NEUE TUMORASSOZIIERTE MARKER

*DE60132475T220090312*
(19)
Bundesrepublik Deutschland
Deutsches Patent- und Markenamt
(12)
(10)
DE 601 32 475 T2 2009.03.12
Übersetzung der europäischen Patentschrift
C07K 16/00 (2006.01)
(97) EP 1 326 894 B1
(21) Deutsches Aktenzeichen: 601 32 475.7
(86) PCT-Aktenzeichen: PCT/US01/29242
(96) Europäisches Aktenzeichen: 01 973 176.9
(87) PCT-Veröffentlichungs-Nr.: WO 2002/022851
(86) PCT-Anmeldetag: 18.09.2001
(87) Veröffentlichungstag
der PCT-Anmeldung: 21.03.2002
(97) Erstveröffentlichung durch das EPA: 16.07.2003
(97) Veröffentlichungstag
der Patenterteilung beim EPA: 16.01.2008
(47) Veröffentlichungstag im Patentblatt: 12.03.2009
(51) Int Cl.8:
(30) Unionspriorität:
664958
(84) Benannte Vertragsstaaten:
AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT,
LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
18.09.2000
G01N 33/53 (2006.01)
C07K 16/12 (2006.01)
C07K 16/28 (2006.01)
C07K 16/30 (2006.01)
A61K 39/395 (2006.01)
G01N 33/574 (2006.01)
G01N 33/569 (2006.01)
G01N 33/68 (2006.01)
C12N 5/16 (2006.01)
A61K 39/00 (2006.01)
US
(73) Patentinhaber:
The Trustees of Columbia University in the City of
New York, New York, N.Y., US
(72) Erfinder:
TRAKHT, Ilya, New York, NY 10033, US;
CANFIELD, Robert, Cold Spring, NY 10516, US;
KALANTAROV, Gary, Fort Lee, NJ 07024, US;
RUDCHENKO, Sergei, Bronx, NY 10463, US
(74) Vertreter:
MÜLLER FOTTNER STEINECKE Rechtsanwälte
Patentanwälte, 80335 München
(54) Bezeichnung: NEUE TUMORASSOZIIERTE MARKER
Anmerkung: Innerhalb von neun Monaten nach der Bekanntmachung des Hinweises auf die Erteilung des europäischen Patents kann jedermann beim Europäischen Patentamt gegen das erteilte europäische Patent Einspruch
einlegen. Der Einspruch ist schriftlich einzureichen und zu begründen. Er gilt erst als eingelegt, wenn die Einspruchsgebühr entrichtet worden ist (Art. 99 (1) Europäisches Patentübereinkommen).
Die Übersetzung ist gemäß Artikel II § 3 Abs. 1 IntPatÜG 1991 vom Patentinhaber eingereicht worden. Sie wurde
vom Deutschen Patent- und Markenamt inhaltlich nicht geprüft.
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Beschreibung
[0001] Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung wird über Autor und Datum auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen. Vollständige Literaturangaben zu diesen Veröffentlichungen sind in alphabetischer Auflistung am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Patentansprüchen zu finden. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen beschreiben in ihrer Gesamtheit den Stand der Technik.
Hintergrund der Erfindung
[0002] Die bahnbrechende Entdeckung von Kohler und Milstein (Kohler, G. und Milstein, C., 1975) von
Maus-"Hybridomen", in der Lage, spezifische monoklonale Antikörper (mAbs) gegen vorbestimmte Antigene
zu sekretieren, ebnete den Weg zu einer neuen Ära der experimentellen Immunologie. Es wurden viele der mit
Antiseren assoziierten Probleme umgangen. Die klonale Selektion und die Immortalität von Hybridomzelllinien
garantierten Monoklonalität und permanente Verfügbarkeit von Antikörperprodukten. Auf der klinischen Ebene
wird jedoch die Verwendung solcher Antikörper dadurch, dass sie fremde Proteine sind und in Menschen als
Antigene funktionieren, deutlich eingeschränkt.
[0003] Seit dem Report von Kohler und Milstein (Kohler, G. und Milstein, C., 1975) ist die Produktion von monoklonalen Maus-Antikörpern zur Routine geworden. Die Anwendung von xenogenen monoklonalen Antikörpern zur Diagnostik und Therapie in vivo ist oft mit unerwünschten Wirkungen assoziiert, wie beispielsweise
einer Human-anti-Maus-Immunglobulinantwort. Zusätzlich besitzen monoklonale Antikörper ein großes Potential als Werkzeuge für das Imaging. Darüber hinaus motivierte die therapeutische Behandlung die Suche nach
Mitteln zur Produktion von humanen monoklonalen Antikörpern (humAbs) (Levy, R. und Miller, RA., 1983).
[0004] Der Fortschritt auf diesem Gebiet wurde jedoch durch das Fehlen von als Fusionspartner geeigneten
humanen Myelomen mit Eigenschaften ähnlich denen der Maus-Myelomzellen behindert (Posner, MR. et al.,
1983). Die Verwendung des Epstein-Barr-Virus (EBV) erwies sich als durchaus effizient für die Immortalisierung von humanen Lymphozyten (Kozbor, D. und Roder, J., 1981; Casual O., 1986), weist jedoch gewisse Einschränkungen auf, wie beispielsweise niedrige Antikörpersekretionsrate, mangelhafte Klonogenität von Antikörper-sekretierenden Linien sowie chromosomale Instabilität, welche häufiges Subklonieren erforderlich
macht. Undifferenzierte humane Lymphoblastoidzelllinien erscheinen attraktiver. Im Gegensatz zu differenzierten Myelomzellen lassen sich diese Zelllinien leicht an Kulturbedingungen anpassen, wenngleich die Probleme
einer geringen Ausbeute und einer instabilen Sekretion ungelöst bleiben (Glassy, MC., 1983; Ollson, L. et al.,
1983). Die besten potentiellen Fusionspartner sind syngenisch Myelomzellen mit gut entwickelten Proteinsynthesemaschinerie (Nilsson, K. und Ponten, J., 1975). Aufgrund von Schwierigkeiten bei der Kultivierung wurden jedoch wenige Linien für in vitro Wachstum sowie die Fähigkeit lebensfähige Hybride zu produzieren konditioniert (Goldman-Leikin, RE., 1989). Bestehende Myelome weisen eine geringe Fusionsausbeute sowie ein
langsames Hybridwachstum auf, obwohl die Produktion monoklonaler Antikörper verhältnismäßig stabil ist
(Brodin, T., 1983). Bei der genetischen Instabilität handelt es sich um einen bedeutenden Nachteil von Interspezieshybriden. Dies ist zum Beispiel der Fall, wenn ein Maus-Myelom als Immortalisierungspartner verwendet wird. Die Produktion von Maus-Mensch-Zellhybriden ist nicht schwierig und diese Zellen besitzen Wachstumseigenschaften in vitro ähnlich denen konventioneller Maus-Maus-Hybridome (Teng, NNH., 1983). Die
spontane Eliminierung von humanen Chromosomen reduziert jedoch die Wahrscheinlichkeit einer stabilen
mAb-Sekretion beträchtlich (Weiss, MC. und Green, H., 1967). Um die Wachstumseigenschaften und Stabilität
der Produktion humaner monoklonaler Antikörper zu verbessern werden Heterohybride zwischen Maus-Myelomzellen und humanen Lymphozyten (Oestberg, L. und Pursch, E., 1983) so wie Heteromyelome (Kozbor, D.
et al., 1984) als Fusionspartner verwendet.
[0005] WO 99/47929 offenbart die Produktion monoklonaler Antikörper gegen z. B. Krebs, mit Infektionskrankheiten assoziierte Antigene sowie Autoimmunerkrankungen durch Isolieren von Lymphozyten aus
Lymphknoten (oder peripherem Blut) und deren Immortalisierung durch Fusionieren mit dem humanen Hybridomfusionspartner MFP-2, was zu Tetromen führt, die Antikörper erzeugen. EP 1006184 offenbart mit dem
Säuger-IGF-1-Rezeptor wechselwirkende Proteine (IIPs) ebenso wie Antikörper gegen diese IIPs.
[0006] Die Rolle der humoralen Immunität bei Krebs ist nur unzureichend verstanden. Zahlreiche Daten zeigen die Anwesenheit von tumorspezifischen Anti-Tumor-Antikörpern in Krebspatienten. Solche Antikörper können an potentiellen protektiven Anti-Tumor-Antworten beteiligt sein, welche Tumorzellen durch einen beliebigen verschiedener physiologischer Mechanismen eliminieren können. Anti-Tumor-Antikörper, welche durch
die Immunisierung von Tieren mit malignen Geweben im Labor entwickelt wurden, sind äußerst viel versprechend in der Diagnostik und im Imaging, weisen jedoch bei der klinischen Anwendung schwere Unzulänglich-
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keiten auf, da solche Antikörper selbst starke Immunreaktionen provozieren können und ihnen wichtige biologische Funktionen fehlen. Bis vor kurzem waren vollständig humane gegen tumorassoziierte Antigene gerichtete Antikörper nicht verfügbar, da die humanen Fusionspartnerzelllinien nicht adäquat waren, welche zur Konstruktion humaner Hybridome, welche in der Lage sind, humane Antikörper in großen Mengen zu erzeugen,
erforderlich sind.
[0007] Die Grundidee zur Entwicklung vollständig humaner monoklonaler Antikörper unter Verwendung von
B-Lymphozyten direkt aus Krebspatienten wurde vor einigen Jahren diskutiert. Die Umsetzung dieser Idee
wurde jedoch erst kürzlich ermöglicht, als die geeignete Fusionspartnerzelllinie entwickelt wurde. Es ist nunmehr möglich, spezifische solche Antikörper erzeugende B-Lymphozyten einzufangen, in Kultur zu erhalten
und die relevanten Antikörper zu ernten.
[0008] Die vorliegende Erfindung umfasst eine einzigartige Fusionspartnerzelllinie, welche mit von Lymphknoten, Milz, Tonsillen oder peripherem Blut stammenden humanen Lymphozyten fusioniert. Die Zelllinie gestattet die Immortalisierung von krebsspezifischen B-Zellen mittels Hybridomtechnik. Die resultierenden Hybride erwiesen sich als stabile Produzierer von als Immunglobuline bezeichneten humanen Immunsubstanzen
und repräsentieren eine verlässliche Quelle von humanen Antikörpern zur Immuntherapie. Unter Verwendung
einer geschützten Fusionspartnerzelllinie, welche als MFP-2 bezeichnet wurde, wurden einige humane Antikörper-produzierende Hybridome mit einer Spezifität für humanen Brust- und Prostatakrebs etabliert, wodurch
etliche monoklonale Antikörper mit spezifischer Immunreaktivität gegen humanen Brust- und Prostatakrebs
entwickelt wurden. Diese Antikörper reagierten sowohl mit den humanen Krebszelllinien als auch mit primären
Tumorgeweben. Diese vollständig humanen Antikörper besitzen eine Spezifität für humane Krebszelllinien
ebenso wie für primäre Krebsgewebe. Für einige dieser Antikörper wurden Antigentargets identifiziert. Es wurde ebenfalls ein Hybridomfusionssystem entwickelt, welches das Einfangen von humanen Lymphknoten oder
von Lymphozyten aus peripherem Blut gestattet, welche für Krebsantigene spezifische Antikörper sekretieren.
Diese vollständig humanen Antikörper können dazu verwendet werden, bei der Identifikation neuartiger tumorassoziierter Antigene behilflich zu sein, oder sie können zur in vivo-Diagnostik sowie zur immuntherapeutischen Behandlung von Krebs eingesetzt werden.
[0009] Potentielle Vorteile von humanen monoklonalen Antikörpern schließen die Möglichkeit ein, das molekulare Target des Antikörper zu identifizieren. Ein solches Target könnte sich als ein vollständig neuartiges Molekül oder als ein bekanntes Molekül herausstellen, dessen Assoziation mit Krebs an sich neuartig ist. Vor einigen Jahren entwickelten Wissenschaftler am Ludwig-Institut für Krebsforschung das SEREX-Verfahren, welches die Identifikation von neuartigen tumorassoziierten Antigenen durch die im Blut von Krebspatienten anwesenden spontanen Antikörper gestattet. Ihre Aufgabenstellung konzentrierte sich spezifisch auf die Identifikation neuer Tumormarker. Die vorliegende Erfindung konzentrierte sich ursprünglich auf die Entwicklung von
humanen monoklonalen Antikörpern, welche in der Lage sind, kanzeröses von normalem Gewebe zu differenzieren. Die Identität eines molekularen Targets war diesem Zweck untergeordnet.
[0010] In der vorliegenden Erfindung wurden molekulare Targets für einige der Antikörper identifiziert und es
wurde gezeigt, dass sie nur für Krebszellen spezifisch sind. Eines der Targets, welches sich zeigte, ist die
PDZ-Domäne, welche Protein enthält, das sowohl im Zytosol als auch in der Zellmembran humaner Brustkrebszellen lokalisiert ist. Dieses Protein namens GIPC oder TIP-2 (mit Tax wechselwirkendes Protein, Klon 2)
ist am Vesikel-Trafficking und der Ausbildung von Proteinnetzwerken beteiligt. Es besitzt etliche Eigenschaften,
wie beispielsweise die Fähigkeit an das mit RGS-Ga-wechselwirkende Protein, C-Domäne zu binden, zum Binden an HTLV-1 Onkogen Tax und Binden an sowohl ein a-Actinin als auch Glukosetransporter 1. Die exakte
physiologische Rolle dieses Proteins ist nicht bekannt, wenngleich es eine konstante Überexpression in Brustkrebszellen, mit vernachlässigbarer, wenn überhaupt vorhandener, Expression in Prostatakrebszellen und keiner in humanen Fibroblasten zeigt. Obwohl dieses Protein zuvor bereits beschrieben wurde (2), war seine Assoziation mit Krebs nicht bekannt. Es war ebenfalls nicht bekannt, dass in Brustkrebspatienten eine spontane
Antikörperantwort auf diesen Marker erfolgt.
[0011] Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die Etablierung der Assoziation von TIP-2 mit maligner
Transformation die Anwendung dieses Antigens/Proteins als einen diagnostischen Marker sowohl in vitro als
auch in vivo gestattet, zur immunhistopathologischen Analyse ebenso wie zur immunchemischen Untersuchung; Dieses Protein kann im Blutkreislauf von Krebspatienten gefunden werden. Dieses Protein könnte aufgrund seiner spezifischen Expression in primären Tumoren ebenfalls als ein molekulares Target für therapeutische Zwecke dienen. Dieses Protein kann ebenfalls als ein löslicher Tumormarker zur Krebsdiagnostik, zum
Fortschreiten einer Krebserkrankung und zur Überwachung einer Krebsbehandlung bei Brust- und Prostatakrebspatienten verwendet werden. Da dieses Protein auf der Oberfläche von Krebszellen exprimiert wird, kann
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es als ein Target für die spezifische Antikörper-getriebene Zufuhr von mit Wirkstoffen beladenen Liposomen
oder Antikörper-konjugierten Wirkstoffen, Wirkstoffvorläufern, Toxinen oder Zellwachstumsinhibitoren verwendet werden. Als Bestätigung der Bedeutung von TIP-2 für das Überleben von Zellen kann dieser neuartige Marker als ein Kandidat für Vakzinentwicklung für die Immuntherapie von Krebserkrankungen angesehen werden.
[0012] Antikörper gegen TIP-2, welche aus den Lymphozyten von Brustkrebspatienten stammten, können als
ein Vektor zur in vivo-Diagnostik (Imaging) und Immuntherapie (z. B. zur Zufuhr von mit Wirkstoffen beladenen
Liposomen oder von radioimmunen oder immuntoxischen Konjugaten an den Tumorort) verwendet werden.
Vollständig humane monoklonale Antikörper gegen TIP-2 können und werden dazu verwendet werden, präparative Mengen an TIP-2 aus Brustkrebszellen oder primären Tumoren zu isolieren und Maus-Antikörper mit hoher Affinität zum Zweck der diagnostischen und therapeutischen Verwendung zu entwickeln, wenn erst einmal
ihr biologischer Nutzen erwiesen ist. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Grundlage für die mögliche
Entwicklung spezifischer Immunassays oder eines immunhistochemischen Kits zur Detektion und Messung
dieses neuartigen Tumormarkers bereit.
[0013] Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass gegen TIP-2 gerichtete humane Antikörper als ein
Immunsorptionswerkzeug zur Isolation und weiteren Charakterisierung der chemischen Struktur des Proteins
(Aminosäurezusammensetzung, Proteinsequenz, Modifikation) verwendet werden können.
[0014] Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung, ist ein auf der Grundlage von humanen anti-TIP-2 monoklonalen Antikörpern hergestelltes Immunosorbens, das die Isolation dieses Antigens sowie seine Verwendung zur Entwicklung monoklonaler Maus-Antikörper mit hoher Affinität und Spezifität gestattet, welche dazu
verwendet werden können, bessere Werkzeuge für einen TIP-2-Immunassay zu entwickeln.
[0015] In dem Wissen um die DNA-Sequenz für TIP-2 und deren Assoziation mit Krebs, besteht ein weiterer
Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, dass es möglich wird unterschiedliche Gewebe, normale wie kanzeröse, hinsichtlich der Expression dieses Markers zu screenen.
[0016] Da humane monoklonale Antikörper gegen TIP-2 verfügbar sind und ein großes Potential für die Entwicklung nicht-humaner Antikörper besteht, welche für bestimmte diagnostische und therapeutische Zwecke
sogar noch effizienter sind, besteht in der hohen Wahrscheinlichkeit, dass TIP-2 als ein potentielles Target für
die Immuntherapie und für die in vivo-Diagnostik (Imaging) verwendet werden kann, ein weiterer Vorteil der
vorliegenden Erfindung.
[0017] Da TIP-2 durch natürlich entwickelte Antikörper in Brustkrebspatienten identifiziert wurde, besteht ein
weiterer Vorteil darin, dass seine Existenz die Hypothese unterstützt, dass dieses Antigen in Menschen immunogen wirken und daher als ein Ausgangskandidat für die Entwicklung eines Anti-Krebs-Vakzins angesehen
werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
[0018] Offenbart wird eine Heteromyelomzelle, welche keinerlei Antikörper produziert und in der Lage ist, eine
Triomzelle zu produzieren, welche, wenn sie mit einer humanen lymphoiden Zelle fusioniert ist, keinerlei Antikörper produziert; wobei die derart produzierte Triomzelle in der Lage ist, eine Tetromzelle zu produzieren, welche einen monoklonalen Antikörper produziert, welcher, wenn er mit einer zweiten humanen lymphoiden Zelle
fusioniert ist, eine spezifische Bindungsaffinität für ein Antigen aufweist und wobei eine solche zweite humane
lymphoide Zelle einen Antikörper produziert, welcher eine spezifische Bindungsaffinität für das Antigen aufweist, unter der Voraussetzung, dass es sich bei der Heteromyelomzelle nicht um B6B11 (ATCC-Zugangsnummer HB-12481) handelt.
[0019] Des Weiteren offenbart wird eine Triomzelle, welche keinerlei Antikörper produziert und durch Fusionieren einer Heteromyelomzelle mit einer humanen lymphoiden Zelle erhalten wird.
[0020] Ebenfalls offenbart wird eine Tetromzelle, welche in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper mit
einer spezifischen Bindungsaffinität für ein Antigen zu produzieren, welche erhalten wird durch Fusionieren der
zuvor beschriebenen Triomzelle, welche keinerlei Antikörper produziert, mit einer humanen lymphoiden Zelle,
welche in der Lage ist, einen Antikörper mit einer spezifischen Bindungsaffinität für das Antigen zu produzieren.
[0021] Die vorliegende Erfindung stellt einen durch das zuvor beschriebene Tetrom produzierten monoklonalen Antikörper bereit.
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[0022] Des Weiteren wird ein Verfahren zur Erzeugung der zuvor beschriebenen Triomzelle offenbart, umfassend: (a) Fusionieren einer Heteromyelomzelle, welche keinerlei Antikörper produziert, mit einer humanen lymphoiden Zelle, wodurch Triomzellen gebildet werden; (b) Inkubieren der in Schritt (a) gebildeten Triomzellen
unter Bedingungen, welche die Produktion von Antikörper durch die Triomzellen gestatten; und (c) Auswählen
einer Triomzelle, welche keinerlei Antikörper produziert.
[0023] Darüber hinaus wird ein Verfahren zur Erzeugung von Tetromzellen offenbart, umfassend: (a) Fusionieren der beschriebenen Triomzelle mit einer humanen lymphoiden Zelle, wodurch Tetromzellen gebildet werden; (b) Inkubieren der in Schritt (a) gebildeten Tetromzellen unter Bedingungen, welche die Produktion eines
Antikörpers durch die Tetromzellen gestatten; und (c) Auswählen einer Tetromzelle, welche in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper zu produzieren.
[0024] Ebenfalls wird ein Verfahren zum Produzieren eines monoklonalen Antikörpers offenbart, umfassend:
(a) Fusionieren einer lymphoiden Zelle, welche in der Lage ist Antikörper zu produzieren, mit der zuvor beschriebenen Triomzelle, wodurch Tetromzellen gebildet werden; und (b) Inkubieren der in Schritt (a) gebildeten
Tetromzelle unter Bedingungen, welche die Produktion von Antikörper durch die Tetromzellen gestatten; (c)
Auswählen einer Tetromzelle, welche in der Lage ist, den monoklonalen Antikörper zu produzieren; und (d) Kultivieren der Tetromzelle aus Schritt (c), so dass der monoklonale Antikörper produziert wird.
[0025] Ebenfalls wird ein Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers offenbart, welcher spezifisch für ein Antigen ist, welches mit einem bestimmten Befinden in einem Subjekt assoziiert wird, umfassend:
(a) Fusion einer lymphoiden Zelle, welche dazu in der Lage ist Antikörper zu produzieren, mit der zuvor beschriebenen Triomzelle, wodurch Tetromzellen gebildet werden; (b) Inkubation der in Schritt (a) gebildeten Tetromzelle unter Bedingungen, welche die Erzeugung von Antikörper durch die Tetromzellen gestatten; (c) Auswählen einer Tetromzelle, welche einen monoklonalen Antikörper produziert; (d) Inkontaktbringen des monoklonalen Antikörpers aus Schritt (c) mit (1) einer Probe aus einem Subjekt mit dem bestimmten Befinden oder
(2) einer Probe aus einem Subjekt ohne das bestimmte Befinden, um so einen Komplex zwischen dem monoklonalen Antikörper und der Probe zu bilden; (e) Detektion eines jeglichen zwischen dem monoklonalen Antikörper und der Probe gebildeten Komplexes; (f) Bestimmen der Menge an in Schritt und (e) gebildetem Komplex; und (g) Vergleichen der in Schritt (f) bestimmten Menge an Komplex für die Probe von dem Subjekt mit
dem bestimmten Befinden mit der in Schritt (f) bestimmten Menge für die Probe von dem Subjekt ohne das
bestimmte Befinden, wobei eine größere Menge an Komplexbildung für die Probe von dem Subjekt mit dem
bestimmten Befinden anzeigt, dass ein monoklonale Antikörper produziert wurde, welcher spezifisch für ein für
das Befinden spezifisches Antigen ist.
[0026] Zusätzlich offenbart wird ein Verfahren zur Identifikation eines mit einem bestimmten Befinden assoziierten Antigens in der Probe, umfassend: (a) Inkontaktbringen des durch das zuvor beschriebene Verfahren
produzierten monoklonalen Antikörpers mit der Probe unter Bedingungen, welche die Bildung eines Komplexes zwischen dem monoklonalen Antikörper und der Probe gestatten; (b) Detektion eines jeglichen in Schritt
(a) gebildeten Komplexes; und (c) Isolation eines jeglichen in Schritt (b) detektierten Komplexes, um dadurch
das mit dem Befinden assoziierte Antigen in der Probe zu identifizieren.
[0027] Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zur Diagnose einer bestimmten Befindens in
einem Subjekt bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Probe von dem Subjekt mit einem durch das zuvor
beschriebene Verfahren produzierten monoklonalen Antikörper unter Bedingungen, welche die Bildung eines
Komplexes zwischen dem monoklonalen Antikörper und der Probe gestatten; und (b) Detektion der Bildung
eines jeglichen zwischen dem monoklonalen Antikörper und der Probe gebildeten Komplexes, wobei die Detektion eines derart gebildeten Komplexes die Anwesenheit eines für das bestimmte Befinden spezifischen Antigens in der Probe anzeigt und somit eine Diagnose für das bestimmte Befinden in dem Subjekt bereitstellt.
[0028] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren eine Zusammensetzung, umfassend einen durch
das hierin beschriebene Verfahren beschriebenen monoklonalen Antikörper sowie einen geeigneten Träger.
[0029] Des Weiteren offenbart die vorliegende Erfindung ebenfalls eine therapeutische Zusammensetzung,
umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines monoklonalen Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0030] Des Weiteren offenbart die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung eines bestimmten Befindens in einem Subjekt, umfassend die Verabreichung einer Menge der zuvor beschriebenen
therapeutischen Zusammensetzung an das Subjekt, welche wirksam ist, um das Befinden in dem Subjekt zu
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behandeln.
[0031] Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls ein Verfahren zur Vermeidung einer bestimmten Befindens in einem Subjekt, umfassend die Verabreichung einer Menge der zuvor beschriebenen therapeutischen
Zusammensetzung an das Subjekt, welche wirksam ist, um das Befinden in dem Subjekt zu vermeiden.
[0032] Die vorliegende Erfindung stellt den monoklonalen Antikörper 27.B1 bereit, welcher durch das Hybridom mit der ATCC-Zugangs-Nr. PTA-1599 produziert wird.
[0033] Die vorliegende Erfindung stellt eine Hybridomzelle bereit, welche den monoklonalen Antikörper der
vorliegenden Erfindung produziert.
[0034] Die vorliegende Erfindung offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0035] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Vakzin, umfassend den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0036] Die vorliegende Erfindung stellt den monoklonalen Antikörper 27.F7 bereit, welcher durch das Hybridom mit der ATCC-Zugangs-Nr. PTA-1598 produziert wird.
[0037] Die vorliegende Erfindung stellt eine Hybridomzelle bereit, welche den monoklonalen Antikörper der
vorliegenden Erfindung produziert.
[0038] Die vorliegende Erfindung offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0039] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Vakzin, umfassend den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0040] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop auf dem
TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper, oder einem Fab-Fragment eines auf ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen
gerichteten Antikörpers, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als
27.F7 bezeichnete Hybridom (ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1598) oder durch den monoklonalen Antikörper
27.B1, produziert durch das als 27.B1 bezeichnete Hybridom (ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1599), erkannt
wird, wobei der Antikörper oder das Fab-Fragment detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind für die Erzeugung eines Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes, umfassend den detektierbar
markierten Antikörper oder das detektierbar markierte Fab-Fragment, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen nicht gebundenen Antikörpers/Fab-Fragments in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex; und (c) Feststellung der Anwesenheit des Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes durch Detektion der Markierung
des detektierbar markierten Antikörpers, wobei die Anwesenheit eines Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes TIP-2-Antigen tragende Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0041] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop auf dem
TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper, oder einem Fab-Fragment eines auf ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen
gerichteten Antikörpers, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als
27.F7 bezeichnete Hybridom (ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1598) oder durch den monoklonalen Antikörper
27.B1, produziert durch das als 27.B1 bezeichnete Hybridom (ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1599), erkannt
wird, wobei der Antikörper durch den Antikörper oder das Fab-Fragment erkannt wird unter Bedingungen, welche geeignet sind für die Erzeugung eines Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes umfassend den Antikörper oder das Fab-Fragment, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in
der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen nicht gebundenen Antikörpers/Fab-Fragments in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex; (c) Inkontaktbringen des Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes aus Schritt (b) mit einem zweiten Antikörper, welcher spezifisch an den Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex bindet, wobei der zweite Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche in geeigneter Weise dem zweiten markierten Antikörper gestatten, an den Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex zu binden; (d) Entfernen eines jeglichen zweiten markierten Antikörpers, welcher in Schritt (c)
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nicht an das Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex-Produkt gebunden hat; und (e) Bestimmen der Anwesenheit des an den zweiten markierten Antikörper gebundenen Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes
durch Detektion der Markierung des zweiten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex TIP-2-Antigen tragende humane Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0042] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop
auf dem TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper, oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop durch den
monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom erkannt wird, wobei
der Antikörper oder das Fab-Fragment davon detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet
sind für die Erzeugung eines Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den detektierbar markierten Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in
der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen markierten nicht gebundenen Antikörpers/Fab-Fragments in dem in
Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex; und (c) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektion der Markierung des
detektierbar markierten Antikörpers, wobei die Anwesenheit eines Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes TIP-2-Antigen tragende humane Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0043] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop
auf dem TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7,
produziert durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom oder ein Fab-Fragment davon erkannt wird, unter
Bedingungen, welche geeignet sind für die Erzeugung eines Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe
gebundenen Antikörper; (b) Entfernen eines jeglichen nicht gebundenen Antikörpers oder Fab-Fragments davon in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex; (c) Inkontaktbringen des Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes aus Schritt (b) mit einem zweiten Antikörper, welcher spezifisch an den Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex bindet, wobei der zweite Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche es dem zweiten markierten Antikörper in geeigneter Weise gestatten, an den Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex zu binden; (d) Entfernen eines jeglichen in Schritt (c) nicht an das Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex-Produkt gebundenen zweiten markierten Antikörpers; und (e) Bestimmen der Anwesenheit des an den zweiten
markierten Antikörper gebundenen Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektion der Markierung des zweiten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex TIP-2-Antigen tragende humane Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0044] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop
auf dem TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop durch den
monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, oder ein Fab-Fragment davon erkannt wird, wobei der Antikörper oder das Fab-Fragment davon detektierbar markiert ist, unter
Bedingungen, welche geeignet sind für die Erzeugung eines Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe
gebundenen detektierbar markierten Antikörper; (b) Entfernen eines jeglichen nicht gebundenen markierten
Antikörpers in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.B1/TIP-2-Antigen-Komplex; und (c) Bestimmen der
Anwesenheit des Antikörper 27.B1 TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektion der Markierung des detektierbar
markierten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex
TIP-2-Antigen tragende humane Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0045] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop
auf dem TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop durch den
monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, oder ein Fab-Fragment davon erkannt wird, unter Bedingungen, welche geeignet sind für die Erzeugung eines Antikörper
27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der
Oberfläche von Zellen in der Probe gebundenen Antikörper; (b) Entfernen eines jeglichen nicht gebundenen
Antikörpers/Fab-Fragments davon in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex; (c) Inkontaktbringen des Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes aus
Schritt (b) mit einem zweiten Antikörper, welcher spezifisch an den Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex bindet, wobei der zweite Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche es
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dem zweiten markierten Antikörper in geeigneter Weise gestatten, an den Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex zu binden; (d) Entfernen eines jeglichen in Schritt (c) nicht an das Antikörper
27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex-Produkt gebundenen zweiten markierten Antikörpers; und (e)
Bestimmen der Anwesenheit des an den zweiten markierten Antikörper gebundenen Antikörper
27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektion der Markierung des zweiten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit des Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes TIP-2-Antigen tragende
humane Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0046] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von Krebs in einem Subjekt durch Detektion von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer von dem Subjekt
erhaltenen Probe von peripherem Blut mit einem auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder
einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop von dem monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das
als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, oder einem Fab-Fragment davon erkannt wird, wobei der Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Erzeugung eines Antikörper
27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den detektierbar markierten Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen
in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex nicht gebundenen
markierten Antikörpers/Fab-Fragments; und (c) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektion der Markierung des detektierbar markierten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex die Diagnose von Krebs in
dem Subjekt anzeigt.
[0047] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von Krebs in einem Subjekt durch Detektion von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer von dem Subjekt
erhaltenen Probe von peripherem Blut mit einem auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder
einem Fab-Fragment Antikörper, wobei das Epitop von dem monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch
das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, oder einem Fab-Fragment davon erkannt wird, unter Bedingungen,
welche geeignet sind zur Erzeugung eines Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe;
(b) Entfernen eines jeglichen in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex nicht gebundenen Antikörpers/Fab-Fragments; (c) Inkontaktbringen des Antikörper
27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes aus Schritt (b) mit einem zweiten Antikörper, welcher spezifisch an den Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex bindet, wobei der zweite Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche es dem zweiten markierten Antikörper in geeigneter Weise
gestatten, an den Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex zu binden; (d) Entfernen eines jeglichen in Schritt (c) nicht an das Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex-Produkt gebundenen
zweiten markierten Antikörpers; und (e) Bestimmen der Anwesenheit des an den zweiten markierten Antikörper gebundenen Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektion der Markierung
des zweiten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex die Diagnose von Krebs in dem Subjekt anzeigt.
[0048] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von Krebs in einem Subjekt durch Detektion von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer von dem Subjekt
erhaltenen Probe von peripherem Blut mit einem auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder
einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop von dem monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das
als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, wobei der Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Erzeugung eines Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den detektierbar markierten Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche
von Zellen in der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper
27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex nicht gebundenen markierten Antikörpers/Fab-Fragments; und
(c) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektion der Markierung des detektierbar markierten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper
27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex die Diagnose von Krebs in dem Subjekt anzeigt.
[0049] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von Krebs in einem Subjekt durch Detektion von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer von dem Subjekt
erhaltenen Probe von peripherem Blut mit einem auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder
einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop von dem monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das
als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, oder einem Fab-Fragment davon erkannt wird, unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Erzeugung eines Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfas-
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send den Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe;
(b) Entfernen eines jeglichen in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex nicht gebundenen Antikörpers/Fab-Fragments; (c) Inkontaktbringen des Antikörper
27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes aus Schritt (b) mit einem zweiten Antikörper, welcher spezifisch an den Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex bindet, wobei der zweite Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche es dem zweiten markierten Antikörper in geeigneter Weise
gestatten, an den Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex zu binden; (d) Entfernen eines jeglichen in Schritt (c) nicht an das Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex-Produkt gebundenen
zweiten markierten Antikörpers; und (e) Bestimmen der Anwesenheit des an den zweiten markierten Antikörper gebundenen Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektion der Markierung
des zweiten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex die Diagnose von Krebs in dem Subjekt anzeigt.
[0050] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vivo-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen in einem Subjekt bereit, umfassend das Bestimmen der Anwesenheit eines zuvor verabreichten
detektierbar markierten Antikörpers 27.F7 oder 27.B1, welcher an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt
gebunden ist, wobei der Antikörper auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichtet ist, oder einem Fab-Fragment
davon, wobei das Epitop durch den monoklonale Antikörper 27.F7, produziert durch das als 27.F7 bezeichnete
Hybridom, oder durch den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als 27.B1 bezeichnete Hybridom, erkannt wird.
[0051] Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Liposoms bereit, welches ein Konjugat von exogenem Material trägt, wobei ein monoklonaler Antikörper 27.B1, produziert durch das Hybridom 27.B1
(ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1599) oder der monoklonale Antikörper 27.F7, produziert durch das Hybridom
27.F7 (ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1598) an eine äußere Oberfläche des Liposoms gebunden wird, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs über die zielgerichtete Zufuhr des exogenen Materials
an TIP-2-Antigen tragende Krebszellen eines humanen Subjekts.
[0052] Offenbart wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem humanen Subjekt, durch Hervorrufen
einer spezifischen Immunantwort, umfassend die Verabreichung eines vollständigen TIP-2-Antigen-Proteins
oder eines Peptidfragments von TIP-2 an das Subjekt.
[0053] Offenbart wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem humanen Subjekt durch Induktion
der Apoptose von Krebszellen, umfassend die Verabreichung eines vollständigen TIP-2-Antigen-Proteins oder
eines Peptidfragments von TIP-2 an das Subjekt.
[0054] Offenbart wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem humanen Subjekt durch Hervorrufen
einer spezifischen Immunantwort, umfassend: (a) Entfernen von dendritischen Zellen aus dem Subjekt; (b) Inkontaktbringen der dendritischen Zellen aus Schritt (a) mit einem vollständigen TIP-2-Antigen-Protein oder einem Peptidfragment von TIP-2; und (c) Wiedereinführen der dendritischen Zellen aus Schritt (b) in das Subjekt.
[0055] Offenbart wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem humanen Subjekt durch Induktion
der Apoptose von Krebszellen, umfassend die Verabreichung eines vollständigen TIP-2-Antigen-Proteins oder
eines Peptidfragments von TIP-2 an das Subjekt.
[0056] Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung des monoklonalen Antikörpers 27.F7 oder des monoklonalen Antikörpers 27.B1 oder eines Peptidfragments davon, gerichtet auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen, zur
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in einem humanen Subjekt durch passive Immunisierung bereit.
[0057] Bereitgestellt wird ein isoliertes Peptid mit der Aminosäuresequenz Lys Leu Leu Gly Gly Gln Ile Gly
Leu.
[0058] Offenbart wird ein isoliertes Peptid mit der Aminosäuresequenz Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr Glu
Val.
[0059] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum immunhistochemischen Screenen einer Gewebesektion aus einer Tumorprobe hinsichtlich der Anwesenheit von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Gewebesektion aus der Tumorprobe mit einem detektierbar markierten Antikörper, gerichtet auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen, oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop durch
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den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, erkannt wird,
wobei der Antikörper/das Fab-Fragment detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind zur
Erzeugung eines Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den detektierbar
markierten Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Gewebesektion; (a) Entfernen eines jeglichen in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex nicht gebundenen markierten Antikörpers/Fab-Fragments; und (b) Bestimmen
der Anwesenheit des Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektion der Markierung des detektierbar markierten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex TIP-2-Antigen tragende humane Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0060] Die vorliegende Erfindung stellt ein Kit zur Detektion der Anwesenheit von TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) einen festen Träger mit einer Vielzahl von kovalent gebundenen Sonden, welche identisch oder unterschiedlich sein können, wobei jede Sonde einen auf ein Epitop auf
TIP-2-Antigen gerichteten monoklonalen Antikörper oder ein Fab-Fragment davon umfasst, wobei es sich bei
dem monoklonalen Antikörper um den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als 27.F7 bezeichnete Hybridom (ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1598), oder um den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als 27.B1 bezeichnete Hybridom (ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1599), handelt; und (b) ein
Mittel zur Bestimmung der Anwesenheit eines monoklonalen Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes.
