Abstract_Werdien
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Aktivierung der Genexpression in Xenopus durch sequenzspezifische DNA Rekombination Dissertationsschrift von Dagmar Werdien Abstract Ein attraktives Modell, um die frühe Entwicklung von Vertebraten zu analysieren, ist der afrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis. In der vorliegenden Arbeit wird erstmals der Gebrauch der sequenzspezifischen DNA Rekombinasen FLP aus Saccharomyces cerevisiae und Cre aus dem Bakteriophagen P1 zur Zelllinienmarkierung in Xenopus Embryonen beschrieben. Zunächst wurden Reporter mit FLP- und Cre-spezifischen Erkennungssequenzen (FRT und loxP) hergestellt, die im nicht aktivierten Zustand das grün fluoreszierende Protein (GFP) als Selektionsmarker und im aktivierten Zustand ß-Galaktosidase als Induktionsmarker CMV-kontrolliert exprimieren. Außerdem wurden Reporter entwickelt, die zwei verschiedenfarbig fluoreszierende Proteine (GFP und DsRed oder ECFP und EYFP) kombinieren. Diese Systeme ermöglichen es, die Rekombiationsaktivität von FLP und Cre an lebenden Tieren zu detektieren. Durch die Coinjektion von Reporter DNA und FLP- oder Cre mRNA in Xenopus Embryonen konnte gezeigt werden, dass die Reporter DNA in Xenopus laevis und Xenopus tropicalis rekombiniert wird und die Expression des Induktionsmarkers aktiviert wird. Bei Fusion der DNA Rekombinasen an die mutierte Ligandenbindungsdomäne des Östrogenrezeptors (ER) wird die Aktivität der DNA Rekombinasen von dem synthetischen Liganden 4Hydroxytamoxifen Rekombinaseaktivität (4-OHT) in abhängig. Xenopus laevis Um die Embryonen Regulierbarkeit zu testen, der wurden DNA die ligandenabhängigen DNA Rekombinasen FLPER(T) und CreER(T) durch RNA Injektion überexprimiert. Als Nachteil erwies sich, dass CreER(T) bereits in Abwesenheit des Induktors 4-OHT eine hohe Basalaktivität zeigt. FLPER(T) ist vorwiegend in Gegenwart des Induktors aktiv. Allerdings ist die Rekombinationsaktivität von FLPER(T) geringer als die von konstitutiv aktiver FLP Rekombinase. Im zweiten Schritt wurden verschiedene Reporter DNAs stabil in das Xenopus laevis Genom integriert und die transgenen Embryonen zu adulten Fröschen aufgezogen. An drei Stammtieren (GfL2, GfL3 und GfL4), die GFP als Selektionsmarkergen und ß-Galaktosidase als FLP-aktivierbares Induktionsmarkergen enthalten, wurde gezeigt, dass die transgene Reporter DNA über die Keimbahn vererbt und in den Nachkommen exprimiert wird. Überraschenderweise wird der CMV Promotor, der als ubiquitär aktiv gilt, im Verlauf der Entwicklung in einem Großteil der Zellen stillgelegt. An F1 Larven der Linien GfL2 und GfL3, die das Transgen in hoher Kopienzahl (34 und 15 Kopien pro diploidem Kern) integriert haben, konnte der Promotor durch Abschneiden der Schwanzspitze reaktiviert werden. Die an der Schnittstelle gebildete Blastema aus dedifferenzierten proliferierenden Zellen enthält offensichtlich Signale, die für die Aktivität des CMV Promotors erforderlich sind, in differenzierten Zellen aber fehlen. Um die Rekombinierbarkeit der transgenen Reporter DNA zu testen, wurde FLP Rekombinase durch RNA Injektion in F1 Embryonen der Reporterlinie GfL2 überexprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Induktionsmarkers ß-Galaktosidase in verschiedenen Geweben mosaikartig aktiviert wird. Das inhomogene Expressionsmuster ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die injizierte FLP mRNA und das translatierte FLP Protein im Organismus nur begrenzt stabil sind und mit der Zeit abgebaut werden. In einem unabhängigen Ansatz wurde die Cre codierende Sequenz zusätzlich zur Reporter DNA stabil in das Xenopus Genom integriert und die DNA Rekombinase unter der Kontrolle des Xenopus -cardiac actin (CAR) Promotors kontinuierlich exprimiert. In den sich entwickelnden doppelt transgenen Larven wurde die Expression des transgenen Induktionsmarkers EYFP mit hoher Effizienz spezifisch in den Muskelzellen des Schwanzes und in den Myofibrillen des Kiefers aktiviert. Da das Genom durch die DNA Rekombination irreversibel verändert wird, sind nicht nur die Zellen, in denen der CAR Promotor aktiv ist, sondern auch alle davon abstammenden Zellen durch die EYFP-Fluoreszenz dauerhaft markiert. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass in Zukunft durch die Kreuzung transgener Reporterlinien mit Effektorlinien, die Cre oder FLP unter der Kontrolle zelltypspezifischer Promotoren exprimieren, der Ursprung und das Schicksal definierter Zellpopulationen erfasst werden kann und die Funktion von Genen bei der Organogenese von Vertebraten an lebenden Tieren auf zellulärer Ebene analysiert werden kann.
