Die Institute Institut für Stammzellforschung

Die Institute
Institut für Stammzellforschung
Institute of Stem Cell Research
Neuherberg
(Direktorin / Director: Prof. Dr. Magdalena Götz)
as ISF untersucht die grundlegenden
molekularen und zellulären Mechanismen der Stammzellerhaltung (Selbsterneuerung) und Stammzelldifferenzierung.
Dies erfolgt an Hand dreier verschiedener
Stammzelltypen aus allen drei Keimblättern,
den neuralen Stammzellen (Ektoderm), den
hämatopoietischen Stammzellen (Mesoderm) und den Stammzellen des Entoderms.
Anhand dieser verschiedenen Stammzellsysteme wurden dieses Jahr besondere
Fortschritte bezüglich der Identifizierung
von Kandidatengenen, die eine Rolle für die
Selbsterneuerung von Stammzellen des
Blutes spielen könnten, als auch von Kandidatengenen für die Entodermentwicklung
erzielt. Zudem konnten wir dieses Jahr die
zentrale Funktion von Transkriptionsfaktoren
neuraler Stammzellen belegen, die es diesen erlauben, auch im adulten läsionierten
Gehirn noch neue Nervenzellen zu generieren. Hier erwies sich die komplementäre
Hemmung der Transkriptionsfaktoren Olig2
und Pax6 als entscheidend, um auch nach
Gehirnverletzungen im Mausmodell wieder
neue Nervenzellen bilden zu können.
Das ISF ist Teil der Programmes ‚Genomforschung’ der Helmholtz-Gemeinschaft und
trägt die funktionelle Genomik der Stammzellspezifizierung und Differenzierung zu
diesem Programm bei. Interaktionen bestehen mit dem Institut für Entwicklungsgenetik bezüglich der Differenzierung von neuralen Stammzellen in dopaminerge Neurone,
der Identifikation von neuen Genen, die
asymmetrische Zellteilung regulieren mittels
Genetrap, und der Funktion der Paired
Domäne des Transkriptionsfaktors Pax6 für
die neuronale Differenzierung (Haubst et al.,
2004). Die Arbeitsgruppe von Frau Dr. Bally-
D
he Institute of Stem Cell Research
addresses the basic molecular and
cellular mechanisms of stem cell
self-renewal and differentiation by using
complementary experimental approaches
with stem cells from all three germ layers,
neural, haematopoietic and endodermal.
This year we made particular progress in
the identification of candidate genes for the
regulation of endoderm development and
haematopoietic stem cell self-renewal.
We were also able to demonstrate at the
functional level that the transcription factor
Pax6 is both necessary and sufficient to
instruct neural stem cells to generate new
nerve cells (neurogenesis) in injured adult
brain. The complementary inhibition of the
transcription factors Olig2 (which is upregulated after injury) and Pax6 is decisive
in enabling neurogenesis following brain
injury in the cerebral cortex of adult mice.
These results indicate a novel approach for
instructing endogenous glial cells to react
to brain injury with neuronal repair.
Research in the Institute is integrated into
the HGF programme on ‘Comparative
Genomics’ to which it contributes the
work on regulation and differentiation of
stem cells. The Institute interacts with the
Institute of Developmental Genetics (IDG)
on the differentiation of neural stem cells in
dopaminergic neurons, the identification of
new genes that regulate asymmetric cell
division using gene trap technology and
the function of the paired domain of the
transcription factor Pax6 in neuronal
differentiation (Haubst et al., 2004).
The IDG research group led by Dr. Bally-Cuif
collaborates with the ISF on investigations
into the mechanisms of adult neurogenesis
T
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Cuif untersucht in Zusammenarbeit mit dem
ISF Mechanismen der adulten Neurogenese
beim Zebrafisch, einem ausgezeichneten
Regenerationsmodell. Enge Zusammenarbeit besteht auch mit dem Institut für Experimentelle Genetik bezüglich des Notch/DeltaSignalweges bei der neuralen Stammzelldifferenzierung und verschiedenen Mikroarrayanalysen von neuralen Stammzellen.
