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Institut für Lebensmittelchemie
Kurspraktikum „Enzymatische Untersuchungsmethoden“
Protokoll
pH – Abhängigkeit der Enzymaktivität
Gruppe:
Ziel:
Bestimmung
des
pH-Optimums
von
Invertase
(Saccharase,
Fructofuranosidofructohydrolase, EC 3.2.1.26) in einem Citrat – Phosphat – Puffer.
β-D-
Literatur:
[1]
[2]
[3]
Vorschrift für Kurspraktikum „Enzymatische Untersuchungsmethoden“ (2007)
Belitz,Grosch,Schieberle: Lehrbuch der Lebensmittelchemie , 5.Auflage, Springer
www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/I9274
Prinzip:
Die Invertase spaltet Saccharose in Abhängigkeit vom pH-Wert mit unterschiedlicher
Geschwindigkeit in Glucose und Fructose. Die Enzymwirkung kann über die Bildung der
reduzierenden Zucker mit 3,5-Dinitrosalicylsäure-Reagenz (DSS) erfasst werden.
Der Verlauf der pH-Aktivitätskurve entspricht formal der Dissoziationskurve eines
Ampholyten (Resultierend aus der Dissoziationskurven der kationischen und anionischen
Gruppen des Enzymproteins). Das Optimum ist umso breiter, je größer die Differenz der pk –
Werte für die Gruppen ist. Seine Lage hängt sowohl von der Zusammensetzung des
Enzymproteins als auch von dem Ionenmilieu des Puffers ab, in dem die Untersuchung
durchgeführt wird. [1]
Chemikalien:
Citrat-Phosphat-Puffer: 0,1M nach McILVAIN (chemische Tafel zur Herstellung im Anhang)
Saccharose
Invertase-Lösung
bidestilliertes Wasser
Geräte:
Digital pH Meter (pH 525)
Photometer 1 (SPEKOLL 11)
Reagenzgläser
Pipetten
Durchführung: nach [1]
1
1. Invertaseverdünnung bestimmen
Durch einen Vorversuch ist diejenige Enzymkonzentration zu ermitteln, die bei pH 5,0 einen
Extinktion von ca. 1,0 ergibt. Die Verdünnungen der Invertase wurden mit bidestilliertem
Wasser durchgeführt.
Blindwert:
pH – Wert:
0,004
5,00
Verdünnung
1:2
1:5
1:8
1:11
1:14
1:17
Extinktion
1,54
1,293
0,851
0,761
0,511
0,430
Für den Hauptversuch wurde die Verdünnung der Invertase von 1:5 verwendet.
2. Hauptversuch (Bestimmung des pH – Optimums)
Messwerte:
pH - Wert
3
4
4,3
4,6
5
6
7
8
Einwage [g]
Saccharose
2,010
2,015
2,004
2,006
2,001
2,001
2,005
2,017
Inkubationszeit
[min]
30
31
30
31
29
31
32
32
Extinktion
(Blindwert)
0,067
0,009
0,013
0,000
0,004
0,018
0,032
0,005
Extinktion
(Probe)
1,058
1,180
1,190
1,293
1,019
0,419
0,016
Extinktion
(Differenz)
1,049
1,167
1,190
1,289
1,001
0,387
0,011
Vor der Bestimmung der Extinktionswerte wurden die Proben für 10 min in ein siedendes
Wasserbad gestellt, anschließend abgekühlt und mit 8 ml bidestilliertem Wasser verdünnt.
Während des Abkühlens ging die Probe mit dem pH – Wert 3 verloren. Am Photometer
wurde bei einer Wellenlänge von 510 nm gemessen.
Graphisch:
2
Extinktion
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
pH - Wert
Extinktion
Berechnung des pH – Optimums aus der polynomischen Ausgleichsfunktion:
f ( x)= − 0, 1111⋅ x 2+1, 0323⋅ x− 1, 2226
f ' ( x )= − 0, 2222⋅ x +1, 0323
f ' ( x )= 0= − 0, 2222⋅ x +1, 0323
− 1, 0323
x Maximum=
= 4, 65
− 0, 2222
Das berechnete pH – Optimum der Invertase – Lösung in dem Citrat – Phosphat – Puffer liegt
bei pH = 4,7.
