Funktionale Charakterisierung des Rca1

Funktionale Charakterisierung des Rca1Proteins in Drosophila melanogaster
Diplomarbeit im Fachbereich Biologie
an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen-Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Norman Zielke
aus Bonn
Köln, im September 2002
Für meinen Opa
Danksagung
Ich danke Herrn PD. Dr. Frank Sprenger für die Möglichkeit dieses Thema in seinem Labor
zu bearbeiten. Ihm möchte ich vor allem für seine Hilfsbereitschaft und seine Anregungen
danken.
Besonderer Dank gilt Heidi und Axel ohne deren Hilfe diese Arbeit nicht möglich gewesen
wäre.
Bei Ruth möchte ich mich für das überlassene Material und ihre Ratschläge zu Beginn dieser
Arbeit bedanken.
Chris möchte ich für die Anregungen und Korrekturen beim Schreiben danken.
Besonders möchte ich mich bei Ulli bedanken, der bei Computer-Abstürzen und ähnlichen
Katastrophen Erste-Hilfe geleistet hat.
Außerdem möchte ich mich bei allen Leuten auf der 5. Etage für das angenehme Arbeitsklima
bedanken.
Inhalt
1 Einleitung ......................................................................... 4
1.1
Der Zellzyklus im Verlauf der Embryogenese von Drosophila ..........................5
1.2
Regulation des Zellzyklus .....................................................................................7
1.2.1
Eintritt in die Mitose........................................................................................7
1.2.2
Austritt aus der Mitose ....................................................................................8
1.2.3
Regulation des G1-S-Übergangs....................................................................10
1.3
Die Funktion des Zellzyklus-Regulator Rca1.....................................................12
1.4
Ziele dieser Arbeit ...............................................................................................16
2 Ergebnisse ...................................................................... 17
2.1
Verwendete Rca1-Konstrukte ............................................................................17
2.2
Herstellung von stabilen UAS-Rca1-Linien .....................................................18
2.3
Bestimmung der Stabilität der Rca1-Deletionskonstrukte................................19
2.3.1
Stabilität von HA-rca1; ∆133.........................................................................21
2.3.2
Stabilität von HA-rca1; ∆203.........................................................................22
2.3.3
Stabilität von HA-rca1; ∆F-Box.....................................................................23
2.3.4
Stabilität von HA-rca1; ∆255.........................................................................24
2.4
Untersuchung der subzellulären Lokalisierung der Rca1-Konstrukte ............26
2.4.1
Lokalisierung von HA-rca1; ∆133 .................................................................27
2.4.2
Lokalisierung von HA-rca1; ∆203 .................................................................28
2.4.3
Lokalisierung von HA-rca1; ∆255 .................................................................29
2.4.4
Lokalisierung von HA-rca1; ∆F-Box .............................................................30
2.5
Überexpression der Rca1-Kostrukte im Drosophila Auge.................................31
2.6
Rettung des rca1-Phänotyps ...............................................................................34
2.6.1
Überexpression von HA-rca1; C351S im rca1-mutanten Hintergrund............34
2.6.2
Überexpression von HA-rca1; ∆203 im rca1-mutanten Hintergrund ..............35
3 Diskussion ...................................................................... 36
3.1
Abbau von Rca1 ..................................................................................................36
3.2
Subzelluläre Lokalisierung von Rca1.................................................................39
3.3
Funktionale Charakterisierung der Rca1-Deletionskonstrukte........................41
4 Zusammenfassung ......................................................... 43
5 Material und Methoden ................................................ 44
5.1
Material ...............................................................................................................44
5.1.1
Chemikalien ..................................................................................................44
5.1.2
Spezielle Chemikalien und Reaktionssets ......................................................44
5.1.3
Puffer; Lösungen; Medien .............................................................................44
5.1.4
Antikörper.....................................................................................................46
5.1.5
Oligonukleotide.............................................................................................46
5.1.6
Plasmide........................................................................................................47
5.1.7
Vektoren .......................................................................................................48
5.1.8
Bakterienstämme...........................................................................................48
5.1.9
Fliegenstämme ..............................................................................................49
5.1.10
Geräte............................................................................................................49
5.2
Molekularbiologische Methoden ........................................................................51
5.2.1
Herstellung von elektrokompetenten Zellen...................................................51
5.2.2
Transformation durch Elektroporation ...........................................................51
5.2.3
DNA-Preperation im Mini-Maßstab ..............................................................51
5.2.4
DNA-Preperation im Midi-Maßstab ..............................................................52
5.2.5
Quantifizierung von DNA und RNA..............................................................52
5.2.6
Restriktionsverdaue .......................................................................................52
5.2.7
Klenow-„fill in“-Reaktion .............................................................................53
5.2.8
Dephosphorylierung von Vektorenden...........................................................53
5.2.9
Agarosegelektrophorese ................................................................................53
5.2.10
Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ......................................53
5.2.11
Ligation von DNA-Fragmenten .....................................................................54
5.2.12
Sequenzierung ...............................................................................................54
5.2.13
In vitro Transkription ....................................................................................55
5.2.14
Gezielte Mutagenese .....................................................................................55
5.3
Drosophila-Methoden .........................................................................................55
5.3.1
Fliegenhaltung...............................................................................................55
5.3.2
Sammeln von Embryonen..............................................................................55
5.3.3
Dechorionierung von Drosophila-Embryonen ...............................................56
5.3.4
Fixierung von Embryonen .............................................................................56
5.3.5
Antikörper-Färbungen ...................................................................................56
5.3.6
Propidiumiodid-Färbungen ............................................................................57
5.3.7
RNA-Injektion ..............................................................................................57
5.3.8
Hestellung transgener Fliegen........................................................................58
5.3.9
Das UAS/Gal4-System ..................................................................................59
6 Abkürzungen ................................................................. 60
7 Literatur ......................................................................... 61
Einleitung
1 Einleitung
Alle lebenden Organismen bestehen aus Zellen, die sich durch Zellwachstum und Zellteilung
vermehren. Die Teilung bereits existierender Zellen stellt die einzige Möglichkeit dar, Zellen
zu vermehren. Damit ist die Fähigkeit zur Zellteilung eine grundlegende Voraussetzung für
den Fortbestand des Lebens. Aus der Zellteilung einzelliger Lebewesen gehen jeweils zwei
neue Organismen hervor. Bei Vielzellern sind hingegen viele Zellteilungszyklen notwendig,
damit aus einer befruchteten Eizelle ein neues Individuum entstehen kann. Da sich Zellteilung
und Differenzierung ausschließen, müssen die Zellteilungen während der Entwicklung eines
Organismus im hohem Maße reguliert sein. Zellteilungen beschränken sich bei vielzelligen
Organismen jedoch nicht ausschließlich auf die Entwicklung. Im Verlauf des Lebens eines
Vielzellers müssen ständig abgestorbene Zellen durch Zellteilungen ersetzt werden.
Störungen in der Regulation des Zellzyklus können sowohl im Verlauf der Entwicklung als
auch im erwachsenen Organismus zu schwerwiegenden Schäden führen.
Die Teilung einer Zelle erfordert zwei grundlegende Prozesse. Zunächst muß eine
Verdopplung der Chromosomen erfolgen, die dann im eigentlichen Teilungsvorgang auf die
beiden Tochterzellen verteilt werden. Da diese beiden Prozesse in einer geordneten
Reihenfolge ablaufen, werden beide Vorgänge als
Zellzyklus zusammengefaßt. Der
eukaryotische Standard-Zellzyklus wird in vier Phasen unterteilt, die man als M, G1, S und
G2 bezeichnet. Den Zeitraum zwischen zwei M-Phasen faßt man als Interphase zusammen.
Den ersten Abschnitt der Interphase bezeichnet man als G1-Phase. In dieser Phase nimmt die
Zelle aufgrund eines verstärkten Metabolismus erheblich an Masse zu. In der darauffolgenden
S-Phase erfolgt die Replikation der DNA, wodurch zwei Schwesterchromatiden gebildet
werden. Den Zeitraum zwischen S-Phase und Mitose bezeichnet man als G2-Phase. Auch hier
nimmt die Zelle weiter an Masse zu. Die Aufteilung der Schwesterchromatiden auf die
beiden Tochterzellen erfolgt in der Mitose. In der darauffolgenden Zytokinese teilt sich dann
die Zelle in zwei Hälften.
Anhand der DNA-Morphologie wurde die Mitose in fünf Phasen unterteilt. Die erste Phase
der Mitose wird als Prophase bezeichnet. In ihr beginnt sich die DNA zu kondensieren. Mit
der darauffolgenden Auflösung der Kernmembran wird die Prometaphase eingeleitet. Die
Metaphase zeichnet sich dadurch aus, daß die Chromosomen in der Mitte der Zelle in der
4
Einleitung
sogenannten
Metaphaseplatte
angeordnet
sind.
Nach
der
Aufteilung
der
Schwesterchromatiden in der Anaphase bildet sich um jeden Chromatidensatz eine neue
Kernmembran. Die Ausbildung der neuen Kernmembran markiert den Beginn der Telophase,
in der sich die DNA wieder dekondensiert.
In der Interphase liegt die DNA in vollständig
dekondensierter Form vor.
Abb. 1 Schematische Darstellung des eukaryotischen
Standard-Zellzyklus (Darnell 1996). Der eukaryotischen
Standard-Zellzyklus besteht aus vier Phasen. In der S-Phase
wird die DNA durch Replikation verdoppelt, und dann in der
M-Phase auf die beiden Tochterzellen verteilt. S- und MPhase werden durch die beiden Gap-Phasen (G1 und G2)
unterbrochen. (gap = engl. Lücke)
1.1 Der Zellzyklus im Verlauf der Embryogenese von Drosophila
Zellzyklen bestehen nicht grundsätzlich aus G1, S, G2 und M-Phase, sondern werden an die
jeweilige Situation angepaßt. Ein sehr gutes Beispiel für die Variabilität von Zellzyklen ist die
Embryonalentwickwicklung von Drosophila. Im Verlauf der Embryogenese von Drosophila
verändert sich die Zusammensetzung der Zellzyklen mehrfach, so daß man insgesamt drei
verschiedene Typen von Zellzyklen findet.
Nach der Befruchtung durchlaufen die Kerne der synzytialen Eizelle eine Folge von zehn
synchronen Kernteilungen. Diese Zellzyklen dauern weniger als zehn Minuten und bestehen
nur aus M- und S-Phasen. Zu Beginn der Teilungen befinden sich die Kerne im Inneren des
Synzytiums. Gegen Ende des siebten Zellzyklus wandern etwa dreiviertel der Kerne zur
5
Einleitung
Oberfläche des Eies, während sich die zurückgebliebenen Kerne zu Dotterkernen entwickeln.
Diese Dotterkerne stellen im Verlauf des zehnten Zellzyklus ihre Teilungsaktivität ein und
durchlaufen eine Reihe von Endozyklen. In diesen Endozyklen kommt es zur Replikation der
DNA, jedoch finden keinen Mitosen statt, so daß der DNA-Gehalt der Zellen zunimmt (Edgar
und Orr-Weaver 2001). Während des neunten Zyklus erreichen die ersten der wandernden
Kerne den posterioren Pol des Eies. Im Verlauf des zehnten Zellzyklus beginnen diese Kerne
zu zellularisieren, wodurch sie die Synchronität mit dem Rest der Zellen verlieren. Bei diesen
Zellen handelt es sich um die sogenannten Polzellen, aus denen sich später die
Geschlechtszellen entwickeln. Der Rest der wandernden Kerne erreicht zu Beginn des
zehnten Zellzyklus die Oberfläche. Dort durchlaufen die Kerne
vier weitere mitotische
Teilungen. Diese Mitosen beginnen in der Nähe der Pole und breiten sich von dort wellenartig
aus. Diese Zyklen bestehen ebenfalls nur aus M- und S-Phasen, sind jedoch nicht ganz so
schnell wie die ersten zehn.
Während des 14. Zellzyklus beginnen die Blastodermzellen zu zellularisieren, wodurch das
Zelluläreblastoderm entsteht. Direkt nach der Zellularisierung erfolgt die Gastrulation. Mit
Beginn der Gastrulation verlieren die Zyklen ihre Synchronität. Die nächsten drei Zellzyklen
(14-16) verlaufen in einem räumlich und zeitlich definierten Muster aus 25 mitotischen
Domänen (Foe 1989). Die ersten
13 Zyklen werden ausschließlich von maternalen
Komponenten reguliert. Während der Interphase des 14. Zyklus wird die Zellzykluskontrolle
jedoch von maternalen Komponenten auf zygotische Komponenten umgestellt. Dies hat zur
Folge, daß die Zellen in den Zyklen 14-16 zusätzlich eine G2-Phase durchlaufen, wodurch die
Zellteilungsgeschwindigkeit abnimmt (Edgar et al. 1994).
Nach der Mitose des 16. Zellzyklus treten die meisten embryonalen Zellen in eine verlängerte
G1-Phase ein (Edgar und O'Farrell 1990). Nur bestimmte Zelltypen, wie die Zellen des sich
entwickelnden Nervensystems, teilen sich weiter. Im weiteren Verlauf der Embryogenese
durchlaufen die Zellen in verschiedenen Geweben wie dem Darm oder den Speicheldrüsen
eine Reihe von Endozyklen. Bis zum Ende der Embryogenese finden keine weiteren
Zellteilungen mehr statt.
6
Einleitung
1.2 Regulation des Zellzyklus
Durch
genetische
Analysen
Schizosaccharomyces pombé
in
den
Hefen
Saccharomyces
cerevisiae
und
wurden eine Reihe von Zellzyklusmutanten identifiziert
(Hartwell et al. 1974; Nurse 1975). Diese Arbeiten führten letztendlich zur Identifiktation der
cyclin-abhängigen Protein-Kinasen (Cdk). Die regulatorischen Untereinheiten der Cdks die
sogenannten Cycline wurden ursprünglich
bei biochemischen Untersuchungen an
Seeigeleiern entdeckt (Evans et al. 1983). Diese frühen Studien führten zu dem
grundlegenden Konzept der Zellzyklus- Regulation. Verschiedene Cdks interagieren in
bestimmten Phasen des Zellzyklus mit unterschiedlichen Cyclinen, wodurch eine Reihe von
nachgeschalteten Prozessen aktiviert werden (Nurse 2000; Nasmyth 2001). Dieses Konzept ist
in allen Eukaryonten verwirklicht. Das Inventar an Cyclinen und Cdks ist unter den
Vielzellern hoch konserviert, es unterscheidet sich jedoch stark von dem der Hefen. In
Drosophila wurden die mitotischen Cycline A, B und B3, sowie die G1-Cycline D und E
identifiziert. Weiterhin wurden in Drosophila
Homologe von Cdk1, Cdk2, und Cdk4/6
gefunden (Edgar und Lehner 1996).
1.2.1 Eintritt in die Mitose
In Drosophila wird der Eintritt in die Mitose von Cdk1 und den drei mitotischen Cyclinen,
CyclinA, CyclinB und CyclinB3 reguliert. Die Funktionen der mitotischen Cycline
überlappen zum Teil. Einzig CyclinA scheint für den Zellzyklus essentiell zu sein, da nur
CyclinA-Mutanten einen letalen Phänotyp haben (Lehner und O'Farrell 1989).
Die
mitotischen Cycline werden im Verlauf der S- und der G2-Phase synthetisiert und binden an
Cdk1. Für den G2-M-Übergang ist die Bindung der Cycline alleine jedoch nicht ausreichend.
Die Aktivität des Cdk/Cyclin-Komplexes ist außerdem von dem Phosphorylierungszustand an
den beiden Threonin-Resten 14 und 161, sowie dem Tyrosin-Rest 15 abhängig. Die
Phosphorylierung von Threonin 161 führt zur Aktivierung des Cdk/Cyclin-Komplexes,
während Phosphorylierung an Threonin 14 und Tyrosin 15 eine Inaktivierung zur Folge
haben. Der Phosphorylierungszustand an diesen Resten wird durch zwei antagonistische
Enzyme reguliert. Die inhibitorische Phosphorylierung wird von den zum Teil redundanten
Kinasen
Wee
und
Myt1
katalysiert.
Im
Gegenzug
können
die
inhibitorischen
Phosphorylierungen durch die Phosphatase Cdc25 aufgehoben werden (Morgan 1997).
Drosophila besitzt zwei Homologe von Cdc25, nämlich string und twine. String wird
7
Einleitung
während der Embryogenese ab dem 14. Zellzyklus in einem räumlich und zeitlich definierten
Muster exprimiert, wodurch es zur Ausbildung der mitotischen Domänen kommt (Edgar et al.
1994). Die Aktivität von twine ist auf die Meiose begrenzt.
1.2.2 Austritt aus der Mitose
Für den Austritt aus der Mitose werden die mitotischen Cycline durch ubiquitinabhängige
Proteolyse abgebaut (Glotzer et al. 1991). Es konnte gezeigt werden, daß die mitotischen
Cycline ein Proteinmotiv enthalten, das für den ubiquitinabhängigen Abbau erforderlich ist.
