanol gewaschen, getrocknet und
in 0.5 ml O.lM NaCl, lOmM Tris-HCl pH7.4 (NT) gelöst und nochmals
mit 2.5 Vol. Ethanol ausgefällt.
2. MicroinJektion von Plasmid-DNA in Xenopus Oocyten-Kerne
(Kressman und Birnstiel,l980; Etkin und DiBerardino,l983).
Einem
geschlechtsreifen,
narkotisierten
(mit
MS
222,
1:200)
Xenopus-Weibchen wurde ein Teil des Ovars entnommen. Das Ovarteil
wurde
in
MBS-H
(88mM
NaCl,
lmM
KCl, 0.33mM Ca(N03)2, 0.4lmM
37
CaCl2,
0.82mM
MgS04,
lOO~g
Penicillin/ml,
2.4mM
NaHC03,
lOmM
HEPES
pH7.4,
lOOU
Streptomycin/ml) in kleine Stücke zerteilt.
Große Oocyten wurden ausgelesen und in neues Medium gegeben.
Um genau in den Kern zu injizieren, wurde eine Vorbehandlung nach
Kreasman
et
al.(l977)
durchgeführt. Die Oocyten wurden in eine
6cm Petrischale mit 3ml Medium auf ein Nylongitter übertragen und
l2min
bei 800xg zentrifugiert. Durch die Zentrifugation wird der
Zellkern
zur
injiziert
einem
Oberfläche gebracht, so daß direkt in den Zellkern
werden
kann. Zur Injektion wurden Mikrokapillaren mit
20-30~m
Durchmesser von
Oocyten mit je 50nl DNA-Lösung
Die
injizierten
Medium
gegeben
intakten
10~1
Oocyten
und
Oocyten
0.25M
benutzt.
(2~g/lOO~l)
wurden
20-24h
In der Regel wurden 40-60
in
injiziert.
Kulturschalen mit frischem
bei 25°C inkubiert. Dann wurden die
ausgelesen. Schließlich wurden ca. 20 Stück in
Tris-HCl
pH7.8
/Oocyte aufgenommen. Durch Auf- und
Abpipettieren wurden die Oocyten zerdrückt.
2.1. Extraktion von RNA aus injizierten Oocyten
150~1
Oocytenhomogenat
Tris-HCl
pH8.0,
vermischt
Gemisch
und
mit
Tris-HCl
wurden
30min
2ml
pH8.5)
Zentrifugation
Phase
lOmM
bei
abgenommen
wurde
EDTA),
mit
l%
2ml
SDS
2xSET
und
(0.3M NaCl, O.lM
lmg/ml Proteinase K
bei 25°C inkubiert. Anschließend wurde das
Phenol/Chloroform
30min
im
Kühlraum
Raumtemperatur
und
(1:1,
gesättigt
geschüttelt.
mit
0.5M
Nach
5min
mit 2700xg wurde die wäßrige
mit Ethanol ausgefällt. Die Nukleinsäuren
anschließend mit 16800xg abzentrifugiert, mit 80% Ethanol
gewaschen
und unter Vakuum getrocknet. Schließlich wurde die RNA
in 500~1 dest. H20 aufgenommen und ihre Konzentration bestimmt.
38
2.2. Extraktion von Proteinen
Das
restliche
Oocytenhomogenat
wurde
10m in
mit
10800xg
zentrifugiert, der Oberstand wurde in ein neues Eppendorfröhrchen
transferiert.
Zur Bestimmung der CAT-Aktivität wurden
5~1
dieses
Oberstandes eingesetzt.
ZELLKULTUR
Die
Zellen
wurden
in
Gewebekulturschalen ( Durchmesser 90mm )
unter
6%
C02
in einem Brutschrank bei 37°C gezogen. Den Zellen
wurde
je
9cm
Kulturschale
Tage
gewechselt
wurde.
lOml Medium zugesetzt, das alle 3-4
Kurz vor Erreichen der Konfluenz wurden
die Zellen trypsiniert und rekultiviert.
Für
die
Hepatomazellen
waren
besondere
Kulturbedingungen
erforderlich: modifiziertes Ham's Fl2-Medium (siehe Materialien),
Serum von sehr guter Qualität, das eine Plattierungseffizienz von
80-100%
gewährleistet,
und
Gewebekulturartikel
von
der Firma
Falcon.
1. Trypsinbehandlung
Das
Kulturmedium
0.05%igem
Trypsin
wurde
abgesaugt,
Trypsin
gewaschen
abgespült.
Die
Zentrifugenröhrchen
mit
dem
und
die
mit
Zellen
weiteren
abgelösten
Zellen
gleichen
Volumen
überführt und 3min mit 250xg abzentrifugiert.
einmal mit 5ml
5ml
wurden.
0.05%igem
in
ein
an Kulturmedium
39
2. Rekultivierung
Das
Zellsediment
vorsichtig
mit
wurde
in
lOml
Kulturmedium
aufgenommen und
resuspendiert. Die Hepatomazellen wurden in der Regel
einer Dichte von 2xl04 Zellen/cm 2 ausgesät,
jedoch nie unter
8xl03 Zellen/cm2,
Die
Hepatomazellen
wurden
nicht
länger als 2 Monate in Kultur
gehalten.
3. Einfrieren und Auftauen von Zellen
Logarithmisch
wurden
10%
wachsende
abtrypsiniert,
Zellen von einer 9cm Gewebekulturschale
zentrifugiert und in lml Kulturmedium mit
DMSO aufgenommen und zunächst 30min auf Eis stehen gelassen,
24h bei -80°0 eingefroren und schließlich in flüssigem Stickstoff
aufbewahrt.
Aufgetaut
wurden
aufgenommen,
die Zellen sehr rasch bei 37°0, in lOml Medium
abzentrifugiert,
in
frischem Medium resuspendiert
und ausplattiert.
4.
Transiente Transfektion
4.1.
Transfektion
Die
Transfektion
technik
(Graham
wurde nach der Calciumphosphat-Präzipitationsund van der Eb,l973 ; modifiziert von Wigler et
al. ,1979) durchgeführt. Einen Tag vor der Transfektion wurden die
Zellen
so
konfluent
ausgesät,
waren:
Gewebekulturschale,
daß
BWIJ
sie
Zellen
LTK-
und
bei
der
Transfektion zu 70-80%
mit einer Zellzahl von 3xl0 6 /9cm
NIH
3T3
Zellen
mit
2xl0 6 /9crn
40
Gewebekulturschale.
Kulturmedium
HSB
(8g/l
Dextrose
20min
und
2h
vor
l0-20~g
gewechselt.
NaCl,
und
0.37g/l
5g/l
der
KCl,
HEPES
Transfektion
wurde
das
DNA wurden mit 125mM CaCl2
O.l25g/l
pH7.05)
Na2HP04x2H20,
in
O.lg/1
in einem Volumen von lml für
copräzipitiert. Das Präzipitat wurde in das Medium gegeben
6h
auf
den
Kulturmedium)
Zellen
gelassen.
(in
9cm
Dann
Gewebekulturschalen mit lOml
wurden
die Zellen gewaschen,
für
2min
mit 25% Glycerol (in Kulturmedium ohne Serum) geschockt, 3x
mit
Kulturmedium
frischem
Medium
ohne
Serum
inkubiert.
gewaschen
24h
und
schließlich
mit
nach Entfernen des Präzipitats
wurden die Zellen durch Abtrypsinieren geerntet.
4.2. Protein-Präparation
Die
Zellen
wurden
gewaschen.
5mM
DTT
abtrypsiniert und mit lml serumfreiem Medium
150~1
Das Zellsediment wurde in
und
Frieren
5%
und
Glycerol
Tauen
aufgebrochen.
Die
abzentrifugiert,
resuspendiert
und durch dreimaliges
(Trockeneis/Methanol-Bad
Zelltrümmer
wurden
proteinhaltige
der
250mM Tris-HCl pH7.6,
und
mit
lOmin
überstand
37°0)
8800xg
wurde bei -20°0
aufbewahrt.
4.3. RNA-Präparation (modifiziert nach Auffray und Rougeon,l980)
16h
nach
Entfernen
präpariert.
17mM
Die
Na2HP04
des
2.5mM
1
Zellsediment
2xPK-Puffer
und
von
den Zellen wurde RNA
Zellen wurden 2x mit eiskaltem PBS (123mM NaCl,
Gewebekulturschalen
abgeschabt
Präzipitats
(0.2M
pH7.3)
gewaschen.
Bis
zu
4
wurden dann in 5ml PBS mit einem Gummispatel
5min
wurde
KH2P04,
bei
in
4°0
lml
Tris-HCl
mit
PBS
pH7.5,
670xg
abzentrifugiert. Das
resuspendiert
und
mit
lml
25mM EDTA, 0.3M NaCl und 2%
41
SDS)
versetzt.
Durch mehrfaches Aufziehen der Lösung durch eine
Kanüle wurde die hochmolekulare DNA geschert. Es wurden dann
Proteinase
K
(20mg/ml)
inkubiert.
Anschließend
zugegeben
wurde
50~1
und das Ganze 30min bei 37°C
eine Phenol/Choroform-Extraktion
durchgeführt. Nach lOmin Zentrifugation bei l8°C mit 9500xg wurde
die
nukleinsäurehaltige
Volumen
4M
ausgefällt
Sediment
LiCl
und
versetzt.
l5min
wurde
Oberphase
Die
bei
abgenommen
RNA
wurde
und
mit
einem
bei 4°C über Nacht
4°C mit l6800xg abzentrifugiert. Das
lx mit 80%igem Alkohol gewaschen und schließlich
unter Vakuum getrocknet.
ANALYTISCHE METHODEN
l. Präparation von radioaktiv markierten Proben
1.1. Kinase-Markierung von RNA
Zuerst
wurde die RNA in NaOH partiell hydrolysiert, so daß freie
OH-Enden
entstanden.
Froschleber
wurde
lM
in
20~1
Tris-HCl
zugegeben
und
(Endkonzentration:
Reaktion
auf
zugesetzt.
Tris-HCl
pH7.6
zu
Lösung
O.lM
HCl).
vergrößert.
Dann
50~Ci
Die
pH7.6,
einer
die
Das
und
wurden
2~g
polyA+-RNA
aus
der
0.25N NaOH für 30min bei 0°C inkubiert. Dann
durchgeführt.
50~1
Kinase
Dazu
~-(
3
lOmM
lM
HCl
Anschließend
wurde
neutralisiert
die Kinase-
Volumen der Reaktionsmischung wurde
wurden
2P)ATP
Inkubation
mit
Endkonzentration von 0.25M
(spez. Aktivität ca. 5000Ci/mmol)
erfolgte
MgCl2,
l Einheit T4 Polynukleotid-
50mM
für 30min bei 37°C in 30mM
DTT.
Durch Zugabe von
10~1
42
Stoplösung
Reaktion
(2%
SDS,
50mM EDTA, 0.01% Bromphenolblau) wurde die
beendet. Die markierte RNA wurde über eine 2ml Sephadex
G50-Säule
von
den
freien,
nicht
eingebauten
Nukleotiden
abgetrennt.
1.2. Endmarkierung von DNA-Fragmenten
Zur
Endmarkierung
Einheiten
T4
von
0.5-l~g
dephosphorylierter DNA wurden 5
Polynukleotid-Kinase
und
lOO~Ci
~-(32P)ATP
eingesetzt. Die Reaktion erfolgte für 30min bei 37°C in
Tris-HCl pH7.6,
Die
30~1
50mM
lOmM MgCl2, 5mM DTT, O.lmM Spermidin, O.lmM EDTA.
radioaktiv markierte DNA wurde durch Gelfiltration über eine
Biogel P60-Säule von nicht eingebauten Nukleotiden abgetrennt.
1.3. Kinasierung von Oligonukleotiden
Zur
Markierung
(30~Ci)
~-(
von 3pmol Oligonukleotid wurden 6pmol
3
2P)ATP
eingesetzt. Die Reaktionsbedingungen waren ansonsten wie
oben beschrieben.
Ubcr eine NACS prepac Säule wurde das markierte
Oligonukleotid von den freien Nukleotiden getrennt.
2. Gelfiltration
2.1. Sephadex G50-Säule
Sephadex
2ml
G50
wurde in TE autoklaviert und somit gequollen. Eine
Pipette
wurde
Säulenmaterial
dann
Nachfüllen
von
Von
aufgebracht,
Glaswolle
gestopft
und
mit
dem
gefüllt. Die Säule wurde zweimal mit TE, 0.2% SOS
gewaschen,
eluiert.
mit
wurde
Puffer
jeder
die
Probe
aufgetragen.
(TE,
0.2%
SDS) wurden
Fraktion
wurde
je
1~1
Unter ständigem
150~1
auf
Fraktionen
GF/C-Filter
mit Quickszint versetzt und im Szintillationszähler
43
gemessen. Die RNA sollte vor den freien Nukleotiden von der Säule
eluiert
worden
sein, daher wurden die ersten stark radioaktiven
Fraktionen gesammelt.
2.2.
"Spin column"
Zur
Hers te 11 ung
einer
sog.
"spin
col umn"
wurden
Eppendorf-
Reaktionsgefäße folgendermaßen vorbereitet: Mit einer Nadel wurde
in
den
Boden
des
Eppendorf-Röhrchens
ein
Loch gestoßen, das
anschließend mit Quarzsand bedeckt wurde. Dann wurde das Röhrchen
silikonisiert und autoklaviert.
Ein
so
vorbehandeltes
lOml-Plastikröhrchen
gefüllt.
Eppendorf-Röhrchen
gesteckt
und
mit
wurde
Sephadex
G50
auf
ein
(in
TE)
Um diesen Vorgang zu beschleunigen, wurde das Ganze 2min
bei 1500xg zentrifugiert. Dies wurde ungefähr dreimal wiederholt,
bis
das
wurden
Eppendorfgefäß
gegeben
wurde
100-200~1
ca.
und
dann
diesem
die
auf
wiederum
Reaktionslösung
Anschließend
Dadurch
wurde
wurde
die
(lmg/ml)
ein
einem
das
auf
die Säule
mit die TE gewaschen. Die fertige Säule
Eppendorfreaktionsgefäß
auf
in
lml Säulenvolumen beinhaltete. Dann
Kalbsthymus-DNA
Säule
ein
ca.
Ganze
gesteckt
lOml-Plastikröhrchen.
Volumen
2min
von
bei
100~1
Dann
und mit
wurde
aufgetragen.
1500xg zentrifugiert.
Nukleinsäure über die Säule geschickt und im
Eppendorfröhrchen unter der Säule aufgefangen, während die freien
Nukleotide in der Säule verblieben.
2.3. Biogel P60-Säule
Biogel
Nacht
P60 (Fraktionierbereich zw. 3000-60000 Dalton) wurde über
in
50ml
NaCl, 0.5mM EDTA gequollen. Als Säule wurde eine
44
mit
Glaswolle
wurde
bis
(50mM
NaCl,
einem
Volumen
von
Puffer
gestopfte
oben
mit
Pasteurpipette
Säulenmaterial
verwendet. Die Pipette
gefüllt und mit 2ml Puffer
0.5mM EDTA) gewaschen. Die Reaktionslösung wurde in
~1
von 100
100~1
wurden
DNA-enthaltenden
aufgetragen. Unter stetigem Nachfüllen
Fraktionen
Fraktionen
wurden
gesammelt.
durch
Die
Cerenkov-Zählung
identifiziert.
3. Elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren
3.1. Auftrennung von in vitro transkribierter RNA (McMaster und
Carmichael,l977)
Die
5~1
getrockneten RNA-Proben wurden in
15~1
Denaturierungslösung
wurde
immer
frisch
NaH2P04/Na2HP04
Glyoxal
war
gestellt
500~1
pH6.85),
dreimal
wurden
und
aufgenommen. Die Denaturierungslösung
50~1
angesetzt und bestand aus:
zuvor
Anschließend
sterilem dest. H20 und
die
über
Proben
5~1
mit
DMSO und
195~1
20xPB (0.2M
30% Glyoxal. Das
AG 501-XB deionisiert worden.
3min auf 50°C erhitzt, auf Eis
RNA-Ladelösung
(50%
Glycerol,
lOmM
NaH2P04/Na2HP04 pH6.85, 0.1% Bromphenolblau) versetzt.
Die
so
vorbereiteten
1.4%igen
Agarosegel
hitzesterilisierte
Polyacrylamidgel
bisacrylamid,
gegossen.
das
(30
0.05%
Dieses
wurden
aufgetrennt.
Glasplatten
Agarosegel
Glasplatten
RNA-Proben
Gew.%
Dazu
auf
einem vertikalen
wurde
(12xl5xO.lcm)
zwischen
zwei
ein ca. 2cm hohes
Acrylamid, 0.8 Gew.% N,N'-Methylen-
TEMED,
0.125%
Ammoniumperoxodisulfat)
Acrylamidkissen diente sicherheitshalber dazu,
während
zu fixieren.
der
Elektrophorese
zwischen
den
Uber dieses Kissen wurde das Agarosegel
(1.4%ig in lx PB) gegossen.
Die
Elektrophorese
wurde
bei
4°C mit lx PB als Laufpuffer bei
45
30mA über 3 h durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde die RNA
l5min
in
PB
mit
0.03mg/ml Acridinorange gefärbt. Unter kurzem
UV-Licht (260nm) wurde das Gel photographiert und schließlich auf
Whatman 3MM Papier 90min unter Vakuum getrocknet.
3.2. Auftrennung von Nukleinsäuren unter denaturierenden
Bedingungen
Die
3~1
Sanger Probenpuffer
EDTA,
0.03g Xylencyanol,
getrockneten Nukleinsäuren wurden in
(lOOml
0.03g
deionisiertes
Formamid,
Bromphenolblau)
20mM
aufgenommen,
3min gekocht, sofort auf Eis
gestellt und möglichst rasch auf das Gel aufgetragen.
Ein
Gel
war
folgendermaßen
Gellösung bestehend aus:
bisacrylamid),
pH8.3,
Borsäure,
TEMED
und
worden:
30ml
einer
6% Acrylamid (19 Teile Acrylamid, 1 Teil
N,N'Methylen
90mM
vorbereitet
8M
Harnstoff in TBE (90mM Tris-HCl
2.5mM EDTA) wurden nach Zugabe von 0.05%
0.1% Ammoniumperoxodisulfat zwischen zwei Glasplatten
mit Abstandshaltern (20x40x0.015cm) gegossen.
Eine
der
Glasplatten
silikonisiert
war
worden,
zuvor
mit
2ml Dimethyldichlorsilan
die andere war mit 5ml 0.3% Haftsilan (in
Ethanol mit O.l5ml 100% Essigsäure) beschichtet worden.
Die
Gele
wurden
20min
bei
25W
vorelektrophoresiert.
Die
Auftrennung der Proben erfolgte ebenfalls bei 25W, als Laufpuffer
diente TBE (90mM Tris-HCl pH8.3, 90mM Borsäure, 2.5mM EDTA).
Nach
der
abgehoben,
Platte.
Es
fließendem
Auftrennung
das
Gel
wurde
Wasser
wurde
die
silikonisierte
auf
der
mit
blieb
lOmin
in
10%iger
abgespült,
getrocknet und autoradiographiert.
bei
Glasplatte
Haftsilan behandelten
Essigsäure fixiert,
80°C
auf
die
unter
Glasplatte
46
4. Southern Transfer von DNA (Southern, 1975)
Restriktionsverdaute
Spannung
von
40V
DNA
wurde
langsam
auf
einen Agarosegel bei einer
aufgetrennt. Das Gel wurde markiert,
gefärbt und schließlich photographiert.
Die
DNA im Gel wurde bei Raumtemperatur 30m in in 0.5M NaOH, l. 5M
NaCl
unter
gewässert
Schütteln
und
30m in
neutralisiert.
denaturiert.
in
Für
den
Nitrocellulose-Filter
wurde
nach Man iat i s et al.
In
eine
wurde
Dann
Tris-HCl
1M
etwas
kurz
pH5.0,
l. 5M
NaCl
DNA
auf
ein
der
Transfer
eine
Gel
das
modifizierte Apparatur
(1982) verwendet.
Plastikwanne
mit
20xSSC
(3M
NaCl, 0.3M tri-Natrium-
citrat-2-hydrat pH6.5) wurden zwei übereinandergestapelte Ständer
für
eine
Gilson-Pipettenspitzen
Enden
in
Whatman
die
vorbehandelte
herum
wurde
gelegt.
Lage
weitere
Papierhandtücher
wurde
mit
zwei
Darauf
reichten.
Der
freigebliebene
wurde
das
Raum um das Gel
Parafilm abgedichtet. Ein mit 20xSSC benetztes
Nitrozellulose-Filter
eine
Glasplatte
3MM Papierstücken (16x30cm) bedeckt, deren
20xSSC-Lösung
Gel
mit
Gilson) gesetzt. Darüber wurde
Diese
gelegt.
Glasplatte
befeuchteten
(Fa.
wurde
auf
feuchtes
geschichtet.
das Gel gelegt. Darüber wurden
Whatman
Das
3MM
Ganze
Papier
und
dann
wurde schließlich mit
einem schweren Gegenstand bedeckt.
Der
Transfer
erfolgte
über
Nacht.
Danach wurde das Filter in
lOxSSC gewaschen und 2h bei 80°C getrocknet.
47
5. Hybridisierung von RNA an DNA, die auf NitrozelluloseFiltern fixiert ist
Zur
Absättigung
NC-Filter
des
unspezifischer
vorhybridisiert.
transferierten
88.5
Vol%
Gels
pH8.0,
SDS,
(2%
20ml
EDTA),
Ficoll,
Hefe-RNA
2%
und
11.5Vol%
bei
aus:
37°C
40ml
lOOml
über
eigentliche
20h
bei
denaturierter
inkubiert.
20xSET
Formamid
(3M
NaCl,
p.a.,
Die
1M
lOml lOOx
Polyvinylpyrolidon, 2% BSA), 2ml 20%
(2.5mg/ml
in
0.1%
Na-Pyrophosphat (0.5M Na2HP04/NaH2P04 pH7.3,
Die
das
wurde das Filter je nach Größe
2-4h
bestand
O.lM
wurde
mit 5, 10 oder 20ml einer Mischung aus
(lmg/ml)
Hybridisierungslösung
Denhardts
Dann
Hybridisierungslösung
Kalbsthymus-DNA
Tris-HCl
DNA-Bindungsstellen
SDS)
und
5ml
4%
1.5% Na4P207).
