Mikrobio B-Praktikums, Teil B

Mikrobiologisches Fortgeshrittenenprkaktikum, Teil B
Bestimmung der unbekannten Bakterien Nr. 99 und Nr. 103
Stefan Rösel
In der belebten Natur gibt es viele verschiedene Mikroorganismen. Diese kommen in der
Umwelt an fast allen erdenkbaren Standorten vor. Ein Teilgebiet der Mikrobiologie beinhaltet
die Identifizierung und systematische Klassifizierung von Bakterien. Ein durch die Nomenklatur artifiziell erschaffenes System erleichtert die Einordnung und das Wiederauffinden von
Mikroorganismen.
Im Fortgeschrittenenpraktikum sollen unbekannte Bakterien aufgrund von Morphologie und
physiologischen Tests bestimmt werden.
Zu Beginn der zweiten Praktikumswoche wurden am Dienstag, dem 20.01.2004, je zwei
unterschiedliche Bakterien auf LB-Agarplatten ausgeteilt. Mir wurde eine Platte mit den
Nummern 99 und 103 ausgehändigt. Da es sich bei den ausgeteilten Bakterienstämmen um
Reinkulturen handelt, sind keine weiteren Reinigungsausstriche nötig. Dennoch werden zur
Sicherheit von den ausgegebenen Platten zur Vermehrung der Zellmasse Abstriche auf
weiteren LB-Platten angefertigt und über Nacht bei 30°C bebrütet.
Wegen der besseren Übersicht werden die weiteren Methoden zur Identifizierung der beiden
Bakterienstämme im Protokoll nacheinander abgefasst, obwohl sie im Praktikum oft parallel
durchgeführt wurden.
Bakterium Nummer 99 (Aeromonas)
Am zweiten Tag werden die Bakterien unter dem Mikroskop betrachtet. Bei 100facher
Objektivvergrößerung kann man kleine Kurzstäbchen erkennen, die sich ungerichtet bewegen.
Da diese kaum spontane Richtungsänderungen ausführen und auch keine Taumelbewegung
erkennbar ist, kann davon ausgegangen werden, dass es sich um eine polare Begeißelung
handelt.
Zur morphologischen Bestimmung der Zellwand wird die Gram-Färbung durchgeführt. Als
Positiv- bzw. Negativkontrollen werden neben der unbekannten Bakterienart die gestellten
Referenzstämmen Bacillus thuringiensis und Pseudomonas putida auf einem gemeinsamen
Objektträger hitzefixiert und durch Behandlung mit Kristallviolett und Lugolscher Lösung
gefärbt. Nach Zugabe von Ethanol können gram-negative Zellen mit Safranin gegengefärbt
werden. Bei der anschließenden Mikroskopie zeigt sich, dass B. thuringiensis als grampositives Bakterium blau gefärbt ist, und das Bakterium Nr. 99 ebenso wie die gram-negative
Referenz P. putida rötlich erscheinen.
Mit dem Hinweis, dass es sich bei der unbekannten Gattung um ein gram-negatives
Bakterium handelt, können die weiteren Tests nach dem Bestimmungsschlüssel, der auch im
Mikrobiologischen Grundpraktikum verwendet wurde, angesetzt werden.
gram negativ
aerob oder fak. anaerob
strikt anaerob
Beweglichkeit
-
ZYMOMONAS
BACTEROIDES
FUSOBACTERIUM
+
ACINETOBACTER
Oxidase
+
-
Glucoseabbau
oxidativ
Glucoseabbau
fermentativ
fermentativ
oxidativ
PSEUDOMONAS
XANTHOMONAS
ENTEROBACTERIACE
Gasbildung
-
+
Lactoseabbau
VIBRIO
CHROMOBACTERIUM
AEROMONAS
+
ESCHERICHIA
ENTEROBACTER
CITROBACTER
SALMONELLA
SERRATIA
PROTEUS
Abb. 1: Bestimmungsschlüssel zur Bestimmung ausgewählter Gattungen
Da die ausgeteilten LB-Platten nicht unter Sauerstoffabschluss inkubiert werden müssen, kann
strikt anaerobes Wachstum ausgeschlossen werden. Dagegen ist aerobes bzw. fakultativ
anaerobes Wachstum möglich.