Dieses Proteinmotiv wird als „destruction box“ bezeichnet. Die Deletion der „destruction
box“ resultiert in einem stabilen Cyclin, was letztendlich zu einem Arrest des Zellzyklus
führt.
Der Zeitpunkt des Arrest korreliert mit dem Abbau der mitotischen Cycline. Der
Abbau von CyclinA erfolgt in der Metaphase, während CyclinB erst beim Übergang in die
Anaphase abgebaut wird. Die Überexpression von stabilen CyclinA führt zu einem
Metaphase-Arrest. Bei der Überexpression von stabilem CyclinB kommt der Zellzyklus
hingegen erst in der frühen Anaphase zum Stillstand. Die Stabilisierung des zuletzt
abgebauten CyclinB3 hat einen Arrest während der späten Anaphase zur Folge (Sigrist et al.
1995)
Abb. 2 Regulation des “anaphase promoting complex” (APC). Der Cdk1/Cyclin-Komplex wird durch
die Phosphatase Cdc25 aktiviert. Der aktive Cdk1/Cyclin-Komplex phosphoryliert unter anderem den
APC. Die phosphorylierte Form des APC wird durch Cdc20fzy aktiviert, was zum Abbau der mitotischen
Cycline und der Inaktivierung von Cdk1 führt. In der späten Mitose und G1 wird die Aktivität des APC
durch Cdh1fzr aufrecht erhalten.
8
Einleitung
Der Abbau der mitotischen Cycline durch daß 26S-Proteasom erfordert die Ubiquitinilierung
der Cycline. Die Ubiquitinilierung von Substraten des 26S-Proteasom wird von einer Kaskade
von drei Enzymen vermittelt. Das erste Enzym dieser Kaskade ist das sogenannte E1- oder
Ubiquitin aktivierende Enzym. Zur Aktivierung des Ubiquitins bildet das E1-Enzym mit
einem Glycin-Rest des Ubiquitins eine energiereiche Thiolbindung. Das aktivierte Ubiquitin
wird dann an eines von mehreren E2- oder Ubiquitin konjugierenden Enzymen angehängt.
Von dem E2-Enzym wird das Ubiquitin dann durch ein E3-Enzym oder Ubiquitin-Ligase auf
einen Lysin-Rest
des Substratmoleküls übertragen (Zachariae und Nasmyth 1999). Die
Ubiquitin-Ligase die den Abbau der mitotischen Cycline vermittelt, bezeichnet man als
„anaphase promoting complex“ (APC).
Der APC ist ein hochmolekularer Komplex der mindestens aus elf Untereinheiten besteht. Die
Aktivität des APC ist abhängig von den beiden WD40-Proteinen Cdc20 und Cdh1. In
Drosophila werden diese Proteine von den Genen fizzy (fzy) und fizzy-related (fzr) kodiert.
Der Verlust des fizzy-Genes führt zu einem Metaphase-Arrest (Dawson et al. 1995). Es
konnte gezeigt werden, daß dieser Arrest darauf zurückzuführen ist, daß die mitotischen
Cycline in fizzy-mutanten stabil sind (Sigrist et al. 1995). Mutationen in fizzy-related
resultieren in einer zusätzlichen Mitose in den epidermalen Zellen, außerdem kommt es zu
einer Inhibition der Endozyklen in den Speicheldrüsen (Sigrist und Lehner 1997)
Der APC-Cdc20fzy-Komplex vermittelt den Abbau der mitotischen Cycline während der
Mitose. Die Aktivierung des APC durch Cdc20fzy ist abhängig von der Phosphorylierung
durch den Cyclin/Cdk1-Komplex. Cdc20fzy kann ausschließlich an den phosphorylierten APC
binden, was dazu führt, daß die Aktivität des APC-Cdc20fzy-Komplex auf die Mitose begrenzt
ist (Kramer et al. 2000). Die Aktivität des APC-Cdh1fzr-Komplex ist hingegegen auf die späte
Mitose und die G1-Phase begrenzt. In diesem Fall ist ausschließlich die unphosphorylierte
Form von Cdh1fzr in der Lage den APC zu aktivieren, so daß der APC-Cdh1fzr-Komplex nur in
Phasen mit niedriger Cdk-Aktivität aktiv ist (Kramer et al. 2000). Während die Substrate des
APC-Cdc20fzy-Komplex durch eine „destruction box“ gekennzeichnet sind, findet man in den
Substraten des APC-Cdh1fzr-Komplex häufig eine sogenannte KEN-Box (Glotzer et al. 1991;
Pfleger und Kirschner 2000). Eine Funktion der
beiden WD40-Proteine könnte in der
Substraterkennung und der anschließenden Präsentation der Substrate für das E2-Enzym
liegen.
9
Einleitung
Der APC-Cdc20fzy-Komplex vermittelt neben dem Abbau der mitotischen Cycline auch die
Trennung der Schwesterchromatiden. Nach der Replikation der DNA werden die beiden
Schwesterchromatiden durch den Cohesin-Komplex zusammengehalten. Beim Übergang von
der Metaphase in die Anaphase muß diese Verbindung zwischen den Schwesterchromatiden
getrennt werden. Dieser Vorgang wird durch eine Cystein-Protease vermittelt, die als
Separase bezeichnet wird. Um eine vorzeitige Trennung der Schwesterchromatiden zu
verhindern, wird die Separase durch den Inhibitor-Securin inaktiviert. Securin, oder pimples
in Drosophila, ist ein Substrat des APC-Cdc20fzy-Komplex, wodurch sichergestellt wird, daß
die Separase nur während des Metaphase-Anaphase-Übergangs aktiv ist (Zachariae und
Nasmyth 1999; Cohen-Fix 2001).
Der APC-Cdc20fzy-Komplex ist außerdem am sogenannten „spindle checkpoint“ beteiligt.
Durch diesen Kontrollpunkt wird sichergestellt, daß alle Chromosomen am Ende der
Metaphase ordnungsgemäß mit dem Spindelapparat verbunden sind. Der Übergang von der
Metaphase in die Anaphase erfolgt nur dann, wenn alle Kinetochoren mit dem Spindelapparat
assoziiert sind. Ist dies nicht der Fall, wird der APC-Cdc20fzy-Inhibitor Mad2 durch die freien
Kinetochoren aktiviert. Dies führt dazu, daß die Substrate des APC-Cdc20fzy-Komplex nicht
abgebaut werden, was letztendlich in einem Metaphase-Arrest resultiert (Shah und Cleveland
2000)
1.2.3 Regulation des G1-S-Übergangs
In Säugetieren wird der Übergang von der G1-Phase in die S-Phase durch zwei Typen von
Cdk´s vermittelt. Cdk4 und Cdk6 interagieren mit CyclinD, während Cdk2 durch CyclinE
aktiviert wird. Das wichtigste Substrat des Cdk/CyclinD-Komplex ist das RetinoblastomaProtein (pRB). In seiner hypophosphorylierten Form agiert
pRB als ein Inhibitor des
Transkriktionfaktors E2F. Die Phosphorylierung von pRB durch den Cdk/CyclinD-Komplex
führt zur Freilassung von E2F, wodurch verschiedene für die DNA-Replikation notwendige
Gene, wie zum Beispiel CyclinE, aktiviert werden. In Drosophila ist der G1-S-Übergang
hauptsächlich von CyclinE abhängig, daß unter der Kontrolle des Entwicklungsprogramm
steht.
Nach dem G1-S Übergang kommt es zur Autophosphorylierung von CyclinE, wodurch dieses
für den ubquitinabhängigen Abbau markiert wird. Der Abbau von CyclinE führt dazu, daß die
Aktivität von Cdk2 abnimmt und daß Cdk2 bis zur nächsten G1-Phase inaktiv bleibt. In
10
Einleitung
diesem Fall wird der Cyclin-Abbau jedoch nicht durch den APC vermittelt, sondern durch ein
weiteres E3-Enzym das man als SCF-Komplex bezeichnet.
Der SCF-Komplex besteht aus drei Kern-Untereinheiten Skp1, einem Cullin und einem FBox-Protein. Neben diesen drei Komponenten, von denen sich der Name ableitet, enthält der
SCF-Komplex noch das Ringfingerprotein Rbx1/Roc1 und ein E2-Enzym (Zachariae und
Nasmyth 1999; Jackson et al. 2000). Das F-Box-Protein fungiert als SubstraterkennungsUntereinheit. In vielen Fällen, jedoch nicht immer, ist die Bindung des F-Box-Proteins an das
Substrat phosphorylierungs-abhängig. Alle Mitglieder der F-Box-Familie enthalten ein
konserviertes Proteinmotiv, das zuerst in CyclinF gefunden wurde und daher als F-Box
bezeichnet wird (Bai et al. 1996). Neben der F-Box findet man in F-Box-Proteinen häufig
„WD40-repeats“, „zinc finger“ und andere an Protein-Protein-Interaktionen beteiligte
Proteinmotive (Das et al. 2002). Das F-Box-Motiv wird spezifisch von Skp1 gebunden
(Schulman et al. 2000; Zheng et al. 2002). Die Funktion von Skp1 liegt wahrscheinlich darin,
das an die F-Box gebundende Substratmolekül mit dem Kernkomplex aus Cullin, Rbx1/Roc1
und dem E2-Enzym zu verbinden. Die Struktur dieses Kernkomplexes wird durch das
Gerüst-(scaffold)-Protein Cullin stabilisiert. Die Aktivität des SCF-Komplex ist nicht auf den
Zellzyklus beschränkt. Durch den SCF-Komplex werden unter anderem die ubiquitinabhängige Proteolyse von armadillo und cactus, den Drophila-Homologen von ß-Catenin und
Iκß vermittelt (Jiang und Struhl 1998; Spencer et al. 1999)
Die Aktivität des Cdk2/CyclinE-Komplex ist in Drosophila und in Säugetieren für den G1-S
Übergang essentiell. Es konnte jedoch gezeigt werden, daß der Cdk2/CyclinA-Komplex
ebenfalls dazu in der Lage ist, die S-Phase einzuleiten (Sprenger, et al. 1997). Normalerweise
wird die Aktivität des Cdk1/CyclinA-Komplex jedoch durch drei verschiedene Mechanismen
unterdrückt. Erstens wird Cyclin A während der G1-Phase durch den APC-Cdh1fzr-Komplex
abgebaut. Zweitens wird die Aktivität des Cdk1/CyclinA-Komplex durch inhibitorische
Phosphorylierung an Threonin 14 und Tyrosin 15 verringert. Drittens wird der Cdk1/CyclinAKomplex durch den cyclin-dependent kinase inhbitor (CKI) roughex (rux) gebremst
(Sprenger et al. 1997; Foley et al. 1999).
11
Einleitung
1.3 Die Funktion des Zellzyklus-Regulator Rca1
Das rca1-Gen (regulator of cyclin A 1) wurde in einem Screen für dominante Suppressoren
des roughex-Augenphänotyps identifiziert (Dong et al. 1997). Roughex ist ein CKI der
spezifisch die Aktivität des Cdk1/CyclinA-Komplex inhibiert. Roughex-Mutanten besitzen
einen rauhen Augenphänotyp, der durch einen Defekt während der Augenentwicklung
hervorgerufen wird. Während der Musterbildung in der Augenimaginalscheibe werden die
Zellen innerhalb der morphogenetischen Furche in der G1-Phase synchronisiert. Ein Teil
dieser Zellen differenziert sich zu Neuronen, während die restlichen eine weitere Zellteilung
durchlaufen. In roughex-Mutanten kann der Cdk1/CyclinA-Komplex nicht mehr inhibiert
werden, was zu ektopischen S-Phasen und letztendlich zu dem rauhen Augenphänotyp führt.
Der rauhe Augenphänotyp kann durch eine Reduktion der Rca1 oder CyclinA Menge
aufgehoben werden. Hingegen führt die Überexpression von Rca1 oder CyclinA in
Augenimaginalscheiben, wie der Verlust von roughex, zu einem rauhen Augenphänotyp
(Dong et al. 1997). Diese Beobachtungen deuten daraufhin, daß Rca1 einen Einfluß auf die
Aktivität des Cdk1/CyclinA-Komplex hat.
Homozygote rca1-Mutanten arretieren in der G2-Phase von Zellzyklus 16, mit einem
ähnlichen Phänotyp wie CyclinA Mutanten (Lehner und O'Farrell 1989; Dong et al. 1997).
Der Verlust des rca1-Gens wirkt sich in einer Reduktion der Anzahl epidermaler Zellen im
Vergleich zu Wildtyp-Embryonen aus. Die DNA in diesen Zellen ist dekondensiert, wodurch
deutlich wird, daß es sich nicht um ein Arrest in der Mitose handelt (Dong et al. 1997). Der
Arrest in der G2-Phase von Zellzyklus 16 ist darauf zurückzuführen, daß in rca1-Mutanten
sowohl Cyclin A als auch Cyclin B vorzeitig abgebaut wird (Grosskortenhaus und Sprenger
2002).
Der Abbau der mitotischen Cycline wird durch den APC in Verbindung mit den beiden
Aktivatorproteinen Cdc20fzy und Cdh1fzr vermittelt.
gezeigt werden, daß rca1 und
Durch genetische Analysen konnte
fizzy-related miteinander interagieren. In fizzy-related-
Mutanten kommen die epidermalen Zellen nicht in der G1 Phase von Zellzyklus 17 zur Ruhe,
sondern durchlaufen eine weitere Zellteilung (Sigrist und Lehner 1997). Dieser Phänotyp ist
hauptsächlich darauf zurückzuführen, daß der CyclinA-Abbau während der G1-Phase nicht
aufrechterhalten werden kann (Sprenger et al. 1997). Im Gegensatz dazu führt die
Überexpression von fizzy-related zum vorzeitigen Abbau der mitotischen Cycline, was sich in
12
Einleitung
einem G2-Arrest in Zellzyklus 16 auswirkt (Sigrist und Lehner 1997). Rca1/fizzy-relatedDoppelmutanten besitzen eine ähnliche Zahl von Epidermiszellen wie vergleichbare WildtypEmbryonen, was bedeutet, daß fizzy-related epistatisch über rca1 ist. Die Überexpression von
Rca1 kann den Effekt der Überexpression von Fizzy-Related aufheben, wodurch bewiesen
wurde, daß Rca1 einen negativen Effekt auf Fizzy-Related ausübt. Außerdem konnte gezeigt
werden, daß Rca1 und Fizzy-Related nicht nur genetisch sondern auch biochemisch
miteinander interagieren (Grosskortenhaus und Sprenger 2002). Diese Daten belegen, daß die
Aktivität des APC-Cdh1fzr-Komplex in der G2-Phase von Zellzyklus 16 durch Rca1 inhibiert
wird.
Abb. 3 Schematische Darstellung der Rca1-Funktion . Die Aktivität des APC-Cdh1fzr-Komplex ist auf
Phasen mit niedriger Cdk-Aktivität begrenzt. Rca1 inhibiert den APC-Cdh1fzr-Komplex in der G2-Phase
und verhindert so den vorzeitigen Abbau der mitotischen Cycline. Auf welche Weise Rca1 in der späten
Mitose inaktiviert wird, ist noch unklar.
Da Cdh1fzr für die Etablierung der G1-Phase von
Zellzyklus 17 benötigt wird, ist es
erforderlich daß Rca1 zu diesem Zeitpunkt inaktiviert wird. Es konnte gezeigt werden, daß
Rca1 in der G1-Phase von Zellzyklus 17 abgebaut wird. Rca1 ist jedoch noch in einigen
Zellen vorhanden die bereits in der G1-Phase von Zellyklus 17 sind. Da auch in diesen Zellen
CyclinA abgebaut wird und nicht wie in fzr-Mutanten reakkumuliert, muß die inhibitorische
Wirkung von Rca1 auf eine andere Weise inaktiviert werden. Durch welchen Mechanismus
dies geschieht ist jedoch bisher unklar.
13
Einleitung
Rca1 besitzt Homologe in der Maus, dem Krallenfrosch (Xenopus laevis) und dem Menschen
(Reimann et al. 2001a). Die Vertebraten Homologe von Rca1 werden Emi1 (early mitotic
inhibitor 1) genannt. Rca1 und das Xenopus-Emi1 sind zu 18 Prozent identisch und besitzen
eine Ähnlichkeit von 27 Prozent (Abb. 4). Beide Proteine sind jedoch sehr ähnlich in ihrer
Größe und in der Anordnung ihrer funktionalen Domänen. Das Rca1-Protein besitzt 411
Aminosäuren, während Emi1 nur aus 393 Aminosäuren besteht. Beide Proteine enthalten in
ihrem
N-terminalen
Teil
eine
potentielle
F-Box.