[0061] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von TIP-2-Antigen in einem biologischen Fluid bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Probe des biologischen Fluids mit einem
auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop
durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, erkannt
wird, wobei der Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Erzeugung
eines Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den an ein beliebiges TIP-2-Antigen in der Probe gebundenen detektierbar markierten Antikörper; (c) Entfernen eines jeglichen nicht in dem
in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex gebundenen markierten Antikörpers; und (d) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes
durch Detektion der Markierung des detektierbar markierten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex TIP-2-Antigen in dem biologischen Fluid anzeigt.
[0062] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von TIP-2-Antigen in einem biologischen Fluid bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Probe des biologischen Fluids mit einem
auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen oder einem Fab-Fragment davon gerichteten Antikörper, wobei das Epitop
durch den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, erkannt
wird, wobei der Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Erzeugung
eines Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes umfassend den an ein beliebiges TIP-2-Antigen in der Probe gebundenen detektierbar markierten Antikörper; (c) Entfernen eines jeglichen nicht in dem
in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex gebundenen markierten Antikörpers; und (d) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes
durch Detektion der Markierung des detektierbar markierten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex TIP-2-Antigen in dem biologischen Fluid anzeigt.
[0063] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum immunhistochemischen Screenen von Gewebesektionen aus einer Tumorprobe hinsichtlich der Anwesenheit von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen bereit,
umfassend: (a) Inkontaktbringen der Gewebesektion aus der Tumorprobe mit einem auf ein Epitop auf
TIP-2-Antigen gerichteten detektierbar markierten Antikörper/Fab-Fragment oder einem Fab-Fragment davon,
wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als PTA-1599 bezeichnete
Hybridom, erkannt wird, wobei der Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet
sind, um den Antikörper an TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von beliebigen Zellen in der Probe zu binden;
und (b) Entfernen eines jeglichen nicht an die Zellen in der Probe gebundenen markierten Antikörpers; (c) Bestimmen der Anwesenheit von an die Zellen in der Probe gebundenem Antikörper 27.B1, wobei eine Anwesenheit von an Zellen gebundenem Antikörper 27.B1 TIP-2-Antigen tragende Krebszellen in der Tumorprobe
anzeigt.
[0064] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens einer Krebserkrankung, wobei es sich bei Krebszellen um TIP-2-Antigen tragende Krebszellen handelt, in einem Subjekt,
umfassend: (a) Verabreichung eines auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörpers oder eines
Fab-Fragments davon an ein Subjekt mit einer Krebsdiagnose, wobei das Epitop durch den monoklonalen An-
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detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind, um den Antikörper an TIP-2-Antigen auf
der Oberfläche von beliebigen Zellen in dem Subjekt zu binden; (b) Bestimmen der Anwesenheit von detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment, welcher/s an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Krebszellen
in einer Probe gebunden ist; (c) Vergleichen der Anwesenheit von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper/Fab-Fragment 27.F7 mit der Anwesenheit von (i) zum Zeitpunkt der Diagnose
oder (ii) nach der Behandlung an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.F7, wobei eine
gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach der Behandlung vermehrte Anwesenheit von in Schritt
(b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment ein Fortschreiten der
Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt und eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach der
Behandlung verminderte Anwesenheit von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment eine Regression der Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt.
[0065] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens einer Krebserkrankung, wobei es sich bei Krebszellen um TIP-2-Antigen tragende Krebszellen handelt, in einem Subjekt,
umfassend: (a) Verabreichung eines auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen oder eines Fab-Fragments davon an ein
Subjekt mit einer Krebsdiagnose, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert
durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, erkannt wird, wobei der Antikörper/das Fab-Fragment detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind, um den Antikörper an TIP-2-Antigen auf der
Oberfläche von beliebigen Zellen in dem Subjekt zu binden; (b) Bestimmen der Anwesenheit von detektierbar
markiertem Antikörper 27.B1/Fab-Fragment, welcher/s an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt gemäß
dem zuvor beschriebenen Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Krebszellen in
einer Probe gebunden ist; (c) Vergleichen der Anwesenheit von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper/Fab-Fragment 27.B1 mit der Anwesenheit von (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder
(ii) nach der Behandlung an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.B1, wobei eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach der Behandlung vermehrte Anwesenheit von in Schritt (b)
an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.B1/Fab-Fragment ein Fortschreiten der
Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt und eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach der
Behandlung verminderte Anwesenheit von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.B1/Fab-Fragment eine Regression der Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt.
[0066] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens einer Krebserkrankung, wobei es sich bei Krebszellen um TIP-2-Antigen tragende Krebszellen handelt, in einem Subjekt,
umfassend: (a) Verabreichung eines auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörpers oder eines
Fab-Fragments davon an ein Subjekt mit einer Krebsdiagnose, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, erkannt wird, wobei der Antikörper/das Fab-Fragment detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind, um den Antikörper
an TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von beliebigen Zellen in dem Subjekt zu binden; (b) Bestimmen der Menge an detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment, welcher/s an die Oberfläche von Zellen in dem
Subjekt gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von
Krebszellen in einer Probe gebunden ist; (c) Vergleichen der Menge an in Schritt (b) an Zellen gebundenem
detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment mit der Anwesenheit von (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach der Behandlung an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper
27.F7/Fab-Fragment, wobei eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach der Behandlung größere Menge von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment
ein Fortschreiten der Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt und eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach der Behandlung geringere Menge von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar
markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment eine Regression der Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt.
[0067] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Überwachung des Fortschreitens einer Krebserkrankung, wobei es sich bei Krebszellen um TIP-2-Antigen tragende Krebszellen handelt, in einem Subjekt,
umfassend: (a) Verabreichung eines auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörpers oder eines
Fab-Fragments davon an ein Subjekt mit einer Krebsdiagnose, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, erkannt wird, wobei der Antikörper/das Fab-Fragment detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind, um den Antikörper
an TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von beliebigen Zellen in dem Subjekt zu binden; (b) Bestimmen der Menge an detektierbar markiertem Antikörper 27.B1/Fab-Fragment, welcher/s an die Oberfläche von Zellen in dem
Subjekt gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren von PTA-1599 gebunden ist; (c) Vergleichen der Menge
an in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.B1/Fab-Fragment mit der An-
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wesenheit von (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach der Behandlung an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.B1, wobei eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach der Behandlung größere Menge von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper
27.B1/Fab-Fragment ein Fortschreiten der Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt und eine gegenüber (i)
zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach der Behandlung geringere Menge von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.B1/Fab-Fragment eine Regression der Krebserkrankung in
dem Subjekt anzeigt.
[0068] Offenbart wird ein Verfahren zur Diagnose von mit der Expression von TIP-2-Antigen assoziiertem
Krebs in einem humanen Subjekt, umfassend: (a) Erhalt von mRNA aus einer Probe von peripherem Blut des
Subjekts; (b) Präparation von cDNA aus der mRNA aus Schritt (a); (c) Amplifikation der in der in Schritt (b)
präparierten cDNA vorhandenen TIP-2-Antigen-kodierenden DNA durch eine Polymerasekettenreaktion unter
Verwendung von mindestens zwei Oligonukleotidprimern, wobei jeder der Primer spezifisch mit der TIP-2-Antigen-kodierenden DNA hybridisiert; und (d) Detektion der Anwesenheit einer jeglichen daraus resultierenden
amplifizierten DNA, wobei die Anwesenheit einer solchen amplifizierten DNA diagnostisch für mit der Expression von TIP-2-Antigen assoziiertem Krebs ist.
[0069] Offenbart wird ein Verfahren zur Diagnose von mit der Expression von TIP-2-Antigen assoziiertem
Krebs in einem humanen Subjekt, umfassend: (a) Erhalt von mRNA aus einer Probe von peripherem Blut des
Subjekts; (b) Präparation von cDNA aus der mRNA aus Schritt (a); (c) Amplifikation der in der in Schritt (b)
präparierten cDNA vorhandenen TIP-2-Antigen-kodierenden DNA durch eine Polymerasekettenreaktion unter
Verwendung von mindestens zwei Oligonukleotidprimern, wobei jeder der Primer spezifisch mit der TIP-2-Antigen-kodierenden DNA hybridisiert; und (d) Bestimmen der Menge an jeglicher daraus resultierender amplifizierter DNA; und (e) Vergleichen der in Schritt (d) bestimmten Menge an amplifizierter DNA mit zuvor bestimmten Standardmengen an amplifizierter DNA, wobei jede Standardmenge indikativ für ein bestimmtes Stadium
von mit der Expression von TIP-2-Antigen assoziiertem Krebs ist.
[0070] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ein Vakzin, umfassend einen durch das hierin beschriebene Verfahren erzeugten monoklonalen Antikörper sowie einen geeigneten Träger.
[0071] Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls ein Vakzin, umfassend eine wirksame Menge eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0072] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ein Verfahren zur Behandlung eines Befindens in
einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer Menge des zuvor beschriebenen Vakzins, welches wirksam
ist, um das mit dem Befinden assoziierte Antigen zu binden, an das Subjekt, wodurch das Befinden in dem
Subjekt behandelt wird.
[0073] Schließlich offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vermeidung eines Befindens in einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer Menge des zuvor beschriebenen Vakzins, welches wirksam
ist, um das mit dem Befinden assoziierte Antigen zu binden, an das Subjekt, wodurch das Befinden in dem
Subjekt vermieden wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1A–Fig. 1C
[0074] Verteilung von Zellen gemäß der Anzahl von Chromosomen. Die X-Achse zeigt die Menge an Chromosomen an. Die Y-Achse zeigt den prozentualen Anteil an Zellen mit geeigneter Anzahl an Chromosomen
an. Die Daten repräsentieren die gemittelten Daten, basierend auf der Analyse von mehr als 50 Metaphaseplatten für jede Linie: P3.X63.Ag8.653 Fig. 1A, RPMI 8226 Fig. 1B, B6B11 Fig. 1C.
Fig. 2
[0075] Fragment des G-Banden Karyotyps der B6B11-Linie. Die Pfeile zeigen genetisches Material vermutlich humanen Ursprungs an; 3p-Abschnitt von Chromosom 3 und Chromosom 19.
Fig. 3
[0076] B6B11-Fusionseffizienz mit frisch isolierten und kultivierten Splenozyten. SPL wurden in LSM isoliert,
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unmittelbar nachdem ein Teil der Zellen mit B6B11-Zellen fusioniert worden war, und die verbleibenden SPL
wurden für 7–9 Tage in vitro in RPMI-C, enthaltend 15% FCS, in der Anwesenheit von ConA, LPS, PHA, PWM
oder ohne Mitogene kultiviert; dann wurden diese Zellen ebenfalls mit B6B11 fusioniert. PWM in der Konzentration von 5 μg/ml beeinflusste wirksam die Fusionseffizienz.
Fig. 4A–Fig. 4D
[0077] DNA-Histogramme der parentalen Zellen 653 (Fig. 4A) und 8226 (Fig. 4B), des Heteromyeloms
B6B11 (Fig. 4C) und des B6B11-Splenozyten-Hybrids (Fig. 4D). Die Menge an B6B11-DNA konstituiert etwa
100% der gesamten Menge an 653-DNA plus 8226-DNA. Der DNA-Gehalt des B6B11-SPL-Hybrids ist größer
als der von B6B11.
Fig. 5A–Fig. 5B
[0078] Immunglobulinproduktion durch aus der Fusion von PBLs mit MFP-2 erhaltene Hybridome (Tetrome).
Fig. 5A zeigt Ergebnisse der Fusion von frischen Lymphozytensuspensionen mit MFP-2. Fig. 5B zeigt Ergebnisse der Fusion von gefrorenen/aufgetauten Lymphozytensuspensionen mit MFP-2. Die dunklen Rechtecke
zeigen die Produktion von IgM an. Die grauen Rechtecke zeigen die Produktion von IgG an. Die Y-Achse zeigt
die optische Dichte bei A490 für unterschiedliche Hybridomproben (Tetrome) an, welche aus der Fusion mit der
MFP-2-Triomlinie (X-Achse) erzeugt wurden. Die gepunktete Linie zeigt die optische Dichte bei A490 für eine
1:500 Verdünnung von IgM-Antikörper an. Die gestrichelte Linie zeigt die optische Dichte bei A490 für eine 1:500
Verdünnung von IgG-Antikörper an.
Fig. 6
[0079] Produktion von Anti-Thyreoglobulin-Antikörper durch Schilddrüsenkrebs-Lymphknoten-Lymphozyten,
welche an MFP-2-Zellen als Fusionspartner fusioniert wurden. Die Y-Achse zeigt die optische Dichte bei A405
(OD405) für unterschiedliche Hybridomproben (Tetrome) an, welche aus der Fusion mit der MFP-2-Triomlinie
(X-Achse) erzeugt wurden. Dreiunddreißig Tetrome produzierten Antikörper, welche positiv gegen Thyreoglobulin reagierten; acht waren besonders stark reaktiv.
Fig. 7
[0080] Durchflusszytometrieanalyse von fixierten und lebenden Zellen, welche mit Anti-TIP-2-fhMAbs behandelt wurden. Grün = Kontrolle; Rot = mit Antikörper behandelte Zellen.
Fig. 8
[0081] Western-Blot-Analyse von Zelllysaten aus Brust- und Prostatakrebs hinsichtlich der Anwesenheit von
TIP-2. Es wurden zwei nicht-transformierte humane Fibroblasten-Zelllinien als Negativkontrolle verwendet. Die
humanen monoklonalen Anti-TIP-2-Antikörper 27.B1 und 27.F7 wurden als Tags verwendet. Zu jeder Linie
wurden 7 mg von Gesamtzelllysatprotein gegeben. Die starke Expression von TIP-2 kann in Brustkrebszellen
beobachtet werden.
Fig. 9
[0082] Immunfluoreszenzfärbung von in Formalin fixierten humanen Zellen mit den humanen monoklonalen
Anti-TIP-2-Antikörpern 27.B1 und 27.F7. Die Größenbalken repräsentieren 20 mm. In dieser wie auch in anderen Figuren mit Immunfluoreszenzfärbung steht Rot für eine Gegenfärbung mit Propidiumjodid von Zellkernen und Grün steht für eine FITC-markierte Antikörperfärbung. Es wurde eine konfokale Mikroskopie für
SK-BR-3-Brustkrebszellen durchgeführt.
Fig. 10
[0083] Immunfluoreszenzfärbung von normalem und kanzerösem humanem Brustgewebe unter Verwendung
des humanen monoklonalen Anti-TIP-2-Antikörpers 27.B1. Oberes Feld – unterschiedliche Fälle von invasivem duktalem Adenokarzinom; unteres Feld – normales Brustgewebe. Die Größenbalken repräsentieren 20
mm.
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Fig. 11
[0084] Immunfluoreszenzfärbung von humanen Prostatageweben unter Verwendung des humanen monoklonalen Anti-TIP-2-Antikörpers 27.B1. Oberes Feld – unterschiedliche Fälle von Prostataadenokarzinom; unteres Feld – gutartige Hypertrophie der Prostata als Negativkontrolle. Die Größenbalken repräsentieren 20 mm.
Fig. 12
[0085] Identisch mit Fig. 4, jedoch mit fhMAb 27.F7.
Fig. 13
[0086] Identisch mit Fig. 5, jedoch mit fhMAb 27.F7.
Fig. 14
[0087] Immunfluoreszenzfärbung von Lymphknoten mit metastatischer Ausbreitung von Brustkrebs. In diesem Experiment wurden die humanen monoklonalen Anti-TIP-2-Antikörper 27.B1 und 27.F7 verwendet. Die
Größenbalken repräsentieren 20 mm.
Fig. 15
[0088] In Formalin fixierte und frisch gefrorene Sektionen aus dem Brustadenokarzinom unter Verwendung
der beiden Anti-TIP-2-Antikörper 27.B1 und 27.F7. Die Größenbalken repräsentieren 20 mm.
Fig. 16
[0089] Immunfluoreszenzfärbung von männlichem intraduktalem Brustkarzinom und Seminom unter Verwendung der fhMAbs 27.F7 und 27.B1. Die Größenbalken repräsentieren 20 mm.
Fig. 17
[0090] Immunfluoreszenzfärbung von Brustkrebs und anderen kanzerösen und normalen Geweben unter
Verwendung der fhMAbs 27.F7 und 27.B1. Die Größenbalken repräsentieren 20 mm.
Fig. 18
[0091] Schematische Darstellung eines G-Protein-Signalling-Systems.
Fig. 19
[0092] Regulatoren des G-Signalling-Systems und der PDZ-Domänen enthaltenden Proteine.
Fig. 20
[0093] Prinzip der SEREX-Technologie
Fig. 21
[0094] Immunisierung von Mäusen gegen TIP-2 unter Verwendung von Immunpräzipitation mit humanem Anti-TIP-2-Antikörper und Western Blotting.
Fig. 22
[0095] Immunreaktivität von polyklonalem Maus-Anti-TIP-2-Antiserum mit TIP-2 aus SK-BR-3-Zelllysat. Der
humane Antikörper 27.F7 wurde als eine Positivkontrolle verwendet.
Fig. 23
[0096] Immunhistochemische Färbung von Brustadenokarzinom unter Verwendung von Immunserum aus mit
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TIP-2 immunisierter Maus. Die Größenbalken repräsentieren 20 mm.
Fig. 24
[0097] Analyse von Ka für den Anti-TIP-2-Antikörper 27.F7 und Berechnung der Anzahl der Kopien von TIP-2,
welche auf SK-BR-3-Zellen vorhanden sind.
Fig. 25
[0098] Expression von TIP-2 in normalen und kanzerösen Brustepithelien.
Fig. 26
[0099] Koppelung des Anti-TIP-2-Antikörpers 27.F7 an Liposomen.
Fig. 27
[0100] Alkoholpräzipitation von TIP-2 aus mit SK-BR-3-Zelllysat gespicktem humanem Blutserum.
Fig. 28
[0101] Die Freisetzung von TIP-2-Antigen in Zellkulturmedien von mit unterschiedlichen Konzentrationen an
Taxol behandelten SK-BR-3-Zellen. Die Linien waren wie folgt (von links nach rechts): 1) SK-BR-3-Zelllysat,
hergestellt aus etwa 70.000 Zellen; 2) leere Bahn; 3) Taxol, 88 μm, zugegeben zu 35 mm Gewebeplatten, enthaltend etwa 250.000 Zellen; 4) das Gleiche mit Taxol, 44 μm; 5) das Gleiche mit Taxol, 22 μm; 7) das Gleiche
mit Taxol, 11 μm; 8) das Gleiche mit Taxol, 5,5 μm; 9) Zelllysat hergestellt aus nicht mit Taxol behandelten Zellen; 10) Lysat hergestellt aus den Überresten der verbleibenden toten Zellen nach der Behandlung mit Taxol,
88 μm.
Fig. 29
[0102] Die Aminosäuresequenz von GIPC/TIP-2-Protein. In Kursivschrift nur die Aminosäuresequenz von
TIP-2. Unterstrichen sind zwei Peptide, welche als starke HLA-*A0201-Binder identifiziert wurden (theoretische
Berechnung).
Fig. 30
[0103] Die mRNA-Sequenz von GIPC. Der Teil der Sequenz, welcher TIP-2 entspricht, ist unterstrichen.
Fig. 31A-1–A-4
[0104] Proteinantigene, identifiziert durch natürliche humane monoklonale Antikörper, entwickelt aus B-Zellen
von Brust- und Prostatakrebspatienten.
Fig. 32A–F
[0105] Humane mRNA-Sequenz für das KIAA0338-Gen, teilweise cds.
Fig. 33A–D
[0106] Humane nicht-muskuläre Alpha-Actinin-mRNA-Sequenz, komplette cds – die zweite nicht-muskuläre
Alpha-Actinin-Isoform, bezeichnet als ACTN4 (Actinin-4).
Fig. 34A–C
[0107] Actinin-Alpha 4 (ACTN4)-mRNA-Sequenz aus Homo sapiens.
Fig. 35A–C
[0108] mRNA-Sequenz des Clathrin-coat-Assemblierungsproteins AP50.
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Fig. 36A–C
[0109] mRNA-Sequenz des GLUT1-C-terminalen Bindungsproteins (GLUT1CBP) aus Homo sapiens.
Fig. 37
[0110] Sequenz des gp130 assoziierten Proteins GAM.
Fig. 38
[0111] mRNA-Seqzenz des aminoterminalen Enhancers of Split (AES) aus Homo sapiens.
Fig. 39A–B
[0112] Antiquitin 1 (Antiquitin = 26 g Turgor-Protein-Homolog), mRNA-Sequenz.
Fig. 40
[0113] KD-Untereinheit des ARP2/3-Proteinkomplexes (P41-ARC), mRNA-Sequenz.
Fig. 41a
[0114] seb4D-mRNA-Sequenz aus Homo sapiens.
Fig. 41b
[0115] seb4B-mRNA-Sequenz aus Homo sapiens.
Fig. 42A–C
[0116] Lamin A/C (LMNA)-mRNA-Sequenz aus Homo sapiens.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
[0117] Offenbart wird eine Heteromyelomzelle, welche keinerlei Antikörper produziert und dazu in der Lage
ist, eine Triomzelle zu erzeugen, welche bei der Fusion mit einer humanen lymphoiden Zelle keinerlei Antikörper produziert; wobei die auf diese Weise erzeugte Triomzelle dazu in der Lage ist, eine Tetromzelle zu produzieren, welche einen monoklonalen Antikörper produziert, welcher bei der Fusion mit einer zweiten humanen
lymphoiden Zelle eine spezifische Bindungsaffinität für ein Antigen aufweist und wobei eine solche zweite humane lymphoide Zelle einen Antikörper produziert, welcher eine spezifische Bindungsaffinität für das Antigen
aufweist, unter der Voraussetzung, dass es sich bei der Heteromyelomzelle nicht um B6B11 (ATCC-Zugangs-Nr. HB-12481) handelt.
[0118] Ebenfalls offenbart wird eine Triomzelle, welche keinerlei Antikörper produziert und durch Fusion einer
Heteromyelomzelle mit einer humanen lymphoiden Zelle erhalten wird. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Heteromyelomzelle um die als B6B11 bezeichnete Zelle (ATCC-Zugangsnummer HB-12481). In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Triom um eine
B6B11-ähnliche Zelle. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung schließt eine B6B11-ähnliche Zelle eine Zelle ein, welche auf der genetischen Ebene im Wesentlichen identisch mit der B6B11-Zelle ist und ein funktionelles Äquivalent derselben darstellt. Folglich schließen B6B11-ähnliche Zellen in spezifischer Weise Klone oder
andere Zellen ein, welche von B6B11 stammen, einschließlich Mutanten von B6B11 oder von Klonen davon.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der humanen lymphoiden
Zelle um eine Myelomzelle. In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der
humanen lymphoiden Zelle um einen Splenozyten oder eine Lymphknotenzelle (Lymphozyt). Gemäß bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Triomzelle um die als MFP-2 bezeichnete Zelle (ATCC-Zugangsnummer 12482).
[0119] Ebenfalls offenbart wird eine Tetromzelle, welche dazu in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper
mit einer spezifischen Bindungsaffinität für ein Antigen zu produzieren, und welche erhalten wird durch Fusionieren der zuvor beschriebenen Triomzelle, welche keinerlei Antikörper produziert, mit einer humanen lympho-
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iden Zelle, welche dazu in der Lage ist, einen Antikörper mit einer spezifischen Bindungsaffinität für das Antigen zu produzieren. Bei der humanen lymphoiden Zelle kann es sich um einen Lymphozyten aus peripherem
Blut, einen Splenozyten, eine Lymphknotenzelle, eine B-Zelle, eine T-Zelle, einen Lymphozyten aus der Rachenmandel, einen Monozyten, einen Makrophagen, eine erythroblastoide Zelle oder eine Peyersche
Plaque-Zelle handeln. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Triomzelle
um die als MFP-2 bezeichnete Zelle (ATCC-Zugangsnummer HB-12482).
[0120] Gemäß bestimmten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Antigen um ein tumorassoziiertes
Antigen, ein zellspezifisches Antigen, ein gewebespezifisches Antigen, ein Enzym, eine Nukleinsäure, ein Immunglobulin, ein Toxin, ein virales Antigen, ein bakterielles Antigen oder ein eukaryotisches Antigen. In einer
Ausführungsform handelt es sich bei dem Antigen um ein Antigen aus Säugern, Insekten, Pilzen, E. coli oder
Klebsiella.
[0121] Die vorliegende Erfindung stellt einen durch das zuvor beschriebene Tetrom erzeugten monoklonalen
Antikörper bereit. Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls eine isolierte Nukleinsäure, welche den durch
das zuvor beschriebene Tetrom erzeugten monoklonalen Antikörper kodiert. Die Nukleinsäure kann einschließen, ist jedoch nicht beschränkt auf: DNA, RNA, cDNA, Oligonukleotidanaloga, Vektoren, Expressionsvektoren oder Sonden. Zusätzlich zieht die vorliegende Erfindung die Expression der Nukleinsäure in Betracht, welche den monoklonalen Antikörper kodiert, eingeführt in eine Wirtszelle, welche dazu in der Lage ist, den monoklonalen Antikörper oder Teile davon zu exprimieren.
[0122] Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls isolierte Nukleinsäuren, einschließend alle oder einen
Teil der Antikörper-bindenden Regionen solcher monoklonalen Antikörper, sowie die Verwendung einer solchen Nukleinsäure zur Expression von Teilen solcher Antikörper, zum Beispiel einzelkettige Antikörper per se
oder Phagen-Display-einzelkettige Antikörper (sFv-a-Antikörper).
[0123] Darüber hinaus können Nukleinsäuren, welche alle oder einen Teil solcher Nukleinsäuren kodieren,
dazu verwendet werden, Säugerzellen wie beispielsweise Maus-Myelom- oder CHO-Zellen zu transfizieren,
um eine erhöhte Produktion eines solchen monoklonalen Antikörpers oder eines Teils davon zu gestatten.
[0124] Des Weiteren offenbart wird ein Verfahren zur Erzeugung der beschriebenen Triomzelle, umfassend:
(a) Fusionieren einer Heteromyelomzelle, welche keinerlei Antikörper produziert, mit einer humanen lymphoiden Zelle, wodurch Triomzellen gebildet werden; (b) Inkubieren der in Schritt (a) gebildeten Triomzellen unter
Bedingungen, welche die Erzeugung von Antikörper durch die Triomzellen gestatten; und (c) Auswählen einer
Triomzelle, welche keinerlei Antikörper produziert.
[0125] Gemäß einer Ausführungsform wird die Heteromyelomzelle aus Schritt (a) als B6B11 (ATCC-Zugangsnummer HB-12481) bezeichnet. Gemäß anderer Ausführungsformen handelt es sich bei der humanen lymphoiden Zelle um einen Lymphknoten-Lymphozyten oder einen Splenozyten. Gemäß bestimmten Ausführungsformen umfasst das Verfahren des Weiteren das Auswählen einer Triomzelle, welche dazu in der Lage
ist, in serumfreien Medien zu wachsen. Weitere Ausführungsformen umfassen das Auswählen einer Triomzelle, welche dazu in der Lage ist, mit einem Lymphozyten aus peripherem Blut oder mit einem Lymphknoten-Lymphozyten zu fusionieren. Des Weiteren bereitgestellt wird eine durch das zuvor beschriebene Verfahren erzeugte Triomzelle.
[0126] Darüber hinaus offenbart wird ein Verfahren zur Erzeugung einer Tetromzelle, umfassend: (a) Fusionieren der zuvor beschriebenen Triomzelle mit einer humanen lymphoiden Zelle, wodurch Tetromzellen gebildet werden; (b) Inkubieren der in Schritt (a) gebildeten Tetromzelle unter Bedingungen, welche die Erzeugung
von Antikörper durch die Tetromzellen gestatten; und (c) Auswählen einer Tetromzelle, welche dazu in der
Lage ist, einen monoklonalen Antikörper zu erzeugen. Gemäß einer Ausführungsform wird die Triomzelle aus
Schritt (a) als MFP-2 (ATCC-Zugangsnummer HB-12482) bezeichnet. Gemäß einer Ausführungsform handelt
es sich bei der humanen lymphoiden Zelle um einen Lymphozyten aus peripherem Blut, einen Splenozyten,
eine Lymphknotenzelle, eine B-Zelle, eine T-Zelle, einen Lymphozyten aus der Rachenmandel, einen Monozyten, einen Makrophagen, eine erythroblastoide Zelle oder eine Peyersche Plaque-Zelle. In einigen Ausführungsformen erzeugt die humane lymphoide Zelle Antikörper mit einer spezifischen Bindungsaffinität für ein
Antigen und die Tetromzelle erzeugt einen monoklonalen Antikörper mit einer spezifischen Bindungsaffinität
für ein solches Antigen. Gemäß bestimmten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Antigen um ein tumorassoziiertes Antigen, ein zellspezifisches Antigen, ein gewebespezifisches Antigen, ein Enzym, eine Nukleinsäure, ein Immunglobulin, ein Toxin, ein virales Antigen, ein bakterielles Antigen oder ein eukaryotisches
Antigen. In einigen Ausführungsformen handelt es sich bei dem Antigen um ein Antigen aus Säugern, Insekten,
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E. coli oder Klebsiella. Des Weiteren bereitgestellt wird eine durch das zuvor beschriebene Verfahren erzeugte
Tetromzelle.
[0127] Offenbart wird die humane Hybridom-Fusionspartner-Heteromyelomzelllinie B6B11 sowie die humane
Hybridom-Fusionspartner-Triomzelllinie MFP-2. Diese Hybridomzelllinine wurden am 17. März 1998 bei der
American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U. S. S., gemäß
den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt. Diesen Hybridomen wurden die ATCC-Zugangsnummern HB-12481, beziehungsweise HB-12482 zugewiesen.
[0128] Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers, umfassend (a)
Fusionieren einer lymphoiden Zelle, welche zur Produktion von Antikörper in der Lage ist, mit der beschriebenen Triomzelle, wodurch eine Tetromzelle gebildet wird; und (b) Inkubieren der in Schritt (a) gebildeten Tetromzelle unter Bedingungen, welche die Produktion von Antikörper durch die Tetromzelle gestatten, so dass dadurch der monoklonale Antikörper erzeugt wird.
[0129] Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers, welcher spezifisch für ein Antigen ist, welches mit einem bestimmten Befinden in einem Subjekt assoziiert ist, umfassend:
(a) Fusionieren einer lymphoiden Zelle, welche zur Produktion von Antikörper in der Lage ist, mit der zuvor beschriebenen Triomzelle, wodurch Tetromzellen gebildet werden; (b) Inkubieren der in Schritt (a) gebildeten Tetromzelle unter Bedingungen, welche die Produktion von Antikörper durch die Tetromzellen gestatten; (c) Auswählen einer Tetromzelle, welche einen monoklonalen Antikörper erzeugt; (d) Inkontaktbringen des monoklonalen Antikörpers aus Schritt (c) mit (1) einer Probe aus einem Subjekt mit dem bestimmten Befinden oder (2)
einer Probe von einem Subjekt ohne das bestimmte Befinden unter Bedingungen, welche die Bildung eines
Komplexes zwischen dem monoklonalen Antikörper und der Probe gestatten; (e) Detektieren des zwischen
dem monoklonalen Antikörper und der Probe gebildeten Komplexes; (f) Bestimmen der Menge an in Schritt (e)
gebildetem Komplex; und (g) Vergleichen der in Schritt (f) bestimmten Menge an Komplex für die Probe aus
dem Subjekt mit dem Befinden, mit der in Schritt (f) bestimmten Menge für die Probe aus dem Subjekt ohne
das Befinden, wobei eine größere Menge an Komplexbildung für die Probe aus dem Subjekt mit dem Befinden
anzeigt, dass ein monoklonaler Antikörper erzeugt wurde, welcher spezifisch für das für das Befinden spezifische Antigen ist.
[0130] In einer Ausführungsform umfasst Schritt (a) des Weiteren das Einfrieren der lymphoiden Zelle. Gemäß einer Ausführungsform umfasst Schritt (c) des Weiteren das Inkubieren der ausgewählten Tetromzelle unter Bedingungen, welche die Zellreplikation gestatten. Gemäß bestimmten Ausführungsformen erfolgt die Tetromreplikation in vitro oder in vivo. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich bei der Triomzelle um die
als MFP-2 bezeichnete Zelle (ATCC-Zugangsnummer HB-12482). Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen Antikörper bereit, welcher spezifisch für ein mit einem Befinden assoziiertes Antigen ist, identifiziert
durch das beschriebene Verfahren. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine isolierte Nukleinsäure bereit,
welche den beschriebenen monoklonalen Antikörper kodiert. Die Nukleinsäure kann einschließen, ist jedoch
nicht beschränkt auf: DNA, RNA, cDNA, Oligonukleotidanaloga, Vektoren, Expressionsvektoren oder Sonden.
Zusätzlich zieht die vorliegende Erfindung die Expression der Nukleinsäure in Betracht, welche den monoklonalen Antikörper kodiert, eingeführt in eine Wirtszelle, welche dazu in der Lage ist, den monoklonalen Antikörper oder Teile davon zu exprimieren.
[0131] Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls isolierte Nukleinsäuren, einschließend alle oder einen
Teil der Antikörper-bindenden Bereiche solcher monoklonaler Antikörper, sowie die Verwendung solcher Nukleinsäure zur Expression von Teilen solcher Antikörper, zum Beispiel einzelkettige Antikörper per se oder Phagen-Display-einzelkettige Antikörper (sFv-a-Antikörper).
[0132] Darüber hinaus können Nukleinsäuren, welche alle oder einen Teil solcher Nukleinsäuren kodieren,
dazu verwendet werden, Säugerzellen wie beispielsweise Maus-Myelom- oder CHO-Zellen zu transfizieren,
um eine erhöhte Produktion solcher monoklonaler Antikörper oder Teilen davon zu gestatten.
[0133] Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das bestimmte Befinden assoziiert
mit: einer Krebserkrankung, einem Tumor, einem Toxin, einem infektiösen Agens, einer Enzymdysfunktion, einer Hormondysfunktion, einer Autoimmunkrankheit, einer Immundysfunktion, einem viralen Antigen, einem
bakteriellen Antigen, einem eukaryotischen Antigen, einer Abstoßung eines transplantierten Gewebes, einer
Vergiftung oder einer Giftintoxikation. Zusätzlich kann es sich bei dem Befinden um eine beliebige anderweitige
Abnormität handeln, einschließend einer solchen resultierend aus einer Infektion, einer Krebserkrankung, ei-
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ner Autoimmundysfunktion, einer kardiovaskulären Erkrankung oder einer Transplantation. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem bestimmten Befinden um Septikämie, Sepsis,
septischen Schock, Virämie, Bakterämie oder Fungämie. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung kann es sich bei der Krebserkrankung um Lungenkrebs, Leberkrebs, Leukämie, Lymphom, Neuroblastom, Gliom, Meningeom, Knochenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Eierstockkrebs, Blasenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs oder Prostatakrebs handeln, wobei sie jedoch nicht auf diese beschränkt ist. Gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem infektiösen Agens um
Hantavirus, HTLV I, HTLV II, HIV, Herpesvirus, Influenzavirus, Ebolavirus, humanes Papillomavirus, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, Anthrax oder Cryptococcus handeln, wobei es jedoch nicht auf diese
beschränkt ist. Gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem
Toxin um Tetanus, Anthrax, Botulin, Schlangengift oder Spinnengift. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Tumor gutartig. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Enzymdysfunktion um eine Hyperaktivität oder Überproduktion des Enzyms. In noch einer weiteren Ausführungsform
handelt es sich bei der Hormondysfunktion um eine Hyperaktivität oder Überproduktion des Hormons. In noch
weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Immundysfunktion durch CD3 oder CD4 vermittelt. In noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Autoimmunkrankheit um Lupus, Thyroiditis, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatsabstoßung oder rheumatoide
Arthritis. In noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Befinden
um eine beliebige Abnormität. In noch weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden um den
Normalzustand.
[0134] Zusätzlich offenbart wird ein Verfahren zur Identifikation eines mit einem bestimmten Befinden assoziierten Antigens in einer Probe, umfassend: (a) Inkontaktbringen des durch das zuvor beschriebene Verfahren
erzeugten Antikörpers mit der Probe unter Bedingungen, welche die Bildung eines Komplexes zwischen dem
monoklonalen Antikörper und der Probe gestatten; (b) Detektieren eines jeglichen in Schritt (a) gebildeten
Komplexes; und (c) Isolieren des in Schritt (b) detektierten Komplexes, wodurch das mit dem Befinden assoziierte Antigen in der Probe identifiziert wird.
[0135] In einer Ausführungsform des zuvor beschriebenen Verfahrens handelt es sich bei dem Befinden um
einen Tumor.
[0136] In einer weiteren Ausführungsform des zuvor beschriebenen Verfahrens ist das Antigen vorher nicht
bekannt.
[0137] Ebenfalls offenbart wird ein durch das zuvor beschriebene Verfahren identifiziertes Tumorantigen, wobei das Antigen vorher nicht bekannt ist.
[0138] Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zum Diagnostizieren eines Tumors in einer Probe, umfassend
das Detektieren der Anwesenheit des durch das zuvor beschriebene Verfahren identifizierten Tumorantigens,
wobei es sich bei dem Befinden um einen Tumor handelt, und wobei die Anwesenheit des Antigens das Vorhandensein eines Tumors in dem Subjekt anzeigt.