Die Beweglichkeit wurde schon bei der Mikroskopie bestimmt. Es konnte ungerichtete
Bewegung auch gegen die Strömungsrichtung festgestellt werden.
Beim Oxidasetest zum Nachweis auf vorhandenes Cytochrom c wird auf ein mit TMPD
(N,N,N´,N´-Tetramethyl-p-phenylendiamindihydrochlorid) getränktes Filterpapier mit einem
Zahnstocher oder besser noch mit einer sterilen Pipettenspitze eine kleine Bakterienkolonie
aufgetragen. Bei einer positiv verlaufenden Reaktion färbt sich der Zellhaufen nach kurzer
Zeit rasch violett. Als Kontrollen werden Pseudomonas putida und Citrobacter freundii
verwendet. Das Ergebnis des Tests ist positiv.
Der nächste verwendete Test deckt gleich zwei Entscheidungshilfen ab. Der O/F-Test zeigt
oxidativen oder fermentativen Glucoseabbau an und gibt Aufschluss über Gas- und Säurebildung bei Gärung. Zudem kann das fakultativ anaerobe Wachstum überprüft werden. Zur
Durchführung dieses Tests wird ein O/F-Röhrchen im Stich angeimpft. Das Medium dieses
Röhrchens enthält neben Pepton und Hefeextrakt hauptsächlich Glucose als einzige Kohlenstoffquelle und Bromkresolpurpur als pH-Indikator. Bei gemäßigtem pH-Wert ist der Agar
violett gefärbt, Säurebildung führt zu einem Farbumschlag nach gelb. Gasbildung ist leicht
am Auftreten von eingeschlossenen Luftblasen zu erkennen. Der unbekannte Organismus
zeigt fermentatives Wachstum, also auch Wachstum im anaeroben Bereich des Röhrchens,
Säurebildung und Gasbildung.
Zusammenfassend sind alle Testergebnisse in folgender Tabelle erneut aufgeführt.
Tab. 1: Übersicht über physiologische Tests zur Bestimmung der Gattung
Mikroskopie
Gram-Färbung
Verhältnis zu Sauerstoff
Beweglichkeit
Oxidase
Glucoseabbau
Gärung
Kurzstäbchen
gram-negativ
fakultativ anaerob
+, polar begeißelt
+, Cytochrom c vorhanden
fermentativ
Säure- und Gasbildung
Dem Entscheidungspfad aus Graphik 1 folgend landet man bei der Bestimmung des unbekannten Bakteriums Nr. 99 bei der Gattung AEROMONAS.
Die weiteren Schritte zur Unterscheidung der verschiedenen Arten von Aeromonas folgen den
Bestimmungstabellen aus dem Bergey´s. Von Tab. 5.47 auf Seite 253 aus Bergey´s Manual of
Determinative Bacteriology, die der Unterscheidung zwischen A. salmonicida, anderen
Aeromonasarten und Plesiomonas dient, sind einige Stoffwechselreaktionen verwendet
worden.
Wachstum bei 37°C kann diagnostiziert werden, indem eine Kolonie auf einer LBAgarplatte ausgestrichen und für 24 Stunden im Brutschank bei 37°C inkubiert wird. Wachstum ist durch erfolgreiches Anwachsen der Kolonie festzustellen.
Der Nachweis der Indolproduktion aus Peptonwasser kann im Zuge der IMViC-Reaktionen
ermittelt werden. Hierzu wird eine Peptonwasserkultur mit ca. 2 ml Kovacs-Reagenz versetzt.
Nach gutem Durchmischen und kurzer Wartezeit trennt sich eine Amylalkoholphase von der
restlichen Flüssigkeit ab. Die oben aufschwimmende organische Phase ist deutlich rot gefärbt.
Der Voges-Proskauer-Test ist ein Nachweis auf gebildetes Acetoin durch Diacetyl. Wird
einer in HD angewachsenen Flüssigkultur α-Naphtol und 40%ige KOH-Lösung zugesetzt, so
zeigt nach gutem Schütteln und Inkubation im 60°C warmen Wasserbad bzw. langer Wartezeit bei Raumtemperatur eine Rosafärbung den positiven Testverlauf an. Die Probe des
unbekannten Bakteriums ergibt auch nach längerer Inkubationszeit keinen Farbumschlag.