Hybridisierung mit kinasierter RNA erfogte dann
37°C
in 88.5 Vol% Hybridisierungslösung und 11.5
Vol% Kalbsthymus-DNA (4.3mg/ml) mit 5.10 6 cpm kinasierter RNA.
Unspezifisch
gebundene
Filter entfernt:
lO~g/ml
RNA
wurde durch mehrmaliges Waschen der
je zweimal 30min bei 65°C in 2xSSC,
Kalbsthymus-DNA
o.l% SDS und
und je dreimal 45min bei 37°C in 2xSSC,
0.1% SDS.
Das
Filter
wurde
naß
in
Folie
eingeschweißt
und autoradio-
graphiert.
6.
In vitro Transkription
Für die in vitro Transkriptions-Experimente wurde das "Eucaryotic
Transcription
System"-Kit
der
Firma
Gibco-BRL,
Karlsruhe,
verwendet.
0.5-l~g
EDTA;
DNA
50mM
wurden jeweils mit
Creatin-Phosphat;
15~1
25mM
HeLa-Lysat und je
rATP;
25mM rGTP;
0.5~1
7mM
25mM rCTP;
48
2.5mM rUTP und mit
mit
sterilem
wurde
lh
Volumen
0.75~Ci
dest.
bei
37°C
Q-(32P)UTP versetzt. Das Volumen wurde
H20 auf
25~1
inkubiert,
gebracht. Das Reaktionsgemisch
anschließend wurde ein gleiches
Transkriptions-Stoplösung
(20mM
EDTA, 2% SDS,
lOO~g/ml
tRNA, 200mM Tris-HCl pH8.0, 0.01% Bromphenolblau) zugesetzt. Nach
einer
Phenol/Chloroform-Extraktion
"spin
column'' gegeben. Die in vitro transkribierte RNA wurde mit
Ethanol
ausgefällt
und
wurden
anschließend
die Proben über eine
auf
einem
1.4%igen
Agarose-Gel aufgetrennt.
7. Seguenzierung von Nukleinsäuren
7.1. von einzelsträngiger DNA nach Sanger (1978)
7.5~1
der zu sequenzierenden, einzelsträngigen DNA wurden mit
primer-Mix
(50mM
Sequenzierprimer,
dieses
Tris-HCl
pH8.5,
Pentadecamer)
lh
Hybridisierungsansatzes
Sequenzierreaktionen
in
25mM
bei
MgClz,
12ng
60°C inkubiert. Je
wurden
für
jede
5~1
Ml3
2~1
der
4
(G,A,C,T) eingesetzt. Die Reaktionen wurden
Mikrotiterplatten
Hybridisierungsansatzes
Sequenzierreaktion
durchgeführt.
wurden
je
spezifischen
2~1
Zu
den
2~1
des
einer für die jeweilige
dNTP/ddNTP-Reaktionslösung
zugegeben. Diese Reaktionslösung war für 5 zu sequenzierende DNAs
bestand
aus
5~1
berechnet
und
NTP 0 -Lösung,
Einheiten
DNA Polymerssei (Klenow-Fragment) und
5~ddNTP-Lösung,
8~Ci
5
Q-( 35 S)dATP
(600Ci/mmol).
Das
Reaktionsgemisch
Chase-Lösung
inkubiert.
verhindert
(0.25mM
Mit
diesem
werden,
wurde
20min
bei
30°C
gehalten, mit
2~1
dNTPs) versetzt und weitere 20min bei 30°C
Schritt sollen vorzeitige Kettenahbrüche
die
aufgrund
Nukleotidkonzentrationen auftreten könnten.
von
zu
niedrigen
49
Mit
4~1
Senger-Probenpuffer (lOOml deionisiertes Formamid, O.lg
Xylencyanol
die
FF,
Reaktion
denaturiert
des
O.lg Bromphenolblau, 2ml 0.5M EDTA pH8.0) wurde
Die
beendet.
und
Proben
wurden
3min
bei
l00°C
sofort auf Eis gestellt. Schließlich wurden
auf
Reaktionsgemischs
einem
2~1
Polyacrylamid-Harnstoff-Gel
aufgetrennt.
Die einzelnen NTP 0 -Lösungen waren:
GO: 12,5 ~M dGTP +
250~M
dCTP +
250~M
AO: 250
250~M
dCTP +
250J.1M dTTP
co: 250 J.IM dGTP + 12. 51JM dCTP +
250J.1M dTTP
~M
dGTP +
TO: 250 !-IM dGTP +
Die
Lösungen
wurden
dTTP
250J.1M dCTP + 12. 5J.1M dTTP
jeweils
aus
lmM
dNTP-Stocklösungen
hergestellt.
Die ddNTP-Lösungen waren:
ddGTP 0.32mM
ddATP 0.02mM
ddCTP O.l6mM
ddTTP 0.5 mM
7.2. Sequenzierung von doppelsträngiger Plasmid-DNA (Chen und
Seeburg, 1985)
20J.1g
gereinigte
Plasmid-DNA
wurde
zunächst
in
lOOJ.!l
TE mit
lOOJ.lg/ml RNAse (lOmg/ml in lOmM Tris-HCl pH 7.5, 15mM NaCl) l5min
bei
Raumtemperatur
Volumen
auf
400~1
inkubiert.
Nach
erhöht.
Die
Phenol/Chloroform-Extraktion
ausgefällt.
Die
dem RNAse-Verdau wurde das
DNA
wurde
über
eine
gereinigt und mit 2 Volumen Ethanol
ausgefällte
DNA
wurde
lOmin
bei
8800xg
abzentrifugiert, einmal mit 80% Ethanol gewaschen und getrocknet.
50
Das
Sediment
20~1
TE aufgenommen und die Konzentration
getrocknet
und einer alkalischen Denaturierung
wurde in
der DNA bestimmt.
2~g
DNA
wurden
unterzogen. Dazu wurde die DNA in
NaOH,
0.2mM
40~1
Denaturierungspuffer (0.2M
EDTA pH8.0) aufgenommen und 5min bei Raumtemperatur
stehen
gelassen.
lösung
(2M
Zur Neutralisierung wurden
Ammoniumacetat
pH4.5)
4~1
zugegeben
Ammoniumacetat-
und die DNA mit 2
Volumen Ethanol über Nacht gefällt. Nach lOmin Zentrifugation bei
8800xg
wurde
die
denaturierte
Plasmid-DNA
mit
80%
Ethanol
gewaschen und getrocknet.
5~1
Die so vorbehandelte DNA wurde mit
lOx
Annealing-Puffer
NaCl,
lOOmM
Ci/mmol)
15min
DTT,
und
bei
lmM
6.5~1
37°C,
Zum
H20
wurden
Sequenzierreaktion
tet.
(70mM
Tris-HCl
EDTA)
entsprechenden
a-( 35 S)dATP
wurden
dann
wurden
die
1.5~1
660
mit
für
jede
dNTP/ddNTP-Lösungen vorberei-
(Klenow-Fragment) gegeben und je
Reaktion
(8~Ci/~l,
Während der Hybridisierung,
Polymerase I
vorbereiteten
1.5~1
70mM MgCl2, 300mM
Eppendorf-Röhrchen,
Hybridisierungsansatz
auf
(0.5pmol/~l),
pH7.5,
2~1
und
versetzt.
4
primer
2
Einheiten DNA-
3~1
dieses Gemischs
Eppendorfröhrchen
verteilt. Die
wurde über 30min bei 30°C durchgeführt. Nach Zugabe von
Chase-Lösung
(O.l25mM
dNTPs)
wurden
die Proben weitere
15min bei 30°C inkubiert.
Schließlich
wurden die Proben unter Vakuum getrocknet und in
Sauger-Probenpuffer
aufgenommen.
Es
wurde
je
1~1
auf
denaturierenden Polyacrylamid-Harnstoff-Gel aufgetrennt.
4~1
einem
51
Die
einzelnen
dNTP/ddNTP-Lösungen
hatten
folgende
Nukleotidkonzentrationen, in lx Annealing-Puffer:
A-Mix:
100J.1M dTTP
C-Mix: 100J.1M dTTP
100 J.IM dCTP
lOfJM dCTP
100 J.IM dGTP
lOOf.IM dGTP
und 100J.1M ddATP
G-Mix:
und lOOfJM ddCTP
lOOf.IM dTTP
T-Mix:
51JM dTTP
lOOfJM dCTP
100 f.IM dCTP
5 f.IM dGTP
lOOf.IM dGTP
und 120f.1M ddGTP
und 5001JM ddTTP
7.3. Sequenzierung von RNA mit der Kettenabbruchmethode
Entsprechend
Methode
der
wurden
Analyse
die
von
RNA
mit
der "primer extension"
RNA-Sequenzierungsreaktionen
durchgeführt,
jedoch in Anwesenheit von ddNTPs (Endkonzentration 1.7mM).
7.4. Sequenzierung von DNA nach Maxam und Gilbert (1980)
Es wurde das Sequencing-Kit der Firma NEN, England verwendet.
20pmol
wurde
5
DNA-Fragment,
das an einem Ende radioaktiv markiert war,
in 40J.1l H20 aufgenommen, für die jeweiligen Reaktionen auf
Eppendorfröhrchen
verteilt
(Lachs-Spermien-DNA) versetzt.
und
mit
je
8flg
Träger-DNA
52
Die einzelnen Kettenabbruchreaktionen waren:
a)
5~1
G-Reaktion:
l~l
und
50~1
200~1
DNA-Lösung wurden mit
G-Reaktionspuffer
DMS 3min bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zugabe von
750~1
G-Stoplösung,
Ethanol und Transfer der Probe in ein
Trockeneis/Methanol-Bad wurde die Reaktion beendet.
10~1
b) G+A-Reaktion:
versetzt
und
30min
Reaktionsgemisch
abgekühlt
und
Schließlich
DNA-Lösung wurden mit
2~1
bei
Im Anschluß wurde das
in
37°C
einem
inkubiert.
Piperidin-Formiat
Trockeneis/Methanol-Bad
in
der
Vakuumzentrifuge
wurde
die
DNA in
20~1
auf
-70°C
zur Trockne eingeengt.
H20 aufgenommen und nochmals
gefriergetrocknet.
c)
EDTA
für
lOmin
Reaktionslösung
4~g
Zugabe von
d)
10~1
A+C-Reaktion:
90°C
150
erhitzt.
l.2N NaOH,
Anschließend
wurde
lmM
die
lN NaOH neutralisiert und die DNA nach
tRNA mit Ethanol ausgefällt.
5~1
C-Reaktion:
Hydrazin
bei
mit
100~1
DNA-Lösung wurden mit
lOmin
15~1
DNA-Lösung wurden mit
5M NaCl und
30~1
bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde
200~1
durch Zugabe von
Hydrazin-Stoplösung beendet. Die DNA wurde
mit Ethanol ausgefällt.
e)
T+C-Reaktion:
Hydrazin
10~1
versetzt
DNA-Lösung
und
wurden mit
ebenfalls
lOmin
10~1
bei
H20 und
30~1
Raumtemperatur
inkubiert. Die Reaktion wurde genau wie die C-Reaktion beendet.
Die
lOmin
ausgefällten
bei
DNA-Sedimente
aufgenommen
DNA-Proben
8800xg
wurden
und
der
Reaktionen a,c,d und e wurden
abzentrifugiert
jeweils
erneut
mit
in
250~1
Ethanol
und
0.3M
getrocknet.
NaAcetat
ausgefällt.
Nach
Die
pH4.8
der
53
Zentrifugation
wurden
die
Proben
zweimal
mit 80%igem Ethanol
gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
Die
DNA-Proben
Piperidin
einer
aller
Reaktionen
aufgenommen,
wurden
jeweils
100~1
in
1M
30min bei 90°C erhitzt und über Nacht in
Vakuumzentrifuge
eingedampft.
Um
alles
entfernen, wurden die Proben noch zweimal in
30~1
Piperidin
zu
H20 aufgenommen
und zur Trockne eingeengt.
Durch
Cerenkov-Zählung
Proben
bestimmt.
Anschließend
Senger-Probenpuffer
gewählt
wurde,
lOOOcpm/~1
wurden
wurde die verbliebene Radioaktivität der
daß
alle
2~1
je
in
Proben
aufgenommen, wobei das zugegebene Volumen so
Einzelreaktionen
und die Doppelreaktionen von
dann
die
wurden
auf
einem
die
Aktivität
2000cpm/~l
von
hatten. Davon
denaturierenden Polyacrylamid-
Harnstoff-Gel aufgetrennt.
8.
"primer extension"-Analyse von RNA (McKnight und Kingsbury,
1982)
Ein
synthetisches
Oligonukleotid mit komplementärer Sequenz zur
zu
analysierenden
RNA
wurde
endmarkiert
(Punkt
1.3.).
Die
spezifische Aktivität des markierten Oligonukleotids betrug meist
zwischen
2.8
7· 10 8
50.000-60.000cpm
gefällt,
pH7.5,
bei
in
cpm/~g
primer
20~1
Zur
l0-20~g
mit
Hybridisierung wurden
Gesamt-RNA
Hybridisierungslösung (250mM KCl,
mit
Ethanol
lOmM Tris-HCl
lmM EDTA) resuspendiert. Die Hybridisierung wurde für l-2h
60°C
abgekühlt
durchgeführt.
und
Danach
anschließend
Reverse-Transkriptase-Mix
Reaktionen
aus:
Actinomycin
D
pH7.5,
DNA.
120~1
(250~g/ml),
wurden
bei
versetzt.
Raumtemperatur
Dieser
Nukleotidmix
80~1
75mM DTT, 60mM MgCl2),
4~1
5x
die Proben 2min auf Eis
Mix
(2.5mM
RT-Puffer
mit
40~1
bestand für 10
dNTPs),
120~1
(375mM Tris-HCl
RNasin(= RNase-Inhibitor;l20U)
54
und
10~1
Das
Reaktionsgemisch
anschließend
wurde
(5U/~l).
M-MLV Reverse Transkriptase
30-45min
bei
37°C
inkubiert
und
die Nukleinsäuren mit Ethanol gefällt. Das Sediment
3~1
in
wurde
Sanger-Probenpuffer
aufgenommen
und
auf
einem
Polyacrylamid-Harnstoff-Gel aufgetrennt.
9. SP6-Analyse von RNA (Melton et al.,l984)
9.1.
Herstellung der Probe
rekombinante
Restriktionsenzym
linearisiert,
Polylinkerbereich
dem
SP6-Plasmid-DNA
radioaktiv
Röhrchen
Die
markierten
zunächst
lOO~Ci
4~1
in
MgCl2,
lOmM
Spermidin),
DNA-Lösung
Matrize
verwendete
wurde
die
Tris-HCl
4~1
von
der
1~1
50mM
DTT,
und
Volumen
und
mit
lOmin
DNA
einem
Eppendorf-
MgCl2),
bei
DEPC-H20 auf
7.25~1
durch
5~1
20~1
(40U/~l),
H20
37°C inkubiert.
synthetisierten
mit
RNasin
bei
wurde
einen
30mM
4~1
und
5x
2~1
Die als
anschließenden
SP6-Probe entfernt. Dazu
lOx
DNase-Puffer
(500mM
DEPC-H20 (0.1% DEPC in H20),
lU/~1)
und
1~1
RNasin
(40U/~l)
37°C inkubiert. Anschließend wurde das
100~1
Phenol/Chloroform-Extraktion
NH4Acetat
einer
Zur Herstellung der
in
rGTP,
60min
RNase-freie DNase (RQ1-DNase,
versetzt
in
zur Trockne eingeengt. Diese
0.75~1
0.25mM
Reaktionslösung
pH7.5,
und
SP6-Puffer (200mM Tris-HCl pH7.5,
1~1
rNTPs),
wurden
a-(~~P)GTP
5x
aufgenommen
DNase-Verdau
im
Phenol/Chloroform-
gefällt
in H20 gelöst.
RNA-Probe
dann
(2.5mM
Erkennungssequenz
durch
Ethanol
0.25~g/~l
von
wurde
mit
wurden
rNTP
DNA
gereinigt,
Konzentration
dessen
einem
mit
lag, und zwar zwischen inserierter Sequenz und
SP6-Promotor.
Extraktion
wurden
gebracht und die RNA-Probe durch
gereinigt.
und in Gegenwart von
lO~g
Die Probe wurde in 2.5M
tRNA mit Ethanol ausgefällt.
55
Meist
wurden
Zur
ca.
10% der angebotenen Radioaktivität eingebaut.
Hybridisierung
FAB-Puffer
pH6.4,
9.2.
(80%
mit
der
RNA
deionisiertes
wurde
die
SP6-Probe in
60~1
Formamid, 400mM NaCl, 40mM PIPES
lmM EDTA) gelöst.
Vorbehandlung der RNA
Gesamt-RNA,
worden
die
aus
transient
transfizierten
Zellen isoliert
war, wurde vor der SP6-Analyse mit DNase behandelt. Damit
sollten
Verunreinigungen
Transfektion
stammte,
durch
Plasmid-DNA,
die
noch von der
beseitigt werden. Eine Verunreinigung mit
Plasmid-DNA könnte in der SP6-Analyse ebenfalls mit der SP6-Probe
hybridisieren
somit
und
zu
unspezifischen
Hybridisierungs-
Signalen führen.
20~g
Ethanol-gefällte,
5~1
aufgenommen,
mit
RNase-freier
DNase
gleiches
Volumen
getrocknete
lOx:
RNA
wurde in
43~1
l~l
DNase-Puffer,
DEPC-H20
RNasin,
2~1
lOmin bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde
DEPC-H20
zugegeben
und
die
RNA
durch eine
Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung gereinigt.
9.3.
Analyse
Die
getrocknete,
aufgenommen
5min
bei
und
85°C
vorbehandelte
RNA
wurde
SP6-Probe versetzt.
mit
17~1
in
FAB-Puffer
Das Gemisch wurde
erhitzt
und
anschließend
über
Nacht bei 45°C
wurde
der
Ansatz auf Eis gestellt, mit
hybridisiert.
Am
nächsten
Tag
Verdau-Puffer
pH7.0,
30°C
(lOmM
40~g/ml
inkubiert.
Tris-HCl
pH7.5,
5mM
EDTA,
300~1
0.3M NaAcetat
RNase A, 600U/ml RNase T1)versetzt und 30min bei
Anschließend wurden die Enzyme durch Zugabe von
56
2.5~1
Proteinase K (lOmg/ml) und
inaktiviert.
Hybride
Durch
gereinigt
5~g
Gegenwart von
3.2~1
20% SDS für l5min bei 37°C
Phenol/Choloroform-Extraktion
und
mit
Ethanol
ohne
wurden
Zugabe
von
die
Salz in
tRNA gefällt. Schließlich wurden die Proben auf
einem Polyacrylamid-Harnstoff-Gel aufgetrennt.
10. Bestimmung der CAT-Aktivität (CAT-Assay; Gorman et al.,
1982)
Die
Proteinkonzentration
transfizierten
al.(l951)
(2%
bestimmt.
Na2C03
wurden
Dazu
Extrakte
nach
wurden
der
5~1
aus
Methode
Extrakt mit
transient
von
Lowry et
995~1
Lösung I
in O.lN NaOH) gemischt und mit 2ml Lösung IV (lml 2%
KTartrat
=
versetzt
und
wurden
Zellen
der
Lösung
0.2ml
II,
lOmin
lml CuS04
bei
frisch
Lösung III,
Raumtemperatur
angesetzte
die
=
50%ige
Reaktionslösung
lOOml Lösung I)
stehen
gelassen.
Folin-Lösung
45min
bei
Dann
(in H20)
zugegeben
und
Raumtemperatur
inkubiert.
Anschließend wurde die Extinktion bei 600nm bestimmt.
Aus parallel angesetzten Standard-Proben mit 5,10,20,30,40,50 und
60~g
BSA
wurde
eine
Eichkurve
erstellt,
aus
der
die
Proteinkonzentrationen in den Proben abgeleitet wurden.
Für
eingeengt
0.25M
5min
0.25M
bei
lml
1.25~Ci
den CAT-Assay wurden
und
1
in einer bestimmten Proteinmenge aufgenommen. Mit
Tris-HCl
pH7.6 wurde das Volumen auf
Vorinkubation bei 37°C wurden
Tris-HCl
37°C
pH7.6)
inkubiert.
Ethylacetat
Ethylacetat
20~1
180~1
gebracht. Nach
4mM Acetyl Coenzym A (in
zugegeben und die Reaktionslösung für 2h
Anschließend wurde das Chloramphenicol mit
aus
wurde
Chloramphenicol
4 C-Chloramphenicol zur Trockne
der
wäßrigen
Phase
extrahiert.
dann in der Vakuumzentrifuge eingedampft.
wurde
in
20~1
Ethylacetat
wieder
Das
Das
gelöst und
57
punktweise
Laufmittel
auf
eine
Kieselgel-DC-Platte
aufgetropft.
Als
dient ein Chloroform-Methanol-Gemisch (9: 1). Nach der
Chromatographie
wurde
die
Platte
an
der
Luft getrocknet und
autoradiographiert.
Zur
Bestimmung der umgesetzten Mengen Chloramphenicol wurden die
nicht-acetylierte und die acetylierten Formen ausgeschnitten, mit
5ml Quickszint versetzt und im Szintillationszähler 5min gezählt.
Die
spezifische
Enzymaktivität
in
pmol/mg· h
läßt
sich
folgender Formel bestimmen:
4750pmol Chloramphenicol x cpm acetyl. Chloramphenicol
2h x mg Proteinextrakt x cpm eingesetztes Chloramphenicol
nach
58
Ergebnisse
I.
STRUKTURELLE ANALYSE DER XENOPUS ALBUMINGENE
Die
Exon/Intron-Struktur
Xenopus
(1983)
wird
Albumingene
mit
die
Zwischen
können
(sog.
DNA
hybridisiert,
Dort,
wo
fixi~rt
und
im
Exon-Sequenzen sind,
DNA mit komplementärer RNA ein Hybrid.
kodierenden
DNA-Sequenzen
Klone für die beiden
Bei solchen R-Loop Experimenten
analysiert.
denaturierte
den
Schleifen
worden.
genorniseher
Elektronenmikroskop
bildet
genorniseben
war durch R-Loop Experimente von May et al.
charakterisiert
RNA
der
Sequenzen befindliche nicht-kodiernde
nicht mit der RNA hybridisieren und bilden
loops) aus.