[0139] Die vorliegende Erfindung stellt das zuvor beschriebene Verfahren bereit, wobei das Detektieren umfasst: (a) Erhalten einer geeigneten Probe, welche das Tumorantigen aus dem Subjekt enthält; (b) Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper, welcher dazu in der Lage ist, spezifisch an des Tumorantigen zu binden, unter Bedingungen, welche die Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und dem Antigen gestatten; und (c) Detektieren des gebildeten Komplexes, wodurch die Anwesenheit des Tumorantigens detektiert wird.
[0140] In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren des Weiteren
das Trennen des monoklonalen Antikörpers von dem monoklonaler Antikörper/Antigen-Komplex. In manchen
Ausführungsformen erfolgt die Trennung durch Größenfraktionierung, z. B. die durch Polyacrylamid- oder Agarosegelelektrophorese bewirkte Größenfraktionierung.
[0141] Gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das bestimmte Befinden assoziiert mit einer Krebserkrankung, einem Tumor, einem Toxin, einem infektiösen Agens, einer Enzymdysfunktion, einer Hormondysfunktion, einer Autoimmunkrankheit, einer Immundysfunktion, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem eukaryotischen Antigen, Abstoßung von transplantiertem Gewebe, Vergiftung
oder Giftintoxikation. Des Weiteren kann es sich bei dem Befinden um eine beliebige andere Abnormität handeln, einschließend eine solche resultierend aus Infektion, Krebserkrankung, Autoimmundysfunktion, kardio-
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vaskulärer Erkrankung oder Transplantation. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es
sich bei dem Befinden um Septikämie, Sepsis, septischen Schock, Virämie, Bakterämie oder Fungämie. In
manchen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei der Krebserkrankung um Lungenkrebs, Leberkrebs, Leukämie, Lymphom, Neuroblastom, Gliom, Meningeom, Knochenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Darmkrebs, Eierstockkrebs, Blasenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs oder Prostatakrebs
handeln, wobei es jedoch nicht auf diese beschränkt ist. Gemäß mancher Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem infektiösen Agens um Hantavirus, HTLV I, HTLV II, HIV, Herpesvirus, Influenzavirus, Ebolavirus, humanes Papillomavirus, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, Anthrax
oder Cryptococcus handeln, wobei es jedoch nicht auf diese beschränkt ist. Gemäß einiger Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Toxin um Tetanus, Anthrax, Botulin, Schlangengift
oder Spinnengift. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Tumor gutartig. In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei der Enzymdysfunktion um Hyperaktivität oder Überproduktion des Enzyms. In noch weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei der Hormondysfunktion um Hyperaktivität oder
Überproduktion des Hormons. In noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Immundysfunktion durch CD3 oder CD4 vermittelt. In noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Autoimmunkrankheit um Lupus, Thyroiditis, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatsabstoßung oder rheumatoide Arthritis. In noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Befinden um eine beliebige Abnormität. In noch weiteren Ausführungsformen
handelt es sich bei dem Befinden um den Normalzustand.
[0142] Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zur Diagnostizieren eines Befindens in einem
Subjekt bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Probe aus dem Subjekt mit einem durch das zuvor beschriebene Verfahren erzeugten monoklonalen Antikörper unter Bedingungen, welche die Bildung eines Komplexes zwischen dem monoklonalen Antikörper und der Probe gestatten; und (b) Detektieren der Bildung eines
jeglichen zwischen dem monoklonalen Antikörper und der Probe gebildeten Komplexes, wobei eine positive
Detektion eines solchen Komplexes die Anwesenheit eines für das Befinden spezifischen Antigens in der Probe anzeigt, was einem Diagnostizieren des Befindens in dem Subjekt entspricht.
[0143] Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der monoklonale Antikörper an einen
detektierbaren Marker gekoppelt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei
dem detektierbaren Marker um eine Radiomarkierung, einen Fluorophor oder ein fluoreszierendes Molekül, ein
Enzym, einen Liganden, einen kolorimetrischen Marker oder ein magnetisches Bead.
[0144] Gemäß einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem vorliegenden
Befinden um oder ist dieses assoziiert mit eine/r Krebserkrankung, einen/m Tumor, ein/em Toxin, ein/em infektiöses/em Agens, ein/er Enzymdysfunktion, ein/er Hormondysfunktion, eine/r Autoimmunkrankheit, eine/r Immundysfunktion, ein/em virales/en Agens, ein/em bakterielles/en Agens, ein/em eukaryotisches/en Agens, Abstoßung von transplantiertem Gewebe, Vergiftung oder Giftintoxikation. Außerdem kann es sich bei dem Befinden um eine beliebige andere Abnormität handeln, einschließend eine solche resultierend aus Infektion,
Krebserkrankung, Autoimmundysfunktion, kardiovaskulärer Erkrankung oder Transplantation. In bestimmten
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Befinden um Septikämie, Sepsis, septischen Schock, Virämie, Bakterämie oder Fungämie. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei der Krebserkrankung um Lungenkrebs, Leberkrebs, Leukämie, Lymphom, Neuroblastom, Gliom, Meningeom, Knochenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Eierstockkrebs, Blasenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs oder Prostatakrebs handeln, wobei sie jedoch nicht auf diese beschränkt ist. Gemäß weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem infektiösen Agens um Hantavirus,
HTLV I, HTLV II, HIV, Herpesvirus, Influenzavirus, Ebolavirus, humanes Papillomavirus, Staphylococcus,
Streptococcus, Klebsiella, E. coli, Anthrax oder Cryptococcus handeln; wobei es jedoch nicht auf diese beschränkt ist. Gemäß einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Toxin um
Tetanus, Anthrax, Botulin, Schlangengift oder Spinnengift. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Tumor gutartig. In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei der Enzymdysfunktion um Hyperaktivität oder Überproduktion des Enzyms. In noch weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei der
Hormondysfunktion um Hyperaktivität oder Überproduktion des Hormons. In noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Immundysfunktion durch CD3 oder CD4 vermittelt. In noch weiteren
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Autoimmunkrankheit um Lupus, Thyroiditis, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatsabstoßung oder rheumatoide Arthritis. In noch weiteren Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei dem Befinden um eine beliebige Abnormität. In noch weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden um den Normalzustand.
[0145] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren eine Zusammensetzung umfassend einen durch das
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hierin beschriebene Verfahren erzeugten monoklonalen Antikörper sowie einen geeigneten Träger.
[0146] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ebenfalls eine therapeutische Zusammensetzung
umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung
sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0147] Gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Befinden
um Krebs und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um das Wachstum des Krebses zu inhibieren oder diesen zu eliminieren. Gemäß bestimmten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden
um eine Infektion und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um das Wachstum des infektiösen Agens zu inhibieren oder das Agens abzutöten. Gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das Befinden mit einem Toxin assoziiert und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um die Menge an Toxin zu reduzieren oder dieses zu zerstören. In noch weiteren Ausführungsformen
handelt es sich bei dem Befinden um eine Autoimmunkrankheit und die Menge an monoklonalem Antikörper
ist ausreichend, um die Menge an krankmachenden Antikörper oder einer oder mehrere Untereinheiten davon
zu reduzieren oder zu zerstören. In noch weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden um
eine kardiovaskuläre Erkrankung und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um das Befinden zu reduzieren. In noch weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden um eine Transplantatsabstoßung und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um das Befinden zu reduzieren.
[0148] Gemäß bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der monoklonale Antikörper
an eine Effektorverbindung gekoppelt. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt
es sich bei der Effektorverbindung um ein zytotoxisches Agens, einen Wirkstoff, ein Enzym, einen Farbstoff
oder ein Radioisotop. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der monoklonale Antikörper an einen Träger gekoppelt. Gemäß weiterer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt
es sich bei dem Träger um ein Liposom.
[0149] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ebenfalls ein Verfahren zum Behandeln eines bestimmten Befindens in einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer Menge der zuvor beschriebenen therapeutischen Zusammensetzung an das Subjekt, welche ausreichend wirksam ist, um das Befinden in dem
Subjekt zu behandeln. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die therapeutische Zusammensetzung an ein zweites Subjekt verabreicht.
[0150] Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Befinden um oder
ist dieses assoziiert mit eine/r Krebserkrankung, einen/m Tumor, ein/em Toxin, ein/em infektiöses/en Agens,
ein/er Enzymdysfunktion, ein/er Hormondysfunktion, eine/r Autoimmunkrankheit, eine/r Immundysfunktion,
ein/em virales/en Agens, ein/em bakterielles/en Agens, ein/em eukaryotisches/en Agens, Abstoßung von
transplantiertem Gewebe, Vergiftung oder Giftintoxikation. Außerdem kann es sich bei dem Befinden um eine
beliebige andere Abnormität handeln, einschließend eine solche resultierend aus Infektion, Krebserkrankung,
Autoimmundysfunktion, kardiovaskulärer Erkrankung oder Transplantation. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem bestimmten Befinden um Septikämie, Sepsis, septischen Schock,
Virämie, Bakterämie oder Fungämie. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es
sich bei der Krebserkrankung um Lungenkrebs, Leberkrebs, Leukämie, Lymphom, Neuroblastom, Gliom, Meningeom, Knochenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Darmkrebs, Eierstockkrebs, Blasenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs oder Prostatakrebs handeln, wobei sie jedoch nicht auf diese beschränkt ist. Gemäß einer
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem infektiösen Agens um Hantavirus, HTLV I,
HTLV II, HIV, Herpesvirus, Influenzavirus, Ebolavirus, humanes Papillomavirus, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, Anthrax oder Cryptococcus handeln, wobei es jedoch nicht auf diese beschränkt ist.
Gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Toxin um Tetanus, Anthrax, Botulin, Schlangengift oder Spinnengift. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist
der Tumor gutartig. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Enzymdysfunktion um Hyperaktivität oder Überproduktion des Enzyms. In noch einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Hormondysfunktion um Hyperaktivität oder Überproduktion des Hormons. In noch weiteren Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung wird die Immundysfunktion durch CD3 oder CD4 vermittelt. In noch weiteren Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei der Autoimmunkrankheit um Lupus, Thyroiditis, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatsabstoßung oder rheumatoide Arthritis. In noch weiteren Ausführungsformen
der Erfindung handelt es sich bei dem Befinden um eine beliebige Abnormität. In noch weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden um den Normalzustand.
[0151] Schließlich offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Vermeiden eines bestimmten Befin-
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dens in einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer Menge der zuvor beschriebenen therapeutischen
Zusammensetzung an das Subjekt, welche wirksam ist, um das Befinden in dem Subjekt zu vermeiden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigte das Subjekt das Befinden bereits vorher. Gemäß einer
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die therapeutische Zusammensetzung an ein zweites Subjekt verabreicht.
[0152] Gemäß bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Befinden
um oder ist dieses assoziiert mit eine/r Krebserkrankung, einen/m Tumor, ein/em Toxin, ein/em infektiöses/en
Agens, ein/er Enzymdysfunktion, ein/er Hormondysfunktion, eine/r Autoimmunkrankheit, eine/r Immundysfunktion, ein/em virales/en Agens, ein/em bakterielles/en Agens, ein/em eukaryotisches/en Agens, Abstoßung
von transplantiertem Gewebe, Vergiftung oder Giftintoxikation. Außerdem kann es sich bei dem Befinden um
eine beliebige andere Abnormität handeln, einschließend eine solche resultierend aus Infektion, Krebserkrankung, Autoimmundysfunktion, kardiovaskulärer Erkrankung oder Transplantation. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem bestimmten Befinden um Septikämie, Sepsis, septischen Schock, Virämie, Bakterämie oder Fungämie. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei der Krebserkrankung um Lungenkrebs, Leberkrebs, Leukämie, Lymphom, Neuroblastom, Gliom, Meningeom, Knochenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Darmkrebs, Eierstockkrebs, Blasenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs oder Prostatakrebs handeln, wobei sie jedoch nicht auf diese beschränkt ist.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem infektiösen Agens um Hantavirus, HTLV I, HTLV II, HIV, Herpesvirus, Influenzavirus, Ebolavirus, humanes Papillomavirus, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, Anthrax oder Cryptococcus handeln, wobei es jedoch nicht auf diese
beschränkt ist. Gemäß einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Toxin
um Tetanus, Anthrax, Botulin, Schlangengift oder Spinnengift. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Tumor gutartig. In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei der Enzymdysfunktion um
Hyperaktivität oder Überproduktion des Enzyms. In noch weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei der
Hormondysfunktion um Hyperaktivität oder Überproduktion des Hormons. In noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird die Immundysfunktion durch CD3 oder CD4 vermittelt. In noch weiteren
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Autoimmunkrankheit um Lupus, Thyroiditis, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatsabstoßung oder rheumatoide Arthritis. In noch weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Befinden um eine beliebige Abnormität.
In noch weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden um den Normalzustand.
[0153] Ebenfalls offenbart wird die Herstellung von Antikörpern für Antigene, welche nicht mit einem bestimmten Befinden assoziiert sind, sondern vielmehr eine Komponente des gesamten Repertoires an Antikörpern in
einem menschlichen Immunsystem darstellen.
[0154] Des Weiteren offenbart wird die Identifikation neuartiger Antigene, welche für ein bestimmtes Befinden
in einem Subjekt relevant sind, sowie deren Verwendung zur Diagnose und Behandlung des bestimmten Befindens in dem Subjekt. Ebenfalls bereitgestellt wird die Identifikation des Repertoires an natürlich vorkommenden Antikörpern in normalen Subjekten und in Subjekten mit einem pathologischen Befinden. In einer Ausführungsform kann es sich bei dem Befinden um eine Entgiftung (Neutralisation) handeln. So kann das Befinden
zum Beispiel aus Bissen von Skorpionen, Spinnen, Klapperschlangen oder giftigen Kröten oder auch daraus
resultieren, dass man einem Gift ausgesetzt war. Bereitgestellt werden Antikörper, welche als Gegengift für solche Befinden wirken.
[0155] Die Triomzelle kann ebenfalls mit Makrophagen, Monozyten, T-Lymphozyten und erythroblastoiden
Zellen fusioniert werden. Aus solchen Fusionen resultierende Hybridomzellen können Wachstumsfaktoren, Zytokine, Enzyme oder Hämoglobin produzieren.
[0156] Wie hierin verwendet, handelt es sich bei einem human-murinen Hybridom (dem "immortalisierenden"
Hybridom) um eine unsterbliche Zelllinie, welche aus der Fusion einer murinen Myelom- oder einer anderen
murinen Tumorzelle mit einer humanen lymphoiden Zelle, die von einem normalen Subjekt stammt, resultiert.
Wie hierin nachfolgend beschrieben, kann durch sorgfältige Selektion und Mutation ein immortalisierendes Hybridom erhalten werden, welches eine verbesserte chromosomale Stabilität bereitstellt, humane Eigenschaften
besitzt und kein Immunglobulin sekretiert. Die Fähigkeit eines solchen resultierenden Trioms zur Sekretion von
Antikörper kann durch die dritte Zellfusion, welche typischerweise entweder von B-Zellen oder einem immunisierten humanen Individuum stammt, oder mit B-Zellen, welche immortalisiert wurden, bereitgestellt werden.
[0157] Wie hierin verwendet, handelt es sich bei einer "B6B11"-Zelle um eine Hybridzelle, welche durch die
Fusion des Maus-Myeloms 653 und des humanen Myeloms RPMI 8226 hergestellt wurde.
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[0158] Wie hierin verwendet, handelt es sich bei einer "B6B11-ähnlichen" Zelle um eine Hybrid-Zelle, welche
durch die Fusion einer mit dem Maus-Myelom 653 verwandten Zelle und einer mit dem humanen Myelom
RPMI 8226 verwandten Zelle hergestellt wurde.
[0159] Wie hierin verwendet, handelt es sich bei einer "MFP"-Zelle um eine Hybridzelle, welche durch die Fusion einer B6B11-Zelle und eines humanen Lymphozyten hergestellt wurde. B6B11-ähnliche Zellen haben mit
B6B11-Heteromyelomzellen funktionelle Eigenschaften und Charakteristiken gemeinsam.
[0160] Wie hierin verwendet, handelt es sich bei einer "MFP-ähnlichen" Zelle um eine Hybridzelle, welche
durch die Fusion einer B6B11-ähnlichen Zelle und eines humanen Lymphozyten hergestellt wurde. MFP-ähnliche Zellen haben mit MFP-Triomzellen funktionelle Eigenschaften und Charakteristiken gemeinsam.
[0161] Wie hierin verwendet, betrifft ein "nicht sekretierendes" oder "nicht produzierendes" Hybridom ein Hybridom, welches zur kontinuierlichen Reproduktion in der Lage und daher unsterblich ist und welches kein Immunglobulin produziert.
[0162] Wie hierin verwendet, betrifft ein Hybridom "mit humanen Charakteristiken" ein Hybridom, welches detektierbare von humanen abgeleitete Chromosomen beibehält, wie beispielsweise diejenigen, welche humanes HLA-Antigen produzieren, welches auf der Zelloberfläche exprimiert werden kann.
[0163] Wie hierin verwendet, betreffen lymphoide Zellen, welche "gegen eine vordefinierte Determinante immunisiert" sind, lymphoide Zellen, welche von einem Subjekt stammen, welches einem die Determinante tragenden Antigen ausgesetzt war. So kann zum Beispiel ein Subjekt dazu veranlasst werden, Antikörper (aus
seinen lymphoiden B-Zellen) zu produzieren, gegen die antigenen Determinanten von unterschiedlichen Bluttypen durch Exponierung, durch Transfusionen oder vorangegangene Schwangerschaft, oder gegen die antigenen Determinanten von spezifischen Viren oder von Bakterien, durch einen Virus durch Exponierung während vorangegangener Infektionen oder Vakzinierungen.
[0164] Wie hierin verwendet, betrifft "Zelllinie" verschiedene Ausführungsformen, einschließend, jedoch nicht
beschränkt auf, einzelne Zellen, geerntete Zellen und Zellen enthaltende Kulturen, so lange diese von Zellen
der betreffenden Zelllinie abstammen, wobei diese auch nicht exakt identisch mit den Ur-Zellen oder Kulturen
sein können und jede beliebige betreffende Zelllinie solche Varianten einschließt.
[0165] Wie hierin verwendet, betrifft "Triom" auf eine Zelllinie, welche generische Komponenten enthält, welche ihren Ursprung in drei ursprünglich separaten Zelllinien haben. Bei diesen Triomen handelt es sich um stabile, immortalisierte Zellen, welche aus der Fusion eines human-murinen Hybridoms mit einer humanen lymphoiden Zelle resultieren.
[0166] Wie hierin verwendet, betrifft "Tetrom" eine Zelllinie, welche generische Komponenten enthält, welche
ihren Ursprung in vier ursprünglich separaten Zelllinien haben. Bei diesen Tetromen handelt es sich um stabile,
immortalisierte Antikörper produzierende Zellen, welche aus der Fusion eines Trioms mit einer humanen lymphoiden Zelle resultieren, welche zur Produktion von Antikörper in der Lage ist.
[0167] Wie hierin verwendet, betrifft "autolog" eine Situation, in welcher dasselbe Subjekt sowohl die Quelle
des Zellimmunglobulins als auch das Ziel für Zellen oder Immunglobulin oder therapeutische Zusammensetzung ist.
[0168] Wie hierin verwendet, betrifft "heterolog" eine Situation, in welcher ein Subjekt die Quelle von Zellen
oder Immunglobulin und ein anderes Subjekt das Ziel für die Zelle, Immunglobulin oder therapeutische Zusammensetzung ist.
[0169] Bei der praktischen Durchführung eines beliebigen der erfindungsgemäßen Verfahren oder bei der
Herstellung einer beliebigen der pharmazeutischen Zusammensetzungen ist eine "therapeutisch wirksame
Menge" eine Menge, welche dazu in der Lage ist, an ein mit dem Befinden assoziiertes Antigen zu binden.
Dementsprechend wird die wirksame Menge je nach dem behandelten Subjekt ebenso wie dem zu behandelnden Befinden variieren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sollen die Verfahren zur Verabreichung die
kutane, subkutane, intravenöse, parenterale, orale und topische Verabreichung sowie eine Verabreichung mittels Aerosol einschließen, jedoch nicht auf diese beschränkt sein.
[0170] Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "geeigneter pharmazeutisch verträglicher Träger" einen be-
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liebigen der standardgemäßen pharmazeutisch verträglichen Träger, wie beispielsweise phosphatgepufferte
Saline-Lösung, Wasser, Emulsionen wie beispielsweise eine Öl/Wasser-Emulsion oder eine Triglyceridemulsion, verschiedene Arten von Feuchthaltemitteln, Liposomen, Tabletten, Dragees, Kapseln und RBC-shadows.
Ein Beispiel für eine verträgliche Triglyceridemulsion, welche bei der intravenösen und intraperitonealen Verabreichung der Verbindungen nützlich ist, ist die Triglyceridemulsion, welche im Handel unter der Bezeichnung
Intralipid® bekannt ist.
[0171] Typischerweise enthalten solche Träger Trägerstoffe wie beispielsweise Stärke, Milch, Zucker, bestimmte Arten von Ton, Gelatine, Stearinsäure, Talkum, pflanzliche Fett oder Öle, Gummis, Glykole oder andere bekannte Trägerstoffe. Solche Träger können ebenfalls Aroma- und Farbstoffzusätze oder andere Ingredienzien einschließen.
[0172] Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, welche dazu
in der Lage sind, an ein mit dem Befinden assoziiertes Antigen zu binden, zusammen mit geeigneten Verdünnungsmitteln, Konservierungsstoffen, Solubilisatoren, Emulgatoren, Adjuvanzien und/oder Trägern. Solche
Zusammensetzungen sind Flüssigkeiten oder lyophilisierte oder anderweitig getrocknete Formulierungen und
schließen ein: Verdünnungsmittel verschiedener Puffergehalte (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH- und ionischer Stärken, Additive wie beispielsweise Albumin oder Gelatine, um die Absorption an Oberflächen zu verhindern, Detergenzien (z. B. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, Salze der Gallensäure), solubilisierende
Agenzien (z. B. Glycerol, Polyethylenglycerol), Antioxidanzien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsstoffe (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Füllstoffe oder Modifikatoren zur Einstellung
der Tonizität (z. B. Laktose, Mannitol), kovalente Bindung von Polymeren wie beispielsweise Polyethylenglykol
an die Verbindung, Komplexierung mit Metallionen, oder Einbau der Verbindung in oder auf bestimmte Präparate von Polymerverbindungen wie beispielsweise Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Hydrogele etc. oder auf
Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, Erythrozyten-"hosts" oder
Sphäroplasten. Solche Zusammensetzungen werden Auswirkungen auf den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, Stabilität, Freisetzungsrate in vivo und Abbaurate der Verbindung oder Zusammensetzung in vivo haben.
[0173] Zusammensetzungen mit kontrollierter oder fortwährender Freisetzung schließen Formulierungen in
lipophilen Depots ein (z. B. Fettsäuren, Wachse, Öle). Ebenfalls von der Erfindung umfasst werden bestimmte
Zusammensetzungen, welche mit Polymeren beschichtet sind (z. B. Poloxamere oder Poloxamine) und die
Verbindung, gekoppelt an gegengewebespezifische Rezeptoren, Liganden oder Antigene gerichtete Antikörper oder gekoppelt an Liganden von gewebespezifischen Rezeptoren. Weitere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beinhalten bestimmte Formen von schützenden Beschichtungen, Proteaseinhibitoren oder Permeationsförderern für unterschiedliche Wege der Verabreichung, einschließlich parenteraler, pulmonaler, nasaler sowie oraler.
[0174] Nach der Verabreichung werden Verbindungen oftmals rasch im Blutkreislauf abgebaut und können
daher relativ kurzlebige pharmakologische Aktivität hervorrufen. In Folge dessen können häufige Injektionen
relativ hoher Dosen von bioaktiven Verbindungen erforderlich sein, um die therapeutische Wirksamkeit aufrecht zu erhalten. Es ist bekannt, dass Verbindungen, welche durch die kovalente Bindung von wasserlöslichen Polymeren wie beispielsweise Polyethylenglykol, Copolymere von Polyethylenglykol sowie Polypropylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon oder Polyprolin modifiziert wurden, im Anschluss an eine intravenöse Injektion wesentlich längere Halbwertszeiten im Blut aufweisen als die
entsprechenden nicht-modifizierten Verbindungen (Abuchowski et al., 1981; Newmark et al., 1982; und Katre
et al., 1987). Solche Modifikationen können ebenfalls die Löslichkeit der Verbindung in wässriger Lösung erhöhen, die Aggregation vermindern, die physikalische und chemische Stabilität der Verbindung verstärken und
die Immunogenizität und Reaktivität der Verbindung maßgeblich reduzieren. Folglich kann die gewünschte biologische Aktivität in vivo durch eine weniger häufige oder geringer dosierte Verabreichung solcher Addukte
von Polymerverbindungen erreicht werden, als es mit der nicht-modifizierten Verbindung.
[0175] Die Bindung von Polethylenglykol (PEG) an Verbindungen ist besonders nützlich, da PEG eine sehr
geringe Toxizität in Säugern aufweist (Carpenter et al., 1971). So wurde zum Beispiel ein PEG-Addukt von
Adenosindesaminase in den Vereinigten Staaten zur Verwendung im Menschen zur Behandlung von schwerem kombiniertem Immundefizienzsyndrom zugelassen. Ein zweiter Vorteil, den die Konjugation von PEG bietet, besteht in der effektiven Reduktion der Immunogenizität und der Antigenizität heterologer Verbindungen.
So könnte zum Beispiel ein PEG-Addukt eines humanen Proteins zur Behandlung einer Erkrankung in anderen
Säugerspezies nützlich sein, ohne das Risiko des Auslösens einer starken Immunantwort. Der Träger schließt
eine Vorrichtung zur Mikroverkapselung ein, so dass eine Immunantwort des Wirts gegen die Verbindung oder
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gegen Zellen, welche die Verbindung produzieren können, reduziert oder vermieden wird. Die Verbindung der
vorliegenden Erfindung kann ebenfalls mikroverkapselt in eine Membran, wie beispielsweise ein Liposom,
übermittelt werden.
[0176] Polymere wie beispielsweise PEG können in geeigneter Weise an einen oder mehrere reaktive Aminosäurereste in einem Protein gebunden werden, wie beispielsweise die alpha-Aminogruppe der aminoterminalen Aminosäure, die epsilon-Aminogruppen von Lysinseitenketten, an die Sulfhydrylgruppen von Cysteinseitenketten, die Carboxylgruppen von Aspartyl- und Glutamylseitenketten, die alpha-Carboxylgruppe der carboxyterminalen Aminosäure, Tyrosinseitenketten oder an aktivierte Derivate von Glycosylketten, welche an bestimmte Asparagin-, Serin- oder Threoninreste gebunden sind.
[0177] Es wurden zahlreiche aktivierte Formen von PEG beschrieben, welche geeignet für die direkte Reaktion mit Proteinen sind. Für die Reaktion mit Proteinaminogruppen nützliche PEG-Reagenzien schließen aktive
Ester der Carboxylsäure oder Carbonatderivate ein, insbesondere diejenigen, in welchen es sich bei den Abgangsgruppen um N-Hydroxysuccinimid, p-Nitrophenol, Imidazol oder 1-Hydroxy-2-Nitrobenzen-4-Sulfonat
handelt. PEG-Derivate, welche Maleimido- oder Haloacetylgruppen enthalten, sind nützliche Reagenzien für
die Modifikation von proteinfreien Sulfhydrylgruppen. Ebenso sind PEG-Reagenzien, welche Aminohydrazin
oder Hydrazidgruppen enthalten, nützlich für die Reaktion mit Aldehyden, welche durch Periodatoxidation von
Kohlenwasserstoffgruppen in Proteinen erzeugt wurden.
[0178] Beschrieben wird die Herstellung von gegen tumorassoziierte Antigene, Tumorzellen, infektiöse Agenzien, infektionsspezifische Antigene sowie Eigenantigene gerichteten humanen monoklonalen Antikörpern unter Verwendung eines modifizierten Zellfusionspartners, einer Triomzelllinie sowie von humanen Lymphozyten,
die aus Milz, Peyerschen Plaques oder einem beliebigen anderen Lymphgewebe oder peripherem Blut der humanen Subjekte stammen.
[0179] Antikörper werden unter Verwendung von kultivierten Zellen, aufgereinigten Antigenen, primären humanen Zellen und Geweben sowie kombinatorischen Bibliotheken selektioniert, welche für das Screenen von
Antikörpern relevant sind, einschließend Zellen und Gewebe, die von einem autologen Donor lymphoider Zellen erhalten wurden.
[0180] Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen Antikörper bereit, welcher spezifisch an auf der
Oberfläche von humanen Krebszellen lokalisiertes TIP-2-Antigen bindet und mit diesem einen Komplex bildet,
wobei es sich bei dem TIP-2-Antigen um ein Antigen handelt, an welches der monoklonale Antikörper 27.B1
spezifisch bindet. Gemäß bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem
erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper um einen murinen monoklonalen Antikörper, einen chimären
monoklonalen Antikörper, einen humanisierten monoklonalen Antikörper oder einen humanen monoklonalen
Antikörper. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper dazu in der Lage, an das Epitop zu binden, welches spezifisch durch den monoklonalen Antikörper
27.B1, erzeugt durch das Hybridom mit der ATCC-Zugangsnummer PTA-1599, erkannt wird.
[0181] Die vorliegende Erfindung stellt den monoklonalen Antikörper 27.B1 bereit, welcher durch das Hybridom mit der ATCC-Zugangsnummer PTA-1599 erzeugt wird.
[0182] Die vorliegende Erfindung stellt eine Hybridomzelle bereit, welche den monoklonalen Antikörper der
vorliegenden Erfindung erzeugt. In einer Ausführungsform der Erfindung hat die Hybridomzelle die ATCC-Zugangsnummer PTA-1599.
[0183] Das Hybridom 27.B1 wurde am 28. März 2000 bei der American Type Culture Collection (ATCC),
10801 University Boulevard, Manassas, Va, USA, hinterlegt, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren. 27.B1 wurde die ATCC-Zugangsnummer PTA-1599 zugewiesen.
[0184] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper mit einem detektierbaren Marker markiert. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es
sich bei dem detektierbaren Marker um ein radioaktives Isotop, ein Enzym, einen Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder chemilumineszierende Markierung. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der monoklonale Antikörper an ein therapeutisches Agens konjugiert. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem therapeutischen Agens um ein Radioisotop, ein Toxin, ein Toxoid
oder ein chemotherapeutisches Agens. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der monoklonale
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Antikörper an ein Imaging-Agens konjugiert. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es
sich bei dem Imaging-Agens um ein Radioisotop.
[0185] Die vorliegende Erfindung offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0186] Die vorliegende Erfindung stellt ein Vakzin bereit, umfassend den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0187] Gemäß bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper um einen murinen monoklonalen Antikörper, einen chimären monoklonalen Antikörper, einen humanisierten monoklonalen Antikörper oder einen humanen monoklonalen Antikörper. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper dazu in der Lage, an das Epitop zu binden, welches spezifisch durch den monoklonalen Antikörper 27.F7,
erzeugt durch das Hybridom mit der ATCC-Zugangsnummer PTA-1598, erkannt wird.
[0188] Die vorliegende Erfindung stellt den monoklonalen Antikörper 27.F7 bereit, welcher durch das Hybridom mit der ATCC-Zugangsnummer PTA-1598 erzeugt wird.
[0189] Die vorliegende Erfindung stellt eine Hybridomzelle bereit, welche den monoklonalen Antikörper der
vorliegenden Erfindung erzeugt. In einer Ausführungsform der Erfindung hat die Hybridomzelle die ATCC-Zugangsnummer PTA-1598.
[0190] Das Hybridom 27.F7 wurde am 28. März 2000 bei der American Type Culture Collection (ATCC),
10801 University Boulevard, Manassas, Va, USA, hinterlegt gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren. 27.F7 wurde die ATCC-Zugangsnummer PTA-1598 zugewiesen.
[0191] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper mit einem detektierbaren Marker markiert. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es
sich bei dem detektierbaren Marker um ein radioaktives Isotop, ein Enzym, einen Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder chemilumineszierende Markierung. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der monoklonale Antikörper an ein therapeutisches Agens konjugiert. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem therapeutischen Agens um ein Radioisotop, ein Toxin, ein Toxoid
oder ein chemotherapeutisches Agens. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der monoklonale
Antikörper an ein Imaging-Agens konjugiert. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es
sich bei dem Imaging-Agens um ein Radioisotop.
[0192] Die vorliegende Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0193] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Vakzin, umfassend den monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0194] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop auf dem
TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper, oder einem Fab-Fragment eines auf ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen
gerichteten Antikörpers, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, erzeugt durch das als
27.F7 bezeichnete Hybridom (ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1598) oder durch den monoklonalen Antikörper
27.B1, erzeugt durch das als 27.B1 bezeichnete Hybridom (ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1599), erkannt wird,
wobei der Antikörper oder das Fab-Fragment detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet
sind für die Erzeugung eines Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes umfassend den detektierbar markierten Antikörper oder das detektierbar markierte Fab-Fragment, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen
auf der Oberfläche von Zellen in der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen nicht gebundenen Antikörpers/Fab-Fragments in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex; und (c) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes durch Detektieren der Markierung des detektierbar markierten Antikörpers, wobei die Anwesenheit eines Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes TIP-2-Antigen tragende Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0195] Wie hierin verwendet, ist mit "Antikörper/Fab-Fragment" ein Antikörper oder ein Fab-Fragment der An-
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tikörper gemeint.
[0196] Bei der praktischen Durchführung eines beliebigen erfindungsgemäßen Verfahrens wird der nicht-gebundene Antikörper oder sein Fragment üblicherweise durch gründliches Waschen der Probe während des
Testens entfernt.
[0197] Bei der praktischen Durchführung eines beliebigen erfindungsgemäßen Verfahrens ist es wirtschaftlicher, zunächst das Fragment herzustellen und es dann mit der relevanten Markierung zu markieren.
[0198] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die detektierbare Markierung ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus einem radioaktiven Isotop, einem Enzym, einem Farbstoff, Biotin, einer fluoreszierenden Markierung oder einer chemilumineszierenden Markierung.
[0199] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0200] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0201] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0202] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0203] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Gewebe aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0204] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TIP-2 durch Alkoholpräzipitation vor Schritt
(a) aus der Probe aufkonzentriert.
[0205] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Probe um Kulturmedien.
[0206] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop auf dem
TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper, oder einem Fab-Fragment eines auf ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen
gerichteten Antikörpers, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, erzeugt durch das als
27.F7 bezeichnete Hybridom (ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1598) oder durch den monoklonalen Antikörper
27.B1, erzeugt durch das als 27.B1 bezeichnete Hybridom (ATCC-Bezeichnungs-Nr. PTA-1599), erkannt wird,
unter Bedingungen, welche geeignet sind für die Erzeugung eines Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes, umfassend den Antikörper oder das Fab-Fragment, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der
Oberfläche von Zellen in der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen nicht gebundenen Antikörpers/Fab-Fragments in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex; (c) Inkontaktbringen des
Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes aus Schritt (b) mit einem zweiten Antikörper, welcher spezifisch
an den Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex bindet, wobei der besagte zweite Antikörper detektierbar
markiert ist, unter Bedingungen, welche dazu geeignet sind, eine Bindung des zweiten markierten Antikörpers
an den Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex zu gestatten; (d) Entfernen eines jeglichen in Schritt (c)
nicht an den Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex gebundenen zweiten markierten Antikörpers; und (e)
Bestimmen der Anwesenheit des an den zweiten markierten Antikörper gebundenen Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes durch Detektieren der Markierung des zweiten Antikörpers, wobei die Anwesenheit
eines Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes TIP-2-Antigen tragende humane Krebszellen in der Probe
anzeigt.
[0207] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markie-
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rung um ein radioaktives Isotop, ein Enzym, einen Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine
chemilumineszierende Markierung.
[0208] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0209] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0210] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0211] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0212] in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Geweben aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0213] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TIP-2 durch Alkoholpräzipitation vor Schritt
(a) aus der Probe aufkonzentriert.
[0214] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen auf Oberflächen
von Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop auf
dem TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, erzeugt durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, erkannt wird, wobei der
Antikörper oder das Fab-Fragment davon detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind
für die Erzeugung eines Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den detektierbar markierten Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen nicht gebundenen markierten Antikörpers/Fab-Fragments in dem in Schritt
(a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex; und (c) Bestimmen der Anwesenheit
des Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektieren der Markierung des detektierbar markierten Antikörpers, wobei die Anwesenheit eines Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes TIP-2-Antigen tragende humane Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0215] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die detektierbare Markierung ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus einem radioaktiven Isotop, einem Enzym, einem Farbstoff, Biotin, einer fluoreszierenden Markierung oder einer chemilumineszierenden Markierung.
[0216] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0217] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0218] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0219] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0220] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe beste-
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hend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Geweben aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0221] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TIP-2 durch Alkoholpräzipitation vor Schritt
(a) aus der Probe aufkonzentriert.
[0222] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop
auf dem TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7,
produziert durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom oder ein Fab-Fragment davon erkannt wird, unter
Bedingungen, welche geeignet sind für die Erzeugung eines Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe
gebundenen Antikörper; (b) Entfernen eines jeglichen nicht gebundenen Antikörpers oder Fab-Fragments davon in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex; (c) Inkontaktbringen des Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes aus Schritt (b) mit einem zweiten Antikörper, welcher spezifisch an den Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex bindet, wobei der zweite Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche es dem zweiten markierten Antikörper in geeigneter Weise gestatten, an den Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex zu binden; (d) Entfernen eines jeglichen in Schritt (c) nicht an das Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex-Produkt gebundenen zweiten markierten Antikörpers; und (e) Bestimmen der Anwesenheit des an den zweiten
markierten Antikörper gebundenen Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektieren der Markierung des zweiten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex TIP-2-Antigen tragende humane Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0223] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, ein Enzym, einen Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine
chemilumineszierende Markierung.
[0224] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0225] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0226] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0227] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0228] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Geweben aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0229] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TIP-2 durch Alkoholpräzipitation vor Schritt
(a) aus der Probe aufkonzentriert.