Ein Test, der dem Nachweis auf Säurebildung aus Glucose dient, wurde bereits früher als
O/F-Test angesetzt. Das Bakterium kann im Anaeroben Glucose vergären. Dadurch werden
sowohl Säure als auch Gas gebildet. Dies hat sich in einer Gelbfärbung, die durch die Ansäuerung des Mediums hervorgerufen wird, gezeigt. Die Menge des produzierten Gases war sehr
groß, weshalb das Bakterium auch den Namen Aeromonas trägt, was soviel wie "Gasbildner"
bedeutet.
Desweiteren wird die Säurebildung aus D-Mannitol untersucht. Hierzu wird wiederum ein
Röhrchen, das diesen Zucker und einen pH-Indikator enthält, angeimpft. Ein Farbumschlag
zeigt auch hier, dass das Medium angesäuert wird.
Aus diesen Tests zur Unterscheidung von A. salmonicida, anderen Aeromonasarten und
Plesimonas können Ersterer und Letzter aufgrund weniger Merkmale ausgeschlossen werden.
Eine Tabelle ist nachfolgend in Auszügen aufgeführt.
Tab. 2: Ausschnitte aus Tabelle 5.47 aus Bergey´s zur Unterscheidung von Aeromonas von Plesiomonas
A. salmonicida andere Aeromonaden Plesiomonas Aeromonas Nr. 99
Beweglichkeit
+
+
+
Wachstum bei 37°C
+
+
+
Indolproduktion aus 1% Peptonwasser
d
+
+
+
Voges-Proskauer
d
d
Gas aus D-Glucose
d
d
+
Säure aus D-Mannitol
d
+
+
Das Ergebnis aus diesen Vorversuchen und die Erhärtung der Erkenntnisse, dass es sich bei
dem unbekannten Bakterium um Aeromonas, nicht jedoch um A. salmonicida handelt, führt
zu einer weiten Tabelle des Bergey´s. Tabelle 5.48 gibt Möglichkeiten zur Unterscheidung
von Aeromonasspezies. Die Tabelle ist nachfolgend abgedruckt.
Abb. 2: Tabelle aus Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology, Tab. 5.48: Differentiation of
Aeromonas species
Von all diesen physiologischen Eigenschaften werden jedoch nur einige getestet. Es werden
so viele wie zur eindeutigen Zuordnung des Bakteriums zu einer Art nötigen Ansätze durchgeführt, jedoch die Tests übersprungen, die im Rahmen des Praktikums zu aufwendig
gewesen wären.
Dennoch kann die Art des Aeromonas mit der Nummer 99 am Ende des Praktikums eindeutig
bestimmt werden.
Bei den IMViC-Reaktionen werden vier einzelne Test durchgeführt. Diese dienen u.a. der
Unterscheidung von E. coli und Enterobacter, können jedoch auch als physiologische Tests
bei anderen Bakterien angewendet werden.
Der Test auf Indolproduktion wurde schon vorher durchgeführt und ist weiter oben erläutert.
Er verlief positiv.
Der Methylrottest gibt Aufschluss, ob aus Zucker unter Luftabschluss Säure gebildet wird.
Damit hat er eine ähnliche Funktion wie der O/F-Test. In eine Flüssigkultur eines HDRöhrchens wird der pH-Indikator Methylrot zugegeben. Bei pH = 6,0 ist der Farbstoff gelb,
bei niedrigerem pH-Wert rot. Da der Indikator an sich jedoch auch rot gefärbt ist, ist es
sinnvoll, durch Zugabe einer Säure oder Base die Richtigkeit der Aussage zu überprüfen. Wie
auch im O/F-Test zeigt sich beim Methylrottest eine positive Reaktion in Bezug auf Säurebildung.
Der Voges-Proskauer-Test, der in der Tabelle als nächstes aufgelistet ist, wurde schon zu
einem früheren Zeitpunkt durchgeführt. Die Erklärung des Tests und die Vorgehensweise ist
weiter oben im Text aufgeführt. Der Test verlief negativ.