F-Box-Proteine
fungieren
als
Substraterkennungs-Untereinheiten des SCF-Komplexes (Zachariae und Nasmyth 1999;
Jackson et al. 2000). Der N-Terminus von Rca1 enthält außerdem eine zweigeteilte
Kernlokalisierungssequenz. Im C-Terminalen Abschnitt beider Proteine befindet sich eine
sogenannte „zinc binding region“ (ZBR). Dieses Proteinmotiv ist häufig an Protein-Protein
Interaktionen beteiligt und zeichnet sich durch eine charakteristische Abfolge von CysteinResten aus. Zwischen der F-Box und der ZBR befinden sich noch zwei weitere konservierte
Strukturelemente. Einerseits eine Folge von drei Aminosäuren die man als KEN-Box
bezeichnet und in Substraten des APC-Cdh1Fzr-Komplex findet (Pfleger und Kirschner 2000).
Andererseits die Erkennungssequenz für
die Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3)
(persönliche Mitteilung Peter Jakson), welche eine wichtige Rolle beim Abbau von Iκß der
inhibitorischen Untereinheit des Transkriptionsfaktors NFκß spielt (Hattori et al. 1999;
Spencer et al. 1999). Rca1 enthält insgesamt zehn potentielle CDK-Phosphorylierungsstellen,
während in Emi1 nur fünf gefunden wurden.
Im Gegensatz zu Rca1 interagiert Emi1 sowohl mit Cdh1fzy als auch mit Cdc20fzr (Reimann
et al. 2001a; Reimann et al. 2001b). Es konnte gezeigt werden, daß Emi1 zu verschieden
Zeiten unterschiedliche Funktionen hat. Eine Funktion von Xenopus-Emi1 besteht darin den
APC-Cdc20fzy-Komplex in der frühen Mitose zu inhibieren (Reimann et al. 2001a). Weiterhin
scheint Emi1 eine wichtige Komponente des „Cytostatic Factor“ (CSF) zu sein, der
gewährleistet das die Eizelle so lange in der Meiose2 gehalten wird bis eine Befruchtung
erfolgt. Dieser Arrest beruht ebenfalls auf einer Inhibition des
APC-Cdc20fzy-Komplex
durch Emi1 (Reimann und Jakson 2002). Während des G1-S-Übergangs in humanen Zellen
agiert Emi1 außerdem als Inhibitor des APC-Cdh1fzr-Komplex (Hsu et al. 2002).
Emi1 blockiert die Substratbindungsstelle von Cdc20 und inhibiert so die Aktivität des APCCdc20fzy-Komplex. Prinzipiell wäre ein ähnlicher biochemischer Mechanismus auch für den
14
Einleitung
Effekt von Rca1 auf Fizzy-Related denkbar. Auf zellulärer Ebene ist jedoch zu beobachten,
daß Rca1 im Kern lokalisiert ist, während Fizzy-Related hauptsächlich zytoplasmatisch
lokalisiert ist. Da die Cycline in der Interphase 16 in ebenfalls im Zytoplasma zu finden sind,
stellt sich die Frage wie Rca1 trotz der räumlichen Trennung den Abbau Cycline durch FizzyRelated verhindern kann.
Abb. 4 Vergleich der Primärstruktur von Rca1 und Emi1 (Grosskortenhaus 2001). 18 Prozent
der Aminosäuren von Rca1 und Emi1 sind identisch (schwarze Kästen); bzw. zu 27 Prozent ähnlich
(graue und schwarze Kästen). Im N-terminalen Bereich von Rca1 befinden sich eine zweiteilige
Kernlokalisierungssequenz (blauer Kasten) und eine potentielle F-Box (gelber Kasten). In der Mitte
befinden sich eine KEN-Box (grüner Kasten) sowie eine GSK3-Phosphorylierungsstelle (rosa
Kasten). Im C-terminalen Abschnitt befindet sich die sogenannte „zinc binding region“ (ZBR) mit der
Konsensussequenz C(4X)C(14-30X)C(1-4X)C(1-4X) C(4X)C(2X)C(4X)H(4X)C. Die konservierten
Cystein-Reste sind durch die roten Kästen markiert. Die blauen Punkte kennzeichnen potentielle CdkPhosphorylierungsstellen.
15
Einleitung
1.4 Ziele dieser Arbeit
Rca1 enthält mehrere konservierte Strukturelemente. Ziel dieser Arbeit ist herauszufinden
welche Strukturelemente für die Funktion von Rca1 von Bedeutung sind. Es konnte gezeigt
werden, daß Rca1 im Zellkern lokalisiert ist (Grosskortenhaus 2001). Es ist jedoch unklar ob
die Kernlokalisierungssequenz oder eines der anderen Strukturelemente von Rca1 für die
nukleare Lokalisierung verantwortlich sind. Weiterhin sollen durch diese Arbeit Hinweise zur
die Funktion der Kernlokalisierung gesammelt werden. Außerdem soll untersucht werden
nach welchem Mechanismus Rca1 abgebaut wird und welche Proteinmotive dafür
erforderlich sind. Ein weiterer Punkt der im Rahmen dieser Arbeit geklärt werden soll ist, ob
die potentiellen CDK-Phosphorylierungsstellen bei der Inaktivierung von Rca1 eine Rolle
spielen.
16
Ergebnisse
2 Ergebnisse
Die Datenbankanalyse der Primärstruktur von Rca1 (Abb. 4) hat gezeigt, daß Rca1 mehrere
konservierte Strukturelemente enthält (Grosskortenhaus 2001). Um die Funktion dieser
Proteinmotive in vivo zu studieren, wurden zunächst mehrere Deletionskonstrukte von Rca1
hergestellt (Abb. 6), die dann in der Fruchtfliege (Drosophila melanogaster) exprimiert
wurden.
2.1 Verwendete Rca1-Konstrukte
Für Emi1, dem Vertebraten Homolog von Rca1, konnte in vitro gezeigt werden, daß der
Austausch eines der konservierten Cysteine der ZBR gegen Serin zu einem nicht funktionalen
Protein führt (Reimann et al. 2001a). Um die Bedeutung der ZBR in vivo zu untersuchen,
wurde ein Rca1-Konstrukt (HA-rca1; C351S) hergestellt, bei dem ebenfalls der zweite
Cystein-Rest der ZBR mutiert wurde (Abb. 5).
Abb. 5 Ausschnitt aus der „zinc binding region“ (ZBR) von Rca1 und
Emi1. Der Austausch von Cystein 346 gegen Serin führt zur Inaktivierung
von Emi1 (Reimann et al. 2001a). Für die in vivo Analyse der ZBR-Funktion,
wurde der homologe Cystein-Rest in Rca1 ebenfalls durch Serin ersetzt.
Zur Bestimmung der Funktion
der weiteren Strukturelemente, wurden
zunächst drei
verkürzte Rca1-Konstrukte hergestellt. HA-rca1; ∆133 fehlen die ersten 133 Aminiosäuren. In
diesem Bereich befindet sich die Kernlokalisierungssequenz und sechs mögliche CDKPhosphorylierungsstellen. Bei HA-rca1; ∆203 wurden die N-terminalen Reste bis zu Position
203 entfernt. Diesem Konstrukt fehlen dadurch die Kernlokalisierungssequenz und die F-Box,
sowie sieben potentielle CDK-Phosphorylierungsstellen. Die KEN-Box und die GSK3Phosphorylierungsstelle sind jedoch noch vorhanden. In HA-rca1; ∆255 wurden diese beiden
Strukturelemente auch noch deletiert. Außerdem wurde zur detaillierteren Untersuchung der
Funktion der F-Box das Konstrukt HA-rca1; ∆F-Box hergestellt, das in diesem Bereich eine
interne Deletion besitzt.
17
Ergebnisse
Abb. 6 Schematische Darstellung der verwendeten Deletionskonstrukte. Die Numerierung der Reste bezieht sich auf das offene Leseraster
von rca1.
Abkürzungen: HA = Hämagglutinin-Epitop; NLS = zweigeteilte
Kernlokalisierungssequenz; KEN = KEN-Box; DSGXXS = GSK3Phosphorylierungsstelle; ZBR = zinc binding region; * = potentielle CdkPhosphorylierungsstelle
Um die exprimierten Proteine in vivo mit Hilfe von Immunfluoreszenzfärbungen
nachzuweisen, wurden alle Konstrukte am N-Terminus mit dem Hämagglutinin-(HA)-Epitop
des Influenza-Virus versehen (Wilson et al. 1984). Außerdem wurde in den 5’ nichttranslatierten Bereich dieser Konstrukte die 5’ß-globin-leader Sequenz aus dem Krallenfrosch
(Xenopus laevis) kloniert. Diese Sequenz dient dazu die Effizienz der Translation zu erhöhen.
2.2 Herstellung von stabilen UAS-Rca1-Linien
Für die Herstellung der transgenen Fliegenlinien wurde die P-Element-Insertions-Methode
nach Rubin und Spradling verwendet (Rubin und Spradling 1982). Bei der Transformation der
Rca1-Konstrukte wurde der an das UAS/Gal4-System angepaßte pUASp-Vektor verwendet
(Brand und Perrimon 1993; Rorth 1998). Dieser Vektor enthält den minimal Promotor des
Transposase-Genes, hinter den die hergestellten Rca1-Deletionskonstrukte kloniert wurden.
Stromaufwärts vom Promotor befinden sich 14 Gal4-Bindungsstellen (Gal4-UAS) und die
GAGA-Sequenz aus dem EP-Vektor. Stromabwärts befindet sich die 3’ nicht-translatierte
18
Ergebnisse
Region des K10-Gens. Durch diese Sequenz wird die Stabilität der transkribierten mRNA
erhöht (Rorth 1998).
Abb. 7 Schematische Darstellung der Promotorregion des pUASp-Vektor (Rorth 1998). Der pUAp-Vektor
enthält den Tronsposase-Minimal-Promotor. Hinter diesen Promotor wurden die Rca1-Deletionskonstrukte,
inklusive 5’ß-globin-leader Sequenz und HA-Epitop, kloniert. Unterhalb des Rca1-Deletionskonstrukts befindet
sich die 3’ nicht-translatierte Region des K10-Gens. Oberhalb des Promotors befinden sich 14 Gal4Bindungsstellen (Gal4-UAS) und die GAGA-Sequenz aus dem EP-Vektor.
Für jedes Konstrukt wurden etwa 800 Embryonen injiziert. Im Durchschnitt erwiesen sich
20% der überlebenden Fliegen als positive Transformanten. Mit diesen Fliegen wurden dann
durch Kreuzung gegen einen Balancerstamm stabile Linien etabliert (Tab. 1).
Konstrukt
1.Chromosom 2.Chromosom 3.Chromosom
UAS-HA-rca1; C351S
1
7
6
/
3
10
UAS-HA-rca1; ∆133
/
11
5
UAS-HA-rca1; ∆203
1
3
8
UAS-HA-rca1; ∆255
2
10
4
UAS-HA-rca1; ∆F-Box
Durchschnittliche
Expression
schlecht
sehr gut
sehr gut
sehr gut
mittelmäßig
Tab. 1 Übersicht über die erhaltenen UAS-Rca1-Linien. Die Tabelle zeigt die Verteilung der P-ElementInsertionen auf die ersten drei Chromosomen. Die Kartierung der Insertionen erfolgte anhand der Verteilung
der Marker. Es wurden nur Insertionsereignisse berücksichtigt die zu stabilen Linien geführt haben. Für den
Test der Expression wurden von jeder Linie jeweils 5 Männchen gesammelt und zusammengeführt. Dieser
Pool wurde dann gegen den prd-Gal4-Stammes gekreuzt. Von dieser Kreuzung wurden dann ÜbernachtAblagen gesammelt und mit dem HA-Antikörper gefärbt.
2.3 Bestimmung der Stabilität der Rca1-Deletionskonstrukte
Der Abbau von Rca1 beginnt in der G1-Phase von Zellzyklus 17. Zu diesem Zeitpunkt
befindet sich der Embryo im 11. Stadium der Embryonalentwicklung (Stadien nach
Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein 1997)). Im Verlauf des 11. Stadiums beginnt
auch der Abbau von CyclinA. CyclinA ist jedoch in der G1-Phase von Zellzyklus 17, wenn
der Rca1-Abbau beginnt, bereits abgebaut. Daher kann man anhand von CyclinA eine
Aussage darüber machen, ob sich eine Zelle noch im 16. Zellzyklus befindet oder ob sie
schon in der Interphase 17 ist (Abb. 8; G-F) . Im 13. Stadium der Embryonalentwicklung
befinden sich alle Zellen der Epidermis in der G1-Phase von Zellzyklus 17. Zu diesem
19
Ergebnisse
Zeitpunkt sind beide Proteine nur noch in den Zellen des sich entwickelnden Nervensystems
detektierbar (Grosskortenhaus und Sprenger 2002). Die Überexpression von HA-rca1 hat
weder einen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA noch auf den Zellzyklus-Verlauf,
was bedeutet, daß das zusätzliche Rca1 auf irgendeine Weise inaktiviert wird.
Abb. 8 Überexpression von HA-rca1in Wildtyp-Embryonen (Grosskortenhaus und Sprenger
2002). Für die Expression wurde die ubiquitär aktive armadillo-Gal4-Linie verwendet. HA-rca1wurde
durch einen Rca1-Antikörper (linke Spalte) nachgewiesen. Außerdem wurde gegen CyclinA (rechte
Spalte) gefärbt.
(A-B) Stadium 10 (C-D) Frühes Stadium 11; Beginn des proteolytischen Abbaus von HA-rca1 und
CyclinA. (E-F) Spätes Stadium 11; Die Zellen, in denen CyclinA noch sichtbar ist, befinden sich
noch in der Mitose von Zellzyklus 16, whärend die Zellen in denen CyclinA bereits abgebaut ist,
schon in der Interphase von Zellzyklus 17 sind (G-H) Stadium 13; Zu diesem Zeitpunkt befinden sich
alle Zellen der Epidermis in der G1-Phase von Zelzyklus 17. In den epidermalen Zellen sind sowohl
Rca1 als auch CyclinA vollständig abgebaut. Beide Proteine sind nur noch in den Zellen des sich
entwickelnden Nervensystems nachweisbar. Die Überexpression von HA-rca1 hat keinen Einfluß auf
das Abbaumuster von CyclinA. Stadien nach Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein 1997).
20
Ergebnisse
Zur Identifizierung der
für den Rca1-Abbau notwendigen Strukturelemente, wurde die
Stabilität der Rca1-Deletionskonstrukte in 6-10 Stunden alten Embryonen analysiert. Dazu
wurden die UAS-Konstrukte mit Hilfe der paired-Gal4-Linie in jedem zweitem Segment
exprimiert. Die Aktivität der paired-Gal4-Linie beginnt im Stadium 10, wenn sich die meisten
Zellen im 15. Zellzyklus befinden. Zu Beginn ist paired-Gal4 im ganzen Segment aktiv,
während die Aktivität in der späteren Stadien auf den posterioren Teil der Segmente
beggrenzt
ist.
Der
Nachweis
der
modifizierten
Rca1-Proteine
erfolgte
durch
Immunfluoreszenzfärbungen mit einem HA-Antikörper. Das Alter der Embryonen wurde
anhand der Morphologie der Embryonen und von CyclinA-Färbungen bestimmt. Gleichzeitig
hätten Unregelmäßigkeiten im Abbaumuster von CyclinA auf einen dominanten Effekt des
exprimierten
Deletionskonstrukts
hingedeutet.
Außerdem
wurden
DNA-Färbungen
durchgeführt.
2.3.1 Stabilität von HA-rca1; ∆133
Bei HA-rca1; ∆133 wurde der N-Terminus um 133 Aminosäuren verkürzt. Neben der
Kernlokalisierungssequenz
fehlen
diesem
Konstrukt
sechs
potentielle
CDK-
Phosphorylierungsstellen, die eine wichtige Rolle bei der Proteolyse von Rca1 spielen
könnten.
Verglichen mit dem vollständigen Protein wird HA-rca1; ∆133 im Verlauf des 17. Zellzyklus
weniger stark abgebaut (Abb. 9; D-I). HA-rca1; ∆133 ist, im Gegensatz zum vollständigen
Rca1, auch noch in der Epidermis von Embryonen detektierbar die bereits sich im Stadium 13
befinden. Das Fluoreszenzsignal ist jedoch auf den posterioren Teil der Segmente beschränkt
(Abb. 9; J-L). Aus diesen Beobachtungen kann man schließen, daß die in HA-rca1; ∆133
deletierte Proteinmotive die Stabilität von Rca1 beeinflussen. Die Expression von HA-rca1;
∆133 hat keinen Effekt auf den Abbau von CyclinA (Abb. 9; mittlere Spalte).
21
Ergebnisse
Abb. 9 Überexpression von HA-rca1; ∆133 in Wildtyp-Embryonen. Für die Expression wurde die in jedem
zweiten Segment aktive paired-Gal4-Linie verwendet. Für den Nachweis von HA-rca1; ∆133 wurde ein
Antikörper gegen das N-terminale HA-Epitop verwendet (linke Spalte). Außerdem wurde gegen DNA (rechte
Spalte) und CyclinA (mittlere Spalte) gefärbt.
