TEB Mikroskopie von Bakterien
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Mikroskopie von Bakterien TEB Themen Bakterien, Sterilität, Mikroskop, Färbung. Prinzip Die mikroskopische Untersuchung von Mikroorganismen kann im Lebendpräparat oder in fixierten und gefärbten Präparaten erfolgen. Lebendpräparate von Mikroorganismen werden in einem Tropfen Wasser (oder gegebenenfalls Kulturflüssigkeit) hergestellt. Die Färbung von Bakterienpräparaten dient der Kontraststeigerung zwischen den Bakterien und ihrer Umgebung, von der sie sich in ungefärbtem Zustand nur sehr wenig abheben. Material 1 Kulturgefäß 1 Schere, l = 140 mm, Spitze rund 64834-00 1 Becherglas DURAN®, 100 ml 1 Objektträger, 50 Stück 36002-00 64625-00 64691-00 1 Deckgläser 18 mm x 18 mm, 50 Stück 64685-00 1 Ausstrichöse mit Halter, l = 230 mm 64936-00 1 Wasser, destilliert 5 l 1 Immersionsöl 50 ml Glasrührstab, Boro 3.3, l = 300 mm, 10 d = 7 mm Sicherheits-Gasschlauch, DVGW , 1 lfd. Meter 31246-81 31381-05 40485-05 39281-10 Bunsenbrenner mit Hahn, für Erdgas, 32167-05 Standard 1 SWIFT Schülermikroskop M3602C-3 63021-99 1 1 Pinzette nach Kühne 1 Petrischale d = 200 mm, Glas 64726-00 1 Messzylinder 100 ml, BORO 3.3 Filtrierpapier 580 mm x 580 mm, 10 1 Stück 1 Karbolfuchsinlösung 100 ml 36629-00 1 Entellan für Mikroskopie, 100 ml 1 Ethanol absolut, reinst 500 ml 31294-10 1 Methylenblau B,f.Mikrosk. 25 g 31567-04 64796-00 32976-03 31463-10 30008-50 Abb. 1: Färbung von Bakterienpräparaten. www.phywe.com P4140300 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG © All rights reserved 1 TEB Mikroskopie von Bakterien Aufgaben Mikroskopieren Sie ein Bakterienpräparat mit den hier beschriebenen Standard-Methoden. Durchführung Die Beschaffung von Mikroorganismen für mikroskopische Untersuchungen Eine rasche Beschaffungsmöglichkeit für Mikroorganismen zu mikroskopischen Untersuchungen, um zum Beispiel die verschiedenen Formen von Bakterien, vorhandene oder fehlende Eigenbewegung, die Bildung von Sporen usw. im lebenden oder fixierten und gefärbten Präparat erkennen und beobachten zu können, ist ein Aufguss von Pflanzenteilen. Man übergießt eine Handvoll Gras, Heu oder Salatblätter in einem Kulturgefäß mit Leitungswasser und lässt diesen Aufguss bei Zimmertemperatur unbedeckt stehen. Das Wasser soll einige Zentimeter über den Pflanzenteilen stehen, das Kulturgefäß zu etwa drei Vierteln gefüllt Abb. 2: Heuaufguss im Glas. sein (Abb. 2). Zu große, sperrige Pflanzenteile sind gegebenenfalls zu zerkleinern. Innerhalb von drei bis fünf Tagen bildet sich an der Flüssigkeitsoberfläche eine sogenannte Kahmhaut. Sie besteht zunächst nur aus Bakterien. Später, nach ein bis zwei Wochen, treten neben Protozoen (vorwiegend Ciliaten) auch verschiedene Arten von mikroskopischen Pilzen auf. Die Kahmhaut kommt dadurch zustande, dass die in das Kulturgefäß eingebrachten Pflanzenteile mit Mikroorganismen und deren Sporen infiziert sind, die sich unter den durch das Übergießen mit Wasser entstandenen sehr günstigen Kulturbedingungen rasch vermehren. Sie wachsen in Form der Kahmhaut, da es sich vorwiegend um aerobe Arten handelt, die sich nur bei ausreichendem Sauerstoffpartialdruck entwickeln. An der Flüssigkeitsoberfläche ist der Sauerstoffgehalt am größten. Die Beobachtung von Mikroorganismen im Lebendpräparat Man überträgt einen Wassertropfen auf einen Objektträger. Mit einer in der Flamme eines Gasbrenners ausgeglühten und wieder abgekühlten Ausstrichöse wird etwas von den zu untersuchenden Mikroorganismen - zum Beispiel von der Kahmhaut eines Aufgusses von Pflanzenteilen oder von einer Kolonie auf einer bewachsenen Petrischale - entnommen und in dem Wassertropfen vorsichtig verrührt (Abb. 3). Um im Präparat keine geschlossene, vollständig von dicht aneinander liegenden Mikroorganismen Abb. 3: Aufbringen der Bakterien auf einen Objektträger. bedeckte Fläche zu bekommen, in der Einzelheiten nur schwer zu erkennen sind, darf nicht zu viel Untersuchungsmaterial verrührt werden. Im Wassertropfen soll nur eine ganz schwache milchige Trübung entstehen, was sich leicht kontrollieren lässt, wenn man den Objektträger auf eine dunkle Unterlage legt. Die Ausstrichöse wird zur Säuberung und Sterilisation sofort wieder in der Flamme eines Gasbrenners bis zur hellen Rotglut ausgeglüht. Das Präparat wird mit einem Deckglas bedeckt, bei 50facher mikroskopischer Vergrößerung (Objektiv 10x, Okular 5x) eingestellt und, je nach der Größe der Objekte, bei 400- und 1000facher Vergrößerung untersucht (Objektiv 40x bzw. 100x, Okular 10x). In vielen Fällen sind aber auch Bakterienzellen so 2 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG © All rights reserved