Ein Test, der eigentlich zur Unterteilung der Aeromonasarten wenig aussagekräftig ist, ist die
Gelatinehydrolyse. Viele Bakterien können Gelatine als Nahrungsquelle nutzen. Dabei verflüssigt sich die Gelatine. Bei diesem Test werden Kolonien auf Gelatineplatten ausgestrichen
und bei 30°C inkubiert. Am nächsten Tag hat die Gelatine eine viskose bis zähflüssige
Konsistenz, was als positives Testergebnis angesehen werden kann.
Die nächsten Tests sollen die Fähigkeit zur Verwertung verschiedener Zucker überprüfen.
Dabei wird u.a. im Anaeroben Säure gebildet. Die Ansäuerung des Mediums wird wiederum
durch einen pH-Indikator angezeigt. Somit funktioniert diese Testreihe ähnlich wie der O/FTest. Der Farbumschlag soll bei positivem Testverlauf von violett nach gelb erfolgen. Die
verschiedenen Zuckermedien hat dankenswerterweise die Gruppe zur Verfügung gestellt, die
sich mit der Isolierung der Enterobacteriaceae beschäftigt hat.
Die Gasbildung aus Glucose und die Säurebildung aus Glucose wurde schon beim O/FTest überprüft. Sie ist für beide positiv.
Die weiteren Test auf Säurebildung sind kurz zusammengefasst:
Säure aus D-Arabitol: kein Farbumschlag, Testergebnis negativ
Säure aus Lactose: kein Farbumschlag, Testergebnis negativ
Säure aus Maltose: Farbumschlag, Testergebnis positiv
Säure aus D-Mannitol: Farbumschlag, Testergebnis positiv
Säure aus Raffinose: kein Farbumschlag, Testergebnis negativ
Säure aus L-Rhamnose: Farbumschlag, Testergebnis positiv
Säure aus D-Sorbitol: Farbumschlag, Testergebnis positiv
Säure aus D-Xylose: kein Farbumschlag, Testergebnis negativ
Die nächsten beiden Tests unterstützen zwar nicht die Entscheidungsfindung zur Differenzierung zwischen den Arten von Aeromonas, sie werden aber dennoch wegen ihres geringen
Aufwandes durchgeführt und bekräftigen die Aussage zur Zuordnung der Gattung.
Die Nitratreduktion stellt eine Art der anaeroben Atmung dar. Bei dieser Denitrifikation
wird Nitrat (NO3-) zu Nitrit (NO2-) reduziert. Dieses Produkt kann weiter über Lachgas (N2O)
zu Stickstoff (N2) umgewandelt werden. Diese Art der anaeroben Atmung wird u.a. von
Pseudomonas denitrificans oder Thiobacillus denitrificans durchgeführt. Zur Energiegewinnung muss jedoch nicht der ganze Weg der Reduktionskette vollzogen werden. Eine
Reduktion von Nitrat stellt genug Energie für weitere Stoffwechselreaktionen zur Verfügung.
Bei der Durchführung dieses Test werden zuerst erstarrte Nitrat-Agarröhrchen aufgeschmolzen. Das Medium dieser Röhrchen enthält u.a. Hefeextrakt als Kohlenstoffquelle und
Kaliumnitrat. Der verflüssigten Agar wird mit dem Bakterium beimpft und zum Erstarren
abgekühlt. Nach Inkubation bei 30°C hätte man gebildeten Stickstoff am Aufreißen der Agarsäulen erkennen könne. Dies ist jedoch nicht der Fall. Den Nachweis der Nitratreduktion
erfolgt mithilfe von Nitrat- bzw. Nitrit-Teststreifen. Diese werden in den Agar eingestochen.
Eine Violettfärbung zeigt sowohl das Vorhandensein von Nitrat als auch von Nitrit an. Um zu
beweisen, dass das Nitrit gebildet wurde und sich nicht schon vorher im Agar befunden hatte,
wird ein frisches Nitratröhrchen auf beide Substanzen überprüft.
