Glyoxylatzyklus

Glyoxysomen
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Isolierung von Glyoxysomen
1. Glyoxysomen: Aufbau
Alle eukaryontischen Zellen enthalten Peroxysomen. Das sind kleine, mit nur einer Membran
gegenüber dem Cytoplasma abgegrenzte Vesikel mit einem Durchmesser von ca. 0,2 - 1,5 µm.
Die Membranen besitzen keine Invaginationen und sind stets ohne Ribosomenbesatz.
Peroxysomen enthalten Enzyme die die bei verschiedenen Stoffwechselvorgängen
entstehenden freien Radikale unschädlich machen.
Glyoxysomen sind spezialisierte Peroxysomen, die nur in Pflanzenzellen -hier vor allem in
keimenden Samen- vorkommen. In ihnen sind Enzyme der Fettsäureoxidation und des
Glyoxylatzyklus lokalisiert. Mit Beginn der Keimung entstehen die Glyoxysomen in großer Zahl
in den fettspeichernden Zellen des Endosperms bzw. der Kotyledonen, vermutlich durch
Abschnürung vom Endoplasmatischen Retikulum. Die Enzyme werden erst später in die Vesikel
eingelagert.
1.2. Glyoxysomen: Funktion
Bei den Pflanzensamen dienen vor allem Fette als Energiespeicher. Mit Beginn der Keimung
besteht aber auch ein Bedarf an Kohlenhydraten (z.B. zur Synthese von Zellulose). Da der
Keimling in den ersten Tagen noch nicht zur Photosynthese in der Lage ist, muß der gesamte
Energie- und Baustoffbedarf aus dem gespeicherten Material gedeckt werden. Die
Glyoxysomen enthalten hierzu einen Teil der Enzyme, die zum Fettsäureabbau und zur
Gluconeogenese notwendig sind. Der Reaktionszyklus der zur Überführung eines C2-Körpers
(Acetyl-CoA, dem Endprodukt des Fettsäureabbaus) in einen C4-Körper (Succinat) führt, wird
als Glyoxylat- oder Krebs-Kornberg-Zyklus bezeichnet. Der Glyoxylatzyklus kann auch von
Bakterien durchgeführt werden, hier befinden sich die entsprechenden Enzyme jedoch in/an der
Cytoplasmamembran und im Cytoplasma.
Der Glyoxylatzyklus in Pflanzenzellen ist auf drei intrazelluläre Kompartimente aufgeteilt,
zwischen denen ein reger Stoffaustausch herrscht (Abb. 1). Von den Enzymen, die sowohl am
Zitronensäure- als auch am Glyoxylatzyklus beteiligt sind, gibt es jeweils zwei Isoenzyme.
Nachdem die Fettsäuren in den Glyoxysomen über die β-Oxidation zu Acetyl-CoA abgebaut
wurden, wird Acetyl-CoA mit Oxalacetat durch die Citrat-Synthase zu Citrat kondensiert. Es
erfolgt eine Umlagerung über cis-Aconitat zu Isocitrat. Isocitrat wird von der Isocitrat-Lyase,
einem der beiden Leitenzyme der Glyoxysomen, zu Succinat und Glyoxylat gespalten. Succinat
wird in die Mitochondrien transportiert und über die Reaktionen des Zitronensäure- oder KrebsZyklus zu Oxalacetat umgesetzt. Durch eine Transaminierung entsteht Aspartat, das wieder in
die Glyoxysomen gelangt. Das Aspartat wird hier wieder zu Oxalacetat desaminiert und steht für
Glyoxysomen
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eine erneute Kondensation mit Acetyl-CoA zur Verfügung. Aus dem bei der Spaltung von
Isocitrat entstandenen Glyoxylat entsteht durch Malat-Synthase Malat. Malat wird ins
Cytoplasma transportiert und steht hier zur Synthese von Glucose (Gluconeogenese) zur
Verfügung. Die Malat-Synthase ist das zweite Leitenzym der Glyoxysomen.
Als Summe der Reaktionen des Glyoxylatzyklus ergibt sich:
2 Acetyl-CoA + NAD+ + 2H2O → Succinat + 2 CoA + NADH + H+
Die Reaktionen des Glyoxylatzyklus sind in Abb.2 übersichtlich dargestellt.