Durch elektronenmikroskopische Ver-
messung der Hybride und der dazwischen liegenden Schleifen konnte
die
Anzahl
der
Gene
und
Größe der Exons und das ungefähre 5' und 3'Ende
vorhergesagt werden.
nomischen
Durch zusätzliche Analyse von ge-
Restriktionsfragmenten konnten die Exonbereiche in ei-
nen Bezug zur genorniseben Restriktionskarte gebracht werden.
trugen
ebenfalls
(Westley
et
die Ergebnisse aus Untersuchungen mit der cDNA
al.,
1981)
Exon/Intron-Karte
methodisch
74kd
5'Endes
zu
bedingt
Gen
die
revidiert
RI/Bam
der
ursprünglichen
der
Restriktionskarte
zu
kann
Ungenauigkeiten kommen.
werden.
Eco
Ergebnis
bei. Bei einer solchen Angleichung von
ursprüngliche
HI-
Dazu
Restriktionskarte
Die
es
durchaus
So mußte für das
im
Größenangaben für
Bereich des
die
beiden
bzw. Bam HI/EcoRI-Restriktionsfragmente war auf
obigen
Karte
vertauscht
worden.
R-loop Untersuchungen,
In ABB.l ist das
zusammen mit den im
5'Bereich verbesserten Restriktionskarten dargestellt.
59
=
0>
=o=
0>
0>
=
~v>
"" "'
5'
3'
74 kd gene
4 5
6 7
II
I I
8
10
11 12
I I
I I
9
•
1314
15
ICl
\
\
\
\
\
'
74 kd
68 kd
'\
\
68 kd gene
\
''
''
5 // 6 7
1\ 2
3
4
I I
I
I I
/
'
/
/
/
/
8
I I I
9
/10
11
12
13 14 /15
I
111
II
I I
0>
ADBl:
Restriktions-
/
I
3'
5'
=
'
==
und
Exon/Intronknrte
der Albumingene des
Kenopus lnevis,
In
der Mitte lst ein ßeteroduplexmolekUl gezeichnet, dns aus der
Renaturierung
entstanden
von
Einzels t r!!ngen
der
beiden
Albumingene
ist. Die gepaarten Dereiche sind in schwarzen Blöcken
DarUber ,und
dargestellt.
darunter
befinden
sich
jeweils die
Exon/Iqtronkarten beider Gene. Die Exons sind schwarz dargestellt
und numeriert.
In
die
Angleichung an diese sind vereinfachte Restriktionskarten flir
jeweiligen Gene angegeben, Es wurden nu~ die fUr das weitere
Verständnis wichtigen Restriktionsschnittstellen angegeben:
Eco RI (E)
1
Dam HI (B), Bgl II (Bg), llind III (H) und Sol I (S)
f-------4
1 kb
60
l. Subklonierung der genorniseben Fragmente, die das 5'Ende
enthalten
Aufgrund
der
in
ABBl
Restriktionskarten
gezeigten, kombinierten Exon/Intron- und
beider
Albumingene
wurden
die
genorniseben
Fragmente, die das 5'Ende enthalten sollten, subkloniert. Für das
68kd
Gen
pEMBL9+,
Vektor
in
wurde
für
ein
2.7kb
EcoRI/BamHI-Fragment
in den Vektor
das 74kd Gen ein 2.0kb BamHI/EcoRI-Fragment in den
pEMBL8+ subkloniert. Die beiden klonierten Fragmente sind
ABBl
hervorgehoben.
Dente et al.,
Messing,
geeignet,
verwendeten
pEMBL-Vektoren (ABB2,
1983) sind Abkömmlinge der pUC-Vektoren (Vieira und
1982)
da
Die
und
sie
sind
zur
DNA-Sequenzierung
besonders gut
eine F1-Region besitzen, die die Synthese von
einzelsträngiger DNA, nach Zugabe eines Helferphagen, ermöglicht.
Im
Gegensatz
zu
Sequenzierungsvektoren,
den
die
üblichen
von
dem
Phagen
einzelsträngigen
Ml3
abstammen,
zeichnen sich die pEMBL-Vektoren durch ihre kleine Größe und ihre
Stabilität
aus. Außerdem können sie als doppelsträngige Plasmide
vermehrt werden.
61
pEMBL
8'
4 kb
Hind 111
Eto Rl
s~'GAAIIC'ccGG'GGA!Cc'G!CGAcc TGCAGCCAAG c 11 GG c IAc 1GG cc Grc GT111 Ac 1 - 3'
Sn;;;) Bomlll
EcoRI
Soll
Psi!
o·
Hind 111
llind 111
5'GCCAAGC!IGGC!GCAGGICGACGGA!Ct'CC GG'GAA!lc'IACIGGCCG!CGI!ITACl -3'
!lind 111
Psi!
~ ßom Hl
--s;;;ar- Eco Rl
9'
llind II
-
ABB2:
3' -I GACC GG CAGCAAAA! G -5' Primer
pEMBLB•-Vektor und Polylinker-Bereich der pEMBL-Vektoren
Oben ist der pEMBLB•-vektor nbgebildet (Dente et al.,l983).
Unten
ist
die
pEMBL9•-Vektors
Bindungsstelle
Sequenz
im
angegeben.
des
Ml3
Polylinkerbereich des pEMBLB•- bzw.
Die
eingernhmtc
Sequenzierprimers.
Sequenz
Der
zeigt die
Pfeil gibt die
Richtung
der1 Sequenzlerreaktion
einzelnen
Sequenzen markieren die Reatriktionaschnittstellen, in
die subkloniert wurde,
an.
Die
Klammern
Uber
den
62
2. Die klonierten Subfragmente enthalten Exon-Seguenzen
Die
klonierten
quenzen
Fragmente sollten noch transkribierte Albuminse-
enthalten
und daher mit Albumin mRNA hybridisieren kön-
nen. Um dies sicherzustellen, wurden die erhaltenen rekombinanten
Subklone
die
einer
Klone
"Southern-Blot"-Analyse
entweder
ausgeschnitten,
radioaktiv
linearisiert oder die inserierten Fragmente
elektrophoretisch
markierte
hybridisiert
spezifische
(ABB3).
unterzogen. Dazu wurden
aufgetrennt
polyA+-RNA
PolyA+-RNA
aus
aus
und
Xenopus-Leber
der
der
gegen
enthält
Leber
10%
Albumin mRNA, die mit Exon-Sequenzen auf dem Subklon
hybridisieren sollte.
1
2
ABB3:
-6.7 kb
Das 68kd Subfragment enthält Exonsequenzen
Autoradiographie
einer
Southern Analyse des 68kd
Subklons (68kd Eco RI/Bam MI-Fragment in pEMBL9+),
l~g
Eco
RI
linearisierter
EcoR/BamHI-geschnittener
-2.7
kinasierter
hybridisiert.
Subklon
polyA•-RNA
Die
Subklon (1) bzw.
aus
Größe
hybridisierten, ist angegeben.
(2)
der
der
l~g
wurden mit
Frosch-Leber
Fragmente,
die
63
ABB3 zeigt das Ergebnis der Analyse für den 68kd Subklon. Der mit
Eco
RI
linearisierte 6.7kb große,
mit
der
mRNA
(Spur
Albuminsequenzen,
große,
l).
denn
Diese Reaktion war spezifisch für die
in
ausgeschnittene
gesamte Subklon hybridisierte
Spur
2
hybridisierte nur das 2.7kb
Albumin-Fragment.
Für
den 74kd Subklon
wurde das gleiche Resultat erhalten (Daten nicht gezeigt).
Die
subklonierten
DNA-Fragmente
beider
Gene
enthalten
also
transkribierte Sequenzen.
3. Die Subklone besitzen eine Promotor-Region, die von der
RNA-Polymerase II erkannt wird.
Die
klonierten
Subfragmente sollten den Albuminpromotor mit der
Startstelle der Transkription besitzen.
Die
Transkription der meisten eukaryontischen Gene erfolgt durch
die
RNA-Polymerase II. Die korrekte Initiation der Transkription
ist
abhängig
(TATA-Box),
von
das
einem
sich
konservierten
ca.
30bp
5'
AT-reichen Sequenzmotiv
von
der
Transkriptions-
Startstelle befindet (Serfling et al.,l985a).
Mit
"in
von
den subklonierten DNA-Fragmenten Transkripte erhalten werden
können,
Dazu
d.h.
wurden
Zugabe
von
wendete
für
vitro Transkriptions"-Experimenten wurde untersucht,
ob sie eine TATA-Box besitzen.
die isolierten Fragmente mit HeLa-Zellextrakt unter
Ribonukleotiden
HeLa-Zellextrakt
die
ob
Transkription
a(3 2 P)rUTP inkubiert.
und
enthielt
wichtige
Der ver-
RNA-Polyrnerase II und andere
Faktoren. Wenn das eingesetzte
DNA-Stück eine TATA-Box, wie oben beschrieben, enthält, sollte in
vitro
eine
transkribiert
radioaktiv
werden
markierte
(Manley,
RNA
von der eingesetzten DNA
1980). Aufgrund der Größe der in
64
transkribierten RNA und der des eingesetzten DNA-Fragments
vitro
kann
man
Rückschlüsse
auf
Lage
die
des Transkriptionsstarts
ziehen.
Für
das
Experiment
Subfragmente
Hindiii/Bam
außerdem
und
die beiden isolierten 6ßkd und 74kd
wurden
vom
ein
Subklon abgeleitetes
68kd
HI-Fragment, das vom 5'Ende her um lkb verkürzt war,
verwendet.
";; ~
>
(I)
68 E/B
Cl
b
a
1
68H/B
c
b
a
74 B/E
c
,------,
a
c
-2.7kb
-1.7
1.1
0.6
ABB4:
Die subklonierten Albuminfragmente enthalten
Promotorelemente
Autoradiogramm
wurde
mit
durchgeführt.
folgenden
DNA(SV40),
eines
1.4%igen
HeLa-Zellextrakt
Von
links
DNA-Fragmenten
keine
llindiii/Bamiii
Agarosegels.
DNA
und
nach
74kd
unter
rechts
aufgeführt:
(-DNA),
Die
6Bkd
Transkription
Standardbedingungen
sind die Transkripta von
l~g
Psti-geschnittene SV40
Albumin
Bamiii/EcoRI.
Die
EcoRI/Bamlll, 6Bkd
verschiedenen,
eingesetzten Konzentrationen waren: a=500ng, b=750ng, c=lOOOng.
Die dicken Pfeile zeigen auf die spezifischen Transkripte.
65
ABB4
zeigt
das
Transkription.
RNAs
und
Ergebnis
durchgeführten
in
vitro
Von den Albumin-Subfragmenten wurden jeweils zwei
transkribiert.
den
der
Die
spezifischen RNAs für den 68kd Subklon
abgeleiteten, verkürzten Klon waren gleich groß:
l.lkb;
das spezifische Transkript vom 74kd Subklon war 0.6kb groß (große
Pfeile).
wurden
(kleine
Durch
neben
den
Pfeile)
DNA-Stücke
erwarteten
von Anfang bis Ende der Fragmente
spezifischen
erzeugt,
auch
deren
unspezifische Transkripte
Größe mit der der eingesetzten
übereinstimmte (Manley,l983).
.eingesetzten,
(vergl.
Transkription
linearisierten
Größen
von 2.04,
SV40-DNA
Von einer als Kontrolle
wurden
vier
RNAs
der
1.94, 1.86 und 1.67kb transkribiert
Handa et al. ,1980), während aus dem Ansatz ohne DNA kein
Transkript erhalten wurde (SV40, -DNA).
Beide
genornisehe
Startstellen,
von
denen
Startstelle
Subfragmente
die
von
enthalten
also
Transkriptions-
der RNA-Polymerase I! erkannt werden und
aus in vitro Transkripte initiiert werden können. Die
im
68kd-Subfragment befindet sich ca.
Bam
BI-Schnittstelle.
ist
wesentlich kleiner,
Die
l.lkb von der
vom 74kd Fragment transkribierte RNA
ihre Startstelle befindet sich ca. 0.6kb
5'von der Eco RI-Schnittstelle.
66
4. Die Seguenzierung der Subklone
Die
soweit
überprüften genorniseben Subfragmente wurden zur Her-
stellung weiterer Subklone herangezogen, dabei wurde von internen
Restriktions-Schnittstellen
wurden
zur
ausgegangen.
Alle
erhaltenen Klone
DNA-Sequenzierung herangezogen (ABB5a,b). Die beiden
Methoden
der
Gilbert,
1980) erfassen maximal nur Sequenzen bis zu einer Größe
von
350bp.
wurde
DNA-Sequenzierung
(Sanger
et al.,l977; Maxam und
Um die gesamte Sequenz der Klone abdecken zu können,
eine
gerichtete
fortschreitenden
Sequenzierung
5'Deletionsmutanten
mit
durchgeführt
Hilfe
(Poncz
von
et
al. ,1982).
Mit
Hilfe
der
verschieden
Exonuklease
große
aktionsbedingungen
tionen
das
in
Bal31 wurden am 5'Ende der Subklone
Deletionen
wurden
eingeführt
dabei
und kloniert. Die Re-
so gewählt, daß sich die Dele-
ihrer Größe um jeweils 100-150bp unterschieden. Durch
Ansequenzieren
Sanger-Methode
dieser
erhält
Deletionsmutanten
nach
der
man nacheinander abfolgende, überlappende
Sequenzen.
Zunächst
direkt
und
wurde
in
lOx
ends)
die
erzeugten Bal31-Deletionsmutanten
die Polylinkerregion der pEMBL-Vektoren (in die Smai-
BamHI- bzw. EcoRI-Schnittstelle) einzubringen. Diese Art der
Klonierung
durch
versucht
war nicht sehr effizient. Zur direkten Klonierung der
Bal31
mehr
erzeugten stumpfen Enden (blunt ends) benötigte man
DNA als zur Klonierung von überstehenden Enden (sticky
nötig
war. Auf diese Art wurden nur drei unterschiedliche
Deletionsl<lone
Aufgrund
dieser
vom
68kd Subklon (-1425,-211 und +449) erhalten.
niedrigen
Ausbeute an Deletionsmutanten wurden
zur
weiteren Klonierung synthetische Linker-Sequenzen verwendet.
Die
Linker-Sequenzen
wurden
an
die stumpfen Enden ligiert und
67
durch
nachfolgenden Restriktionsverdau konnten dann überstehende
Enden
erzeugt
ließen.
Es
werden,
wurden
die
sich
jeweils
die
schießlieh
leicht
klonieren
Restriktions-Schnittstelle als
Linkersequenz eingebracht, von der aus deletiert worden war.
Ein
bedeutender
DNA-Fragmente
Vorteil
für
die
Bal31-Deletionsmutanten
dieser
gerichteten
Sequenzierung
später
zur
Unterteilung
lag auch darin, daß diese
Untersuchung der Regulation
der Gene herangezogen werden konnten.
ABB5:
Restriktionskarten der 68kd und 74kd Subklone und deren
Sequenzierungsstrategie
5a: 68kd Subklon
5b: 74kd Subklon
Die
Restriktions~arten
angegeben.
Die
entsprechend
einzelnen
mit
den wichtigsten Schnittstellen sind
erstellten Subklone und 5'Deletionsmutanten sind
ihrer
Lage
Deletionen
eingezeichnet.
sind
sind
Die
angeschrieben.
durch
einen
Anfangspunkte der
Die
nach
Sanger
dickeren
Strich
sequenzierten
Bereiche
hervorgehoben,
die gestrichelten Pfeile markieren die nach Maxam
und Oilbert sequenzierten Bereiche.
der
68
68 kd
a:
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74 kd
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-1237
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-1173 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1
-1100 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - i
-1091 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1
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- 283 1 - - - - - - - - - - - - 1
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+55 1 - - - - - - - - i
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+ 266 1 - - - - - l
+312
1------l
70
Die
Sequenzierung
1977)
der
erlaubte
Subklone
Sequenzierung
nach der Kettenabbruchmethode (Sanger et al.,
es
bis auf wenige Ausnahmen die gesamte Sequenz
sicher aufzuklären.
In ABB6 ist als Beispiel einer
nach
von Sanger die Autoradiogaphie
der
Methode
eines Sequenziergels gezeigt.
Einige
Bereiche,
(homopolymer
z.B.
Regionen),
(Klenow-Fragment)
Teil
dieser
Reverser
sehr
nicht
AT-reiche
konnten
mit
sequenziert
Problemstellen
Transkriptase
der
werden
konnte
(BioRad
oder GC-reiche Regionen
durch
Bulletin
DNA-Polymerase
(Smith,
1980). Ein
Sequenzierung
1205)
I
oder
mit
durch
geänderte Reaktionsbedingungen (Inkubation mit Hinc II-Puffer bei
56°Cj
Gomer
et
al.,
1985)
aufgekärt
werden. Wenige Bereiche
konnten jedoch trotz verschiedener, angewandter Variationen nicht
eindeutig analysiert werden.
Pfeile)
und
wurden
Gilbert,
schnittstellen
daher
1980)
Diese Bereiche (ABB5a,b:gestrichelte
mit der Basenmodifikations-Methode (Maxam
sequenziert.
wurden
Ausgehend
von
Restriktions-
die Subklone oder Deletions- mutanten vor
dem zu sequenzierenden Bereich linearisiert, dephosphoryliert und
mit einem weiteren Restriktionsenzym hinter dem zu analysierenden
Bereich
nachgeschnitten. Das DNA-Fragment wurde isoliert, an der
dephosphorylierten
Sequenzanalyse
Schnittstelle
unterzogen.
Auf
radioaktiv
diese
einiger Bereiche vollständig abgesichert.
Art
markiert
wurde
die
und
der
Sequenz
71
II
II
GACTGACT
ABB6:
Nukleotidsequenz
Albumingene im
beider
Bereich
der
Kenopus
TATA-Box
und
des Transkriptionastarte
Autoradiographie
eines Sequenziergels. Die
Nukleotidsequenz wurde nach der Methode von
Q.
~
ro
u
Sanger von
und
74kd
den
Gens
Sequenzbereiche
kiert
und
Bgl II-Subklonen
aus
erstellt,
sind
durch
angeschrieben,
des 68kd
Wichtige
Klammern mareinzelne Basen
dazu sind durch Punkte hervorgehoben •
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72
68kd Albumin
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CAAGAGATGTGGTTGAAAAGGGCAAACTTTTGTGTATATTTCACCAGTATGAGACTCGCGAATAGAAAACTCCAGGGAAAATATGTATGTTGCTGTAGCA
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AGTGTGGCTGTTTTTATTTTGCCAGCTCAGGAAAAGATAAATAGGTCTCTGGAGTGGATGGAGGAGAGCAGGGTGGGACCTCCATTCCATACTCCATTTA
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AAAGCCAACTAAGTTGGTGAGGAAAGTGTATCAAGCCTACATGGAAATAATATGACAAATATTTAGCAAATATACCCAGTGAAATATTTACAGTAAACAT
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ATATATGCAAATAATTACTCTTTTCTTTTTAGTCTA66ATTGTAATT66ATTAACCTTGCATGCACATCCTGGAA6CATTAATACATAATATCT66CTAT
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AGATGAA6ATTTTATATTTGTTATTTGACTTTTTACAGTTTCCCCCAAGCABTATAGTTTTATTCTTTG66AT6TTATBTTTTTATATAAATTGTTTATA
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TAGAAAGT66ATGAGCTTATATTCATTTGTCTATGTCACCATGTTTTATGAATTTTBTTTACTTTGCTTTTTTACTTTATGCTATTAT66ACAATACAAT
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GAATGCTTAAGTACTTATnACTACTTCABTTATATAAATGCTTCTBTTTABGATCC
73
74kd Albumin
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66ATCCATCCTGASATCTATATCTTAT666AT66AAACTCCGCATTCATT6666AAAGCGTCTCCTSACCAAASCATTGTAGATCTTCTCCACTGCTACC
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ATATATATTTATAATGCTTAATTATSSCTATCTTGTASATSCAGACCATCACAAGCATATTGCTSATGTATACACCGCATTSACTGAGCGSACCTTCAAA
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I
SGACTGTAASAATTATATCCAAATATACATTATACTAATAAAACATATAA
74
ABB7:
Die Nukleotidsequenzen der 5'Enden der beiden Kenopus
Albumingene
7a: 68kd Albumingen
7b: 74kd Albumingen
Die
TATA-Box
ist umrahmt. Der Start der Transkription ist durch
einen'Pfeil gekennzeichnet.
Der
sequenzierte
(ABB7a),
Bereich
des
68kd
Subklons
umfaßte
2656bp
der des 74kd Subklons 2074bp. Um für das 74kd Albumingen
einen
zum
68kd
Gen
vergleichbaren Bereich abdecken zu können,
wurde
noch
ein
zum
sequenzierten
74kd
Subklon benachbartes,
genomisches Eco RI/Bgl !I-Fragment subkloniert und vom 5'Ende her
ansequenziert.
(vergl.
ABBl, ABB5b). Somit wurde für das 74kd Gen
ein ähnlicher Bereich von insgesamt 2350bp sequenziert (ABB7b).
Aus
den erstellten Sequenzdaten kann durch Auffinden der für die
RNA-Polymerase
Sequenzen,
}{artiert
II
der
werden.
transkribierten
TATA-Box
und
der
Gene typischen konservierten
CAAT-Box,
die Promotorregion
Der Anfang der proteinkodierenden Sequenz liegt
3'von der TATA-Box und ist durch ein Methionincodon ATG, dem sich
offenes Leseraster anschließt,
gekennzeichnet.
75
Eine
TATA-Box
erstellten
bzw.
konnte
Sequenzen
in
den
für
beide Gene (68kd bzw. 74kd)
identifiziert werden. Sie befindet sich 19
l8bp 3' von der Bgl !I-Schnittstelle entfernt. Damit ist sie
für beide Gene ungefähr an der Position, die aufgrund der anfangs
durchgeführten
wurde,
in
vitro
Transkriptions-Experimente
erwartet
für das 68kd Gen l.lkb 5' von der Bam HI-Schnittstelle und
für das 74kd Gen ca. 0.6kb 5' von der Eco RI-Schnittstelle.
70bp 3'
offenes
mit
AGGT
der
von der TATA-Box entfernt, findet sich für beide Gene ein
Leseraster,
üblichen
enden
das
für 26 Aminosäuren kodieren könnte und
Konsensussequenz
könnte (Gannon et al.,
für eine Exon/Intron-Grenze
1979). Dieser Bereich ist bis
auf wenige Nukleotide für beide Gene identisch (ABB7a,b).