Die Funktion der Homeodomäne des Transkriptionsfaktors Pax6 wird in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Jack Favor am Institut für
Humangenetik untersucht.
Das ISF ist Teil des Programmes ,Funktionelle Genomik‘. Leitende Mitarbeiter sind M.
Götz, H. Lickert und T. Schroeder.
Da das Institut im Jahr 2004 gegründet
wurde, hat sich die Anzahl der Mitarbeiter
erst im Laufe des Jahres erhöht. Zum Abschluss 2005 waren am Institut 11 Wissenschaftler/innen, 12 Doktoranden/innen,
4 Gastwissenschaftler und 8 technische
Mitarbeiter/innen beschäftigt. Frau Dr. Andrea Wizenmann ist die stellvertretende
Institutsleiterin.
Neurale Stammzellen
M. Götz
Ziel unserer Arbeiten ist es, grundlegende
Mechanismen der Spezifizierung von neuralen Stammzellen und ihrer Nachkommen so
gut zu verstehen, dass Stammzellen gezielt
zur regenerativen Therapie eingesetzt werden können. Diesem Ziel sind wir mit zwei
Schlüsselarbeiten dieses Jahr entscheidend
näher gekommen.
Im ausgewachsenen Gehirn von Säugern,
inklusive des Menschen, findet fast keine
Neubildung von Nervenzellen mehr statt,
mit Ausnahme zweier kleiner Bereiche des
Vorderhirns, dem Riechkolben und dem
Hippocampus. Unsere Arbeiten haben nun
im Mausmodell herausgefunden, dass der
Transkriptionsfaktor Pax6 für die Fähigkeit,
neue Nervenzellen zu bilden, eine wesent-
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in zebrafish, a superb regeneration model.
There is also close cooperation with the
Institute of Experimental Genetics on the
Notch-Delta signal pathway in neural stem
cell differentiation and various microarray
analyses for neural stem cells. The function
of homeo domains of the transcription
factor Pax6 is investigated together with
Dr. Jack Favor of the Institute of Human
Genetics.
The Institute of Stem Cell Research
is a part of the programme on Functional
Genomics. The Senior Scientists are M.
Götz, H. Lickert and T. Schroeder.
The Institute was founded in 2004 and the
number of people involved in the research
increased over the year. At the end of 2005
there were 11 scientists, 12 postgraduate
students, 4 visiting scientists, and 8 technicians at the Institute. Dr. Andrea
Wizenmann is the Deputy Director.
liche Rolle spielt. Nachdem wir letztes Jahr
nachweisen konnten, dass Pax6 genau in
dem Bereich, in dem noch zeitlebens die
Neubildung von Nervenzellen fortgesetzt
wird, in neuronalen Vorläuferzellen exprimiert ist – nicht aber in anderen Regionen
des Gehirns (Hack et al., 2004) –, konnten
wir dieses Jahr die Funktion von Pax6 in
diesen Zellen klären. Virale Vektoren, die
Pax6 enthalten oder seine Funktion blockieren, wurden in die Region des Vorderhirns injieziert, in der adulte neurale Stammzellen lokalisiert sind. Sie bilden über einen
Stammbaum verschiedener weiter spezialisierter Vorläuferzellen zeitlebens bestimmte
Nervenzellen des Riechkolbens. Die virale
Transfektion ermöglicht es, die Nachkommen der manipulierten Vorläuferzellen in
einer anderweitig nicht veränderten Umgebung und damit die zell-autonome Funktion
des Transkriptionsfaktors Pax6 zu untersu-
Die Institute
Abb. 1: In dem linken panel ist die Pax6-Immunfärbung ausschließlich in der äußeren Schicht
(GL = glomerular layer), aber kaum in der inneren Schicht (granule cell layer = GCL) des Riechkolbens
gezeigt. Nur in der äußeren Schicht befinden sich dopaminerge Neurone und tatsächlich ist Pax6 in
dopaminergen Neuronen vorhanden, wie rechts oben in der Doppelfärbung von Pax6-Immunfärbung
(grün) mit dem Marker für dopaminerge Neurone, die Tyrosine-hydroxylase (TH-Immunfärbung in rot)
gezeigt ist. Pax6 ist tatsächlich in der Lage, die vermehrte Bildung von TH-immunopositiven Neuronen
zu instruieren, wie in der Abbildung rechts unten gezeigt ist (Pax6 wurde mit einem viralen Vektor
transduziert, der Pax6 und GFP, das hier nachgewiesen ist, enthält) (siehe Hack et al., 2005).