Abb. 1. Aufteilung der Reaktionen des Glyoxylatzyklus in verschiedene Kompartimente.
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Abb.2. Reaktionen des Glyoxylatzyklus.
1.3. Der Begriff „Leitenzym“
Die eukaryontischen Zellen bestehen aus verschiedenen Kompartimenten wie Cytosol,
Zellkern, Mitochondrien etc. Bei Pflanzenzellen kommen noch verschiedene andere Organellen
wie z.B. Plastiden und Glyoxysomen vor. In diesen Organellen sind spezifische
Stoffwechselreaktionen mit den dazugehörigen Enzymen lokalisiert. Man bezeichnet das dort
vorherrschende und charakteristische, nicht in anderen Organellen vorkommende Enzym als
Leitenzym dieser Struktur. Dessen spezifische Aktivität hilft bei der differentiellen Zentrifugation,
aber auch bei der Gradientenzentrifugation, Zellfraktionen zu identifizieren.
Glyoxysomen
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2. Isolierung von Glyoxysomen
Die Isolierung der Glyoxysomen erfolgt durch differentielle Zentrifugation und einer
anschließenden Auftrennung der verschiedenen Zellfraktionen in einem Saccharosedichtegradienten.
Als Ausgangsmaterial dienen 20 g vorgekeimte (3 Tage bei 26°C) Sonnenblumenkerne.
Alle Präparationsschritte sollten auf Eis und mit vorgekühlten Puffern durchgeführt werden, um
den durch Proteasen bedingten Proteinverlust zu minimieren.
Das Endospermgewebe wird unter Zusatz von 2 Volumen (1 Volumen = g eingesetztes Gewebe
in ml) Puffer 1 mit einem Zwiebelhacker fein zerkleinert und anschließend in einem Mörser
weiter zerrieben.
Der resultierende Brei wird durch 4 Lagen Verbandsmull filtriert, und der Filterkuchen vorsichtig
ausgepreßt. Das Filtrat, welches die Glyoxysomen enthält, wird nach folgendem Schema weiter
aufgearbeitet:
Filtrat
Zentrifugation Rotor SS34
1500 rpm (270 g), 10 min
Überstand 1 (Ü1)
Pellet 1 (P1)
Zentrifugation Rotor SS34
9300 rpm (10000 g), 30 min
Überstand 2 (Ü2)
Puffer1:
0,5 M Saccharaose
0,15 M Tris/HCL, pH 7,5
10 mM KCl
1 mM MgCl2
1 mM EDTA
10 mM Dithiothreitol
Pellet 2 (P2)
I
in wenig Puffer 1 (2 ml) aufnehmen
I
10 - 15 mg Protein auf einen
Saccharosegradienten auftragen
I
Zentrifugation Rotor SW 28
28000 rpm (110000 g), 2 h
I
Gradient am Fraktionssammler
absaugen und fraktioniert auffangen
(F1 - F4)
Saccharosegradient: 60 % (w/w) Saccharose
57 % (w/w) Saccharose
50 % (w/w) Saccharose
44 % (w/w) Saccharose
33 % (w/w) Saccharose
25 % (w/w) Saccharose
alle mit 1 mM EDTA
Von allen Proben (Filtrat, Überstände, Pellets und Gradientenfraktionen) werden Proteinbestimmungen sowie Enzymtests gemacht um die Aufreinigung der Glyoxysomen zu verfolgen.
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3. Proteinbestimmung nach Bradford
Bei der Proteinbestimmung nach Bradford handelt es sich um eine kolorimetrische Proteinbestimmung. Die Methode beruht auf der Bindung des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue
G250 an Proteine. Hierbei kommt es zu einer Verschiebung des Extinktionsmaximums des
Farbstoffs von 465 nm nach 595 nm. Da der Proteintest schnelle Ergebnisse liefert, auf
Saccharose und die meisten Salze nicht anspricht und nur durch Detergentien in höheren
Konzentrationen beeinflußt wird, kommt er häufig zur Anwendung.