76
5.
Kartierung der in vivo benutzen Startstelle der
Transkription
Der
Start der Transkription,
3'
der sich meist 20 bis 30 Nukleotide
von der TATA-Box und vor dem Translationsstart befindet, kann
aufgrund
der Sequenzdaten allein nicht bestimmt werden.
dessen
wurden
herangezogen,
dazu
die
in
vitro
Aufgrund
Transkriptions-Experimente
sowie SP6-Analyse- und "primer extension"-Analysen
der in vivo vorkommenden Albumin mRNAs durchgeführt.
Die
zur
Überprüfung
der
Subklone
durchgeführten
in
vitro
Transkriptions-Experimente
(ABB4) für den 68kd Klon deuteten auf
einen
hin,
Transkriptionsstart
stelle
ist.
5'
liegt
Für
von
SP6-
und ca.
den
der
74kd
l.lkb von der BamHI-Schnittstelle entfernt
Klon wurden Transkripte erhalten,
EcoRI-Schnittstelle
und
"primer
Transkriptionsstart
der 3' von der Hindili-Schnitt-
initiiert
extension"-
Exon charakterisiert bzw.
wurden. Mit Hife von
Analysen
genauer festgelegt,
die 0.6kb
sollte
der
und das erste und zweite
identifiziert werden.
5.1. SP6-Analyse der Albumin mRNAs
Mit
einer
RNA-Probe
des
untersuchenden RNA komplementären markierten
werden.
Durch
geschickte
Wahl einer SP6-Probe,
die
über die vermuteten Exon-Bereiche erstreckt, kann die Größe
Exons
bestimmt
und
die
auch die Position der Transkriptions-Startstelle
werden.
DNA-Fragmente,
in
zu
(SP6-Probe) können Transkripte spezifisch entdeckt und
analysiert
sich
zur
Zur
die
SP6-Vektoren
Herstellung
einer
solchen
Probe werden
die zu untersuchenden Bereiche enthalten, so
kloniert,
daß
die
davon
synthetisierte
77
RNA-Probe
komplementär
Hybridisierung
entstehen
der
SP6-Probe
dort,
doppelsträngige
nachfolgenden
zur
wo
zellulären
mit
sich
RNA-RNA-Hybride.
RNase-Abbau
der
die
zu
RNA
ist.
Nach
untersuchenden RNA,
Sequenzen
entsprechen,
Diese Hybride sind gegen einen
resistent.
Die Größe der geschützten
Hybride ist ein direktes Maß für die Größe des Exons.
Für
das
68kd
hergestellt,
und
die
das
74kd Gen wurden verschiedene SP6-Proben
das vermutete 5'Ende enthalten (ABBB), und zur
Untersuchung der Albumin mRNAs eingesetzt wurden. Die SP6-Analyse
der
beiden
beiden
Xenopus Albumin mRNAs ist nicht ganz einfach, da die
mRNAs
Aufgrund
einander
dessen
hybridisieren.
Hybride
sind
verschiedenen
stabileren
zwei
kann
Die
dann
sehr ähnlich sind (Westley et al.,l981).
eine
durch
parallelen
die
instabiler.
beim
Hybride
mit
beiden
RNAs
kreuz
Kreuzhybridisierung entstehenden
allerdings
Temperaturen
korrekten
SP6-Probe
Durch
RNase-Verdau
selektionierten.
die Wahl von
kann man auf die
Daher wurde bei
Analysen der RNase-Verdau bei unterschiedlichen
Temperaturen, 30°0 und 45°0, durchgeführt.
78
s.,.
1=1
c:
0,
=<:
68 kd
;;
+1
~~
i
'CD
I
•
;;
E
="'
zur
CD
CD
I I
'I
..
u
LW
I
I
®
117 nt
Kartierung des Tronekriptionstnrtes verwendeten
SP6-Proben
Die
spezifischen
g e n o mische 11
Exons
DNA
dnr.
gel<ennzeichnet.
Der
SP6-Proben
sind
ein g e z e ich 11 e t • Di e
67 nt
37 nt
I
I
I
.. I
Die
117nt+67nt
0
+117
I~
ADDB:
117 nt
c;:;
:::::
g+1
74 kd
protected fragments:
I
I
I
I
I
I
I
="'
li!II!Jj
I
I
... I
E
+604 +670
+117
entsprechend
s
ihrer Loge zur
c h war· z e n Dl ö c k e
Trnnsltriptionsstnrt
ist
dur·clt
s
t e ll e n d i o
einen
Pfeil
79
m
2
3
4
2 3 4
122110-
90-
m
5 6
76-76
67-
J[
-67
-
34-
ABB9:
-34
Identifizierung
von
transkribierten
Sequenzen
in
den
Subldonen
Autoradiogramm
Analyse
wurde
durchgeführt.
der
der
mit
Die
RNase-Verdau
durchgeführt.
eingesetzt:
SP6-Analyse
Von
Probe
0.6~g
wurde
links
Xenopus
polyA•-RNA
Hybridisierung
aus
Albumin mRNA. Die
der
Frosch-Leber
erfolgte über Nacht bei 45°C,
entweder
bei
30°C
oder
bei
·45°C
nach rechts wurden folgende SP6-Proben
1 (1), Probe 2 (2), Probe 3 (3), Probe 5 (4),
Probe 3 (5), Probe 4 (6). m
Die
der
= DNA-Größenmarker
indikativen Fragmente sind durch Pfeile markiert. Durch eine
Klammer
sind
hervorgehoben.
die
für
das
zweite
Exon spezifischen Fragmente
80
ABB9
zeigt
74kd
mRNA
das
Ergebnis der Analysen·. Bei der Untersuchung der
mit Probe 5, die zum 74kd Bgl II/Eco RI-Restriktions-
fragment
komplementär
ll6/ll7nt
Größe
die
war,
gefunden
wurden
geschützte
Fragmente
von
(Spur 4). Dieses Resultat wurde durch
zweite Analyse, die unter stringenten Bedingungen stattfand,
noch
verdeutlicht
(45°C,
Spur4) und entsprach den Erwartungen,
die aufgrund Sequenzdaten aufgestellt worden waren.
Der
74kd
Subklon enthält nur das erste Exon mit einer Größe von
ll7bp. Wenn man von der möglichen Exon/Intron-Grenze, die nur auf
Sequenzvergleichen
basiert,
ll7bp
zurückrechnet, befindet sich
die Startstelle der Transkription 32 bp 3'von der TATA-Box.
FUr
die
68kd
rihnJichen
mRNA
Bereich
wurden
ll7nt,
Spur
2).
65-70nt
der
komplementär
Restriktionsfragment,
(jeweils
mit
SP6-Probe 2, die zu einem
war,
dem
68kd
Bgl li/Bam HI-
verschiedene geschützte Fragmente entdeckt
Es traten hauptsächlich Fragmente der Größen
und
40nt
auf.
Der
RNase-Verdau
bei
höherer
Temperatur führte zu einer unwesentlichen Verringerung der Banden
im
Größenbereich
deutlich
zu
zwischen
erkennen,
40
daß
und
60nt (45°C, Spur 2). Es war
spezifisch
Fragmente
der
Größen
ll6/ll7nt, 65-70nt und 40/42nt geschützt werden.
Dieses
Resultat
untersuchte
führte
zunächst
zu
der
Vermutung,
daß
der
Bereich des 68kd Gens im Gegensatz zum 74kd Gen noch
weitere Exonsequenzen enthält.
Daher
wurden
aufgrund
weitere
Analysen mit SP6-Proben durchgeführt, die
der Sequenzdaten spezifisch für das erste (Probe 1) und
zweite Exon (Probe 3 u. 4) sein sollten (vergl. ABB8).
Die
für
das
Deletionsmutanten
umfassen,
stelle
zweite
Exon
spezifischen
Proben
wurden
von
erhalten. Probe 3 sollte das ganze zweite Exon
sie war dem Bereich von +449 bis +1050 (BamBI-Schnitt-
komplementär.
Probe
4
dagegen
sollte ungefähr bis zur
81
Mitte
des zweiten Exons reichen, sie war komplementär zur Region
von +634 bis +1050 (BamHI-Schnittstelle).
Probe
4
schützte
während
(Spur
ein Fragment der Größen von 48-50nt (Spur 6),
mit
Probe 3 Fragmente der Größe 63-67nt entdeckt wurden
u.
5), von diesen blieben nach der stringenten Analyse
3
nur noch Fragmente der Größen 63 u.
Diese
mit
den
SP6-Proben
für
3
das
und
vermutete
4
ursprüngliche Annahme,
64nt übrig (45°C,
zweite
erhaltenen
Exon
Resultate
Spur 3).
spezifischen
bestätigen
die
daß der von Probe 2 abgedeckte Bereich und
somit der 68kd Subklon noch zusätzlich das zweite Exon enthält.
Die
Analyse
brachte
kein
Bgli/Aha
der
für
klares
ersten
kurzen
geschützt,
das
erste Exon spezifischen Probe l
Ergebnis.
III-Fragment
vermuteten
dieser
mit
und
umfaßte
damit
entsprach
den
Bereich
einem
des
Exons und lObp des nachfolgenden Introns. Mit
Probe
l
wurden wider Erwarten mehrere Fragmente
Analyse
bei
höherer
Veränderung im Bandenmuster (45°C,
Auftreten
erklären,
Probe
die hauptsächlich 70 und 40nt groß waren (Spur 1). Die
stringente
Das
Diese
dieser
Banden
Temperatur
brachte
keine
Spur 1).
läßt
sich
zunächst
nur dadurch
daß das erste Exon des 68kd Gens vermutlich kleiner als
angenommen
und
daher
möglicherweise unterschiedlich zu dem des
74kd Gens ist.
Um
diese
besser
Daten
zu
zu
überprüfen und das erste Exon des 68kd Gens
charakterisieren,
wurde
eine
"primer
extension"-
Analyse der RNA durchgeführt.
5. 2.
"primer extension" -
Analyse der Albumin mRNAs
Bei der "primer extension" Analyse wird ein radioaktiv markiertes
Oligonukleotid,
das komplementäre Sequenzen zur zu untersuchenden
82
mRNA hat, an die RNA hybridisiert und als Primer benutzt. Mit der
mRNA
als
Reverse
Matrize
Transkriptase
Richtung
beginnt,
für
Aus
wird
vom
Primer
aus
mit dem viralen Enzym
eine Kettenverlängerung (extension)
durchgeführt.
Die
Extension
in 5'
bricht dort, wo die mRNA
also bei der Transkriptions-Startstelle, ab, weil danach
die
Reverse Transkriptase keine Matrize mehr vorhanden ist.
der
Größe
der
Initiationsstelle
der
verlängerten
Ketten
kann
die
genaue
in vivo vorkommenden Transkripte bestimmt
werden.
Basierend
auf
gewonnenen
den
DNA-Sequenzdaten und den aus der SP6-Analyse
Erkenntnissen
transkribierten
Bereichen
wurden
Primer
synthetisiert,
die zu
komplementär sein sollten (ABBlO).
Um
zwischen den beiden sehr homologen Albumin mRNAs unterscheiden zu
können, wurden vor allem auch Primer für einen Bereich der beiden
Albumin
eine
mRNAs hergestellt, die sich aufgrund der Sequenzdaten um
Base
Primern
unterscheiden
sollten
die
sollten
Startstellen
(primer
b und d). Mit diesen
der Transkription der beiden
Gene und die Exon/Intron-Ubergänge charakterisiert werden.
83
TGTC TACATCTGGTA
128 nt
- - - - - - - - -----------
-~--+: ®
·1~--------A~uo________________~·11~Lo4______________·~67o
68 kd
------------------------ -7~
135 nt
TGGTAGTGTTCG
53 nt
----- ------41:®
/
\
TACTTCACCTAGTGG
~
I®
- ----------41:
53 nt
AUG
128 nt
-
+117
+722
+788
_j~/
74 kd
- - - - - - ------------- ~--+:@)
TGTCTACG TC TGGTA
ADDlO:
Die zur "primer extension"-Annlyse verwendeten
Ollgonukleotidprimer.
Erstes
und zweites Exon des 68l<d sowie des 74l<d Albumingens siud
dargestellt.
Anfnugs-
und
Klommern
Die Zahlen Uber den kodierenden Sequenzen geben dlo
r
Endpunkte
der
Exons
symbolisieren
die
Intronsequenzen.
Primer
mit
ihrer
J.o.ge
zu
den
Extensionsprodukte
spezifischen
kodierenden
sind
nn.
Die
dUnn gezeichneten
Die
verwendeten
Sequenz sind entsprechend ihrer
Sequenzen
durch
die
eingezeichnet,
gestrichelte
verdeutlicht, ihre erwartete Oröße ist Jeweils angegeben.
Die
Linie
84
b
c
m
ITI
a
i92
184
124
123
i04
89
primer b
80
64
57
51
ABBll:
In vivo Transkriptionastart und partielle Sequenz der
Kenopus Albumin mRNAs
A:
polyA+-RNA
verschiedenen
primern (a,b,c) analysiert. Die Extensionsprodukte
sind
Pfeile
durch
Frosch-Leber
der
aus
gekennzeichnet.
wurden
mit
DNA-Größenmarker
m
(pBR322/Hae !li-geschnitten),
11
B:
Die
primer extension" -Sequenzierung der Albumin mRNAs mit
den
Primern a, b und d wurde wie die "primer extension"- Analyse
durchgefUhrt,
doch in Gegenwart der entsprechenden ddNTPs (1.7mM
Endkonzentration).
Es sind die Sequenzbereiche dargestellt, in denen sich die beiden
ansonsten
homologen
mRNAs
erstellten
Sequenz
Basenfolge
angeschrieben,
Uberlagerte
6bkd
Primer
b
und
d
ist
Sequenz
unterscheiden.
die
fUr
die
während
durch
Bei der mit Primer a
74kd
die
Sternchen
mRNA
schwach
spezifische
zu
lesende,
hervorgehoben
ist.
erkennen spezifisch die 68kd bzw. 74kd Albumin
mRNA, die dafUr typische Basenfolge ist angeschrieben.
85
ABBllA
zeigt
Primern
das
Ergebnis
der
Analyse. Mit allen eingesetzen
wurden Extensionsprodukte erhalten, d.h.
alle konnten an
transkribierte Sequenzen hybridisieren.
Mit
dem
für
das erste Exon spezifischen Primer a, der aufgrund
der
Sequenzhomologie
in
diesem
Bereich
beide
mRNAs erkennen
sollte, wurde ein 53nt großes Extensionprodukt erhalten (Spur a).
Ein
Extensionsprodukt
SP6-Analyse
bestätigt
der
dieser
74kd
zumindest
mRNA
für
Größe
auch
wurde
erwartet.
auf
Dieses
Grund
der
Resultat
das 74kd Gen, daß sich die Startstelle
der Transkription 32bp 3'von der TATA-Box befindet.
Mit Primer c, der seine komplementäre Sequenz im zweiten Exon der
Gene
haben sollte, wurde ein Extensionsprodukt mit der Größe von
l35nt
gefunden (Spur c). Dieses Resultat bestätigt zum einen den
obigen
Befund
über
die
Lage des Transkriptions-Starts und zum
anderen die Präsenz des zweiten Exons.
Mit
Primer b,
die
vermuteten
ebenfalls
des
eine
Exon/Exon-Grenze
beim
der
74kd
Vermutungen
hybridisieren
Kettenverlängerung
Extensionsproduktes
Startstelle
wie
der spezifisch für die 68kd mRNA sein und der über
betrug
sollte,
erhalten (Spur b).
128nt.
wurde
Die Größe
Damit befindet sich die
Transkription des 68 kd Gens an gleicher Stelle
Gen. wird. Die aufgrund der Sequenz angestellten
über
den
Verlauf
der Exon/Exon-Grenzen waren also
richtig.
Dieses
mit
darauf
zurückzuführen
homologen
Primer
74kd
unterscheiden
sich
eine
Base.
mRNA
analysiert
b
erhaltene Resultat könnte allerdings auch
sein,
daß
dieser
mRNA
hybridisierte,
im
Bindungsbereich
Primer
denn
mit
die
der sehr
Sequenzen
des Primers eben nur um
Um zu beweisen, daß mit Primer b spezifisch die 68kd
wurde,
extension"-Sequenzierung
wurde
der
mit
mRNA
diesem
Primer eine "primer
durchgeführt.
Parallel dazu
86
wurde,
mit dem entsprechenden um ein Nukleotid unterschiedlichen
Primer
d,
der
spezifisch
die
74kd
mRNA erkennen sollte, die
gleiche Analyse vorgenommen.
Mit
der
RNA-Sequenzierung
abgedeckt
werden,
da
konnte
nicht
der ganze Exonbereich
oft unspezifische Kettenahbrüche erhalten
wurden. Dennoch konnten für einige Bereiche ganz deutlich lesbare
Sequenzen erhalten werden.
Mit
Primer
b
wurde
( ABB llB)
eine
RNA-Sequenz
erhalten,
die der 68kd
DNA-Sequenz entsprach., während mit Primer d , eindeutig die 74kd
mRNA
erkannt
aufgrund
sollte,
wurde
der
(llB, primerb u. d). Mit dem Primer a, der
homologen
wurde
überlappenden
eine
Sequenz
an
Hybridsequenz
Sequenzen
der
beide
mRNAs hybridisieren
erhalten,
68kd
die
sich aus den
und 74kd mRNAs zusammensetzt
(ABBllB, primer a).
An
einigen
Stellen
DNA-Sequenz
wurden
Unterschiede in der RNA-Sequenz zur
entdeckt, die trotz nochmaliger Überprüfung bestehen
blieben. Dies wurde vor allem für die 68kd-Sequenzen gefunden bei
Position
möglich
68kd
+83,
Gen)
an
Artefakten
über
RNA
den
einigen
könnten
+95
(Daten
nicht
gezeigt). Es könnte
Stellen
allerdings
genetisch
auch
polymorph
sind. Die
infolge von Klonierungs-
entstanden sei. Diese Befunde erklären möglicherweise
Daten,
wurden.
und
sein, daß die DNA und damit auch die RNA (vor allem beim
Unterschiede
die
+86
die
Durch
für
die
ganzen
homolog.
das
68kd Gen mit der SP6-Analyse erhalten
Sequenzunterschiede
war die SP6-Probe nicht
Bereich des ersten Exons zur zu untersuchenden
Aufgrund dessen wurden statt des erwarteten großen
Fragments hauptsächlich zwei kleinere beobachtet.
Die
aus
der
"primer
extension"-Analyse
erhaltenen
Resultate
beantworten die eingangs gestellten Fragen:
Die
untersuchte
5'Region beider Xenopus Albumingene enthält die
87
ersten zwei Exons.
Die
in
vivo
benutzte
Startstelle
der
Transkription
konnte
aufgrund der sich deckenden Daten der Sequenzierung, der in vitro
Transkriptions-Experimente,
Analyse
Gene
eindeutig
32bp
stimmt
3'von
mit
kartiert
der
der
der
SP6- und der "primer extension"
werden. Sie befindet sich für beide
TATA-Box entfernt (ABB7). Diese Anordnung
für
eukaryontische
Promotoren
postulierten
Struktur überein (Serfling et al. ,1985a).
6. Die Seguenz der 5'Enden der Xenopus Albumingene
Die
erstellten
umfaßten
(2074bp
276bp
für
für
DNA-Sequenzen
das
den
68kd
Gen
für
beide
Xenopus
Albumingene
2656bp und für das 74kd Gen 2350bp
genomischen BamHI-EcoRI-Subklon und die ersten
des 3'benachbarten EcoRI-Bglii-Fragmentes). Darunter waren
1606bp 5'flankierende Region für das 68kd Gen bzw. 1517bp für das
74kd
Gen.
enthält
Das
eine
nachfolgende
erste
Exon
ist bei beiden Genen ll7bp groß.
nicht-translatierte
translatierte
Bereich
Region
von
38bp,
Es
der
kodiert für 26 Aminosäuren.
Der
Translationsstart
Mit
der Sequenz CAGTC unmittelbar vor dem Translation-Startcodon
entsprechen
3
Konsensus-Sequenz
der
Sequenz
der
möglichen
AG/GT,
Albumingen
definiert
al., 1986).
Danach
gleich
5
Basen
der
aufgestellten
CCA/GCC (Kozak,l984). Das erste Exon endet mit
Exon/Intronübergängen,
Intronsequenzen.
stimmt mit der Kozak'schen Regel überein.
die
wurde
einer
u.a.
(Gannon
Konsensussequenz
auch
et
für
al.,
das
1979;
für
menschliche
Sakai
et
folgen 486bp (68kd Gen) bzw. 604bp (74kd Gen)
Das
zweite
Exon
könnte für beide Gene wieder
groß, 67bp, sein. Es kann für 22 Aminosäuren kodieren und
endet zumindest für das 68 kd Gen (vergl. SP6-Daten) wiederum mit
88
einer
Konsensussequenz
CT/GT. Schließlich folgen für beide Gene
noch 380 bzw. 45bp Intronsequenzen (ABB7 und 13).
6.1. Die Sequenzen der beiden Gene zeigen große Homologie
Bei
einem Vergeich der 68kd Sequenz mit der des 74kd Gens wurden
sehr
große
Homologien
Sequenzhomologie
verdeutlicht.
speziellen
einen
wo
homolog
Für
beiden
diese
Gene
In
in
ABB12
einer
Darstellungsform
wird
"dot
wird
mit
diese
matrix"
einem
Computerprogramm immer eine Sequenzfolge von lObp der
Sequenz
eine
der
festgestellt.
mit der gesamten anderen Sequenz verglichen. Dort
Sequenzfolge
ist,
wird
mit
ein
Sequenzen identisch sind,
der zu vergleichenden Sequenz zu 80%
Punkt gesetzt.
Im Idealfall, wenn beide
entsteht eine Gerade.
89
68kd_...
- .• --------- 1------------1-· -··---·-----1-·- -··---··-· -1-------- ·-- ·1--- --
r
<;!
1
I
"'\
I
'~',,
.;sP<ON2
-- ···--. --
ADD12:
- 1-· ---. -----I- .. -. ---· ·- --1·--- ·-- --- --- 1- ·-·· ------- :-
Die Sequenzen der belden Xenopus Albumingene sind oehr
homolog
Bs
ist
ein
Dot
Matrix-Vergleich
der
beiden Albuminsequenzen
gezeigt. Die von links nach rechts verlaufende 60kd Sequenz wurde
gegen
die
verglichen,
10
Basen
von
oben
nach
unten
aufgezeigte
74kd
Sequenz
Eine zwischen belden Genen zu 80% homologe Folge .von
wurde
durch
einen
Punkt
gekennzeichnet,
kodierende Sequenzen umfassende Dereich ist eingerahmt.