[0230] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop
auf dem TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop durch den
monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom oder ein Fab-Fragment davon erkannt wird, wobei der Antikörper oder das Fab-Fragment davon detektierbar markiert ist, unter
Bedingungen, welche geeignet sind für die Erzeugung eines Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Anti-
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gen-Komplexes, umfassend den an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe
gebundenen detektierbar markierten Antikörper; (b) Entfernen eines jeglichen nicht gebundenen markierten
Antikörpers in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.B1-TIP-2-Antigen-Komplex; und (c) Bestimmen der
Anwesenheit des Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektieren der Markierung des detektierbar markierten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex TIP-2-Antigen tragende humane Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0231] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die detektierbare Markierung ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus radioaktivem Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, einer fluoreszierenden Markierung
oder einer chemilumineszierenden Markierung.
[0232] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0233] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus humanen Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen, multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen, Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0234] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0235] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0236] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Geweben aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0237] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TIP-2 durch Alkoholpräzipitation vor Schritt
(a) aus der Probe aufkonzentriert.
[0238] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen der Probe mit einem auf ein Epitop
auf dem TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop durch den
monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom oder ein Fab-Fragment davon erkannt wird, unter Bedingungen, welche geeignet sind für die Erzeugung eines Antikörper
27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes umfassend den an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe gebundenen Antikörper; (b) Entfernen eines jeglichen nicht gebundenen Antikörpers/Fab-Fragments davon in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex; (c) Inkontaktbringen des Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes aus Schritt
(b) mit einem zweiten Antikörper, welcher spezifisch an den Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex bindet, wobei der zweite Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche es dem
zweiten markierten Antikörper in geeigneter Weise gestatten, an den Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex zu binden; (d) Entfernen eines jeglichen in Schritt (c) nicht an das Antikörper
27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex-Produkt gebundenen zweiten markierten Antikörpers; und (e)
Bestimmen der Anwesenheit des an den zweiten markierten Antikörper gebundenen Antikörper
27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektieren der Markierung des zweiten Antikörpers,
wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex TIP-2-Antigen tragende
humane Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0239] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0240] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
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[0241] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus humanen Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen, multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen, Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0242] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0243] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0244] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Geweben aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0245] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TIP-2 durch Alkoholpräzipitation vor Schritt
(a) aus der Probe aufkonzentriert.
[0246] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von Krebs in einem Subjekt durch Detektion von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen bereit welches umfasst: (a) Inkontaktbringen einer von dem
Subjekt erhaltenen Probe von peripherem Blut mit einem auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop von dem monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert
durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, oder einem Fab-Fragment davon erkannt wird, wobei der Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Erzeugung eines Antikörper
27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den detektierbar markierten Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen
in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex nicht gebundenen
markierten Antikörpers/Fab-Fragments; und (c) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektieren der Markierung des detektierbar markierten Antikörpers,
wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex die Diagnose von Krebs
in dem Subjekt anzeigt.
[0247] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0248] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Subjekt um einen Menschen.
[0249] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Krebserkrankung um ein
humanes Melanom, Basalzellkarzinom, Plattenzellkarzinom, Neuroblastom, multiformes Glioblastom, myeloide Leukämie, Brustkarzinom, Darmkarzinom, Endometriumkarzinom, Lungenkarzinom, Ovarkarzinom, Prostatakarzinom, Zervikalkarzinom, Osteosarkom, Testikularkarzinom sowie Lymphom.
[0250] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0251] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0252] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Geweben aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0253] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TIP-2 durch Alkoholpräzipitation vor Schritt
31/195
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2009.03.12
(a) aus der Probe aufkonzentriert.
[0254] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von Krebs in einem Subjekt durch Detektion von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen bereit, welches umfasst: (a) Inkontaktbringen einer von dem
Subjekt erhaltenen Probe von peripherem Blut mit einem auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop von dem monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert
durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, oder einem Fab-Fragment davon erkannt wird, unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Erzeugung eines Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in
der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex nicht gebundenen Antikörpers/Fab-Fragments; (c) Inkontaktbringen des Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes aus Schritt (b) mit einem zweiten Antikörper, welcher spezifisch an den Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex bindet, wobei der zweite Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche es dem zweiten markierten Antikörper in geeigneter Weise
gestatten, an den Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex zu binden; (d) Entfernen eines jeglichen in Schritt (c) nicht an das Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex-Produkt gebundenen
zweiten markierten Antikörpers; und (e) Bestimmen der Anwesenheit des an den zweiten markierten Antikörper gebundenen Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektieren der Markierung
des zweiten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex die Diagnose von Krebs in dem Subjekt anzeigt.
[0255] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0256] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Subjekt um einen Menschen.
[0257] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Krebserkrankung um ein
humanes Melanom, Basalzellkarzinom, Plattenzellkarzinom, Neuroblastom, multiformes Glioblastom, myeloide Leukämie, Brustkarzinom, Darmkarzinom, Endometriumkarzinom, Lungenkarzinom, Ovarkarzinom, Prostatakarzinom, Zervikalkarzinom, Osteosarkom, Testikularkarzinom sowie Lymphom.
[0258] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0259] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0260] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Geweben aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0261] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TIP-2 durch Alkoholpräzipitation vor Schritt
(a) aus der Probe aufkonzentriert.
[0262] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von Krebs in einem Subjekt durch Detektion von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen bereit, welches umfasst: (a) Inkontaktbringen einer von dem
Subjekt erhaltenen Probe von peripherem Blut mit einem auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder einem Fab-Fragment, wobei das Epitop von dem monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch
das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, erkannt wird, wobei der Antikörper detektierbar markiert ist, unter
Bedingungen, welche geeignet sind zur Erzeugung eines Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den detektierbar markierten Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen in dem in Schritt (a) gebildeten
Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex nicht gebundenen markierten Antikörpers/Fab-Fragments; und (c) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes
durch Detektieren der Markierung des detektierbar markierten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex die Diagnose von Krebs in dem Subjekt anzeigt.
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[0263] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0264] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Subjekt um einen Menschen.
[0265] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Krebserkrankung um ein
humanes Melanom, Basalzellkarzinom, Plattenzellkarzinom, Neuroblastom, multiformes Glioblastom, myeloide Leukämie, Brustkarzinom, Darmkarzinom, Endometriumkarzinom, Lungenkarzinom, Ovarkarzinom, Prostatakarzinom, Zervikalkarzinom, Osteosarkom, Testikularkarzinom sowie ein Lymphom.
[0266] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0267] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0268] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Geweben aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0269] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TIP-2 durch Alkoholpräzipitation vor Schritt
(a) aus der Probe aufkonzentriert.
[0270] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose von Krebs in einem Subjekt durch Detektion von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen bereit, welches umfasst: (a) Inkontaktbringen einer von dem
Subjekt erhaltenen Probe von peripherem Blut mit einem auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop von dem monoklonalen Antikörper 27.B1/Fab-Fragment, produziert durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, oder einem Fab-Fragment davon erkannt
wird, unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Erzeugung eines Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der
Oberfläche von Zellen in der Probe; (b) Entfernen eines jeglichen in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper
27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex nicht gebundenen Antikörpers/Fab-Fragments; (c) Inkontaktbringen des Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes aus Schritt (b) mit einem zweiten Antikörper, welcher spezifisch an den Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex bindet, wobei der
zweite Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche es dem zweiten markierten Antikörper
in geeigneter Weise gestatten, an den Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex zu binden; (d)
Entfernen eines jeglichen in Schritt (c) nicht an das Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex-Produkt gebundenen zweiten markierten Antikörpers; und (e) Bestimmen der Anwesenheit des an den
zweiten markierten Antikörper gebundenen Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch
Detektieren der Markierung des zweiten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.B1/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex die Diagnose von Krebs in dem Subjekt anzeigt.
[0271] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0272] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Subjekt um einen Menschen.
[0273] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Krebserkrankung um ein
humanes Melanom, Basalzellkarzinom, Plattenzellkarzinom, Neuroblastom, multiformes Glioblastom, myeloide Leukämie, Brustkarzinom, Darmkarzinom, Endometriumkarzinom, Lungenkarzinom, Ovarkarzinom, Prostatakarzinom, Zervikalkarzinom, Osteosarkom, Testikularkarzinom sowie ein Lymphom.
[0274] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
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[0275] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0276] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Geweben aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0277] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TIP-2 durch Alkoholpräzipitation vor Schritt
(a) aus der Probe aufkonzentriert.
[0278] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vivo-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen in einem Subjekt bereit, welches umfasst: Bestimmen der Anwesenheit eines zuvor verabreichten
detektierbar markierten Antikörpers 27.F7, welcher an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt gebunden ist,
wobei der Antikörper auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen oder ein Fab-Fragment davon gerichtet ist, wobei das
Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als 27.F7 bezeichnete Hybridom, erkannt wird.
[0279] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0280] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Subjekt um einen Menschen.
[0281] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Krebserkrankung um ein
humanes Melanom, Basalzellkarzinom, Plattenzellkarzinom, Neuroblastom, multiformes Glioblastom, myeloide Leukämie, Brustkarzinom, Darmkarzinom, Endometriumkarzinom, Lungenkarzinom, Ovarkarzinom, Prostatakarzinom, Zervikalkarzinom, Osteosarkom, Testikularkarzinom sowie Lymphom.
[0282] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0283] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0284] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (b) die Anwesenheit des Antikörpers 27.F7 oder eines Fab-Fragments davon, gebunden an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt, detektiert, wobei es sich bei dem Mittel zum Detektieren der detektierbaren Markierung um eine Imaging-Vorrichtung
handelt.
[0285] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Magnetresonanz-Imaging-Vorrichtung.
[0286] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Röntgen-Immunszintigraphie-Imaging-Vorrichtung.
[0287] Die vorliegende Erfindung stellt ein in vivo-Verfahren zur Detektion von TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen in einem Subjekt bereit, welches umfasst: Bestimmen der Anwesenheit eines zuvor verabreichten
detektierbar markierten Antikörpers/Fab-Fragments 27.B1, gebunden an die Oberfläche von Zeilen in dem
Subjekt, wobei der Antikörper auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen oder ein Fab-Fragment davon gerichtet ist, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als 27.B1 bezeichnete Hybridom, erkannt wird.
[0288] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0289] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Subjekt um einen Men-
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schen.
[0290] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Krebserkrankung um ein
humanes Melanom, Basalzellkarzinom, Plattenzellkarzinom, Neuroblastom, multiformes Glioblastom, myeloide Leukämie, Brustkarzinom, Darmkarzinom, Endometriumkarzinom, Lungenkarzinom, Ovarkarzinom, Prostatakarzinom, Zervikalkarzinom, Osteosarkom, Testikularkarzinom sowie Lymphom.
[0291] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0292] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0293] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Geweben aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0294] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (b) die Anwesenheit des Antikörpers 27.B1 oder eines Fab-Fragments davon, gebunden an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt, durch
Mittel zum Detektieren der detektierbaren Markierung detektiert, wobei es sich um eine Imaging-Vorrichtung
handelt.
[0295] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Magnetresonanz-Imaging-Vorrichtung.
[0296] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Röntgen-Immunszintigraphie-Imaging-Vorrichtung.
[0297] Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Liposoms bereit, welches ein Konjugat aus exogenem Material trägt, wobei ein monoklonaler Antikörper 27.F7, produziert durch das als 27.F7 bezeichnete
Hybridom (ATCC-Bezeichnungs/Kennzeichnungs-Nr. PTA-1598), oder ein monoklonaler Antikörper 27.B1,
produziert durch das als 27.B1 bezeichnete Hybridom (ATCC-Kennzeichnungs-Nr. PTA-1599), an eine äußere
Oberfläche des Liposoms gebunden ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs
durch die zielgerichtete Verabreichung von exogenem Material an TIP-2-Antigen tragende Krebszellen eines
humanen Subjekts.
[0298] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das exogene Material ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus Anit-Krebs-Wirkstoffen, Radioisotopen, Toxinen, Antibiotika, Wirkstoffvorläufern, Enzymen und chemotherapeutischen Verbindungen.
[0299] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen, multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen, Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen,
Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen sowie Lymphomzellen.
[0300] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das exogene Material ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus Anit-Krebs-Wirkstoffen, Radioisotopen, Toxinen, Antibiotika, Wirkstoffvorläufern, Enzymen und chemotherapeutischen Verbindungen.
[0301] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen, multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen, Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen,
Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen sowie Lymphomzellen.
[0302] Offenbart wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem humanen Subjekt durch Hervorrufen
einer spezifischen Immunantwort, welche umfasst das Verabreichen eines vollständigen TIP-2-Antigen-Prote-
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ins oder eines Peptidfragments von TIP-2 an das Subjekt.
[0303] In dem zuvor beschriebenen Verfahren können das vollständige TIP-2 oder von TIP-2 abgeleitete Peptide entweder (1) direkt oder (2) an ein Trägerprotein gekoppelt oder (3) in einer Mischung mit Adjuvans oder
(4) anderweitig modifiziert (wie beispielsweise an ein Tetanus-Toxoid gekoppelt) injiziert werden, um die gegen
sämtliche TIP-2 tragenden Zellen gerichtete Immunantwort zu verstärken.
[0304] In einer Ausführungsform handelt es sich bei der spezifischen Immunantwort um eine Komplement-abhängige Zytolyse von TIP-2-Antigen tragenden. Krebszellen.
[0305] In einer Ausführungsform handelt es sich bei der spezifischen Immunantwort um eine Aktivierung natürlicher Killerzellen gegen TIP-2-Antigen tragende Krebszellen.
[0306] In einer Ausführungsform umfasst das Peptidfragment des TIP-2-Antigens die Aminosäuresequenz
Lys Leu Leu Gly Gly Gln Ile Gly Leu.
[0307] In einer Ausführungsform umfasst das Peptidfragment des TIP-2-Antigens die Aminosäuresequenz
Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr Glu Val.
[0308] Offenbart wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem humanen Subjekt durch Induktion
der Apoptose von Krebszellen, welche umfasst das Verabreichen eines vollständigen TIP-2-Antigen-Proteins
oder eines Peptidfragments von TIP-2 an das Subjekt.
[0309] Offenbart wird ein Verfahren zur Behandlung von Krebs in einem humanen Subjekt durch Hervorrufen
einer spezifischen Immunantwort, die umfasst: (a) Entfernen von dendritischen Zellen aus dem Subjekt; (b) Inkontaktbringen der dendritischen Zellen aus Schritt (a) mit einem vollständigen TIP-2-Antigen-Protein oder einem Peptidfragment von TIP-2; und (c) Wiedereinführen der dendritischen Zellen aus Schritt (b) in das Subjekt.
[0310] In dem zuvor beschriebenen Verfahren werden die dendritischen Zellen das Antigen dem autologen
Immunsystem präsentieren und dadurch Antikörper in dem Subjekt induzieren.
[0311] In einer Ausführungsform umfasst das Peptidfragment des TIP-2-Antigens die Aminosäuresequenz
Lys Leu Leu Gly Gly Gln Ile Gly Leu.
[0312] In einer Ausführungsform umfasst das Peptidfragment des TIP-2-Antigens die Aminosäuresequenz
Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr Glu Val.
[0313] In einer Ausführungsform handelt es sich bei der spezifischen Immunantwort um eine Komplement-abhängige Zytolyse von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen.
[0314] In einer Ausführungsform handelt es sich bei der spezifischen Immunantwort um eine Aktivierung natürlicher Killerzellen gegen TIP-2-Antigen tragende Krebszellen.
[0315] In einer Ausführungsform handelt es sich bei der spezifischen Immunantwort um die Produktion von
Antikörpern gegen das vollständige TIP-2-Antigen-Protein oder das Peptidfragment von TIP-2 in dem Subjekt.
[0316] In dem zuvor beschriebenen Verfahren kann es sich bei Antikörpern, welche dem Patienten zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen Krebs injiziert werden, entweder um vollständig humane, humanisierte Antikörper oder Fragmente davon handeln, welche entweder direkt oder indirekt an ein Toxin, einen Wirkstoff oder
einen Wirkstoffvorläufer, ein Enzym, ein Radionuklid oder an Liposomen gekoppelt sind, welche die Nutzlast
eines Wirkstoffs, Toxins, Wirkstoffvorläufers, Enzyms oder Radionuklids tragen. Solche Antikörper können die
Immunantwort durch Aktivieren von Effektorzellen (natürliche Killerzellen und Makrophagen) hervorrufen, was
ADCC verursacht; sie können Komplemente aktivieren, was CDC verursacht, oder sie können direkt durch
Apoptose wirken. Solche Antikörper können ebenfalls die Kaskade von anti-idiotypischen Antikörpern induzieren, wobei Ab2 (Mimetika des Antigens, in diesem Fall TIP-2) durch Induzieren von Ab3 (Mimetika des ursprünglichen Anti-TIP-2-Ab1) eine noch stärkere Immunantwort bewirken werden.
[0317] Offenbart wird ein Verfahren zum Behandeln von Krebs in einem humanen Subjekt durch Induzieren
von Apoptose von Krebszellen, die das Verabreichen eines vollständigen TIP-2-Antigen-Proteins oder eines
Peptidfragments von TIP-2 an das Subjekt umfasst.
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[0318] Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers 27.F7 oder eines
monoklonalen Antikörpers 27.B1 oder eines auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Peptidfragments davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs in einem humanen Subjekt durch passive
Immunisierung bereit.
[0319] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung induziert der Antikörper Apoptose von TIP-2-Antigen tragenden Zellen.
[0320] Bereitgestellt wird ein isoliertes Peptid mit der Aminosäuresequenz Lys Leu Leu Gly Gly Gln Ile Gly
Leu.
[0321] Bereitgestellt wird ein isoliertes Peptid mit der Aminosäuresequenz Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr
Glu Val.
[0322] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum immunhistochemischen Screenen einer Gewebesektion aus einer Tumorprobe hinsichtlich der Anwesenheit von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen, das
umfasst: (a) Inkontaktbringen der Gewebesektion aus der Tumorprobe mit einem Antikörper, gerichtet auf ein
Epitop auf TIP-2-Antigen oder ein Fab-Fragment davon, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper
27.F7, produziert durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, erkannt wird, wobei der Antikörper/das besagte Fab-Fragment detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Erzeugung eines
Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den detektierbar markierten Antikörper, gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Gewebesektion; (a) Entfernen eines jeglichen in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex
nicht gebundenen markierten Antikörpers/Fab-Fragments; und (b) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper
27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Detektieren der Markierung des detektierbar markierten
Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex TIP-2-Antigen tragende humane Krebszellen in der Probe anzeigt.
[0323] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Gewebesektion um konserviertes frisch eingefrorenes Gewebe oder um in Formalin fixiertes Gewebe.
[0324] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0325] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0326] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen. Bei dem Antikörper
handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper.
[0327] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper.
[0328] Die vorliegende Erfindung stellt ein Kit zur Detektion der Anwesenheit von TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen in einer Probe bereit, umfassend: (a) einen festen Träger mit einer Vielzahl von kovalent gebundenen Sonden, welche identisch oder unterschiedlich sein können, wobei jede Sonde einen auf ein Epitop auf
TIP-2-Antigen gerichteten monoklonalen Antikörper oder ein Fab-Fragment davon umfasst, wobei es sich bei
dem monoklonalen Antikörper um den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als 27.F7 bezeichnete Hybridom (ATCC-Kennzeichnungs-Nr. PTA-1598), oder durch monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als 27.B1 bezeichnete Hybridom (ATCC-Kennzeichnungs-Nr. PTA-1599), handelt; und (b)
ein Mittel zum Bestimmen der Anwesenheit eines monoklonalen Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes.
[0329] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Mittel zum Bestimmen
der Anwesenheit des monoklonale Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes um einen detektierbar
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markierten zweiten Antikörper, welcher spezifisch an den auf das Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten monoklonalen Antikörper bindet.
[0330] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem auf das Epitop auf
TIP-2-Antigen gerichteten monoklonalen Antikörper um den humanen monoklonalen Antikörper 27.F7, gerichtet auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert
durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, erkannt wird.
[0331] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem auf das Epitop auf
TIP-2-Antigen gerichteten monoklonalen Antikörper um den humanen monoklonalen Antikörper 27.B1, gerichtet auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert
durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, erkannt wird.
[0332] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem auf das Epitop auf
TIP-2-Antigen gerichteten monoklonalen Antikörper um einen auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten murinen monoklonalen Antikörper, wobei das Epitop durch den durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom
produzierten monoklonalen Antikörper erkannt wird.
[0333] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0334] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0335] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0336] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsie, Gewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Geweben aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedien und anderen Tumoren, für welche TIP-2 ein assoziiertes Antigen sein kann.
[0337] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Probe um Kulturmedien.
[0338] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Probe um eine Tumorprobe.
[0339] Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion der Anwesenheit von TIP-2-Antigen in einem biologischen Fluid bereit, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Probe des biologischen Fluids mit einem
auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörper oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop
durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, erkannt
wird, wobei der Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind zur Erzeugung
eines Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, umfassend den an ein beliebiges TIP-2-Antigen in der Probe gebundenen detektierbar markierten Antikörper; (c) Entfernen eines jeglichen nicht in dem
in Schritt (a) gebildeten Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex gebundenen markierten Antikörpers; und (d) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes
durch Detektieren der Markierung des detektierbar markierten Antikörpers, wobei eine Anwesenheit von Antikörper 27.F7/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex TIP-2-Antigen in dem biologischen Fluid anzeigt.
[0340] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0341] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
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[0342] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0343] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das biologische Fluid ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Schleimhautabsonderungen, Urin, Peritonealflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit sowie Lymphflüssigkeit.
[0344] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird TIP-2 durch Alkoholpräzipitation vor Schritt
(a) aus der Probe aufkonzentriert.
[0345] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem biologischen Fluid um
Kulturmedien.
[0346] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem auf das Epitop auf
TIP-2-Antigen gerichteten monoklonalen Antikörper um den humanen monoklonalen Antikörper 27.F7, gerichtet auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert
durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, erkannt wird.
[0347] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem auf das Epitop auf
TIP-2-Antigen gerichteten monoklonalen Antikörper um den humanen monoklonalen Antikörper 27.B1, gerichtet auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert
durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, erkannt wird.
[0348] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem auf das Epitop auf
TIP-2-Antigen gerichteten monoklonalen Antikörper um einen auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten murinen monoklonalen Antikörper.
[0349] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das TIP-2-Antigen auf TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen in dem biologischen Fluid vorhanden.
[0350] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum immunhistochemischen Screenen von Gewebesektionen aus einer Tumorprobe hinsichtlich der Anwesenheit von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen,
das umfasst: (a) Inkontaktbringen der Gewebesektion aus der Tumorprobe mit einem auf ein Epitop auf
TIP-2-Antigen gerichteten detektierbar markierten Antikörper oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, erkannt wird, wobei der Antikörper detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind, um den
Antikörper an TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von beliebigen Zellen in der Probe zu binden; und (b) Entfernen eines jeglichen nicht an die Zellen in der Probe gebundenen markierten Antikörpers; (c) Bestimmen der
Anwesenheit von an die Zellen in der Probe gebundenem Antikörper 27.B1, wobei eine Anwesenheit von an
Zellen gebundenem Antikörper 27.B1 TIP-2-Antigen tragende Krebszellen in der Tumorprobe anzeigt.
[0351] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Gewebesektion um konserviertes frisch eingefrorenes Gewebe oder um in Formalin fixiertes Gewebe.
[0352] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0353] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0354] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
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[0355] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper.
[0356] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem monoklonalen Antikörper um einen humanen monoklonalen Antikörper oder um einen murinen monoklonalen Antikörper.
[0357] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum Überwachen des Fortschreitens einer Krebserkrankung, wobei es sich bei Krebszellen um TIP-2-Antigen tragende Krebszellen handelt, in einem Subjekt,
umfassend: (a) Verabreichen eines auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörpers oder eines
Fab-Fragment davon an ein Subjekt mit einer Krebsdiagnose, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, erkannt wird, wobei der Antikörper
detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind, um den Antikörper an TIP-2-Antigen auf
der Oberfläche von beliebigen Zellen in dem Subjekt zu binden; (b) Bestimmen der Anwesenheit von detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment, gebunden an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt gemäß dem Verfahren nach Anspruch 23; (c) Vergleichen der Anwesenheit von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper/Fab-Fragment 27.F7 mit der Anwesenheit von (i) zum Zeitpunkt der
Diagnose oder (ii) nach Behandlung an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.F7, wobei
eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach Behandlung größere Anwesenheit von in Schritt
(b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment ein Fortschreiten der
Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt und eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach
Behandlung geringere Anwesenheit von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment eine Regression der Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt.
[0358] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0359] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0360] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0361] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (b) die Anwesenheit des detektierbar markierten Antikörpers 27.F7/Fab-Fragments durch, gebunden an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt, detektiert, durch Mittel zum Detektieren der detektierbaren Markierung, wobei es sich um eine Imaging-Vorrichtung handelt.
[0362] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Magnetresonanz-Imaging-Vorrichtung.
[0363] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Röntgen-Immunszintigraphie-Imaging-Vorrichtung.
[0364] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum Überwachen des Fortschreitens einer Krebserkrankung, wobei es sich bei Krebszellen um TIP-2-Antigen tragende Krebszellen handelt, in einem Subjekt,
umfassend: (a) Verabreichen eines auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörpers oder eines
Fab-Fragments davon an ein Subjekt mit einer Krebsdiagnose, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom, erkannt wird, wobei der Antikörper/das Fab-Fragment detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind, um den Antikörper
an TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von beliebigen Zellen in dem Subjekt zu binden; (b) Bestimmen der Anwesenheit von detektierbar markiertem Antikörper 27.B1/Fab-Fragment, gebunden an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt ist, gemäß dem Verfahren nach Anspruch 23; (c) Vergleichen der Anwesenheit von in Schritt
(b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper/Fab-Fragment 27.B1 mit der Anwesenheit von
(i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach der Behandlung an Zellen gebundenem detektierbar markiertem
Antikörper 27.B1/Fab-Fragment, wobei eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach Behandlung größere Anwesenheit von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper
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27.B1/Fab-Fragment ein Fortschreiten der Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt und eine gegenüber (i)
zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach Behandlung geringere Anwesenheit von in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.B1/Fab-Fragment eine Regression der Krebserkrankung in
dem Subjekt anzeigt.
[0365] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0366] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0367] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0368] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (b) die Anwesenheit des Antikörpers 27.B1, gebunden an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt, detektiert, durch Mittel zur Detektion der
detektierbaren Markierung, wobei es sich um eine Imaging-Vorrichtung handelt.
[0369] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Magnetresonanz-Imaging-Vorrichtung.
[0370] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Röntgen-Immunszintigraphie-Imaging-Vorrichtung.
[0371] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum Überwachen des Fortschreitens einer Krebserkrankung, wobei es sich bei Krebszellen um TIP-2-Antigen tragende Krebszellen handelt, in einem Subjekt,
umfassend: (a) Verabreichen eines auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörpers oder eines
Fab-Fragments davon an ein Subjekt mit einer Krebsdiagnose, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.F7, produziert durch das als PTA-1598 bezeichnete Hybridom, erkannt wird, wobei der Antikörper/das Fab-Fragment detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, welche geeignet sind, um den Antikörper
an TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von beliebigen Zellen in dem Subjekt zu binden; (b) Bestimmen der Quantität von detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment, gebunden an die Oberfläche von Zellen, gemäß dem Verfahren nach Anspruch 23; (c) Vergleichen der Quantität von in Schritt (b) an Zellen gebundenem
detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment mit der Anwesenheit von (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach Behandlung an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment, wobei eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach Behandlung größere Menge an in
Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.F7/Fab-Fragment ein Fortschreiten
der Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt und eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach
Behandlung geringere Menge an in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper
27.F7/Fab-Fragment eine Regression der Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt.
[0372] Aufgrund der hohen Heterogenität von Tumorzellen können in dem zuvor beschriebenen Verfahren einige Zellen mehr von dem Antigen und einige weniger davon tragen. Die Menge des Antigens kann unterschiedliche Stadien der Erkrankung bestimmen, d. h. sie kann zwischen einer präkanzerösen und einer kanzerösen Läsion differenzieren.
[0373] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemilumineszierende Markierung.
[0374] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0375] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
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Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0376] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (b) die Quantität des Antikörpers
27.F7 gebunden an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt, detektiert, durch Mittel zum Detektieren der detektierbaren Markierung, wobei es sich um eine Imaging-Vorrichtung handelt.
[0377] In der zuvor beschriebenen Ausführungsform der Erfindung kann eine Schätzung der akkumulierten
Menge des mit einem Radionuklid markierten Antikörpers durch die Verwendung einer Imaging-Vorrichtung erfolgen. Formeln helfen bei dem schlussfolgern, ob eine Akkumulation spezifisch ist oder nicht.
[0378] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Magnetresonanz-Imaging-Vorrichtung.
[0379] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Röntgen-Immunszintigraphie-Imaging-Vorrichtung.
[0380] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
[0381] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeloiden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0382] Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum Überwachen des Fortschreitens einer Krebserkrankung, wobei es sich bei Krebszellen um TIP-2-Antigen tragende Krebszellen handelt, in einem Subjekt,
umfassend: (a) Verabreichen eines auf ein Epitop auf TIP-2-Antigen gerichteten Antikörpers oder eines
Fab-Fragments davon an ein Subjekt mit einer Krebsdiagnose, wobei das Epitop durch den monoklonalen Antikörper 27.B1, produziert durch das als PTA-1599 bezeichnete Hybridom erkannt wird, wobei der Antikörper/das Fab-Fragment detektierbar markiert ist, unter Bedingungen, die geeignet sind, um den Antikörper an
TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von beliebigen Zellen in dem Subjekt zu binden; (b) Bestimmen der Quantität
von detektierbar markiertem Antikörper 27.B1/Fab-Fragment, gebunden an die Oberfläche von Zellen in dem
Subjekt, gemäß dem gemäß dem Verfahren nach Anspruch 27; (c) Vergleichen der Menge an in Schritt (b) an
Zeilen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.B1/Fab-Fragment mit der Anwesenheit von (i) zum
Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach Behandlung an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper
27.B1, wobei eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach Behandlung größere Menge an in
Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper 27.B1/Fab-Fragment ein Fortschreiten
der Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt und eine gegenüber (i) zum Zeitpunkt der Diagnose oder (ii) nach
Behandlung geringere Menge an in Schritt (b) an Zellen gebundenem detektierbar markiertem Antikörper
27.B1/Fab-Fragment eine Regression der Krebserkrankung in dem Subjekt anzeigt.
[0383] In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der detektierbaren Markierung um
ein radioaktives Isotop, Enzym, Farbstoff, Biotin, eine fluoreszierende Markierung oder eine chemolumineszierende Markierung.
[0384] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (b) die Quantität des Antikörpers
27.B1/Fab-Fragments, gebunden an die Oberfläche von Zellen in dem Subjekt detektiert durch Mittel zum Detektieren der detektierbaren Markierung, wobei es sich um eine Imaging-Vorrichtung handelt.
[0385] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Magnetresonanz-Imaging-Vorrichtung.
[0386] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Imaging-Vorrichtung um
eine Röntgen-Immunszintigraphie-Imaging-Vorrichtung.
[0387] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den TIP-2-Antigen tragenden
Krebszellen um humane Krebszellen.
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[0388] In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Krebszellen ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen,
multiformen Glioblastomzellen, myeliden leukämischen Zellen, Brustkarzinomzellen, Darmkarzinomzellen, Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Ovarkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Zervikalkarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Testikularkarzinomzellen und Lymphomzellen.
[0389] Offenbart wird ein Verfahren zum Diagnostizieren von mit der Expression von TIP-2-Antigen assoziiertem Krebs in einem humanen Subjekt, welches umfasst: (a) Erhalt von mRNA aus einer Probe von peripherem
Blut des Subjekts; (b) Präparieren von cDNA aus der mRNA aus Schritt (a); (c) Amplifizieren der in der in Schritt
(b) präparierten cDNA vorhandenen, das TIP-2-Antigen kodierenden DNA durch eine Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von mindestens zwei Oligonukleotidprimern, wobei ein jeder der Primer spezifisch mit
der TIP-2-Antigen kodierenden DNA hybridisiert; und (d) Detektieren der Anwesenheit einer jeglichen daraus
resultierenden amplifizierten DNA, wobei die Anwesenheit einer solchen amplifizierten DNA diagnostisch für
mit der Expression von TIP-2-Antigen assoziierten Krebs ist.
[0390] Da die Nukleinsäurestruktur von TIP-2 bekannt ist, kann der Fachmann in dem zuvor beschriebenen
Verfahren die Expression von TIP-2-mRNA durch Northern Blot messen, da die vollständige mRNA-Sequenz
bekannt ist und daher die Volllängen-cDNA hergestellt werden kann. Ein weiterer Weg zur Messung der Expression ist durch quantitative PCR unter Verwendung von 18–21-mer-Primern auf der Grundlage der bekannten mRNA-Sequenz. Der Fachmann kann ebenfalls spezifische Primer synthetisieren oder die Volllängen-cDNA herstellen. Die vollständige mRNA-Sequenz von GIPC (GAIP-interagierendes Protein, C-Terminus) ist in
Fig. 24 gezeigt, wobei der der TIP-2-Sequenz entsprechende Teil unterstrichen ist.
[0391] In einer Ausführungsform wird die Anwesenheit jeglicher in Schritt (d) amplifizierten DNA unter Verwendung einer markierten Oligonukleotidsonde detektiert, welche spezifisch mit der amplifizierten DNA hybridisiert.
[0392] In einer Ausführungsform wird die markierte Sonde mit 32P oder 33P radiomarkiert.
[0393] Offenbart wird ein Verfahren zum Diagnostizieren von mit der Expression von TIP-2-Antigen assoziiertem Krebs in einem humanen Subjekt, welches umfasst: (a) Erhalt von mRNA aus einer Probe von peripherem
Blut des Subjekts; (b) Präparieren von cDNA aus der mRNA aus Schritt (a); (c) Amplifizieren der in der in Schritt
(b) präparierten cDNA vorhandenen, das TIP-2-Antigen kodierenden DNA; (d) Bestimmen der Menge an jeglicher daraus resultierender amplifizierter DNA; und (e) Vergleichen der in Schritt (d) bestimmten Menge an amplifizierter DNA mit zuvor bestimmten Standardmengen an amplifizierter DNA, wobei jede Standardmenge indikativ für ein bestimmtes Stadium von mit der Expression von TIP-2-Antigen assoziiertem Krebs ist.
[0394] In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Stadium um präkanzerösen Krebs oder gutartige
Dysplasie.
[0395] In einer Ausführungsform ist die Krebserkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem
Tumor, einer Krebserkrankung in den Lymphknoten und metastatischem Krebs.
[0396] Das am häufigsten angewandte System zur Stadieneinteilung ist das auf dem so genannten TNM-System basierende (T, Tumor; N, Knoten; und M, Metastasen). In Stadium 0 liegt die Paget-Krankheit ohne einen
Tumor oder ein Karzinom in situ vor, wobei keine Lymphknoten betroffen und ohne Metastasen. In Stadium 1
liegt ein Tumor nicht größer als 2 cm ohne Metastasen und ohne dass Lymphknoten betroffen sind vor. In Stadium II liegt ein Tumor größer als 5 cm vor, mit Achsellymphknoten betroffen, ohne entfernt liegenden Metastasen. Stadium III ist identisch mit Stadium II, wobei eine Reihe der betroffenen Lymphknoten aneinander oder
an anderen Strukturen und im fortgeschrittenen Stadium an Lymphknoten in der Brustdrüse fixiert sind. Bei
Stadium IV handelt es sich um die am weitesten fortgeschrittene Erkrankung, mit einem Tumor beliebiger Größe, massiver Einbeziehung von Lymphknoten und beliebigen entfernt liegenden Metastasen.
[0397] Wie hierin verwendet, umfasst "vollständiges TIP-2-Antigen-Protein" die in Fig. 23 dargestellte Aminosäuresequenz.
[0398] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ein Vakzin, umfassend einen monoklonalen Antikörper, erzeugt durch das hierin beschriebene Verfahren, sowie einen geeigneten Träger.
[0399] Die vorliegende Erfindung offenbart ebenfalls ein Vakzin, umfassend eine wirksame Menge eines mo-
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noklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0400] Gemäß bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Befinden
um Krebs und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um das Wachstum des Krebses zu inhibieren oder diesen zu eliminieren. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem Krebs um
Brustkrebs, Schilddrüsenkrebs oder Prostatakrebs. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich
bei dem Befinden um eine Infektion und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um das
Wachstum des infektiösen Agens zu inhibieren oder das Agens abzutöten. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem infektiösen Agens um Hantavirus, HTLV I, HTLV II, HIV, Herpesvirus, Influenzavirus, Ebolavirus, humanes Papillomavirus, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, Anthrax oder
Cryptococcus. Gemäß bestimmter Ausführungsformen ist das Befinden mit einem Toxin assoziiert und die
Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um die Menge an Toxin zu reduzieren oder dieses zu zerstören. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem Toxin um Tetanus, Anthrax, Botulin,
Schlangengift oder Spinnengift. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden um
eine Autoimmunkrankheit und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um die Menge an
krankmachenden Antikörper zu reduzieren oder zu zerstören. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Autoimmunkrankheit um Lupus, Thyroiditis, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatsabstoßung oder rheumatoide Arthritis.
[0401] Gemäß bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der monoklonale Antikörper an
ein Effektormolekül gebunden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es
sich bei dem Effektormolekül um ein zytotoxisches Agens, einen Wirkstoff, ein Enzym, einen Farbstoff oder ein
Radioisotop. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der monoklonale Antikörper an
einen Träger gebunden. Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich
bei dem Träger um ein Liposom.
[0402] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ein Verfahren zum Behandeln eines Befindens in einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer Menge des zuvor beschriebenen Vakzins an ein Subjekt, welche ausreichend wirksam ist, um das mit dem Befinden assoziierte Antigen zu binden, wodurch das Befinden
in dem Subjekt behandelt wird.