Der Oxidasetest zum Nachweis auf Cytochrom c wurde zwar schon einmal durchgeführt, er
wird aber hier noch einmal wiederholt. Beim ersten Mal dienten die vom Kursassistenten zur
Verfügung gestellten Referenzstämme Pseudomonas putida und Citrobacter freundii als
Positiv- bzw. Negativkontrollen. Nun werden Pseudomonas fluorescens und Enterobacter
aerogenes verwendet. Die Vorgehensweise und das Reagenz sind weiter oben im Text
beschrieben. Der Aeromonas ist Oxidase-positiv.
Ein wichtiger Test zur Unterscheidung von A. schubertii und A. veronii von anderen Arten der
Gattung Aeromonas ist der Test zum Wachstum auf Citrat als einziger Kohlenstoffquelle.
Hierzu wird ein Medium verwendet, dessen Inhaltsstoffe im Praktikumsskript zum Mikrobiologischen Grundpraktikum angegeben ist. Wichtigster Bestandteile ist neben Citrat der pHIndikator Bromthymolblau. Auf pH = 7 eingestellt erscheint die Agarplatte grün. Kann das
ausgestrichene Bakterium Citrat verwerten, so muss es zum Ausgleich der Ladung HydroxidIonen an das Medium abgeben. Bei dieser Alkalisierung verfärbt sich der Farbstoff nach blau.
Auch nach längerer Inkubation bei 30°C stellt sich bei der Platte von Aeromonas keine
Verfärbung ein.
Zur Auswertung und Bestimmung der Art von Aeromonas werden die Testergebnisse mit der
oben abgedruckten Tabelle aus Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology verglichen.
Dabei können außer Aeromonas hydrophila alle anderen Arten ausgeschlossen werden und
das unbekannte Bakterium Nr. 99 eindeutig als A. hydrophila identifiziert werden.
Nachfolgend eine kurze Zusammenfassung der Eigenschaften von A. hydrophila und der
gewonnene Testergebnisse.
Tab. 3: Vergleich der Eigenschaften von Aeromonas hydrophila und dem Bestimmungsobjekt.
A. hydrophila
Indolproduktion
Methylrot
Voges-Proskauer
Harnstoffhydrolyse
Arginindihydrolase
Beweglichkeit
Gelatinehydrolyse
Säure aus D-Glucose
Gas aus D-Glucose
Säure aus D-Arabitol
Säure aus Lactose
Säure aus Maltose
Säure aus D-Mannitol
Säure aus Raffinose
Säure aus L-Rhamnose
Säure aus D-Sorbitol
Säure aus D-Xylose
Nitratreduktion
Oxidase
Citrat
+
+
+
+
+
+
+
+
d
+
+
+
+
-
Nr. 99
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Der Vergleich der Eigenschaften von A. hydrophila und dem unbekannten Organismus zeigt,
dass es überwiegend Übereinstimmung bei den Test gegeben hat. Lediglich der VogesProskauer-Test zum Nachweis auf gebildetes Acetoin und die Säurebildung aus L-Rhamnose
und D-Sorbitol haben nicht so reagiert, wie es bei einem A. hydrophila hätte sein sollen.
Womöglich waren die beiden Zuckermedien durch Spuren von anderen Zuckern verunreinigt
gewesen oder es wurde beim Animpfen des Röhrchens versehentlich eine Kontaminante mit
eingebracht.
Bakterium Nummer 103 (Citrobacter)
Da sich einige Test bei der Bestimmung des zweiten Bakteriums wiederhohlen, sei bei den
Erläuterungen der Testreaktionen und den Vorgehensweisen auf den ersten Teil des
Protokolls verwiesen.
Auch das zweite Bakterium, das mit der Nummer 103 ausgegeben wurde, wird zuerst unter
dem Mikroskop betrachtet. In einem Lebendpräparat sind bewegliche Stäbchen erkennbar.
Wegen abwechselnden Schwimm- und Taumelphasen kann auf peritiriche Begeißelung
geschlossen werden.