Der
die
90
Der Homologiebereich erstreckt sich über 550bp. Er beinhaltet ca.
400bp 5'flankierende Sequenzen mit Promotorregion, das erste Exon
und
noch
ist
40bp des nachfolgenden Introns. Am größten - ca. 91% Homologie
die
Transkriptionsstarts
Homologie
75%
Exon
und
im
des
Bereich
der
TATA-Box,
des
ersten Exons. Ansonsten liegt die
zwischen beiden Genen bei 86%. Ein zweiter Bereich mit
Homologie beginnt im ersten Intron ca. l80bp vor dem zweiten
und endet ca. 40bp nach dem zweiten Exon. Die Homologie für
die kodierenden Sequenzen des zweiten Exons beträgt 88% (ABB13).
ABB13:
Die homologe Nukleotidsequenz der 68kd und 74kd
Albumingene.
Die
um
Sequenzen
ihre
der beiden Albumingene sind einander angeglichen,
große Homologie in diesem Bereich zu verdeutlichen. Die
l1onservierten Bereiche umfassen die Promotorregion, das erste und
zweite Exon.
Der 1ranskriptionsstart ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Die
TATA-Box
(l)
ist eingerahmt. Die Klammern markieren die Exon/Intron-
bzw. die Intron/Exon-Struktur (
J).
91
68kd albumin
74kd albumin
-~97
1160
TATTTAGCAAATATACCCAGTGAAATATTTACAGTAAACATATTTTAGAATTATGGTAAA
1118
I II
I I II
TTT
TTATTGTTAA
II
II
1220
TAAATGCTTTTACAAAGAAACATGCACAGATAAAAGAATCACATAAGGCTATTTGAACTT
1131
TAAATGCTTTTACAAAGAAAAATGTGCAAACAAAATGATCATATGAGGCTATTTGAACTT
1280
TGCATATAATTAGACTAAATGAAGATTTGGGCACATACCAATACACTAGTATACACAAAG
1191
TGCATATAATTGGACCAAATGAAGATGTGGGCCCAGACCAATACACTAGCATACGCAAAG
1340
ATCAGTTTGCTTAACCTTTTGTTCAGCAATTACCAAAGACGTTGACTAGCCCATGCTAGG
1251
ATCAGTTTGCTTAACCTTTTGTTCTGCAATTACCAAAGACTTTGATTAGCCCATGCTAGT
1400
TTTTTTTTCACAATTTAAAAGGTTTTT
11111111111111111·111
III I 1111111
II I
III
II
II I 1111111
I
II II
11111
II
II II
II
111111 I 11111111
III I 111111111
II II
11111
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1: I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
11111
111111
11111
CAAAATTCAGAAAACCAATATAGAGCAACAG
111
1111
111
111
1111111
11111111
1311
TTTTTCCCTTTAATTTACAAGGTCTTTAAAAAAAAGCAGCAAATCAATATACAGCAACAG
1458
CAATACGTTATTTGACCTTAAAAGTTGATTGACATTAGGAAATTCCACAAAGCTAAAACA
1371
CAATACATTATTTGACCTTAAAACTTATTTGACTTTAGG AACTCCACAAAGCTAAAACA
1518
ACTGCAAACAGAACAATTTGATAGGTTAATAATTTTCCAGATCTCTCTGAGCAATA~T
1430
ACTGCAAACAACACATTTTGATAGGTTAATCATTTTCCAGATCTCTCT AGGAATGG AT
1578
AAA
111111
11111111:1111111
1111111111
111
11111
II
11111111111111
11111
II
11111111111111111
11111111111111111
II
111
1111
+I
AAGAGGTATCACTCATTTCAGATCAGGCTTCTCAGAGGTCCCCACCCAATACATC
IIII I III
I
IIIII
IIIIIII IIIIIIIIIIII
II I I I I I I I I I I
IIIIII II
1489
AAGTGATATCAATCATTTCTGATCAGGCTTCTACGAGGTCCCCACCTAATACATC
1638
TCCAGTGATGAAGTGGATCACCCTCATTTGTCTGTTAATTAGCTCCACTTTAATAGAATC
1549
TCCAGTC~AAGTGGATCACCCTGATTTGTCTGTTAATTAGCTCCTCTTTCATTGAATC
1698
AAGAATAATTTTCAAAAGAGATACA~TAAGCCTTTAAATGCATTCATCGTTATTGAAAT
1609
AAGGATACTTTTCAAAAGAGATACA
1758
CCAAAAGCCTCCCCCTTCAATAAAGAATTTTTATGTAACTTTT
1669
CCAAAGACATCCAAATCTAATATTAAAAATAT
111111111111111111111111
111111111111111111111
1111
II
11111
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I
TAAGCCTTAAAATGCATTCATCGTTATTGAAAT
+183
IIIII
2000
I III
I
TT TGCCTAT AT
II
I
II
I I II
II
I I
CCAGTTAATCCCAA
I II
1111
111
I
TTA
CATACTATT
111
111
I
I
2000
ATATTATAACTTTAATTGGAAAGTTCTGCCCTATTTTACTATATCCAGGTTCATTTAACT
2037
t~b
TAG GTGCTGTTGGGGATTTTTTGCTTGATATTCTTAATATTCTTGATAGTCA
III
III
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 1:
I
2060
TACCAATTAGAATTCTGTTTGGGATTTTTTACTTGATATTCTCAATACTCTTCAT
I II II I III I IIIII I
A
2092
TTACAGACTGCTTTCTCTTTCTGTATCTTTTCATATTTCCATACTGTTTCTGTTCATGAT
2116
TT CAGCCTGCTTTCTCTTTCTGTGTCTTTTCATGTTTTCATACTGTTTCTGTGCATGTC
2152
GTTCTCT
TCATTTTATATTCATATATATTGATAATACTTTATTATGCCTTTCAT
I
I
h43
II
.
111
II
11111111111111111
I
I 1111111
111111111
111
111.111111
11111111111111
11111
111
111111
1111
II
II
I
2175
GACCTATTTGGTATAAATTTATATATATATATATTTATAATGCTTAATTATGGCTATCTT
2206
ACAtTGTAGACCATCACAAGCATATTGCTGACATGTACAATTTATTGACTGAGCGGACC
2235
GTA
2266
TTCAAAGGAC GTAAGAATTGTATCTAAATTTACAATATATGCAAATAATTACTCTTTTC
I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
I
I I II
IIII IIIII IIIII II
TGCAGACCATCACAAGCATATTGCTGATGTATACACCGCATTGACTGAGCGGACC
.
1111111111
~
~
11111111
1111
1111
1111
1111
TTCAAAGGAC GTAAGAATTATATCCAAATATACATTATA
I 11111
I I
CTAATAAAACATATAA
+830
92
Der
große
konservierte
Albuminsequenzen
ersten
wird
Introns
Homologie
Bereich
Region
Bereich
den
zwischen
in ABB12 durch eine lange,
beiden
im Bereich des
unterbrochene Gerade symbolisiert. Da sich diese
allem
vor
beider
auch ca. 400bp weit in den 5'flankierenden
Gene erstreckt, kann man annehmen,
Sequenzen
lokalisiert
sind,
daß in dieser
die für die Regulation der
Gene außerordentlich wichtig sind.
Eine
Computeranalyse
bekannten,
Der
konservierten
untersuchte
TATA-Box.
dieses
Zwar
(Efstradiatis
Bereich
sind
in
Sequenzbereichs zur Auffindung von
Regulationselementen endete erfolglos.
enthält nur die schon charakterisierte
beiden
Albuminsequenzen
et al.,l980) zu finden,
CCAAT-Motive
jedoch sind diese nach den
allgemein
gültigen
entfernt:
in der 68kd Sequenz wurde ein Motiv bei Position -160,
in
der
74kd
Definitionen zu weit vom Transkriptionastart
Sequenz
eines
(ABB13). Obwohl die Regionen,
zu
finden
konservierten
einer
der
waren,
noch
zu
mit
der Sequenz bei Position -315
in denen diese beiden Sequenzmotive
dem
zwischen
den
beiden
Genen
Bereich gehören, waren diese Motive jeweils nur in
beiden
Sequenzen
zu
finden.
Ob
sie
tatsächlich
funktionell von Bedeutung sind, bleibt noch zu beweisen.
93
6.2. Das erste Exon der Albumingene zeigt bei Xenopus,
Huhn
und Säugern den gleichen Aufbau
Ein
Vergleich
Sequenzen
der
aus
verschiedener
Xenopus
Albuminsequenzen
mit
bekannten
dem 5'Bereich der Albumin- und a-Foetoproteingene
Spezies
ergab für die 5'flankierende Region keine
offensichtliche Sequenzhomologien.
Beim
Vergleich
latierten
der
Sequenzen
Albuminsequenzen
das
schon
wurde
et
(bei
den
nicht-trans-
wurde in beiden Xenopus
Pentanukleotid der Sequenz CCCAC gefunden,
al.,l98l;
Dugaiczyk
Xenopus
und
loop"
mRNA
et
al. ,1982;
Hache et
einzelsträngige
Struktur
Region
RNA-Schleife
zum
Strukturen
5'Ende
wurden
Hühneralbumin,
und
GTGG)
innerhalb
der
Durch Computeranalysen kann man
vorhersagen,
=
ausbildet,
"loop"
Translationsstartcodon
komplementär
nur
bei
der
die
teilweise mit sich selbst hybridisiert und
doppelsträngige
das
Albuminen
Region der mRNAs.
einzelsträngige
enthält
Exons
der
Dieses Pentanukleotid hat seine komplementäre Sequenz
"stem
eine
ersten
d.h.
für die Albumine der Säuger und des Huhns beschrieben
translatierten
eine
des
ein
(Sargent
al. ,1983).
GTGGG
leader-Sequenzen,
auch
der
ausgeht.
AUG
l8S
rRNA
schon
für
menschliche
mRNA
von
und
ist
die
der
eine
Dieser "loop"
eine Sequenz,
(ABB14).
die
Solche
Rattenalbumin,
vorhergesagt.
In wieweit
diese mögliche Sekundärstruktur für die Translationseffizienz und
die
Genauigkeit,
wichtig ist,
mit
der
das Initiationscodon abgelesen wird,
ist noch nicht geklärt.
94
+1
Xenopus 68l<d alb
Xenopus 74kd alb
chicken
alb
rat
alb
human
alb
AGGCTTCTCAGAGGTCCCCACCCAATACATCTCCAGTCATGAAGTGGATC
+ 1 AGGCTTCTCAGAGGTCCCCACCTAATACATCTCCAGTC TG ltiGTGGATC
AGCATTTTTGAATAATTTAGCCCACATCATAATCTGCAGCCATGAAGTGGGTA
GACCACCTTTCCTGGCAACCCCACTGCCTCTGGCAACA
GCTTTTCTCTTCTGTCAACCCCACACGCCTTTGGCACA
A
0
A.
0 0
I "
CTCC
0
COUCCU,,, .5'
ISS RNA
0
' '
T
C
c
'
'- u
·-· D
u-'
:t'
AUUACUA
'- u
c- 0
c- 0
c-o
5'
AOOCUUCUCAOAOOU
CC,,. ,3'
Die "lender"-Sequenzen verecl1iedener Albumingene beeitzen
ADDH:
ein koneervlertes Pentanukleotid
Die
"lender"-Sequenzen
Albumingene von Huhn (llnche et nl.,
Ratte (Sargent et al. ,1901) und Hensch (Dugniczyk et al.,
1903),
wurden
1902)
der
mit
denen der Xenopus Albumingene verglichen. Dus
Tranelationsetartcodon
Pen tunultleot id
CCCAC
eingerahmt.
ist
und
seine
Dan
komplementHre
ltons e rv l er t e
Sequenz
im
translutlerten Bereich sind unterstrichen.
Durunter
,enopue
Die
ist
eine
Albumin
möglichen
hypothetische
atem
und loop - Struktur der
mRNA, zusammen mit der Xenopus lBS RNA gezeigt,
WusserstoffbrUcken
sind durch Striche verdeutlicht.
zwischen den belden Sequenzen
95
Albumine
und
a-Foetoproteine
sind
sezernierte
Proteine
und
besitzen daher ein Signalpeptid aus 18-19 überwiegend hydrophoben
Aminosäuren,
das
Signalpeptid
wird
vor
der
im
Sekretion
ersten
Exon
abgespalten
wird. Dieses
kodiert. Weiterhin besitzen
Albumine ein basisches Propeptid, das im Golgi-Apparat vom reifen
Protein
abgespalten
wird.
basischen
Aminosäuren
Propeptid
aus
8
Dieses Propeptid besteht meist aus 6
- mit Ausnahme des Hühneralbumins, dessen
Aminosäuren
zusammengesetzt
ist. Desweiteren
enthält das erste Exon noch die Information für die ersten beiden
Aminosäuren des reifen Proteins (Tilghman, 1985).
Ein
Vergleich
der
aus
den
Sequenzdaten
Aminosäuresequenzen
mit
den
bekannten
abgeleiteten Xenopus
Aminosäuresequenzen von
Säugern und Vögeln ergibt einige Homologien (ABB15).
96
<
prepeptide
Xenopus 68kd:
> <
EXON 1
propeptide
MKWITLICLLISSTLIES
RII
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
.I
EXON 2
mature protein
FKR
DT
DVDHHKHIADMYNLLTERTFKGct
74kd:
-------------SF---
chicken alb:
---V---SFIFLFSSAT-
rat
alb:
---V-FLL--FI-GSAF-
bovine
alb:
---V-F-S--LLFSSAY-
-GV -R-
human
alb:
---V-F-S--FLFSSAY-
-GV -R-
mause
AFP:
-----PAS-ILLLHFAA-
KALHENEFGI
ASTLDSSQCVTEKNVLS ..
rat*
AFP:
---SASISF-LLLNFAEP
-VLHTNEFGI
ESTLDSSQCPTEKNMFN ..
human
AFP:
---VESIF-IFLLNFTE-
-TLHRNEYGI
ASILDSYQCTAEISLADct
ADD15:
--L
-A--------V-TA----------
-NLQR-A-
-A
-GV -R-
EA
N. D.
HKSEIAHRFKDLGEQHFKGLVL ..
HKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVL ..
HKSEVAHRFKDLGEENFKALVL ..
-A
Das erste Exon der Xenopus Albumingene zeigt einen
Albumin-typischen Aufbau.
Die
Aminosäuresequenzen
verschiedener
Albumingene
Serumalbumins
abgeleitet,
Spezies
fUr
sind
dargestellt,
(Chung
Die
Pre-
und
erste
und
zweite
al,
Sequenzen
1900)
außer
sind
Propeptidgrenzen
der des Rinder
von
sind
DNA-Sequenzen
durch
gestrichelte bzw. durchgezogene Linie markiert.
- identische Aminosäure
* FUr
diese vergleichende Darstellung wurde vom zweiten
Translationsstartcodon ausgegangen
.. Hier waren die genaue Qrenze fUr das zweite Exon nicht
bel<annt,
Exon
in Angleichung zu denen der Xenopus
Alle
et
das
>
eine
97
Die
ersten
drei
Aminosäuren
sind
für
alle
Albumine
und
a-Foetoproteine identisch. Zum Maus a-Foetoprotein erstreckt sich
die
Sequenz
sogar
Aminosäuresequenzen
sind
die
(oder
an
die ersten 5 Aminosäuren. Die weiteren
zeigen
keine großen Homologien mehr. Jedoch
Aminosäurecodons
an
der Grenze zwischen Signalpeptid
Prepeptid) und Propeptid konserviert geblieben, ebenso wie
der
Grenze
Vergleich
Spezies
beiden
das
über
mit
gibt
Xenopus
zwischen
den
Pre-
Anlaß
zu
Propeptid
und
der
Albumingene
und
reifem
Protein.
Der
Proregionen von Albuminen anderer
Vermutung,
daß das erste Exon der
für das Prepeptid (18 Aminosäuren),
Propetid (6 Aminosäuren) und für die ersten zwei Aminosäuren
des reifen Proteins kodiert.
98
II.
FUNKTIONELLE ANALYSE DER ALBUMINGENE DES XENOPUS LAEVIS
Die Aktivität von Genen wird größtenteils auf Transkriptionsebene
durch
das
Zusammenwirken
von
cis-wirkenden
trans-wirkenden Faktoren, Proteinen (Ptashne,
zweiten
Teil
meiner
Untersuchungen
solche
werden,
die
für
Arbeit
sollten
cis-wirkenden
eine
der
DNA-Elemente
zeichnen sich dadurch aus,
diese
der
werden.
proteinkodierenden
Zur
Region
Sequenz
Indikatorgene
Thymidikinase-Gen
1983;
Hynes
et
wurden
sind.
Diese
daß ihre regulatorischen
genauen
Analyse
regulatorischer
Indikatorgens zusammensetzen.
virale
al.,
1983),
das
wie
oder
Deschatrette
solcher
Virus
et
wie
z.B.
das
(Chandler et al.,
bakterielle Chloramphenicol-
Gorman
z.B.
Gene
die
et
al.,
a-
1982)
und
oder
ß-Glogingene
Mensch (Treisman et al.,
1983; Ponta et al.,
Zuhilfenahme
eines
simplex
Gene
Maus
zu untersuchenden Gens und der
Herpes
eukaryontische
Kaninchen,
des
des
(CAT;
(DHFR;
definiert
gewebespezifische
verantwortlich
bisher
Acetyltransferase-Gen
al.,
funktionelle
werden daher meist Fusionsgene eingesetzt, die sich aus
5'flankierenden
Als
und
Im
auf heterologe Gene übertragbar sind, wenn sie vor
gesetzt
Elemente
über
DNA-Elemente
Expression
Eigenschaften
1986) reguliert.
nun
konstitutive
Albumingene
DNA-Elementen mit
auch
von
1983; Banerji et
1985) und das Dehydrofolatreduktase-Gen
al.,
1985, verwendet. Die Analyse unter
Indikatorgene
hat
etliche
Vorteile:
So
besitzen die Indikatorgene selbst keine regulatorischen Sequenzen
mehr,
dadurch
Indikatorgen
wird gewährleistet, daß die beobachteten, auf das
ausgeübten
5'flankierenden
Bereichs
Effekte
vom
nur
durch
die Einwirkung des
zu untersuchenden Gens entstanden
99
sind.
Außerdem
meist
relativ
sind die üblicherweise verwendeten Indikatorgene
klein
außerordentlichem
Hilfe
eines
Fusionsgens
endogenen
und
somit
Vorteil
in
Zellen
die
transfizierbar.
Von
ist schließlich die Tatsache, daß mit
oder
Regulation
untersucht
leichter
in den Organismus eingeschleusten
eines
werden
Gens
kann.
losgelöst
von der des
Schließlich kodieren manche
dieser
Indikatorgene für funktionsfähige Enzyme, deren Aktivität
leicht
bestimmt
werden kann (CAT-Gen) bzw. auf deren Expression
selektioniert werden kann (DHFR-Gen).
Für
die Identifizierung von regulatorischen DNA-Elementen in der
5'flankierenden
Indikatorgen
Region
das
in
einem
et
al. ,1982).
der
Xenopus
Albumingene
bakterielle CAT-Gen gewählt,
wurde
als
dessen Expression
recht einfachen Enzymtest gemessen werden kann (Gorman
(Luckow
Dazu
und
wurden in den CAT-Expressionsvektor pBLCAT3
Schütz,
5'flankierende
unveröffentlicht)
Sequenzen
des
Albumingens
vor
CAT-Vektor
3' vom CAT-Gen Sequenzen des SV40 Virus, die
ein
sorgen
korrektes
(ABB16).
exprimiert
werden
Spleißen
und
die
daher
kloniert.
die
Sequenz
für
CAT-Gens
große
proteinkodierenden
enthält
des
verschieden
Dieser
Polyadenylierung der RNA
Er
kann
in
eukaryontischen
Zellen
und
das CAT-Gen untersteht der Kontrolle der
Albuminsequenzen.
Aufgrund
der
gefundenen,
großen Sequenzhomologien von 68kd und
74kd Gen wurde nur das 68kd Gen weiter untersucht.
Zur
Herstellung
solcher
3'Deletionsmutante
mit
kloniert werden,
Transkriptions-Startstelle
authentische
Startstelle
Albuminsequenz
vorhandenes
in
Fusionsgene
der
mußte
zunächst eine 68kd
die noch den Albuminpromotor
besitzt,
jedoch
Translation.
nicht mehr die
Ein
in
der
Startkodon für die Translation würde
einem Albumin/CAT-Fusionstranskript zuerst benutzt werden und
100
daher
dem Translationsstart des Indikatorgen, des CAT-Gens,
mit
Die
int.erferieren.
ABB16
bei
Klonierung
+19
wurde
war,
Restriktionsenzymen
einer De1etionsmutante, deren 3'Ende
Von
zusammengefaßt.
dieser 3'Deletionsmutante ist in
der
Bereich
von
-662
bis
+19
mit den
Hindill und Bg1 II ausgeschnitten und in den
Polylinkerbereich des Vektors pBLCAT3 vor das CAT-Gen gesetzt.
§
1:::
c
g> E1
~
E2
c:J
~r-----------+~,---------+'~----L---~~-------~
'
-142S
\,
,
j
'
',
,
'
'-
!;:j
\Lcap
•h
1. Hpal',
2.Bal31 ·,
3. Born Hllinkers
4. Born 111
',
5. religotion
,
', ·=
\:
j
pEMBL9'
+604
\,
'
;:2
~
E
~
': l!=
c
1. sequencing
cap
2. Hind III I Born Hl
J. ligation into pBLCAT 3 Hind 111/Bglll
-66,.2_ _ _ _ _ _ _._,19
X
E
Cl
c:J
=
g
c.
ADD16:
Die Klonierung des -662 ALD/CAT-Gens
Als
Ausgangskonstrukt
vom
68kd
Albumingen
unveröffentlicht)
zur
in
diente
Klonierung des -662/+19 - Fragmentes
den Vektor pDLCAT3 (Luckow und SchUtz,
die
Bal31-Deletionsmutante
einzelnen Klonierungsschritte sind angegeben.