[0403] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ein Verfahren zur Vermeidung eines Befindens in
einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer Menge des zuvor beschriebenen Vakzins an das Subjekt,
welche ausreichend wirksam ist, um das mit dem Befinden assoziierte Antigen zu binden, wodurch das Befinden in dem Subjekt vermieden wird. In einer Ausführungsform der Erfindung zeigte das Subjekt bereits vorher
das Befinden. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Vakzin an ein zweites Subjekt verabreicht.
[0404] Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist das Befinden assoziiert mit: einer Krebserkrankung,
einem Tumor, einem Toxin, einem infektiösen Agens, einer Enzymdysfunktion, einer Hormondysfunktion, einer
Autoimmunkrankheit, einer Immundysfunktion, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem eukaryotischen Antigen oder Abstoßung eines transplantierten Gewebes. In einer anderen Ausführungsform der
Erfindung handelt es sich bei dem Befinden um Septikämie, Sepsis, septischen Schock, Virämie, Bakterämie
oder Fungämie. Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Krebserkrankung um Schilddrüsenkrebs, Brustkrebs oder Prostatakrebs. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung
handelt es sich bei dem infektiösen Agens um Hantavirus, HTLV I, HTLV II, HIV, Herpesvirus, Influenzavirus,
Ebolavirus, humanes Papillomavirus, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, Anthrax oder Cryptococcus. Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Toxin um Tetanus, Anthrax, Botulin, Schlangengift oder Spinnengift. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Tumor
gutartig. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Enzymdysfunktion um
Hyperaktivität oder Überproduktion des Enzyms. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Hormondysfunktion um Hyperaktivität oder Überproduktion des Hormons. In einer anderen
Ausführungsform der Erfindung wird die Immundysfunktion durch CD3 oder CD4 vermittelt. In einer weiteren
Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Autoimmunkrankheit um Lupus, Thyroiditis, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatsabstoßung oder rheumatoide Arthritis.
[0405] Des Weiteren offenbart wird ein Vakzin, umfassend ein vollständiges TIP-2-Antigen-Protein oder eine
Peptidform von TIP-2 sowie einen geeigneten Träger.
[0406] Ebenfalls offenbart wird ein Vakzin, umfassend eine wirksame Menge eines vollständigen TIP-2-Anti-
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gen-Proteins oder einer Peptidform von TIP-2 sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
[0407] Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden um Krebs und die Menge
des vollständigen TIP-2-Antigen-Proteins oder eine Peptidform von TIP-2 ist ausreichend, um das Wachstum
des Krebses zu inhibieren oder diesen zu eliminieren. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich
bei dem Krebs um Brustkrebs, Schilddrüsenkrebs oder Prostatakrebs. Gemäß bestimmter Ausführungsformen
handelt es sich bei dem Befinden um eine Infektion und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um das Wachstum des infektiösen Agens zu inhibieren oder dieses abzutöten. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem infektiösen Agens um Hantavirus, HTLV I, HTLV II, HIV, Herpesvirus,
Influenzavirus, Ebolavirus, humanes Papillomavirus, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, Anthrax oder Cryptococcus. Gemäß bestimmter Ausführungsformen ist das Befinden mit einem Toxin assoziiert
und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um die Menge an Toxins zu reduzieren oder dieses zu zerstören. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem Toxin um Tetanus, Anthrax,
Botulin, Schlangengift oder Spinnengift. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden um eine Autoimmunkrankheit und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um die Menge an krankmachendem Antikörper zu reduzieren oder zu zerstören. In bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei der Autoimmunkrankheit um Lupus, Thyroiditis, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatsabstoßung oder rheumatoide Arthritis.
[0408] Gemäß bestimmter Ausführungsformen wird das vollständige TIP-2-Antigen-Protein oder die Peptidform von TIP-2 an ein Effektormolekül gebunden. Gemäß einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei
dem Effektormolekül um ein zytotoxisches Agens, einen Wirkstoff, ein Enzym, einen Farbstoff oder ein Radioisotop. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der monoklonale Antikörper an einen Träger
gebunden. Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Träger
um ein Liposom.
[0409] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ein Verfahren zum Behandeln eines Befindens in einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer Menge des zuvor beschriebenen Vakzins an das Subjekt,
welche ausreichend wirksam ist, um das mit dem Befinden assoziierte Antigen zu binden, wodurch das Befinden in dem Subjekt behandelt wird.
[0410] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ein Verfahren zur Vermeidung eines Befindens in
einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer Menge des zuvor beschriebenen Vakzins an das Subjekt,
welche ausreichend wirksam ist, um das mit dem Befinden assoziierte Antigen zu binden, wodurch das Befinden in dem Subjekt vermieden wird. In einer Ausführungsform der Erfindung zeigte das Subjekt bereits vorher
das Befinden. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Vakzin an ein zweites Subjekt verabreicht.
[0411] Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist das Befinden assoziiert mit: einer Krebserkrankung,
einem Tumor, einem Toxin, einem infektiösen Agens, einer Enzymdysfunktion, einer Hormondysfunktion, einer
Autoimmunkrankheit, einer Immundysfunktion, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem eukaryotischen Antigen oder Abstoßung eines transplantierten Gewebes. In einer anderen Ausführungsform der
Erfindung handelt es sich bei dem Befinden um Septikämie, Sepsis, septischen Schock, Virämie, Bakterämie
oder Fungämie. Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Krebserkrankung um Schilddrüsenkrebs, Brustkrebs oder Prostatakrebs. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung
handelt es sich bei dem infektiösen Agens um Hantavirus, HTLV I, HTLV II, HIV, Herpesvirus, Influenzavirus,
Ebolavirus, humanes Papillomavirus, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, Anthrax oder Cryptococcus. Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Toxin um Tetanus, Anthrax, Botulin, Schlangengift oder Spinnengift. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Tumor
gutartig. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Enzymdysfunktion um
Hyperaktivität oder Überproduktion des Enzyms. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Hormondysfunktion um Hyperaktivität oder Überproduktion des Hormons. In einer anderen
Ausführungsform der Erfindung wird die Immundysfunktion durch CD3 oder CD4 vermittelt. In einer weiteren
Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Autoimmunkrankheit um Lupus, Thyroiditis, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatsabstoßung oder rheumatoide Arthritis.
[0412] Des Weiteren offenbart wird ein Vakzin, umfassend dendritische Zellen, welche aus einem Patienten
entfernt und mit einem vollständigen TIP-2-Antigen-Protein oder einer Peptidform von TIP-2 sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger in Kontakt gebracht wurden.
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[0413] Ebenfalls offenbart wird ein Vakzin, umfassend eine wirksame Menge an dendritischen Zellen, welche
aus einem Patienten entfernt und mit einem vollständigen TIP-2-Antigen-Protein oder einer Peptidform von
TIP-2 sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger in Kontakt gebracht wurden.
[0414] Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden um Krebs und die Menge
an dendritischen Zellen, welche aus einem Patienten entfernt und mit einem vollständigen TIP-2-Antigen-Protein oder einer Peptidform von TIP-2 in Kontakt gebracht wurden, ist ausreichend, um das Wachstum des Krebses zu inhibieren oder diesen zu eliminieren. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem
Krebs um Brustkrebs, Schilddrüsenkrebs oder Prostatakrebs. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt
es sich bei dem Befinden um eine Infektion und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um
das Wachstum des infektiösen Agens zu inhibieren oder das Agens abzutöten. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem infektiösen Agens um Hantavirus, HTLV I, HTLV II, HIV, Herpesvirus, Influenzavirus, Ebolavirus, humanes Papillomavirus, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, Anthrax
oder Cryptococcus. Gemäß bestimmter Ausführungsformen ist das Befinden mit einem Toxin assoziiert und
die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um die Menge an Toxin zu reduzieren oder dieses zu
zerstören. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem Toxin um Tetanus, Anthrax, Botulin,
Schlangengift oder Spinnengift. Gemäß bestimmter Ausführungsformen handelt es sich bei dem Befinden um
eine Autoimmunkrankheit und die Menge an monoklonalem Antikörper ist ausreichend, um die Menge an
krankmachenden Antikörper zu reduzieren oder zu zerstören. In bestimmten Ausführungsformen handelt es
sich bei der Autoimmunkrankheit um Lupus, Thyroiditis, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatsabstoßung
oder rheumatoide Arthritis.
[0415] Gemäß bestimmter Ausführungsformen sind die dendritischen Zellen, welche aus einem Patienten
entfernt und mit einem vollständigen TIP-2-Antigen-Protein oder einer Peptidform von TIP-2 in Kontakt gebracht wurden an ein Effektormolekül gebunden. Gemäß einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei
dem Effektormolekül um ein zytotoxisches Agens, einen Wirkstoff, ein Enzym, einen Farbstoff oder ein Radioisotop. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der monoklonale Antikörper an einen
Träger gebunden. Gemäß einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Träger um ein Liposom.
[0416] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ein Verfahren zum Behandeln eines Befindens in einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer Menge des zuvor beschriebenen Vakzins an ein Subjekt, welche ausreichend wirksam ist, um das mit dem Befinden assoziierte Antigen zu binden, wodurch das Befinden
in dem Subjekt behandelt wird.
[0417] Die vorliegende Erfindung offenbart des Weiteren ein Verfahren zur Vermeidung eines Befindens in
einem Subjekt, umfassend das Verabreichen einer Menge des zuvor beschriebenen Vakzins an ein Subjekt,
welche ausreichend wirksam ist, um das mit dem Befinden assoziierte Antigen zu binden, wodurch das Befinden in dem Subjekt vermieden wird. In einer Ausführungsform der Erfindung zeigte das Subjekt zuvor das Befinden. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Vakzin an ein zweites Subjekt verabreicht.
[0418] Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist das Befinden assoziiert mit: einer Krebserkrankung,
einem Tumor, einem Toxin, einem infektiösen Agens, einer Enzymdysfunktion, einer Hormondysfunktion, einer
Autoimmunkrankheit, einer Immundysfunktion, einem viralen Antigen, einem bakteriellen Antigen, einem eukaryotischen Antigen oder Abstoßung eines transplantierten Gewebes. In einer anderen Ausführungsform der
Erfindung handelt es sich bei dem Befinden um Septikämie, Sepsis, septischen Schock, Virämie, Bakterämie
oder Fungämie. Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Krebserkrankung um Schilddrüsenkrebs, Brustkrebs oder Prostatakrebs. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung
handelt es sich bei dem infektiösen Agens um Hantavirus, HTLV I, HTLV II, HIV, Herpesvirus, Influenzavirus,
Ebolavirus, humanes Papillomavirus, Staphylococcus, Streptococcus, Klebsiella, E. coli, Anthrax oder Cryptococcus. Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei dem Toxin um Tetanus, Anthrax, Botulin, Schlangengift oder Spinnengift. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Tumor
gutartig. In noch einer anderen Ausführungsform handelt es sich bei der Enzymdysfunktion um Hyperaktivität
oder Überproduktion des Enzyms. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei
der Hormondysfunktion um Hyperaktivität oder Überproduktion des Hormons. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Immundysfunktion durch CD3 oder CD4 vermittelt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Autoimmunkrankheit um Lupus, Thyroiditis, Transplantat-Wirt-Reaktion, Transplantatsabstoßung oder rheumatoide Arthritis.
[0419] Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden experimentellen Details besser verstanden
werden. Es wird jedoch für den Fachmann offensichtlich sein, dass die besprochenen spezifischen Verfahren
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und Ergebnisse lediglich dem Zweck der Veranschaulichung der Erfindung dienen, wie sie in den nachstehenden Ansprüchen umfassender beschrieben ist.
Experimentelle Details:
ERSTE REIHE VON EXPERIMENTEN
BEISPIEL 1: Konstruktion eines Maus-humanen Heteromyeloms zur Produktion humaner monoklonaler Antikörper.
Einführung
[0420] B6B11-Zellen oder B6B11-ähnliche Zellen können durch die Fusion von Maus-Myelomzellen mit humanen Myelomzellen, derart ausgewählt, dass sie keinen Antikörper sekretieren, hergestellt werden. Die spezifische Erzeugung und Anwendung von Heteromyelom-B6B11 wird hierin nachfolgend beschrieben. B6B11
wurde erhalten durch Fusionieren des Maus-HAT-sensitiven und G-418-resistenten Myeloms X63.Ag8.653 mit
dem Subklon des humanen Myeloms RPMI 8226, derart ausgewählt, dass es keine Lambda-Leichtketten sekretiert. Eine Fusion von humanen Splenozyten und B6B11-Zellen resultierte in einer Fusionsfrequenz von
30–50 Hybriden pro 107 Zellen. Dies ist ähnlich der Frequenz der murinen Hybridombildung. Die Hybride können mittels limitierender Verdünnung einfach kloniert werden, erzeugen für mindestens 10 Monate Antikörper
und wachsen in serumfreien Medien. Es wurden zwei Klone erhalten, welche gegen Lipopolysaccharid (LPS)
aus gramnegativen Bakterien reaktives humanes IgM sekretierten. Diese Klone wurden durch Fusionieren von
in vitro-immunisierten humanen Splenozyten mit den B6B11-Zellen erhalten. Es ist bekannt, dass muriner Anti-Lipid A mAb die Entwicklung von septischem Schock verhindert (Shnyra, AA., et al., 1990). Für humane
mAbs gibt es wichtige klinische Anwendungsgebiete.
Ergebnisse
[0421] Heteromyelom B6B11. Es wurde ein Heteromyelom, B6B11, durch PEG-Fusion des Maus-Myeloms
653 (HAT-sensitiv, G-418) mit humanem RPMI8226 erzeugt, welches derart ausgewählt wurde, dass es keine
Lambdaketten sekretiert. Die Hybride wurden in der Anwesenheit von HAT und G-418 selektioniert. Die Selektionierung hinsichtlich der 8-Ag-Resistenz erfolgte durch allmähliche Steigerung der 8-Ag-Konzentration von 2
μg/ml bis 20 μg/ml über 2,5 bis 3 Wochen. Die HAT-sensitive Hybridpopulation 653 × 8226 wurden zweimal
kloniert. Die Klone wurden auf ihre Fähigkeit getestet, Hybride mit humanen Lymphozyten zu produzieren. Es
wurde ein Klon ausgewählt, bezeichnet als B6B11. Während eines Zeitraums von 5–6 Tagen starben
B6B11-Zellen in Aminopterin-enthaltendem Medium; in mehr als 18 Monaten wurden keine Revertanten detektiert. In RPMI 1640, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (FCS) wies die Linie eine Verdopplungszeit von
etwa 25–30 Stunden auf; die maximale Dichte in 75 cm2 Kolben betrug etwa 1,5 × 106 Zellen/ml (in einem Volumen von 30 ml). B6B11-Kulturmedium wurde mittels ELISA (enzyme-linked immunoassay) unter Verwendung von Kaninchen-anti-human-Immunglobulin auf die Anwesenheit von humanem Immunglobulin getestet.
B6B11 zeigte Sekretion von IgG, IgM oder IgA. Durch Färben der Zellpräparate mit MAH-L, H mittels der
PAP-Technik wurden keine Spuren von zytoplasmischem humanem Leicht- und Schwerketten-Immunglobulin
detektiert.
[0422] Karyotypisierung. Fig. 1 illustriert die Verteilung von parentalen und B6B11-Zellen anhand des Chromosomengehalts. Eine Chromosomenanalyse der Heteromyelomzellen zeigte an, dass die Anzahl der Chromosomen zwischen 60 und 82 variiert.
[0423] Fig. 2 zeigt ein Fragment des G-Banden-Karyotyps von B6B11-Zellen. Normale Maus-Chromosomen
konstituieren etwa 84% des Karyotyps. Es liegen einige neu angeordnete Chromosomen vor. Es liegen einige
Marker für Maus-Myelomchromosomen ebenso wie neu angeordnete Heteromyelom (human-Maus-chimäre)-Chromosomen vor. In allen untersuchten B6B11-Metaphasenplatten war ein großes telozentrisches Chromosom vertreten. Dies legte nahe, dass der proximale Abschnitt dieses Chromosoms Maus- und der distale
Abschnitt humanes genetisches Material von Chromosom 3 (3p21.1-3p ter) enthält. Eine Lokalisierung des humanen Materials wurde wie beschrieben durchgeführt (33). In einigen der analysierten B6B11-Zellen war das
humane Chromosom 19 und das humane Chromosom 7 deletiert.
[0424] Fusion von B6B11-Zellen mit humanen Lymphozyten. Es wurde eine Fusion von B6B11-Zellen mit
frisch isolierten Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL) und Lymphozyten aus der Milz (SPL) wie hierin nachfolgend im Abschnitt der experimentellen Vorgehensweisen beschrieben durchgeführt. Eine Fusion von Lym-
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phozyten aus peripherem Blut (PBL) und Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL), welche mit Pokeweed-Mitogen (PWM) behandelt wurden, führte zu einer geringen Hybridomausbeute (1–5 Hybride pro 107 Lymphozyten), während eine Fusion von Milzlymphozyten (SPL) und mit (PWM) behandelten Milzlymphozyten (SPL)
30–60 Hybride pro 10 Zellen ergab (siehe Tabelle 1). Nach der Fusion wurden die Zellen in einer Dichte von
1,5 × 105 Zellen pro Well ausgesät. Variationen der Zellverhältnisse von 1:1 bis 1:2 (Heteromyelom:Lymphozyt)
hatten keine Auswirkung auf die Fusionseffizienz für PBL oder SPL. Die Fusionseffizienz wurde jedoch bei Verhältnissen von B6B11:Lymphozyt von 1:4 bis 1:8 dramatisch reduziert.
Tabelle 1
Fusion humaner Lymphozyten mit B6B11-Zellen.
LYMPHOZYTEN
PBL
PBL-PWM
SPL
SPL-PWM
Nummer der Fusion
4
6
10
8
Anzahl der Wells
1536
2304
4800
3072
4
6,9
55
72
Hybridpopulationen pro 10 Lymphozyten
1–3
3–5
30–50
40–60
Wells mit Ig-Sekretion4, %
95
92
84
82
2
Wachstum , %
3
7
1
Frisch isolierte Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL) und Splenozyten (SPL) wurden für 7–9 Tage in komplettem RPMI 1640, ergänzt mit 15% FCS, mit PWM (5 μg/ml) aktiviert.
2
Wells mit Hybriden (% der Gesamtanzahl an Wells)
3
Nach der Fusion wurden die Zellen mit einer Dichte von 15 × 104 Zellen/Well ausgesät.
4
Die gesamte Ig-Produktion wurde über ELISA mit monoklonalen Maus-Antikörpern gegen H- und L-Ketten
von humanem Ig ELISA bestimmt.
[0425] Die Auswirkungen der Splenozytenstimulation mit verschiedenen Mitogenen auf die Fusionseffizienz
sind in Fig. 3 illustriert. PWM-Behandlung erhöhte die Effizienz der SPL-Hybridisierung im Vergleich zur ConA-Behandlung, PHA-Behandlung, LPS-Behandlung oder unbehandelten SPL signifikant. Die Fusionseffizienz hing von dem Zeitpunkt der Zugabe von HAT ab. Wurde HAT unmittelbar im Anschluss an die Fusion zugegeben, verringerte sich die Ausbeute auf 10–15 Hybride pro 107 Lymphozyten (für SPL).
[0426] Das Klonieren von Hybriden mit SPL und PBL (stimuliert und nicht stimuliert) zeigte an, dass PBL nicht
zur Hybridombildung verwendet werden konnten. Die Klonierung wurde 4–6 Wochen nach der Fusion in 50%
epithelkonditionierten Medien (ECM) (vorinkubiert für 24 Stunden bei 37°C in 96-Well-Platten) und 50% RPMI
1640, enthaltend 15% FCS, durchgeführt. Die Ergebnisse wurden nach 2–2,5 Wochen bestimmt. Die Klonierungseffizienz (1,5–2 Zellen pro Well) betrug 50–80% für SPL und 10–30% für PBL. Ein ELISA unter Verwendung von Kaninchen-anti-human-Immunglobulin und MAH-L, H zeigte an, dass die Produktion von Gesamtimmunglobulin in 90–95% der wachsenden Hybride mit PBL und 80–85% mit SPL-Hybridomen stattfand. Basierend auf SPL wurde selektioniert für PWM-Stimulation und in vitro-Immunisierung.
[0427] Um die Effizienz der Hybridisierung zu steigern, wurden Splenozyten mit 2,5 mM Leu-Ome behandelt
und in einem Verhältnis von 1:1 oder 1:2 (B6B11:SPL) mit B6B11-Zellen fusioniert (siehe Tabelle 2). Die Auswirkung dieser Behandlung war bei Kultivierung mit PWM nach 18–24 Stunden zu sehen; bei SPL ohne
Leu-Ome-Behandlung zeigten sich erst nach drei Tagen Blasten. Die Effizienz der Hybridisierung von
Leu-Ome behandelten SPL war ein wenig höher (80%) im Vergleich zu nicht behandelten SPL (72%). Diese
Behandlung erhöhte die Anzahl der Ig-sekretierenden Hybride beachtlich (93%).
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Tabelle 2
Auswirkung der Leu-Ome-Behandlung von Splenozyten auf die Effizienz ihrer Hybridisierung mit B6B11-Zellen
(Daten aus 3 Milzen)
Lymphozyten
Anzahl der Wells
Wells mit Hybrid-Populationen, (%)
Wellst mit Ig-Sekretion,
(%)
SPL
1440
1034 (72)
825 (80)
SPL-Leu-Ome
864
691 (80)
642 (93)
1
Splenozyten wurden in LSM isoliert. Ein Teil wurde mit Leu-Ome (2,5 mM, 40 Minuten in serumfreiem RPMI
1640) behandelt, der andere diente als eine Kontrolle. Vor der Fusion wurden beide Teile für 7 Tage in komplettem RPMI 1640, ergänzt mit 15% FCS, in der Anwesenheit von 5 μg/ml PWM kultiviert.
2
Die Ig-Produktion wurde über ELISA mit monoklonalen Maus-Antikörpern gegen H- und L-Ketten von humanem Ig bestimmt.
[0428] Die Heteromyelomzellen wurden in der Anwesenheit von PWM und Maus-Thymozyt-konditionierten
Medien (TCM) mit Leu-Ome-behandelten Splenozyten, immunisiert mit Salmonella minnesota Re595 (Re595),
fusioniert (Tabelle 3). Die Hybridomkulturüberstände wurden in verschiedenen Stadien des Hybridwachstums
auf antibakterielle Antikörper getestet: (1) nach dem Transferieren von responsiven Populationen auf
24-Well-Platten und (2) nach der Klonierung und der darauf folgenden klonalen Expansion. Es wurden zwei
unabhängige antibakterielle Antikörper produzierende Klone ausgewählt. Über ELISA, unter Verwendung immobilisierter Lipopolysaccharide (LPS) oder immobilisierten Re595 und LPS in Lösung, wurde bestimmt, dass
die von beiden Klonen erzeugten Antikörper mit LPS reagierten.
[0429] Über ELISA, unter Verwendung von immobilisierten monoklonalen Maus-anti-humanen Re595-Isotypen und Ziege-anti-Maus-Peroxidasekonjugat, absorbiert mit humanem Immunglobulin, wurde bestimmt, dass
es sich bei dem Antikörper-Isotyp um IgM-Kappa handelte. Durch allmähliches Ersetzen des 10% FCS enthaltenden Wachstumsmediums wurden beide Klone an serumfreie Medien (SFM) angepasst. Die maximale Dichte nach der Kultivierung in SFM lag bei etwa 1,2 × 106 Zellen/ml. An SFM angepasste Zellen wurden wie zuvor
beschrieben kloniert. Die Effizienz und Klonierungszeit waren ähnlich wie bei den Zellen, die in Serum-ergänztem RPMI 1640 Medium kultiviert wurden.
Tabelle 3
Fusion von in vitro immunisierten Splenozyten1 mit B6B11-Zellen.
Nummer der Fusion
1
2
3
Anzahl der Wells
288
864
576
Wells mit Hybridpopulationen, (%)
193 (69)
734 (85)
472 (82)
Wells mit Ig-Sekretion, (%)
173 (90)
675 (92)
420 (89)
Primäre Antwort auf Re595, Anzahl der
Wells
9 (4,5)
-
17 (3,6)
Sekundäre Antwort3, Anzahl der Wells
2
-
16
Anzahl responsiver Populationen nach
Klonierung
-
-
2
2
1
Splenozyten wurden nach Behandlung mit Leu-Ome (2,5 mM, 40 min) in vitro mit S. minnesota-Re595
(107–1010 Zellen/ml) in der Anwesenheit von PWM (5 μg/ml) und TCM für 7–9 Tage immunisiert. Fusionen mit
B6B11-Zellen erfolgten in Verhältnissen 1:1 und 1:2.
2
ELISA von Hybridomkulturüberständen von 96-Well-Platten (Kaninchen-anti-human-Ig).
3
ELISA von Hybridomkulturüberständen nach Transferieren in 24-Well-Platten (Kaninchen-anti-human-Ig).
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[0430] DNA-Analyse. Fig. 4 illustriert die Verteilung des DNA-Gehalts durch parentale Linien, B6B11-Heteromyelom und B6B11-Splenozyten-Hybrid. Die DNA von Heteromyelomzellen besteht aus 78,7% der gesamten
parentalen DNA. Der DNA-Gehalt von B6B11-Splenozyt-Hybridzellen ist 3% höher als der von B6B11-Zellen.
Diskussion
[0431] Es wurde eine Partnerzelllinie für die Produktion von humanen monoklonalen Antikörpern erzeugt,
durch somatische Hybridisierung von Maus-X63.Ag8.653 und humanen RPMI 1640-Myelomzellen. Die Adaption an Medium mit 8-Ag, nachfolgende Klonierung und Selektion über Hybridisierungseffizienz führten zu einem Heterohybridklon, bezeichnet als B6B11. Eine Fusion zwischen Heterohybridlinien und Lymphozyten ergibt im Wesentlichen stabile produktive Hybride (Raison, RL., et al., 1982). Die Mechanismen, die diesem Phänomen zu Grunde liegen, sind nicht bekannt. Es wird darauf geschlossen, dass humane Chromosomen oder
deren Fragmente, welche in der Partnerlinie beibehalten werden, nach der ersten Fusion die intrazelluläre Umgebung derart modifizieren, dass die humanen Lymphozyten-Chromosomen oder Fragmente nach der zweiten
Fusion stabilisiert werden (Oestberg, L. und Pursch, E., 1983). Die große Anzahl an Chromosomen, die Anwesenheit von Hybridmarker-Chromosomen und erhöhter DNA-Gehalt, beobachtet in den hierin beschriebenen
Experimenten, bestätigten die Hybridnatur von B6B11-Zellen. Der DNA-Gehalt von B6B11-SPL-Hybridzellen
wurde ebenfalls erhöht. Immunhistochemisches Testen auf intrazelluläre schwere und leichte Ketten sowie
ELISA-Tests auf Immunglobulin-Sekretion zeigten, dass B6B11-Zellen weder Immunglobuline noch schwere
und leichte Ketten produzieren. Eine Fusion von B6B11 mit SPL ergab mehr Hybride als eine Fusion mit PBL
(30–50 pro 107 SPL-Verbindung bis 1–5 pro 107 PBL). Die Klonierungseffizienz mit SPL lag bei 50–80% im Vergleich zu 10–30% mit PBL. Daher handelte es sich bei SPL um den bevorzugteren Fusionspartner. Die Kulturmedien wurden mit Endothelzellen konditioniert; dies wurde als ausschlaggebend für die Lebensfähigkeit und
die Klonogenität der Hybride erachtet. Im Falle der B6B11-PBL-Hybride wurde die Immunglobulin-Sekretion in
bis zu 95% der Hybride detektiert. Um die Ausbeute an Immunglobulin sekretierenden Hybriden nach Fusion
mit SPL zu erhöhen (bis zu 93%), wurde Leu-Ome verwendet. Beinahe alle Hybride sekretierten Antikörper mit
unbekannter Spezifität. Die Antikörperproduktion durch B6B11-Hybride war über mindestens 10 Monate stabil.
Die Hybride konnten leicht an serumfreie Medien angepasst werden, wodurch die ex vivo-Erzeugung eines Antikörpers ermöglicht wurde.
[0432] Nach Fusion von immunisierten SPL mit B6B11-Zellen wurden zwei Antikörper-produzierende Klone
(mit wahrscheinlich ähnlicher Spezifität für LPS aus S. minnesota-Re595) erhalten. Wie hierin gezeigt, ist das
human-Maus Heteromyelom, B6B11, nützlich für die Produktion humaner monoklonaler Antikörper gegen verschiedene Antigene. Eine korrekte in vitro-Sensibilisierung von Lymphozyten ist ebenfalls von entscheidender
Bedeutung für die Erzeugung humaner Antikörper.
Experimentelle Vorgehensweisen
[0433] Zellkultur. Es wurden Zellen des 8-Azaguanin (8-Ag)-resistenten Maus-Myeloms X63.Ag8.653 (653)
wie nachfolgend beschrieben mit dem Plasmid pBgl-neoR (Dr. A. Ibragimov) transfiziert. Die Myelomzellen
wurden in DMEM-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), 4 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, nicht-essentiellen Aminosäuren und Vitaminen (Flow Laboratories), gehalten. Vor der Fusion wurden die
Zellen drei Mal in der Anwesenheit von 20 μg/ml 8-Ag (Sigma) und 500 μg/ml G-418 (Gibco) passagiert.
[0434] Die humane Myelomzelllinie RPMI 8226 (8226) wurde in RPMI 1640-Medium mit den zuvor genannten
Ergänzungen (reguläres RPMI 1640) kultiviert. Das Hybrid-Heteromyelom B6B11 wurde entweder in regulärem RPMI 1640 mit 10% FCS oder in serumfreien Medien kultiviert, welche ein 1:1-Gemisch aus der Iscov'schen Modifikation von Dulbecco-Medium (IMDM) und HAM F-12 (Flow Laboratories), ergänzt mit bovinem Serumalbumin Fraktion #5, 2 mg/ml, (BSA) (Sigma) dargestellten, bovinem Insulin, 5 μg/ml (Serva), humanem Transferrin, 5 μg/ml (Sigma), Progesteron, 6 ng/ml (Gibco), Hydrocortison, 60 ng/ml (Gibco). Die Hybridome wurden durch allmähliches Ersetzen des Wachstumsmediums, enthaltend 10% FCS, an dieses serumfreie Medium (SFM) angepasst. Alle Zellen wurden in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5,5%
CO2/94,5% Luft bei 37°C kultiviert.
[0435] Humane Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL) wurden gemäß den Angaben des Herstellers unter
Verwendung von Lymphozyten-Separationsmedium (LSM) (Flow Laborstories) isoliert. Milzen, erhalten bei einer Autopsie nicht später als 2 Stunden nach dem Tod (Männer im Alter zwischen 50–60 Jahre), wurde homogenisiert und Splenozyten (SPL) wurden in LSM isoliert.
[0436] Produktion von Geneticin (G-418)-resistenten 653-Myelomzellen. Die Zellen wurden in steriler phos-
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phatgepufferter Saline (PBS) ohne Ca++ oder Mg++ gewaschen. Durch BamH1 (konstruiert von P. Chumakov,
Institute of Molecular Biology of the Academy of Sciences of the USSR, Moskau, USSR) linearisierte pBg1-neoR-Plasmid-DNA wurde zu der Zellsuspension gegeben. Vor dem Zugeben der DNA zu der Zellsuspension
wurde die DNA zweimal unter Verwendung von Phenolether bei 4°C mit Phenol extrahiert, mit 96% Ethanol
präzipitiert und unter sterilen Bedingungen getrocknet.
[0437] Die Transfektion erfolgte durch Elektroporation bei 4°C unter Verwendung einer von L. Chernomordik
(Institute of Electrical Chemistry of the Academy of Sciences of the USSR, Moskau, USSR) konstruierten Einheit. Es wurden etwa 4 × 106 653-Myelomzellen und 3,5 μg Plasmid-DNA in einer 80 μl Elektroporationskammer kombiniert. (Die Endkonzentration der DNA betrug 44 μg/ml). Es wurde ein elektrischer Stromimpuls von
1,7 Kv/cm für 100 μsec durch die Kammer gepulst.
[0438] Nach dem man sie für 10 Minuten ruhen gelassen hatte, wurden die Zellen in 0,5 ml Komplettmedien
in 16 mm2 Wells zu 5 × 103 und 2 × 104 Zellen/Well transferiert. Nach 36 Stunden wurden 0,5 ml des Mediums,
enthaltend 1 mg/ml Geneticin (G-418) zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugegeben. Im Anschluss daran wurden für 12 Tage an jedem zweiten Tag 50% des Medienvolumens ausgetauscht.
[0439] Heteromyelom-Produktion. Es wurden G-418-resistente 653-Zellen mit 8226-Zellen in einem Verhältnis 1:1 vermischt und pelletiert. Es wurden eine Minute lang unter konstantem Rühren 50% (v/v) Polyethylenglykol (PEG) 3350 (Sigma) zugegeben (200–300 μl pro 4–5 × 107 Zellen). Es wurden einige Portionen von serumfreiem RPMI 1640 (RPMI-S–) für 5 Minuten (zuerst 10 ml), 1 Minute (10 ml), und 1 Minute (30 ml), zugeben.
Die Zellen wurden pelletiert, in regulärem RPMI 1640 mit 20% FCS, Hypoxanthin (1 × 104 M), Aminopterin (4
× 107 M), Thymidin (1,6 × 105 M) (HAT, Flow Laborstories) und 500 μg/ml G-418 resuspendiert und in
96-Well-Platten (Linbro) in einer Dichte von 105 Zellen pro Well ausgesät. Nach zwei Wochen wurde das Medium (1/2 Volumen) durch Medium, enthaltend Hypoxanthin (2 × 104 M), Thymidin (3,2 × 105 M) (HAT, Flow
Laborstories) und G-418 (500 μg/ml), ersetzt. Dieser Vorgang wurde nach zwei Wochen wiederholt.
[0440] Produktion humaner monoklonaler Antikörper. Eine Fusion von B6B11-Zellen mit humanen Lymphozyten wurde durch das zuvor beschriebene Verfahren mit den nachfolgenden Modifikationen ausgeführt. Lymphozyten wurden mit B6B11 in einem Verhältnis von 1:1 oder 1:2 vermischt, pelletiert, mit RPMI 1640-S gewaschen und für 3 Minuten unter konstantem Rühren mit PEG (600 μl pro 105 Zellen) inkubiert. Die Portionen von
zugegebenem RPMI-S- waren wie folgt: 10 ml/10 Minuten, 10 ml/10 5 Minuten, 10 ml/1 Minute. Die Zeilen wurden pelletiert, in regulärem RPMI, ergänzt mit 15% FCS, resuspendiert und in 96-Well-Platten (1,5 × 105 Zellen
pro Well) ausgesät. Nach 24 Stunden wurde HAT-Medium zugegeben. Das Wachstumsmedium (1/2 Volumen)
wurde innerhalb von 7–9 Tagen durch frisches HAT ersetzt. Das HAT-Medium wurde nach 15–18 Tagen durch
HT-Medium ersetzt.
[0441] Klonierung. Es wurden parentale Heteromyelom- und Hybridomzellen mittels des Verfahrens der limitierenden Verdünnung in Medium, konditioniert über humane Endothelzellen aus Nabelschnur oder Aorta (Antonov, A. S., et al., 1986) (Geschenk von Dr. A. Antonov) (ECM). Es wurden 100 μl/Well in 96-Well-Platten bei
37°C über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden zu etwa 1 bis 2 Zellen pro Well angesetzt. Das Kulturmedium
wurde nach 2,5–3 Wochen auf Antikörper getestet.
[0442] Immunisierung in vitro. Es wurden frisch isolierte Lymphozyten in RPMI-S, enthaltend 2,5 mM L-Leucin-Methylester (Leu-OMe) (Borrebaeck, CAK., et al., 1987) bis zu einer Endkonzentration von 107 Zellen pro
ml resuspendiert. Nach 40-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen dreimal mit RPMI-Sgewaschen und in regulärem RPMI 1640, ergänzt mit 15% FCS, resuspendiert. Als Quelle an Lymphokinen
wurde ein Medium verwendet, konditioniert durch Maus-Thymozyten (TCM) (Reading, CL., 1982). Zu der Zellsuspension wurde Pokeweed-Mitogen (PWM) (Flow Laborstories) bis zu einer Endkonzentration von 5 μg/ml,
TCM (25%) und Antigen in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben. Die Zellsuspension (4–6 × 106 Zellen/ml) wurde in Kolben (30 ml/75 cm2 Kolben) überführt. Die Fusion wurde nach 7–9-tägiger Kultivierung
durchgeführt. An Stelle von PWM wurden Concanavalin A (ConA) (Flow, 5–10 μg/ml), Phytohämagglutinin
(PHA) (Flow, 5–10 μg/ml) sowie Lipopolysaccharid (LPS) (Sigma, 10–15 μg/ml) verwendet. Als Antigen wurde
Re595 aus S. minnesota (Geschenk von Dr. O. Luderitz, Max Planck Institut für Immunologie, Freiburg,
Deutschland) verwendet. Die Bakterien wurden in Medium enthaltend 16 g/l tryptische Soja-Bouillon (TSB) Difco), 16 g/l Hirn-Herz-Infusion (BHI) (difco) und 4 g/l Hefeextrakt (YE) (DIFCO) für 18 Stunden bei 37°C unter
konstantem Rühren gezüchtet und dann durch Hitze inaktiviert. Die Antigenkonzentration variierte von
107–1010 Zellen/ml.
[0443] Bestimmung von Antikörpern unspezifische Ig-Produktion. Es wurde ein enzyme-linked immunoassay
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(ELISA) verwendet, um die Hybridomüberstände auf Anwesenheit von Antikörpern gegen Salmonella minnesota-Re595 und LPS zu testen.