(A-C) Frühes Stadium 11; Beginn des proteolytischen Abbaus von CyclinA. (D-F) Spätes Stadium 11; HA-rca1;
∆133 wird verglichen mit dem vollständigen Rca1-Protein weniger stark abgebaut (G-I) Stadium 12 (J-L)
Stadium 13; HA-rca1; ∆133 ist noch nachweisbar, während das vollständige Rca1-Protein zu diesem Zeitpunkt
bereits abgebaut ist. Das HA-Signal ist ausschließlich auf den posterioren Teil der Segmente begrenzt. Die
Überexpression von HA-rca1; ∆133 hat keinen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA. Stadien nach
Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein 1997).
2.3.2 Stabilität von HA-rca1; ∆203
C-terminal von der Kernlokalisierungssequenz befinden sich die F-Box und eine weitere
mögliche CDK-Phosphorylierungsstelle. Da beide Proteinmotive in den Abbau von Rca1
involviert sein könnten, wurde das Konstrukt HA-rca1; ∆203 hergestellt. Bei diesem
Konstrukt
wurde der
N-Terminus
bis
zu
Position
203
verkürzt,
so
daß
die
Kernlokalisierungssequenz und die F-Box, sowie sieben CDK-Phosphorylierungsstellen
deletiert wurden.
HA-rca1; ∆203 verhält sich ähnlich wie HA-rca1; ∆133. (Abb. 10; D-I). Es wird wie HArca1; ∆133 im Vergleich zum vollständigen Rca1 weniger stark abgebaut. HA-rca1; ∆203 ist
22
Ergebnisse
ebenfalls noch in Embryonen nachweisbar, die bereits im Stadium 13 sind (Abb. 10; J-L).
Verglichen mit HA-rca1; ∆133 sind jedoch weniger Zellen angefärbt. Der Abbau von
CyclinA wird durch die Überexpression wiederum nicht beeinflußt (Abb. 10; mittlere Spalte).
Abb. 10 Überexpression von HA-rca1; ∆203 in Wildtyp-Embryonen. Für die Expression wurde die in jedem
zweiten Segment aktive paired-Gal4-Linie verwendet. Für den Nachweis von HA-rca1; ∆203 wurde ein
Antikörper gegen das N-terminale HA-Epitop verwendet (linke Spalte). Außerdem wurde gegen DNA (rechte
Spalte) und CyclinA (mittlere Spalte) gefärbt.
(A-C) Stadium 10 (D-F) Frühes Stadium 11; Beginn des proteolytischen Abbaus von CyclinA (G-I) Stadium 12;
HA-rca1; ∆203 wird verglichen mit dem vollständigen Rca1-Protein weniger stark abgebaut (J-L) Stadium 13;
HA-rca1; ∆203 ist noch nachweisbar, während das vollständige Rca1-Protein zu diesem Zeitpunkt bereits
abgebaut ist. Das HA-Signal ist ausschließlich auf den posterioren Teil der Segmente begrenzt. Die
Überexpression von HA-rca1; ∆203 hat keinen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA. Stadien nach
Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein 1997).
2.3.3 Stabilität von HA-rca1; ∆F-Box
Bei HA-rca1; ∆F-Box wurde nur der Abschnitt deletiert in dem sich die F-Box befindet. Wie
die bei den vorangegangenen Deletionskonstrukten, ist HA-rca1; ∆F-Box auch noch in der
Epidermis von Embryonen im Stadium 13 detektierbar. Bei
HA-rca1; ∆F-Box ist das
Fluoreszenzsignal ebenfalls auf die posterioren Bereiche der Embryonen beschränkt (Abb. 11;
23
Ergebnisse
G-I). Das Abbaumuster von CyclinA scheint durch die Überexpression von HA HA-rca1; ∆FBox nicht beeinflußt zu werden (Abb. 11; D-F).
Abb. 11 Überexpression von HA-rca1; ∆F-Box in Wildtyp-Embryonen. Für die Expression wurde die in
jedem zweiten Segment aktive paired-Gal4-Linie verwendet. Für den Nachweis von HA-rca1; ∆F-Box wurde
ein Antikörper gegen das N-terminale HA-Epitop verwendet (linke Spalte). Außerdem wurde gegen DNA
(rechte Spalte) und CyclinA (mittlere Spalte) gefärbt.
(A-C) Stadium 10 (D-F) Frühes Stadium 11; Beginn des proteolytischen Abbaus von CyclinA (G-I) Stadium 13;
HA-rca1; ∆F-Box ist noch nachweisbar, während das vollständige Rca1-Protein zu diesem Zeitpunkt bereits
abgebaut ist. Das HA-Signal ist ausschließlich auf den posterioren Teil der Segmente begrenzt. Die
Überexpression von HA-rca1; ∆F-Box hat keinen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA. Stadien nach
Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein 1997).
2.3.4 Stabilität von HA-rca1; ∆255
C-terminal
von
der
F-Box
befinden
sich
eine
KEN-Box
und
eine
GSK3-
Phosphorylierungsstelle. Von beiden Proteinmotiven ist bekannt, daß sie einen Einfluß auf die
Stabilität von Proteinen haben können (siehe 1.2.2). Um zu Untersuchen ob diese Motive
auch für den proteolytischen Abbau von Rca1 von Bedeutung sind, wurde das Konstrukt HArca1; ∆255 verwendet, bei dem die Reste 1-255 fehlen.
24
Ergebnisse
Abb. 12 Überexpression von HA-rca1; ∆255 in Wildtyp-Embryonen. Für die Expression wurde die in jedem
zweiten Segment aktive paired-Gal4-Linie verwendet. Für den Nachweis von HA-rca1; ∆255 wurde ein
Antikörper gegen das N-terminale HA-Epitop verwendet (linke Spalte). Außerdem wurde gegen DNA (rechte
Spalte) und CyclinA (mittlere Spalte) gefärbt.
(A-C) Stadium 10. (D-F) Stadium 11; Beginn der Proteolyse von CyclinA.. Der Abbau von HA-rca1; ∆255
bleibt jedoch aus (G-I) Stadium 12; Ein Großteil des CyclinA ist abgebaut; während die Menge an HA-rca1;
∆255 wenig verändert erscheint (J-L) Stadium 13; HA-rca1; ∆255 ist noch in großen Mengen nachweisbar,
während das vollständige Rca1-Protein zu diesem Zeitpunkt bereits abgebaut ist. Die Überexpression von HArca1; ∆255 hat keinen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA. Stadien nach Hartenstein und Campos-Ortega
(Hartenstein 1997).
HA-rca1; ∆255 scheint im Verlauf des 17. Zellzyklus nahezu stabil zu sein (Abb. 12; D-I).
Im Gegensatz zu den anderen Deletionskonstrukten ist HA-rca1; ∆255 im Stadium 13 noch in
nahezu allen Zellen der Epidermis detektierbar (Abb. 12; I-J). Die im Vergleich zu den
anderen rca1-Deletionskonstrukten erhöhte Stabilität deutet daraufhin, daß entweder die
KEN-Box oder die GSK3-Phosphorylierungsstelle entscheidenden Einfluß auf die Stabilität
von Rca1 haben. Die Überexpression dieses Konstrukts hat ebenfalls keinen Effekt auf das
Abbaumuster von CyclinA (Abb. 12; mittlere Spalte).
25
Ergebnisse
2.4 Untersuchung der subzellulären Lokalisierung der Rca1Konstrukte
Die Injektion von HA-rca1-mRNA hat gezeigt, daß das vollständige Rca1 im Zellzyklus 14
im Nukleus lokalisiert ist (Grosskortenhaus 2001). Diese Beobachtung bestätigte sich bei der
Untersuchung von älteren Embryonen, bei denen HA-rca1 mit armadillo-Gal4 oder pairedGal4 überexprimiert wurde (Grosskortenhaus und Sprenger 2002).
Die subzelluläre Lokalisierung eines Proteins wird durch verschiedene Sequenzmotive
bestimmt. Um herauszufinden welche Proteinmotive die Lokalisierung von Rca1
beeinflussen, wurden die Rca1-Deletionskonstrukte wiederum mit Hilfe der paired-Gal4Linie exprimiert. Zur Bestimmung der Lokalisierung der Konstrukte wurden 6-10 Stunden
alte Embryonen verwendet. Um die Lokalisierung der Rca1-Deletionskonstrukte auch in
früheren Stadien zu untersuchen, wurden außerdem mRNA-Injektionen durchgeführt. Für die
Herstellung der mRNA´s wurden die Rca1-Deletionskonstrukte zunächst in den pSP64Vektor kloniert. Dieser Vektor enthält den für die in vitro Transkription notwendigen SP6Promotor. Um eine effektive Translation im Embryo zu gewährleisten wurden die mRNA´s
mit einer 7-Methylguanosin-Kappe versehen.
Der Nachweis der Konstrukte erfolgte wiederum durch einen gegen das HA-Epitop
gerichteten Antikörper. Zur besseren Orientierung wurden die Embryonen außerdem gegen
CyclinA und DNA gefärbt. Die CyclinA-Färbung dient im diesem Fall als Marker für das
Zytoplasma, während die DNA-Färbung den Zellkern sichtbar macht. Zusätzlich wurden
WGA- und Phosphotyrosin-Färbungen durchgeführt. Bei „wheat germ agglutinin“ (WGA)
handelt es sich um ein Protein das an O-glykolysierte Proteine in der Kernmembran bindet.
Diese Eigenschaft wird ausgenutzt, um die Kernmembran mit Hilfe von fluoreszenzmarkiertem WGA anzufärben. Der Phosphotyrosin-Antikörper erkennt „tight junctions“ in
der Zellmembran, so daß diese angefärbt wird.
26
Ergebnisse
Abb. 13 Lokalisierung von HA-rca1 in Wildtyp Embryonen. Während des 16. Zellzyklus ist HA-rca1
innerhalb des Nukleus lokalisiert.
Obere Reihe (A–D) Ausschnitt aus einem Embryo gefärbt gegen HA, CyclinA (Zytoplasma) und DNA. Untere
Reihe (E-H) Ausschnitt aus einen Embryo gefärbt gegen HA; WGA (Kernmembran) und Phosphotyrosin
(Zellmembran). Für die Überexpression von HA-rca1 wurde in beiden Fällen die paired-Gal4-Linie verwendet
2.4.1 Lokalisierung von HA-rca1; ∆133
Mit diesem Konstrukt sollte getestet werden, ob die Kernlokalisierungssequenz oder die
sechs deletierten Phosphorylierungsstellen
für die nukleare Lokalisierung von Rca1
verantwortlich sind.
Obwohl bei HA-rca1; ∆133 die Kernlokalisierungssequenz deletiert wurde, ist HA-rca1; ∆133
während des Zellyklus 14 weiterhin im Nukleus lokalisiert (Abb. 14; A). Ein anderes Bild
zeigt sich jedoch bei der Überexpression mit der paired-Gal4-Linie. Im Verlauf von
Zellzyklus 16, findet man HA-rca1; ∆133 auch im Zytoplasma (Abb. 14; B-I). Die
zytoplasmatische Lokalisierung zeigt eine starke Variabilität. In einigen Fällen ist HA-rca1;
∆133
über die ganzen Zelle verteilt,
(Abb. 14; B) während es in anderen rein
zytoplasmatisch lokalisiert ist (Abb. 14; F). Diese Beobachtung deutet daraufhin, daß die
deletierten Proteinmotive während des 16. Zellzyklus für eine effektive Kernlokalisierung
benötigt werden.
27
Ergebnisse
Abb. 14 Lokalisierung von HA-rca1; ∆133 in Wildtyp Embryonen.
(A) Ausschnitt aus einem Wildtyp Embryo in den HA-rca1; ∆133-mRNA injiziert wurde. Während des 14.
Zellzyklus zeigt HA-rca1; ∆133 eine eindeutige Kernlokalisierung. Der Nachweis von HA-rca1 erfolgte mit
einem HA-Antikörper.
Obere Reihe (B–E) Ausschnitt aus einem Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; CyclinA (Zytoplasma)
und DNA. HA-rca1; ∆133 ist in der ganzen Zelle verteilt. Untere Reihe (F-I) Ausschnitt aus einem Embryo im
16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; WGA (Kernmembran) und Phosphotyrosin (Zellmembran). HA-rca1; ∆133 ist
hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Für die Überexpression von HA-rca1; ∆133 wurde in beiden Fällen die
paired-Gal4-Linie verwendet
2.4.2 Lokalisierung von HA-rca1; ∆203
Bei HA-rca1; ∆203 fehlen die N-terminalen Aminosäuren bis zu Position 203. In diesem
Abschnitt befindet sich die Kernlokalisierungssequenz und die F-Box, sowie sieben
potentielle CDK-Phosphorylierungsstellen.
In Embryonen in denen HA-rca1; ∆203 mit Hilfe der paired-Gal4-Linie exprimiert wurde
zeigt sich ein ähnliches Bild wie bei HA-rca1; ∆133 (Abb. 15). Die Lokalisierung variiert
wiederum von einer Verteilung in der ganzen Zelle (Abb. 15; H) bis zu einer rein
zytoplasmatischen Lokalisierung (Abb. 15; E) .
28
Ergebnisse
Abb. 15 Lokalisierung von HA-rca1; ∆203 in Wildtyp Embryonen
Obere Reihe (A–D) Ausschnitt aus einem Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; CyclinA (Zytoplasma)
und DNA. HA-rca1; ∆203 ist größtenteils zytoplasmatisch lokalisiert.Untere Reihe (E-H) Ausschnitt aus einem
Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; WGA (Kernmembran) und Phosphotyrosin (Zellmembran). HArca1; ∆203 ist in der ganzen Zelle nachweisbar. Für die Überexpression von HA-rca1; ∆203 wurde in beiden
Fällen die paired-Gal4-Linie verwendet.
2.4.3 Lokalisierung von HA-rca1; ∆255
Bei HA-rca1; ∆255 wurde das Rca1-Protein bis auf ein C-terminales Fragment verkürzt das
nur noch die ZBR und drei potentielle CDK-Phosphorylierungsstellen enthält.
Die Injektion der entsprechenden mRNA zeigt, daß HA-rca1; ∆255 während des 14.
Zellzyklus vorwiegend zytoplasmatisch lokalisiert ist (Abb. 16; A). Im Zellzyklus 16 ist HArca1; ∆255 ebenfalls hauptsächlich zytoplasmatisch lokalisiert (Abb. 16; B-E). Allerdings
findet man, wie bei den anderen N-terminal verkürzten Rca1-Konstrukten, auch hier Bereiche
in denen HA-rca1; ∆255 in der ganzen Zelle verteilt ist (Abb. 16; F-I).
29
Ergebnisse
Abb. 16 Lokalisierung von HA-rca1; ∆255 in Wildtyp Embryonen
(A) Ausschnitt aus einem Wildtyp Embryo in den HA-rca1; ∆255-mRNA injiziert wurde. Im Zellzyklus 14 ist
HA-rca1; ∆255 nahezu vollständig im Zytoplasma lokalisiert.
Obere Reihe (B–E) Ausschnitt aus einem Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; CyclinA (Zytoplasma)
und DNA. HA-rca1; ∆255 ist in der ganzen Zelle verteilt. Untere Reihe (F-I) Ausschnitt aus einem Embryo im
16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; WGA (Kernmembran) und Phosphotyrosin (Zellmembran). HA-rca1; ∆255 ist
entweder in der ganzen Zelle verteilt oder hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Für die Überexpression von
HA-rca1; ∆255 wurde in beiden Fällen die paired-Gal4-Linie verwendet.
2.4.4 Lokalisierung von HA-rca1; ∆F-Box
Um die Bedeutung der F-Box für die Kernlokalisierung alleine zu untersuchen, wurde das
Konstrukt HA-rca1; ∆F-Box hergestellt. Dieses Konstrukt enthält eine interne Deletion im
Bereich der F-Box, während alle anderen Proteinmotive intakt sind.
HA-rca1; ∆F-Box ist in Zellzyklus 14 weiterhin im Kern lokalisiert (Abb. 17; A). In älteren
Embryonen in denen HA-rca1; ∆F-Box in jedem zweiten Segment exprimiert wurde, ist es
jedoch eindeutig zytoplasmatisch lokalisiert (Abb. 17; B-I). Aus diesem Resultat kann man
entnehmen, daß für die Kernlokalisierung im Zellzyklus 16 sowohl die Kernlokalisierungssequenz als auch die F-Box erforderlich sind. Im Vergleich zu den N-terminal verkürzten
30
Ergebnisse
Konstrukten, findet man hier eine erheblich geringere Anzahl von Zellen bei denen HA-rca1;
∆F-Box in der gesamten Zelle verteilt ist (Abb. 17; B & F).
Abb. 17 Lokalisierung von HA-rca1; ∆F-Box in Wildtyp Embryonen
(A) Ausschnitt aus einem Wildtyp Embryo im 14. Zellzyklus in den HA-rca1; ∆F-Box-mRNA injiziert wurde.
HA-rca1; ∆F-Box ist eindeutig Kern lokalisiert.