Funktion:
1.Ableitung:
Maximum:
Ermittlung der gebildeten Invertzuckermenge aus der Kalibriergeraden:
Die verwendete Kalibriergerade lag im Praktikumssaal aus und wurde mit einer definierten
Menge Glucose überprüft.
definierte Konzentration: 400µg/ml (Glucose – Lösung)
Probe berechneter Wert gemessener Wert Differenz
0,644
0,553
0,091
I
0,644
0,570
0,074
II
3
7
100
200
300
400
500
600
700
Glucose [µg/ml]
Berechnung der Aktivität
pH – Wert Invertzuckermenge Invertzuckermenge Aktivität
[µg/ml]
[µMol]
[µMol/min]
4
312,47
9,137
0,295
4,3
345,25
10,095
0,337
4,6
351,64
10,282
0,332
5
379,14
11,086
0,382
6
299,14
8,747
0,282
7
128,58
3,760
0,118
8
24,14
0,706
0,022
verwendete Gleichungen:
Extinktion+0,0759
[µg/ml] (aus Kalibriergerade)
0,0018
Invertzuckermenge [μg/ml ]⋅ 10ml
Invertzuckermenge=
[µMol] (Verdünnung berücksichtigt)
M Glucose
Invertzuckermenge [μMol ]
Aktivität=
[µMol/min]
Inkubationszeit [min ]⋅ 2
Invertzuckermenge=
4
800
Aktivität [µMol/min]
0,30
Auftragung
der Aktivität gegen den pH – Wert
0,20
0,10
0,00
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
pH-Wert
Daten
Maximum der quadratischen Funktion bei 4,7  pH – Optimum bei pH=4,7
Auswertung:
Die β – D – Fructofuranosidase oder Invertase findet in der Lebensmitteltechnologie eine
breite Anwendung. Das Enzym ist vor allem in Süßwaren (Pralinen, Marzipan, „Kunsthonig“)
zu finden. Der Invertzucker ist löslicher und besitzt auf Grund des höheren Gehaltes an freier
Fructose eine etwas höhere Süßkraft. Für technologische und analytische Prozesse wird die
Invertase aus verschiedenen Mikroorganismen wie Aspergillus niger, Saccharomyces
carlsbergensis oder S. cerevisiae gewonnen. [2] Die Herstellerinformation der Firma Sigma –
Aldrich für die Invertase SIGMA I9274 (~300units/mg) besagt, das 1u des Enzyms 1µMol
Saccharose zu Glucose und Fructose in einer Minute hydrolysiert, bei einem pH – Wert von
4,6 und einer Temperatur von 25°C. [3]
Der in dem Versuch bestimmte pH – Wert liegt im optimalen Arbeitsbereich der Invertase.
Die berechnete Aktivität des Enzyms ist jedoch zu niedrig, im Praktikumsversuch wurde eine
maximale Aktivität von 0,38 µMol/min erreicht. Zum Vergleich der Hersteller Sigma –
Aldrich gibt eine Aktivität von 1 µMol/min an. [3]
Fehlerbetrachtung:
Im Versuch wurde versehentlich die falsche Verdünnung der Invertase für den Hauptversuch
verwendet. Die resultierenden Extinktionswerte waren größer als 1 und können somit nicht als
fehlerfrei angesehen werden, da das Gesetz von Lambert – Beer nicht mehr uneingeschränkt
gilt. Die Überprüfung der Kalibriergerade zeigte eine relativ große Abweichung zwischen
berechnetem und gemessenem Wert, sie wurde jedoch trotzdem zur Berechnung der
Invertzuckermenge und Aktivität herangezogen. Weiterhin können schon kleine
Verunreinigungen in den verwendeten Lösungen das Messergebnis signifikant verändern, da
sehr kleine Probenvolumina verwendet wurden.
5
7,5
8,0
Anhang:
Citronensäure – Phosphat – Puffer nach McILVAIN
Citronensäurelösung:
Phosphatlösung:
21,008g Citronensäure (C6H6O7∙H2O) auf 1000ml Wasser
35,62g Dinatriumphosphat (Na2HPO4∙H2O) auf 1000ml Wasser
pH – Wert bei 18°C Citronensäurelösung [ml] Phosphatlösung [ml]
3,0
79,45
20,55
4,0
61,45
38,55
4,6
53,25
46,75
5,0
48,50
51,50
6,0
36,85
63,15
7,0
17,65
82,35
8,0
2,75
97,25
Signum
Dresden, den
6