[0444] Screenen nach gegen Bakterien reaktiven mAbs. Es wurden 96-Well-Platten für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit Glutaraldehyd (1%, 100 μl pro Well) bedeckt. Die Platten wurden 3mal mit destilliertem Wasser
gewaschen. Die Bakterien wurden in 50 mM Ammoniumcarbonatpuffer (pH 9,6) resuspendiert und auf Platten
(5 × 107 Zellen in 100 μl pro Well) transferiert, bei 780 × g für 30 Minuten zentrifugiert und 4mal mit destilliertem
Wasser gewaschen. Die getesteten Überstände (100 μl) wurden mit 0,1% Tween 20 (Fluka) ergänzt, in Bakterien-enthaltende Wells gegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Medium wurde dann
entfernt und die Wells wurden mit destilliertem Wasser gewaschen. Affinitätsgereinigtes, an alkalische Phosphatase konjugiertes Kaninchen-anti-human-Immunglobulin (RAHAP), verdünnt in Tris-gepufferter Lösung
(TBS, 50 mM, pH 7,4), enthaltend 0,1% Tween 20, wurde zu 1 μg in 100 μl pro Well zugegeben. Nach 1 Stunde
Inkubation bei Raumtemperatur und 6-maligem Waschen mit destilliertem Wasser wurden 100 μl 4-Nitrophenylphosphat (1 mg/ml, Sigma) in Diethanolamin-Puffer (10% Diethanolamin, 0,5 mM MgCl2, pH 9,8) zugegeben. Nach 1 Stunde wurden die Ergebnisse unter Verwendung eines Multiscans (Flow Laborstories) bei 405
nm gelesen. Bei der negativen Kontrolle handelte es sich um Kulturmedium RPMI 1640, ergänzt mit 15% FCS.
[0445] Screenen nach gegen Lipopolysacchariden reaktiven mAbs. Es wurde LPS aus Salmonella minnesota-Re 595 aus aufgereinigt wie beschrieben (Galanos, G., et al., 1969). Die LPS-Präparation wurde sonifiziert
und zu 2,5 μg pro Well in 5 mM Ammoniumcarbonat-Puffer (pH 9,6) auf die Platten überführt. Nach Inkubation
über Nacht bei Raumtemperatur wurden die zuvor beschriebenen Vorgehensweisen zum Bestimmen von gegen Bakterien reaktiven mAbs durchgeführt.
[0446] Screenen nach unspezifischer Produktion von mAbs. Unspezifische Produktion von Immunglobulin
und separaten Ketten wurde nach der Zugabe von 100 μl Kaninchen-anti-human-Immunglobulin (10 μg/ml in
Phosphatpuffer, PBS, pH 7,2) oder 100 μl/Well (10 ng/ml in PBS) an monoklonalen Maus-Antikörpern zu leichten und schweren Ketten von humanem Immunglobulin (MAH-L, H) (Rokhlin, OV., 1989) (Geschenk von O.
Rochlin, CRC, Moskau) bewertet. Die nachfolgenden Vorgehensweisen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt.
[0447] Bestimmung des Isotyps der sekretierten Antikörper. Der Isotyp der humanen Antikörper wurde mittels
ELISA, unter Verwendung von murinen anti-humanen leichten und schweren Ketten (MAH-L, H) sowie Ziege-anti-Maus-Immunglobulin (25 μg/ml), konjugiert an Peroxidase und mit humanem Immunglobulin absorbiert, bestimmt.
[0448] Bestimmung der Produktion von zytoplasmatischen leichten oder schweren Ketten. Die Produktion
von zytoplasmatischen leichten und/oder schweren Ketten in Hybridomen, B6B11 und den parentalen Zelllinien wurde unter Verwendung des Peroxidase-Antiperoxidase-Systems (PAP) immunhistochemisch eingeschätzt. Zellabstriche wurden luftgetrocknet, für 45 Sekunden mit 10% Formaldehyd (v/v) und 45% Aceton (v/v)
in phosphatgepufferter Saline (PBS, 10 mM NaH2PO4, pH 6,6) fixiert und mit MAH-L, H (200 μl, 5–10 mg/ml)
inkubiert. Dann wurde 1 ml Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulin (38 mg/ml in PBS) zugegeben. Alle Inkubationen dauerten 30 Minuten. Waschschritte wurden unter Verwendung von PBS für 10 Minuten durchgeführt.
[0449] Chromosomenanalyse. Durch die nachfolgende Technik wurden Präparate von Metaphasen-Chromosomen erhalten. Es wurde während des exponentiellen Wachstums Colchicin zu den Zellen hinzugegeben
(1,5–2 Stunden zu parentalen Linien und B6B11-Zellen). Die Zellen wurden dann trypsiniert und für die G-Bänderung wie beschrieben gefärbt (Seabright, S., 1971) (10–15 Platten von jeder Linie). Um die Chromosomenanzahl zu erfassen wurden mindestens 50 Metaphasenfiguren für jede Zelllinie analysiert.
[0450] DNA-Analyse über Durchflusszytometrie. Um den des DNA-Gehalt zu bestimmen, wurden die Zellen
(1 × 106) mit 1 ml 70% Ethanol fixiert, gewaschen, für 2–3 Stunden mit 0,3 mg/ml Ribonuklease A (Serva) in
Hank-Lösung (pH 7,4) inkubiert und für 2 Stunden mit Propidiumjodid (0,05 mg/ml, Sigma) in Hank-Lösung gefärbt. Der DNA-Gehalt wurde in einem FACS-II Zytofluorometer (Becton Dickinson) gemessen. Die Fluoreszenz wurde mittels eines Argon-Ionen-Lasers (Modell 164-05, Spectra-Physics) bei 488 nm und einer Leistung
von 400 mW angeregt und unter einem 600 nm langen Pass-Interferenzfilter (Ditric Optica) erfasst.
[0451] Parentale Linien. Die Myelomlinie 653 wurde in DMEM, ergänzt mit 10FCS, 20 ng/ml 8-Azaguanin und
500 μg/ml G-418, gehalten. Die Myelomlinie 8226, die die Lambdaketten von humanem Ig produziert wurde in
RPMI-C, enthaltend 10% FCS, kultiviert. Zur Erzeugung eines Heteromyeloms wurde durch Klonierung in ECM
(2 Zellen pro Well) ein nicht-produzierender Klon der 8226-Linie ausgewählt. Die Lambdaketten-Produktion
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wurde nach 2–2,5 Wochen unter Verwendung von MAH-L, H eingeschätzt. Die Häufigkeit der nicht-sekretierenden Klone lag bei 1 × 10–3.
BEISPIEL 2: Triom MFP-2, ein Fusionspartner zur Erzeugung humaner monoklonaler Antikörper.
Einführung
[0452] Durch Hybridisierung der kommerziell erhältlichen humanen Myelomzelllinie RPMI 8226 und dem sowohl gegen 8-Azaguanin (8-Ag) als auch Geneticin 418 (G-418) resistenten Maus-Myelom X63.Ag8.653 wurde
eine Vorläufer-Hybridomzelllinie erhalten. Es wurde in der Anwesenheit von G-418 einer der resultierenden
Klone, B6B11, ausgewählt. B6B11 wurde in der Anwesenheit von erhöhten Konzentrationen an 8-Ag gezüchtet
und ist sowohl gegen G-418 als auch 8-Ag resistent (siehe Beispiel 1).
[0453] Obwohl B6B11 zum Herstellen humaner Hybridome durch Fusionieren mit humanen aus Lymphknoten
stammenden oder aus der Milz stammenden Lymphozyten verwendet werden kann, war B6B11 nicht in der
Lage, mit Lymphozyten aus humanem peripherem Blut (PBL) zu fusionieren oder führte nur zu einer äußerst
geringen Ausbeute an Hybriden (siehe Beispiel 1).
[0454] Um dieses Problem zu überwinden, wurde B6B11 mit Lymphozyten aus humanen Lymphknoten fusioniert und es wurden einige Hybriden erhalten. Die resultierenden Zellen wurden hinsichtlich der Produktion
von humanem Immunglobulin oder der Produktion separater Immunglobulinketten analysiert. Die Klone, welche kein Immunglobulin oder keine Immunglobulinketten synthetisierten, wurden zur weiteren Evaluierung hinsichtlich Fusionsfähigkeit und des Potentials zur Sekretion von Antikörper selektioniert. Diese Hybride wurden
als recht stabil bestimmt. Diese Fusionsprodukte wurden als "modifizierte Fusionspartner" (MFP)-Zellen bezeichnet. Diese MFP-Zellen werden, als das Produkt der Fusion des B6B11-Hybridoms mit Lymphozyten, hierin als "Triom"-Zellen bezeichnet, da sie im Wesentlichen das Produkt aus drei fusionierten Zellen sind. Einer
der Klone, MFP-2, zeigte eine sehr hohe Effizienz sowohl für das Fusionieren mit Lymphozyten aus peripherem
Blut als auch für das Fusionieren mit humanen Lymphozyten eines jeden beliebigen Ursprungs (d. h. Lymphknoten, Milz, Peyersche Plaques, etc.). MFP-2 wurde auf der Grundlage seiner überlegenen Eigenschaften
und Stabilität als ein Fusionspartner ausgewählt und in den hierin nachfolgend beschriebenen Experimenten
verwendet. Die Produkte der Fusionen zwischen den MFP-Triom-Zellen und den Lymphozyten werden hierin
als "Tetrom"-Zellen bezeichnet, da sie im Wesentlichen das Produkt aus vier fusionierten Zellen sind.
Ergebnisse
[0455] Immunglobulinproduktion. Um zu zeigen, dass die humane Hybridom (Triom)-Fusionspartner-Zelllinie,
MFP-2, in der Lage ist, mit humanen Lymphozyten zu fusionieren und hohe Ausbeuten an Hybriden mit stabiler
Immunglobulinproduktion zu produzieren, wurden Experimente unter Verwendung von humanen Lymphozyten
aus unterschiedlichen Quellen durchgeführt.
[0456] Die Heteromyelom-Zelllinie, B6B11 (Vorläufer von MFP-2), kann mit hoher Effizienz mit Lymphozyten
aus Lymphknoten und Milz fusioniert werden. (Siehe Beispiel 1). Bis zu 90% der resultierenden Hybride produzierten IgG oder IgM. B6B11 war jedoch nicht in der Lage, an aus peripherem Blut stammende Lymphozyten
(PBLs) zu fusionieren. Die Triomzelllinie, MFP-2, (resultierend aus einer Fusion zwischen B6B11 und Lymphozyten aus humanen Lymphknoten) überwand dieses Problem und zeigte eine hohe Fusionseffizienz mit PBL,
was zu einer hohen Rate an Immunglobulinproduktion durch die resultierenden Tetromhybride führte. Die Fähigkeit von MFP-2 mit PBL zu fusionieren wurde auf zwei Arten getestet: (1) durch Fusion mit frisch isolierten
Lymphozyten in Suspension und (2) durch Fusion mit aufgetauten Lymphozyten, welche über unterschiedliche
Zeiträume in gefrorenem Zustand gelagert worden waren (siehe Experimentelle Vorgehensweisen). Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 5 gezeigt.
[0457] Die Fusionseffizienz betrug 105 (1 Hybrid pro 105 Lymphozyten). Es wurden dreißig Hybridom (Tetrom)-Populationen erhalten und auf ihre Fähigkeit Immunglobulin zu sekretieren analysiert. (Es ist wahrscheinlich, dass es sich bei einer primären Hybridompopulation um eine Mischung aus zwei oder mehr individuellen
Klonen handelt). Siebenundzwanzig Populationen (90%) produzierten IgM auf einem Level, der 5-mal höher
war als der Hintergrund. Vierundzwanzig Populationen (80%) sekretierten IgE auf einem Level, der 5-mal höher war als der Hintergrund. Die Fusion von MFP-2 mit Lymphozytensuspensionen, welche eingefroren und
aufgetaut worden waren, führte ebenfalls zu Immunglobulin-produzierenden Hybriden. Neunzehn Prozent und
11% dieser Hybridompopulationen produzierten humanes IgM beziehungsweise IgG. Die Effizienz der Fusion
an sich wurde durch den Vorgang des Einfrierens und wieder Auftauens nicht beeinflusst. Diese Ergebnisse
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zeigen, dass sowohl frisch isolierte als auch eingefrorene PBL zur Erzeugung von humanen Hybridomen verwendet werden können, welche in der Lage sind, Antikörper zu produzieren.
[0458] Identifikation von tumorassoziierten Antigenen und Produktion von spezifischen Antikörpern unter Verwendung des MFP-2-Fusionspartners: Humane monoklonale Antikörper gegen Thyreoglobulin. In diesem Experiment wurden humane anti-Thyreoglobulin-Antikörper erzeugt durch MFP-2-Fusion unter Verwendung von
Lymphknoten aus Patienten, bei welchen ein Schilddrüsenadenokarzinom diagnostiziert worden war. Aus einer Patientin mit Schilddrüsenkrebs wurde während einer operativen Lymphadenektomie ein periklavikulärer
Lymphknoten entfernt und Lymphknoten wurden isoliert und mit MFP-2 fusioniert, wodurch Tetromzellen erzeugt wurden.
[0459] Die daraus resultierenden Hybridome (Tetrome) wurden unter Verwendung eines enzyme-linked immunoassay (ELISA)-Verfahrens auf Produktion von gegen Thyreoglobulin reaktiven humanen Antikörpern getestet. Es wurde aufgereinigtes humanes Thyreoglobulin verwendet, um eine Mikrotiterplatte zu beschichten.
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. Dreiunddreißig von 144 Tetromen zeigten eine Antwort gegen das Thyreoglobulin-Antigen. Von diesen waren acht besonders stark (siehe Fig. 6). Folglich produzierten von Lymphknoten stammende Tetrome von dieser Schilddrüsenkrebspatientin Anti-Thyreoglobulin-Antikörper. Das war
ein unerwartetes und überraschendes Ergebnis, da die Patientin keine bekannte Historie einer Autoimmunkrankheit (d. h. Anti-Schilddrüsen-Antikörper) aufwies. Dies legt nahe, dass die in dieser Patientin gegen
Thyreoglobulin erzeugten Antikörper durch die Anwesenheit von kanzerösen Schilddrüsenadenokarzinomzellen induziert worden waren. Es ist bekannt, dass kanzeröse Schilddrüsenadenokarzinomzellen Thyreoglobulin
sekretieren. Dieses Experiment zeigt, dass Tumorzellen eine humorale Immunantwort auf tumorassoziierte
Antigene induzieren können und dass die Antikörper-produzierenden Zellen durch die hierin beschriebenen
Techniken unter Verwendung des MFP-2-Fusionspartners identifiziert und immortalisiert werden können, um
humane monoklonale Anti-Tumor-Antikörper zu produzieren.
[0460] Produktion von humanen monoklonalen Antikörpern gegen mit Brustkrebs assoziierte Antigene. In einem anderen Experiment wurden unter Verwendung von Lymphozyten aus Lymphknoten und peripherem Blut
von Brustkrebspatienten humane monoklonale Antikörper gegen mit Krebs assoziierte Antigene produziert.
Aus Brustkrebspatienten, welche sich einer Mastektomie oder einer Lumpektomie unterzogen, wurden axillare
Lymphknoten entfernt. Aus diesen Lymphknoten isolierte Lymphozyten wurden an MFP-2 fusioniert und die
resultierenden Tetrome wurden gegen die Brustkrebszelllinien MCF7, SK-BR-3, ZR-75-1 gescreent. Fast alle
Tetrome produzierten IgG oder IgM (etwa 85% beziehungsweise 10%). Überraschenderweise produzierten
beinahe 15% der gegen Brustkrebszelllinien untersuchten Tetrome spezifisch gegen Krebszellen gerichtete
Antikörper. Die Tetromüberstände wurden auf zwei Arten getestet: (1) auf lebenden Zellen in dem CELISA (zellulärer ELISA)-Assay und (2) durch Western Blotting unter Verwendung von Zelllysaten. Der Molekulargewichtbereich der von humanen monoklonalen Antikörpern erkannten spezifischen Antigene betrug 25 bis 160 kDa.
Um die Natur des antigenen Targets zu skizzieren wird eine Immunpräzipitation gefolgt von einer Mikrosequenzierung durchgeführt. Zusätzlich werden kombinatorische Bibliotheken von beliebigen Peptiden dazu verwendet, die molekularen Targets der krebsspezifischen Antikörper zu identifizieren.
[0461] In einem Patienten mit Brustkrebs im Stadium IV waren keine Lymphknoten verfügbar; also wurden
PBLs an MFP-2 fusioniert und es wurden 156 Tetrome erhalten. Die Tetrome wurden in Bezug auf Immunglobulinproduktion so wie auf Produktion von krebsspezifischen Antikörpern analysiert. IgM wurde von 28 Tetromen produziert; 87 Tetrome produzierten IgG. Vier der IgM-Antikörper und sieben der IgG-Antikörper wurden
als reaktiv gegen zelluläre Antigene identifiziert; drei IgM-Antikörper und vier IgG-Antikörper waren spezifisch
für Brustkrebszellen. Die übrigen Tetrome zeigten eine Immunreaktivität gegen andere Zelltypen, einschließend humane Prostatakrebszelllinien, humane diploide Fibroblasten sowie humane Hautfibroblasten. Diese
letztgenannten Antikörper waren wahrscheinlich gegen gemeinsame Antigene gerichtet (gemeinsam für normale und kanzeröse Zellen).
[0462] Die PBLs wurden aus dem Blut eines Patienten isoliert, welcher 77 Zyklen Chemotherapie erhalten
hatte, wovon normalerweise erwartet würde, dass dies eine schwächende Wirkung auf das Immunsystem des
Patienten hätte. Nichtsdestotrotz produzierte dieser Patient noch immer Anti-Krebs-Antikörper, welche zur Fusion mit MFP-2 geeignet waren.
[0463] Durch Fusionieren von MFP-2 und Prostatakrebslymphozyten erzeugte humane Tetrome werden auf
die Anwesenheit von sowohl PSA-spezifischen Antikörpern als auch von gegen die Prostatakrebszelllinien LNCaP, DU-145 und PC-3 gerichteten Antikörpern getestet.
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[0464] Produktion von humanen Antikörpern, gegen Antigene, die mit einer infektiösen Erkrankung assoziiert
sind. Infektiöse Erkrankungen gehen im Allgemeinen mit einer gut entwickelten humoralen und zellulären Immunantwort einher. Patienten mit bestimmten Infektionen enthalten oftmals große Anzahlen von Zellen die
spezifische Antikörper produzieren. Eine bedeutende Anwendungsmöglichkeit für die im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebene Immuntherapie ist die Produktion von humanen monoklonalen Antikörpern
gegen proinflammatorische Zytokine, welche an einem septischen Schock beteiligt sind. Unter diesen Targets
befinden sich Zytokine wie beispielsweise der Tumornekrosefaktor α (TNF-α) und Interleukin-1a (IL-1a). Weitere Targets schließen ein: andere Zytokine und Lymphokine, infektiöse Agenzien und deren Toxine, einschließend Tetanustoxin, Anthraxtoxin, Botulintoxin sowie Lipid A. Das periphere Blut von Patienten, welche durch
Bakterien, Pilze, Protozoen oder Viren infiziert sind, enthält typischerweise zirkulierende Antikörper-produzierende Zellen, welche isoliert und als eine Quelle für eine Fusion mit MFP-2 verwendet werden können. So können zum Beispiel PBLs aus Patienten mit septischem Schock, Hantavirusinfektion, HIV, HTLV-I, HTLV-II, Influenza, Hepatitis oder Herpesvirus mit MFP-2 fusioniert werden und die resultierenden Tetromzellen können gegen die jeweiligen Antigene gescreent werden. Insbesondere im Fall von AIDS können Lymphozyten des Patienten unter Verwendung der hierin beschriebenen Techniken immortalisiert werden, um große Mengen an
Anti-HIV-Antikörpern zur Verwendung in der passiven Immuntherapie in einer autologen oder heterologen Art
und Weise zu erzeugen.
[0465] Produktion von humanen Antikörpern gegen eine Autoimmunkrankheit. Eine allgemeine Überlegung
für die Verwendung von humanen monoklonalen Antikörpern in einer Autoimmunkrankheit ist, Autoantikörper
oder CD4+-T-Zellen, welche an der autoimmunen zellulären Zytotoxizität beteiligt sind, zu blockieren. In einem
Ansatz werden im Anschluss an die Fusion mit der MFP-2-Triomzelle humane monoklonale Antikörper gegen
CD4+-Zellen erzeugt. Die resultierenden Tetromzellen, welche Anti-CD4-Antikörper produzieren, werden dazu
verwendet, CD4+-T-Zellen zu reduzieren oder abzureichern, wodurch der autoimmune zelluläre Angriff abgeschwächt wird. In einem anderen Ansatz wird MFP-2 dazu verwendet, Tetromzellen zu erzeugen, welche dazu
in der Lage sind, gegen spezifische Autoantikörper gerichtete anti-idiotypische Antikörper zu produzieren. Zum
Beispiel ist autoimmune Thyroiditis eine Autoimmundysfunktion, bei der ein hoher Titer an Anti-Thyreoglobulin-Antikörpern im Plasma eines Patienten vorliegt. Von PBL stammende Lymphozyten werden zur Fusion mit
MFP-2 aus solchen Patienten isoliert. Die resultierenden Tetromzellen werden hinsichtlich solcher gescreent,
welche in der Lage sind Antikörper zu erzeugen, die gegen die mit Thyreoglobulin reaktiven Autoantikörper
gerichtet sind, mit einer substantiellen anti-idiotypischen Immunantwort. Diese anti-idiotypischen Antikörper
werden dann dazu verwendet, die Autoimmunkrankheit durch reduzieren oder abreichern der Anti-Thyreoglobulin-Antikörper zu modulieren. Ein derartiger Ansatz kann autolog oder heterolog angewandt werden. In einem autologen Ansatz werden die anti-idiotypischen Antikörper-produzierenden Zellen im peripheren Blut des
zu behandelnden Patienten identifiziert, dann isoliert und mit MFP-2 fusioniert, und nach Selektion auf spezifische Anti-anti-Thyreoglobulin-Antikörper, dem ursprünglichen Patienten passiv verabreicht. In einem heterologen Ansatz werden die Anti-anti-Thyreoglobulin-Antikörper an einen anderen Patienten verabreicht.
[0466] Andere Anwendungsmöglichkeiten: Vermeidung der Abstoßung von transplantierten Organen, Blutgerinnung. Eine von mehreren weiteren Anwendungsmöglichkeiten von humanen monoklonalen Antikörpern ist
die Vermeidung einer Abstoßung eines transplantierten Organs durch Blockieren von T-Zellen durch den
OKT-3(Anti-CD3)-Marker. Antikörper gegen Adhäsionsmoleküle (Anti-Integrin-Antikörper) verhindern ebenfalls
die Migration von Immunzellen, was zum Beispiel bei der rheumatoiden Arthritis von Bedeutung ist. Die Blutgerinnung kann zum Beispiel bei akuter kardialer Ischämie nach einer koronaren Angioplastie unter Verwendung von humanen monoklonalen Antikörpern gegen GPIIb/IIIa von Blutplättchen moduliert werden. Eine intravenöse Infusion von Immunglobulinen hilft die Fc-Rezeptor-vermittelte Zellaggregation von Blutplättchen
oder anderen Blutzellen (z. B. thrombozytopenische Purpura), zu neutralisieren.
[0467] Zusätzlich kann dieser Ansatz dazu verwendet werden, eine Belastung durch Toxin oder Gift zu detoxifizieren oder zu neutralisieren. Solche Belastungen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Bisse
von Schlangen, Spinnen oder giftigen Kröten sowie Stiche von Wespen oder Skorpionen. Das Pferde-Antiserum, welches derzeit zur Neutralisierung von Klapperschlangengift verwendet wird, verursacht in 30% der Fälle
eine Serumkrankheit.
[0468] Es herrscht eine Knappheit an natürlichem humanem Immunglobulin, welches für diese Art von Behandlungen erforderlich ist. Das hierin beschriebene System zur Produktion humaner monoklonaler Antikörper
vereinfacht die Produktion in vitro, unbeschränkter Mengen an humanen Immunglobulinen, welche entsprechend eines spezifischen Bedarfs ausgewählt werden können. So kann zum Beispiel im Fall von Fc-Rezeptoren blockierendem Immunglobulin anstatt einer Behandlung des Patienten mit der gepoolten Präparation von
Immunglobulinen, in welcher nur ein geringer Anteil der Moleküle die erforderlichen Qualitäten aufweist, das
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Immunglobulinpräparat der Moleküle mit den erforderlichen Eigenschaften unter Verwendung der hierin beschriebenen Fusionspartner produziert werden.
Diskussion
[0469] Es besteht bereits seit langem ein Bedarf an humanen monoklonalen Antikörpern zur Diagnose, Behandlung und Überwachung von Krebserkrankungen. Versuche, Xenoantikörper in klinischen Versuchen anzuwenden erzielten keine viel versprechenden Ergebnisse. Nicht-humane Antikörper von Mäusen zum Beispiel verursachen die Entwicklung einer humanen Anti-Maus-Immunantwort, eine Sensibilisierung gegen fremdes Protein, welche gegebenenfalls zu einer anaphylaktischen Reaktion führen kann, sowie ein Ausbleiben eines biologischen Effekts, die Effektoreigenschaften der Xenoantikörper mit den Komponenten des humanen
Immunsystems fehlpaaren können. Humane monoklonale Antikörper besitzen zahlreiche Vorteile. Einer ist,
dass die humanen monoklonalen Antikörper diejenigen tumorassoziierten Antigene (TAA) identifizieren können, die nur im Menschen immunogen sind, während Xenoantikörper in den meisten Fällen diejenigen Antigene und antigenen Epitope erkennen, welche die Immundominanz in einem Wirt exprimieren und bei denen es
sich oftmals um die gewebespezifischen Epitope handelt. Ein anderer Vorteil ist die gut-entwickelte Wechselwirkung von humanen monoklonalen Antikörpern mit den Effektorkomponenten (wie beispielsweise Komplemente) des Immunsystems des Wirts. Zusätzlich ist eine allergische und/oder anaphylaktische Reaktion auf
die injizierbaren humanen monoklonalen Antikörper weniger bedenklich, da humane monoklonale Antikörper
in humanen Subjekten syngenisch sind. Es wurden alternative Versuche unternommen, Antikörper wie beispielsweise chimäre (teils humane, teils murine) Antikörper zu entwickeln, in welchen der Fc-Teil des murinen
Immunglobulins durch das humane IgG-Fc ersetzt wurde. Bei humanisierten Antikörpern handelt es sich um
humane Immunglobuline, in welche CDR-Regionen des spezifischen murinen Antikörpers eingebracht wurden. Einzelkettige (Fc) humane Antikörper wurden unter Verwendung von Phagen-Display-Bibliotheken in
Phagen entwickelt. Eine Schattenseite dieser Ansätze besteht darin, dass die resultierenden Antikörper nicht
natürlich sind; sie entstanden nicht als Teil einer natürlichen Immunantwort auf Krebs oder ein infektiöses
Agens.
[0470] Die Verwendung der hierin beschriebenen Hybridomtechniken und die Verfügbarkeit der hierin beschriebenen MFP-2 Triom-Fusionspartner-Zelllinie vereinfacht die Identifikation, Immortalisierung sowie die ex
vivo-Expansion von Antikörper-produzierenden Zellen, welche in vivo als ein Ergebnis natürlicher humoraler
Immunantworten auf ein Antigen entstehen. Da solche Zellen ein Teil der natürlichen Antwort des Immunsystems sind, stimmen sich die von diesen Zellen produzierten Antikörper mit den anderen Komponenten des Immunsystems aufeinander ab und sind in der Lage, eine effektive und spezifische biologische Antwort bereitzustellen.
[0471] Es wurden bereits eine Anzahl von brustkrebsspezifischen Antigenen beschrieben, bei welchen es
sich um potentielle Targets für die Immuntherapie von Krebserkrankungen handelt, einschließend HER2/neu,
Mucin 1 und Mucin 2, p53, c-myc, die Blutantigene T, Tn und Sialyl-Tn, eine verkürzte Form von EGF, Lewis-Y-Antigen und andere. Die Anwesenheit von zirkulierenden Antikörpern gegen diese Antigene wurde in
Krebspatienten ebenfalls bereits beschrieben. (G. Moller, 1995). Lymphknoten sind wichtige Orte für solche
Antikörper-produzierenden Zellen. Durch Isolieren von Lymphozyten aus Lymphknoten (oder aus peripherem
Blut) und deren Immortalisierung durch ihr Fusionieren mit dem humanen Hybridomfusionspartner MFP-2 können Hybride (Tetrome) erhalten werden, welche Antikörper gegen Krebs-assoziierte Antigene produzieren.
Wie zuvor beschrieben werden spezifische monoklonale Antikörper-produzierende Zellen identifiziert und können in nicht eingeschränkter Art und Weise ex vivo erzeugt werden (unter Verwendung von Bioreaktoren,
SCID-Mäusen, etc.). Die Antikörper können therapeutisch als passive Immuntherapie verwendet werden, entweder autolog in dem selben Subjekt oder heterolog in einem anderen Subjekt. Es kann sogar eine andere Art
von Krebs damit behandelt werden, vorausgesetzt es gibt ein überlappendes Tumorantigen.
[0472] Die syngenische oder allogenische Verwendung von humanem monoklonalem Antikörper kann sich
als höchst effektiv erweisen, da ein solcher Antikörper viele Male ohne das Risiko oder die Bedrohung, eine
anti-xenogenen Immunantwort zu entwickeln, infundiert werden kann. Die infundierten Antikörper können je
nach ihren Effektorfunktionen die komplementabhängige Zytolyse der Targettumorzellen oder eine antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) initialisieren (durch NK- oder CTL-Zellen), oder eine direkte zytotoxische Wirkung durch Apoptose bereitstellen.
Zusammenfassung
[0473] Es wurde eine einzigartige Fusionspartnerzelllinie, MFP, erhalten, welche verwendet werden kann,
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spezifische humane monoklonale Antikörper zu erzeugen. Diese monoklonalen Antikörper können in vivo auf
einer natürlichen Immunantwort auf infektiöse Agenzien, Krebszellen oder eine autoimmune Dysfunktion basieren, oder können in vitro basiert sein auf Immunisierung von humanen lymphoiden Zellen, in vitro.
[0474] Die hierin beschriebenen Verfahren zur Erzeugung spezifischer monoklonaler Antikörper können dazu
verwendet werden, eine adoptive humorale Immuntherapie bereitzustellen, entweder als eine autologe Methode oder als eine heterologe Methode. Aus einem Patienten mit Krebs oder einer infektiösen Erkrankung isolierte Lymphozyten werden durch die Fusion mit MFP-2 immortalisiert. Die resultierenden Tetrome, welche gegen die jeweiligen Antigene gerichtete Antikörper produzieren, werden in vitro selektiert. Im Anschluss an die
Selektion werden diese Antikörper-produzierenden Zellen expandiert und es können unter Verwendung eines
Bioreaktors oder immundefizienter Mäuse (z. B. nackter Mäuse oder SCID-Mäuse) Antikörper produziert werden. Solche Antikörper können dann in Form einer autologen adoptiven Methode der Immuntherapie zur Behandlung des ursprünglichen Donors oder in Form einer heterologen adoptiven Methode der Immuntherapie
zur Behandlung eines anderen Subjekts verwendet werden.
[0475] Die entwickelten Antikörper können ebenfalls sowohl zur invasiven Diagnostik (Imaging, Immunszintigraphie) als auch zur Therapie (Drug Targeting, Radioimmuntherapie, komplementabhängige Zytolyse, ADCC,
apoptotische Zytolyse etc.) angewandt werden.
[0476] Dieser Ansatz stellt ebenfalls ein Verfahren zur Identifikation von neuartigen Tumormarkern oder neuartigen Antigenen gegen infektiöse Agenzien bereit. Das Immunsystem reagiert auf Krebszellen oder infektiöse Agenzien mit der Produktion von Antikörpern, welche gegen verschiedene Komponenten der fremden Formation gerichtet sind, und kann verschiedene Neo-Epitope erkennen. Das Fusionieren von tumorreaktivem
oder gegen infektiöse Antigene reaktivem Immunglobulin mit MFP-2 kann dazu verwendet werden, neuartige
Tumormarker oder infektiöse Antigene zu identifizieren. Solche Antikörper sind von Bedeutung bei der Behandlung gegen spezifische Krebserkrankungen oder infektiöse Agenzien sowie bei der Entwicklung spezifischer Imaging- und Diagnostik-Techniken. Bisherige Versuche, humane Anti-Tumor- oder anti-infektiöse Antikörper zu erzeugen, erorderten eine erzwungene oder künstliche Immunisierung eines Subjekts mit aufgereinigtem oder isoliertem Antigen. In der vorliegenden Erfindung kann das Antigen unbekannt sein; das Ausgangsmaterial zur Entwicklung von Antikörpern ist der Pool immunkompetenter Lymphozyten, welche sich als
ein Teil der natürlichen Immunantwort auf die in ihrer natürlichen Form und in natürlicher Umgebung in vivo
präsentierten fremden Antigene entwickelten. Bei einer autologen Anwendung kann die Selektion unter Verwendung eines relevanten autologen Gewebes (z. B. Tumorbiopsien) durchgeführt werden, was die Chancen,
den richtigen Antikörper auszuwählen erhöht. Ebenso können autologes Blutplasma und weiße Blutkörperchen dazu verwendet werden, bezüglich zytotoxischer Antikörper von dem gleichen Donor zu selektionieren.
[0477] Folglich gestattet der MFP-Fusionspartner (1) die Fusion mit Lymphozyten aus peripherem Blut, was
zu hohen Leveln an Hybriden führt; (2) das Inbetrachtziehen einer adoptiven humoralen Immuntherapie auf
einer individuellen Basis (Selektion der Antikörper gegen Tumorzellen oder infektiöse Agenzien, welche von
dem selben Donor stammen, von dem auch die Lymphozyten erhalten wurden sowie autologe Behandlung des
Patienten); (3) Fusion mit den Lymphozyten des Donors, die einer Immunisierung in vitro unterzogen werden;
(4) erlaubt die Verwendung von gefrorenen Lymphozyten oder von aus Plasmapherese stammenden Lymphozyten als eine Quelle von Antikörper-produzierender Zellen.
Experimentelle Vorgehensweisen
[0478] Der Hybridomfusionspartner MFP-2 wurde durch Fusionieren von nicht-produzierendem Heteromyelom B6B11 mit aus paraclaviculärem Lymphknoten isolierten humanen Lymphozyten als eine Triomzelllinie
entwickelt.
[0479] Isolation von Lymphozyten. Während der Operation wurden paraclaviculäre Lymphknoten aus einem
Patienten mit einer Diagnose von metastatischem Schilddrüsenkrebs entfernt und in sterile Konservierungsmedien RPMI 1640 gegeben, ergänzt mit L-Glutamin (4 mM), nicht-essentiellen Aminosäuren (100 × Vorrat),
Vitaminen (100 × Vorrat), Natriumpyruvat (1 mM) und Gentamicin (2 × Konzentration). Lymphknotengewebe
wurde in den gleichen Medien in eine 100 mm Gewebekultur-TC-Schale überführt und mit Pinzette und Schere
vorsichtig zerrupft. Das zerrupfte Gewebe wurde unter Verwendung eines Glasstößels durch ein Metallsieb
(50er Maschung) passiert. Die Suspension wurde als eine zugrundeliegende Schicht ein einem Verhältnis von
2:1 (Lymphozytensuspension:Histopaque) in sterile konische 15 ml Gefäße überführt, die Lymphozytenseparationsmedien (Histopaque 1.077, Sigma) enthielten. Im Anschluss an eine Zentrifugation bei 400 × g für 20
Minuten bildete sich an der Grenze zwischen den Schichten ein undurchsichtiger Ring. Rote Blutkörperchen
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(RBC) waren als Pellet am Boden des Gefäßes vorhanden. Sind in der Ausgangslymphozytensuspension keine RBC vorhanden (was bei Lymphknoten eine durchaus normale Situation darstellt), so kann der Separationsschritt übersprungen werden. Der Lymphozyten enthaltende undurchsichtige Ring wurde unter Verwendung einer Pasteur-Pipette vorsichtig gesammelt und mit regulärem serumfreiem RPMI 1640 10-fach verdünnt. Die Zellen wurden für 10 Minuten bei 300 × g geschleudert und zweimal mit Medien gewaschen.
[0480] Die endgültige Lymphozytensuspension wurde mit Medien verdünnt und die Zellen wurden unter Verwendung von 0,05% Trypanblau gezählt. Die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Isolation lag üblicherweise
bei 95%. Die gesamte Ausbeute lag bei etwa 4 × 107 Zellen.
[0481] Präparation von B6B11. Heteromyelom-B6B11 wurde in RPMI 1640 mit 10% Cosmic Kälberserum
(Hyclone), dem Standardsatz an Ergänzungen (L-Glu, 4 mM nicht-essentielle Aminosäuren, Vitamine, Natriumpyruvat), ohne Antibiotika gezüchtet. Vor der Fusion wurden die Zellen in der Anwesenheit von 8-Ag (20
μg/ml) kultiviert, um die Reversion von HAT-sensitiven Zellen in den Wildtyp zu verhindern. Die Zellen wurden
bis zu einer Dichte von 10% in logarithmischer Wachstumsphase kultiviert.