Obere Reihe (B–E) Ausschnitt aus einen Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; CyclinA (Zytoplasma)
und DNA. HA-rca1; ∆F-Box ist fast ausschließlich zytoplasmatisch lokalisiert. Untere Reihe (F-I) Ausschnitt
aus einen Embryo im 16. Zellzyklus gefärbt gegen HA; WGA (Kernmembran) und Phosphotyrosin
(Zellmembran). HA-rca1; ∆F-Box ist hauptsächlich zytoplasmatisch lokalisiert. Nur vereinzelt findet man eine
Gleichverteilung in der Zelle. Für die Überexpression von HA-rca1; ∆F-Box wurde in beiden Fällen die pairedGal4-Linie verwendet.
2.5 Überexpression der Rca1-Kostrukte im Drosophila Auge
Die Überexpression des vollständigen Rca1-Proteins, unter der Kontrolle des glass responsive
element-(GMR)-Promotors führt zu einem rauhen Augenphänotyp (Dong et al. 1997). Im
Verlauf der Musterbildung in der Augenimaginalscheibe werden die Zellen, die sich in
morphogentischen Furche befinden, in der G1-Phase synchronisiert. Ein Teil dieser Zellen
differenziert sich zu Neuronen, während die restlichen eine weitere Zellteilung durchlaufen.
Die Überexpression von Rca1 führt, ähnlich wie die Überexpression von CyclinA oder der
31
Ergebnisse
Verlust von roughex, dazu, daß diese G1-Phase nicht etabliert wird, was sich letztendlich in
dem rauhen Augenphänotyp auswirkt. Um zu Untersuchen welche Proteinmotive für die
Induktion des rca1-abhängigen Augenphänotyps erforderlich sind, wurden die Rca1Deletionskonstrukte im Auge überexprimiert. Für die Überexpression der Rca1-Konstrukte
wurden zwei verschiedene augenspezifische Gal4-Linien verwendet. Zum einem wurde
ähnlich wie bei Dong et al die gmr-Gal4-Linie verwendet. Die Überexpression von HA-rca1
mit gmr-Gal4 führt wie beim unmarkierten Rca1 zu einem rauhen Augenphänotyp, woraus
man schließen kann, daß die Induktion des rca1-abhängigen Augenphänotyps durch das HAEpitop nicht beeinflußt wird (Abb. 18; D & E). Um zu Testen ob die Menge des
überexprimierten Proteins die Stärke des Augenphänotyps beeinflußt, wurden zwei
unterschiedlich starke gmr-Gal4-Linien verwendet.
Jedoch ist in keinem der Fälle ein
Unterschied zwischen beiden Allelen sichtbar. Benutzt man für die Überexpression von HARca1 die sevenless-Gal4-Linie, erhält man ebenfalls rauhe Augen (Abb. 18; F).
Die Überexpression von HA-rca1; C351S resultiert weder mit gmr-Gal4 noch mit sevenlessGal4 in einem rauhen Augenphänotyp (Abb. 18; G-I). Daraus kann man schließen, daß die
„zinc binding region“ (ZBR) für die Induktion des rauhen Augenphänotyps notwendig ist.
Außerdem wird deutlich, daß der Austausch eines der konservierten Cystein-Reste ausreicht
um die ZBR auch in vivo zu inaktivieren.
Wie das vollständige Rca1-Protein ist auch HA-rca1; ∆133 in der Lage den rauhen
Augenphänotyp zu induzieren, was bedeutet, daß die ersten 133 Aminosäuren für diesen
Prozeß nicht erforderlich sind (Abb. 18; J-L).
Die Überexpression von HA-rca1; ∆203 und HA-rca1; ∆F-Box hat keinen Einfluß auf die
Gestalt des Auges (Abb. 18; M-O & S-U), woraus man entnehmen kann, daß die F-Box eine
wichtige Funktion bei der Induktion des rca1-abhängigen Augenphänotyps hat. Wie nach den
vorangegangenen Experimenten zu erwarten war, hat die Überexpression von HA-rca1; ∆255
ebenfalls keinen Effekt (Abb. 18; P-R).
32
Ergebnisse
Abb. 18 Überexpression der
Rca1-Deletionskonstukte im
Drosophila Auge. Für die
Überexpression wurden zwei
unterschiedlich starke gmrGal4-Linien, sowie die sevenless-Gal4-Linie verwendet.
Die Überexpression von HArca1 (D-F) und HA-rca1; ∆133
(J-K) resultiert in einem
rauhen Augenphänotyp. Die
Überexpression der anderen
Konstrukte hat keinen Einfluß
auf die Morphologie des Auges. Als Kontrolle dienten
heterozygote Fliegen von den
jeweiligen Gal4-Linien (A-C).
33
Ergebnisse
2.6 Rettung des rca1-Phänotyps
Rca1 wird in der G2-Phase von Zellzyklus 16 benötigt um den Cdh1fzr-Komplex zu
inhibieren. In Abwesenheit von Rca1 kommt es zum vorzeitigen Abbau von CyclinA, was zu
einem Arrest am G2-M-Übergang führt. Aufgrund dieses Arrests besitzen rca1-mutante
Embryonen etwa 50 Prozent weniger epidermale Zellen als vergleichbare WildtypEmbryonen (Dong et al. 1997).
Es konnte gezeigt werden, daß die Mitose 16 in rca1-Mutanten durch die Überexpression von
HA-rca1 wiederhergestellt wird. Dazu wurde HA-rca1 mit Hilfe der paired-Gal4-Linie im
rca1-mutanten Hintergrund exprimiert. Die segmentale Expression ermöglicht einen direkten
Vergleich zwischen den rca1-exprimierenden und den rca1-mutanten Segmenten. Die HArca1-exprimierenden Segmente besaßen fast doppelt so viele Zellen wie die benachbarten
mutanten Segmente (Grosskortenhaus und Sprenger 2002).
Um zu untersuchen, welche Strukturelemente für die Funktion von Rca1 in der Interphase 16
erforderlich sind, wurden die Deletionskonstrukte in den rca1-mutanten Hintergrund
gekreuzt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten jedoch nur die Rettungexperimente mit HA-rca1;
C351S und HA-rca1; ∆203 fertiggestellt werden. Um den Effekt der Überexpression besser
mit der mutanten Situation vergleichen zu können, wurde für die Expression der
Deletionskonstrukte ebenfalls die paired-Gal4-Linie verwendet. Zur Bestimmung der
Zelldichte in den einzelnen Segmenten wurde gegen Phosphotyrosin und DNA gefärbt. Die
Detektion der überexprimierten Konstrukte erfolgte durch einen gegen das N-terminale HAEpitop gerichteten Antikörper.
2.6.1 Überexpression von HA-rca1; C351S im rca1-mutanten Hintergrund
Überexpression von HA-rca1; C351S in rca1-Mutanten hat keinen Einfluß auf die Zelldichte,
woraus zu schließen ist, daß der Austausch eines der konservierten Cystein-Reste der ZBR
auch in vivo zu einem nicht funktionalen Protein führt. Allerdings zeigten die untersuchten
Transgene nur eine sehr schwache Expression, weshalb bisher keine Bilder verfügbar sind.
34
Ergebnisse
2.6.2 Überexpression von HA-rca1; ∆203 im rca1-mutanten Hintergrund
Die Überexpression von HA-rca1; ∆203 in rca1-mutanten Embryonen, resultiert in einer
deutlich höheren Zelldichte in den HA-rca1; ∆203 exprimierenden Segmenten (Abb. 19; C &
D). Dies zeigt, daß HA-rca1; ∆203 den G2-Arrest in rca1-Mutanten aufheben kann. Aus
diesem Experiment man schließen, daß die Kernlokalisierungssequenz und die F-Box, sowie
die sieben deletierten CDK-Phosphorylierungsstellen nicht für die Funktion von Rca1 in der
Interphase 16 erforderlich sind.
Abb. 19 HA-rca1; ∆203 kann den G2-Arrest in Zellzyklus 16 aufheben Die Abbildung zeigt einen rca1mutanten Embryo im Stadium 13 in dem HA-rca1; ∆203 überexprimiert wurde. Die HA-rca1; ∆203
exprimierenden Segmente weisen eine deutlich höhere Zelldichte auf (C&D).
Für die Expression wurde die in jedem zweiten Segment aktive paired-Gal4-Linie verwendet. Für den
Nachweis von HA-rca1; ∆203 wurde ein Antikörper gegen das N-terminale HA-Epitop verwendet (A&B).
Außerdem wurde gegen DNA (E&F) und Phosphotyrosin (C&D) gefärbt. Die gestrichelten Linien markieren
die Grenze zwischen den exprimierenden und den nicht-exprimierenden Segmenten. Die Zahlen stehen für die
Anzahl der Zellen in den jeweiligen Segmenten. Stadien nach Hartenstein und Campos-Ortega (Hartenstein
1997).
35
Diskussion
3 Diskussion
Rca1 enthält mehrere konservierte Proteinmotive. Im Verlauf dieser Arbeit sollte mit Hilfe
von Deletionskonstrukten in vivo untersucht werden, welche dieser Motive für die Funktion
von Rca1 von Bedeutung sind. Außerdem sollte analysiert werden, durch welche
Strukturelemente die Stabilität und die subzelluläre Lokalisierung des Rca1-Proteins bestimmt
wird.
3.1 Abbau von Rca1
Der Abbau des vollständigen Rca1-Proteins beginnt, wie die Proteolyse von CyclinA, im
Stadium 11 der Embryogenese von Drosophila. Der Rca1-Abbau erfolgt kurz nach dem
Verschwinden von CyclinA, wenn die Zellen in der G1-Phase von Zellzyklus 17 sind. Im
Stadium 13 wenn sich alle epidermalen Zellen in der G1-Phase von Zellzyklus 17 befinden,
sind beide Proteine vollständig abgebaut (Grosskortenhaus und Sprenger 2002). Bisher ist
jedoch unklar durch welchen Mechanismus der Abbau von Rca1 vermittelt wird. Rca1 enthält
mehrere Proteinmotive die in dessen Abbau involviert sein könnte. Etwa in der Mitte von
Rca1 befindet sich eine Folge von drei Aminosäuren, die man als KEN-Box bezeichnet und
in Substraten des APC-Cdh1fzr-Komplex findet (Pfleger und Kirschner 2000). Es wäre daher
denkbar, daß Rca1 in der G1-Phase selbst zu einem Substrat des APC-Cdh1fzr-Komplex wird
und auf diese Weise für den proteasomalen Abbau markiert wird. C-terminal von der KENBox befindet sich eine Erkennungssequenz für die Glykogen Synthase Kinase 3 (GSK3)
(persönliche Mitteilung Peter Jakson). Diese Phosphorylierungsstelle spielt eine wichtige
Rolle beim Abbau von Iκß, der inhibitorischen Untereinheit des Transkriptionsfaktors NFκß.
Bei der Activierung von NFκß kommt es zunächst zu einer Phosphorylierung von Iκß durch
GSK3sgg. Das phosphorylierte Iκß wird dann von dem F-Box-Protein ß-TRCPslmb erkannt,
was zur Ubiquitinilierung durch den SCF-Komplex führt. Durch die Ubiquitinilierung wird
Iκß für den Abbau durch das Proteasom markiert (Hattori et al. 1999; Spencer et al. 1999). Es
wäre vorstellbar, daß Rca1 nach einem ähnlichen Mechanismus wie Iκß abgebaut wird. Im
N-Terminalen Abschnitt von Rca1 befindet sich außerdem eine F-Box. Es wäre daher
denkbar, daß Rca1 über die F-Box direkt an einen SCF-Komplex bindet und so für den
ubiquitinabhängigen Abbau markiert wird. In diesem Modell würde das F-Box-Protein eines
SCF-Komplex direkt ubiquitiniliert werden. Die F-Box von Rca1 scheint funktional zu sein,
36
Diskussion
da Rca1 biochemisch mit SkpA, dem Drosophila Homolog von Skp1, interagiert (persönliche
Mitteilung Ruth Grosskortenhaus).
Rca1 enthält außerdem eine Reihe von CDK-Phosphorylierungsstellen. Für Emi1 konnte
gezeigt werden, daß die Deletion aller fünf Phosphorylierungsstellen zu einer Stabilisierung
von Emi1 in Xenopus-Extrakten führt (Reimann al. 2001a). Die zehn potentiellen CdkPhosphorylierungsstellen von Rca1 könnten also ebenfalls einen Einfluß auf die Stabilität von
Rca1 haben. Bei jedem dieser hypothetischen Abbauwege ist außerdem ein zusätzlicher
Regulationsmechanismus erforderlich, der den vorzeitigen Abbau von Rca1 verhindert.
Ein Ziel dieser Arbeit war die am Rca1-Abbau beteiligten Proteinmotive mit Hilfe von
Deletionskonstrukten zu bestimmen. Dazu wurden die Rca1-Deletionskonstrukte in WildtypEmbryonen mit der paired-Gal4-Linie überexprimiert. Die Stabilität der Rca1-Konstrukte
wurde dann durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie analysiert und mit dem Abbau-Verhalten
des vollständigen Rca1-Proteins verglichen.
Die Verkürzung des N-Terminus bis zu Aminosäure 203 führt zu einer Stabilisierung von
Rca1 in der G1-Phase von Zellzyklus 17 (Abb. 10). Durch die Verkürzung des N-Terminus
fehlen HA-rca1; ∆203 die Kernlokalisierungssequenz, die F-Box sowie sieben potentielle
Cdk-Phosphorylierungsstellen. Die Deletion der F-Box führt ebenfalls zu einer Stabilisierung
von Rca1, was auf eine Beteiligung der F-Box am Rca1-Abbau hindeutet (Abb. 11).
Überaschenderweise führt auch die Deletion der ersten 133 Aminosäuren dazu, daß HA-rca1;
∆133, obwohl es noch die F-Box besitzt, im Verlauf der G1-Phase von Zellzyklus 17 weniger
stark abgebaut wird (Abb.9). Diese Beobachtung ist ein Indiz dafür, daß die Stabilisierung
dieser drei Konstrukte eher auf eine Veränderung der dreidimensionalen Struktur als auf die
Deletion eines bestimmten Proteinmotivs zurückzuführen ist. Dafür spricht auch, daß alle drei
Konstrukte im Stadium 13 nur im posterioren Teil der Segmente detektierbar sind. Zu diesem
Zeitpunkt
ist
die paired-Gal4-Linie
nur
noch in diesem Bereich aktiv. Diese
Deletionskonstrukte sind wahrscheinlich deshalb noch nachweisbar, weil der Abbau der neu
synthetisierten Proteine, aufgrund der strukturellen Veränderung, stark verlangsamt ist.
Die Verkürzung des N-Terminus bis zu Position 255 führt zu einem C-terminalen Fragment,
das nur noch die ZBR und drei potentiellen Cdk-Phosphorylierungsstellen enthält. Dieses
Fragment wird im Verlauf der G1-Phase von Zellzyklus 17 praktisch nicht abgebaut. Im
37
Diskussion
Gegensatz zu den anderen Deletionskonstrukten ist HA-rca1; ∆255 im Stadium 13 in nahezu
allen epidermalen Zellen nachweisbar (Abb. 12). HA-rca1; ∆255 fehlen im Vergleich zu HArca1; ∆203 die KEN-Box und die GSK3-Phosphorylierungsstelle. Der signifikante
Unterschied zu den anderen Rca1-Konstrukten weist darauf hin, daß vermutlich eines dieser
Proteinmotive in den Rca1-Abbau involviert ist. Durch in vitro Experimente konnte gezeigt
werden konnte, daß Emi1 kein Substrat des APC ist, was gegen eine Beteiligung der KENBox am Abbau von Rca1 spricht (Reimann et al. 2001a). Eine genauere Aussage kann jedoch
erst nach gezielter Deletion dieser Motive gemacht werden.
Da Rca1 ein Inhibitor des APC-Cdh1fzr-Komplex ist, sollte die Überexpression von Rca1
auch zu einer Inhibition des APC-Cdh1fzr-Komplex in der G1-Phase von Zellzyklus 17
führen. Dieser Effekt würde sich in einem Anstieg der CyclinA-Konzentration in der G1-Pase
von Zellzyklus 17 bemerkbar machen. Das Abbauverhalten von CyclinA wird durch die
Überexpression von Ha-rca1 jedoch nicht beeinflußt. Diese Beobachtung deutet darauf hin,
daß das zusätzliche Rca1 in der G1-Phase von Zellzyklus 17 auf irgendeine Weise inaktiviert
wird
(Grosskortenhaus
und
Sprenger
2002).
Die
Überexpression
der
Rca1-
Deletionskonstrukte hat ebenfalls keinen Einfluß auf das Abbaumuster von CyclinA.
Vorausgesetzt es handelt sich um funktionale Konstrukte, kann man daraus schließen, daß
keines der deletierten Proteinmotive an der Inaktivierung von Rca1 beteiligt ist.