chen. Diese funktionellen Untersuchungen
zeigten eindeutig, dass die Blockade der
Funktion von Pax6 die Neubildung von
Nervenzellen des Riechkolbens vollständig
blockiert (Hack et al., 2005). Umgekehrt
brachten zusätzliche Mengen des Transkriptionsfaktors Pax6 die Vorläuferzellen dazu,
verstärkt in Nervenzellen zu differenzieren
(Hack et al., 2005). Interessanterweise reguliert Pax6 zudem in einem späteren Differenzierungsstadium der Nervenzellen deren
spezielle neurochemische Eigenschaften,
nämlich welchen chemischen Überträgerstoff diese Zellen benutzen, um mit anderen
Nervenzellen zu kommunizieren. Bleibt Pax6
auch während diesem späteren Differenzierungsstadium vorhanden, entwickeln die
Nervenzellen den Überträgerstoff Dopamin
(Abb. 1; Hack et al., 2005). Diese Untersuchungen haben also zum ersten Mal einen
molekularen Mechanismus aufgezeigt, wie
auch im ausgewachsenen Gehirn von Säugern dopaminerge Nervenzellen neu gebildet werden. Die mögliche klinische Relevanz
dieser Ergebnisse besteht darin, dass bei
Parkinson-Patienten speziell dopaminerge
Nervenzellen absterben, allerdings in einem
anderen Teil des Gehirns.
Wir konnten in diesen Untersuchungen
zudem auch einen molekularen Gegenspieler von Pax6 identifizieren, den Transkriptionsfaktor Olig2. Olig2 hemmt die Neurogenese und hält einerseits die Vorläuferzellen
in einem undifferenzierten Zustand, fördert
andererseits aber auch die Bildung von
Oligodendrozyten (Hack et al., 2005), einer
wichtigen Klasse von Gliazellen. Zu unserer
großen Überraschung wird genau dieser
Transkriptionsfaktor Olig2 nach Gehirnverletzungen verschiedener Art (Stichverletzung,
Hirnschlag, Neurodegeneration) in Gliazellen verschiedenster Gehirnregionen, die alle
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Abb. 2: Diese Abbildung
zeigt ein junges Neuron,
erkenntlich an der
doublecortin (DCX)Immunreaktivität, das
nach Verletzung des
GFP
Gehirns (cerebraler
DCX
Cortex) aus einer Gliazelle hervorging, die mit
einem viralen Vektor
infiziert wurde, der zur
Expression von Pax6
und GFP führt. Diese
Ergebnisse zeigten zum
ersten Mal, daß endogene Zellen im erwachsenen Gehirn von Säugern
nach einem schweren
Hirntrauma in der Lage
sind, neue Nervenzellen zu bilden – allerdings nur
nach Überexpression von Pax6. (siehe Buffo et
al., 2005)
keine Neurone mehr bilden können, hochreguliert (Abb. 2; Buffo et al., 2005). Tatsächlich ist es durch Blockade dieses Transkriptionsfaktors gelungen, die Neubildung von
Nervenzellen nach Gehirnverletzungen in
diesen Regionen wieder zu ermöglichen
(Buffo et al., 2005). Diese Versuche zeigen
also, dass es prinzipiell auch im ausgewachsenen Gehirn von Säugetieren möglich ist,
abgestorbene Nervenzellen endogen wieder
zu ersetzen, eine hoffnungsvolle Aussicht
für viele neurologische Erkrankungen, die
bislang praktisch nicht behandelt werden
können. Es bleibt aber noch viel zu tun, da
die meisten der neu gebildeten Nervenzellen in einem unreifen Stadium verbleiben,
und viele auch wieder absterben.