Nach dieser Mikroskopie schließt sich eine Gram-Färbung an, deren Ergebnis erneut
mikroskopisch unter 100facher Vergrößerung angeschaut wird. Die Vorgehensweise bei einer
Gram-Färbung kann im Praktikumsskript zum Mikrobiologischen Grundpraktikum nachgelesen werden bzw. ist auch bei der Gram-Färbung des Bakteriums Nr. 99, das als Aeromonas
hydrophila identifiziert werden konnte, erklärt. Als Vergleichsstämme zur Färbung dienen
hier wieder die beiden Referenzen Bacillus thuringiensis und Pseudomonas putida, die
zusammen mit dem unbekannten Organismus auf einen Objektträger aufgetragen werden. Die
Färbung von diesem ist rot, also gram-negativ.
Somit kann ebenfalls mit den Bestimmungen nach Abb. 1 vorgegangen werden.
Da auch diese ausgeteilte LB-Platte nicht unter Sauerstoffabschluss ausgeteilt wurde, kann
strikt anaerobes Wachstum ausgeschlossen werden.
Die Beweglichkeit wurde gerade eben diskutiert. Das Bakterium ist peritrich begeißelt.
Der Oxidasetest zum Nachweis auf vorhandenes Cytochrom c verläuft negativ. Dieser Test
wurde auch zu einem späteren Zeitpunkt zusammen mit der Bestimmung von Aeromonas
hydrophila noch einmal durchgeführt. Auch bei diesem erneuten Versuch konnte ein negatives Ergebnis festgestellt werden. Als Kontrollen werden wiederum Pseudomonas putida und
Citrobacter freundii verwendet, wobei P. putida erwartungsgemäß ein positives Ergebnis
erzielt, der Citrobacter jedoch ein negatives.
Zur Unterscheidung zwischen Xanthomonas und Enterobacteriaceae wird zum Nachweis auf
Glucoseabbau ein O/F-Test angeimpft. Die Auswertung am nächsten Tag ergibt einen
fermentativen Abbau unter Säure- und Gasbildung, was an einer Gelbfärbung des Mediums
und an eingeschlossenen Luftblasen zu erkennen ist. Jedoch ist die Menge des gebildeten
Gases geringer als bei Aeromonas.
Auch die Art der Begeißelung lässt diese Schlussfolgerung zu, da Xanthomonas polar
begeißelt ist, die Enterobacteriaceaen dagegen peritrich oder unbegeißelt.
Ein positiver Nachweis auf Lactoseabbau, der genauso durchgeführt wird wie der Test auf
Glucoseabbau, ergibt, dass der unbekannte Organismus, der schon zu den Enterobacteriaceae
zugeordnet werden konnte, zu einer der Gattungen Escherichia, Enterobacter oder Citrobacter gehören muss.
Abschließend zusammengefasst die Ergebnisse der ersten Vortests. Diese führen zwar noch
nicht zu einer Gattung, können jedoch die Abstammung des unbekannten Organismus auf
einige Enterobacteriaceae einschränken.
Tab. 4: Übersicht über erste physiologische Tests zur Bestimmung der Familie
Mikroskopie
Gram-Färbung
Verhältnis zu Sauerstoff
Beweglichkeit
Oxidase
Glucoseabbau
Lactoseabbau
Kurzstäbchen
gram-negativ
fakultativ anaerob
+, peritrich begeißelt
-, kein Cytochrom c vorhanden
fermentativ, Säure- und Gasbildung
+, Säure- und Gasbildung
Da die Tabelle 5.2 aus dem Bergey´s zur biochemischen Unterscheidung von Arten aus der
Familie der Enterobacteriaceae auf den Seiten 203ff sehr umfangreich ist, und die Gattung des
Bakteriums Nr. 103 noch nicht bestimmt wurde, können die nächsten Schritte anhand nachfolgender Abbildung genommen werden. Die Graphik hat freundlicherweise die Gruppe, die
sich mit der Isolierung von Enterobakterien beschäftigt hat, zur Verfügung gestellt.
gram negativ
Oxidase negativ
beweglich
β-Galactosidase +
Citrat +
DNase -
VP -
unbeweglich
β-Galactosidase -
Citrat -
D-Xylose Urease Mannitol +
Urease +
Mannitol -
SALMONELLA
PROTEUS
DNase +
VP +
SERRATIA
Citrat Adonitol -
Citrat +
Adonitol +
D-Xylose +
KLEBSIELLA
YERSINIA
SHIGELLA
ESCHERICHIA
ENTEROBACTER
CITROBACTER
Abb. 3: Bestimmungsbaum zur Unterscheidung von Gattungen der Enterobacteriaceae
Der Weg der Bestimmung beginnt bei gram-negativen Stäbchen, die auch Oxidase negativ
sind. Die erste Abzweigung führt zur Frage der Beweglichkeit, die schon zuvor beantwortet
wurde. Somit können Shigella, Yersinia und Klebsilla ausgeschlossen werden.