[0482] Zellfusion. Sowohl B6B11-Zellen als auch Lymphknotenlymphozyten wurden 3mal mittels Zentrifugation bei 300 × g für 5 Minuten gewaschen, um jegliches verbleibende Protein in den Medien zu entfernen. Die
Zellen wurden in einem Verhältnis von 5:1 (Lymphozyt:Myelom) gemischt und bei 300 × g für 10 Minuten geschleudert. Der Überstand wurde vorsichtig und vollständig entfernt, das Pellet wurde sanft "puffed" und 100
μl einer auf Raumtemperatur erwärmten PEG/DMSO-Lösung wurden zu dem Zellgemisch gegeben, welches
für 3 Minuten sanft "angetippt" wurde. Dann wurden wie folgt 15 ml Hank's balancierte Salzlösung (HBSS) und
PBS (1.1) (aus einem 10 × Vorrat, Cellgro) zugegeben: 10 ml langsam in 10 Minuten, dann 5 ml über 5 Minuten,
dann 10 ml Komplettmedien (Medien zur Kultivierung von Zellen) über 5 Minuten und schließlich 5 ml über 1
Minute. Das Gesamtvolumen betrug 30 ml. Dann wurden 600 μl HT-Lösung (10 × Vorrat) und 1 Tropfen (etwa
20–30 μl) DMSO in das Gefäß zugegeben. Die Zellsuspension wurde in einem Gefäß vermischt, in eine Petrischale (100 × 15) überführt und in einem 37°C-CO2-Inkubator über Nacht inkubiert. Dann wurden die Zellen
geerntet, bei 300 × g für 10 Minuten pelletiert und in kompletten Medien, ergänzt mit HAT-Lösung und HT-Lösung (beide aus 50 × Vorrat), resuspendiert und dann zu etwa 250.000 Zellen pro Well in einem Volumen von
200 μl in 96-Well-Platten plattiert. Zweimal pro Woche wurden 50% der Medien durch frische Medien ersetzt.
Vor dem Screenen hinsichtlich der Antikörpern-Produktion wurden die Zellen in der Anwesenheit von HAT und
HT für 14–20 Tage kultiviert.
[0483] ELISA-Screening nach unspezifischem Immunglobulin. Es wurden ELISA-Platten mit polyklonalem
Ziege-anti-Mensch-IgG (Fc-spezifisch) (Sigma), Ziege-anti-Mensch-IgM (μ-spezifisch) (Sigma) oder Ziege-anti-Mensch-Ig (G + M + A)-H-Ketten (Sigma) in 100 μl Plattierungspuffer (0,1 M Natriumcarbonat, pH 9,0) zu 100
ng pro Well beschichtet. Die Platten wurden mit Parafilm oder Dichtungsabdeckungen versiegelt und bei 4°C
über Nacht inkubiert. Das Antigen wurde zweimal mit destilliertem Wasser ausgewaschen. Restliche Wassertropfen wurden entfernt und es wurden 200 μl Blockierungslösung (0,4% nicht fette Trockenmilch in PBS) zu
den Wells gegeben. Komplette Zellkulturmedien dienten als eine negative Kontrolle. Humanes Serum
(1:2.000) wurde als eine positive Kontrolle verwendet. Die Platten wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur
oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden 4mal mit destilliertem Wasser gewaschen und es wurden
zweit-Antikörper (die gleichen wie die Capture-Antikörper, jedoch an HRP konjugiert), verdünnt in 0,4%
Milch/PBS im Verhältnis 1:2.000, zu den Wells gegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur
wurden die Wells 4mal mit H2O gewaschen und es wurde Peroxidasesubstrat (Orthophenylendiamin in Phosphat-Citrat-Puffer mit Peroxid) zu den Platten gegeben. Die Farbreaktion wurde durch die Zugabe von 20 μl
10% Schwefelsäure gestoppt. Auf einem Multiscan-Lesegerät wurde bei A492 ein kolorimetrisches Auslesen
durchgeführt. Proben mit einer mindestens 3-fachen Erhöhung gegenüber dem Hintergrund wurden als Immunglobulin-produzierende Zellen angesehen.
[0484] Assay für die intrazelluläre (nicht-sekretierte) Anwesenheit von Immunglobulinen oder deren einzelne
Ketten. Zellen, die kein Immunglobulin in den Kulturmedienüberstand sekretierten, wurden auf die Anwesenheit von intrazellulärem Immunglobulin-immunreaktivem Material getestet. Es wurden ELISA-Platten mit Ziege-anti-Mensch-Kappa-Kette (Sigma), Ziege-anti-Mensch-Lambda-Kette (Sigma) und Ziege-anti-Mensch-IgH
(G, M, A) wie zuvor beschrieben beschichtet. Die Zellen wurden in 75 cm2 Kolben bis zu einer Dichte von 106
Zeilen pro ml gezüchtet, geerntet und 3mal mit HBSS gewaschen. Die Zellen wurden in PBS resuspendiert und
durch Sonifikation (8 × 15 Sekunden bei 25 MHz auf Eis) aufgebrochen. Die Suspension wurde für 15 Minuten
bei 10.000 × g geschleudert und der Überstand wurde für Immunglobulintests verwendet. Es wurde ein Äquivalent von 2 × 106 Zellen verwendet. Als eine negative Kontrolle wurden Maus-Fibroblasten T3T im selben Proteinmengen-Äquivalent verwendet. Der Rest des Protokolls war dasselbe wie zuvor für das Testen des Hybri-
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domüberstands beschrieben. Klone, die ein Signal zeigten, das gleich dem oder niedriger als das der Kontrollzellen war, wurden als potentielle Kandidaten für eine Fusion mit humanen Lymphozyten aus peripherem Blut
ausgewählt. Diese Triomklone wurden als modifizierte Fusionspartner-Serie (MFP-S) bezeichnet und fortlaufend nummeriert (MFP-1, MFP-2, MFP-3, etc.). Zur weiteren Analyse wurden sechs nicht-produzierende, nicht
sekretierende Triome selektioniert.
[0485] Selektion bezüglich 8-Ag-resistenter MFP-Mutanten. Um MFP-Triomzellen als Fusionspartner zu verwenden, wurden die MFP-Zellen in kompletten Medien, enthaltend ansteigende Mengen an 8-Ag, platziert. Die
Resistenz gegen 8-Ag wird durch das beeinträchtigte Enzym HGPRT oder dessen Abwesenheit bestimmt. Die
Selektion konzentrierte sich demzufolge auf Zellen, welche in der Anwesenheit von 8-Ag überlebten. Nach 5
bis 10 Passagen bei den niedrigeren Konzentrationen von 8-Ag (5 μg/ml) wurden die Überlebenden in Medien
mit einer höheren Konzentration (10 μg/ml) kultiviert. Dies wurde wiederholt, bis eine Konzentration von 20
μg/ml erreicht wurde. Nach 5–6 Passagen in der Anwesenheit von 8-Ag (20 μg/ml) wurden die Zellen hinsichtlich ihrer Lebensfähigkeit in HAT-Medien getestet. Keine der auf 8-Ag gezüchteten Zellen hatte nach 3 Tagen
der Kultivierung in der Anwesenheit von HAT überlebt.
[0486] Fusionseffizienz. Die MFP-Klone wurden auf ihre Fähigkeit getestet, mit Lymphknotenlymphozyten
und PBL zu fusionieren. MFP-2 ergab etwa 2–3 Hybride pro 105 Lymphknotenlymphozyten und 0,7–1,5 Hybride pro 105 PBL. Die Immunglobulin-Sekretionsrate für die unter Verwendung von MFP-2 entwickelten Hybride
rangierte zwischen 0,5 bis 15 μg/ml, ohne Abnahme über 7 Monate.
ZWEITE REIHE VON EXPERIMENTEN
1. Die Triomzelllinie MFP-2, welche für die Fusion mit humanen B-Lymphozyten aus peripherem Blut und
B-Lymphozyten aus humanen Lymphknoten verwendet wird, kann ebenso für die Fusion mit humanem peripherem Blut und Lymphknoten-T-Zellen verwendet werden und stabile Hybride erzeugen.
2. Die Triomzelllinie MFP-2 kann für die Fusion mit Lymphozyten aus peripherem Blut und Lymphknotenlymphozyten aus zwei Primatenspezies verwendet werden: Rhesusäffchen (Macaque mulatta) und Pavianen (Papio hamadryas), was Affen-Immunglobulin-produzierende Hybride ergibt. Das birgt eine potentielle
Anwendungsmöglichkeit für die Entwicklung von monoklonalen Affen-Antikörpern gegen verschiedene infektiöse Agenzien, um diese in Primatenmodellen zu testen.
3. Die Triom-Fusionspartner-Zelllinie MFP-2 wurde an das Wachstum in proteinfreien Medien angepasst,
mit den gleichen Wachstumseigenschaften wie bei einer Kultivierung in serumhaltigen oder serumfreien
(mit Protein ergänzten Medien).
4. Da MFP-2 in proteinfreien Medien kultiviert werden kann, wurde angenommen, dass es vergleichsweise
einfach wäre, die abgeleiteten Hybridome an die selben proteinfreien Medien anzupassen.
5. Von 6 Hybridomen wurden vier erfolgreich an proteinfreie Medien angepasst, ohne dass sich dabei die
Wachstumseigenschaften veränderten oder die Antikörperproduktion aufhörte. Diese Eigenschaft von
MFP-2 ergänzt den Vorteil dieser Zelllinie bei der Entwicklung von Hybridomen, welche zu einem Wachstum
in proteinfreien Medien in der Lage sind.
6. Es wurden unter Verwendung von MFP-2 und B-Lymphozyten aus peripherem Blut und Lymphknoten
von Brust- und Prostatakrebspatienten 27 humane Hybridome entwickelt, welche humane monoklonale Antikörper gegen mit Brust- und Prostata assoziierte Antigene produzieren.
7. 23 humane Hybridome stammen aus Brustkrebspatienten und 4 stammen aus Prostatakrebspatienten
ab.
8. Von Prostatakrebs stammende Hybridome:
1. Hybridom (32-B8) produziert IgM, Lambda-Antikörper, welcher spezifisch mit zwei humanen Prostata-Adenokarzinom-Zelllinien und mit einer humanen Brust-Adenokarzinom-Zelllinie reagiert und gegen ein
unbekanntes Antigen gerichtet ist, welches aller Wahrscheinlichkeit nach keine Proteinnatur aufweist (Western Blot ist negativ, obwohl es durchaus sein könnte, dass es sich bei dem Antigen um ein Protein handelt,
jedoch die Antigendeterminante konformationell und labil ist).
2. Hybridom (32-F6) produziert ebenfalls IgM, Lambda-Antikörper, welcher sowohl mit Prostata- als auch
Brust-Adenokarzinomzellen reagiert und das proteinöse Antigen mit einem Molekulargewicht von 60 kDa
erkennt.
3. Hybridom (39-A7) ist ebenfalls IgM, Lambda-Antikörper, welcher auf ein unbekanntes Proteintarget gerichtet ist, welches spezifisch sowohl für Brust- als auch für Prostata-Adenokarzinom ist.
4. Hybridom (50-1B3) produziert IgM, Kappa-Antikörper, welcher sowohl auf Brust- als auch auf Prostata-Adenokarzinom, auf ein molekulares Target unbekannter Natur gerichtet ist.
9. Die mit Brustkrebs assoziierten Hybridome sind die folgenden:
1. Hybridom (13-42) IgM, Kappa erkennt Proteinantigen von ~ 42 kDa Molekulargewicht, welches sowohl
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auf der Oberfläche als auch intrazellulär der Adenokarzinomzellen (Brust und Prostata), jedoch nicht in normalen humanen Fibroblasten vorhanden ist.
2. Hybridom (13-74), IgM, Kappa reagiert mit Proteinantigen von 65 kDa, welches spezifisch für die
Brust-Adenokarzinomzellen ist und auf der Zelloberfläche ebenso wie intrazellulär exprimiert wird.
3. Hybridom (13-82), IgM, Kappa, reagiert mit intrazellulärem Proteinantigen, welches nur für Brust- und
Prostata-Adenokarzinomzellen, nicht jedoch für humane Hautfibroblasten ist.
4. Hybridom (13-2C1), IgM Kappa reagiert mit einem Protein von 100 kDa, welches sowohl in Adenokarzinom- als auch in normalen Fibroblastenzellen anwesend ist.
5. Isotyp des Hybridoms (22-3E9) ist nicht bestimmt, erkennt etliche Proteintargets (welche alle miteinander
verwandt sein können) mit den Molekulargewichten 35, 45 und 250 kDa, welche sowohl auf Adenokarzinom- als auch auf Fibroblastenzellen vorhanden sind. Das Antigen befindet sich meistens auf der Oberfläche der Zellen. Reagiert spezifisch mit primären kanzerösen Läsionen.
6. Hybridom (22-6E7), IgM, Lambda, das Antigen ist unbekannt, der Antikörper reagiert nur mit Brust-Adenokarzinomzellen in Kultur.
7. Hybridom (22-8D11), IgM, Lambda, Antigen ist unbekannt, reagiert mit humanen Brust- und Prostata-Adenokarzinomzellen in Kultur.
8. Hybridom (27-F7), IgM-Kappa, reagiert nur mit Brust-Adenokarzinomzellen in Kultur. Bei dem Antigen
handelt es sich um ein mit TAX wechselwirkendes Protein 2 mit einem Molekulargewicht von ~ 35–40 kDa.
9. Hybridom (27-B1), dasselbe wie 27-F7, zeigt hohe spezifische Reaktivität mit den kanzerösen Läsionen
in primären Tumoren, keine Kreuzreaktivität mit dem Bindegewebe oder mit normalen Brustepithelzellen.
10. Hybridom (36-G7), Antikörper-Isotyp ist nicht bestimmt; Spezifität ist dieselbe wie 27-B1.
11. Hybridom (27-F10), IgG, Lambda, reagiert mit dem Protein mit etwa 200 kDa auf Brust-Adenokarzinomzellen.
12. Hybridom (33-2F10), IgM, Kappa, Antigen ist nicht bekannt, reagiert mit Brust-Adenokarzinomzellen.
13. Hybridom (33-2H6), IgM, Lambda, erkennt 65 kDa Protein auf Brust- und Prostata-Adenokarzinomzellen, nicht jedoch auf humanen Hautfibroblasten.
14. Hybridom (59-3G7), IgM, Lambda, reagiert mit einem 70 kDa Protein Lamin A oder C in Adenokarzinomzellen. Kreuzreaktivität mit anderen Zellen wurde nicht getestet.
15. Hybridom (59-2F6), IgG, Lambda, reagiert nur mit Brust-Adenokarzinomzellen mit unbekanntem Antigen.
16. Hybridom (69-C12), IgM, Kappa, reagiert hauptsächlich mit Brust-Adenokarzinomzellen, gerichtet auf
ein Protein, 50 kDa.
17. Hybridom (76-2F6), IgM, Lambda, reagiert mit unbekanntem Antigen nur auf Brust-Adenokarzinomzellen.
18. Hybridom (83-3A6), Isotyp nicht bestimmt, reagiert nur mit Brust-Adenokarzinomzellen.
19. Hybridom (85-E1), IgM, Lambda, reagiert nur mit Brust-Adenokarzinomzellen, welche Her2/neu exprimieren; Antigen bisher noch nicht identifiziert.
20. Hybridom (88-1D8), Isotyp ist bisher noch nicht bestimmt, erkennt Proteinantigene auf Brustkrebszellen;
Molekulargewichte variieren zwischen –70, 90 und 100 kDa
21. Hybridom (89), Isotyp ist nicht bestimmt, reagiert nur mit Her2/neu-negativen Adenokarzinomzellen; Antigen ist nicht bekannt
22. Hybridom (100-1F4), IgM, Kappa, reagiert nur mit Brust-Adenokarzinomzellen; Antigen ist nicht bekannt.
23. Hybridom (100-2H3), ähnliche wie 100-1F4.
REFERENZEN FÜR DIE ZWEITE REIHE VON EXPERIMENTEN
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DRITTE REIHE VON EXPERIMENTEN
BEISPIEL 1: Entwicklung von vollständig humanen monoklonalen Antikörpern
Einführung
[0487] Die vorliegende Erfindung umfasst eine einzigartige Fusionspartner-Zelllinie, welche mit aus Lymphknoten, Milz, Tonsillen oder peripherem Blut stammenden humanen Lymphozyten fusioniert. Die resultierenden Hybride erwiesen sich als stabile Produzenten von humanen Immunsubstanzen, Immunglobuline genannt,
und repräsentieren eine verlässliche Quelle von humanen Antikörpern für die Immuntherapie. Unter Verwendung dieser Fusionspartnerzelllinie, welche als MFP-2 bezeichnet wurde, entwickelten wir mehrere monoklonale Antikörper mit einer spezifischen Reaktivität gegenüber humanem Brust- und Prostatakrebs.
Ergebnisse
Hybridomtechnologie
[0488] Mittels Hybridomtechnologie unter Verwendung der geschützten Fusionspartnerzelllinie MFP-2 und
humaner Lymphknotenlymphozyten (LNL), welche aus dem Lymphknoten einer Patientin mit Brustkrebs in
Stadium IV, die sich einer Mastektomie und Lymphadenektomie unterzogen hatte, isoliert wurden, wurden vollständig humane monoklonale Antikörper (fhMAb) entwickelt. Die Fusion von MFP-2 an LNL ergab etliche Klone, welche Antikörper produzierten, die mit den etablierten Brustkrebszelllinien SK-BR-3, MCF-7 und ZR-75-1
reagierten. Zwei der Antikörper, bezeichnet als 27.F7 und 27.B1, reagierten spezifisch mit dem Proteintarget
aus diesen Zellen mit einem Molekulargewicht von etwa 43 kDa, wie durch Western-Blot-Analyse derjenigen
Lysate dieser Zellen sowohl unter reduzierten als auch unter nicht reduzierten Bedingungen gezeigt wurde. Die
Hybridomzelllinien wurden an das Wachstum in serumfreien Medien angepasst, wobei sie eine Dichte von 1,5
× 106 Zellen pro ml in Kolben/TC-Schalen in der Plateauphase erreichen. Die Zelllinie 27.F7 war ebenfalls in
der Lage, in einem Hohlfaser-Bioreaktor zu wachsen und erreichte die Dichte von 20–25 × 106/ml und die Zelllinie 27.B1 wuchs effizient in Spinnerflaschen. Die Produktion der Antikörper betrug für 27.F7 17 μg/ml/106 Zellen/24 h und für 27.B1 49 μg/ml/106 Zellen/24 h. Beide Antikörper waren IgM, k. Für weitere Untersuchungen
des Molekulartargets für diese Antikörper wurden Zellen in Mengen unter Verwendung serumfreier Medien kultiviert und es erfolgte die Aufreinigung unter Verwendung einer Größenausschlusschromatographie von SephacrylTM S-200 (hohe Auflösung), wo IgM in einem Ausschlussvolumen erschien.
BEISPIEL II – Antikörperbindung an Krebszelllinien
[0489] Die erzeugten Antikörper reagierten sowohl mit den humanen Krebszelllinien als auch mit primären
Tumorgeweben. Für einige dieser Antikörper wurden Antigentargets identifiziert. Zwei Antikörper, 27.F7 und
27.B1, waren auf das gleiche Antigen gerichtet, welches als mit Tax wechselwirkendes Protein, Klon 2 (TIP-2)
identifiziert wurde. Die Antikörper 27.B1 und 27.F7 reagierten mit drei humanen Brustkrebszelllinien, MCF-7,
SK-BR-3 und ZR-1-75 und weisen eine Tracer- oder keine Reaktivität mit humanen Prostatakrebszellen sowie
eine negative Reaktivität mit humanen Fibroblasten auf.
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Ergebnisse
ELISA-Assay
[0490] Ein zellulärer ELISA-Assay zeigte die Bindung von 27.F7 und 27.B1 an humane Brustkrebszelllinien
in einer spezifischen Art und Weise und keine Bindung an humane Haut- oder Rumpf-Fibroblasten.
Durchflusszytometrie
[0491] Durchflusszytometriestudien zeigten, dass das Antigentarget auf der Oberfläche von lebenden Zellen
ebenso zugänglich ist wie im Zytosol von in Formaldehyd fixierten Zellen. Das Muster der Bindung der Antikörper an die Zellen war jedoch unterschiedlich, was anzeigt, dass diese Antikörper wahrscheinlich unterschiedliche Epitope auf ein und demselben Antigen erkennen. Der Antikörper 27.B1 reagierte mit der Oberfläche der
Brustkrebszellen SK-BR-3 und MCF-7, jedoch nicht mit den lebenden Prostatakrebszellen PC-3 und LNCaP
sowie mit lebenden humanen Fibroblasten (Fig. 7). Wurden jedoch bei der durchflusszytometrischen Analyse
in Formaldehyd fixierte Zellen verwendet, so zeigte diese, dass der Antikörper 27.B1 sowohl mit Brustkrebszelllinien als auch mit den Prostatakrebszelllinien LNCaP reagierte, obwohl er humanen Fibroblasten gegenüber noch immer negativ war. Der Antikörper 27.F7 zeigte ein unterschiedliches Muster der Reaktivität: er reagierte mit den fixierten primären Fibroblasten, anscheinend mit irgendeinem intrazellulären Epitop. Unter Verwendung von Zelllysaten, präpariert aus drei Brustkrebszelllinien (SK-BR-3, MCF-7 und ZR-75-1), drei Prostatakrebszelllinien (LNCaP, PC-3 und Du-145) sowie zwei humanen Fibroblastenzelllinien (Hs556.Sk und
Hs143.We).
Western Blot
[0492] Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die beiden Antikörper 27.F7 und 27.B1 mit dem Protein von
etwa 43 kDa reagieren, welches auf dem Blot als eine Doppelbande erscheint. Dieses Protein wird in höchstem
Maße in allen drei Brustkrebszelllinien, nicht in zwei humanen Fibroblastenzelllinien und nur sehr schwach in
den Prostatakrebszellen PC-3 und Du-145 exprimiert. LNCaP-Zellen zeigen vernachlässigbare, wenn überhaupt vorhandene, Level der Expression dieses Proteins (Fig. 8).
Immunzyto- und histochemische Studien
[0493] Immunzyto- und histochemische Studien unter Verwendung von etablierten humanen Zelllinien und
primären und metastatischen Läsionen aus Tumorgeweben von einer Anzahl von Patienten mit Brust- und Prostatakrebs zeigten ein sehr spezifisches Muster der Immunfärbung von Brust- und Prostatakrebszellen
(Fig. 9), primären Tumoren (Fig. 10, Fig. 11, Fig. 12 und Fig. 13) und metastatischen Läsionen in den Lymphknoten (Fig. 14). Sowohl fixierte als auch frisch eingefrorene Tumorgewebe waren positiv bei der Immunfärbung mit den Antikörpern 27.B1 und 27.F7 (Fig. 15). Von 10 Fällen von Brustkrebs, die in der Immunhistochemie mit fhMAb 27.B1 getestet wurden, erwiesen sich alle 10 als positiv, während sich die entsprechende Anzahl von normalen Proben aus dem Brustepithel durchweg negativ zeigte. Neben diesen zwei Arten von Krebs
wurde ebenfalls eine positive Färbung von männlichem Brustkrebs und Seminom beobachtet (Fig. 16).
[0494] Von weiteren auf die Anwesenheit von 27.B1/27.F7-Immunreaktivität getesteten Geweben, wie beispielsweise normaler Darmschleimhaut, Darmkrebs, Nierenkrebs, normalen Nierenglomeruli, normalen Leberund sowohl normalen als auch kanzerösen Lungengeweben, erwiesen sich alle als negativ (Fig. 17). Gleichzeitig war die Immunfärbung von normalem Brustepithel, nicht betroffenen Lymphknoten und gutartiger Prostatahyperplasie negativ. Dies legt die Spezifität von Brust-/Prostatakrebs für diese fhMAbs nahe.
Diskussion
[0495] Zwei der entwickelten Antikörper, beide IgM, Kappa, reagieren mit einem als GIPC oder TIP-2 bezeichneten krebsspezifischen Antigen. GIPC steht für mit GAIP (mit Ga wechselwirkendes Protein, Regulator des
G-Signalings) wechselwirkendes Protein, C-Domäne, und TIP-2 steht für mit Tax wechselwirkendes Protein,
Klon 2. Die Anwesenheit dieses Proteins war nur mit Brustkrebszellen assoziiert, während Prostatakrebszellen
nur Spuren davon halten, wenn überhaupt. Humane Fibroblasten waren hinsichtlich der Anwesenheit von
GIPC-/TIP-2-Antigen negativ. Die Scatchard-Analyse der Anzahl der Kopien von TIP-2-Antigen in
SK-BR-3-Zellen (TIP-2-positive Zellen) ergab etwa 300.000 Kopien pro Zelle. In den immunhistochemischen
Studien wurde gefunden, dass sowohl 27.F7 als auch 27.B1 alle drei Haupt-Arten von Brustkrebs positiv färben: invasiv lobulär, invasiv duktal sowie Adenokarzinom in situ. Diese Antikörper färben ebenfalls Prostata-
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krebs, während sich normale Brustepithelien und gutartige Prostatahyperplasie (BPH) als negativ erwiesen.
Die Antikörper waren ebenfalls negativ auf normalem und kanzerösen Lungengewebe, auf normaler Darmschleimhaut und Darmkrebs, sowie auf normalem und kanzerösen Nierengewebe. Folglich handelt es sich bei
dem GIPC-/TIP-2-Marker um einen wertvollen immunhistochemischen Marker für die histopathologische Bewertung von Proben aus Krebsgeweben.
BEISPIEL III – Identifikation des Antigens
[0496] Auf der Grundlage der zuvor beschriebenen Antikörper wurde ein neuartiges tumorassoziiertes Antigen, welches spezifisch für Brust- und Prostata-Adenokarzinom ist, als GIPC (mit Tax wechselwirkendes Protein 2) identifiziert. Das zur Identifikation dieses neuartigen tumorassoziierten Antigens verwendete Verfahren
war SEREX (SErologische Analyse von Antigenen durch REkombinante EXpressionsklonierung oder spontane Antikörperantworten auf tumorassoziierte Antigene) (Fig. 20). Dieses Verfahren wurde ursprünglich am
Ludwig-Institut entwickelt, zum Zweck der Identifikation von spezifischen Proteintargets für die im Plasma oder
Serum von Krebspatienten zu findenden Antikörper (1). Die Erfindung beschreibt ein 43 kDa-Protein, welches
zu den so genannten PDZ-Domänen-enthaltenden Proteinen gehört. Bei PDZ-Domänen handelt es sich um
Proteinmotive von 80–100 Aminosäuren, in welchen der sich wiederholende Konsensus von GLGF eine charakteristische Eigenschaft ist. Die PDZ-Domäne (benannt nach dem Protein der postsynaptischen Dichte
PSD-95 in Säugern, dem Drosophila-Disk-Large-Protein Dlg und einem Tight-Junction-Protein ZO-1 in Säugern) ist in mehr als 50 Proteinen zu finden, welche zum größten Teil nicht miteinander verwandt zu sein scheinen. Diese Proteine sind üblicherweise an Signalnetzwerken beteiligt, wie beispielsweise den G-Protein-vermittelten Signalwegen. PDZ-Domänen sind zum Beispiel zu finden in Signalmolekülen wie beispielsweise Dlg,
Stickoxidsynthase (NOS), Protein-Thyrosin-Phosphatase, membranassoziierte Guanylatkinasen (MAGUK)
und so weiter.
[0497] Die meisten PDZ-Domänen-enthaltenden Proteine sind mit dem Zytoskelett assoziiert und anscheinend an der Bildung von multimeren Proteinkomplexen beteiligt (2, 3). Das einzige PDZ-Domänen-enthaltende
Protein, das mit humanem Darmkrebs assoziiert ist, wurde von Scanlan et al. beschrieben (4, 5). Dieses Antigen, NY-Co-38/PDZ-73, wurde über IgG-Autoantikörper identifiziert, welche in Darmkrebspatienten entwickelt
wurden. Die gleichen Autoren beschrieben ebenfalls einige wenige gewebespezifische Isoformen von PDZ-73,
bei denen es sich allem Anschein nach um verkürzte Formen handelt, die eine oder zwei PDZ-Domänen enthalten (die ursprüngliche PDZ-73-Form hat drei Domänen). Die Funktion dieser Proteine ist nicht bekannt, obwohl sie eine strukturelle Ähnlichkeit mit der MAGUK-Familie von Proteinen aufweisen. Es wird angenommen,
dass die PDZ-Domäne, obwohl ihre spezielle Funktion nicht klar ist, an der Protein-Protein-Wechselwirkung
und der Bildung von umfangreichen Proteinnetzwerken beteiligt ist.
[0498] TIP-2 wurde kürzlich von Rousset et al. (1) als eines von 6 zellulären Proteinen mit unbekannter Funktion identifiziert, die durch ihre PDZ-Domäne mit dem C-Terminus vom Onkoprotein-Tax Wechselwirken. Da
das C-terminale Motiv S/TXV von Bedeutung für die Wechselwirkung mit der PDZ-Domäne ist, stellte sich heraus, dass das Onkoprotein-Tax die Wechselwirkung mit TIP-2 sogar dann bewahrt, wenn das kritische C-terminale Valin durch beispielsweise Alanin ersetzt wird, während alle anderen Tax-bindenden PDZ-Domänen-enthaltenden Proteine ihr Bindungspotential verlieren.
Ergebnisse
[0499] TIP-2 wurde identifiziert durch Screenen von Antikörpern, welche von den B-Zellen von Brustkrebspatienten stammen, auf einer cDNA-Expressionsbibliothek, welche aus der humanen Brustkrebszelllinie
SK-BR-3 hergestellt worden war. Kurz gesagt wurde poly(A)+-RNA aus den Zellen isoliert, in cDNA transkribiert und in einen pseudolytischen Lambda-Phagen ligiert, was etwa 5 × 10 5 Rekombinanten ergab. Der Phage wurde in E. coli Y1090 amplifiziert und dann auf Nitrozellulosemembranen überführt, welche mit humanen
Antikörpern behandelt wurden. Nachdem sie den Antikörpern ausgesetzt worden waren, wurden die Membranen mit polyklonalen Anti-μ-Ketten-Kaninchen-Antikörpern behandelt, die an Meerrettichperoxidase konjugiert
waren. Positive cDNA-Klone wurden durch Exzision in vivo in Plasmidformen konvertiert und die Plasmid-DNA
wurde aufgereinigt und einer Sequenzanalyse unterzogen. Die resultierende Sequenz wurde unter Verwendung einer GenBank-Datenbank einer Homologiesuche unterzogen. Es wurden zwei humane monoklonale
Antikörper (27.F7 und 27.B1), entwickelt aus B-Zellen der Lymphknoten von Brustkrebspatienten, als Antikörper identifiziert, welche mit TIP-2 reagieren, wenn auch anscheinend mit unterschiedlichen Epitopen.
[0500] Einer der Antikörper, 27.F7, wurde in großen Mengen in einem Bioreaktor hergestellt und zur Immunpräzipitation von TIP-2 aus dem SK-BR-3-Zelllysat verwendet. Das Präzipitat ergab 2 Banden des Molekular-
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gewichts, welches charakteristisch für TIP-2 ist und den Banden entspricht, welche im Western Blotting von
Zelllysaten von Anti-TIP-2-Antikörpern erkannt werden. Der Streifen der Nitrozellulosemembran, welcher die
Banden von TIP-2 enthielt, wurde subkutan in Balb/C-Mäuse implantiert, um diese zu immunisieren. Nach zwei
Implantationen entwickelten die Mäuse eine signifikante Immunantwort auf TIP-2, wie durch eine Western-Blot-Analyse von Mäuseseren gegen SK-BR-3-Zelllysate bewiesen wurde (Fig. 21 und Fig. 28). Das Immunserum aus diesen Mäusen zeigte sich positiv bei der Immunhistochemie von vorliegenden Tumorgeweben
(Fig. 23). Diese Mäuse werden zur weiteren Entwicklung von Maus-Anti-TIP-2-Antikörpern verwendet werden.
[0501] Unter Verwendung des fhMAb 27.F7 wurde eine Bewertung seiner Affinität und ebenfalls der Anzahl
an TIP-2-Molekülen auf der Oberfläche von SK-BR-3 durchgeführt. Es wurde gefunden, dass es zwei Untergruppen von TIP-2-Molekülen gibt (was den Western Blot-Daten entspricht), welche unterschiedliche Affinität
für 27.F7 aufweisen. Eine Untergruppe (Isoform) von TIP-2 ist zu etwa 60.000 Kopien pro Zelle vorhanden und
bindet 27.F7 mit Ka = 4,2 × 1011 M–1 und eine andere ist zu 230.000 Kopien pro Zelle vorhanden mit Ka = 3,3 ×
109 M–1 (Fig. 24). Eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung von humanen Brustkrebszelllysaten ebenso
wie von primären Tumorlysaten zeigte eine starke Expression von TIP-2 in allen Tumorläsionen und keine Spuren dieses Antigens in normalen nicht betroffenen Brustepithelien (Fig. 25). Diese Daten waren konsistent mit
immunhistochemischen Studien der Gewebesektionen von denselben klinischen Fällen (Daten nicht gezeigt).
Kopplung von 27.F7 an Liposomen
[0502] Um die Möglichkeit zu erforschen, Anti-TIP-2-Antikörper als einen Vektor zur Liposomzufuhr zu verwenden, wurden einige unterschiedliche Verfahren zur Kopplung von 27.F7 an Liposomen getestet. Aufgrund
der Tatsache, dass die Antikörper IgMk-Isotyp aufwiesen, wurde mit chemischen Problemen hinsichtlich der
Kopplung von IgM an Liposomen erwartet. Eines der Protokolle erwies sich als höchst effektiv und erbrachte
ein hohes Verhältnis zwischen Antikörperkopplung an Liposomen und Konservierung des Antikörpers in einem
intakten und gegenüber TIP-2 reaktiven Zustand, wie durch Western Blot gezeigt wurde (Fig. 26).
TIP-2-Identifikation in Brustkrebspatienten
[0503] Es wurden ebenfalls Experimente zur Identifikation von TIP-2 in Serum oder Plasma von Brustkrebspatienten erprobt. Die logische Grundlage für eine solche Annahme besteht darin, dass – da TIP-2 auf der
Oberfläche der Zellen exprimiert wird – ein gewisser Teil davon in den Blutkreislauf abgegeben werden kann
oder, selbst wenn dies nicht der Fall ist, dass es doch in den Seren von Patienten im fortgeschrittenen Stadium
der Erkrankung als ein Ergebnis der Nekrose des Tumors oder als ein Ergebnis chemotherapeutischer Behandlung auftreten kann. Da es keinen ELISA-Assay für einen solchen Test gibt, wurden die Seren von Patienten auf TIP-2 getestet, unter Verwendung von Western Blotting der gesamten Serumprobe und dem fhMAb
27.F7 als einem Tag. Dieses Verfahren funktionierte aufgrund eines technischen Problems nicht: Die Fülle an
humanem Serumalbumin (HSA) in humanem Serum maskiert die Region auf einem Gel, wo TIP-2 gemäß den
Erwartungen lokalisiert werden würde. Das Spicken der Serumprobe mit dem SK-BR-3-Zelllysat (enthaltend
TIP-2) zeigte, dass TIP-2 sowohl in humanem Serum als auch humanem Plasma durch Western Blot identifiziert werden konnte. Um die Identifikation von TIP-2 in Serum zu untermauern, wurde eine schrittweise Alkoholfraktionierung von mit SK-BR-3-Zelllysat gespicktem humanem Serum durchgeführt, um die Alkoholkonzentration zu identifizieren, die ausreicht, um TIP-2 zu präzipitieren. Es wurde gezeigt (Fig. 27), dass TIP-2
durch 10% Alkohol vollständig präzipitiert werden kann, während HSA und Immunglobuline (der hauptsächliche Proteinbestandteil von humanem Serum) noch immer in der Lösung verblieben. Dies kann die Identifikation von TIP-2 in Serum unter Verwendung von Western Blot vereinfachen. Ein zweiseitiger immunenzymatischer Assay unter Verwendung von Maus-Antikörpern mit hoher Affinität würde ein anderes Mittel zur Identifikation von TIP-2-Antigen bereitstellen.
Diskussion
[0504] Eines der Targets, die sich zeigten, ist die PDZ-Domäne, welche Protein enthält, das sowohl im Zytosol
als auch in der Zellmembran von humanen Brustkrebszellen lokalisiert ist. Dieses Protein, bezeichnet als GIPC
oder TIP-2 (mit Tax wechswelwirkendes Protein, Klon 2), ist am Vesikel-Trafficking und Bildung von Proteinnetzwerken beteiligt. Es hat eine Reihe von Eigenschaften, wie beispielsweise die Fähigkeit an das mit
RGS-Ga wechselwirkende Protein, C-Domäne zu binden, zur Bindung an HTLV-1-Onkogen-Tax und zum Eingehen einer Bindung sowohl mit a-Actinin als auch mit Glukosetransporter 1. Während die exakte physiologische Rolle dieses Proteins nicht bekannt ist, zeigt es eine konstante Überexpression in Brustkrebszellen, mit
vernachlässigbarer, wenn überhaupt vorhandener, Expression in Prostatakrebszellen und keiner Expression
in humanen Fibroblasten. GIPC/TIP-2 ist ein 42 kDa-Protein, welches auf einem Western Blot in Form eines
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Dublettes vorhanden ist, vermutlich, weil es zwei offene Leserahmen in seinem N-Terminus aufweist. Die Anzahl der Kopien pro SK-BR-3 humaner Brustkrebszelle ist relativ hoch, in etwa 300.000 Kopien pro Zelle. Zwei
vollständig humane Antikörper, durch welche dieses Antigen identifiziert wurde, gehören zum IgM-Isotyp und
weisen unterschiedliche Epitopspezifitäten auf. Einer der Antikörper, 27.B1, weist eine signifikante Immunreaktivität mit der Oberfläche von TIP-2-positiven Zellen auf, während ein anderer, 27.F7, nur mit den fixierten
Zellen, d. h. intrazellulär, reagiert. 27.B1 exprimiert ebenfalls die umfassende Fähigkeit zur Internalisation,
während 27.F7 dies nicht tut. Tests von 27.B1 hinsichtlich seiner biologischen Wirkung in der Anwesenheit und
Abwesenheit eines Komplements zeigten, dass dieser Antikörper den zelluläre zytolytischen/zytostatischen Effekt ohne das Komplement bewirken kann. Bei dem Mechanismus dieses Effekts handelt es sich wahrscheinlich um eine Apoptose.