P4140300 Mikroskopie von Bakterien TEB groß, dass die Verwendung eines Immersionsobjektives nicht erforderlich ist. Mikroorganismen, die in einer Nährlösung verteilt sind, werden im Allgemeinen mit dieser, ohne Verwendung eines Wassertropfens, auf einen Objektträger gebracht und mit einem Deckglas bedeckt. Ungefärbte Lebendpräparate von Mikroorganismen sind verhältnismäßig kontrastarm. Die Zellen oder Zeltverbände heben sich nur wenig von ihrer Umgebung ab. Durch Schließen der Irisblende des Beleuchtungsapparates am Mikroskop bis etwa zur Hälfte oder zu zwei Dritteln kann der Kontrast im Präparat gesteigert werden. Die Fixierung von Bakterienpräparaten Bei den meisten Bakterienarten sind fast alle Innenstrukturen so klein, dass sie im Lichtmikroskop nicht mehr aufgelöst werden und infolgedessen auch nicht gesehen werden können. Man nimmt daher im Allgemeinen bei der Fixierung von Bakterienpräparaten auf die Erhaltung der Innenstruktur der Zellen keine Rücksicht und fixiert durch HitzeAbb. 4: Fixierung von Bakterienpräparaten. einwirkung. Man entnimmt mit einer in der Flamme eines Gasbrenners ausgeglühten und wieder abgekühlten Ausstrichöse etwas Bakterienmasse, zum Beispiel von der Kahmhaut eines Aufgusses von Pflanzenteilen, und verrührt sie möglichst gleichmäßig in einem Wassertropfen auf einem Objektträger. Die Menge der verrührten Bakterienmasse ist dann richtig gewählt, wenn der Wassertropfen bei Betrachtung über einem dunklen Untergrund eine leichte milchige Trübung zeigt. Die Ausstrichöse wird zur Säuberung und Sterilisation sofort wieder in der Flamme eines Gasbrenners bis zur hellen Rotglut ausgeglüht. Nachdem das Präparat an der Luft vollständig eingetrocknet ist, zieht man den Objektträger mit der Schichtseite nach oben im Abstand von jeweils etwa einer Sekunde dreimal kurz durch die nicht leuchtende und nicht prasselnde Flamme eines Gasbrenners (Abb. 4). Auf dem Objektträger entsteht dabei eine Temperatur von etwa 120°C, wodurch die Bakterienzellen ohne Veränderung ihrer äußeren Form abgetötet, das heißt fixiert, und auf dem Objektträger festgeklebt werden. Das Färben von Bakterienpräparaten Fast alle Färbungen beruhen auf der Elektroadsorption von Farbstoffionen an freie Valenzen der Moleküle der am Aufbau der Bakterienzelle beteiligten Stoffe. In geringem Maße entstehen Färbungen auch durch Lösungsaffinität eines Farbstoffes zu bestimmten Teilen, zum Beispiel Inhaltskörpern, der Bakterienzelle oder durch chemische Reaktionen innerhalb der Zelle, wenn das Reaktionsprodukt ein Farbstoff ist. Vor der Färbung müssen Bakterien in jedem Fall fixiert werden. Zum Färben wird das fixierte Präparat auf eine Färbebank über einer Färbewanne gelegt, die sehr leicht selbst hergestellt werden kann. Man steckt über den Rand einer halben Petrischale von 200 mm Durchmesser etwa zur Hälfte, paarweise sich gegenüber stehend, vier mittelgroße Büroklammern, schiebt durch die auf diese Weise von ihnen gebildeten Ösen zwei Glasstäbe (300 mm lang, Durchmesser 5 mm) und drückt die Klammern fest www.phywe.com P4140300 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG © All rights reserved 3 TEB Mikroskopie von Bakterien Auf den Objektträger wird so viel Farblösung aufgetropft, dass die fixierte Bakterienmasse vollständig bedeckt ist. Nach der vorgesehenen Färbezeit lässt man die Farblösung durch Kippen des Objektträgers in die Färbewanne ablaufen, spült das Präparat unter der Wasserleitung, bis keine Farbwolken mehr abgehen, und trocknet es an der Luft, indem man es auf etwas Filtrierpapier schräg an die Färbewanne stellt. Die gefärbten Präparate werden bei 400- und 1000facher mikroskopischer Vergrößerung betrachtet (Objektiv 40x bzw. 100x, Okular 10x) und können auch bei Verwendung des Immersionsobjektives ohne Deckglas untersucht werden. Sollen sie jedoch als Dauerpräparate aufbewahrt werden, so bringt man auf den Objektträger einen Tropfen Einschlussmittel (Entellan) und legt ein Deckglas auf. Als Standard-Farbstoffe kommen für Bakterienpräparate in Frage: verdünnte Karbol-Fuchsin-Lösung Man verdünnt Karbol-Fuchsin-Lösung nach ZIEHL-NEELSEN mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1:5, das heißt auf ein Teil Farblösung gibt man vier Teile destilliertes Wasser. Die Färbezeit beträgt 5 Minuten. Die Bakterien sind kräftig rot gefärbt. verdünnte Methylenblau-Lösung Gesättigte alkoholische Methylenblau-Lösung wird mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1 :5 verdünnt, das heißt man gibt auf ein Teil Farblösung vier Teile destilliertes Wasser. Die Färbezeit beträgt 5 Minuten. Die Bakterien sind tiefblau gefärbt. 4 PHYWE Systeme GmbH & Co. KG © All rights reserved P4140300