-1425.Die
101
Von
diesem
ursprüglichen Alburnin/CAT-Hybridgen ausgehend wurden
alle anderen Konstrukte mit verschieden großen Albumin 5'Regionen
erhalten:
wurde
Für die Herstellung des kurzen -50 ALB/CAT-Fusionsgens
der
stelle
wurden
bei
-662
ALB/CAT-Klon
Position -50 der Albuminsequenz aufgeschnitten. Dann
die
überstehenden
III-Linkern
versehen.
nachgeschnitten
II-Fragrnent,
an der singulären Bgl !I-Schnitt-
und
von
aufgefüllt
Anschließend
das
-662
Enden
somit
bis
und
wurde
mit
ausgeschnittene
-50,
vorn
Vektor
mit
Hind
Hindiii
Hindiii/
Bgl
abgetrennt.
Der
verbliebende Vektor wurde wieder geschlossen.
Die
5'Deletionsmutanten von -340 bis -180 (außer -211) wurden in
den
ursprünglichen
ALB/CAT-Vektor
II-Restriktionsschnittstellen
-1425
und
befindlichen
-211
über
die
eingebracht.
ALB/CAT-Gens
wurden
5'Deletionsrnutanten
mit
Zur
die
dem
Hindiii-
im
und Bgl
Klonierung
des
pEMBLB+-Vektor
in der Vektorsequenz
schneidenden Restriktionsenzym Clai und dem in der Albuminsequenz
bei
die
Position -50 schneidenden Enzym Bgl II ausgeschnitten und in
Clai-
und
ALB/CAT-Vektors
durch
Einsetzen
Bgl
!I-Schnittstelle
eingebracht.
eines
Restriktionsfragmentes
Das
Ausgangshybridgens kloniert.
die
ursprünglichen
-4200 ALB/CAT-Hybridgen wurde
5'benachbarten
in
des
3.6kb
großen
Hindili-
Hindiii-Schittstelle
des
102
l. 69 bp genügen zur konstitutiven Expression in Oocyten
Für
die
konstitutive
zellulärer
Gene
5'flankierenden
Expression
sind
Bereich
verschiedener
hauptsächlich
von
Bedeutung
zwei
viraler
und
Elemente
im
die TATA- und CCAAT-Box
(siehe oben).
Für
beide
Xenopus
eigentlich
weiteren
sind,
nur
Albumingene
ein
TATA-Box.
findet
Um
nun
sich
zu
auf
der
Sequenz
untersuchen, welche
Sequenzbereiche für die konstitutive Expression wichtig
wurde
eine
Reihe
von Albumin/CAT-Hybridgenen in Xenopus
Oocyten
injiziert und deren Expression untersucht.
konnte
auch
schon
der
Promotor
des
Auf diese Art
HSV-Thymidinkinasegens
genauestens untersucht werden (McKnight und Kingsbury,
Die
Expression
die
Aktivität der Chloramphenicol-Acetyltransferase bestimmt. Es
zeigte
sich,
der
1982).
injizierten Fusionsgene wurde zunächst über
daß die injizierten ALB/CAT-Konstrukte -662, -340,
-274,-180
und -50 alle gleich stark exprimiert wurden.
genauere
Aussagen
erhalten,
wurde
über
die
Transkripte
der
Um jedoch
Hybridgene
zu
die RNA injizierter Oocyten mittels der "primer
extension" Methode analysiert (ABB17).
103
69
ABB17:
I
- 50alb. CA!
zur konstiALB/CAT-
des
Hybridgens in den Oocyten
cop
Cr=d
TATAA
reichen
Expression
tutiven
A
bp
CA!
-50
korrekt
der
Bestimmung
Zur
A:
104ntond92nt
initiierten Transkripte wurde ein ein
das
Oligonukleotid,
30-mer
seine
komplementäre Sequenz im CAT-Gen hat,
B
+tk
E
N
<0
<0
I
184
0
lr>
IN
<0
""I
0
lr>
N
<0
entsprechend
o'
lr>
""I
+
I
CAT-Primer
Dieser
verwendet.
seiner Lage zum Albumin
CAT - Hybridgen (als Beispiel ist das
+
ALB/CAT-
-50
aufgezeichnet.
Gen
dargestellt)
Die
erwarteten
gestrichelte
Ende,
~
tk
mit
Xenopus Oocyten wurden
mit
500ng ALB/CAT-DNA bzw.
ALB/CAT-DNA
400ng
pBLCAT8'-DNA
RNA,
RNA
Es
die
und
4
der
unter-
pro Reaktion
etwa
in
20~g
Oocyten-
entsprechen,
Äquivalenten
64-
isoliert
wurden
lOOng
Nach 20-24h
extension"-Analyse
"primer
zogen.
und
injiziert.
die
wurde
-alb
Pfeilen am
30-40
entweder
80:
mit
Ihre Größen sind
dargestellt.
Je
- alb
89-
Linie,
nngegeben.
B:
- alb
als
sind
Extensionsprodukte
104-
ist
einge-
setzt.
Die
sind
123456
7
erhaltenen
durch
Extensionsprodukte
Pfeile
markiert.
m
DNA-Größenmarker
(pBR322/Haeiii-
geschnitten);
mit koinjizier-
8 9 10
+tk
tem Kontrollplasmid (pBLCAT8')
104
Ergebnisse
Oocyten
aus
verschiedenen
zwei
Experimenten
unterschiedlich
ALB/CAT-Genen abgelesen werden,
zurückzuführen
sind
Extensionsprodukt
92nt
auf.
Die
Intensitäten,
gleich
daß in den
Transkripte
von
den
die auf verschiedene Startstellen
(ABB17:Spur
1,2).
Neben
dem
erwarteten
von l04nt trat noch ein um l2nt verkürztes von
beiden Extensionsprodukte zeigten ähnlich starke
daher
häufig
ist
anzunehmen,
benutzt
Extensionsprodukte
Startstellen
große
zeigten,
werden.
ist
identisch
eine
mit
beiden
Aufgrund
der
der
daß
in
den
Startstellen
der
Größe
Oocyten
der
benutzten
in vivo benutzten, während die
zweite oocytenspezifisch zu sein scheint und sich 12nt 3' von der
in
vivo
Startstelle befindet.
Die Initiation in den Oocyten ist
also nicht so akkurat wie in vivo.
Die
beiden
untersuchten ALB/CAT-Hybridgene mit der größten bzw.
kürzesten
5'flankierenden
tatsächlich
1,2).
der
wider
Die
Erwarten
Injektion
wurde
aus
(Klein-Hitpaß
et
das
werden
den
von
Albuminsequenzen
Deletion)
koinjiziert,
und
das ein
CAT-Gen
beiden
vom
unter
internen Kontrollplasmid
Konstrukten
erhalten
trägt
(ABB17:Spur
gleich
viele
3,4
5,6).
und
von -50 bis +19 enthalten also die vollständige
konstitutive Expression zu vermitteln.
weitere
etwa
werden
Das Resultat war das Gleiche:
Transkripte
Albumin/CAT-Transkripte
Information,
Plasmid pBLCAT8+
al.,l986).
der
um
bzw.50bp)
gleich stark exprimiert (ABB17:Spur
Thymidinkinase-Promotor
Berücksichtigung
richtigen
(662
Experimente wurden daher wiederholt und zur Kontrolle
Hybridgen
Die
Sequenz
Verkleinerung
dieser Region führte zum Verlust des
Transkriptions-Startes. Die wenigen,
20nt
sind
verkürzten
auf
die
(ABB17:Spur 7,8 und 9,10).
Transkripte
aberrante
(genau
noch beobachteten
wie die erfolgte
Startstelle zurückzuführen.
105
Zur
effizienten
Transkription
eines
ALB/CAT-Hybridgens
unter
Verwendung der richtigen Startstelle scheinen in den Oocyten 69bp
Albuminsequenz zu genügen. In dieser minimalen Sequenz konnte nur
die TATA-Box als einziges konserviertes Element definiert werden.
2. Die Xenopus ALB/CAT-Hybridgene werden in den Maus
Hepatomazellen BWIJ gewebespezifisch reguliert.
Um
die
gewebespezifische Regulation der Albumingene des Xenopus
laevis
zu
untersuchen,
albuminproduzierenden
als
auch
wurde
Zellen
deren
mit
Expression
sowohl
in
leberspezifischen Funktionen,
in Zellen, die normalerweise kein Albumin exprimieren,
verfolgt.
Von
der
Vermutung
Regulationsmechanismen
Evolution
in
konserviert
ALB/CAT-Hybridgene
Hepatomazellen
ausgehend,
verschiedenen
geblieben
transient
BWIJ
und
daß
in
sind,
gewebespezifische
Spezies
wurden
während
die
der
Xenopus
die albuminproduzierenden Maus
in Maus Fibroblasten, NIH3T3 und LTK-,
eingebracht und auf ihre Expression hin untersucht. Es wurde eine
Serie
von
transfiziert
5'
Deletionsmutanten
und
deren
Expression
transient
über
in
die
Zellen
die Aktivität des vom
Indikatorgen kodierten CAT-Enzyms bestimmt (ABB18 und TABl).
106
1-
1-
u
u
<(
"'
;})
0.
ABB18:
M
<(
""
(ii
'@
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Xenalb CAT
0
"'"'
"'
I
"'
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N
0
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I
I
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N
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I
I
u
..J
0
00
"'
I
0.
I
Die Xenopus ALB/CAT-Gene werden in Maus Hepatoma-Zellen
BWIJ reguliert exprimiert
BWIJ,
NIH3T3
Zellen
und LTK- Zellen wurden mit 3·10 8 (BWIJ) bzw, 2·108
(NIH3T3,LTK-) pro 9cm Petrischale angesetzt und einen Tag
später
mit
je
CaPhosphat-Methode
lO~g
der
angegebenen
transfiziert.
Konstrukte
nach
der
24h später wurden die Proteine
extrahiert und die CAT-Aktivität bestimmt.
Dazu
das
wurden
positive
wurden.
300~g
die
eingesetzten Proteinmengen so gewählt, daß fUr
Kontrollplasmid vergleichbare Umsetzungen erhalten
Die Proteinmengen waren im Einzelnen:
fUr die NIH3T3 und
50~g
30~g
fUr die LTK- Zellen.
fUr die BWIJ,
107
Tab. 1: Gewebespezifische Expression der Xenopus Albumin-Gene
in Maus Hepatoma-Zellen
transf. Konstr.
pSV2CAT
rat
-4200
-1425
-662
-340
-274
-211
-180
-50
pBLCAT3
BWIJ
27300
40
NIH 3T3
57400
315
197
228
5116
4958
6082
3502
5068
1519
692
3620
3935
2282
1259
2833
212
39
1455
9.4
6.3
8.6
12.6
13.4
5.5
7.1
15.7
14.2
64.5
Ltk
14.2
17.3
14.9
21.2
14.9
18.9
13.4
23.6
17.3
8.7
9440
23.6
255
519
6513
1510
944
614
1510
7504
991
1227
71
94
557
614
203
151
142
127
411
269
Die angegebenen Werte sind CAT-Aktivitäten in pmol·mg- 1 ·h- 1 aus
jeweils zwei unabhängigen Experimenten.
Die
BWIJ
Analyse
zeigte,
Sequenzen
denen
der
ALB/CAT-Hybridgene
daß
( 4200 und
Konstrukte
mit
langen
5'flankierenden
1425) nicht exprimiert wurden, während von
mit weniger 5'flankierenden Sequenzen (-662 bis -180) hohe
CAT-Enzymaktivitäten
aufgrund
der
Expression
nur
die
in den Maus Hepatomazellen
erhalten
Das -50 ALB/CAT-Gen, das
Oocytenexperimente den minimalen zur konstitutiven
ausreichenden
schwach
wurden.
Albuminpromotor
enthält, wurde jedoch
exprimiert. Vom Kontrollplasmid pBLCAT3, das keinen
eukaryontischen
Promotor
besitzt,
wurde
ebenfalls
nur
wenig
CAT-Aktivität erhalten.
In den NIH3T3 Zellen war kein ALB/CAT-Hybridgen aktiv, obwohl das
positive
Kontrollplasmid
pSV2CAT, mit dem SV40 Enhancer und dem
SV40 frühen Promotor stark exprimiert wird.
108
Nach
Transfektion
mit
Ausnahme
exprimiert,
den
der
großen
ALB/CAT-Gene
(-4200
und
-1425)
jedoch nicht reguliert. Das -50 ALB/CAT-Gen, das nur
minimalen
stark
der Konstrukte in die LTK- Zellen wurden alle
Albuminpromotor
besitzt,
wurde in diesen Zellen
exprimiert. Die 5'flankierenden Sequenzen hatten in diesen
Zellen
keinen aktivierenden Einfluß auf den Promotor, eher einen
reprimierenden.
Auffällig
hoch
war in diesen Zellen auch die CAT-Aktivität, die
vom promotorlosen Kontrollplasmid pBLCAT3 erhalten wurde (TABl).
In
keiner
M.Weiss
der
und
drei
untersuchten
Zellinien
wurde ein von Dr.
Dr. M.Yaniv erhaltenes Ratten Albumin/CAT-Hybridgen
exprimiert.
Dieses
Ratten-Konstrukt
diente
als
negative
Kontrolle. Es ist bekannt, daß dieses Hybridgen nicht in den Maus
Hepatomazellen
exprimiert
synthetisieren
und
zellen
obwohl
gewebespezifisch
wird,
obwohl
diese
Zellen
Albumin
dieses Hybridgen in Ratten Hepatomareguliert
exprimiert
wird
(Ott
et
al.,l984).
Die
nicht
Xenopus
(NIH3T3)
reguliert
sich
ALB/CAT-Hybridgene
in
(LTK-)
der
DNA-Element
Expression
zwischen
oder
im
werden also in Fibroblasten gar
Gegensatz
zu den Hepatomazellen nicht
exprimiert. Dieses Ergebnis läßt vermuten, daß
5'flankierenden Region der Xenopus Albumingene ein
befindet, das für eine hepatomaspezifisch regulierte
verantwortlich
ist.
Durch
Deletion
des
Bereiches
-180 und -50 wird dieses Element zerstört, denn die -50
Deletionsmutante
wird 5 bis lOfach schlechter exprimiert als das
-180 ALB/CAT-Gen (TABl).
109
2.1. Ein Promotor-Element vermittelt die hepatomaspezifische
Expression
Um
die
für
die
Regulation
gewebespezifische
verantwortliche
Sequenz näher einzugrenzen, wurden ausgehend vom -180 ALB/CAT-Gen
weitere
5'Deletionsmutanten
hergestellt und deren Expression in
den BWIJ Zellen untersucht (ABB19).
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1-
<(
0
"'\!:!
I"'
ABB19:
r-
r-
.:<
u
-'
0
""
I
I
u
N
0
Ci)
"'I
I
E
0.
Definition der 5'Grenze des Elementes, das
hepatomaspezifische Expression vermittelt.
Die
Maus
angegebenen
Hepatoma
Zellen
Plasmid-DNA
Proteinextrakte
BWIJ
wurden
transfiziert.
hergestellt
und
die
mit
24h
Menge
lOpg
der
später
an
oben
wurden
CAT-Protein
bestimmt. Flir die CAT-Bstimmung wurden 100 pg Protein eingesetzt.
110
Es
zeigte
sich,
daß
sich
Expression
verantwortliche
Startstelle
der
Sequenzen
-77
für
Sequenz
Transkription
zwischen
drastischen
die
und
die
hepatomaspezifische
relativ
nahe
an
der
befindet. Nur die Entfernung der
-62
führte
letztlich
zu
einem
Aktivitätsverlust. Somit stellt dieses Element einen
Teil des Albuminpromotors dar.
Aufgrund der zum Teil beträchtlichen Mengen an CAT-Aktivität, die
vom
promotorlosen
bewiesen
auf
werden,
eine
Plasmid
pBLCAT3
erhalten
wurden,
sollte
daß die gemessenen CAT-Aktivitäten tatsächlich
erhöhte
Menge
an
korrekt
initiierten
ALB/CAT-
Transkripten zurückzuführen sind.
Zur
Kontrolle
Zellinien
der
wurde
Transfektionseffizienz
das
Plasmid
pSV2CAT,
verschiedenen
der
das
in
jeder
der
untersuchten Zellinien stark exprimiert wird, kotransfiziert. Die
in
der
Gesamt-RNA
der
transfizierten
ALB/CAT-Transkripte
wurden
Albuminpromotor
einem
SP6-Probe
geschütztes
und
identifiziert
Fragment
Albumin-Transkripten,
von
mit
Teil
einer
des
(ABB20A).
l88nt
während
pSV2CAT-Transkripte indikativ ist.
Zellen
spezifischen,
CAT-Gens
Ein
enthaltenen
mit
zum
komplementären
dieser
Probe
entspricht korrekt initiierten
ein
Fragment
von
l50nt
für
111
A
__
-s_o_a_lb_C_AT______
~I ~~~
I
CAT
I
-50
·,1
·188
·19
SPj probe
I
R!Iase
188 nt
alb CA! correct start
pSVZ CA! transcript
150 nt
B
"'>
c:>
E'ß. !!'I
M
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1-
U-"'
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0
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I
LTK-
NIH3T3
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BWIJ
M
M
1-
1-
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"'
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OJ
E'ß..
c.
267-
1111
ID
234- ..
~
ID
213- ..
1111
ID
192- ..
atb184-
1111
ID
0
00
rr-
I
I
"'
3
4
...
0
u
...J
OJ
c.
.
1111
pSV2-
a
--~
2 3
4
5 6
7
8
9 10 11
12 13 14
b
1
2
3 4
5
c
1 2
5
112
ABD20:
In den transient transfizierten Maus Hepatoma Zellen
können korrekt initiierte Transkripte nachgewiesen werden.
A: Albuminpromotor-spezifische SP6-Probe
Transkripte
von
einheitlich
3 2
den
P-markierten
identifiziert,
die
synthetisiert
wurde.
schützen
einen
ALB/CAT-Hybridgenen
in
269nt
vitro
großen
großen
mit
einer
anti-sense
RNA
von einem -50 ALB/CAT-SP6-Plasmid
Korrekt
lBBnt
wurden
initiierte
Bereich
,ALD/CAT-Transkripte
der
Probe,
spezifische
Transkripte von der pSV2CAT-DNA schützen 150nt von der Probe.
B: Korrekt initiierte ALB/CAT Trankripte in BWIJ Zellen
Die
mit
Zellen
5~g
lO~g
wurden mit
der oben angegebenen Plasmid-DNA und
pSV2CAT-DNA transfiziert. 16h nach der Transfektion wurde
Gesamt-RNA
isoliert.
DNAse-behandelte
Pfeile
zeigen
Zur
RNA
auf
Analyse
wurden
20~g
bzw. in b
lO~g
mit ca, 30fmol RNA-Probe hybridisiert. Die
die
spezifisch
geschützten
Fragmente. Als
Längenmarker wurde Hae !!I-geschnittene pBR322-DNA verwendet.
In
ABB20B ist zu sehen, daß in den transfizierten Hepatomazellen
BWIJ
der
2,3,6,7).
6)
wurden
authentische
Von
Albuminpromotor
benutzt
(a: Spur
wird
den ALB/CAT-Genen -180 (a:Spur 2) und -77 (a:Spur
im Vergleich zum -50 ALB/CAT-Gen (a:Spur 3,7) 3 bis 5
mal mehr Transkripte erhalten.
Wie
aufgrund
der
CAT-Aktivitäten
Menge
an
initiiert
promotorlosen Plasrnid pBLCAT3 erhaltenen
wurde,
konnte auch eine beträchtliche
entdeckt
werden, die an anderen Stellen
erwartet
Transkripten
wurden.
komplementären
Transkripte
vorn
Je
Sequenzen
Länge
nach
waren
verschieden groß:
diese
der
zu
falsch
der
SP6-Probe
initiierten
246nt für das -50 Konstrukt, 238nt
für die anderen Albumin Konstrukte und l60nt für pBLCAT3.
113
Das
Ergebnis
der
SP6-Analyse
bestätigt
die
aktivität
erhalten
Xenopus
Daten,
das
vermittelt.
über
wurden:
Albumingens
Element,
die
in
befindet
eine
der
die
der
transfizierter
Zellen
Bestimmung der CAT-Enzym5'flankierenden Region des
zwischen
sich
erhöhte
RNA
Expression
-77
in
und
-62 ein
Hepatomazellen
Dieses Element ist in NIH3T3 Zellen (b:Spur 2-4) und
in LTK- Zellen (c:Spur 2-4) nicht wirksam.
2.2.Das hepatomaspezifische Promotor-Element (HPl)
ist
l3bp groß und durch Punktmutationen inaktivierbar
Das
Maus
entdeckte
Zellen
hepatomaspezifische Promotor-Element, HPl,
aktiv,
obwohl
führt zu der Vermutung,
a-Foetoproteingenen
Vergleich
et
et
Menschen
Dies
daß das HPl auch in den Albumingenen oder
der
Säuger
vorhanden
sein
könnte.
Ein
der
Maus
(Scott
and
Ti1ghman, 1983;
Gorski et
der Ratte (Heard et al. ,1987) und des Menschen (Urano
al. ,1986)
Tilghman,
Teil eines Froschgens ist.
der Promotorsequenzen der Albumingene des Huhns (Hach~
al., 1983),
al.,l986),
es
ist in
bzw.
1983)
1
(Sakai
der
der
a-Foetoproteingene
Ratte
et
(Chevrette
al. ,1985)
Homologiebereiche auf (ABB2l).
et
zeigt
der Maus (Scott und
al.,
1987) und des
mindestens
zwei
114
-67
l
ACAATTTGATA
77
Xenopus 68kd
"
-62
-50
.------+--------. ~
*
AGATCTCTCTGAGCAATAG ATAAAA AAGAGGTATCACTCATTTCAGATCA
s91 n
*
AGATCTCTCT-AGGAATGGfATAAAA.AAGTGATATCAATCATTTCTGATCA
-76
74kd
ACATTTTGATA
.. .
-75
chicken
GCCAGCTCTAC
mouse
.ATATTPGAGCGAGTTTCTCTGCACACAGACC~
...... . .. . .. .. ..
rat
human
mouse
c..
u..
<!
[
. . . . ...... .. .
. .. .
.
rat
GACATCACTTAAAAAGGA- ATAAAAoAACTTCAGCGCTACTGCTCACAGTA*
human
GGCATTGCCTGAAAAGAG-
. . . .. . . ....... .. .