Molekulare Kontrolle hämatopoetischer Schicksalsentscheidungen
T. Schroeder
Das hämatopoetische System ist eines der
aktivsten regenerativen Systeme des
menschlichen Körpers. Während des gesamten Lebens müssen permanent große
Mengen an Blutzellen durch Proliferation
und Differenzierung hämatopoetischer
Stammzellen neu hergestellt werden. Deren
enormes therapeutisches Potential zeigt sich
beispielsweise bei ihrer erfolgreichen An-
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wendung für Knochenmarkstransplantationen. Gleichzeitig kann die Fehlregulation
ihres Verhaltens aber auch zu schwerwiegenden Krankheiten wie z.B. Leukämien
führen. Ziel unserer Arbeiten ist es, zu verstehen, wie das Verhalten von Blutzellen
molekular gesteuert wird.
Um die Funktion von z.B. Genen oder
Zytokinen exakt analysieren zu können, sind
Methoden zur genauen Beobachtung ihrer
Effekte auf das Verhalten von Blutzellen notwendig. Wir haben daher neuartige Mikroskopie- und Bildverarbeitungsverfahren entwickelt, die es erlauben, das Verhalten von
Blutzellen über lange Zeiträume auf Einzelzellebene zu verfolgen. Dazu werden neue
Stammzellisolationsverfahren, Mikroskopietechniken, Inkubationsmethoden, und transgene Mauslinien kombiniert. Zusätzlich wurden computergestützte Ansätze zur Herstellung mikroskopischer Zeitrafferaufnahmen
verbessert und neue Programme zur Auswertung dieser Aufnahmen entwickelt. Um
die nicht-invasive Detektion von Linienentscheidungen der beobachteten Blutzellen
zu ermöglichen, liegen in unserem Labor
mehrere transgene Mauslinien vor, welche
unterschiedliche Fluoreszenzproteine spezifisch in Zellen bestimmter Arten von Blutzellen exprimieren. Momentan werden zusätzlich zu den bereits vorhandenen Linien
weitere transgene Mauslinien hergestellt,
mit dem Ziel, möglichst viele Blutlinien einer
Maus gleichzeitig nicht-invasiv im Mikroskop
unterscheiden zu können.
Wir verwenden diese neuen Technologien,
um die Funktion von Genen zu bestimmen,
welche als Regulatoren von Stammzellschicksalen im Blutsystem vermutet werden. Besonderes Interesse liegt dabei auf
Genen, welche bei der Steuerung asymmetrischer Zellteilung beteiligt sein könnten.
Dazu wurde die Expression von verschiedensten Kandidatengenen in murinen Blutstammzellen untersucht. Diese Kandidatengene wurden auf Grund ihrer Funktion bei
der molekularen Steuerung der asymmetrischen Zellteilung in anderen biologischen
Systemen, z.B. im Wurm C. elegans, oder
der Fliege D. melanogaster ausgewählt. Für
einige dieser Kandidatengene konnte gezeigt werden, dass sie auch von Blutstammzellen exprimiert werden, und daher auch in
Entwicklung des Entoderm
in der Maus
H. Lickert
Ziel unserer Arbeit ist es, die frühe Entodermentwicklung und die Entstehung der
entoderm-abgeleiteten Organe (Pankreas,
Leber und Lunge) zu verstehen. Dieses soll
einerseits ermöglichen, spezialisierte Zellen
dieser Organe, wie z.B. die Insulin-produzierenden β-Zellen des Pankreas für regenerative Stammzelltherapien zu differenzieren.
Andererseits dient unsere Arbeit auch als
Grundlage für die Identifizierung von Genen
und Ursachen genetisch bedingter Krankheiten der entodermalen Organe.