[0505] Das hierin identifizierte Protein wurde kürzlich als GIPC (mit GAIP wechselwirkendes Protein, C-Terminus) beschrieben, ein Protein, welches über seine PDZ-Domäne an das C-terminale Motiv des Target-Proteins bindet (6). In diesem Fall handelt es sich bei dem Target-Protein um GAIP (mit Gai3 wechselwirkendes
Protein), ein membranverankertes RGS (Regulator des G-Signalling)-Proteins, welches mit einer ai3-Untereinheit des G-Proteins wechselwirkt und dessen GTPase-Aktivität verstärkt, wodurch die Deaktivierung des
G-Proteins vereinfacht wird (Fig. 18, Fig. 19) (7). Bei GIPC handelt es sich um das einzige bisher beschriebene Protein, welches an den C-Terminus von GAIP bindet. Die funktionelle Bedeutung dieser Wechselwirkung
ist nicht bekannt. Kürzlich isolierten Rousset et al. (8) unter Verwendung des Tax-Transaktivator-Proteins aus
HTLV-1 als Köder eine unvollständige GIPC-cDNA. Sie bezeichneten diese Form von GIPC als TIP-2, für mit
Tax wechselwirkendes Protein, Klon 2, und zeigten, dass diese Form effektiv mit dem C-Terminus von Tax-Onkoprotein interagiert. Tax-Onkoprotein ist nicht das einzige Onkoprotein, das über seinen C-Terminus an die
PDZ-Domäne bindet. E6-Onkoprotein aus dem humanen Papillomavirus (HPV) (9) und E4-Onkoprotein aus
dem D-Adenovirus, Typ 9, (Ad9) weisen ebenfalls C-terminale Motive auf, welche an die PDZ-Domäne binden
(10). Bei einer solchen Bindung könnte es sich um einen zugrundeliegenden Mechanismus handeln, in der Entwicklung von mit HPV assoziierten Krebserkrankungen oder, wie im Fall von E4-Onkoprotein, von Brusttumoren (Ad9 ruft als einziges Protein ausschließlich östrogenabhängige Brusttumoren in weiblichen Ratten hervor
[11]). Für alle drei Onkoproteine ist die C-terminale Region ausschlaggebend für die Auslösung des Transformationspotentials (8, 9, 10). Da das C-terminale Motiv S/TXV wichtig für die Wechselwirkung mit der PDZ-Domäne ist, stellte sich heraus, dass Tax-Onkoprotein die Wechselwirkung mit TIP-2 aufrechterhält, selbst wenn
das kritische C-terminale Valin durch zum Beispiel Alanin ersetzt wird, während alle anderen Tax-bindenden
PDZ-Domänen-enthaltende Proteine ihr Bindungspotential verlieren. TIP-2 wurde identifiziert durch Screenen
von Antikörpern, die von B-Zellen aus Brustkrebspatienten stammten, auf einer DNA-Expressionsbibliothek,
die aus der humanen Brustkrebszelllinie SK-BR-3 hergestellt worden war. Kurz gesagt wurde poly(A)+-RNA
aus den Zellen isoliert, in cDNA transkribiert und in einen pseudolytischen Lambda Phagen ligiert, was in etwa
5 × 105 Rekombinanten ergab. Der Phage wurde in E. coli Y1090 amplifiziert und dann auf Nitrozellulosemembranen überführt, welche mit humanen Antikörpern behandelt wurden. Nachdem sie den Antikörpern ausgesetzt worden waren, wurden die Membranen mit polyklonalen Anti-μ-Ketten-Kaninchen-Antikörpern behandelt,
welche an Meerrettichperoxidase konjugiert waren. Positive cDNA-Klone wurden durch Exzision in vivo in
Plasmidformen konvertiert und die Plasmid-DNA wurde aufgereinigt und einer Sequenzanalyse unterzogen
(Fig. 8). Die resultierende Sequenz wurde unter Verwendung einer GenBank-Datenbank einer Homologiesuche unterzogen. Es wurden zwei humane monoklonale Antikörper (27.F7 und 27.B1), entwickelt aus B-Zellen
der Lymphknoten von Brustkrebspatienten, als Antikörper identifiziert, welche mit TIP-2 reagieren, wenngleich
anscheinend mit unterschiedlichen Epitopen.
[0506] Die GenBank/Protein-Datenbank-Information für dieses Protein lautet wie folgt: NCBI-Referenz –
NP005707.1PGGLUT1CBP; Homo sapiens mit RGS-GAIP wechselwirkendem Protein GIPC; vollständige
CDS (AF0889816); Homo sapiens mRNA mit Tax wechselwirkendes Protein 2, partielle CDS (AF028824). Die
vorliegende Erfindung zeigt, dass dieses Antigen, das mit Tax wechselwirkendes Protein 2 (TIP-2), als ein unverwechselbarer und spezifischer Marker für Brust- und Prostata-Adenokarzinom dienen kann.
Zusammenfassung der Experimente
[0507] Unter Verwendung einer spezifischen Fusionspartnerzelllinie MFP-2 wurden zwei vollständig humane
Antikörper gegen mit Brust- und Prostatakrebs assoziierte Antigene entwickelt. Beide Antigene reagierten mit
einem 42 kDa-Proteintarget welches durch SEREX-Technologie als ein mit Ga wechselwirkendes Protein,
C-Terminus, oder mit Tax wechselwirkendes Protein, Klon 2, identifiziert wurde. Dieses Protein wird in drei humanen Brustkrebszelllinien, SK-BR-3, MCF-7 und ZR-1-75 spezifisch überexprimiert, weist ein sehr niedriges,
wenn überhaupt vorhandenes, Expressionsniveau in den humanen Prostatakrebszelllinien PC-3, LNCaP und
DU-145 und keine Expression in zwei humanen Fibroblastenzelllinien auf. Es wurde gefunden, dass das
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TIP-2-Antigen in sämtlichen Brustkrebsgeweben und in den meisten Prostatakrebsarten exprimiert wird. Normale Brustepithelien erwiesen sich als negativ bei der Färbung mit Anti-TIP-2-Antikörpern, ebenso wie Gewebe aus gutartiger Prostatahyperplasie (BPH). Zwei vollständig humane monoklonale Antikörper gegen
GIPC-/TIP-2-Antigen wurden gegen unterschiedliche Epitope gerichtet und ergaben ein unverkennbares Muster an Immunreaktivität mit humanen Brustkrebszellen. Der Antikörper 27.F7 reagierte sowohl mit in Formalin
fixierten als auch lebenden Krebszellen SK-BR-3 und MCF-7, während der Antikörper 27.B1 sowohl mit lebenden als auch mit fixierten SK-BR-3-Zellen und ausschließlich mit fixierten MCF-7-Zellen reagierte. Auf der anderen Seite zeigte der Antikörper 27.B1 eine rapide Internalisation, während sich 27.F7 nicht internalisierte.
Bei Tests hinsichtlich zytolytischer/zytostatischer Wirkung in der der Anwesenheit von und ohne Komplement
schien es ebenfalls, dass 27.F7 keinerlei zytotoxische Wirkung auf die Zellen verursacht, während 27.B1 einen
zytotoxischen Effekt verursacht, welcher nicht von Komplement abhängig ist. Die Scatchard-Analyse einer Anzahl von Kopien von GIPC-/TIP-2-Antigen pro Zelle zeigte, dass folglich Antigen in einer durchaus hohen Anzahl von Kopien bis hin zu etwa 300.000 Kopien pro Zelle vorhanden ist. Dies beinhaltet die Gesamtanzahl von
TIP-2-Molekülen, sowohl auf der Oberfläche als auch im Zytosol. Unter Verwendung eines der humanen Antikörper, 27.F7, als Immunpräzipitations-Köder wurde eine geringe Menge von TIP-2 isoliert und es war möglich,
etliche monoklonale Maus-Antikörper gegen dieses Antigen zu erzeugen. Alle Antikörper reagieren im Western
Blot mit der Proteinbande, die TIP-2 entspricht, und ergeben ebenfalls eine unverkennbare und spezifische positive Färbung von Krebszellen und primären Tumorgeweben. Unter Verwendung von humanen Antikörpern
wurde gezeigt, dass GIPC/TIP-2 normalerweise nicht von Krebszellen sekretiert oder abgegeben wird, jedoch
in Kulturmedien lediglich als ein Ergebnis der Zellzerstörung vorgefunden werden kann. Die Behandlung von
SK-BR-3-Zellen mit den ansteigenden Mengen von Taxol zeigte, dass TIP-2-Antigen in einer Dosis-abhängigen Art und Weise in die Medien freigesetzt wird, was folglich anzeigt, dass dieser Marker wertvoll für die Überwachung der natürlichen oder Chemotherapie-induzierten Nekrose von Tumorläsionen ist.
Referenzen für die dritte Reihe von Experimenten
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responses in the autologous host. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11810–11813, 1995.
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J. D., Chef, Y. T., Old, L. J., Isoforms of the human PDZ-73 protein exhibit differential tissue expression. Biochimica et Biophysica Acta 1445: 39–52, 1999.
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specifically with the C terminus of RGS-GAIP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12340–12345, 1998.
7. Berman, D. M., Gilman, A. G., Mammalian RGS proteins: barbarians at the gate. J. Biol. Chem. 273:
1269–1272, 1998.
8. Rousset, R., Fabre, S., Desbois, C., Bantignies, F., Jalinot, P., The C-terminus of the HTLV-1 Tax oncoprotein
mediates interaction with the PDZ domain of cellular proteins. Oncogene 16: 643–654, 1998.
9. Kyono, T., Hiraiwa, A., Fujita, M., Hayashi, Y., Akiyama, T., Ishibasahi, M., Binding of high risk Papillomavirus
E6 oncoproteins to the human homologue of the Drosophila discs large tumor suppressor protein. Proc. Natl.
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homologue of the Drosophila discs large tumor suppressor protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6670–6675,
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2, pp. 2111–2148, 1996.
VIERTE REIHE VON EXPERIMENTEN
Proteinantigene, identifiziert durch natürliche humane monoklonale Antikörper, entwickelt aus B-Zellen von
Brust- und Prostatakrebspatienten
EINFÜHRUNG
[0508] Zusätzlich zu GIPC/TIP-2 kann das in der dritten Reihe von Experimenten beschriebene Verfahren
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(oben) dazu verwendet werden, andere Proteinantigene zu identifizieren, einschließend die im Nachfolgenden
aufgelisteten.
BEISPIEL I: Humane mRNA für das KIAA0338-Gen, partielle CDS
[0509] Der vollständig humane monoklonale Antikörper (fhMAb) 13.42 erkennt die unbekannte humane Antigen-mRNA, welche für das als KIAA0338 bezeichnete Gen bekannt ist (Sequenz in Fig. 32 gezeigt). Das berechnete Molekulargewicht (MW) für diesen mit Brustkrebs assoziierten Marker beträgt 103,5 kDa, obwohl sich
im Western Blot das Protein mit einem Molekulargewicht von ~ 40 kDa zeigt. Es wurden drei MHC-I bindende
Peptide von der Sequenz abgeleitet; diese Peptide können als Peptidvakzin-Kandidaten in Betracht gezogen
werden.
BEISPIEL II: Humane nicht-muskuläre Alpha-Actinin-mRNA, vollständige CDS; Homo sapiens Actinin, Alpha
4 (ACTN4) mRNA
[0510] Der fhMAb 13.2C1 erkennt nicht-muskuläres Alpha-Actinin des Molekulargewichts von 105 kDa (Sequenz in Fig. 33 gezeigt), welches in vielen humanen Geweben zu finden ist; jedoch gibt es Berichte über die
Assoziation dieses Markers mit Brustkrebs. Wir leiteten drei MHC-I-restringierte Peptide ab, welche als Peptidvakzin-Kandidaten gegen Brustkrebs in Betracht gezogen werden können. Der fhMAb 13.2C1 erkennt ebenfalls Homo sapiens Actinin, Alpha 4 (ACTN4) (Sequenz in Fig. 34 gezeigt).
BEISPIEL III: Humanes Clathrin Coat Assembly Protein 50 (AP50) mRNA
[0511] Der fhMAb 22.8D11 ist gegen einen mit Brust- und Prostatakrebs assoziiertem Marker gerichtet, bei
dem es sich um das humane Clathrin Coat Assembly Protein 50 (AP50) mit einem Molekulargewicht von 50
kDa handelt. Obwohl von dessen mRNA (Sequenz in Fig. 34 gezeigt) in einigen humanen Geweben einschließlich Eierstocktumoren berichtet wurde, scheint das Proteinprodukt mit Brust- und Prostatakrebs assoziiert zu sein. Nach unserem besten Wissen wurde für diesen Marker nie zuvor berichtet, dass er mit diesen
Krebsarten assoziiert ist. Wir leiteten vier MHC-I-restringierte Peptide ab im Hinblick auf deren mögliche Signifikanz als Peptidvakzin-Kandidaten.
BEISPIEL IV: Homo sapiens gp130 assoziiertes Protein GAM mRNA; Homo sapiens aminoterminaler Enhancer of Split (AES) mRNA; Antiquitin 1 mRNA
[0512] Der fhMAb 33.2H6 ist gegen das humane mit gp130 assoziierte Protein GAM mit einem Molekulargewicht von ~ 22 kDa gerichtet. Von diesem Protein wurde niemals zuvor als mit Brustkrebs assoziiertem Antigen
berichtet, obwohl dessen mRNA (Sequenz in Fig. 37 gezeigt) in Eierstocktumoren gefunden wurde. Die mRNA
aus seinem homologen humanen aminoterminalen Enhancer of Split (AES) (Sequenz in Fig. 38 gezeigt) hat
eine unbekannte Funktion, wurde jedoch als ein in Frage kommendes Antigen gegen humanen Krebs vorgeschlagen. Wir leiteten ein MHC-I bindendes Peptid als möglichen Peptidvakzin-Kandidaten ab. Der selbe Antikörper war reaktiv gegenüber Antiquitin 1 (MW ~ 55 kDa)-26g-Turgor-Proteinhomolog (Sequenz in Fig. 39
gezeigt). Partielle mRNA für dieses Antigen wurde in einer Anzahl von humanen Geweben gefunden, es wurde
jedoch niemals zuvor von dessen Assoziation mit Brustkrebs berichtet. Wir leiteten drei MHC-I-restringierte
Peptide aus der Aminosäuresequenz dieses Proteins ab.
BEISPIEL V: ARP2/3-Proteinkomplex 41 KD Untereinheit, mRNA
[0513] Der fhMAb 39.A7 ist gegen die 41 KD Untereinheit des ARP2/3-Proteinkomplexes 41 KD (P41-ARC)
gerichtet. Es war zuvor nicht bekannt, dass dieses Protein mit Brustkrebs assoziiert ist. Wir leiteten ein
MHC-I-restringiertes Peptid als einen Kandidaten für ein peptidbasiertes Vakzin ab (Sequenz in Fig. 40 gezeigt).
BEISPIEL VI: Homo sapiens seb4D mRNA; Homo sapiens seb4B mRNA
[0514] Der fhMAb 50.1B3 erkennt das Protein in Brust- und Prostatakrebsgeweben, das als seb4B/4D-Antigen mit einem MW von ~ s25 kDa identifiziert wurde. Auch dieses Protein war nicht für seine spezifische Assoziation mit Brustkrebs bekannt. Die Funktion ist unbekannt, während seine mRNA in einer Reihe von normalen humanen Geweben gefunden wurde. Wir leiteten zwei MHC-I-restringierte Peptide aus der Primärsequenz
dieses Proteins ab (Sequenzen in den Fig. 41a und Fig. 41b gezeigt).
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BEISPIEL VII: Homo sapiens Lamin A/C (LMNA) mRNA
[0515] Der fhMAb 59.3G7 ist reaktiv gegenüber humanem Lamin A/C, einem intermediären Filamentprotein,
für welches in vielen humanen Geweben mRNA gefunden wurde. Das MW dieses Proteins beträgt ~ 65 kDa.
Dieses Protein wurde bereits früher von verschiedenen Forschungsgruppen durch den in Krebspatienten gefundenen Serumantikörper identifiziert. Es wird in Betracht gezogen, dass dieses Protein in Brust-Adenokarzinomen so wie in manchen anderen Arten von Krebs überexprimiert wird. Wir leiteten drei MHC-I-restringierte
als potentielle Kandidaten für ein peptidbasiertes Vakzin ab (Sequenz in Fig. 42A–C gezeigt).
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Patentansprüche
1. Monoclonaler Antikörper 27.B1 hergestellt von dem Hybridom 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer
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PTA-1599).
2. Hybridomzelle gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Zugangsnummer PTA-1599).
3. Monoclonaler Antikörper 27.F7 hergestellt von dem Hybridom 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer
1598).
4. Hybridomzelle gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Zugangsnummer PTA-1598).
5. In vitro-Verfahren zum Nachweisen von das TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen in einer Probe, umfassend:
(a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper, der gegen ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen gerichtet ist,
oder einem Fab-Fragment eines Antikörpers, der gegen ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen gerichtet ist, wobei
das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.F7, der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7
(ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) hergestellt wird, oder von dem monoclonalen Antikörper 27.B1,
der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) hergestellt wird,
erkannt wird, wobei der Antikörper oder das Fab-Fragment nachweisbar markiert ist, unter geeigneten Bedingungen, um einen Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex herzustellen, der den/das nachweisbar markierte(n) Antikörper oder Fab-Fragment gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen
in der Probe umfasst;
(b) Entfernen eines jeglichen markierten Antikörpers/Fab-Fragments, das nicht in dem Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex gebunden ist, der in Schritt (a) gebildet wurde; und
(c) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes durch Nachweisen der
Markierung des nachweisbar markierten Antikörpers, wobei die Anwesenheit von Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex die Anwesenheit von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen in der Probe anzeigt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Probe ein Gewebeschnitt aus einer Tumorprobe ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Gewebeschnitt konserviertes frisch eingefrorenes Gewebe oder
Formalin-fixiertes Gewebe ist.
8. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die nachweisbare Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe
bestehend aus einem radioaktiven Isotop, einem Enzym, einem Farbstoff, Biotin, einem Fluoreszenzmarker
oder einem Chemilumineszenzmarker.
9. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die das TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen menschliche
Krebszellen sind.
10. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Krebszellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend
aus Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenepithelzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen, Glioblastoma multiforme-Zellen, myeloische Leukämie-Zellen, Brustkarzinomzellen, Kolonkarzinomzellen, Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Eierstockkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Gebärmutterhalskarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Hodenkarzinomzellen und Lymphomzellen.
11. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
12. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.F7 erkannt
wird, der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) produziert
wird.
13. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.B1 erkannt
wird, der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) produziert
wird.
14. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei der monoclonale Antikörper ein menschlicher monoclonaler
Antikörper oder ein muriner monoclonaler Antikörper ist.
15. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Serum,
Plasma, Speichel, Tränen, Mucosasekret, Urin, Peritonealflüssigkeit, cerebrospinaler Flüssigkeit, lymphatischer Flüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsiegewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Gewebe aus Brust-
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und Prostatametastasen, Kulturmedium.
16. Verfahren nach Anspruch 5, wobei TIP-2 vor Schritt (a) durch Alkoholfällung aus der Probe konzentriert
wird.
17. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Probe Kulturmedium ist.
18. In vitro-Verfahren zum Nachweisen von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen in einer Probe, umfassend:
(a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Antikörper, der gegen ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen gerichtet ist,
oder einem Fab-Fragment eines Antikörpers, der gegen ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen gerichtet ist, wobei
das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.F7, der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7
(ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) hergestellt wird, oder von dem monoclonalen Antikörper 27. B1,
der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) hergestellt wird,
erkannt wird, und wobei das Epitop von dem Antikörper oder dem Fab-Fragment erkannt wird, unter geeigneten Bedingungen, um einen Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex herzustellen, der den Antikörper oder
das Fab-Fragment gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe umfasst;
(b) Entfernen eines jeglichen Antikörpers/Fab-Fragments, das nicht in dem Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex gebunden ist, der in Schritt (a) gebildet wurde;
(c) Inkontaktbringen des Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes aus Schritt (b) mit einem zweiten Antikörper, der spezifisch an den Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex bindet, wobei der zweite Antikörper
nachweisbar markiert ist, unter geeigneten Bedingungen, die dem zweiten markierten Antikörper erlauben, an
den Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex zu binden;
(d) Entfernen eines jeglichen zweiten markierten Antikörpers, der nicht an das Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex-Produkt aus (c) gebunden hat; und
(e) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplexes, der an den zweiten markierten Antikörper gebunden hat, durch Nachweisen der Markierung des zweiten Antikörpers, wobei die Anwesenheit von Antikörper/Fab-Fragment-Antigen-Komplex die Anwesenheit von TIP-2-Antigen tragenden
menschlichen Krebszellen in der Probe anzeigt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die nachweisbare Markierung ein radioaktives Isotop, ein Enzym,
ein Farbstoff, Biotin, ein Fluoreszenzmarker oder ein Chemilumineszenzmarker ist.
20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen menschliche Krebszellen
sind.
21. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Krebszellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenepithel-zellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen, Glioblastoma multiforme-Zellen, myeloische Leukämie-Zellen, Brustkarzinomzellen, Kolonkarzinomzellen, Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Eierstockkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Gebärmutterhalskarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Hodenkarzinomzellen und Lymphomzellen.
22. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
23. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.F7 erkannt wird,
der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) hergestellt wird.
24. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.B1 erkannt wird,
der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) hergestellt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der monoclonale Antikörper ein menschlicher monoclonaler Antikörper oder ein muriner monoclonaler Antikörper ist.
26. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Serum,
Plasma, Speichel, Tränen, Mucosasekret, Urin, Peritonealflüssigkeit, cerebrospinaler Flüssigkeit, lymphatischer Flüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsiegewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Gewebe aus Brustund Prostatametastasen, Kulturmedium.
27. Verfahren nach Anspruch 18, wobei TIP-2 vor Schritt (a) durch Alkoholfällung aus der Probe konzent-
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riert wird.
28. Verfahren zum Diagnostizieren von Krebs in einem Individuum durch Nachweisen von TIP-2-Antigen
tragenden Krebszellen, das umfasst:
(a) Inkontaktbringen einer Probe von peripherem Blut, das vom Individuum erhalten wurde, mit einem Antikörper, der gegen ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen gerichtet ist, oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.F7, der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) hergestellt wird, oder von dem monoclonalen Antikörper 27. B1, der von dem
Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) hergestellt wird, erkannt
wird, wobei der Antikörper nachweisbar markiert ist, unter geeigneten Bedingungen, um einen Antikörper/Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex herzustellen, der den nachweisbar markierten Antikörper gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe umfasst;
(b) Entfernen eines jeglichen markierten Antikörpers/Fab-Fragments, das nicht in dem Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex gebunden ist, der in Schritt (a) gebildet wurde; und
(c) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörpers/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Nachweisen
der Markierung des nachweisbar markierten Antikörpers, wobei die Anwesenheit von Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex eine Diagnose von Krebs im Individuum anzeigt.
29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die nachweisbare Markierung ein radioaktives Isotop, ein Enzym,
ein Farbstoff, Biotin, ein Fluoreszenzmarker oder ein Chemilumineszenzmarker ist.
30. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Individuum ein Mensch ist.
31. Verfahren nach Anspruch 28, wobei der Krebs menschliches Melanom, Basalzellkarzinom, Plattenepithelzellkarzinom, Neuroblastom, Glioblastoma multiforme, myeloische Leukämie, Brustkarzinom, Kolonkarzinom, Endometriumkarzinom, Lungenkarzinom, Eierstockkarzinom, Prostatakarzinom, Gebärmutterhalskarzinom, Osteosarkom, Hodenkarzinom oder Lymphom ist.
32. Verfahren nach Anspruch 28, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
33. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Epitop von einem monoclonalen Antikörper 27.F7 erkannt
wird, der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) hergestellt
wird.
34. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Epitop von einem monoclonalen Antikörper 27.B1 erkannt
wird, der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) hergestellt
wird.
35. Verfahren nach Anspruch 28, wobei der Antikörper ein menschlicher monoclonaler Antikörper oder ein
muriner monoclonaler Antikörper ist.
36. Verfahren nach Anspruch 28, wobei TIP-2 vor Schritt (a) durch Alkoholfällung aus der Probe konzentriert wird.
37. Verfahren zum Diagnostizieren von Krebs in einem Individuum durch Nachweisen von TIP-2-Antigen
tragenden Krebszellen, das umfasst:
(a) Inkontaktbringen einer Probe von peripherem Blut, das vom Individuum erhalten wurde, mit einem Antikörper, der gegen ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen gerichtet ist, oder einem Fab-Fragment davon, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.F7, der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) hergestellt wird, oder von dem monoclonalen Antikörper 27.B1, der von dem
Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) hergestellt wird, erkannt
wird, unter geeigneten Bedingungen, um einen Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex herzustellen, der den Antikörper gebunden an ein beliebiges TIP-2-Antigen auf der Oberfläche von Zellen in der Probe
enthält;
(b) Entfernen eines jeglichen Antikörpers/Fab-Fragments, das nicht in dem in Schritt (a) gebildeten Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex gebunden ist;
(c) Inkontaktbringen des Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes aus Schritt (b) mit einem zweiten
Antikörper, der den Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex spezifisch bindet, wobei der zweite Antikörper nachweisbar markiert ist, unter geeigneten Bedingungen, die dem zweiten markierten Antikörper erlauben, an den Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex zu binden;
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(d) Entfernen eines jeglichen zweiten markierten Antikörpers, der nicht an den Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex aus (c) gebunden hat; und
(e) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes, der an den zweiten
markierten Antikörper gebunden ist, durch Nachweisen der Markierung des zweiten Antikörpers, wobei die Anwesenheit von Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex die Diagnose von Krebs in dem Individuum
anzeigt.
38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die nachweisbare Markierung ein radioaktives Isotop, ein Enzym,
ein Farbstoff, Biotin, ein Fluoreszenzmarker oder ein Chemilumineszenzmarker ist.
39. Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Individuum ein Mensch ist.
40. Verfahren nach Anspruch 37, wobei der Krebs menschliches Melanom, Basalzellkarzinom, Plattenepithelzellkarzinom, Neuroblastom, Glioblastoma multiforme, myeloische Leukämie, Brustkarzinom, Kolonkarzinom, Endometriumkarzinom, Lungenkarzinom, Eierstockkarzinom, Prostatakarzinom, Gebärmutterhalskarzinom, Osteosarkom, Hodenkarzinom oder Lymphom ist.
41. Verfahren nach Anspruch 37, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
42. Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.F7 erkannt wird,
der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) hergestellt wird.
43. Verfahren nach Anspruch 37, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.B1 erkannt wird,
der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) hergestellt wird.
44. Verfahren nach Anspruch 37, wobei der Antikörper ein menschlicher monoclonaler Antikörper oder ein
muriner monoclonaler Antikörper ist.
45. Verfahren nach Anspruch 37, wobei TIP-2 vor Schritt (a) durch Alkoholfällung aus der Probe konzentriert wird.
46. Diagnostisches in vivo-Verfahren zum Nachweisen von TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen in einem
Individuum, das umfasst:
Bestimmen der Anwesenheit eines vorher verabreichten nachweisbar markierten Antikörpers, der an die Oberfläche von Zellen in dem Individuum gebunden hat, wobei der Antikörper gegen ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen gerichtet ist, oder eines Fab-Fragment davon, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.F7
hergestellt von dem Hybridom gekennzeichnet mit 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598), oder
von dem monoclonalen Antikörper 27.B1 hergestellt von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1
(ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599), erkannt wird.
47. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die nachweisbare Markierung ein radioaktives Isotop, ein Enzym,
ein Farbstoff, Biotin, ein Fluoreszenzmarker oder ein Chemilumineszenzmarker ist.
48. Verfahren nach Anspruch 46, wobei das Individuum ein Mensch ist.
49. Verfahren nach Anspruch 46, wobei der Krebs menschliches Melanom, Basalzellkarzinom, Plattenepithelzellkarzinom, Neuroblastom, Glioblastoma multiforme, myeloische Leukämie, Brustkarzinom, Kolonkarzinom, Endometriumkarzinom, Lungenkarzinom, Eierstockkarzinom, Prostatakarzinom, Gebärmutterhalskarzinom, Osteosarkom, Hodenkarzinom oder Lymphom ist.
50. Verfahren nach Anspruch 46, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
51. Verfahren nach Anspruch 46, wobei das Epitop erkannt wird von einem monoclonalen Antikörper
27.F7, der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) produziert wird.
52. Verfahren nach Anspruch 46, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.B1 erkannt wird,
der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) hergestellt wird.
53. Verfahren nach Anspruch 46, wobei der Antikörper ein menschlicher monoclonaler Antikörper oder ein
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muriner monoclonaler Antikörper ist.
54. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Anwesenheit des Antikörpers oder Fab-Fragments davon,
der/das an die Oberfläche von Zellen in dem Individuum gebunden ist, mit einer bildgebenden Vorrichtung
nachgewiesen wird.
55. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die bildgebende Vorrichtung eine Magnetresonanztomographievorrichtung ist.
56. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die bildgebende Vorrichtung eine bildgebende Röntgenstrahlenimmunszintigrafievorrichtung ist.
57. Verwendung eines Liposoms, das ein Konjugat von exogenem Material trägt, wobei ein monoclonaler
Antikörper 27.F7, hergestellt von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer
PTA-1598), oder ein monoclonaler Antikörper 27.B1, hergestellt von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1
(ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599), an eine äußere Oberfläche des Liposoms gekoppelt ist, für die
Herstellung eines Medikamentes, um Krebs durch die gezielte Hinführung des exogenen Materials zu
TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen eines menschlichen Individuums zu behandeln.
58. Verwendung nach Anspruch 57, wobei das exogene Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus Anti-Krebs-Medikamenten, Radioisotopen, Toxinen, Antibiotika, Prodrugs, Enzymen und chemotherapeutischen Verbindungen.
59. Verwendung nach Anspruch 57, wobei die TIP-2-Antigentragenden Krebszellen menschliche Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenepithelzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen, Glioblastoma
multiforme-Zellen, myeloische Leukämie-Zellen, Brustkarzinomzellen, Kolonkarzinomzellen, Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Eierstockkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Gebärmutterhalskarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Hodenkarzinomzellen oder Lymphomzellen sind.
60. Verwendung des monoclonalen Antikörpers 27.F7, hergestellt von dem Hybridom gekennzeichnet als
27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598), oder des monoclonalen Antikörpers 27.B1 hergestellt von
dem Hybridom 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) oder eines Peptidfragments davon, das gegen ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen gerichtet ist, für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von
Krebs in einem menschlichen Individuum durch passive Immunisierung.
61. Verwendung nach Anspruch 60, wobei der Antikörper die Apoptose der TIP-2-Antigen tragenden Zellen induziert.
62. Kit zum Nachweisen der Anwesenheit von TIP-2-Antigentragenden Krebszellen in einer Probe, umfassend:
(a) einen festen Träger mit einer Vielzahl von kovalent gebundenen Sonden, die gleich oder unterschiedlich
sein können, wobei jede Sonde einen monoclonalen Antikörper, der gegen ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen
gerichtet ist, oder ein Fab-Fragment eines solchen Antikörpers umfasst, wobei der monoclonale Antikörper der
monoclonale Antikörper 27.F7, hergestellt von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598), oder der monoclonale Antikörper 27.B1, hergestellt von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) ist; und
(b) ein Reagenz zum Nachweisen der Anwesenheit des monoclonalen Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes.
63. Kit nach Anspruch 62, wobei das Reagenz zum Nachweisen des monoclonalen Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes ein nachweisbar markierter zweiter Antikörper ist, der spezifisch an den monoclonalen Antikörper bindet, der gegen das Epitop auf dem TIP-2-Antigen gerichtet ist.
64. Kit nach Anspruch 62, wobei der monoclonale Antikörper, der gegen das Epitop auf dem TIP-2-Antigen
gerichtet ist, der menschliche monoclonale Antikörper 27.F7 ist, der von dem Hybridom gekennzeichnet als
27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) hergestellt wird.
65. Kit nach Anspruch 62, wobei der monoclonale Antikörper, der gegen das Epitop auf dem TIP-2-Antigen
gerichtet ist, der menschliche monoclonale Antikörper 27.B1 ist, der von dem Hybridom gekennzeichnet als
27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) hergestellt wird.
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66. Kit nach Anspruch 62, wobei die nachweisbare Markierung ein radioaktives Isotop, ein Enzym, ein
Farbstoff, Biotin, ein Fluoreszenzmarker oder ein Chemilumineszenzmarker ist.
67. Kit nach Anspruch 62, wobei die TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen menschliche Krebszellen sind.
68. Kit nach Anspruch 62, wobei die Krebszellen ausgewählt sind aus einer Gruppe bestehend aus
menschlichen Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenepithelzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen, Glioblastoma multiforme-Zellen, myeloische Leukämie-Zellen, Brustkarzinomzellen, Kolonkarzinomzellen,
Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Eierstockkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Gebärmutterhalskarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Hodenkarzinomzellen und Lymphomzellen.
69. Kit nach Anspruch 62, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
70. Kit nach Anspruch 62, wobei der Antikörper ein menschlicher monoclonaler Antikörper ist oder ein muriner monoclonaler Antikörper ist.
71. Kit nach Anspruch 62, wobei die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma,
Speichel, Tränen, Mucosasekret, Urin, Peritonealflüssigkeit, cerebrospinaler Flüssigkeit, lymphatischer Flüssigkeit, Knochenmark, Brustbiopsiegewebe, Lymphknoten, Prostatagewebe, Gewebe aus Brust- und Prostatametastasen, Kulturmedium.
72. Kit nach Anspruch 62, wobei die Probe Kulturmedium ist.
73. Kit nach Anspruch 62, wobei die Probe eine Tumorprobe ist.
74. Verfahren zum in vitro-Nachweisen der Anwesenheit von TIP-2-Antigen in einer biologischen Flüssigkeit, umfassend:
(a) Inkontaktbringen einer Probe der biologischen Flüssigkeit mit einem Antikörper, der gegen ein Epitop auf
dem TIP-2-Antigen gerichtet ist oder einem Fab-Fragment des Antikörpers, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.F7, hergestellt von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) oder von dem monoclonalen Antikörper 27.B1, hergestellt von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599), erkannt wird, wobei der Antikörper nachweisbar markiert ist, unter geeigneten Bedingungen, um einen Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex
herzustellen, der den nachweisbar markierten Antikörper, der an ein beliebiges in der Probe anwesendes
TIP-2-Antigen gebunden ist, umfasst;
(b) Entfernen eines jeglichen markierten Antikörpers, der nicht in dem Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex gebunden ist, der in Schritt (a) gebildet wurde; und
(c) Bestimmen der Anwesenheit des Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplexes durch Nachweisen
der Markierung des nachweisbar markierten Antikörpers, wobei die Anwesenheit von Antikörper/Fab-Fragment-TIP-2-Antigen-Komplex die Anwesenheit von TIP-2 Antigen-tragenden Krebszellen in der biologischen
Flüssigkeit anzeigt.
75. Verfahren nach Anspruch 74, wobei die nachweisbare Markierung ein radioaktives Isotop, ein Enzym,
ein Farbstoff, Biotin, ein Fluoreszenzmarker oder ein Chemilumineszenzmarker ist.
76. Verfahren nach Anspruch 74, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
77. Verfahren nach Anspruch 74, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.F7 erkannt wird,
der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) hergestellt wird.
78. Verfahren nach Anspruch 74, wobei das Epitop von dem monoclonalen Antikörper 27.B1 erkannt wird,
der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.B1 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1599) hergestellt wird.
79. Verfahren nach Anspruch 76, wobei der Antikörper ein menschlicher monoclonaler Antikörper oder ein
muriner monoclonaler Antikörper ist.
80. Verfahren nach Anspruch 74, wobei die biologische Flüssigkeit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Serum, Plasma, Speichel, Tränen, Mucosasekret, Urin, Peritonealflüssigkeit, cerebrospinaler Flüssigkeit und lymphatischer Flüssigkeit.
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81. Verfahren nach Anspruch 74, wobei TIP-2 vor Schritt (a) durch Alkoholfällung aus der Probe konzentriert wird.
82. Verfahren nach Anspruch 74, wobei die biologische Flüssigkeit Kulturmedium ist.
83. Verfahren nach Anspruch 74, wobei der monoclonale Antikörper, der gegen das Epitop auf dem
TIP-2-Antigen gerichtet ist, der menschliche monoclonale Antikörper 27.F7 ist, der von dem Hybridom gekennzeichnet als 27.F7 (ATCC-Kennzeichnungsnummer PTA-1598) hergestellt wird.
84. Verfahren nach Anspruch 74, wobei der monoclonale Antikörper, der gegen das Epitop von TIP-2-Antigen gerichtet ist, ein muriner monoclonaler Antikörper ist, der gegen ein Epitop auf dem TIP-2-Antigen gerichtet ist.
85. Verfahren nach Anspruch 74, wobei das TIP-2 Antigen sich auf TIP-2 Antigen-tragenden Krebszellen
in der biologischen Flüssigkeit befindet.
86. Verfahren nach Anspruch 85, wobei die TIP-2-Antigen tragenden Krebszellen menschliche Krebszellen
sind.
87. Verfahren nach Anspruch 85, wobei die Krebszellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
Melanomzellen, Basalzellkarzinomzellen, Plattenepithelzellkarzinomzellen, Neuroblastomzellen, Glioblastoma multiforme-Zellen, myeloische Leukämie-Zellen, Brustkarzinomzellen, Kolonkarzinomzellen, Endometriumkarzinomzellen, Lungenkarzinomzellen, Eierstockkarzinomzellen, Prostatakarzinomzellen, Gebärmutterhalskarzinomzellen, Osteosarkomzellen, Hodenkarzinomzellen und Lymphomzellen.
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