;
ATAAAP3AATTTCAGCATGATTTTCC~
\
;
\
;
\
;
G:91-
-33
A:---96-
5--37-
T: - 8 9 - - 9 - 1 9 6 6 2 C:----3consensus:
ABB21:
- - 9
GNTANTNNTNNNC
Im Promotorbereich der Albumin- und a-Foetoproteingene
können zwei homologe Bereiche gefunden werden
Die Sequenzen im Promotorbereich der Albumingene des Huhns (Hache
et
al.,l983) der Maus (Scott and Tilghman et al. ,1983; Gorski et
al.,l986),
et
der Ratte {Heard et al. ,1987) und des Menschen {Urano
al.,l986)
sowie
Tilghman, 1983),
Menschen
dieses
auf
Ratte
(Chevrette
et
al,,l987)
und
des
markieren
Bereiches
verglichen. Die Sequenzen sind in
die TATA-Box und ein zwischen -67 und -62 vorkommende
Hexamersequenz
einander
identische
HPl-Element
Bereich
a-Foetoproteingene der Maus {Scott und
Sakai et al.,l985) wurden mit der Sequenz der Xenopus
Albumingene
Bezug
der
der
des
sind
HPl
angeglichen.
Nukleotide.
Die
Die
schwarzen
TATA-Box
und
Punkte
sowie das
eingerahmt.
Aufgrund
wurde
Konsensus-Sequenz aus Nukleotiden
eine
der großen Homologie im
aufgestellt, die in diesem Bereich zu 100% konserviert sind.
115
Ein
Bereich
zur
Startstelle
zwischen
repräsentiert
und
-67
Vorhandensein
der
des
die TATA-Box um Position -30 relativ
Transkription,
-50
zu
Hexamers
finden
AGGTTA,
während der zweite Bereich
ist.
das
Auffallend
ist
das
sowohl in der Xenopus
Albuminsequenz als auch in der Sequenz des a-Foetoproteingens der
Maus
zu
und des Menschen an ähnlicher Position relativ zur TATA-Box
finden
aktiven
ist. Dieses Hexamer ist noch in der in Hepatomazellen
Deletionsmutante -77 vorhanden, jedoch nicht mehr in der
inaktiven
-62
Mutante.
Teil
HPl
sein
des
Oligonukleotid
Dies impliziert, daß dieses Hexamer ein
könnte.
Aufgrund dieser Annahme, wurde ein
synthetisiert, das der Albuminsequenz von -67 bis
-50 entspricht (synO). Das Oligonukleotid wurde mit überhängenden
5'Hindiii-
und
3'Bglii-Enden
angefertigt,
natürliche
Bglii-Restriktionsschnittstelle
so
bei
daß
es
in die
Position -50 in
das
ALB/CAT- Hybridgen kloniert werden konnte. Dieser Klon synO,
der
einer natürlichen Deletionsmutante -67 gleichkommt, wurde in
den
Hepatomazellen
BWIJ
ebenso
wie
die
-77
Hexamer
inseriert bei Position -50 enthielt, war in den
BWIJ Zellen nicht aktiv (ABB22).
Das
exprimiert
Deletionsmutante
AGGTTA,
(ABB22).
gut
Hybridgen syn6 ,das nur das
116
-77
ABB22:
-67(syn0)
syn /_\
syn 1
syn 8
syn 3
Ein synthetisches Oligonukleotid vermittelt
hepatomaspezifische Expression
FUr
den
Bereich
Oligonukleotide
hergestellt,
Albuminpromotor
gesetzt
Transfektion
die
FUr
in
die
-50
und
bei
Position
(vergl.
wurden
zwei
mehrere
wurden
vor
-50
ABB23)
unabhängige
den
FUr
jedes
Klone
nach
BWIJ-Zellen auf ihre Aktivität untersucht,
der
Bestimmung
die
jeweils
wurden
Oligonukleotid
-67
zwischen
CAT-Aktivität
wurden je
lOO~g
Protein
eingesetzt.
Das
Hexamer
Regulation
syn6
alleine ist also nicht für die hepatoma-spezifische
ausreichend.
-Hybridgen
TATA-Box
wurden
nur
inaktiv
zur
Allerdings
aufgrund
ist.
könnte
es sein, daß dieses
seines veränderten Abstandes zur
Um solche Abstandsprobleme zu vermeiden,
weiteren Charakterisierung des HPl nur noch einzelne
Basen im Bereich zwischen -67 und -50 ausgetauscht.
die
des
Sequenzen
der
HPl-Elementes
In ABB23 sind
Oligonukleotide aufgelistet, die zur Analyse
eingesetzt
wurden.
Die
Aktivität
dieser
Sequenzen in den BWIJ-Zellen ist ebenfalls angegeben (vergl. auch
ABB22).
Die
beiden
ersten Basen der 16bp-Sequenz, das A (synl)
und das G (syn2), können verändert werden, ohne daß die Aktivität
117
des
Elementes beeinträchtigt wird. Die dritte Base jedoch, das G
(Position -65), ist essentiell, da durch eine Transversion dieses
G
in
ein
(ABB22).
A
(syn3) die Aktivität des Elementes völlig zerstört
Ebenso
wichtig
ist das C in Position 15 des HPl (bzw.
-52 relativ zur Startstelle der Transkription), seine Veränderung
in
ein
Gegensatz
T
fUhrt
dazu
gleichfalls zur Inaktivierung des Elements. Im
zeigen zwei andere Punktmutationen, syn8 und syn
16, Wildtypaktivität.
118
FUNCTION
SEQUENCE
-50
-67
A
TTAATAATTTTfCAGATCT
+
synl
T------------- -------
+
syn2
-A ----------- -------
+
syn3
--A----------- -------
syn8
+
synl5:
-------G------------------------1-------
s yn 16:
-------------T------
+
Xenopus synO
I
syn6 :
-66
mouse al bumin~:
T-H-----"G--C-AI-1 ------64
--~~--C--G--AAH
mouse AFP
ABB23:
------
Mutationsanalyse des HPl mit synthetischen
Oligonukleotiden
Die Sequenz des Wildtyp-Oligonukleotids synO, das der natUrliehen
-67 Deletionemutante entspricht ist dargestellt.
Ftir die weiteren
zur Analyse des HPl-Elements verwendeten Oligonukleotide sind nur
die
Unterschiede
funktionellen
Die
ftir
sind
synO-Sequenz
Oligonukleotide
sind
angegeben.
Die
noch
mit einem + gel{ennzeichnet.
die Funktion essentiellen Basen in Position -65 und -53
eingerahmt.
benutzte
zur
Die
zur
Klonierung
dieser
Oligonukleotide
Bgl II-Restriktionsschnittstelle ist unterstrichen. Die
Bezeichnung der Oligonukleotide ist so gewählt worden, daß daraus
direkt
die Position der Mutation im Vergleich zur WildtypRequenz
ersichtlich ist.
119
Einige
der
erhaltene
mit
den
Resultate
verschiedenen
wurden
auf
Oligonukleotid-Konstrukten
RNA-Ebene
nachvollzogen.
Die
SP6-Analyse der RNA transfizierter BWIJ Zellen wurde mit der oben
erwähnten
führt
Albumin
und
ist
promotor-spezifischen Probe (ABB20A) durchge-
in
Wildtypsequenz
ABB20B zu sehen.
von -67 bis -50 enthält wurden korrekt initiierte
ALB/CAT-Transkripte
erhalten
vom
alleine
-50-Konstrukt
aufgrund
Vom Konstrukt synO, das die
der
(a:Spur
(a:
CAT-Bestimmung
10,12), deutlich mehr als
Spurl4).
Von
den
mutierten,
inaktiven Konstrukte syn
und syn3
wurden
nur wenig Transkripte erhalten (a:Spur 11 und 13), ebenso
wenige
wie
vom
-50 ALB/CAT-Gen (a:Spurl4),
dem die HPl-Sequenz
gänzlich fehlt.
Die
Analyse
der
Transkripte
bestätigte
wiederum die über die
CAT-Enzymbestimmung erhaltenen Daten.
Aufgrund
der
Albumingens
vermuten,
Tatsache,
in
daß
Maus Hepatoma Zellen funktionell ist,
die
zum
bzw.a-Foetoproteingens
wurden
daß das HPl-Element Element des Xenopus
HPl
der
homologen
Maus
Sequenzen
könnte man
des Albumin-
das HPl ersetzen können.
Daher
synthetische Oligonukleotide sowohl mit der Maus Albumin-
als
auch mit der a-Foetoproteinsequenz (ABB 23) bei Position -50
vor
den
jedoch
Xenopus
Albuminpromotor
nicht
aktiv,
a-Foetoprotein-Sequenzen
d.h.
die
konnten
die
ersetzen. Dazu ist zu bemerken,
4
Basen
Weiterhin
Angesichts
eine
gegenüber
ist
Diese
Maus
Xenopus
Klone waren
AlbuminSequenz
und
nicht
daß in diesen beiden Elementen je
Xenopus
Element
ausgetauscht
sind.
ihr Abstand zum Promotor um eine Base verringert.
dieser
Aussage
dem
kloniert.
multipler Veränderungen ist es nicht möglich,
darüber
zu
machen,
Hybridkonstrukte nicht aktiv waren.
warum
diese
Maus/Xenopus-
120
Aus den Ergebnissen der Mutationsanalyse läßt sich schließen,
die
Basen
zwischen
hepatoma-spezifische
einzige
-53,
Punktmutation
kann
werden.
die
-65
und
-53
das
daß
eigentliche
Promotor-Element HPl darstellen. Durch eine
entweder in Position -65 oder in Position
Aktivität
dieses
Elementes vollkommen zerstört
121
Disk~ssion
Der Krallenfrosch Xenopus laevis besitzt 2 Albumingene,
gewebespezifisch
in
vorliegenden
Arbeit
beider
gezeigt
Gene
untereinander
konnte
Leber
exprimiert
durch
Sequenzanalyse
werden,
homolog
a-Foetoproteingenen
wenige
der
daß
diese
sind.
der
Säuger
Homologien gefunden,
werden.
über
Zu
die beide
den
In
der
weite
der
5'Enden
Bereiche
Albumin-
und
und des Huhns wurden jedoch nur
die hauptsächlich auf das erste Exon
beschränkt waren.
Aufgrund
der
konstruiert
wurden.
erhaltenen Sequenzdaten konnten Albumin-Hybridgene
Damit
konnte
Regulation
die
konstitutive
großen
war
der
ist
Hepatoma-Zellen
kurzes
allerdings
beschreiben,
und
Xenopus
die
HPl,
Albumingene in einem
Identifizierung
das
zwischen
gewebespezifische
vermittelt.
genau
der
So ist für
Bereich von -50 bis +19 ausreichend.
Promotorelements,
lokalisiert
ein
beiden Gene geleistet werden:
Expression
System
bedeutendsten
in Gentransfer-Experimenten eingesetzt
ein entscheidender Beitrag zur Aufklärung
dieser
der
heterologen
die
werden,
Am
eines 13 bp
-65
Expression
und
in
-53
Maus
Damit ist es zum erstenmal gelungen,
definiertes cis-wirkendes Promotor Element zu
das hepatoma-spezifische Expression vermittelt.
Die konservierte 5'Region der Xenopus Albumingene
Für beide Gene wurden ca.
erste
Exon,
Sequenzvergleich
Intron
ergab,
1.5 kb 5'flankierende Region,
und
zweite
Exon
sowie das
sequenziert.
daß beide Gene untereinander,
Der
vor allem
122
im
Bereich
Homologie
der
Exonsequenzen,
erstreckt
sich
sehr
sogar
konserviert
über
400bp
sind.
weit
in
Die
den
5'flankierenden Bereich. Um das erste Exon herum wurde somit eine
konservierte
Resultat
Region
über
stimmt
Untersuchungen
mit
insgesamt
den
erhaltenen
aus
Daten
550bp
gefunden.
Dieses
elektronenmikroskopischen
von May et al.
(1983) überein,
die einen konservierten DNA-Bereich der gleichen Größe·(550bp) um
das
erste
Exons,
Exon
die
aufzeigten.
durch
unterscheidet
Die
Größe
des ersten und zweiten
Sequenzierung und RNA-Analyse bestimmt wurde,
sich
aber
von den Angaben von May et al.
(1983).
Hier ist vor allem richtigzustellen, daß das erste Exon für beide
Gene
gleich
Unterschied
groß
ist,
zwischen
Größenunterschied
ll7bp;
74kd
und
den
68kd
beschriebenen
Gen
gibt
es
50bp großen
nicht.
Der
der primären Translationsprodukte der 68kd und
74kd Albumingene ist nicht im ersten Exon begründet.
Das
zweite Exon ist für das 68kd Gen 67 bp groß, während für das
74kd Gen dazu keine Angaben gemacht werden können.
Für dieses Gen
wurde nur die 5'Grenze des zweiten Exons bestimmt. Es besteht die
Möglichkeit,
68kd
Gens
daß
dieses
und
dies
Translationsprodukte
Exon anders gespleißt wird als das des
zum
führt.
beobachteten
Da
die
Größenunterschied
mittleren
12
Exons
der
der
Albumingene, bedingt durch den Aufbau der Gene aus einem dreifach
wiederholten
(May
et
Block
al.,
von 4 Exons,
sehr homolog untereinander sind
1983), könnte ansonsten der Größenunterschied noch
im letzten Exon kodiert sein.
Insgesamt
gesehen
beiden
Xenopus
beide
durch
Ur-Albumingen
1981).
ist
die
große Sequenzhomologie zwischen den
Albumingenen nicht sehr verwunderlich, da sie ja
eine
Genomduplikation
hervorgegangen
aus
sind (Bisbee,
ein
und
demselben
1977; Westley et al.
123
Die
große
Homologie
impliziert,
die
daß
beider
jedoch
nur
konservierte
TATA-Box.
5'flankierenden
eukaryontischer
al.,
die für
In der Promotorregion
identifiziert
Konsensus-Sequenzen,
Gene
Bereich
für eukaryontische Promotoren typische
Regulationssequenz
et
im
Gene wichtig sind.
eine
Weitere
Serfling
Gene
diese Region Elemente enthalten könnte,
Regulation
konnte
beider
beeinflussen
werden
die
könnten
die
die
Expression
(Ubersichtsart.:
1985), wurden aufgrundder Sequenzdaten allein
nicht gefunden.
Die
genaue
zunächst
homolog
schwierig,
sind
SP6-Proben
auf
den
jedoch
der
da
(Westley
Startstelle
die
beiden
et al.,
Kreuzhybridisierung
DNA-Sequenzdaten
entweder
Somit
Sequenzierung
die
der
Transkription war
Xenopus Albumin mRNAs sehr
1981) und mit den entsprechenden
erhalten
werden kann.
Basierend
für das erste und zweite Exon konnten
Oligonukleotid-Primer
spezifisch
wurden.
Bestimmung
hergestellt
werden,
mit
denen
68kd oder die 74 kd mRNA identifiziert
konnte die DNA-Sequenz des ersten Exons durch die
der
RNA
bestätigt werden.
Für die erstellte 68kd
mRNA-Sequenz und die vom Genomklon abstammende DNA-Sequenz wurden
allerdings
einige
Unterschiede festgestellt,
die wahrscheinlich
auf genetische Polymorphismen zurückzuführen sind.
Das
Ergebnis,
spezifischen
ist
für
die
daß
die
beiden
Albumin
mRNAs
mit
Hilfe
von
Oligonukleotid-Primern unterschieden werden können,
Klärung entwicklungsspezifischer Fragen von großer
Bedeutung. Die Expression der Albumingene kann nun in sehr frühen
Entwicklungsstadien
verfolgt
werden,
aktiviert werden.
mit
um
sensitiveren
abzuklären,
ob
Untersuchungsmethoden
beide
Gene
gleichzeitig
124
Verwandtschaft
der
Xenopus
Albumingene
zu
den Albumin- und
a-Foetoprotein-Genen der Säuger und Vögel
Zu den bekannten Albumin- und a-Foetoproteingenen von Säugern und
Vögel
wurden
aufgrund
von
Sequenzvergleichen
nur
wenige
Homologien im ersten Exon entdeckt.
Der
Aufbau
Region
dem
(sog.
der
der
des
ersten
Albumine
CCCAC
"leader"-Sequenzen
1982)
und
und 26 Aminosäurecodons ist mit
wurde
gefunden,
In der "leader"-Sequenz
auch
das
das
typisch
konservierte
ist
für
die
der Albumin mRNAs von Nagern (Sargent et al.,
(Hache
auch
38nt 5'nicht-translatierter
der Säuger identisch.
Albumingene
Pentanukleotid
Huhn
mit
"leader"-Sequenz)
Xenopus
1981),
Exons
et al.,
in
der
1983) und Mensch (Dugaiczyk et al.,
Maus a-Foetoprotein mRNA vorhanden ist
(Dugaiczyk et al.,
1982).
Für
Aminosäuresequenz, die vom ersten Exon kodiert
die
wird,
gesamte
wurde
wenig
Homologie
(zwischen
42
und
46%) entdeckt
(ABB15). Diese erstellt sich aus wenigen Einzelbereichen, die vor
allem
die
ersten
3
Aminosäuren und die möglichen Spaltstellen
zwischen Prepeptid, Propeptid und reifen Protein umfasst.
Albumine und a-Foetoproteine sind sezernierte Proteine und werden
daher
mit
einem Prepeptid, bestehend aus 18 bis 19 Aminosäuren,
synthetisiert
(Ubersichtsart.
Tilghman,
1985).
Im Gegensatz zum
a-Foetoprotein
besitzen die Albumine ein zusätzlichens basisches
Propeptid
6
aus
Golgi-Apparat
1977).
Pre-
( b zw.
entfernt
und
für
das
Huhn
8)
Aminosäuren, das im
wird (Bradshaw und Peters, 1969; Peters,
Propeptid werden beide im ersten Exon kodiert.
Die Spaltstellen zwischen Prepeptid, Propeptid und reifem Protein
125
sind
zu
zwischen
100%
allen Albuminen,
auch den Xenopus Albuminen,
konserviert. Die Aminosäuresequenzen um die Spaltstelle
zwischen
Prepeptid
und
Propeptid
Ausnahme in der Xenopus-Sequenz,
Von
Heijne
(übersichtsart.
Primärsequenz
werden
die
kann.
Spaltstelle,
unterliegen,
1986),
dieser
mit
Regel
Position
alle
ein
am
zu
den
Position
Isoleuein
einigen
anderen
anderen
Xenopus
-3
Albuminen
der
Alanin
aus
an
dieser
daß
und
der
vorhergesagt
dies trifft für die
Albumin-Sequenzen zu,
die an
ABB15). Weiterhin sollte
sehr groß oder polar sein,
Säuger
tragen,
und des Huhns,
befindet
Stelle,
Prepeptiden
Forderung,
zwischen
direkt
Spaltstelle
Serin haben (vgl.
ein
Albumin
Die
eine
häufigsten in dieser Position Alanin zu finden ist.
Gegensatz
dieser
auf
sollte die Aminosäure vor der
die Aminosäure in Position -3 geladen,
wobei
der
in Position -1, sehr klein sein;
und
bis
ganz genau der (-3,-1)-Regel von
wahrscheinlichste
Nach
Xenopus-Sequenz
dieser
fast
das
Im
die in
sich im Xenopus
allerdings auch bei
in dieser Position gefunden wurde.
sich die Aminosäure Prolin nicht im Bereich
+1
der Spaltstelle befinden darf, wird in der
Aminosäuresequenz
ebenso
wie
in den anderen Albuminen
eingehalten.
Bis
jetzt
gibt
Sequenzdaten
vorhergesagten
Konservierung
ihre
es
keinen
vorhergesagte
Spaltstellen
Beweis
dafür,
Propeptid
in
tatsächlich
daß
das
aus
den
vivo vorkommt und die
gebraucht
werden. Die
dieser Spaltstellen in der Xenopus Albuminsequenz,
Übereinstimmung
mit
der
(-3,-l)-Regel
und
die typische
Zusammensetzung der Aminosäuresequenz aus hydrophoben Aminosäuren
für
das
Prepeptid
sprechen
allerdings
Albumine
typisches
wie
folgt
und
basischen Aminosäuren für das Propeptid
dafür,
daß
die
Xenopus
Albumine ein für
erstes Exon besitzen. Dieses Exon setzt sich
zusammen:
18
Aminosäuren
für
das
Prepeptid,
6
126
Aminosäuren
für
das
Propeptid
Protein (Hacheet al.,
1983;
und 2 Aminosäuren für das reife
Tilghman,
1986). Aus diesem Ergebnis
läßt
sich zunächst folgender Schluß ziehen:
sind
näher
mit
Die Xenopus Albumine
den Albuminen der Säuger und Vögel verwandt als
mit den a-Foetoproteinen.
Regulation der konstitutiven Expression
Aufgrund
der
Albumingene
strengen gewebespezifischen Expression der Xenopus
in
der Leber,
steht natürlich die Aufklärung dieses
Regulationsmechanismus
im
Endziel,
DNA-Elemente
cis-wirkende
Vordergrund
des
zu
identifizieren, die die
Gewebespezifität
vermitteln,
DNA-Sequenz-elemente
definiert,
die
Expression
sind.
geschah
Überzeugung
notwendig
heraus,
Dies
daß
Interesses. Mit dem
wurden
solche
für
zuallererst
die
vor
Sequenzen
konstitutive
allem
die
aus
der
essentielle
Grundlage für die Regulation eines Gens darstellen.
Nach
der
Albumingene
deren
korrekt
3'
war
es
wurden
initiierte
Transkripte
von
der
initiiert.
5'flankierenden
Expression
in
den
in
Oocyten
Region
der
zu
untersuchen.
Oocyten von den ALB/CAT-Hybridgenen
Transkripte erhalten;
zusätzlich wurden aber
von einer aberranten Startstelle, die ca.
richtigen,
Die
der
möglich ALB/CAT-Hybridgene herzustellen und
konstitutive
Tatsächlich
auch
Sequenzanalyse
d.h.
12bp
in vivo benutzten Startstelle lag,
Analyse verschiedener 5'Deletionsmutanten ergab,
daß die 5'flankierenden Sequenzen bis zu 50bp vor der Startstelle
der
Transkription
entfernt
Transkriptionseffizienz
3'Deletions-mutante
-50/-4,
werden
konnten,
beeinträchtigt
bei
der
ohne
daß
wurde.
die
Startstelle
die
Eine
der
127
Transkription
exprimiert.
entfernt
Die
von
worden
war,
wurde eindeutig schlechter
dieser Mutante noch erhaltenen Transkripte
stammten
von
einer
Startstelle,
die
unüblich
weit
von
der
TATA-Box
weg
livgt und der beobachteten aberranten Startstellen
entspricht.
