Abstract_Werdien

Aktivierung der Genexpression in Xenopus
durch sequenzspezifische DNA Rekombination
Dissertationsschrift von Dagmar Werdien
Abstract
Ein attraktives Modell, um die frühe Entwicklung von Vertebraten zu analysieren, ist der
afrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis. In der vorliegenden Arbeit wird erstmals der
Gebrauch der sequenzspezifischen DNA Rekombinasen FLP aus Saccharomyces cerevisiae
und Cre aus dem Bakteriophagen P1 zur Zelllinienmarkierung in Xenopus Embryonen
beschrieben. Zunächst wurden Reporter mit FLP- und Cre-spezifischen Erkennungssequenzen
(FRT und loxP) hergestellt, die im nicht aktivierten Zustand das grün fluoreszierende Protein
(GFP) als Selektionsmarker und im aktivierten Zustand ß-Galaktosidase als Induktionsmarker
CMV-kontrolliert
exprimieren.
Außerdem
wurden
Reporter
entwickelt,
die
zwei
verschiedenfarbig fluoreszierende Proteine (GFP und DsRed oder ECFP und EYFP)
kombinieren. Diese Systeme ermöglichen es, die Rekombiationsaktivität von FLP und Cre an
lebenden Tieren zu detektieren.
Durch die Coinjektion von Reporter DNA und FLP- oder Cre mRNA in Xenopus Embryonen
konnte gezeigt werden, dass die Reporter DNA in Xenopus laevis und Xenopus tropicalis
rekombiniert wird und die Expression des Induktionsmarkers aktiviert wird. Bei Fusion der
DNA Rekombinasen an die mutierte Ligandenbindungsdomäne des Östrogenrezeptors (ER)
wird die Aktivität der DNA Rekombinasen von dem synthetischen Liganden 4Hydroxytamoxifen
Rekombinaseaktivität
(4-OHT)
in
abhängig.
Xenopus
laevis
Um
die
Embryonen
Regulierbarkeit
zu
testen,
der
wurden
DNA
die
ligandenabhängigen DNA Rekombinasen FLPER(T) und CreER(T) durch RNA Injektion
überexprimiert. Als Nachteil erwies sich, dass CreER(T) bereits in Abwesenheit des Induktors
4-OHT eine hohe Basalaktivität zeigt. FLPER(T) ist vorwiegend in Gegenwart des Induktors
aktiv. Allerdings ist die Rekombinationsaktivität von FLPER(T) geringer als die von
konstitutiv aktiver FLP Rekombinase.
Im zweiten Schritt wurden verschiedene Reporter DNAs stabil in das Xenopus laevis Genom
integriert und die transgenen Embryonen zu adulten Fröschen aufgezogen. An drei
Stammtieren (GfL2, GfL3 und GfL4), die GFP als Selektionsmarkergen und ß-Galaktosidase
als FLP-aktivierbares Induktionsmarkergen enthalten, wurde gezeigt, dass die transgene
Reporter DNA über die Keimbahn vererbt und in den Nachkommen exprimiert wird.
Überraschenderweise wird der CMV Promotor, der als ubiquitär aktiv gilt, im Verlauf der
Entwicklung in einem Großteil der Zellen stillgelegt. An F1 Larven der Linien GfL2 und
GfL3, die das Transgen in hoher Kopienzahl (34 und 15 Kopien pro diploidem Kern)
integriert haben, konnte der Promotor durch Abschneiden der Schwanzspitze reaktiviert
werden. Die an der Schnittstelle gebildete Blastema aus dedifferenzierten proliferierenden
Zellen enthält offensichtlich Signale, die für die Aktivität des CMV Promotors erforderlich
sind, in differenzierten Zellen aber fehlen.
Um die Rekombinierbarkeit der transgenen Reporter DNA zu testen, wurde FLP
Rekombinase durch RNA Injektion in F1 Embryonen der Reporterlinie GfL2 überexprimiert.
Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Induktionsmarkers ß-Galaktosidase in
verschiedenen Geweben mosaikartig aktiviert wird. Das inhomogene Expressionsmuster ist
vermutlich darauf zurückzuführen, dass die injizierte FLP mRNA und das translatierte FLP
Protein im Organismus nur begrenzt stabil sind und mit der Zeit abgebaut werden.
In einem unabhängigen Ansatz wurde die Cre codierende Sequenz zusätzlich zur Reporter
DNA stabil in das Xenopus Genom integriert und die DNA Rekombinase unter der Kontrolle
des Xenopus -cardiac actin (CAR) Promotors kontinuierlich exprimiert. In den sich
entwickelnden doppelt
transgenen
Larven
wurde die Expression des
transgenen
Induktionsmarkers EYFP mit hoher Effizienz spezifisch in den Muskelzellen des Schwanzes
und in den Myofibrillen des Kiefers aktiviert. Da das Genom durch die DNA Rekombination
irreversibel verändert wird, sind nicht nur die Zellen, in denen der CAR Promotor aktiv ist,
sondern auch alle davon abstammenden Zellen durch die EYFP-Fluoreszenz dauerhaft
markiert.
Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass in Zukunft durch die Kreuzung
transgener Reporterlinien mit Effektorlinien, die Cre oder FLP unter der Kontrolle
zelltypspezifischer Promotoren exprimieren, der Ursprung und das Schicksal definierter
Zellpopulationen erfasst werden kann und die Funktion von Genen bei der Organogenese von
Vertebraten an lebenden Tieren auf zellulärer Ebene analysiert werden kann.