Der nächste Test, der auch als ONPG-Test (o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid) angegeben
ist, soll β-Galactosidaseaktivität zeigen. Auf einer Platte, die X-Gal enthält, wird eine
Kolonie des unbekannten Bakteriums ausgestrichen und bei 37°C inkubiert. Ein positives
Testergebnis, was die Spaltung des X-Gals bedeutet, zeigt sich an blauen Kolonien. Der
Versuch hat aber ein negatives Ergebnis, was auf die Gattungen Salmonella und Proteus
hinweißt. Da aber bei anderen Praktikumsteilnehmern dieser Test ebenfalls negativ verläuft,
obwohl er hätte eindeutig positiv sein sollen, kann davon ausgegangen werden, dass das Testreagenz nicht wie erwartet reagiert. Weil es jedoch zu diesem Test keine Alternative gibt, und
der Test zur Unterscheidung der übrigen Gattungen notwendig ist, hat der Kursassistent
andeutungsweise klar gemacht, dass das erwartete Ergebnis bei diesem Test positiv hätte
ausfallen sollen.
Zur Unterscheidung von Escherichia wird der Nachweis auf Citratverwertung angesetzt. Bei
diesem ist Citrat als einzige Kohlenstoffquelle vorhanden. Ist es einem Bakterium möglich,
dieses Substrat zu nutzen, äußert sich das Wachstum an der Blaufärbung des grünen Agars.
Da dies so beobachtet werden kann, ist Escherichia als mögliche Gattung auszuschließen.
Die nächste Abzweigung kann durch zwei Test bestritten werden. Sowohl negative DNaseAktivität als auch negative Gelatinehydrolyse lassen auf Citrobacter und Enterobacter
schließen. Es werden beide Test angesetzt, ersterer auf DNase-Agar, der zweite auf GelatineAgar. Bei beiden hat sich nach Inkubation bei 37°C nichts verändert. Die blaue DNase-Platte
bleibt bei ihrer Ausgangsfarbe, die Gelatine wird nicht verflüssigt.
Die letzte Entscheidung wird durch den Test auf Acetoin getroffen. Dieser Voges-ProskauerTest wird, wie schon bei Aeromonas beschrieben, angesetzt und durchgeführt. Für Citrobacter und Escherichia soll er negativ verlaufen, für Enterobacter dagegen positiv. Wie beim
Oxidasetest wird Enterobacter aerogenes und Citrobacter freundii als Referenz verwendet.
Das Ergebnis fällt zugunsten des Letzten aus.
Somit kann Citrobacter als Gattung sicher ausgemacht werden. Der Kursassistent bestätigt
diese Aussage.
Zur Bestimmung der Art von Citrobacter werden weitere Tests aus der abgedruckten Tabelle
aus Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology angesetzt. Da es nur drei Arten von
Citrobacter gibt, nämlich C. amalonaticus, C. diversus und C. freundii, sollten einige wenige
Test genügen, um die unbekannte Art zu einer dieser zuzuordnen. Der erste Vergleich der drei
Spalten der Tabelle zeigt, dass die Tests auf Indolproduktion und Wachstum auf KCN oder
Malonatverwertung ausreichen müssten. Dennoch werden zur Sicherheit mehrere Bestimmungsverfahren ausgenutzt.
Abb. 4: Ausschnitte der Tabelle aus Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology,
Tab. 5.2: Biochemical differentiation of the species of the family of Enterobacteriaceae
Der Nachweis der Indolproduktion aus Peptonwasser kann im Zuge der IMViC-Reaktionen
ermittelt werden. Hierzu wird eine Peptonwasserkultur mit Kovacs-Reagenz versetzt. Die
oben aufschwimmende organische Phase zeigt keine kontrastive Färbung. Mit diesem Test
können C. amalonaticus und C. diversus ausgeschlossen werden.