Insgesamt belegen diese Daten, daß der N-terminale Teil von Rca1 großen Einfluß auf dessen
Stabilität hat. Diese Daten sind im Einklang mit der Beobachtung, daß die Deletion des NTerminus von Emi1, zu einer Stabilisierung von Emi1 in Xenopus-Extrakten führt (Reimann
et al. 2001a). Die KEN-Box oder die GSK3-Phosphorylierungsstelle scheinen die Stabilität
von
Rca1
zu
beeinflussen,
während
die
F-Box
und
die
potentiellen
Cdk-
Phosphorylierungsstellen vermutlich nicht am Rca1-Abbau beteiligt sind. Eine genauere
Aussage kann jedoch erst nach der Herstellung weiterer Deletionskonstrukte gemacht werden.
Aus diesem Grund ist es derzeit nicht möglich eindeutige Rückschlüsse auf den Mechanismus
des Rca1-Abbaus zu machen.
38
Diskussion
3.2 Subzelluläre Lokalisierung von Rca1
Rca1 ist während der Interphase des 16. Zellzyklus innerhalb des Zellkerns lokalisiert
(Grosskortenhaus 2001). Zu diesem Zeitpunkt befindet sich sowohl Fizzy-Related als auch
CyclinA im Zytoplasma (Sigrist und
Lehner 1997; Jacobs et al. 2002). Die räumliche
Trennung der Proteine wirft die Frage auf, durch welchen Mechanismus das nukleare Rca1
den zytoplasmatischen APC-Cdh1fzr-Komplex inhibiert. Außerdem stellt sich die Frage nach
der Funktion der nuklearen Lokalisierung. Ein erster Schritt zur Klärung dieser Probleme ist
herauszufinden, welche Mechanismen für die Kernlokalisierung von Rca1 verantwortlich
sind. Die einfachste Erklärung wäre, daß die nukleare Lokalisierung von Rca1 durch die Nterminale Kernlokalisierungssequenz verursacht wird. Eine andere Erklärung wäre, daß Rca1
mit einem nuklearen Protein interagiert und auf diese Weise mit in den Nukleus transportiert
wird. Bei diesem Modell wäre die Kernlokalisierung von Strukturelementen abhängig die an
Protein-Protein-Interaktionen beteiligt sind. Auf diese Weise könnte die subzelluläre
Lokalisierung von Rca1 sowohl von der F-Box als auch von der ZBR beeinflußt werden. Im
Rahmen dieser Arbeit sollte mit Hilfe von Deletionskonstrukten untersucht werden, durch
welche Proteinmotive die Kernlokalisierung von Rca1 hervorgerufen wird.
Die Deletion der ersten 133 Aminosäuren von Rca1 führt dazu, daß HA-rca1; ∆133 während
des 16. Zellzyklus hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist (Abb. 14). In diesem Bereich
befindet sich unter anderem die Kernlokalisierungssequenz, was darauf hindeutet, daß die
nukleare Lokalisierung von Rca1 auf diese Signalsequenz zurückzuführen ist. Die gleiche
Situation findet man bei den beiden anderen N-terminal verkürzten Rca1-Konstrukten (Abb.
15 & Abb. 16). Interessanterweise führt die Deletion der F-Box ebenfalls zu einer
zytoplasmatischen Lokalisierung obwohl die Kernlokalisierungssquenz noch vorhanden ist
(Abb. 17). Diese Beobachtung deutet darauf hin, daß beide Motive für eine effektive
Kernlokalisierung während des 16. Zellzyklus erforderlich sind.
Die subzelluläre Lokalisierung der N-terminal verkürzten Rca1-Konstrukte variiert von einer
Verteilung in der ganzen Zelle bis hin zu einer rein zytoplasmatischen Lokalisierung. Die
Variabilität der subzellullären Loakalisierung könnte auf einen biologischen Effekt
zurückzuführen sein. Es wäre vorstellbar, daß Rca1 in einigen Zellen
zumindest noch
teilweise in den Zellkern transportiert wird, während in anderen Zellen kein Kerntransport
mehr möglich ist. Wahrscheinlicher ist
jedoch, daß die Variabilität auf einen
39
Diskussion
Fixierungsartefakt zurückzuführen ist, da das normalerweise zytoplasmatisch lokalisierte
CyclinA, in einigen Fällen ebenfalls in der ganzen Zelle verteilt ist (Abb. 12 & Abb. 16). Bei
der Überexpression von HA-rca1; ∆F-Box findet man eine erheblich geringere Anzahl von
Zellen, bei denen HA-rca1; ∆F-Box in der ganzen Zelle verteilt ist (Abb. 17). Diese
Beobachtung deutet daraufhin, daß die Variabilität in der subzellulären Lokalisierung, auf die
geringe Größe der N-terminal verkürzten Rca1-Konstrukte zurückzuführen ist.
Durch mRNA-Injektionen konnte gezeigt werden, daß Rca1 während des 14. Zellzyklus
ebenfalls im Kern lokalisiert ist. Überraschenderweise weicht die subzelluläre Lokalisierung
der Rca1-Deletionskonstrukte in Zellzyklus 14 von der in späteren Stadien ab. Die Injektion
der entsprechenden mRNAs hat gezeigt, daß sowohl HA-rca1; ∆133 als auch HA-rca1; ∆FBox während des 14. Zellzyklus im Kern lokalisiert sind (Abb. 14 & Abb. 17). Erst die
Deletion von beiden Abschnitten, wie es bei HA-rca1; ∆255 der Fall ist, führt zu einer
zytoplasmatischen Lokalisierung (Abb. 16). Aus diesen Daten kann man schließen, daß eines
der beiden Motive für die Kernlokalisierung in Zellzyklus 14 ausreichend ist.
Die Injektion von HA-rca1; C351S-mRNA hat gezeigt, daß sich HA-rca1; C351S während
des 14. Zellzyklus innerhalb des Kerns befindet. Das gleiche Bild zeigte sich auch bei der
Untersuchung von Embryonen im 16. Zellzyklus, bei denen HA-rca1; C351S überexprimiert
wurde (Daten nicht gezeigt). Aus diesen beiden Beobachtungen kann man schließen, daß die
Inaktivierung der ZBR keinen Einfluß auf die subzelluläre Lokalisierung von Rca1 hat.
Diese Daten belegen, daß neben der Kernlokalisierungssequenz auch die F-Box in die
nukleare
Lokalisierung
involviert
ist.
Interessanterweise
sind
für
eine
effektive
Kernlokalisierung im Verlauf des 16. Zellzyklus beide Sequenzabschnitte erforderlich,
während im 14. Zellzyklus einer von beiden ausreicht. Für eine Beteiligung der F-Box spricht
die biochemische Interaktion mit SkpA, da durch mRNA-Injektionen gezeigt werden konnte,
daß SkpA ebenfalls kernlokalisiert ist (persönliche Mitteilung Ruth Grosskortenhaus). Ob nun
SkpA oder eines seiner fünf Homologe an der Kernlokalisierung beteiligt ist, bleibt jedoch
weiterhin unklar (Nayak et al. 2002; Yamanaka et al. 2002).
40
Diskussion
3.3 Funktionale Charakterisierung der Rca1-Deletionskonstrukte
Die Überexpression des vollständigen Rca1-Protein führt sowohl mit gmr-Gal4 als auch mit
sevenless-Gal4 zu einem rauhen Augenphänotyp (Dong et al. 1997). Weshalb die
Überexpression von Rca1 zu einem rauhen Augenphänotyp führt konnte im Detail noch nicht
geklärt werden. Vorhandene Daten zeigen, daß die Überexpression von Rca1 zu ektopischen
S-Phasen und einem Anstieg der CyclinA-Konzentration in der Augenimmaginalscheibe führt
(Dong et al. 1997). Diese Ergebnisse konnten bisher nicht bestätigt werden (persönliche
Mitteilung Frank Sprenger).
Sicher ist jedoch, daß für die Induktion des rauhen
Augenphänotyps ein funktionales Rca1-Protein erforderlich ist.
In Homozygoten rca1-Mutanten werden die mitotischen Cycline vorzeitig abgebaut, was zu
einem Arrest in der G2-Phase von Zellzyklus 16 führt. Als Folge dieses Arrests besitzen rca1mutante Embryonen nur etwa 50 Prozent der Epidermiszellen eines vergleichbarer WildtypEmbryo. Es konnte gezeigt werden, daß die Überexpression von HA-rca1 diesen Arrest
aufheben kann (Grosskortenhaus und Sprenger 2002).
Für die Untersuchung welche Proteinmotive für die Funktion von Rca1 essentiell sind,
wurden zwei verschiedene experimentelle Ansätze gewählt. Im ersten Test wurde überprüft,
ob die Überexpression der Deletionskonstrukte zu einem rauhe Augenphänotyp führt. In dem
zweiten Test wurde untersucht, ob die Rca1-Kontrukte in der Lage sind die Mitose 16 in
homozygoten rca1-Mutanten wiederherzustellen.
Durch Zellkultur-Experimente wurde für Emi1 gezeigt, daß der Austausch eines der
konservierten Cystein-Reste der ZBR zur Inaktivierung des Proteins führt. Durch
Koimmunoprezipitations-Experimente konnte außerdem gezeigt werden, daß die ZBR für die
Interaktion zwischen Emi1 und Cdc20 notwendig ist (Reimann et al. 2001a). Um zu Prüfen
ob die ZBR auch für die Funktion von Rca1 erforderlich ist wurde ein Konstrukt (HA-rca1;
C351S) verwendet, bei dem der entsprechende Cystein-Rest ebenfalls mutiert wurde. HArca1; C351S ist nicht in der Lage den rca1-abhängigen Augenphänotyp zu induzieren (Abb.
18). Außerdem kann die Mitose 16 in rca1-mutanten Embryonen nicht durch die
Überexpression von HA-rca1; C351S wiederhergestellt werden. Diese in vivo Daten belegen,
daß die ZBR auch für die Funktion von Rca1 essentiell ist. Ob die ZBR von Rca1 in die
Interaktion mit Fizzy-Related involviert ist, muß jedoch noch geklärt werden.
41
Diskussion
Durch biochemische Analysen und Zellkultur Experimente wurde gezeigt, daß ein C-terminales Fragment von Emi1, welches die ZBR enthält, für die Funktion von Emi1 ausreichend
ist (Reimann et al. 2001a). Im Fall von HA-rca1; ∆203 sieht die Situation ähnlich aus.
Obwohl bei HA-rca1; ∆203 der N-Terminus bis zu Aminosäure 203 verkürzt wurde, ist diese
Konstrukt in der Lage die Mitose 16 in rca1-mutanten Embryonen wiederherzustellen (Abb.
19). Aus dieser Beobachtung kann man schließen, daß die Kernlokalisierungssequenz, die FBox sowie die sieben deletierten CDK-Phosphorylierungsstellen nicht für die Funktion von
Rca1 in der Interphase 16 erforderlich sind. Aus diesem Experiment kann man auch
entnehmen, daß die Kernlokalisierung zu diesem Zeitpunkt nicht erforderlich ist (Abb. 15).
Interessanterweise ist HA-rca1; ∆203 nicht fähig den rca1-abhängigen Augenphänotyp zu
induzieren (Abb. 18). Erst die Überexpression von HA-rca1; ∆133 führt zu einem rauhen
Augenphänotyp (Abb. 18). Im Gegensatz zu HA-rca1; ∆203 besitzt HA-rca1; ∆133 noch die
F-Box. Diese Beobachtung ist ein Indiz dafür, daß die F-Box für die Induktion des rauhen
Augenphänotyps notwendig ist. Diese Hypothese wird durch die Beobachtung bestätigt, daß
das Konstrukt HA-rca1; ∆F-Box, in dem ausschließlich die F-Box entfernt wurde, ebenfalls
nicht in der Lage ist den rauhen Augenphänotyp zu induzieren (Abb. 18). Da auch HA-Rca1;
∆133 im Zytoplasma vorzufinden ist, kann man davon ausgehen, daß dieser Effekt nicht auf
die zytoplasmatische Lokalisierung von HA-rca1; ∆F-Box zurückzuführen ist (Abb. 14 &
Abb. 17)
Wie bei Emi1 scheint die ZBR auch für die Funktion von Rca1 essentiell zu sein. Bei Rca1
scheint die Situation komplizierter zu sein, da für die Induktion des rauhe Augenphänotyps
zusätzlich zur ZBR die F-Box notwendig ist. Dies ist ein weiterer Hinweis dafür, daß Rca1 in
den späteren Stadien auf eine andere Weise als in Zellzyklus 16 reguliert wird.
42
Zusammenfassung
4 Zusammenfassung
Rca1 (regulator of cyclinA) ist ein nukleares Protein, das den APC-Cdh1fzr-Komplex während
der G2-Phase von Zellzyklus 16 inhibiert und so den vorzeitigen Abbau der mitotischen
Cycline verhindert. Rca1 enthält mehrere konservierte Proteinmotive. Mit Hilfe der im
Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Deletionsanalyse sollte die Funktion dieser Motive in
vivo untersucht werden.
Durch die Deletionsanalyse konnte in vivo gezeigt werden, daß der N-terminale Abschnitt von
Rca1 großen Einfluß auf dessen Stabilität hat. Eine besondere Bedeutung für die Stabilität
von
Rca1
haben
wahrscheinlich
Phosphorylierungsstelle.
Die
die
potentielle
Deletionsanalyse
hat
KEN-Box
außerdem
und
gezeigt,
die
GSK3-
daß
zwei
unterschiedliche Proteinmotive an der Kernlokalisierung von Rca1 beteiligt sind. Für eine
effektive
Kernlokalisierung
während
des
16.
Zellzyklus
sind
sowohl
die
Kernlokalisierungssequenz als auch die F-Box von Rca1 erforderlich. Hingegen ist für eine
nukleare Lokalisierung im Verlauf des 14. Zellzyklus eines der beiden Proteinmotive
ausreichend.
Die Funktionale Charakterisierung der Deletionskonstrukte hat gezeigt, daß die „zinc binding
region“ (ZBR) für die Funktion von Rca1 essentiell ist. Der N-terminale Teil bis zu
Aminosäure 203 ist dagegen nicht für die Rettung des Phänotyps von homozygoten rca1Mutanten erforderlich. Die Überexpression der Deletionskonstrukte hat gezeigt, daß für die
Induktion des rca1-abhängigen Augenphänotyps neben der ZBR auch die F-Box notwendig
ist.
43
Material und Methoden
5 Material und Methoden
5.1 Material
5.1.1 Chemikalien
Falls nicht anders angegeben, wurden ausschließlich analysereine Substanzen folgender
Firmen verwendet: Bachem; Boehringer; Fluka; Pharmacia; Riedel-de-Häen; Serva; SigmaAldrich; Roche; Roth
5.1.2 Spezielle Chemikalien und Reaktionssets
Altered Sites 2 in vitro Mutagenesis System
Big Dye Terminator Kit
DNA-Gel-Extraktions-Kit (easypure)
DNA-Größenstandard (1kb-ladder)
CIP (calf intestinal Phosphatase)
Klenow-Fragment
Megascript-Sp6-Kit
m7G(5’)ppp(5’)G
NGS (natural goat serum)
Nucleobond AX-100 (Midi-Prep-Kit)
PCR-Purification-Kit
Propidiumiodid
Restriktionsendonukleasen
T4-DNA-Ligase
T4-DNA-Polymerase
Vectashield-Einbettungsmedium
Promega
ABI Prism
Biozym
Gibco-BLR
Boehringer
Boehringer
Ambion
Ambion
Dianova
Machery & Nagel
Quiagen
Sigma
NEB; Boehringer
NEB
NEB
Vector-Laboratories
5.1.3 Puffer; Lösungen; Medien
Antibiotika
Ampicilin (50 mg/ml in 50 % EtOH) [1 :1000]
Tetracyclin (5 mg/ml in 50 % EtOH) [1:250]
EDTA
Ethidiumbromid
Ladepuffer
0,5 M in H2O; pH8,0
10 mg/ml in H2O
1x TAE
50 % Glycerin
0,1 %(w/v) Xylencyanol
0,1 %(w/v) Bromphenolblau
44
Material und Methoden
LB-Medium (für 1l)
10 g Baktotrypton
5 g Hefeextrakt
10 g NaCl
auf pH 7,2 mit NaOH einstellen
LB-Agarplatten
LB-Medium
1,5 %(w/v) Agar
100 µg/ml Methicillin
Ligasepuffer (10x)
500 mM Tris-HCl
100 mM MgCl2
100 mM DTT
10 mM ATP
250 µg/ml BSA
Mini-Prep-Lösungen
Resuspensions-Puffer
100 µg/ml RNase
50 mM Tris-HCl pH8,0
10 mM EDTA pH8,0
Lyse-Puffer
200 mM NaOH
10 %w/v SDS
Neutralisations-Puffer
3 M KAc; pH5,5
Binde-Lösung
1:1 Suspension von „diatomecous earth“ in
7M Guanidinium-HCl
Wasch-Puffer
100 mM NaCl
10 mM Tris pH7,0
2,5 mM EDTA
50 % EtOH
Natriumacetat
3 M in H2O; pH5,1
PBS (1x)
130 mM NaCl
2,7 mM KCl
7 mM Na2HPO4
3 mM KH2PO4
pH7,4
PBT
0,1 % Tween-20 in PBS
Propidiumiodid
10 mg/ml in PBS [1:1000]
RNAse-Voratslösung
10 mg/ml in H2O; zur Inaktivierung von DNAse 10 min kochen
45
Material und Methoden
TAE (1x)
40 mM Tris-Acetat
1 mM EDTA
TE
1 mM EDTA
10 mM Tris-HCl; pH8,0
Terrific Broth
Lösung A
12 g Baktotrypton
24 g Hefeextrakt
4 ml Glycerin
in 900 ml H2O
Lösung B
3 mM KH2PO4
3 mM K2HPO4
in 100 ml H2O
5.1.4 Antikörper
Antikörper gegen
ß-Galactosidase
CyclinA
HA
Rca1
Phosphotyrosin
Hergestellt in
Kaninchen
Kaninchen
Ratte
Ratte
Maus
Verdünnung
1:1000
1:100
1:100
1:100
1:10
Herkunft
Cappel
Frank Sprenger
Boehringer
Ruth Grosskortenhaus
Deborah Morrison
Verdünnung
1:500
1:500
1:500
1:500
1:2500
Herkunft
Dianova
Dianova
Dianova
Dianova
MoBiTec
Tab. 2 Primäre Antikörper
Antikörper
Ziege-α-Kaninchen
Ziege-α-Kaninchen
Zeige-α-Ratte
Zeige-α-Mouse
WGA*
Gekoppelt mit
Cy5
Alexa-488
Alexa-488
Cy5
Rhodamin
Tab. 3 Sekundäre Antikörper * Bei WGA handelt es sich nicht um einem Antikörper sondern um ein Protein
das an O-glykolisierte Proteine bindet. WGA wird zusammen mit den sekundären Antikörpern eingesetzt.