Testansatz:
790 µl
10 µl
200 µl
Wasser
Proteinlösung (max. 10 mg Protein)
Bradford-Reagenz
5 min bei Raumtemperatur stehen lassen
Extinktion bei 595 nm im Photometer gegen Blindwert messen
Die Proteinkonzentration wird anhand einer Eichgeraden berechnet und in die
Aufreinigungstabelle eingetragen. Es gilt (eine evtl. Verdünnung der Probe ist zu
berücksichtigen!):
Extinktion595nm / Faktor aus Eichgerade = µg Protein / 10µl Lösung
4. Bestimmung der Enzymkinetik
Es wird die katalytische Aktivität der Isocitrat-Lyase, einem der beiden Leitenzyme der
Glyoxysomen, bestimmt.
Das bei dieser Reaktion entstehende Glyoxylat reagiert sofort mit Phenylhydrazin zu GlyoxylatPhenylhydrazon weiter. Die Entstehung dieser Verbindung kann durch Messung der Extinktion
bei 324 nm verfolgt werden.
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4.1. Enzymtest
Ansatz für Enzymtest:
400 µl
0,5 M Kalium-Phosphat-Puffer, pH 6,85
100 µl
150 mM MgCl2
100 µl
100 mM Phenylhydrazin
100 µl
60 mM Cystein
2090 µl
entmineralisiertes Wasser
200 µl
Protein-Probe (evtl. verdünnen)
Zum Starten der
Reaktion:
10 µl
0,5 M Isocitrat
Es wird die Extinktionszunahme bei 324 nm (ΔE324) für 3-4 min gemessen.
Der Reinheitsgrad eines Enzyms wird durch die spezifische Aktivität beschrieben. Sie ist als
Verhältnis der katalytischen Aktivität zum Proteingehalt der Probe definiert:
katalytische Aktivität (Enzymeinheiten)
(1)
spez. Aktivität =
Protein (mg)
Ein Maß für die katalytische Aktivität ist die Änderung der Extinktion (s.o.). Die Extinktions-änderung
ist proportional der Konzentrationsänderung der untersuchten Verbindung. Dieser Zusammenhang
wird durch das Lambert-Beer´sche Gesetz (2) beschrieben:
(2)
ΔE324 = ε × Δc × d
ε:
Δc:
molarer Extinktionskoeffizient
Konzentrationsänderung der
untersuchten Substanz
d:
Schichtdicke der Meßküvette
Die katalytische Aktivität wird in Enzymeinheiten (Units) U angegeben. Eine Enzymeinheit ist als
diejenige Enzymmenge definiert, die pro Minute 1 µmol Substrat umsetzt. (Die abgeleitete SI-Einheit
ist das Katal [kat]. Für die Umrechnung gilt: 1 U = 16,67 nkat).
Substratumsatz (Δc)
(3)
Enzymeinheiten (U) =
Zeit (min)
Glyoxysomen
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Der Substratumsatz wird durch Messen der Extinktionszunahme bei 324 nm erfaßt. Durch Einsetzen
von Gleichung (2) in (3) erhält man
(4)
ΔE324
Enzymeinheiten (U) =
ε × d × min
Um die spezifische Aktivität zu bestimmen werden die Enzymeinheiten in Beziehung zum
Proteingehalt gesetzt, d.h. Gleichung (4) wird in (1) eingesetzt. Da ε, d und die Minute feste Größen
sind, werden sie zu einer Konstanten K zusammengefaßt. Mit Gleichung (5) kann die spezifische
Aktivität aus den experimentell ermittelten Daten bestimmt werden:
(5)
ΔE324
spez. Aktivität =
ε × d × min × mg Protein
ΔE324
=
mg Protein
× K
K = 1,7 × 10-4
Aufreinigungstabelle:
Probe
Filtrat
Ü1
P1
Ü2
P2
F1
F2
F3
Volumen
ml
Protein
mg/ml
Gesamtprotein
spezifische
Aktivität
GesamtAktivität
Glyoxysomen
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Schema Stufengradient: 3 und 5 stufiger Gradient:
Beispiele für den Proteingehaltsverlauf bei Stufengradienten unter verschiedenen Bedingungen:
Auftrag: 1000µl Probe (ca. 50 mg Protein):
Auftrag: 500 µl Probe (ca. 25 mg Protein):