Der Methylrottest, die Voges-Proskauer-Reaktion und der Citratnachweis komplettieren
die IMViC-Reaktionen. Sie tragen aber nicht zur Unterscheidung der Art bei. Das Ergebnis
dieser Reaktionen stimmt mit den Soll-Werten in der Tabelle überein.
Der Test auf H2S-Produktion wird nach Anleitung durchgeführt. Der Agar verfärbt sich tief
dunkelbraun, also positiv. Als Kontrolle dient der zur Verfügung gestellte Referenzstamm
Citrobacter freundii. Auch durch diesen Test können die beiden anderen Arten ausgeschlossen werden.
Der Test auf Harnstoffspaltung wird nicht durchgeführt, da er sowohl bei C. diversus und
auch bei C. freundii von Stamm zu Stamm verschiedene Ergebnisse liefern kann.
Der unbekannte Citrobacter wird ebenfalls nicht auf Phenylalanin-deaminase, Lysindecarboxylase, Arginin-dihydrolase und Ornithin-decarboxylase getestet, da diese Tests
nicht zur Identifizierung der Art beitragen.
Die nächsten beiden Tests, Beweglichkeit und Gelatinehydrolyse, wurden schon zu einem
früheren Zeitpunkt ausgeführt. Der Citrobacter ist peritrich begeißelt, was ihm Motilität
verleiht. Gelatine kann er nicht spalten und verwerten.
Die nächsten Test sollen die Fähigkeit zur Verwertung verschiedener Zucker überprüfen.
Unter anaeroben Bedingungen findet bei Vergärung eine Ansäuerung des Mediums statt, was
durch einen pH-Indikator angezeigt wird. Somit funktioniert diese Testreihe ähnlich wie der
O/F-Test. Der Farbumschlag soll bei positivem Testverlauf von violett nach gelb erfolgen.
Obwohl auch diese Test nicht zur Unterscheidung zwischen den drei Arten beitragen, werden
sie im Zusammenhang mit der Bestimmung von Aeromonas hydrophila durchgeführt und
sind deshalb der Vollständigkeit halber kurz zusammengefasst.
D-Glucose: Gasbildung, Test +
Gasbildung aus:
Säurebildung aus: D-Glucose: Säurebildung, Test + Raffinose: keine Säurebildung, Test L-Rhamnose: Säurebildung, Test +
Säurebildung aus: Lactose: Säurebildung, Test +
D-Sorbitol: Säurebildung, Test +
Säurebildung aus: Maltose: Säurebildung, Test +
Säurebildung aus: D-Mannitol: Säurebildung, Test + D-Xylose: Säurebildung, Test +
Die Fähigkeit der anaeroben Atmung und Nutzung von Nitrat als Energiequelle wird beim
Test auf Nitratreduktion überprüft. Bei dieser Denitrifikation wird Nitrat zu Nitrit reduziert.
Diese Art der anaeroben Atmung wird u.a. von Pseudomonas denitrificans oder Thiobacillus
denitrificans durchgeführt.
Zur Durchführung dieses Test werden aufgeschmolzene Nitrat-Agarröhrchen mit dem Bakterium beimpft. Nach Inkubation bei 30°C hätte man gebildeten Stickstoff am Aufreißen der
Agarsäulen erkennen könne. Den Nachweis der Nitratreduktion wird durch Nitrat- bzw.
Nitrit-Teststreifen ausgeführt. Diese werden in den Agar eingestochen. Eine Violettfärbung
zeigt sowohl das Vorhandensein von Nitrat als auch von Nitrit an. Zum Beweis, dass Nitrit
gebildet wurde und sich nicht schon vorher im Agar befunden hatte, wird ein frisches Nitratröhrchen auf beide Substanzen überprüft. Die Nitratreduktion ist für Citrobacter mit positiv
zu bewerten.
Nach Begutachtung aller Testergebnisse können die beiden Organismen C. amalonaticus und
C. diversus aufgrund der Indolproduktion und der H2S-Produktion ausgeschlossen werden.
Bei dem unbekannten Bakterium handelt es sich um Citrobacter freundii.