5.1.5 Oligonukleotide
Folgende Oligonukleotide wurden für die Herstellung und Sequenzierung der Rca1Deletionskonstrukte eingesetzt (Eurogentec):
Name
CO-005
CO-006
CO-125 (rca1B)
Sequenz
GGATAACAATTTCACACAG
GGTGACACTATAGAATAC
TCG GGA TCC ATG AGC GCC TAT TAT CGG
Verwendungszweck
Sequenzieren
Sequenzieren
Sequenzierenvon Rca1
46
Material und Methoden
CO-126 (rca1X)
CO-166 (rca1.1)
CO-167 (rca1.2)
CO-168 (rca1.3)
CO-169 (rca1.4)
CO-170 (rca1.5)
CO-228
CO-232
CO-233
AmpR
TetKO
ATG TCT AGA CTA AAA ACA GAG CCG CTT GAG
GAT GAA CGA GTC TGG CTA CAC ATC
CCA AGC GAC GCA AGA AAC ACT TTC
CTA ATG GAC TCG GGC AAC TCG AGC ATC
CTA ACC AAA GAG AAT CCT CAC CTG CC
CCT ATT GGA CGT ACA ACC AGC ACA TTC
GTG TCA TCT CCC AGT TTC GG
A TTA CCC GGG CCA TTG CGC CAG CTT GGC CAC
A TTA CCC GGG CGC CTA CAG AAC CAC CGA
CTC
GTT GCC ATT GCT GCA GGC ATC GTG GTG
GCC GGG CCT CTT GCG GGC GTC CAT TCC
Sequenzieren von Rca1
Sequenzieren von Rca1
Sequenzieren von Rca1
Sequenzieren von Rca1
Sequenzieren von Rca1
Sequenzieren von Rca1
Mutagenese
Mutagenese
Mutagenese
pAlter
pAlter
Tab. 4 Verwendete Oligonukleotide
5.1.6 Plasmide
Name
pRG026
Insert
HA-rca1
Vektor
pSP64
Verwendungszweck
pRG028
HA-rca1
pBluescript SK (-)
pRG054
HA-rca1; ∆203 (∆1-203)
pSP64
pRG057
HA-rca1; ∆203 (∆1-203)
pBluescript SK (-)
pRG058
HA-rca1; ∆203 (∆1-203)
pUASp
Transformation
pNZ001
HA-rca1
pAlter1
Mutagenese
pNZ003
HA-rca1;C351S
pAlter1
pNZ004
HA-rca1;C351S
pSP64
in vitro Transkription
pNZ005
HA-rca1;C351S
pUASp
Transformation
pNZ007
HA-rca1; ∆255 (∆1-255)
pSP64
in vitro Transkription
pNZ008
HA-rca1; ∆133 (∆1-133)
pSP64
in vitro Transkription
pNZ012
HA-rca1; ∆255 (∆1-255)
pBluescript SK (-)
pNZ013
HA-rca1; ∆133 (∆1-133)
pBluescript SK (-)
pNZ017
HA-rca1; ∆255 (∆1-255)
pUASp
Transformation
pNZ018
HA-rca1; ∆133 (∆1-133)
pUASp
Transformation
pNZ022
HA-rca1; ∆F-Box (∆164-203)
pAlter1
pNZ024
HA-rca1; ∆F-Box (∆164-203)
pSP64
in vitro Transkription
pNZ025
HA-rca1; ∆F-Box (∆164-203)
pUASp
Transformation
in vitro Transkription
Tab. 5 Verwendete Plasmide
47
Material und Methoden
5.1.7 Vektoren
Für die Klonierungsarbeiten wurden die Vektoren pAlter1 (Promega), pBluescript SK (-)
(Stratagene) und pSP64 eingesetzt. Für die Herstellung der transgenen Fliegen wurden der
Transformations-Vektor pUASp und das Helfer-P-Element ∆2,3 eingesetzt (Rio und Rubin
1985; Rorth 1998).
Abb. 20 Schematische Darstellung der verwendeten Vektoren. (A) pAlter1 Vektor (Promega). (B)
pBluescript II SK (-) Vektor (Stratagene). (C) pSP64 Vektor
5.1.8 Bakterienstämme
DH5α
supE44 ∆lacU169 (φ80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1
gyrA96 thi-1 relA1
ES1301 mutS
lacZ53 mutS201::Tn5 thyA36 rha-5 metB1 deoC IN(rrnD-rrnE)
JM109
endA1 recA1 gyrA96 thi hsdR17(rκ-mκ+) relA1 supE44 λ∆(lac-proAB) [F´ traD36proA+B+ lacIqZ∆M15]
48
Material und Methoden
5.1.9 Fliegenstämme
Als Wildtyp-Fliegen wurden entweder OregonR oder w1118 verwendet. Alle verwendeten
Marker sind bei Lindsey und Zimm (Zimm 1992) beschrieben.
Name
F-232
T-F-291
T-F-292
T-F-313
T-F-374
T-F-377
T-F-378
T-F-383
T-F-451
T-F-452
T-F-499
T-F-502
T-F-505
Genotyp
w-; If/CyO(wg-LacZ); MKRS/TM6B
p{w+; GMR-GAL4} (schwächere Linie)
p{w+; GMR-GAL4} (stärkere Linie)
prd-Gal4/TM3(ftz-LacZ)
rca12/CyO(wg-LacZ); MKRS/TM6B
sev-GAL4 / CyO wg-LZ; +/+
rca12/CyO(wg-LacZ); prd-Gal4/TM6B
p{w+; UAS-HA-Rca1}/CyO(wg-LacZ); MKRS/TM6B
p{w+; UAS-HA-Rca1;∆203}/CyO(wg-LacZ); MKRS/TM6B
If/CyO(wg-LacZ); p{w+; UAS-HA-Rca1;∆203}/TM6B
p{w+; UAS-HA-Rca1; C351S}/CyO(wg-LacZ); MKRS/TM6B
If/CyO(wg-LacZ); p{w+; UAS-HA-Rca1;C351S}/TM6B
rca12/CyO(wg-LacZ); p{w+; UAS-HA-Rca1;351S}/TM6B
Herkunft
Frank Sprenger
Frank Sprenger
Frank Sprenger
Frank Sprenger
Ruth Grosskortenhaus
Frank Sprenger
Ruth Grosskortenhaus
Ruth Grosskortenhaus
Eigene Herstellung
Eigene Herstellung
Eigene Herstellung
Eigene Herstellung
Eigene Herstellung
(T-F-502 x T-F-374)
T-F-508 rca12/CyO(wg-LacZ); p{w+; UAS-HA-Rca1;∆203}/TM6B
Eigene Herstellung
(T-F-452 x T-F-374)
T-F-511
T-F-514
T-F-518
T-F-521
p{w+; UAS-HA-Rca1;∆255}/CyO(wg-LacZ); MKRS/TM6B
If/CyO(wg-LacZ); p{w+; UAS-HA-Rca1;∆255}/TM6B
p{w+; UAS-HA-Rca1;∆133}/CyO(wg-LacZ); MKRS/TM6B
If/CyO(wg-LacZ); p{w+; UAS-HA-Rca1;∆133}/TM6B
p{w+; UAS-HA-Rca1;∆F-Box}/CyO(wg-LacZ); MKRS/TM6B
If/CyO(wg-LacZ); p{w+; UAS-HA-Rca1;∆F-Box}/TM6B
Eigene Herstellung
Eigene Herstellung
Eigene Herstellung
Eigene Herstellung
Eigene Herstellung
Eigene Herstellung
Tab. 6 Verwendete Fliegenstämme
5.1.10 Geräte
Computer
Apple Macintosh
IBM kompatibler PC
Elektroporationsgerät
Genepulser (Biorad)
Gelelektrophoresekammer
Eigenbau Institut für Genetik
Inkubatoren
Heizblöcke; Wasserbäder; Heizschränke (Mettler)
Mikromanipulator
(Bachhofer)
Mikroskope und Kameras
Stemi DRC (Zeiss) & ProgRes3008 Digitalkamera (Zeiss)
Konfokales-Mikroskop (Leica)
49
Material und Methoden
Mikrowellengerät
Daewoo
PCR-Maschinen
Personal-Cycler (Biometra)
UNO-Block (Biometra)
Plastikartikel
Reaktionsgefäße; Petrischalen (Eppendorf; Falcon; Greiner)
Rotoren für Zentrifugen
G3; SS34
Software
Adobe Photoshop (Adobe Systems)
Canvas (Deneba Systems)
DNA-Strider
Endnote (Niles Software Inc.)
Word (Microsoft)
Sequenzierer
ABI 377A DNA-Sequenzer (Perkin Elmer)
Spektralphotometer
Genequant II (Pharmacia)
PMQ II (Zeiss)
Zentrifugen
(Hettich; Heraeus; Sorvall; Beckman)
50
Material und Methoden
5.2 Molekularbiologische Methoden
5.2.1 Herstellung von elektrokompetenten Zellen
Dazu wurde zunächst eine 20ml-Vorkultur (LB-Medium) mit einer Einzelkolonie des
entsprechenden E.coli-Stamms angeimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Diese Vorkultur
wurde dann zu 1 Liter „Terrific Broth“ Medium gegeben und bis zu einer OD600 von 0,5 bei
37°C inkubiert. Danach wurden die Zellen 10 Minuten bei 4°C mit 4000Upm im G3-Rotor
zentrifugiert. Die pelletierten Zellen wurden dann in eiskaltem 10%igen Glycerin
aufgenommen und nochmal für 20 Minuten im G3-Rotor bei 4°C mit 4000Upm zentrifugiert.
Das resultierende Pellet wurde in 20ml eiskaltem 10%igen Glycerin resuspendiert und in ein
50ml-Falcon-Röhrchen überführt. Nach siebenminütiger Zentrifugation mit 4000Upm bei 4°C
in der Heraeus-Zentrifuge wurden die Zellen zunächst in eiskaltem
10%igen Glycerin
aufgenommen und dann auf 50µl Aliquots verteilt. Die Aliquots wurden in flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bei –70°C gelagert.
5.2.2 Transformation durch Elektroporation
Dazu wurde ein Aliquot (50µl) der entsprechenden kompetenten Zellen mit 1µl der zu
transformierenden DNA versetzt und in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette überführt.
Die Elektroporation erfolgte bei einer Spannung von 2500V und einer Kapazität von 25µF,
wobei die Pulslänge ca. 4 Millisekunden betrug. Zur Regeneration wurden die Zellen in 1ml
LB-Medium überführt und für ca. 1h bei 37°C inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wurden
zwischen 20 und 300µl der Suspension auf Agarplatten mit einem geeignetem
Selektionsmedium ausplattiert.
5.2.3 DNA-Preperation im Mini-Maßstab
Zur Gewinnung von analytischen Plasmid-Mengen wurden zunächst mehrere 2ml-Kulturen
(LB/Amp-Medium) mit einer Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert.
1,5ml der hochgewachsenen Bakterienkultur wurden dann in ein Eppendorf-Gefäß überführt
und 2 Minuten mit 14000Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das
Pellet in 200µl Resuspensions-Puffer aufgenommen. Danach wurde die Bakterien Suspension
51
Material und Methoden
mit 200µl Lyse-Puffer versetzt und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
Ablauf der Zeit wurde 200µl Neutralisations-Puffer dazugegeben und für 10 Minuten bei 4°C
mit 14000Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und in ein neues
Reaktionsgefäß mit 200µl Binde-Lösung überführt. Diese Suspension wurde dann auf
„Wizard-Mini-Columns“ (Promega) aufgetragen. Nach dem Absaugen der Flüssigkeit, wurde
einmal mit 2ml Wasch-Puffer gewaschen. Für die Elution der DNA wurden die Säulen in ein
neues Eppendorf-Gefäß überführt. Die Elution erfolgte durch die Zugabe von 50µl TE (60°C)
und kurzeitiger Zentrifugation bei 14000Upm.
5.2.4 DNA-Preperation im Midi-Maßstab
Für die Preperation von größeren Plasmid-Mengen wurde das „Nucleobond-AX100-Kit“ der
Firma Machery & Nagel eingesetzt. Bei der Reinigung wurde nach den Angaben des
Herstellers vorgegangen.
5.2.5 Quantifizierung von DNA und RNA
Für
die
photometrische
Konzentrationsbestimmungen
wurden
zunächst
geeignete
Verdünnungen (z.B. 1:200) in TE hergestellt und ihre Extinktion bei λ=260nm gemessen.
Dabei wurden Quartsküvetten mit einer Schichtdicke von 1cm verwendet. 1OD260 entspricht
50µg doppelsträngiger DNA bzw. 40µg einzelsträngiger DNA oder RNA. Zu Überprüfung
der Sauberkeit wurde außerdem der Quotient aus OD260 und OD280 ermittelt. Bei guter
Reinheit liegt OD260/OD280 zwischen 1,8 und 2.
5.2.6 Restriktionsverdaue
Für analytische Zwecke wurden die Restriktionsverdaue in einem Volumen von 30µl
durchgeführt. Präperative Restriktionsverdaue erfolgten hingegen in einem Endvolumen von
80µl. Die Menge an Enzym wurde an die zu verdauende DNA-Menge angepaßt. Die
Restriktionsverdaue wurden jeweils unter den vom Hersteller empfohlenen Temperatur- und
Pufferbedingungen durchgeführt. Die analytischen Restriktionsansätze wurde für mindestens
2 Stunden oder über Nacht inkubiert. Analytische Restriktionsverdaue wurden grundsätzlich
über Nacht durchgeführt.
52
Material und Methoden
5.2.7 Klenow-„fill in“-Reaktion
Für das Auffüllen von 5’-überhängenden Enden wurde das Klenow-Fragment der DNAPolymerase I aus E.coli eingesetzt. Mit Hilfe dieser Methode können DNA-Fragmente mit
nicht-kompatiblen Enden in glattendige Fragmente umgewandelt werden und so miteinander
verbunden werden. Für die Durchführung der Reaktion wurde der Restriktionsansatz mit 1U
Klenow pro µg DNA sowie einer entsprechenden Menge 10x dNTP-Mix (330µM) versetzt
und dann für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wurde die
Reaktion durch die Zugabe von 10mM EDTA und zehnminütiges Erhitzen auf 75°C gestoppt.
5.2.8 Dephosphorylierung von Vektorenden
Zur Vermeidung von Religationen wurden die Vektorenden mit CIP (calf intestinal
phosphatase) dephosphoryliert. Dazu wurde der Restriktionsansatz mit 1U Enzym versetzt
und für 15-30 Minuten bei 37°C inkubiert.
5.2.9 Agarosegelektrophorese
DNA-Fragmente wurden durch horizontale Flachbettelektrophorese bei einer Feldstärke von
ca. 10V/cm aufgetrennt. Dabei wurden grundsätzlich 1%ige TAE-Agarosegele verwendet.