Es
zeigte
sich,
ausreichen,
um
vermitteln.
Sequenzen
der
Genen
daß
Der
von
69bp
vollständige
Befund,
stimulieren
gerade
ähnliches
Maus
in
diesem
Serfling et al.,
1985a;
Kadonaga et
Durch
effizienten
1983).
Bei
Xenopus
a-Foetoproteingen
konstitutive
funktionellen
Sequenz
in vitro Transkription und
konnte gezeigt werden,
neben
der
TATA-Box
keine
daß im
weiteren
Elemente in diesem heterologen System zur genauen
Tilghrnan,
der
cis-wirkende Elemente
die die Transkription im Allgerneinen
gefunden.
a-Foetoproteingen
den
ist erstaunlich. Bei vielen
Bereich
Expressionsexperimente
5'flankierende
und
zu
Allerdings wurde für das Maus a-Foetoproteingen ein
Ergebnis
transiente
bis +19
Transkriptionsaktivität
führt,
( Übersichtsart.
1986).
-50
-660 bis -50 nicht zu einem deutlichen Verlust in
Transkriptions-Effizienz
wurden
von
daß die Entfernung der 5'flankierenden
gefunden (CAAT-Box, GC-Box),
al.,
Albuminsequenzen
Transkription
Albumingenen
die
Expression
TATA-Box
zu
benötigt
scheint
werden
ebenso
ausreichend
zu
(Scott
wie
beim
sein,
und
Maus
um eine
vermitteln. Dieses Resultat aus den
Untersuchungen deckt sich mit den Sequenzdaten.
konnte
ja
außer
der
TATA-Box
kein
konserviertes cis-wirkendes DNA-Elernent gefunden werden.
In
anderes
128
Das hepatoma-spezifische Promotorelement (HPl)
Durch
transiente
Transfektion der Xenopus ALB/CAT-Hybridgene in
albumin-produzierenden
5'flankierenden
identifiziert
Maus
BWIJ konnte in der
der
Xenopus Albumingene ein DNA-Element
HPl,
das hepatoma-spezifische Expression
Region
werden,
Hepatoma-Zellen
vermittelt.
Dieses
Element
ist nicht wirksam in Fibroblasten Zellen: in den
NIH3T3 Zellen werden die ALB/CAT-Hybridgene gar nicht exprimiert,
während in den LTK- Zellen nur eine konstitutive Expression, auch
in
Abwesenheit
des
ALB/CAT-Hybridgene
zurückzuführen,
TATA-Box
keinen
HPl
in
daß
den
in
ausreicht,
beobachtet
LTK-
dieser
Expression
stimulierenden
wurde. Diese Aktivität der
Zellen
ist
Zellinie
vermutlich darauf
die Anwesenheit einer
zu vermitteln. Das HPl hat hier
sondern eher einen reprimierenden Einfluß
auf die Expression. In den Maus Hepatoma-Zellen BWIJ dagegen wird
die
Transkription
in
Anwesenheit des HPl um das 5 bis 10 fache
stimuliert.
Dieses HPl konnte sehr gut charakterisiert werden: Es umfaßt 13bp
und
befindet
sich
Albuminpromotor.
Durch
zwischen
eine
Position
einzige
-65
und
-53
im
Punktmutation entweder in
Position -65 oder -53 kann seine Funktion völlig zerstört werden.
Die
beiden
Guanidin
das
in
für
die
Position
funktionell
Aktivität
der Elemente essentiellen Basen
-65 und Cytidin in Position -53 begrenzen
definierte
Element,
palindrom-ähnlich strukturiert ist.
das
sehr
AT-reich
und
129
HPl-ähnliche
Sequenzmotive
a-Foetoproteingenen
Motive
sind
der
ebenso
können
auch
in
den
Albumin-
und
Säuger und Vögel gefunden werden. Diese
wie das HPl im Promotorbereich zwischen -75
und -48 relativ zur Startstelle der Transkription lokalisiert und
besitzen
meist
ähnliche
Struktur (ABB21). Aufgrund der Homologievergleiche kann
die
ebenfalls
eine
mehr
oder
weniger
palindrom-
Konsensus-Sequenz GNTANTNNTNNC abgeleitet werden,
definierten
Basen
Sequenzmotiven
menschlichen
zu
in
100%
den
verschiedenen
konserviert
a1-Antitrypsingens
sind.
In
in der die
beobachteten
der Sequenz des
(Ciliberto et al., 1985), einem
ebenfalls
leberspezifisch
ähnlichen
Bereich zwischen -75 und -63 die Sequenz GTTAAATATTCAC
entdeckt
werden,
in
Konsensus-Sequenz
an
der
Mutationsanalyse
Aktivität
im
HPl
verloren
von Bedeutung ist,
den
den
dessen,
daß
Positionen
außerdem
kann
man
der
wenn
der
werden
(ABB22,23).
Ob
Daten
aus
der
darf,
ohne daß die
diese
aufgestellte
Genexpression generell
Sequenzbereichen
Maus
wurden
des
dazu
Albumin-
und
Untersuchungen
sie anstelle des HPl bei Position -50 vor
Albuminpromotor
diese
beiden
unterschiedlich
ihr
einem
Diese Elemente konnten das HPl-Element des Xenopus
ersetzen,
Xenopus
in
ist noch nicht geklärt.
a-Foetoproteingens
nicht
aufgrund
leberspezifisc~e
entsprechenden
durchgeführt.
konnte
Der Unterschied befindet sich
verändert
geht
Gen,
Positionen von 6 möglichen mit der
die
Konsensus-Sequenz für die
Mit
5
übereinstimmen.
Position,
einer
exprimierten
Abstand
nicht
kloniert
wurden.
Säuger-Elemente
In
Anbetracht
jeweils
in 3 von 4
zum funktionellen HPl waren, und daß
zum Promotor um eine Base verringert war,
erklären,
welche
beobachteten Inkaktivierung führt.
der
Veränderungen
zur
130
Dem
HPl
der
bedeutende
Xenopus
Rolle
Albumine konnte jedenfalls eindeutig eine
für
die
hepatomaspezifische
Expression
zugesprochen werden.
Wie ist die Regulation der Xenopus Albumingene einzuordnen ?
Für
die
meisten,
bisher
genau
untersuchten,
gewebespezifisch
regulierten Gene wurden mehrere Regulationselemente (positive und
negative)
beschrieben,
Expression
eines
die alle zusammen, die gewebespezifische
Gens
vermitteln.
Meist
setzen
sich
solche
komplexe Regulationseinheiten aus distalen Enhancer-Bereichen und
proximalen
1985;
Promotorelementen
Edlund et al.,
Die
1985).
gewebespezifische
a-Foetoproteingene
Zusammenwirken
zusammen (Groschedl und Baltimore,
der
Expression
Säuger
einzelner
vieler
der
Albumin-
ebenfalls
wird
durch
und
das
und proximal gelegener
distal
Regulationselemente vermittelt.
So
der
besitzt
das a-Foetoproteingen der Maus drei Enhancer, die in
5'flankierenden
verteilt
sind,
Region
und
über
einen
ca.
7kb großen Bereich
ein gewebespezifisches Promotorelement, das
zwischen -85 und -52 lokalisiert ist (Godbout et al.,
und
Papaconstantinou,
Regionen
sind
Vergleiche
werden,
nicht
mit
um
1986).
der
zu
Die
Sequenzen
veröffentlicht.
Sequenz
untersuchen,
dieser
Insofern
1986; Widen
Enhancer-
können
keine
der Xenopus Albumingene angestellt
ob
sieh
in
diesen Bereichen ein
HPl-ähnlichens Sequenzmotiv befindet.
Der
Bereich
von
Gewebespezifität
Tilghman,
1983).
-85
bis
vermitteln
In
diesem
-52
soll,
in
der
ist
Bereich
Promotor-Region,
sequenziert
der
(Scott und
wurde ein zum HPl-Element
131
ähnliches
Sequenzmotiv gefunden (ABB21).
Allerdings wurde dieser
gewebespezifität-vermittelnde
Promotorbereich
charakterisiert.
Daher
noch
Sequenz-Element,
das
muß
der
nicht
geklärt
werden,
aufgestellten
weiter
ob
das
Konsensus-Sequenz
entspricht, die gleiche Funktion wie das HPl hat.
Die
Enhancer
des
die
gewebespezifische
Promotor-Element
Maus a-Foetoproteingens sind nur zum Teil für
gezeigt,
1986).
daß
die
während
das
Funktionen haben.
Gewebe,
in
dem
In vivo Studien mit transgenen Mäusen
drei
gleichen
verschiedene
verantwortlich,
für die Expression in Hepatomazellen essentiell
ist (Godbout et al.,
haben
Regulation
das
Enhancer-Domänen nicht genau die
Sie üben vielmehr in Abhängigkeit zum
a-Foetoproteingen
Einflüsse
auf
die
exprimiert
wird,
Regulation aus (Hammer et al.,
1987) .
Dieser
den
Enhancer-Bereich ist sehr groß und befindet sich zwischen
gekoppelten Albumin- und a-Foetoproteingenen (Ingram et al.,
1981;
Urano et al.,
1984): Daher wird vermutet,
die
Albuminexpression,
möglicherweise
daß in vivo auch
während
bestimmter
Entwicklungsstadien, von dieser Enhancer-Region beeinflußt werden
könnte
(Godbout
konnte
gezeigt
positionierter
Promotors
Allerdings
et
werden,
daß
erhöht
dieser
20-25kb wirken können.
die
1986).
In
Transfektionsexperimenten
ein
a-Foetoprotein-Enhancer
signifikant
müßte
al.,
(Muglia
3'
zum
die
Albuminpromotor
Aktivität
des
und Rothman-Denes,
1986.
Enhancer in vivo über eine Distanz von
Bisher gibt es nur einen Präzidenzfall für
Wirkung eines Enhancers über eine solche große Distanz (Wang
und Calame,
1985).
132
Die
gewebespezifische Regulation der Albumingene scheint ähnlich
komplex
organisiert
zu
sein. So gibt es Hinweise, daß das Maus
Albumingen sehr weit entfernt in der 5'flankierenden Region einen
Enhancer
pers.
besitzt,
Gewebespezifität
Bereich
für
das
der
Albumingene
Ratten
vermitteln
Bereich
(Ott
et
weiter
al.,
Transfektionsexperimenten
gewebespezifischen
Ebenso
konnte
Albumingen
der
sind,
Da
die
besitzen.
Bei
Mit
transienten
Deletionsmutanten
Bereich
Albumingene
(Heard et al.,
Transkriptionssystem
1987).
für
das
von -170 bis -55 relativ zur
definiert
Transkription
beiden
daß 400bp
gewebespezifische Expression
ausreichen
vitro
ein
ist anzunehmen,
werden,
verschiedenen
Transkription
gewebespezifische
gezeigt
daß l50bp vor dem Transkriptions-Start zur
einem
Maus
Ratte und Maus. Zuerst
werden:
von
Expression
in
der
Startstelle
1986).
(Tilghman,
1984). Mittlerweile konnte dieser
eingegrenzt
konnte gezeigt werden,
von
Albumingen
5'flankierende Sequenzen ausreichen,
zu
vermittelt
Mitteilung). Genau untersucht wurde bislang jedoch nur der
proximale
konnte
der
werden,
notwendig
ist
der
für die
(Gorski et al.,
der Ratte und der Maus sehr homolog
daß beide die gleichen Regulationselemente
Genen
führt
eine stufenweise Verkürzung
dieser Sequenzbereiche zu einem graduellen Verlust der Aktivität.
Daraus
läßt
Regulation
1987).
sich
wichtig
schließen,
sind
daß
(Gorski
mehrere
et
al.,
Elemente
für
die
1986; Heard et al.,
133
Durch
Vergleich
konnten
in
werden:
zwei
sowie
ein
dieser
Region
vier homologe Bereiche identifiziert
distale Elemente (das DE II zwischen -123 und -111
das DE I zwischen -102 und -95), die CCAAT-Box bei -80 und
proximales
TATA-Box
zu
der Albuminsequenzen von Ratte, Maus und Mensch
Promotorelement,
das
zwischen
CCAAT-Box
und
lokalisiert ist. Alle diese Elemente scheinen notwendig
sein,
um
eine
optimale
gewebespezifische
Expression
zu
vermitteln (Heard et al. ,1987).
Eines dieser Elemente,
HPl
der
Xenopus
zwischen
oben;
Element
Albumingene.
Position
ABB2l).
Im
nur
Regulation
-64
kleinen
leisten.
Albumingen der Ratte,
nur
schwach
in
beträgt
der
Ratte
enthält
wird
scheint das proximale
zur der gewebespezifischen
die 5'Deletionsmutante -93 im
allerdings immer noch gewebespezifisch
1987).
Maus Albumingens zeigten ebenfalls,
promotornahen
regulatorisches
Element
die nur noch das proximale Element enthält,
reguliert (Heard et al.,
des
proximale
Beitrag
So
exprimiert,
Untersuchungen
Das
zeigt Homologie zum
und -51 eine HPl-ähnliche Sequenz (siehe
Albumingen
einen
zu
das proximale Element,
Bereich,
zwischen
-74
und
daß sich
-55,
ein
Element befindet. Die Aktivität dieses Elementes
etwa
5%
der
gesamten
Transkriptionsaktivität
und
zwischen
-75
und
deletiert wird (Gorski et al. ,1986). Bei
Position
-64
beginnt
(ABB2l).
daß
-64
aber
sinkt
auf
gewebespezifischen
l% ab, wenn der Bereich
gerade die zum HPl ähnliche Sequenz
Aufgrund der Ergebnisse über das HPl würde man erwarten,
diese
-64
Deletionsmutante
noch
aktiv
ist.,
da
das
HPl-ähnliche Sequenzmotiv noch intakt ist.
Aufgrund
unterschiedlicher
Daten
über
Ratte
nicht
Analysemethoden
kann man alle diese
die Regulation des Albumingens der Maus als auch der
richtig
mit
denen
vergleichen,
die
vom Xenopus
134
Albumingen erhalten wurden. So wurde das Maus Albumingen in einem
in
vitro Transkriptionssystem mit Proteinextrakten aus der Leber
analysiert,
während
transfizierten
Xenopus
die
Ratten
Zellen
kann
werden.
wurden
Maus
das
den
untersucht
ihrerseits
Hepatoma-Zellen
BWIJ-Zellen
Differenzierungsmarker
Leber
Ratten Albumingens in
in
wurde.
den
Die
albumin-
BWIJ analysiert.
In diesen
Albumingen von Ratte und Maus nicht exprimiert
Diese
daher,
des
Hepatoma-Zellen
Albumingene
produzierenden
Regulation
(Cassio
exprimieren
und
nur
Weiss,l979).
foetale
Man
vermutet
daß für die Expression der Säuger Albumingene in foetaler
regulatorische
Sequenzen
erforderlich sind, die nicht in
untersuchten Bereichen (-400 bis +l) vorhanden waren (Ott et
al. ,1984;
Heard
ihrerseits
sehr
et
al. ,1987).
schlecht
Die
Xenopus Albumingene wurden
in Ratten Hepatoma-Zellen mit adulten
Differenzierungsmarkern exprimiert (Daten nicht gezeigt).
Diese Beobachtung läßt den Schluß zu, daß die Xenopus Albumingene
in
Bezug auf ihre Regulation wohl eher mit dem a-Foetoproteingen
der
Säuger,
sind.
die
Diese
Xenopus
gezeigt
das in der foetalen Leber exprimiert wird, verwandt
Annahme
Albumingene
werden,
System
noch
daß
und
ein
das Maus a-Foetoproteingen konnte
Minimalpromotor
konstitutive
a-Foetoprotein
zwischen
wird durch folgende Daten unterstützt: Für
Expression
in einem heterologen
vermitteln
kann. Im Maus
konnte außerdem ein proximales Regulationselement
Position
Gewebespezifität
-85
und
vermittelt
-52
(Godbout
definiert
et
werden,
al.,l986).
das
In diesem
Bereich konnte ebenfalls eine zum HPl ähnliche Sequenz beobachtet
werden (ABB21).
Ein endgültiger Beweis dafür, daß die Xenopus Albumingene ähnlich
reguliert
erbracht
Maus
werden
wie
die
a-Foetoproteingene
kann
erst
dann
werden, wenn man zeigt, daß das HPl-ähnliche Element im
a-Foetoproteingen
in
Verbindung
mit
seinem
Promotor
135
ausreicht,
um gewebespezifische Expression in den BWIJ-Zellen zu
vermitteln.
Im
Unterschied
Regulation
zu
der
wurden,
konnte
Bereich
nur
Daten,
Albuminfür
ein
identifiziert
den
die
und
über die gewebespezifische
a-Foetoproteingene
beschrieben
die Xenopus Albumingene im 5' flankierenden
cis-wirkendes
werden,
das
Element,
das
13bp
hepatoma-spezifische
große
HPl
Expression
vermittelt.
Aufgrund der Analyse der Xenopus Albumingene in einem heterologen
System
wurden sicherlich nicht alle Regulationselemente der Gene
entdeckt. Möglicherweise befinden sich im 5'flankierenden Bereich
zwischen
wie
-4200 und -662 negativ regulatorische Elemente,
im
a-Foetoproteingen
Rothman-Denes,l986),
-4200
und
-1425
exprimiert.
in
Befund
von
Ratte
Bereich
keiner
spricht
ausgeschlossen
werden,
5'flankierenden
Region
bis
(Muglia
und
beiden großen ALB/CAT-Hybridgene
der untersuchten Zellinien
auf
gewebespezifischen
5'flankierenden
bereits
die
wurden
Dieser
Vorhandensein
denn
der
ähnlich
zu
daß
Fälle
gegen das
Enhancer-Elementen
-4200.
sich
alle
Allerdings
weiter
im
kann nicht
entfernt
in
der
gewebespezifische Enhancer befinden, was
für die Albumin- und a-Foetoproteingene beobachtet wurde
(siehe oben).
Mit
der
Analyse
der
Xenopus
Albumingene
in
den het~rologen
Maus-Hepatomazellen ist es also gelungen ein Element,
definieren, das Teil eines Regulationsmechanismus ist,
Evolution
Element
konserviert
eine
geblieben
entscheidende
das HPl,
zu
der in der
ist. Möglicherweise hat dieses
Rolle
in
der
gewebespezifischen
Regulation der Albumin- und a-Foetoproteingene . . sw.
136
Solche
zwischen
Säugern
Regulationselemente
wurden
schon
Hitzeschock-Regulationselement
(Bienz,l984),
des
das
und
HSE
Xenopus
mehrfach
des
Oestrogen-Induktion
Vitellogeningens
A2
(Klein-Hitpaß
konservierte
beschrieben:
Hitzeschockgens
das
hsp 70
vermittelnde Element EHE
et
al. ,1986)
und
des
Serum-Induktion vermittelnde Element des zytoskeletalen Actingens
(Mohun
et
konnte
somit
das
nach
al.,l987).
ein
ist
der Identifikation des HPl-Elementes
weiteres Regulationselement definiert werden,
Transfektion
Bemerkenswert
Mit
in
dabei,
Säugerzellen
noch
funktionell ist.
daß ein Element charakterisiert wurde,
das hepatoma-spezifische Regulation vermittelt.
137
Welcher Faktor erkennt das HPl ?
Durch
Zellfusions-Experimete
trans-wirkende
gezeigt
konnte
werden,
daß
Faktoren in die gewebespezifischen Regulation von
Genen involviert sind.
Aufgrund
von
der
beobachteten selektiven und reziproken Auslöschung
differenzierten
verschiedener
Funktionen nach der Fusionierung von Zellen
Differenzierungszustände
wurden
zunächst
nur
Hinweise für die Existenz von negativen Regulationsfaktoren (sog.
extinguisher)
gefunden
Davidson,l974).
Expression
Es
einer
(übersichtsart.
wurde
angenommen,
sozusagen
Weiss
daß
fremden
et
diese
al.,l972;
Faktoren die
Differenzierungsfunktion
verhindern.
über
die Existenz von positiven Regulationsfaktoren,
Aktivierung
konnten
die
einer
die für die
differenzierungsspezifischen Funktion sorgen,
zunächst nur indirekte Hinweise gesammelt werden Identifizierung
DNA-Elementen.
werden,
daß
von
Inzwischen
gewebespezifischen
konnte
trans-wirkende
für
Faktoren
das
an
durch
cis-wirkenden
Insulingen
gezeigt
die gewebespezifische
Enhancer-Region des Gens binden (Ohlsson und Edlund,l986).
Die
Isolierung
cis-wirkenden
des
5'flankierenden
Region
Gewebespezifität
vermittelt,
trans-wirkenden Faktoren,
der
Elements
Xenopus
ermöglicht
HPl
in
Albumingene,
nun
die
das
Suche
nach
die mit dieser Sequenz interagieren.
Durch in vitro Bindungsstudien ("mobility shift"-Experimente)
es
bereits
gelungen,
einen
Faktor
nachzuweisen,
isolierte HPl-Element bindet (G.Ryffel,
Faktor
von
ist hepatomaspezifisch,
den
Maus
der
der
ist
an das
pers. Mitteilung). Dieser
er wurde nur in den Kernextrakten
Hepatoma-Zellen
BWIJ
und
den
menschlichen
138
Hepaotma-Zellen Hep G2 gefunden.
Aufgrund
es
der Eigenschaft dieses Faktors, das HPl zu binden, wird
möglich
Nach
sein, dieses Protein in größeren Mengen zu reinigen.
erfolgter
Anreicherung
auch
wird
des
Schließlich
wird
spezifischer
Oligonukleotide die für den Faktor spezifische cDNA
Hilfe
herstellen
Proteins
und
mit
dagegen
Teile
sequenzieren
man
Antikörper
man
dieser
können.
Antikörper
oder
isolieren können und damit seine Regulation studieren können.
Mit
der
Zugang
Identifizierung des HPl-Elementes ist es also gelungen,
zu
übergeordneten Genen zu bekommen. Damit ist der erste
Schritt getan,
erhalten,
die
um genauen Einblick in die Regulation von Genen zu
für
den·
Mechanismus
Expression verantwortlich sind.
der
g~webespezifischen
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