Semisynthetische Ras-Lipoproteine : Studium der intrazellulären

Zusammenfassung
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6. Zusammenfassung
Das kleine GTP-bindende Protein Ras ist ein molekularer Schalter, der die Differenzierung
und Proliferation von Zellen reguliert. Das Protein erfährt eine Reihe von posttranslationalen
Modifikationen, bevor es zur Plasmamembran transportiert wird, wo sich Rezeptor, Adaptorund Effektor-Proteine in nächster Nähe befinden. Zwei hydrophobe Modifikationen, eine
Farnesyl- und eine Palmitoylgruppe, vermitteln bei der Isoform N-Ras die Interaktion mit
Membranen. Es wurde gezeigt, dass der Transport von N-Ras zur Plasmamembran vesikulär
über den Golgi-Apparat erfolgt.
Durch die Kombination eines rekombinant exprimierten, C-terminal verkürzten N-RasProteins und eines chemisch synthetisierten N-Ras-Peptids war es in dieser Arbeit möglich
sowohl nativ als auch artifiziell modifizierte N-Ras Proteine herzustellen. Die Lipopeptide
umfassten die im Protein fehlenden Aminosäuren und waren N-terminal durch eine
Maleinimidogruppe aktiviert, die mit der Thiolgruppe des C-terminalen Cysteins im Protein
reagierte. Die biologische Aktivität dieser Konjugate wurde in einem Differenzierungsassay
mit PC12 Zellen quantifiziert. PC12 Zellen bilden neuritenartige Fortsätze nach Injektion von
onkogenem Ras-Protein. Das verkürzte N-Ras-Protein ist in der Zelle nicht inaktiv, sondern
konkurriert mit dem vollständigen Protein um die Bindung an Partnerproteine. Die Aktivität
des vollständigen N-Ras wurde durch Koinjektion von verkürztem Ras verringert. Für
verschiedene Kopplungsprodukte wurde die biologische Aktivität statistisch aussagekräftig
evaluiert. Die reversible Natur des Palmitoylankers schien keinen entscheidenden Einfluss auf
die Aktivität des N-Ras-Proteins zu haben, da ein stabil hexadecyliertes Konjugat ebenso
aktiv war. Mit einem N-Ras-Protein, dessen C-Terminus aus Aminosäuren in der DKonfiguration bestand, wurde nachgewiesen, dass die Palmitoylierung von Ras nicht
stereospezifisch erfolgt.
Ein Hauptteil dieser Arbeit bestand in der Entwicklung eines fluoreszenzmarkierten RasProteins. Addition der Fluorophore mant und Dansyl an das Isoprenylmotiv führte zu
biologisch aktiven Konjugaten, die aber aufgrund der geringen Quantenausbeute für
fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen nicht geeignet waren. N-Ras-Proteine, die mit
den Fluorophoren NBD und Bodipy®FL modifiziert wurden, waren nicht biologisch aktiv,
obwohl prinzipiell eine Interaktion mit Membranen möglich war. In der Zelle waren die
markierten N-Ras-Proteine nur an Endomembranen und nicht an der Plasmamembran
lokalisiert.
Die
Membraninsertion
der
N-Ras-Proteine
wurde
in
verschiedenen
biophysikalischen Ansätzen mit artifiziellen Membranen untersucht und nachgewiesen. Dazu
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wurden Membranen, die im BiacoreTM-System auf Sensorchips aufgebracht worden waren,
ebenso wie unilamellare Vesikel, in Anisotropie- und Fluoreszenz-basierten Assays
eingesetzt.
Ein fluoreszenzmarkiertes N-Ras-Protein mit biologischer Aktivität konnte schließlich
hergestellt werden, indem die C-terminale Carboxymethylgruppe durch den Fluorophor
Bodipy®FL substituiert wurde. Das Konjugat war am Golgi-Apparat und an der
Plasmamembran lokalisiert, während ein nicht palmitoylierbares Protein auf Endomembranen
beschränkt war. Untersuchungen zum Transport des Ras zur Plasmamembran zeigten, dass
neben dem vesikulären Weg über den Golgi-Apparat ein alternativer Weg existieren musste.
In pharmakologischen Studien wurden der PC12 Assay und das fluoreszenzmarkierte RasProtein zur Charakterisierung eines Inhibitors der Acyl Protein Thioesterase 1 und eines
Analogons des Cerulenin eingesetzt. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Substanzen
die biologische Aktivität eines palmitoylierbaren Ras-Proteins reduzierten und den Transport
des Ras zur Plasmamembran beeinflussten.