Bei einem Gelvolumen von 100ml wurden 7,5µl Ehtidiumbromid (10mg/ml) eingesetzt. Für
die Beladung des Gels wurden die aufzutrennenden Proben mit 1/6-Volumen Ladepuffer
versetzt. Als Größenstandard wurde die 1kb-Leiter der Firma Gibco-BLR benutzt. Die
aufgetrennten DNA-Banden wurde auf einem UV-Tisch (λ=312nm) sichtbar gemacht und mit
Hilfe einer Digitalkamera dokumentiert.
5.2.10 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die zu isolierenden Fragmente wurden über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Die
entsprechenden Banden wurden dann auf dem UV-Tisch (λ=312nm) ausgeschnitten, in
Eppendorf-Gefäße überführt und ausgewogen. Für die Reineinigung der ausgeschnittenen
Fragmente wurde das „easypure“ DNA-Extraktion-Kit der Firma Biozym entsprechend den
Herstellerangaben eingesetzt.
53
Material und Methoden
5.2.11 Ligation von DNA-Fragmenten
Für die Ligation zweier DNA-Fragmente wurde die DNA-Ligase aus dem T4-Phagen
verwendet. Die Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 15µl durchgeführt. Dabei
wurden jeweils 100-200ng Vektor-DNA und ein fünffacher Überschuß des zu klonierenden
Restriktionsfragments eingesetzt. Der Ligationsansatz wurde dann mit 400U T4-Ligase und
einer entsprechenden Menge 10x Ligasepuffer versetzt und über Nacht bei 18°C inkubiert.
5.2.12 Sequenzierung
Für die Sequenzierung von Plasmiden wurde das auf der Kettenabbruchmethode basierende
„Abi Prism BigDye Terminator cycle sequencing kit“ eingesetzt (Sanger et al. 1977). Dabei
wird statistisch gesehen an jeder Position des zu sequenzierenden DNA-Abschnitts
ein
fluoreszenzmarkiertes Didesoxynukleotid eingebaut, was zu einem Kettenabbruch führt. Auf
diese Weise entstehen unterschiedlich lange Fragmente, die elektrophoretisch aufgetrennt
werden können. Anhand des Bandenmusters wird dann die Sequenz bestimmt.
Für die Sequenzierungsreaktion wurden 4µl BDT mit 1µg DANN sowie 5pmol der
entsprechenden Primer (Tab. 4) versetzt und dann mit H2O auf ein Endvolumen von 20µl
gebracht. Die Sequenzierungsreaktion bestand aus den folgenden Einzelschritten:
5 min bei 96°C
30 s
bei 96°C
15 s
bei 50°C
4 min bei 72°C
∞
25 Zyklen
bei 4°C
Die fertigen Sequenzansätze wurden mit H2O auf 100µl aufgefüllt und mit 10µl
Natriumacetat (3M; pH5,2) sowie 300µl 100%igen Ethanol versetzt. Nach zehnminütiger
Inkubation auf Eis wurde der Ansatz für 20 Minuten bei 4°C mit 4000Upm zentrifugiert. Das
Pellet wurde einmal mit 300µl 70%igem Ethanol gewaschen und unter Lichtausschluß über
Nacht getrocknet. Die Sequenzanalyse wurde auf einem ABI377A DNA-Sequenzer (PerkimElmer) durchgeführt.
54
Material und Methoden
5.2.13 In vitro Transkription
Für die Herstellung von mRNA wurde der pSP64-Vektor und das „Megascript-SP6-Kit“ von
Ambion nach den Herstellerangaben eingesetzt. Die Reinigung der mRNA erfolgte durch
LiCl-Fällung.
5.2.14 Gezielte Mutagenese
Für das gezielte Einfügen von Mutationen wurde das „Altered Sites2 in vitro Mutagenesis
System“ von Promega verwendet. Die Vorgehensweise entsprach den Anweisungen des
Herstellers.
5.3 Drosophila-Methoden
5.3.1 Fliegenhaltung
Die Fliegen wurden in mit Schaumstoff und Watte verschlossenen Kunststoffröhrchen
gehalten. Die Röhrchen wurden etwa zu 1/3 mit Fliegenfutter gefüllt. Die Haltung der Fliegen
erfolgte bei 18 bis 25°C, wobei die Fliegen alle 2-4 Wochen in neue Röhrchen umgesetzt
wurden. Genauere Angaben findet man bei (Roberts 1986; Ashburner 1989).
5.3.2 Sammeln von Embryonen
Für die Sammlung von Embryonen wurden die Fliegen in einem mit einer Apfelsaft-AgarPlatte verschlossenen Legekäfig gehalten. In der Mitte der Apfelsaft-Agar-Platte wurde etwas
Bäckerhefe positioniert. Nachdem die Fliegen ihre Eier auf die
Apfelsaft-Agar-Platte
abgelegt hatten, wurden die Platten gewechselt und das Gelege weiterverarbeitet. Durch den
zeitlich kontrollierten Wechsel der Platten war es möglich Embryonen in einem bestimmten
Entwicklungsstadium anzureichern.
55
Material und Methoden
5.3.3 Dechorionierung von Drosophila-Embryonen
Zur Entfernung des Chorions wurden die auf Apfelsaft-Agar-Platten gesammelten Embryonen
für etwa 1 Minute mit 50%iger Chlorbleiche (Klorix) behandelt. Danach wurden die
Embryonen in ein Gaze-Sieb überführt und unter fließendem Leitungswasser abgespült.
5.3.4 Fixierung von Embryonen
Die Embryonen wurden auf Apfelsaft-Agar-Platten gesammelt und dechorioniert. Die
gewaschenen Embryonen wurden dann in ein 2ml Eppendorfgefäß mit 1ml Heptan sowie 1ml
4%igem Formaldehyd (in PBS) überführt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur
geschüttelt. Nach Ablauf der Zeit wurde die wäßrige (untere) Phase abgenommen und durch
1ml Methanol ersetzt. Danach wurden die Embryonen zur Entfernung der Vitillinmembran ca.
1 Minute gevortext und mehrmals mit Methanol gewaschen. Die so behandelten Embryonen
wurden in Methanol bei –20°C gelagert.
5.3.5 Antikörper-Färbungen
Die in Methanol gelagerten Embryonen wurden zweimal mit PBT gewaschen und dann für 1
Stunde mit 5% NGS-PBT geblockt. Nach Ablauf der Zeit wurde die Blocklösung entfernt und
durch die jeweiligen primären Antikörper (Tab. 2) in 5% NGS-PBT ersetzt. Die Inkubation
mit dem primären Antikörper erfolgte bei 4°C über Nacht. Zur Entfernung von nicht
gebundenen Antikörper wurden die Embryonen im Anschluß dreimal für 10 Minuten mit PBT
gewaschen. Danach wurden die Embryonen für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit dem
entsprechenden sekundären Antikörpern (Tab. 3) in 5% NGS-PBT inkubiert. Nach Ablauf der
Zeit wurde wiederum dreimal für 10 Minuten mit PBT gewaschen. Um eine gleichmäßige
Verteilung der Lösungen zu gewährleisten wurden alle Schritte unter gleichmäßigem
Schütteln durchgeführt.
Die gefärbten Embryonen wurden anschließend auf einen Objektträger überführt. Nach dem
Entfernen des überschüssigem PBTs, wurden die Embryonen in Vectashield eingebettet und
56
Material und Methoden
mit einem Deckglas überschichtet. Die fertigen Präparate wurden in speziellen Mappen bei
4°C gelagert.
5.3.6 Propidiumiodid-Färbungen
Um die DNA in den Embryonen sichtbar zu machen, wurden Propidiumiodid-Färbungen
durchgeführt. Da auch die RNA durch
Propidiumiodid angefärbt wird, wurden die
Embryonen während der Inkubation mit dem sekundären Antikörpers mit RNase
(Endkonzentration 200µg/µl) behandelt. Vor dem letzten Wasch-Schritt wurden die
Embryonen dann für 4 Minuten mit Propidiumiodid (1:1000) gefärbt. Im Anschluß daran
wurde zweimal für 10 Minuten mit PBT gewaschen. Die gefärbten Embryonen wurden dann
wie bei der normalen Antikörperfärbung eingebettet.
5.3.7 RNA-Injektion
Für die Injektion wurden 1,5 Stunden alte Wildtyp-Embryonen gesammelt und dechorioniert.
Etwa 180 dechorionierte Embryonen wurden unter dem Stereomikroskop auf einem
Agarblock aufgereiht. Dabei wurden die Embryonen so ausgerichtet, daß der anteriore Pol
nach außen zeigte. Anschließend wurden die Embryonen auf ein mit Heptankleber
präpariertes Deckglas überführt. Die aufgeklebten Embryonen wurden in einem mit Silicagel
gefüllten Exsikator getrocknet. Während des Trocknungsvorgangs wurde die Injektionsnadel
mit 0,5µl RNA-Lösung beladen und unter dem Mikroskop mit einer Präpariernadel
abgebrochen. Nach dem Trocknen wurde das Deckglas auf einem Objektträger montiert und
mit 10S-Voltaleföl überschichtet. Durch das Öl wurden die Embryonen transparenter und vor
dem Austrocknen geschützt. Die RNA wurde kurz vor der Zellularisierung in den posterioren
Pol von WT-Embryonen injiziert. Das Deckglas mit den injizierten Embryonen wurde dann
auf eine Apfelsaft-Agar-Platte gelegt und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach Ablauf der Zeit wurde das Voltaleföl entfernt und die Embryonen mit Heptan vom
Deckglas gelöst. Die gelösten Embryonen wurden dann in ein Glasfläschchen mit 1ml Heptan
sowie 1ml 6%igem Formaldehyd in PBT überführt und für 20 Minuten bei RT inkubiert.
Anschließend wurden die Embryonen auf ein kleines Sieb überführt und mehrmals mit PBS
gewaschen. Danach wurde die überschüssige Flüssigkeit entfernt und die Embryonen
vorsichtig auf ein Stück doppelseitiges Klebeband überführt. Das doppelseitiges Klebeband
wurde dann mit der anderen Seite in eine Petrischale geklebt und mit PBS überschichtet.
57
Material und Methoden
Unter dem Stereomikroskop wurden die Embryonen mit einer 27G-Nadel vorsichtig aus der
Vitellinmembran befreit. Die devitellinisierten Embryonen wurden dann mit PBT
überschichtet und in ein Eppendorf-Gefäß überführt. Die Embryonen wurden entweder direkt
gefärbt oder in Methanol aufgenommen und bei –20°C gelagert.
5.3.8 Hestellung transgener Fliegen
Für die Herstellung der transgenen Fliegenlinien wurde die P-Element-Insertions-Methode
nach Rubin und Spradling verwendet (Rubin und Spradling 1982). P-Elemente sind mobile
genetische
Elemente
die
natürlicherweise
in
Drosophila
vorkommen.
Der
Transpositionsvorgang wird von dem Enzym Transposase vermittelt, welches die auf den PElement
enthalten
Inverted
Repeats
(P-IR)
erkennt
und
zusammen
mit
dem
dazwischenliegenden DNA-Abschnitt in das Genom integriert. Für die Transformation von
Drosophila verwendet man zwei modifizierte P-Elemente, ein sogenanntes Carrier-P-Element
und ein Helfer-P-Element. Beide P-Elemente werden mittels Mikroinjektion
in die sich
-
bildenden Keimzellen von white Embryonen eingebracht. Das Carrier-P-Element enthält
neben des zu transformierenden DNA-Abschnitts auch noch das white+ Gen, welches als
Marker dient. Da unkontrollierte Bewegungen von P-Elementen zu genomischer Instabilität
führen können, wurde die Transposase des Carrier-P-Elements entfernt. Das Helfer-PElement besitzt keine P-IR-Sequenzen und wird deshalb nicht in das Genom integriert, was
dazu führt, daß die für den Transpositionsvorgang notwendige Transposase nur transient
exprimiert wird. Bei der Transformation der Rca1-Konstrukte wurde der an das UAS/Gal4System angepaßte pUASp-Vektor als Carrier-P-Element verwendet (Rorth 1998). Als HelferP-Element kam das Plasmid ∆2,3 zum Einsatz (Rio und Rubin 1985).
Für die Injektion wurden 30 Minuten alte white--Embryonen gesammelt und dechorioniert.
Etwa 80 dechorionierte Embryonen wurden unter dem Stereomikroskop auf einem Agarblock
aufgereiht. Dabei wurden die Embryonen so ausgerichtet, daß der anteriore Pol nach außen
zeigte. Anschließend wurden die Embryonen auf ein mit Heptankleber präpariertes Deckglas
überführt. Die aufgeklebten Embryonen wurden in einem mit Silicagel gefüllten Exsikator
getrocknet. Während des Trocknungsvorgangs wurde die Injektionsnadel mit 1µl
Injektionsmix beladen und unter dem Mikroskop mit einer Präpariernadel abgebrochen. Der
Injektionsmix enthielt den pUASP-Vektor in einer Konzentration von 400ng/µl sowie das
58
Material und Methoden
Plasmid ∆2,3 in einer Konzentration von 100ng/µl. Nach dem Trocknen wurde das Deckglas
auf einem Objektträger montiert und mit 10S-Voltaleföl überschichtet. Durch das Öl wurden
die Embryonen transparenter und vor dem Austrocknen geschützt. Die Injektion erfolgte in
den posterioren Pol kurz vor der Bildung der Polzellen. Ingesamt wurden pro Konstrukt etwa
800 Embryonen injiziert. Das Deckglas mit den injizierten Embryonen wurde dann in eine
Petrischale gelegt und mit 3S-Voltaleföl überschichtet. Die Petrischale wurde bis zum
Schlüpfen der Larven in eine feuchte Kammer gelegt und bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach etwa 24 Stunden wurden die geschlüpften Larven in ein Futteröhrchen mit Bäckerhefe
transferiert.
Nach etwa 8-9 Tagen hatten sich aus den Larven Fliegen entwickelt, die dann gegen den
Balancer-Stamm (F-232) gekreuzt wurden. Die Identifizierung positiver Transformanten unter
den Nachkommen erfolgte anhand der roten Augen. Die rotäugigen Fliegen wurden dann ein
weiteres Mal gegen den Balancer-Stamm (F-232) gekreuzt. Diese Kreuzung diente zur
Kartierung der P-Element-Insertionen. Zur Etablierung stabiler Linien wurden die kartierten
Fliegen untereinander gekreuzt.
5.3.9 Das UAS/Gal4-System
Für die Expression der Rca1-Konstrukte wurde das UAS/Gal4-System nach Brand und
Perrimon verwendet (Brand und Perrimon 1993). Dieses System besteht aus zwei
Komponenten, einer Gal4-Linie und einer UAS-Linie. In der Gal4-Linie wird der aus der
Hefe stammende Transkriptionsfaktor Gal4 unter der Kontrolle eines bestimmten Promotors
exprimiert. Die UAS-Linie enthält die upstream activator sequence (UAS) des Gal4-Genes
mit einen basalen Promotor, hinter den das zu exprimierende Konstrukt kloniert wird. Kreuzt
man Gal4 und UAS-Linie, wird in den Nachkommen dieser Fliegen das Konstrukt exprimiert,
welches hinter die UAS-Sequenz kloniert wurde. Der modulare Aufbau des UAS/Gal4Systems hat den Vorteil, daß das zu analysierende Protein, durch die Verwendung
verschiedener Promotoren in den Gal4-Linien, zu unterschiedlichen Zeiten oder
gewebespezifisch exprimiert werden kann.
59
Abkürzungen
6 Abkürzungen
Abb.
Amp
ATP
BDT
c
CIP
DNA
DNase
dNTPs
DTT
EDTA
F
g
h
k
kb
l
LB
m
µ
min
mol
mRNA
n
OD
p
PBS
PBT
RNA
RNase
RT
sec
Tab.
Tet
Tris
U
Upm
UV
V
x
%
°C
Abbildung
Ampicillin
Adenosintriphosphat
Big Dye Terminator
centi
calf intestinal Phosphatase
Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonuklease
Desoxyribonukleotidtriphosphate
Dithiotreitol
Ethylendiamintetraessigsäure
Farad
Gramm
Stunden
kilo
Kilobasenpaare
Liter
Luria-Bertrani
mili
mikro
Minute
molar
Boten-RNA
nano
optische Dichte
pico
phosphate buffered saline
PBS mit 0,1% Tween-20
Ribonukleinsäure
Ribonuklease
Raumtemperatur
Sekunde
Tabelle
Tetracycline
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Unit
Umdrehungen pro Minute
ultraviolettes Licht
Volt
-fach
Prozent
Grad Celsius
60
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7 Literatur
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Literatur
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64
Erklärung:
Hiermit erkläre ich, daß ich die vorliegende Arbeit und die ihr zugrunde liegenden
Experimente selbständig angefertigt und keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel und
Quellen verwendet habe. Ich versichere, daß diese Arbeit noch keiner anderen Fakultät oder
Universität zur Prüfung vorgelegen hat.
Diese Diplomarbeit wurde am Institut für Genetik der Universität zu Köln von Herr PD. Dr.
Frank Sprenger betreut.
Norman Zielke
Köln, September 2002
65