Hierfür versuchen wir die Entodermentwicklung im Tiermodellsystem Maus in
Echtzeit zu beobachten. Ein statisches
Embryokultursystem in Kombination mit
4D-Zeitrafferaufnahmen am konfokalen
Mikroskop wurde diesbezüglich etabliert.
Die genetische Fluoreszenzmarkierung von
entodermalen Vorläuferzellen soll uns er-
möglichen, die Differenzierung und Morphogenese im Entoderm zu analysieren. Für
eine detailierte Analyse der Entodermentwicklung ist es entscheidend, genügend
spezifische Markergene zu identifizieren.
Deshalb haben wir systematisch begonnen,
nach neuen Genen in der Entodermentwicklung zu suchen. Hierfür erstellen wir genomweit Expressionsprofile von normalen
Mausembryonen und solchen mit abnormaler Entodermentwicklung und werten diese
bioinformatisch aus (Lickert et al., 2005).
Dies dient dann als Ausgangspunkt für die
Suche nach Genen mit einer spezifischen
mRNA-Expression im embryonalen Entoderm. Dieses Jahr ist es uns gelungen, über
250 Kandidatengene auf diese Weise zu
analysieren. Interessanterweise zeigen bereits 12 dieser Gene spezifische Expression
in Regionen des Entoderms oder für die
Entwicklung des Entoderms entscheidenden
embryonalen Organisatorstrukturen.
Um diese Kandidatengene nun funktionell
zu untersuchen, haben wir eine neue Methode der transgenen RNA-Interferenz (RNAi)vermittelten Geninaktivierung etabliert
(Lickert et al., 2005; Tanaka et al., 2005).
Diese Methode ermöglich es Gene in embryonalen Stammzellen (ES-Zelle) zu inaktivieren. Mittels tetraploider Komplementationstechnologie können direkt aus den ESZellen Embryonen generiert werden, ohne
die ES-Zellen durch die Keimbahn schleusen
zu müssen, wie es beim Gen knock-out
üblich ist. Dies macht die sonst mühsame
Genfunktionsanalyse sehr schnell und ökonomisch, wodurch die Auswahl der interessanten Kandidatengene erleichtert wird.
Um die funktionelle Charakteriserung der
identifizierten Kandidatengene mit alternativen Strategien voran zu treiben, nutzen wir
die Resourcen an der GSF in Form des
German Genetrap Konsortiums und anderer
weltweiter Genetrapkonsortien. Der Genetrap (dt.: Genfalle) ist eine Form der Mutagenisierung von Genen in der ES-Zelle.
Hierbei werden Gentrapvektoren zufällig ins
Mausgenom integriert und die betroffenen
Gene können so identifiziert werden. Einige
unserer Entodermkandidatengene wurden
mit dieser Methode in der ES-Zelle mutagenisiert. Um die Folgen der Mutation und
darausfolgend die Funktion der Gene in vivo
Die Institute
diesen an der Steuerung asymmetrischer
Zellteilung beteiligt sein könnten.
Zusätzlich untersuchen wir die Entstehung
von Blutstammzellen aus ihren mesodermalen Vorläufern während der Embryonalentwicklung. Als Modellsystem wird dazu die
Differenzierung muriner embryonaler
Stammzellen verwendet, welche in vitro zu
Blutzellen differenziert werden. Durch Anwendung einer Kombination mesodermaler
in vitro Differenzierung von murinen embryonalen Stammzellen, Anreicherung definierter Vorläuferpopulationen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und neuer
Bioimaging Verfahren, konnten wir dabei
Vorgänge beobachten, welche während der
normalen Entwicklung im Embryo nicht
sichtbar sind und auf die Herstellung von
Blutzellen aus Endothelzellen hinweisen.
Ein besseres Verständnis der untersuchten
Vorgänge wird helfen, sowohl die Eigenschaften adulter Blutstammzellen besser zu
verstehen, als auch die therapeutisch viel
versprechende Herstellung von Blutzellen
aus embryonalen Stammzellen in vitro zu
optimieren.
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studieren zu können etablieren wir derzeit
Mausmodelle für diese Kandidatengene.
Aufgrund der Tatsache, dass das X-Chromosom eine überdurchschnittlich hohe
Dichte an Krankheitsgenen kodiert (unter
den derzeit identifizierten Genen > 15% im
Menschen), versuchen wir neue Krankheitsgene auf diesem Chromosom zu identifizieren. Hierbei suchen wir systematisch nach
hemizygot embryonalen Phänotypen, d.h.
Mutationen in einem der 1098 Gene auf
dem X-Chromosom, bei denen die 27 Gene
auf dem Y-Chromosom nicht kompensieren
können. Hierbei konnten wir vor kurzem
einen embryonal lethalen Phänotyp für eine
hemizygote Mutation im Drosophila Homolog des Tumorsuppressorproteins Disc large
identifizieren. Diese Mausmutanten arrestieren am Tag neun der Embryonalentwicklung
und zeigen eine nahezu komplette Deletion
des Vorderhirns. Dies ist möglicherweise auf
ein Ausbleiben der Signale des Entoderms
auf die Entwicklung des Nervensystems
zurückzuführen. Interessanterweise führen
Punktmutationen dieses Gens im Menschen
zu einer X-Chromosom-gekoppelten mentalen Retardation. Dieses Projekt ist eine
Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von
Prof. Wolfgang Wurst am Institut für Entwicklungsgenetik (IDG) der GSF.
"
"
Zusammenarbeit
Nationale und Internationale Zusammenarbeiten
Sind national weitgehend in das Schwerpunktprogramm
SP1109 zum Thema Stammzellforschung integriert und
existieren mit vielen international führenden Instituten
weltweit, u.a. RIKEN Entwicklungsbiologie, Kobe, Japan;
Terry Fox Laboratories, Vancouver, Kanada; Albert
Einstein College of Medicine, New York, USA; NIMR,
London, UK; Institut Pasteur, Paris, Frankreich.
"
Sonderfinanzierte Vorhaben
Emmy Noether-Programm: ,Analyse der Entodermentwicklung in der Maus’
SPP 1109: ‚Pax6 in neuralen Stammzellen’
SPP 1172: ‚Gliazellen bei der Integration neu generierter
Neurone im adulten Nervensystem’
BMBF-Netzwerk ‚Stammzell-basierte Regeneration nach
Schlaganfall’
238 " GSF
Ausgewählte Veröffentlichungen
Buffo, A., Vosko, M.R., Ertürk, D., Hamann, G., Jucker, M.,
Rowitch, D. and Götz, M. (2005). Expression pattern of
the transcription factor Olig2 in response to brain injuries
– implications for neuronal repair. PNAS (2005)
Czuchra, A., Wu, X., Meyer, H., van Hengel, J.,
Schroeder, T., Rottner, K. and Brakebusch, C.:
Cdc42 is not essential for filopodium formation, directed
migration, cell polarization and mitosis in fibroblastoid
cells. Molecular Biology of the Cell 16: 4473 – 4484 (2005)
Hack, M.A., Saghatelyan, A., de Chevigny, A., Lledo, P.-M.
and Götz, M. Neuronal fate determinants of adult olfactory
bulb neurogenesis. Nature Neuroscience 7: 865-872
(2005)
Lickert, H., Cox B., Taketo, M.M., Wehrle, C., Kemler, R.
and Rossant, J. (2005). Dissecting Wnt/b-catenin signaling during gastrulation using RNA interference in mouse
embryos. Development 132:2599-2609
Tanaka, S.S., Yamaguchi, Y.L., Tsoi, B., Lickert, H. and
Tam, P.L. (2005). IFITM/Mil/Fragilis family proteins IFITM1
and IFITM3 play distinct roles in mouse primordial germ
cells. Dev. Cell 9(6): 745-756